KR100682713B1

KR100682713B1 - 폴리펩티드 처리용 효소

Info

Publication number: KR100682713B1
Application number: KR1019970033890A
Authority: KR
Inventors: 다다오 다니모도; 마사시 구리모토
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-07-19
Publication date: 2007-12-10
Also published as: DE69739280D1; TW480285B; JPH1080270A; EP0819757A3; US5879942A; EP0819757A2; KR970065710A; EP0819757B1

Abstract

면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 폴리펩티드의 선구물을 그 활성형으로 변환하는 효소 또는 단백질과, 이 효소를 생성하는 세포를 증식시키고 생성된 효소를 증식세포로부터 채취하는 효소의 제조방법, 및 이 선구물을 그 활성형으로 변환하는 방법이 개시되어 있다.

Description

폴리펩티드 처리용 효소

본 발명은 폴리펩티드 처리용 효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역담당 세포에서 인터페론-γ (이하, 간단히 "INF-γ "라 함)의 생성을 유도하는 폴리펩티드의 선구물을 그 활성형으로 변환하는 효소에 관한 것이다.

본 발명자들은 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 폴리펩티드와 이 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA를 분리하는데 성공하여 이들을 일본국 특허공개 제27,198/96호 및 제193,098/96호 공보에 개시하였다.

이 폴리펩티드는 유용한 생물학적 활성을 가진 물질로서의 IFN-γ 의 생성을 유도하고, 킬러 세포에 의한 세포독성을 증강시키며, 킬러 세포의 생성을 유도하는 특징을 가지고 있으므로, 항바이러스제, 살균제, 항종양제 및 항면역병 의약으로서의 용도가 기대되고 있다.

즉, 인간 세포에 있어서 유전자 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 세포내 효소로 처리하여 이 폴리펩티드를 부분적으로 소화시키고 여기에 당 체인(sugar chain)을 부가하고 있다.

의약에 만족스럽게 첨가되는 폴리펩티드는 인간 세포에서와 마찬가지로 처리를 받은 것들이어도 좋은데, 이러한 세포들은 일본국 특허출원 제269,105/96호에 개시된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드의 생성량이 적다는 결점을 가지고 있다. 본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 통상적으로 이 폴리펩티드는 분자량 약24,000 달톤의 선구물 형태로 인간 세포중에 존재하며 생물학적 활성이 전혀 없다는 것을 판명하였다. 이 폴리펩티드에 한정된 것은 아니지만 통상적으로 대부분의 사이토카인류(cytokines)를 그 생물학적 활성이 없는 선구물로서 생성시킨 다음 세포내 효소로 처리하여 그 활성형으로 변환하는 것이 알려져 있다.

상기한 바를 고려하여 본 발명의 제1과제는 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 폴리펩티드의 선구물에 작용하여, 이 선구물을 변환하여 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 활성형을 생성시키는 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 제2과제는 이 효소의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제3과제는 상기 선구물을 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 활성형으로 변환하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명자들은 이 과제를 해결하고자 예의 연구를 한 결과, 인간 세포주에서 분리한 효소가 폴리펩티드 선구물에 작용하여 이 선구물을 변환하여 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 활성형을 생성시킨 것을 발견하였다. 더욱이 본 발명자들은 이 효소를 인공적으로 증식시킨 세포, 특히 인간 조혈세포로부터 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 제1과제는 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 폴리펩티드 선구물을 활성형으로 변환하는 효소에 의해 해결된다.

본 발명의 제2과제는 효소를 생산하는 세포를 영양배지에서 배양하고, 생성된 효소를 수득한 배양물로부터 채취하는 효소의 제조방법에 의해 해결된다.

본 발명의 제3과제는 이 선구물과 이 효소를 접촉시켜 이 선구물을 그 활성형으로 변환하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 변환방법에 의해 해결된다.

상기한 바와 같이 본 발명은 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 폴리펩티드 선구물을 그 활성형으로 변환하는 효소의 발견에 근거하여 된 것이다. 본 발명에서 말하는 선구물은 환원제 존재하에서의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 24,000 달톤이고, 예컨대 본래부터 폴리펩티드를 생성하는 세포내와, 폴리펩티드를 코우드하는 영역을 가진 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA를 도입하여 형질 전환시킨 포유동물의 숙주세포중에 존재한다.

이러한 선구물은 N 말단영역에서 서열번호(SEQ ID NO:) 1의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 가지며, 전체적으로 서열번호(SEQ ID NO:) 2의 전체 아미노산 서열(여기서 "Xaa"는 "이소로이신" 또는 "트레오닌" 임)을 가지고 환원제 존재하에서의 SDS-PAGE에 의한 분자량이 18,000∼19,500 달톤이다.

본 발명에서 말하는 효소에는 그 특정된 기원과 공급원에 한정됨이 없이 면역담당 세포에서 INF-γ 생성을 유도하는 활성형을 생산할 수 있는 것이면 그것이 천연산이거나 인공산이거나 간에 모두 본 발명에 포함된다.

인간 조혈세포로부터 수득되는 본 발명의 효소는 일반적으로 아래와 같은 이화적 성질을 가지고 있다 :

(1) 분자량

SDS-PAGE에 의해 분자량 약 25,000 달톤 및 약 10,000 달톤을 나타냄.

(2) 부분 아미노산 서열

서열번호(SEQ ID NO:) 4(여기서 "Xaa"는 "아스파라긴" 또는 "아스파르트산"임) 및 서열번호(SEQ ID NO:) 5로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가짐.

(3) 저해제

아세틸-L-티로실-L-발릴-L-알라닐-L-아스파르트-1-알(이하, 간단히 "Ac-YNAD-CHO"라 함) 및 요오도아세트아미드에 의해 저해됨.

세포를 공급원으로 사용하는 본 발명의 방법으로 이 효소를 제조할 수 있다. 천연세포와, 이 천연세포로부터 인공적으로 얻은 세포주 및 형질 전환체를 공급원으로 사용할 수 있다. 이들 세포주와 형질 전환체는 특히 본 발명의 실시에 유용하다. 세포주는 인간 조혈세포(예 : 임파아구, 임파구, 단아구, 단핵세포, 골수아구, 골수구, 과립구, 대식세포 등), 종양세포를 비롯한 표피세포(예 : 악하선류 표피암, 폐암, 대장암, 결장암 등), 신경아세포 및 간질계(間質系) 세포 등으로부터 주화시켜 얻을 수 있다. 각 세포주의 예로서는 문헌[Jun MINOWADA in "Cancer Review", Vol.10, pp.1∼18(1988)]에 기재되어 있는, 골수성 백혈병, 전골수성 백혈병, 단구성 백혈병, 성인 T세포 백혈병, 모상(毛狀)세포 백혈병을 포함하는 백혈병 및 임파종으로부터 유래하는 HBL-38세포, HL-60세포(ATCC CCL240), K-562세포(ATCC CCL243), KG-1세포(ATCC CCL246), Mo세포(ATCC CRL8066), THP-1세포(ATCC TIB202), 및 U-937세포(ATCC CRL1593.2) 등의 백혈병 세포주 및 이들의 변이주를 들 수 있다.

이들 세포주 모두가 본 발명의 폴리펩티드를 비교적 높은 수율로 증식하여 생성하므로 본 발명에서 유리하게 사용할 수 있다. 특히 HBL-38세포, HL-60세포, KG-1세포, THP-1세포 및 U-937세포 등의 인간 골수 단구계 세포주는 본 발명의 폴리펩티드를 극히 고수율로 생성하므로 이들을 본 발명에서 유리하게 사용할 수 있다.

상기한 세포주의 형질 전환체는 상기 세포주로부터 얻은 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 적당한 포유동물 숙주세포속에 도입하여 얻을 수 있다. 이러한 숙주세포의 예로서는 인간, 원숭이, 마우스 및 햄스터 유래의 것으로서 종래부터 숙주로 사용되고 있는 상피계 세포주, 간질계(間質系) 세포주, 신경아세포주, 조혈세포주 등이 있는데, 그 예를 들자면 3T3세포(ATCC CCL92), C1271세포(ATCC CRL1616), CHO KI세포(ATCC CCL61), CV-1세포(ATCC CCL70), COS-1세포(ATCC CRL1650), HeLa세포(ATCC CCL2), MOP-8세포(ATCC CRL1709) 및 이들의 변이주가 있다.

효소를 코우드하는 DNA를 숙주 세포속에 도입하는 방법에는 종래의 DEAE-덱스트란법, 인산-칼슘법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 리포펙션법(lipofection), 현미경하 주사법(microinjection), 및 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤르페스바이러스 및 종두 바이러스를 사용하는 바이러스 감염법 등이 포함된다. 형질 전환체를 영양배지에서 배양하고, 효소 생성이 관찰된 소요의 클론을 선택하는 방식으로 콜로니 하이브리다이제이션법에 의해 효소를 생성하는 클론을 형질 전환체로부터 선택할 수 있다. 포유동물의 세포를 이용하는 제조합 DNA기술은 문헌[Jikken-Igaku-Bessatsu-Saibo-Kogaku-Handbook", edited by Toshio KUROKI, Masaru TANIGUCHI and Mitsuo OSHIMURA (1992) and in "Jikken-Igaku-Bessatsu-Biomaterial Series 3, Genetic Cloning Experimental Method", edited by Takashi YOKOTA and Kenichi ARAI, edited by Yodo Publisher, Tokyo, Japan(1993)]에 상세히 나와 있다.

본 발명에 의한 방법은 상기한 세포주들을 증식시키고, 증식된 세포로부터 소요의 효소를 채취하는 것으로 되어 있다. 세포주 증식방법에 대해서는 특별히 한정되지는 않으며 이 기술분야에서 일반적으로 사용된 생체내 및 생체외 증식방법이 포함된다. 생체외 증식방법은 포유동물 세포배양에 종래부터 사용되고 있는 방법등의 영양배지에서의 세포 증식 방법을 뜻한다. 일반적으로 이 배지는 베이스로서의 완충수와 나트륨, 칼륨, 칼슘, 인 및 염소 이온 등의 무기 이온 및 미량원소, 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등의 기타 성분으로 되어 있는데, 이들은 세포 동화능력에 따라 필요로 하게 된다. 필요한 경우, 혈청, 호르몬, 세포생장 인자 및 세포접착 인자를 배지중에 첨가할 수 있다. 이러한 배지의 예로서는 199, DMEM, Ham's F12, IMDM 배지, MCDB104, MCDB153, MEM, RD, RITC80-7, RPMI 1630, RPMI 1640 및 WAJC404 배지등이 있다. 이들 배지에다 세포주를 약 1× 10⁴∼1× 10⁷ 세포/ml, 바람직하게는 약 1× 10⁵∼1× 10⁶ 세포/ml의 세포농도로 접종하고, 필요에 따라 신선한 새로운 배지로 교체해 주면서 약 37℃에서 1∼7일간, 바람직하게는 2∼4일간 현탁배양 또는 단일층 배양방식으로 배양한다.

인간이외의 온혈동물을 이용하는 생체내 증식방법은 일반적으로 토끼 유래의 항흉선 항체를 마우스, 누우드 마우스, 래트, 누우드 래트, 기니아 피그 및 햄스터 등의 갖 태어난 설치류에 주사하여 면역반응을 감소시킨 다음, 각각의 동물에 대해 약 1× 10⁵∼1× 10⁸개의 세포를 피하주사 또는 복강내 주사하여 본 발명의 효소를 생성시키거나, 동물체내에 매설된 확산 체임버속에 인간 세포를 주입하고, 이 체임버내에서 동물의 영양 체액을 순환시키면서 종래방식으로 이들 동물을 약 2∼10주간 사육하는 것으로 되어 있다. 이식된 세포는 사육 도중에 동물의 체액을 공급 받으면서 증식한다. 이어서 증식된 세포를 종양 덩어리, 복수 또는 체액 혹은 배지중의 세포 부유액 형태로 채취하고, 필요한 경우에는 채취한 세포를 적당한 매체중에 분산하여 세척한 다음, 소요의 효소를 회수한다. 생체외 증식방법에 비해 생체내 증식방법은 필요한 양의 세포를 저렴하게 싼 인건비로 짧은 시간에 얻을 수 있다는 장점이 있다. 예컨대 일본국 특허 공고 제54,158/81호 공보에는 생체내 증식방법에 대해 상세히 개시되어 있다.

배양물로부터 분리한 세포 또는 배양물 그대로를 초음파로 처리하거나 세포를 저장(低張)매체(hypotonic media)중에 침지하여 세포를 파쇄한 다음, 수득한 세포 부스러기 또는 이들 세포 부스러기와 배양 상청액의 혼합물을 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등의 이 기술분야에서 효소정제에 사용되는 종래의 방법으로 처리함으로써 증식된 세포로부터 효소를 채취할 수 있다. 목적에 따라 이들 정제방법중 두가지 이상을 병용해도 좋다.

구체적으로는 본 발명의 효소에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피에 의하여 비교적 고순도의 효소를 가장 저렴한 경비와 인건비로 얻을 수 있다. 세포의 종류와 배양조건에 따라서는 생성된 효소가 세포증식도중 세포외에서 분비될 경우 배양 상청액으로부터 얻을 수도 있다.

본 발명에 있어서. 본 발명의 효소의 활성은 다음과 같이 측정하여 단위로 나타낸다. 즉, 수크로오스 10w/v％, 2mM 디티오드레이톨 및 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산(이하, 간단히 "CHAPS"라 함) 0.1w/v％을 함유한 25mM Hepes 완충액(pH 7.5) 395㎕을 용기에 넣고, 여기에 시험 효소액 100㎕와 10mM N-(N-아세틸-티로실)-발리닐-알라닐-아스파르트산-7-아미노-4-메틸쿠마린아미드 5㎕을 혼합한 다음, 30℃에서 1시간 유지하였다. 반응 도중 반응이 진행함에 따라 유리된 7-아미노-4-메틸쿠마린의 함량을 파장 355nm의 빛에 의한 들뜸(excitation)에 의해 방출되는 파장 460nm에서의 형광의 강도를 형광 광도계로 모니터링하여 체크하였다. 이 효소의 활성 1단위는 이들 반응 조건하에서 1분당 7-아미노-4-메틸쿠마린 1pmole을 방출하는 양으로 정의된다.

본 발명은 이 효소를 폴리펩티드 선구물과 접촉시켜 폴리펩티드 선구물을 활성형으로 변환하는 방법을 제공한다. 예컨대, 상기한 방법으로 일단 분리된 본 발명의 효소를 선구물과 접촉시키거나, 이 효소를 코우드하는 DNA와 이 선구물을 코우드하는 뉴클레오티드 영역을 가진 DNA를 적당한 숙주세포에 도입하여 이들 DNA를 발현시킨다. 전자의 경우에 있어서, 이 폴리펩티드의 선구물을 생성하는 세포 또는 형질전환에 의한 선구물을 생성할 수 있는 능력을 얻은 세포를 배양한다.

상기 방법으로 얻은 효소를 수득된 배양물과 접촉시키거나, 배양물로부터 분리 또는 분리되지 아니한 세포에 가하거나, 필요한 경우 이러한 조건에서 세포를 파쇄하여 얻은 세포 부스러기 또는 혼합물에다 가한다. 효소의 공존량 또는 첨가량은 선구물의 양과 같거나 그 보다 적은 양이고, 이 혼합물을 각기 상이한 pH와 온도에서 유지함으로써 효소를 선구물에 작용시켜 그 활성형으로 변환시키는데, 구체적으로는 약 4∼40℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도 및 6∼9, 바람직하게는 약 7∼8의 pH에서 작용시킨다. 후자의 경우에 있어서, 이 효소를 코우드하는 DNA와 이 폴리펩티드를 코우드하는 영역을 가진 DNA를 적당한 포유동물 숙주세포속에 도입하여 세포를 형질 전환시킨다, 수득한 형질 전환된 세포는 본 발명의 효소를 반드시 필요로 하지 않고서도 소요의 선구물과 효소를 생성한다.

이러한 형질 전환된 세포에 대해서는 그대로 각각의 온도에서 유지하는 것만으로도 본 발명의 효소를 선구물에 작용시켜 그 활성형으로 변환시켜도 되고, 혹은 필요한 경우에는 균질화하여 세포 부스러기로 한후에 유지하여도 된다.

활성형을 함유한 수득한 배양물을 그대로 IFN-γ 유도제로 사용할 수 있는데, 통상적으로는 배양물중의 세포를 초음파, 세포 용해효소 및/또는 계면활성제로 파쇄한 다음, 세포와 세포 부스러기로부터 폴리펩티드를 여과, 원심분리 등에 의해 분리한 후 이 폴리펩티드를 정제한다. 정제시에는 세포 또는 세포 부스러기 무함유의 배양물을 이 기술분야에서 생물학적 활성을 가진 물질의 정제에 사용되던 종래의 정제방법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등으로 정제하였다. 필요한 경우, 이들 정제방법중 두가지 이상을 병용해도 좋다. 수득한 정제 폴리펩티드를 농축하여 동결건조함으로써 최종용도에 부합하는 액상제품 또는 고형 제품을 얻는다. 본 발명의 동일한 출원인에 의한 일본국 특허공개 제231,598/96호 공보에 개시된 바와 같이 모노클로날 항체를 이 폴리펩티드의 정제시에 유리하게 사용할 수 있다. 예컨대, 모노클로날 항체를 사용하는 면역 친화성 크로마토그래피에 의해 비교적 높은 순도의 소요의 폴리펩티드를 가장 저렴한 코스트와 인력으로 얻을 수 있다.

상기한 바와 같이 활성형의 선구물, 즉 본 발명의 방법으로 얻는 활성 폴리펩티드는 유용한 생물학적 활성을 가진 물질로서의 IFN-γ 생성을 유도하는 활성을 가지고 있고, 킬러 세포의 세포독성을 증대시키며 킬러 세포의 생산을 유도한다. 따라서 이 폴리펩티드는 IFN-γ 및/또는 킬러 세포 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 강한 활성을 발휘한다.

본 발명의 방법으로 얻는 활성의 폴리펩티드는 IFN-γ 유도능이 강력하므로 일반적으로 비교적 소량만으로도 소정량의 IFN-γ 생성을 유도한다. 이 활성 폴리펩티드는 그 독성이 극히 낮기 때문에 비교적 높은 투여량으로 하여 체내에 투여하더라도 심각한 부작용을 실질적으로 유발하지 않고, 실제 사용시에 투여량을 엄격히 제한하지 않더라도 소요량의 IFN-γ 생성을 원만하게 유도한다. 본 발명의 동일한 출원인에 의한 일본국 특허출원 제28,722/96호에는 감수성 질환제로서의 활성 폴리펩티드의 용도에 대해 상세히 개시되어 있다. 아래의 실시예로써 본 발명을 설명한다.

실시예 1 : 효소 제조

갖 태어난 햄스터에게 토끼 유래의 항흉선 항혈청을 복강내에 주사하여 면역반응을 저하시킨 다음, 햄스터 한마리당 등부위의 피하조직에 THP-1세포(ATCC TIB202)를 약 5× 10⁵개 주사하여 종래 방식으로 3주간 사육하였다. 햄스터의 피하에 생긴 각각 약 15g의 종양 덩어리를 적출하여 종래의 방식으로 RPMI 1640 배지(pH 7.4)중에 부유시켜 세척함으로써 증식된 세포를 얻었다.

이들 세포를 10mM 염화 칼륨, 1.5mM 염화 마그네슘 및 0.1mM 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 2나트륨염을 함유한 10배 체적의 빙냉(氷冷)의 20mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 세척하고 빙냉조건하에서 3배 체적의 동일한 신선한 완충액중에 20분간 방치한후 -20℃에서 동결하였다. 동결한 것을 해동하고, 여기에 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1mg/ml의 류우펩틴 및 10mg/ml의 펩스타틴 A를 혼합한 다음, 테플론 호모지나이저로써 균질화하였다. 파쇄된 세포를 2,000 × g에서 10분간 원심분리하여 상청액을 얻고, 침전물을 위와 마찬가지로 다시 처리하여 원심분리함으로써 상청액을 얻었다. 이들 상청액을 한데 합쳐 여기에 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 2나트륨염을 혼합하여 농도 6mM로 한후 24,000× g에서 20분간 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고 다시 100,000× g에서 60분간 원심분리하여 마이크로솜(microsome) 획분과 시토솔(cytosol) 획분을 생성시킨 다음 후자의 획분을 채취하였다.

채취한 획분에다 빙냉조건하에서 포화도 40％가 되도록 황산 암모늄을 가하고, 이 혼합물을 교반하여 원심분리함으로써 상청액을 얻었다. 이 상청액에 다시 황산 암모늄을 가하여 포화도 80％가 되게 하여 교반하고 원심분리하여 침전물을 얻은 다음, 글리세롤 5v/v％, CHAPS 0.1w/v％ 및 2mM 디티오드레이톨을 함유한 20mM Tris-HC1 완충액(pH 7.8)중에 용해하였다. 이 용액을 투석 백(dialysis bag)에 주입하여 동일한 신선한 완충액에 대하여 4℃에서 16시간 투석하였다. 이 투석백의 내부액을 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, 동일한 신선한 완충액으로 평형화시켜둔 "DEAE 5PW"(일본국의 Tosoh사 판매의 이온교환 크로마토그래피용 수지) 충전 칼럼에 공급한 다음, 이 칼럼에 동일한 완충액에서 0M에서부터 0.5M까지 증가하는 염화 나트륨의 직선 기울기 완충액을 통과시켜 0.04∼0.09M의 염화 나트륨 농도에서 용출한 획분을 채취하였다.

채취한 획분을 글리세롤 5v/v％, CHAPS 0.1w/v％ 및 2mM 디티오드레이톨을 함유한 20mM Hepes 완충액(pH7.4)로써 1.5배로 희석한후 이 희석액을 묽은 염산을 가해 pH7.4로 조정한 다음, 동일한 신선한 완충액으로 평형화시켜둔 "S-SEPHAROSE"(스웨덴국의 Pharmaia LKB Biotechnology AB판매의 이온교환 크로마토그래피용 겔)충전 칼럼을 통과시켰다. 이 칼럼을 동일한 신선한 완충액으로 세척하고 이 칼럼에 동일한 완충액에서 0M에서부터 0.5M까지 증가하는 염화 칼륨의 직선 기울기 완충액을 통과시켜 약 0.01∼0.1M의 칼륨 농도에서 용출한 획분을 채취하였다.

이 획분을 한데 모아 글리세롤 5v/v％, CHAPS 0.1w/v％ 및 2mM 디티오드레이톨을 함유한 20mM Hepes 완충액(pH7.4)에 대하여 16시간 동안 투석하고, 동일한 신선한 완충액으로 평형화시켜둔 "MONO S" 칼럼(스웨덴국의 Pharmaia LKB Biotechnology AB판매의 이온교환 크로마토그래피용 칼럼)을 통과시킨 다음, 이 칼럼에 0.5M 염화 칼륨을 함유한 동일한 신선한 완충액을 통과시켰다.

"MONO S" 칼럼에서 용출한 본 발명의 효소 활성을 가진 획분을 채취하여 한데 모아 농축하였다. 이 농축물을 글리세롤 5v/v％, CHAPS 0.1w/v％ 및 2mM 디티오드레이톨을 함유한 20mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 평형화시켜둔 "SUPERDEX 200"칼럼(스웨덴국의 Pharmaia LKB Biotechnology AB판매의 겔 여과 크로마토그래피용 칼럼)을 통과시킨 다음, 이 칼럼에 동일한 신선한 완충액을 통과시키고 본 발명의 효소활성을 가진 획분을 채취하여 한데 모아 농축함으로써 이 효소를 약 9,000 단위/ml 함유한 용액 1ml을 햄스터 한마리당 약 45 단위의 수득량으로 얻었다.

실시예 2 : 효소의 분자량

"SUPERDEX 75HR"(스웨덴국의 Pharmaia LKB Biotechnology AB판매의 겔 여과크로마토그래피용 겔)을 24ml 충전한 칼럼을 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline ; 이하, 간단히 "PBS"라 함)로 평형화한 다음, 여기에 실시예 1-1의 효소액 200㎕을 통과시키고 용출액중의 효소 활성을 모니터링하면서 신선한 PBS를 0.5ml/min의 유속으로 통과시켰다. PBS중에 겔 여과 크로마토그래피용 분자량 마아커로서 분자량 67,000 달톤의 소혈청 알부민, 분자량 43,000 달톤의 난알부민, 분자량 25,000 달톤의 키모트립시노젠 A, 및 분자량 13,700 달톤의 리보뉴클레아제를 적당량 용해하고, 효소를 모니터링함이 없이 파장 280nm에 대한 흡착도로서 용출액중의 단백질 농도를 모니터링한 것 외에는 상기 효소액의 시험의 경우와 마찬가지로 용액을 처리하였다. 효소의 크로마토그램과 분자량 마아커의 용출위치에 근거하여 본 발명의 효소는 겔 여과 크로마토그래피에서 약 30,000 달톤의 분자량을 가진 것으로 계산되었다.

본 발명의 효소를 함유한 "SUPERDEX 75HP"로부터의 용출액을 농축하여 문헌[U. K. Lemuli in "Nature", Vol. 227, pp.680∼685(1970)]에 기재된 방법에 준하여 환원제로서 디티오드레이톨 2w/v％ 존재하에 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동하였다. 미합중국의 Santa Cruz Biotechnology사 판매의 항인간 ICE-p20항체 및 항인간 ICE-p10항체를 사용하여 이 겔을 통상의 방법으로 면역염색하고 "ELC 키트"(미합중국의 Amersham사제)로 착색시켜 분자량 약 25,000 및 약 10,000에 상당하는 위치에서 두개의 단일 단백질 밴드를 검출하였다. 이 시험에 사용한 분자량 마아커는 분자량 67,000 달톤의 소혈청 알부민, 분자량 45,000 달톤의 난알부민, 분자량 30,000 달톤의 탄산 탈수효소, 분자량 20,100 달톤의 대두 트립신 저해제, 및 분자량 14,400 달톤의 α -락토알부민이었다.

실시예 3 : 효소의 부분 아미노산 서열

실시예 1에서 얻은 본 발명의 효소를 함유한 효소액을 글리세롤 5v/v％ 및 2mM 디티오드레이톨을 함유한 20mM Hepes 완충액(pH 7.4)에 대하여 투석하고 원심농축기에서 농축하였다. 이 농축물을 환원제로서 디티오드레이톨 2w/v％ 및 15w/v％의 겔 농도를 사용하는 SDS-PAGE에서 통상의 방법으로 분리하였다. 분리된 단백질을 디플루오라이드 폴리비닐 멤브레인에 옮겨 Coomassie Brilliant Blue로 염색한 다음 분자량 약 25,000 달톤 및 약 10,000 달톤에 상당하는 밴드를 절단하였다.

절단된 겔로부터 종래의 방법으로 단백질 성분을 각각 추출하고 미합중국의 Applied Biosystems사 판매의 단백질 시퀀서인 "MODEL 473A"를 사용하여 N 말단영역에서의 아미노산 서열을 분석한 결과, 분자량 약 25,000 달톤의 밴드로부터 추출된 성분은 부분 아미노산 서열로서 서열번호(SEQ ID NO:) 4(여기서 부호 "Xaa"는 "아스파라긴" 또는 "아스파르트산"임)의 아미노산 서열을 가진 반면, 분자량 약 10,000 달톤의 밴드로부터 추출된 성분은 N 말단영역에서 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다. 이로부터 본 발명의 효소는 상이한 분자량을 가진 두종류의 부단위를 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 4-1 : 선구물 제조

0.5ml 용량의 반응관에 10× PCR 완충액 10㎕, 2.5mM dNTP 1㎕, 5단위/㎕ Taq DNA 폴리메라아제 용액 0.5㎕, 및 본 발명의 동일한 출원인에 의한 일본국 특허공개 제193,098/96호 공보에 개시된 재조합 DNA pHIGIF 1ng를 넣었다. 이 혼합물에 폴리펩티드를 코우드하는 영역을 가진 cDNA에 대해 서열번호(SEQ ID NO:) 7의 뉴클레오티드 서열에 근거하여 화학합성한 뉴클레오티드 서열5'-AAGGCCAGTGTGCTGGGCCTGGACAGTCAGCAAGG-3' 및 5'-ACAGCCAGTGTGATGGCTAGTCTTCGTTTTGAACAG-3'을 가진 올리고뉴클레오티드를 20 pmole씩의 양으로 가하고 멸균 증류수로 100㎕의 체적이 되게 하였다. 수득한 혼합물을 종래방식으로 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분의 순서로 30사이클 인큐베이트하여 PCR반응을 시켰다. "TAKARA PCR AMPLIFICATION KIT"(일본국의 Takara Shuzo사 판매)를 PCR반응용 시약으로 사용하였다.

이 반응 생성물을 통상의 방법으로 제한효소 Bst XI로 절단하고, 수득한 약 800 염기쌍(bp)의 DNA 단편을 0.1㎍ 용기에 넣고, 적당량의 멸균 증류수에 용해시킨후 제한효소 Bst XI로 절단해 둔 "pRc/CMV"(네델란드국의 Invitrogen BV사 판매의 플라스미드 벡터) 10ng, 적당량의 10× 라이게이션 완충액(ligation buffer) 및 T4 리가아제와 혼합하고 최종농도가 1mM 되도록 10mM ATP를 가한 다음, 이 혼합물을 16℃에서 18시간 인큐베이트하여 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pRC/CMV에 도입하였다. 이렇게 하여 수득한 재조합 DNA를 에세리히아 콜리 JM109주에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음 앰피실린 50㎍/ml를 함유한 L-브로드(broth)(pH 7.2)에 접종한후 37℃에서 18시간 인큐베이트하였다. 이어서 증식된 세포를 배양물로 부터 채취하고 알칼리-SDS법으로 처리하여 재조합 DNA를 추출하였다. 이 재조합 DNA를 "pRCHuGF"로 명명하고, 디데옥시법을 사용하여 뉴클레오티드 서열을 분석한 결과, 도 1에 나온 구조를 가지고 있음이 판명되었다. 도 1에 나온 바와 같이 pRCHuGF는 cDNA HuIGIF를 가지고 있는데, 이것은 폴리펩티드의 선구물을 코우드하는 서열번호(SEQ ID NO:) 7의 뉴클레오티드 서열을 가지며 거대세포 바이러스 프로모우터 (PCMV)의 하류에 결합되어 있다.

중국산 햄스터의 난소 유래의 CHO-K1 세포(ATCC CCL61)의 종배양물을 10v/v％ 소태아 혈청이 보충된 Ham's F12 배지(pH 7.2)에 접종하고 배양하여 증식시켰다. 이어서 증식된 세포를 채취하여 인산 완충 식염수(이하, 간단히 "PBS"라 함)로 세척하고 PBS중에 세포밀도 1× 10⁷개/ml가 되도록 부유시켰다. 이 현탁액 0.8ml와 재조합 DNA pRCHuGF 10㎍을 쿠벳(cuvette)에 넣고 이 혼합물을 10분간 얼음냉각한 후 "GENE PULSER^TM"(일본국의 Japan Bio-Rad Laboratories사 판매의 일렉트로포레이션 장치)에 넣고 방전 펄스를 일회 가한 다음 쿠벳을 신속히 제거하여 10분간 얼음 냉각하였다. 이어서 쿠벳에서 세포 현탁액을 회수하여 10v/v％ 소태아 혈청이 보충된 Ham's F12배지(pH 7.2)가 접종하고 5v/v％ CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 3일간 배양한 다음, 여기에 최종 농도가 400㎍/ml가 되도록 G418을 가하고 위와 동일한 조건하에서 3일간 배양하였다. 약 100콜로니중에서 48콜로니를 선별하고, 선별된 것들 중의 일부를 10v/v％ 소태아 혈청이 보충된 Ham's F12배지(pH 7.2)가 분산된 배양 플레이트에 접종하여 위와 마찬가지로 일주일 동안 배양하였다. 이어서 각 웰에 5.1mM 염화 마그네슘, 데옥시콜산 0.5w/v％, 계면 활성제 "NONIDETP-40" 1w/v％, 아프로티닌 10㎍/ml 및 SDS 0.1w/v％을 함유한 10mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5)를 가하여 플레이트의 각 웰중의 세포를 용해시켰다.

수득한 세포 용해물중의 50㎖씩을 취해 용기에 넣은 다음, 최종 농도 2w/v％되는 양으로 50㎕ 글리세롤과 디티오드레이톨을 가하여 37℃에서 1시간 동안 용기를 방치하였다. 이어서 세포 용해물중의 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법으로 분리하고, 겔중의 분리된 폴리펩티드를 통상의 방법으로 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮기고, 본 발명의 동일한 출원인에 출원된 일본국 특허공개 제231,598/96호 공보에 개시된 바와 같은 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 H-1주의 앞서 얻은 배양 상청액중에 1시간 동안 침지한후 0.05v/v％ tween 20을 함유한 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 세척함으로써 과잉량의 모노클로날 항체를 제거하였다. 양고추냉이 유래의 퍼옥시다아제로 표지된 토끼 유래의 앤티마우스 면역글로불린 항체를 함유한 PBS중에 니트로셀룰로오스 멤브레인을 1시간 동안 침지하고, 0.05v/v％ tween 20을 함유한 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 세척한후 과산화 수소 0.005v/v％와 디아미노 벤지딘 0.3mg/ml을 함유한 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)중에 침지하여 발색시켰다. 착색도에 따라 폴리펩티드의 선구물을 보다 많이 생성한 형질 전환체의 클론을 선택하여 "RCHuGF"로 명명하였다.

이 형질 전환체 RCHuGF를 G418 400㎍/ml와 10v/v% 소태아 혈청이 보충된 Ham's F12 배지(pH 7.2)가 분산된 정사각형 배양 플라스크에 접종하고 필요할 때마다 신선한 배지로 교체해주면서 5v/v％ CO₂ 인큐베이터중에서 37℃에서 1주일 동안 유지하였다. 이어서 적당량의 "TRYPSIN-EDTA"(미합중국의 Life Technologies사의 GIBCO Laboratories 판매의 트립신)을 가하여 플라스크의 벽에 붙은 세포를 분리하고, 분리된 세포를 PBS로 세척한후 다시 10mM 염화 칼륨, 1.5mM 염화 마그네슘 및 0.1mM 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 2나트륨염을 함유한 빙냉의 20mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 세척하고 동일한 신선한 완충액 3배 체적중에서 20분 동안 방치하였다. 이어서 세포를 통상의 방법으로 파쇄하고 10,000× g에서 30분간 원심분리하여 폴리펩티드의 선구물을 함유한 상청액을 얻었다, 이 선구물의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 약 24,000 달톤이었고 N 말단영역에서의 서열번호(SEQ ID NO:) 1의 아미노산 서열을 가지고 있었다.

실시예 4-2 : 선구물의 변환

글리세롤 10v/v％, CHAPS 0.1w/v％ 및 2mM 디티오드레이톨을 함유한 100mM Hepes 완충액(pH 7.4)중에 농도 500nM이 되도록 실시예 4-1의 폴리펩티드의 선구물을 용해하여 기질 용액을 제조한후, 여기에 실시예 1의 효소 용액 350 단위/ml을 혼합한 다음 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 개시한지 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간 및 18시간 후에 반응 혼합물의 일부를 각각의 샘플링시간 마다 샘플링하고, 최종 농도 200㎍/ml이 되도록 요오도아세트아미드를 혼합하여 반응을 정지시켰다. 본 발명의 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허출원 제231,598/96호 공보에 개시된 바와 같이 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅법(Western Blotting method)을 상기 반응 혼합물에 적용하여 선구물의 활성형으로의 변환 도중의 경과시간에 따른 변화를 조사하였다.

각 샘플링 시간 마다 채취된 각 샘플의 활성 폴리펩티드의 함유량을 인간의 급성 골수구 백혈병 유래의 단핵세포주인 KG-1세포(ATCC CCL246)를 사용하는 생물학적 검정법으로 추산하였다. 생물학적 검정법을 다음과 같이 실시하였다. 즉, 10v/v％ 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(pH 7.4)중에 세포밀도 1.5× 10⁶개/ml가 되도록 KG-1세포를 부유시키고, 이 세포 부유물을 각 웰당 0.1ml의 양으로 96웰 마이크로플레이트에 나누어 넣었다. 이 마이크로플레이트를 10v/v％ 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(pH 7.4)로 희석한 후에 여기에 상기 반응 혼합물을 각 웰당 0.1ml의 양으로 가한 다음, 5v/v％ CO₂ 인큐베이터중에서 37℃에서 24시간 동안 유지하였다. 이어서 마이크로플레이트의 웰중의 각 상청액을 0.1ml씩을 샘플링하여 종래의 효소 면역 검정법을 사용하여 IFN-γ를 정량하였다. 그 결과는 표 1에 나와 있다. 표 1의 IFN-γ 함유량은 미합중국의 국립보건 연구원(NIH)으로부터 입수한 IFN-γ 표준물인 Gg23-901-530에 대하여 국제 단위로 환산하여 나타내었다.

표 1

도 2의 웨스턴 블로팅에 나온 바와 같이, 이 반응조건하에서 선구물에 상응한 분자량 약 24,000 달톤의 단백질 밴드는 반응 개시후 3시간 이내에 점차로 소멸한 반면, 분자량 약 18,200 달톤의 밴드는 나타나 있었다. 표 1의 IFN-γ 함유량은 이 결과와 잘 일치하였다. 즉, 반응 생성물로서의 IFN-γ 의 산생능은 활성 폴리펩티드에 상응한 약 18,200 달톤의 분자량을 가진 밴드로서 점차 증가하였다. 이들 결과로부터 본 발명의 효소는 폴리펩티드의 선구물에 작용하여 이 선구물을 면역 담당 세포에서의 IFN-γ 생성을 유도하는 활성형으로 변환한다는 것을 알 수 있다.

실시예 4-3 : 활성 폴리펩티드의 이화학적 성질

실시예 4-3(a) : 활성 폴리펩티드의 정제

실시예 4-2에서의 18시간 인큐베이션후의 반응 혼합물을 10mM 인산 완충액(pH 6.8)에 대해 투석한후 10mM 인산 완충액(pH 6.8)으로 평형화시켜둔 "DEAE 5PW"(일본국의 Tosoh사 판매의 이온교환 크로마토그래피용 겔)의 칼럼을 통과시키고, OM로부터 0.5M로 증가하는 염화 나트륨의 직선 기울기 하에서 10mM 인산 완충액(pH 6.8)을 통액한 다음, 약 0.2∼0.3M의 염화 나트륨 농도에서 용출한 획분을 채취하였다.

이들 획분을 한데 모아 PBS에 대해 투석하고, 본 발명의 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허출원 제231,598/96호에 개시된 방법에 준하여 모노클로날 항체를 사용하는 면역 친화성 크로마토그래피용 겔을 준비하고 이 겔을 플라스틱제 원통 내부에 칼럼상으로 주입한후 이 칼럼을 PBS로 세척한 후에 상기 투석액을 칼럼 속으로 통과시켰다. 이 칼럼에 100mM 글리신-HCl 완충액(pH 2.5)을 통과시켜 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 활성형을 함유한 획분을 채취하였다.

이들 획분을 한데 모아 멸균 증류수에 대해 투석하고 멤브레인 필터로 농축한후 동결건조하여 정제된 고상의 활성 폴리펩티드를 얻었다.

실시예 4-2(b) : 폴리펩티드의 분자량

문헌[U. K. Lemuli in Nature, Vol. 227, pp.680-685 (1970)]에 보고된 방법에 준하여 실시예 4-3(a)의 정제 폴리펩티드를 환원제로서의 디티오드레이톨 2w/v％ 존재하에 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과 약 18,000∼19,500 달톤에 상응한 위치에서 주밴드를 나타내었다. 이 데이타로부터 본 발명의 효소는 분자량이 약 24,000 달톤인 폴리펩티드 선구물에 작용하여 이 선구물을 원래의 분자량 보다 훨씬 낮은 분자량을 가진 활성형으로 변환함을 알 수 있다. 이 실험에 사용된 분자량 마아커는 분자량 67,000 달톤의 소혈청 알부민, 분자량 45,000 달톤의 난알부민, 분자량 30,000 달톤의 탄산 탈수효소, 분자량 20,100 달톤의 대두 트립신 저해제, 및 분자량 14,400 달톤의 α -락토알부민이었다.

실시예 4-3(c) : N 말단영역에서의 폴리펩티드의 아미노산 서열

미합중국의 Applied Biosystems사 판매의 단백질 시퀀서인 "MODEL 473A"를 사용하는 종래의 분석법으로 분석한 결과, 실시예 4-3(a)의 활성 폴리펩티드는 N 말단영역에서의 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다. 이 데이타로부터 본 발명의 효소는 폴리펩티드 선구물에 작용하여 아스파르트산 36과 티로신 37 사이의 폴리펩티드 결합을 절단하였다는 것을 알 수 있다.

실시예 5 : 효소에 미치는 저해제의 활성

실시예 4-2의 선구물에 대한 변환방법에 있어서, 실시예 1의 본 발명의 효소에 5μ M Ac-YVAD-CHO 또는 650μ M 요오도아세트아미드를 가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 각 반은 혼합물을 2w/v％ 디티오드레에이톨 존재하에 겔 15w/v％을 사용하는 SDS-PAGE에서 분리한 다음, 일본국 특허공개 제231,598/96호 공보에 개시된 바와 같이 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅법으로 분석한 결과, 각 겔에서는 활성형에 상응한 밴드가 전혀 검출되지 않았음이 판명되었다. 이것은 Ac-YVAD-CHO 및 요오도아세트아미드가 본 발명의 효소에 활성 저해제로서 작용하였음을 나타내는 것이다.

실시예 6 : 효소 제조

기공 크기가 0.5μ 인 멤브레인 필터가 장치된 약 10ml 용량의 플라스틱제 원통형 확산 체임버내에 수용된 RPMI 1640배지에 인간 조직구 임파종 유래의 골수성 단구세포인 U-937세포(ATCC CRL1593.2)를 부유시켰다. 이 체임버를 성장한 래트의 복강내에 매설한 다음 종래의 방법으로 4주 동안 사육한후 래트로부터 체임버를 분리하였다. 체임버로부터 증식 세포를 채취하여 PBS로 세척하고 실시예 1과 마찬가지로 파쇄한 다음, 이 혼합물을 정제하여 본 발명의 효소를 래트 한마리당 약 5 단위의 수득량으로 얻었다.

실시예 7 : 효소 제조

10v/v％ 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640배지(pH 7.2)중에 인간 전골수 세포성 백혈병 유래의 골수성 단구세포인 HL-60세포(ATCC CCL240)를 세포밀도 약 3× 10⁵개/ml되도록 부유시키고 5v/v％ CO₂인큐베이터에서 동일한 신선한 배지를 교체해주면서 37℃에서 3주 동안 배양하였다. 이 배양물로부터 증식 세포를 채취하여 PBS로 세척하고 실시예 1과 마찬가지로 균질화한 다음, 수득물을 정제하여 본 발명의 효소를 배양물 1L당 약 30 단위의 수득량으로 얻었다.

이렇게 하여 실시예 2 내지 5의 방법으로 얻은 수득한 효소의 이화학적 성질을 분석한 결과, 이 효소는 실시예 1에서와 동일한 효소활성, 분자량 및 부분 아미노산 서열을 가지고 있으며, 효소활성은 Ac-YVAD-CHO 및 요오도아세트아미드에 의해 저해되었음이 확인되었다.

이상과 같이 본 발명은 면역담당 세포에서 IFN-γ 생성을 유도하는 폴리펩티드의 선구물을 그 활성형으로 변환하는 효소의 발견에 근거하여 된 것이다. 이러한 활성을 가진 본 발명의 효소는 인간 세포의 경우에서와 마찬가지의 처리를 받고, (1) 본래부터 폴리펩티드를 생성하는 세포와 이 효소를 접촉시키거나, 또는 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 도입하여 형질 전환시킨 포유동물의 숙주세포 유래의 폴리펩티드의 선구물과 이 효소를 접촉시키고, 혹은 (2) 이 효소를 코우드하는 DNA와 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 모두 포유동물의 숙주세포속에 도입하여 이들 DNA를 발현시킴으로써 얻어지는 활성형의 생산을 가능하게 한다. 이 효소는 세포를 공급원으로 사용하는 본 발명의 방법에 의해 필요로 하는 양을 생산할 수 있다.

이러한 유용한 기능과 활성을 가진 본 발명은 이 기술분야에 큰 기여를 할 수 있는 의의가 있는 발명이라 할 수 있다.

[서열표]

(1) 서열번호(SEQ ID NO:) 1의 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이 : 41 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : N 말단 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 1 :

(2) 서열번호 (SEQ ID NO:) 2의 정보:

(ⅰ) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 193 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 2 :

(3) 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 정보 :

(ⅰ) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 5 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : N 말단 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 3 :

(4) 서열번호 (SEQ ID NO:) 4의 정보 :

(ⅰ) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 19 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : N 말단 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 4 :

(5) 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 정보 :

(ⅰ) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 14 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : N 말단 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 5 :

(6) 서열번호(SEQ ID NO:) 6의 정보 :

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이 : 157 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 6 :

(7) 서열번호(SEQ ID NO:) 7의 정보 :

(ⅰ) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 579 염기쌍

(B) 서열의 형 : 핵산

(D) 형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA to mRNA

(ⅸ) 특징 :

(A) 특징을 나타내는 기호 : leader peptide

(B) 존재위치 : 1..108

(C) 특징을 결정하는 방법 : S

(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide

(B) 존재위치 : 109..579

(C) 특징을 결정하는 방법 : S

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 7 :

도 1은 본 발명에 의한 폴리펩티드 선구물(precursor)을 코우드하는 cDNA를 함유한 재조합 DNA pRCHuGF의 구조도.

도 2는 웨스턴 블로팅에 의한 겔 전기영동 패턴을 스크린상에 나타낸 가시화 중간도로서 본 발명의 폴리펩티드 선구물을 활성형으로 변환할 때의 경과시간에 따른 변화를 나타내는 도면.

상기 도면중에서 "PCMV"는 거대세포 바이러스 프로모우터를 뜻하고, "HuIGIF"는 본 발명에 의한 폴리펩티드 선구물을 코우드하는 cDNA를 뜻함.

Claims

면역담당 세포에서 인터페론-γ 생성을 유도하는, 서열번호(SEQ ID NO:) 2의 아미노산 서열(여기서 부호 "Xaa"는 "이소로이신" 또는 "트레오닌"임)을 가진 폴리펩티드의 선구물에, 인간 조혈세포로부터 수득되고, 아래의 이화학적 성질 (1) 내지 (3)을 가진 효소를 작용시켜, 상기 선구물의 N 말단 영역에서 서열번호(SEQ ID NO:) 1에서의 아스파르트산 36 및 티로신 37 사이의 결합을 절단하여 상기 선구물을, 서열번호(SEQ ID NO:) 6의 아미노산 서열(여기서 부호 "Xaa"는 "이소로이신" 또는 "트레오닌"임)을 가진 그 활성형으로 변환시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 변환방법.

서열번호(SEQ ID NO:) 1

선구물의 아미노산 서열번호(SEQ ID NO:) 2

이화학적 성질

(1) 분자량:

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분자량 25,000 및 10,000 달톤을 나타냄.

(2) 부분 아미노산 서열

서열번호(SEQ ID NO:) 4(여기서 "Xaa"는 "아스파라긴" 또는 "아스파르트산" 임) 및 서열번호(SEQ ID NO:) 5로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가짐.

서열번호 4:

서열번호 5:

(3) 저해제

아세틸-L-티로실-L-발릴-L-알라닐-L-아스파르트-1-알 및 요오도아세트아미드에 의해 저해됨.

상기 선구물의 활성형의 아미노산 서열:

서열번호(SEQ ID NO:) 6