JP2004215669A - アポトーシス阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】アポトーシスを阻害し得る組成物を提供する。
【解決手段】アポトーシス阻害のための組成物であって、（ａ）ＡＰＯ−１阻害化合物、（ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害する化合物、および、（ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物、から成る群より選択される成分を１以上含有し、該成分が個体内の異物とも、従来の賦形剤ともみなされない組成物に関するものである。さらに、アポトーシス阻害に適した化合物であって、個体内で異物とみなされない１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび個体内で異物とみなされない担体を有している化合物に関するものである。
【選択図】なし

Description

本発明はアポトーシスを阻害する組成物に関するものである。さらに、本発明は、アポトーシスの阻害に好適な化合物、並びにその製造方法に関するものである。

アポトーシスは、計画された細胞死を意味する用語である。アポトーシスは例えば、器官の発達、変態、隆形成、および腫瘍の後退等においてみられる。アポトーシスは、細胞質の濃縮、原形質膜毛の喪失、核の分節化、および染色体ＤＮＡのはなはだしい放壊によって達成される（非特許文献１）。

アポトーシス陽性細胞はしばしば、ＡＰＯ−１と呼ばれる細胞表面のタンパク質を含んでいる。この糖タンパク質は、腫瘍壊死因子／神経成長因子レセプター群に分類されている。ＡＰＯ−１が抗ＡＰＯ−１抗体と架橋結合することにより、前述の細胞中でアポトーシスが誘発される（前記非特許文献１を参照）。ＡＰＯ−１リガンドと呼ばれる可溶性または膜結合性タンパク質がＡＰＯ−１に結合することによって、同じ現象が生じると思われる（非特許文献２）。

しかしながら、アポトーシスの阻害については何も知られてはいない。
Ｏｅｈｍ， Ａ． 等、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２６７，Ｎｏ．１５，１９９２，ｐｐ１０７０９−１０７１５ Ｓｕｄａ Ｔ，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｔｈｅ Ｒｏｃｋｆｅｌｌｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌ，１７９，１９９４，ｐｐ８７３−８７９

出願人の最近の研究により、アポトーシスは、例えばエイズや自己免疫疾患等のさまざまな病気でも起こることが明らかとなったため、その阻害は必要であろう。エイズの場合には、アポトーシスはＣＤ４−Ｔ細胞の激減に対する反応であると考えられている。

従って、本発明はアポトーシスを阻止し得る組成物を提供することを目的とする。

本発明に従って、
（ａ） ＡＰＯ−１阻害化合物
（ｂ） ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉する化合物
（ｃ） 細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物
から成る群より選択される成分を１以上含み、該成分が個体内において異物とみなされないことを特徴とする組成物を提供することにより、この目的を達成する。

「ＡＰＯ−１阻害化合物」という表現は、ＡＰＯ−１を阻害するのに適したいかなる化合物をも含む。好ましくは、その化合物は、非細胞毒性の抗ＡＰＯ−１阻止抗体またはＦｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体（例えば抗ＡＰＯ−１抗体のＦ(ａｂ)、Ｆ(ａｂ)_２、またはＦｖ断片）である。そのような断片は普通の当業者が行っている方法によって、（例えば根拠として、Oehm等、前出に記載されている抗ＡＰＯ−１抗体、またはDhein, J. 等、The Journal of Immunology Vol. 149, No.10, 1992, pp.3166-3173 に記載されている抗ＡＰＯ−１Ｆ(ａｂ)₂ 断片を用いて）調製される。後者は直接的に用いることができる。

上述の抗体でのＦｃ部分の欠如は、結合したＡＰＯ−１の架橋を防ぎ、従ってアポトーシスの誘発を防ぐ。驚いたことに、ＡＰＯ−１はこのような抗体によって阻害される。

ＡＰＯ−１リガンドのアナログが、別の好ましい「ＡＰＯ−１−阻害化合物」として言及されるべきである。このアナログはＡＰＯ−１と結合はするが、もはや細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を誘導しない。このようなアナログは、例えば根拠としてSuda, T.およびNagata, S.前出に記載されているＡＰＯ−１リガンド等を用いて、当業者によって普通に調製できる。

「ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉する化合物」という表現は、ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉するのに好適ないかなる化合物をも含む。好ましくは以下の化合物の一つである。

・抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、
・ＡＰＯ−１、
・細胞外ＡＰＯ−１ドメイン、
・少なくとも１つの細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体を含む化合物
・ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有するペプチド、および
・ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有する少なくとも１つのペプチドおよび担体からなる化合物
このような化合物は通常の方法で調製できる。抗ＡＰＯ−１リガンド抗体の作成には、当業者は例えば前出のSuda, T.およびNagata, S.に記載されているＡＰＯ−１を基礎として用いる。当業者は、抗体のＦｃ部分が個体中で異物とされない事実に注目している。当業者はこれを可能にしている工程をよく知っている。さらに当業者は、例えばＥＰ−９２ １０７ ０６０．３に記載されているＡＰＯ−１およびそのＡＰＯ−１細胞外ドメインを、ＡＰＯ−１およびＡＰＯ−１細胞外ドメイン作成の基礎としてそれぞれ利用する。加えて、当業者は例えば、前述のＡＰＯ−１リガンドおよび前述のＡＰＯ−１およびその細胞外ドメインそれぞれの組合せも、ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有するペプチドの作成のために利用する。

少なくとも１つのＡＰＯ−１細胞ドメインおよび担体を含む化合物の作成方法が以下の実施例に記載されている。ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有する少なくとも１つのプペチドおよび担体を含む化合物を同様に作成することが可能である。

「細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物」という表現は、細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を適切に阻害し得るいかなる化合物をも含む。以下の化合物の１つが好ましい。

・「インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）」阻害剤、特に、３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）、ＩＣＥ特異的テトラペプチドであるＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ワクシニアウイルスタンパク質であるＣｒｍＡまたはそれらの誘導体。ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＣｒｍＡまたはそれらの誘導体を、発現可能な核酸として使用するのが好適である。さらに、ＩＣＥ−アンチセンス核酸およびそれらの誘導体をＩＣＥ阻害剤として用いるのも好ましい。

・構造的にＩＣＥに関連しているプロテアーゼ群、特にＮｅｄｄ−２／Ｉｃｈ−１またはｐｒｉＣＥの阻害剤
このような阻害剤化合物を普通に調製できる。ＤＣＩおよびそれらの誘導体の製造において、当業者は、例えばＨａｒｐｅｒ, J., W.等、Biochemistry, 24, 1831-1841, 1985.の研究に戻るであろう。さらに当業者は、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ, N., A. 等、Nature 356, 768-774 1992の、ＹＶＡＤ−ＣＨＯおよびその誘導体それぞれについての研究を考慮するであろう。加えて、当業者は、例えば、Ｒａｙ, C., A.等、Cell 69, 597-604, 1994のＣｒｍＡまたはそれらの誘導体についての研究を考慮するであろう。そのうえ、当業者は、例えば、Ｃｅｒｒｅｔｔｉ等，Science 256, 97-100, 1992 、の、ＩＣＥアンチセンス核酸およびその誘導体それぞれに関する研究を参考にするであろう。さらに、Ｗａｎｇ, L.等、Cell 78, 739-750, 1994およびＬａｚｅｂｎｉｋ, Y. A. 等、Nature 371, 346-347, 1994 の研究に、プロテアーゼＮｅｄｄ−２／Ｉｃｈ−１およびｐｒｉＣＥそれぞれに関して戻るであろう。

本発明に従って、前述の組成物は、特に、ＨＩＶ感染関連疾患におけるアポトーシスの阻害に用いられる。これに関連して、本発明の組成物は、個体内で異物として認識されない１以上の以下の成分をさらに含む場合に特に有用であることが証明されている。

（ａ） ＴＡＴレセプターを阻害する化合物
（ｂ） ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉する化合物
（ｃ） 細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害する化合物
（ｄ） ＣＤ４レセプターを阻害する化合物
（ｅ） ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉する化合物、および、
（ｆ） 細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害する化合物
「ＴＡＴレセプターを阻害する化合物」という表現は、ＴＡＴレセプターを阻害するのに適当ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは、抗ＴＡＴレセプター抗体である。この抗体は通常の方法で調製される。当業者は抗体のＦｃ部分が個体内で異物とみなされない点に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程を熟知している。

ＴＡＴアナログもまた、別の好適な「ＴＡＴレセプターを阻害する化合物」として言及されるべきである。そのような化合物はＴＡＴレセプターに結合するがもはや細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を誘導しない。このようなアナログは通常の方法で当業者が、例えば、Ａｒｙａ, S., K.等、Scicence, Vol. 229, 1985, pp.69-73、等を基本として用いて調製できる。

「ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉する化合物」という表現は、ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉するのに好適ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは以下の化合物の１つである。

・抗ＴＡＴ抗体
・ＴＡＴレセプター
・細胞外ＴＡＴレセプタードメイン
・１以上の細胞外ＴＡＴレセプタードメインおよび担体を含む化合物
・ＴＡＴ結合部位を有するペプチド
・ＴＡＴ結合部位を有する１以上のペプチドおよび担体を含む化合物
・核酸塩基のＴＡＴ結合部位
・トランスドミナント（transdominant ）ＴＡＴ変異体
このような化合物は通常の方法により調製できる。抗ＴＡＴ抗体の作成のために、当業者は、例えば、前出のＡｒｙａ, S.,K. らに記載されているＴＡＴを基礎として用いるであろう。当業者は、抗体のＦｃ部分が個体内で異物とされないという事実に注意を払うであろう。当業者はこれを可能にする工程に精通している。さらに、当業者は、例えば、Ｆｅｎｇ, S.およびＨｏｌｌａｎｄ, E., C., Nature, Vol. 334, 1988, pp. 165-167 、に記載されているＴＡＴ−ＬＴ Ｒ配列を、核酸塩基上のＴＡＴ結合部位に関する基礎として用いるであろう。さらに当業者は、例えば、Ｅｃｈｅｔｅｂｕ, C., O.およびＲｉｃｅ, A., P., J. Acquir. Immune Def, Syndrome, Vol. 6, 1993, pp. 550-557、に記載されている変異体を、トランスドミナントＴＡＴ変異体に関する基礎として用いるであろう。

「細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害する化合物」という表現は、細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害するために適当ないかなる化合物をも含む。

「ＣＤ４レセプターを阻害する化合物」という表現は、ＣＤ４レセプターの阻害のために適当ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは抗ＣＤ４レセプター抗体である。そのような化合物は、当業者が例えば、Ｃａｐｏｎ, D., J.およびＷａｒｄ, R., H., R., Annu, Rev. Immunol, 9, 1991, pp. 649-678に記載されているＣＤ４レセプターを基礎として用いて普通に調製できる。当業者は抗体のＦｃ部分が個体内で異物とされないという事実に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程を熟知している。

ｇｐ１２０アナログを別の好ましい「ＣＤ４レセプターを阻害する化合物」として言及する。ｇｐ１２０アナログはＣＤ４レセプターに結合するが、もはや細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を誘導しない。そのようなアナログは、当業者が、例えば前出のＣａｐｏｎ, D., J.およびＷａｒｄ, R., H., R., に記載されているｇｐ１２０を基礎として用いる通常の方法により調製できる。

「ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉する化合物」という表現は、ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉するために適当ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは、以下の化合物の１つである。

・抗ｇｐ１２０抗体
・ＣＤ４レセプター
・細胞外ＣＤ４レセプタードメイン
・１以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメインおよび担体を含む化合物
・ｇｐ１２０結合部位を有するペプチド
・ｇｐ１２０結合部位を有する１以上のペプチドおよび担体を含む化合物
このような化合物は通常の方法により調製できる。抗ｇｐ１２０抗体の作成のために、当業者は、例えば、前出のＣａｐｏｎ, D., J.およびＷａｒｄ, R., H., R., に記載されているｇｐ１２０を基礎として利用するであろう。当業者は抗体のＦｃ部分が個体内で異物として認識されないという事実に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程に精通している。さらに当業者は、前出のＣａｐｏｎ, D., J.,およびＷａｒｄ, R., H., R., に記載されているＣＤ４レセプターおよびその細胞外ＣＤ４レセプタードメインをそれぞれ、ＣＤ４レセプターおよび細胞外ＣＤ４レセプタードメインの作成に関する基礎として利用するであろう。さらに、当業者は、例えば上述のｇｐ１２０およびＣＤ４レセプターおよびその細胞外ドメインの組合せをそれぞれ、ｇｐ１２０結合部位を有するペプチドの作成に利用するであろう。

１以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメイン、および１以上のｇｐ１２０結合部位を有するペプチドそれぞれ、ならびに担体を含む化合物の作成は、以下に記載された、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体からなる化合物の場合と同様に実施できる。

「細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害する化合物」という表現は、細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害するために適当ないかなる化合物をも含む。

上述の組成物は、個々の成分の1から数種類の化合物を有していても差支えないと解する。

本発明に基づき、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体からなる化合物が提供され、そのドメインおよび担体は個体内で異物とはみなされない。

「担体」という表現は、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインが結合し得るいかなる化合物をも含む。

より好適な実施例において、担体は、例えば血清アルブミン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、コラーゲンなどのタンパク質、または抗体のＦｃ部分であり、後者が好ましい。特に好ましい実施例では、本発明の化合物は融合タンパク質である。

本発明の化合物は通常の方法で調製できる。融合タンパク質の場合は、以下の作成工程が好ましいことが判明している。

（ａ）１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよびその３’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを公知のＰＣＲ技術により増幅させ、
（ｂ）タンパク質担体およびタンパク質担体の５’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを公知のＰＣＲ技術により増幅させ、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）により増幅されたＤＮＡを組み合わせて、更に、公知のＰＣＲ技術により、ＡＰＯ−１領域の５’末端ＤＮＡに対応するプライマーおよびタンパク質担体の３’末端ＤＮＡに対応するプライマーを用いてそれらＤＮＡを増幅させて、両方のＤＮＡが融合した増幅ＤＮＡ断片を得て、
（ｄ）工程（ｃ）のＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入し、通常の方法でＤＮＡ断片を発現させる。

好ましい実施例において、（ａ）および（ｂ）の結合領域は、抗体ヒンジ領域あるいはその一部分である。さらには、それはトロンビン分解部位であってもよい。

前述の作成工程において、さまざまなＤＮＡが公知のＰＣＲ技術により増幅される。当業者は、１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインをコードするＤＮＡと同様に、例えば前出のＥＰ−９２ １０７ ０６０．３記載のＤＮＡを利用するであろう。当業者は、その３’末端に結合領域をコードするＤＮＡを結合させるであろう。ヒト抗体のヒンジ領域またはその一部分をコードするＤＮＡの場合は、当業者は、例えば、Duebel, S.,等、Methods in Molecular and Cellular Biology, Vol.3, 1992, pp.47-52 へと戻るであろう。タンパク質担体、例えば、ヒト抗体のＦｃ領域をコードしているＤＮＡに関しては、当業者は、前出のDuebel, S.等に記載されているＤＮＡへと戻るであろう。

動物の細胞中での発現にはｐＣＤＮ８３，ｐＣＥＶ４，およびｐＣＤＭ８等の公知のベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用にはｐＧＥＭＥＸおよびｐＵＣ等の公知のベクターを用いて、並びに酵母での発現用にはｐＹ１００およびＹＣｐＡＤ１等の公知のベクターを用いて、増幅したＤＮＡ断片を発現させる。Ｌ ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、動物細胞として特に適切であるが、Ｅ．ｃｏｌｉは原核生物として、およびサッカロミセスおよびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は酵母細胞として、特に適切であることを言及しておかねばならない。

本発明の化合物はアポトーシスの阻害に非常によく適している。この目的のため、個体内で異物とは見なされない1以上の以下の成分の組合せを用いることができる。

（ａ） ＡＰＯ−１阻害化合物
（ｂ） ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害し捕捉する他の化合物
（ｃ） 細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物
個々の成分の記述については（ａ），（ｂ）および（ｃ）についてはすでに言及してある。これらの記述はここでも一致して適用される。

本発明の化合物は、ＨＩＶ感染に関連した疾患におけるアポトーシスの阻害に特に適している。この目的のため、本発明の化合物は、個体内で異物と見なされない1以上の以下の成分の組合せを用いることができる。

（ａ） ＡＰＯ−１阻害化合物
（ｂ） ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ阻害および捕捉する別の化合物
（ｃ） 細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物
（ｄ） ＴＡＴレセプターを阻害する化合物
（ｅ） ＴＡＴをそれぞれ阻害および捕捉する化合物
（ｆ） 細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害する化合物
（ｇ） ＣＤ４レセプターを阻害する化合物
（ｈ） ｇｐ１２０をそれぞれ阻害または捕捉する化合物、および
（ｉ） 細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害する化合物
個々の成分（ａ）から（ｉ）については、前記のように言及されており、成分（ｄ）−（ｉ）は前述した（ａ）−（ｆ）のように言及される。前の記述はここでもそれに応じて適用される。

本発明は、アポトーシスが重要な役割を果たす疾患の新しい治療法を提供するものである。本発明は、特に、エイズ治療の突破口となることを想定している。

以下の実施例により本発明を説明する。

実施例１：抗体ヒンジ領域を介して、細胞外ＡＰＯ−１ドメインをヒト抗体Ｆｃ部分に融合させた融合タンパク質の作成
前述の融合タンパク質の調製のため、細胞外ＡＰＯ−１ドメインをコードするｃＤＮＡ（Oehm, A.ら、前出を参照）およびヒト抗体のＦｃ部分（Duebel, S. et al.,前出）をコードするｃＤＮＡについて、公知のＰＣＲ増幅を実施した。

細胞外ＡＰＯ−１ドメインのｃＤＮＡ用に用いられたプライマーは、開始メチオニンをとりまく完全コザック・コンセンサス（Ｋｏｚａｋ−Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）領域の上流にＨｉｎｄIII 部位が導入されている５’ ＧＣＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＴＣ ３’、および細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよびヒンジ領域の最初の１８ｂｐをコードする５’ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＴＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ３’である。

Ｆｃ部分のｃＤＮＡ用に用いられたプライマーは、ヒンジ領域の最初の１８ｂｐおよびＦｃ部分の５’末端領域をコードする５’ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ３’、およびＦｃ部分の３’末端をコードし、停止コドンの下流にＸｂａＩ部位を導入する５’ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ３’である。

得られたＰＣＲ産物を、低融点アガロースゲルにより分離し、適当な分子量のＤＮＡ分子を含むゲル小片を集めた。そのサンプル自体について更にＰＣＲ増幅を行った。用いたプライマーは、それぞれ細胞外ＡＰＯ−１ドメインの５’末端およびＦｃ部分の３’末端に対応するもののみであった。このように、共通ヒンジ領域を介して、細胞外ＡＰＯ−１ドメインをＦｃ部分に融合させることが可能であった。「融合」ＤＮＡ断片を得た。

この断片をＨｉｎｄIII およびＸｂａＩで切断し、アガロースゲルにより精製し、さらにベクターｐＣＤＭ８内にクローン化した。ｐＣＤＭ８のインサートの塩基配列をジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法により決定した。

実施例２：ｈｕ ＡＰＯ−１−Ｉｇおよび抗ＡＰＯ−１Ｆ（ａｂ’）_２ それぞれによるアポトーシスの阻害
ＳＫＷ６．４細胞（前出のOehm, A.らを参照）はアポトーシス陽性細胞であり、即ち、その細胞内において、例えば、抗ＡＰＯ−１抗体の結合によりアポトーシスが誘導され得る。

ＳＫＷ６．４細胞を、さまざまな量の実施例１のタンパク質（ｈｕ ＡＰＯ−１−Ｉｇ）および抗ＡＰＯ−１−Ｆ（ａｂ）_２（上記を参照）それぞれの存在下で、抗ＡＰＯ−１抗体とともに２４時間保温した。アポトーシスの阻害を測定した（第１図参照）。

実施例１の融合タンパク質および抗ＡＰＯ−１−Ｆ（ａｂ）_２は、強力なアポトーシス阻害効果を有することが判明した。融合タンパク質において特に強力であった。

実施例３：ＤＣＩ、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、アンチセンスＩＣＥ、およびＣｒｍＡ−ｃＤＮＡそれぞれによるアポトーシスの阻害
Ｌ ９２９−ＡＰＯ−１細胞（Schulze-Osthoff, K. 等、EMBO J. 13, 4587-459, 1994を参照）は、実施例２のＳＫＷ６．４の細胞と同様にアポトーシス陽性である。

（ａ） 抗ＡＰＯ−１抗体によるＩＣＥのタンパク質分解活性の刺激
Ｌ ９２９−ＡＰＯ−１細胞（○）およびＳＫＷ６．４細胞（●）を培養し、抗ＡＰＯ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）とともに第２ａ図に示した期間にわたり処理した。細胞を回収する１０分前に、０．０５％ジギトキシンを用いて細胞を透過性化（permeabilize）し、２０μＭの発蛍光性ＩＣＥ基質、ＤＡＢＣＹＬ−ＹＶＡＤＡＰ−ＥＤＡＮＳ（Bachem, Bubendorf,スイス）とともに保温した。細胞を回収し、励起波長３６０ｎｍ、放出波長４８８ｎｍのＦＡＣＳ分析により分析した。

その結果、ＩＣＥのタンパク質分解活性は抗ＡＰＯ−１抗体により刺激され得ることが判明した。

（ｂ） 抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポトーシスのＤＣＩを用いた阻害
Ｌ ２９ ＡＰＯ−１細胞をＤＣＩ存在下（●４５μＭ、▲１５μＭ）または非存在下（○）で保温した。１時間後、第２ｂ図に示した量の抗ＡＰＯ−１抗体を添加し、細胞とともに７時間放置した。細胞死の割合（％）を、ジフェニルテトラゾリウム塩からのホルマザンの生成により決定した（ＭＴＴアッセイ）。

その結果、抗ＡＰＯ−１抗体により誘導されるアポトーシスはＤＣＩによって阻害されることが判明した。

（ｃ） 抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポトーシスのＹＶＡＤ−ＣＨＯを用いた阻害
Ｌ ２９−ＡＰＯ−１細胞（○）およびＳＫＷ６．４細胞（●）を低張ショックにより透過性化し、第２ｃ図に示されたＹＶＡＤ−ＣＨＯ濃度で３０分間にわたり保温した。細胞を抗ＡＰＯ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）とともに６０分間保温した。アポトーシスは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ｄｙｅ ３３３４２（モレキュラー プローブス ユージーン，ＯＲ）を用いたＤＮＡの断片化により測定した。特異的細胞死（抗ＡＰＯ−１抗体の存在下での細胞死から、抗体非存在下での細胞死を差し引く）のデータを、ＦＡＣＳバンテッジ７Ｄ−サイトメーターを用いた三連での測定により得た。抗ＡＰＯ−１抗体不在下での自発細胞死は７％以下であった。

この結果、抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポトーシスはＹＶＡＤ−ＣＨＯにより阻害されることが判明した。

（ｄ） 抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポトーシスの、アンチセンスＩＣＥおよびＣｒｍＡ−ｃＤＮＡそれぞれを用いた阻害
以下の発現プラスミドを調製した：
ｐＣＡＧＧＳ−ＩＣＥ
第１ストランド合成用のＥＬ４／Ｃ ｍＲＮＡおよびオリゴｄＴプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりネズミＩＣＥ ｃＤＮＡを単離した。１３２２ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマー ５’−ＡＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＧＧ−３’ および ５’− ＣＧＧ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＴＣＡ ＴＣＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＴＡ ＴＴＧ ＧＣ−３’ のペアを用いて作成した。このペアは、ｐＣＡＧＧＳ中にクローン化されたＥ１４／１３ｃＤＮＡ発現コロニーバンクのスクリーニングのための試料として用いられた（Ｎｉｗａ, H.等、Gene 108 , 193-200, 1994. を参照）。１３８７ｂｐのＩＣＥ ｃＤＮＡクローンを得、その配列をＤＮＡの配列決定により決定した。このクローンをｐＣＡＧＧＳ−ＩＣＥと呼ぶ。

ｐＣＡＧＧＳ−アンチセンスＩＣＥ
前出のＩＣＥ ｃＤＮＡの３２０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をｐＣＡＧＧＳ中に逆向きでクローン化した。断片は４８ｂｐの５’ＵＴＲおよびＩＣＥ−オープンリーディングフレームの最初の２５５ｂｐを含む。ｐＣＡＧＧＳ−アンチセンスＩＣＥ発現プラスミドを得た。

ｐＳＶ２５Ｓ−ＣｒｍＡ
プライマーのペア ５’−ＧＣＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＣＧＡ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＣＧ ＡＴＴ ＡＣＴ Ａ−３’および５’−ＣＧＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＧＡ ＧＡＧ−３’を用いてＣｒｍＡをコードするｃＤＮＡを、公知のＰＣＲによってワクシニアウイルスＤＮＡから得た。このｃＤＮＡを、公知のプラスミドｐＳＶ２５Ｓ中にＨｉｎｄIII ／ＫｐｎＩ断片としてクローン化した。このようにｐＳＶ２５Ｓ−ＣｒｍＡ発現プラスミドを得た。

前記の発現プラスミドを、Ｌ ９２９−ＡＰＯ−１細胞の移入に用いた。この目的のために、細胞をＴＢＳバッファーに入れ、氷上で１０分間にわたり平衡化させた。バイオラッドエレクトロポレータ（９６０μＦＤ、２２０Ｖ）を用いて、前述の発現プラスミドをそれぞれ２０μｇずつ細胞内に移入させた。電気穿孔 （エレクトロポレーション）の後、培養用プレートに接種する前に、さらに３０分間細胞を氷上に置いた。１６時間後、洗浄工程により死細胞を除去した。第２ｄ図に示した時間、抗ＡＰＯ−１抗体（１μｍ／ｍｌ）で生細胞を処理した。前述のように、アポトーシスをＨｏｅｃｈｓｔ ｄｙｅ ３３３４２を用いたＦＡＣＳ分析により測定した。２連の実験による細胞死の割合（％）のデータを得た。

その結果、抗ＡＰＯ−１抗体によって誘導されるアポトーシスは、アンチセンスＩＣＥおよびＣｒｍＡそれぞれによって阻害されることが判明した。

第１図は、ｈｕ ＡＰＯ−１−Ｉｇおよび抗−ＡＰＯ−１Ｆ（ａｂ’）_２それぞれによるアポトーシスの阻害を示している。 第２ａ図は、抗ＡＰＯ−１抗体による、ＩＣＥのタンパク質分解活性への影響を示している。 第２ｂ図は、ＤＣＩによるアポトーシスの阻害を示している。 第２ｃ図は、ＹＶＡＤ−ＣＨＯによるアポトーシスの阻害を示している。 第２ｄ図は、アンチセンスＩＣＥおよびＣｒｍＡ−ｃＤＮＡそれぞれによるアポトーシスの阻害を示している。

Claims (20)

1. アポトーシスを阻害する組成物であって、
   （ａ）ＡＰＯ−１阻害化合物、
   （ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害する化合物、および、
   （ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物
   から成る群より選択される成分を１以上含有し、該成分が個体内で異物とみなされないことを特徴とする組成物。
2. 前記成分（ａ）が、
   非細胞毒性抗ＡＰＯ−１阻止抗体、
   Ｆｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体、および、
   ＡＰＯ−１リガンドのアナログ、から成り
   前記成分（ｂ）が、
   抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、
   ＡＰＯ−１、
   細胞外ＡＰＯ−１ドメイン
   １以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体を含む化合物、
   ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有するペプチド、および、
   ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有する一以上のペプチドおよび担体を含む化合物、から成り、
   前記成分（ｃ）が、
   ＩＣＥ阻害剤、および、
   ＩＣＥに構造的に関連するプロテアーゼの阻害剤、から成ることを特徴とする請求項１記載の組成物。
3. 前記成分（ｃ）のＩＣＥ阻害剤が、それぞれ、ＤＣＩ、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＣｒｍＡまたはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項２記載の組成物。
4. 前記成分（ｃ）のＩＣＥに構造的に関連するプロテアーゼが、Ｎｅｄｄ−２／Ｉｃｈ−１またはｐｒｉＣＥであることを特徴とする請求項２記載の組成物。
5. ＨＩＶ感染関連疾患でのアポトーシスを阻害する組成物であって、
   （ａ）ＴＡＴレセプターを阻害する化合物、
   （ｂ）ＴＡＴをそれぞれ捕捉および阻害する化合物、
   （ｃ）細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害する化合物、
   （ｄ）ＣＤ４レセプターを阻害する化合物、
   （ｅ）ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉する化合物、および、
   （ｆ）細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害する化合物
   から成る群より選択される成分を１以上含有し、該成分が個体内で異物とみなされないことを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の組成物。
6. 前記成分（ａ）が、
   抗ＴＡＴレセプター抗体、および
   ＴＡＴアナログ、から成り、
   前記成分（ｂ）が、
   抗ＴＡＴ抗体、
   ＴＡＴレセプター、
   細胞外ＴＡＴレセプタードメイン、
   １以上の細胞外ＴＡＴレセプタードメインおよび担体を含む化合物、
   ＴＡＴ結合部位を有するペプチド、
   ＴＡＴ結合部位を有する１以上のペプチドおよび担体を含む化合物、
   核酸塩基のＴＡＴ結合部位、および
   トランスドミナントＴＡＴ変異体、から成り、
   前記成分（ｄ）が、
   抗ＣＤ４レセプター抗体、および、
   ｇｐ１２０アナログ、から成り、
   前記成分（ｅ）が、
   抗ｇｐ１２０抗体、
   ＣＤ４レセプター、
   細胞外ＣＤ４レセプタードメイン、
   １以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメインおよび担体を含む化合物、
   ｇｐ１２０結合部位を有するペプチド、および、
   ｇｐ１２０結合部位を有する１以上のペプチドを有する化合物、から成ることを特徴とする請求項５記載の組成物。
7. １以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよび担体を有し、該ドメインおよび該担体が、個体内で異物としてみなされないことを特徴とする化合物。
8. 前記担体がタンパク質であることを特徴とする請求項７記載の化合物。
9. 前記タンパク質が抗体のＦｃ部分であることを特徴とする請求項８記載の化合物。
10. 前記化合物が融合タンパク質であることを特徴とする請求項８または９記載の化合物。
11. 請求項１０記載の化合物を製造する方法であって、
    （ａ）１以上の細胞外ＡＰＯ−１ドメインおよびその３’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを公知のＰＣＲ技術により増幅させ、
    （ｂ）担体タンパク質および該担体タンパク質の５’末端に取り付けられた結合領域をコードするＤＮＡを公知のＰＣＲ技術により増幅させ、
    （ｃ）前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）により増幅されたＤＮＡを組み合わせて、更に、公知のＰＣＲ技術により、ＡＰＯ−１ドメインの５’末端に対応するプライマー、および担体タンパク質の３’末端に対応するプライマーを用いてそれらＤＮＡを増幅させて、両方のＤＮＡが融合した増幅ＤＮＡ断片を得て、
    （ｄ）前記工程（ｃ）のＤＮＡ断片を発現ベクター内に挿入し、該ＤＮＡ断片を通常の方法により発現させる各工程より成ることを特徴とする方法。
12. 前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）の前記結合領域が、抗体ヒンジ領域またはその一部であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 請求項７から１０いずれか１項記載の化合物を含むことを特徴とするアポトーシス阻害のための薬剤組成物。
14. （ａ）ＡＰＯ−１阻害化合物、
    （ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害する化合物、および、
    （ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物、
    から成る群より選択される１以上の成分を含み、該成分が個体内で異物とみなされないことを特徴とする請求項１３記載の薬剤組成物。
15. 前記成分（ａ）が、
    非細胞毒性抗ＡＰＯ−１阻止抗体、
    Ｆｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体、および、
    ＡＰＯ−１リガンドのアナログ、から成り、
    前記成分（ｂ）が、
    抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、
    ＡＰＯ−１、
    細胞外ＡＰＯ−１ドメイン
    ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有するペプチド、および、
    ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有する一以上のペプチドおよび担体を含む化合物、から成り、
    前記成分（ｃ）が、
    ＩＣＥ阻害剤、および、
    ＩＣＥに構造的に関連しているプロテアーゼの阻害剤、から成ることを特徴とする請求項１４記載の薬剤組成物。
16. 前記成分（ｃ）のＩＣＥ阻害剤が、ＤＣＩ、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＣｒｍＡまたはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１５記載の薬剤組成物。
17. 前記成分（ｃ）のＩＣＥに構造的に関連するプロテアーゼが、Ｎｅｄｄ−２／Ｉｃｈ−１またはｐｒｉＣＥであることを特徴とする請求項１５記載の薬剤組成物。
18. 請求項７から１０いずれか１項記載の化合物を含むことを特徴とする、ＨＩＶ感染関連疾患でのアポトーシスの阻害のための薬剤組成物。
19. （ａ）ＡＰＯ−１阻害化合物、
    （ｂ）ＡＰＯ−１リガンドをそれぞれ捕捉および阻害する化合物、
    （ｃ）細胞内ＡＰＯ−１シグナル経路を阻害する化合物、
    （ｄ）ＴＡＴレセプターを阻害する化合物、
    （ｅ）ＴＡＴをそれぞれ捕捉および阻害する化合物、
    （ｆ）細胞内ＴＡＴレセプターシグナル経路を阻害する化合物、
    （ｇ）ＣＤ４レセプターを阻害する化合物、
    （ｈ）ｇｐ１２０をそれぞれ阻害および捕捉する化合物、および、
    （ｉ）細胞内ＣＤ４レセプターシグナル経路を阻害する化合物
    から成る群より選択される１以上の成分を含み、該成分が個体内で異物とみなされないことを特徴とする請求項１８記載の薬剤組成物。
20. 前記成分（ａ）が、
    非細胞毒性抗ＡＰＯ−１阻止抗体、
    Ｆｃ部分を有さない抗ＡＰＯ−１抗体、および、
    ＡＰＯ−１リガンドのアナログ、から成り、
    前記成分（ｂ）が、
    抗ＡＰＯ−１リガンド抗体、
    ＡＰＯ−１、
    細胞外ＡＰＯ−１ドメイン
    ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有するペプチド、および、
    ＡＰＯ−１リガンド結合部位を有する一以上のペプチドおよび担体を含む化合物、から成り、
    前記成分（ｄ）が、
    抗ＴＡＴレセプター抗体、および
    ＴＡＴアナログ、から成り、
    前記成分（ｅ）が、
    抗ＴＡＴ抗体、
    ＴＡＴレセプター、
    細胞外ＴＡＴレセプタードメイン、
    １以上の細胞外ＴＡＴレセプタードメインおよび担体を含む化合物、
    ＴＡＴ結合部位を有するペプチド、
    ＴＡＴ結合部位を有する１以上のペプチドおよび担体を含む化合物、
    核酸塩基のＴＡＴ結合部位、および
    トランスドミナントＴＡＴ変異体、から成り、
    前記成分（ｇ）が、
    抗ＣＤ４レセプター抗体、および、
    ｇｐ１２０アナログ、から成り、
    前記成分（ｈ）が、
    抗ｇｐ１２０抗体、
    ＣＤ４レセプター、
    細胞外ＣＤ４レセプタードメイン、
    １以上の細胞外ＣＤ４レセプタードメインおよび担体を含む化合物、
    ｇｐ１２０結合部位を有するペプチド、および、
    ｇｐ１２０結合部位を有する１以上のペプチドを有する化合物、から成ることを特徴とする請求項１９記載の薬剤組成物。

Images