JP2003517311A - カスパーゼにより誘導されるアポトーシスのための組成物および方法 - Google Patents

カスパーゼにより誘導されるアポトーシスのための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明はカスパーゼにより誘導されるアポトーシスのための方法および組成物を提供する。アポトーシスが誘導されるべき標的細胞にキメラタンパク質が提供される。本発明に係るキメラタンパク質は、内因性カスパーゼを活性化し、または細胞死を惹起するカスパーゼユニットを提供する。病的状態を治療するインビボおよびエクスビボ治療のための本発明に係るキメラタンパク質の使用のための方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、自己免疫疾患、アレルギーの軽減のため活性化リンパ球を排除する
ための、そして同種移植片に対する寛容を誘導するための、カスパーゼにより誘
導されるアポトーシスの誘導に関するものである。 発明の背景 アポトーシスまたはプログラム細胞死は、小さな虫Caenorhabditis elegansか
ら人間に至る全ての動物において、成長と成熟へと導く発達過程に含まれている
ことが知られている。通常は、アポトーシスは様々な組織で整然とした発達を導
く生理的シグナルによって厳密に調節されている。全ての細胞はアポトーシスを
受ける能力を持っているが、正常の状態においてアポトーシス機構は「オフ」モ
ードにある。病的状態においては、注意深く標的化され管理されたアポトーシス
を細胞に誘導することが有利である。このような状態は、自己免疫疾患およびア
レルギーといったように免疫系が機能不全である、または、同種移植の場合のよ
うに免疫系の機能性を低くすることが望ましい状態を包含する。望ましくない細
胞、例えば良性または悪性腫瘍においてアポトーシスを誘導することもまた望ま
しい。
【０００２】 免疫反応は、外来抗原の存在に対して反応する幾つかの異なる細胞型の相互作
用によって調節される。適応免疫反応は、病原性微生物に満ちた環境で脊椎動物
が生存するために必須のものである。先天性の遺伝的欠陥のため、化学療法剤へ
の暴露のため、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなウイルスによる感染
のために免疫反応を欠失している人間は、健常な免疫反応系を持つ人間ならば容
易に切り抜けるような感染症に屈服する。しかしながら免疫系は生物にとって常
に有益である訳ではない。その調節不良は自己免疫および腫瘍を導く。さらに免
疫系は、別の個体から採取した臓器を含む外来抗原といったような有益な外来抗
原の移植、末期疾患でだめになった臓器を取り替えることのできるプロセス、お
よび骨髄移植で治療できる様々な造血系疾患の治療に対する障壁としても働く。
移植が成功するためには、適応免疫を抑制するか、またはレシピエントの免疫系
にこれらの外来抗原を生来のものとして受容するよう「教示する」ことが必要で
ある。
【０００３】 T細胞は適応免疫系のエフェクター機構を統合していることから、最も重要な
適応免疫の細胞である。外来抗原に対する免疫反応は、自己-主要組織適合遺伝
子複合体(MHC)分子により提示されるペプチドのような抗原を認識するために、
クローン発現されたT細胞レセプター(TCR)を使用する、ナイーブT細胞によって
開始される。この認識反応(シグナル1)は、抗原提示細胞(APC)が提供する同時刺
激シグナル(シグナル2)を随伴する時、完全なT細胞の活性化を引き起こす。活性
化の際、T細胞は、系から抗原を一掃する原因となる免疫機構を発動させるエフ
ェクター細胞へと増殖して分化する。次いで死の段階がこれに続き、その間に、
殆どの活性化T細胞は、アポトーシスが仲介する「活性化により誘発された細胞
死」(AICD)を受け、エフェクター活性が静まる。アポトーシスは、細胞をアポト
ーシスへと決定付けるカスパーゼと呼ばれる酵素の活性化へと集束する、一連の
細胞外および細胞内シグナルを含む、複雑なプロセスである。カスパーゼ-3は、
細胞の生存に必要な一連の細胞タンパク質を開裂させることによりアポトーシス
を執行する最下流のエフェクターカスパーゼであることから、アポトーシス経路
の中で最も決定的な「執行者」酵素である。選択されたモチーフを含む合成ペプ
チドが、死のレセプター／リガンド相互作用を介して変換されるシグナルを必要
とすることなく細胞内カスパーゼ-3を活性化することが最近示された。
【０００４】 血管新生化移植片の移植は、選択された末期疾患の患者にとって重要且つ有効
な代替治療法となっている。とは言え、遺伝的に異なる患者間の臓器移植(同種
移植片)は、免疫学的認識を制御する能力と、レシピエントによる移植片の拒絶
によって制限を受ける。同種移植片拒絶を防止するための免疫抑制療法として、
薬理学的物質がより一般的に使用されている。これらの薬物は拒絶エピソードの
重篤度を低下させるのに有効であるが、非特異的であり、永続的な移植片特異的
寛容の状態を作り出すことはできない。よって、移植片の生存を延長するために
レシピエントをこれらの免疫抑制剤に持続的に暴露させることは、日和見感染と
悪性疾患の危険性が著しく上がることに関係する。さらに、これらの非特異的免
疫抑制剤は宿主に重大且つ望ましくない薬理学的副作用を誘発し得る。
【０００５】 これらの望ましくない副作用は、原因は不明であるが身体が自己の或る部分を
「外来のものである」と認識し、適応免疫による攻撃を開始するという、慢性の
長期免疫疾患を有する患者にとっての利益をしばしば上回る。自己免疫疾患は、
様々な組織のDNAが免疫標的となるエリテマトーデス；神経の骨髄鞘が免疫反応
により破壊されるMS；インスリンを産生する膵臓細胞が破壊されるI型糖尿病を
包含する。筋萎縮性側索硬化症、甲状腺炎および慢性関節リウマチもまた本質的
に自己免疫であると考えられる。免疫系に「外来性」自己抗原を寛容することを
「教示」できることは極めて望ましい。
【０００６】 幾つかの病理は自体免疫系の機能不全によるものではないかも知れないが、そ
の症状は非常に活発な制御不能の免疫系の活動によっている。アレルギー、喘息
、および敗血症ショックはこの群に包含される。患者の苦痛は活性化された免疫
細胞の管理された排除によって軽減されるであろう。
【０００７】 免疫系の機能不全により惹起される病的状態に加えて、或る細胞がアポトーシ
スの標的になった場合に患者が利益を受ける、その他の状態がある。なかでも良
性または悪性の腫瘍としてまとめられる様々な病理が主たるものである。このよ
うな悪党細胞の排除にはアポトーシス法を用いるのが望ましい。
【０００８】 免疫反応を調節し、腫瘍細胞のような望ましくない細胞を排除するための、よ
り選択的且つ長期持続的方法を開発する必要性が依然としてある。 発明の概要 本発明はアポトーシスを調節する組成物および方法を提供するものである。こ
の組成物は、生体内カスパーゼの誘導または活性カスパーゼサブユニットの投与
を引き起こすことのできるキメラタンパク質を包含する。これらの組成物は、(1
)アポトーシスのために選択された細胞を標的とする親和分子を含むベクター、
および(2)カスパーゼまたは標的細胞中の内因性カスパーゼの活性化を誘導する
ペプチドの反応性部分を含む挿入物、を含んでいる。標的が免疫細胞である場合
、好ましい親和分子はIL-2であり、好ましい挿入物はカスパーゼ-3のp12またはp
17サブユニットである。本発明方法は、その他の親和分子およびその他のカスパ
ーゼを含むキメラタンパク質の構築を当業者に教示するものである。本発明方法
はまた、自己抗原および同種抗原に対する寛容の誘導のため、活性化免疫細胞の
アポトーシスをインビボおよびエクスビボで誘導することを包含する。
【０００９】 標的細胞とは、細胞シグナルまたは抗体もしくは抗体の一部のためのレセプタ
ーとして働くリガンドであるユニークな表面タンパク質を有する任意の細胞を意
味し、このタンパク質はそのリガンドと反応すると内部移行する。標的細胞は白
血球、活性化白血球および腫瘍細胞を包含する。
【００１０】 カスパーゼにより誘導されるアポトーシスとは、カスパーゼ関連分子の内在化
(インターナライゼーション)により惹起される細胞死を意味し、この定義はカス
パーゼ、活性カスパーゼサブユニットまたは生体内カスパーゼを活性化するカス
パーゼ活性化因子に適用される。
【００１１】 生産細胞とは、カスパーゼまたは活性カスパーゼサブユニットを産生できる任
意の細胞を意味する。E.coli、酵母およびその他の微生物が産生細胞として使用
できる。驚くべき事にDrosophila細胞がヒトカスパーゼ関連分子を産生できるこ
とが見出されている。
【００１２】 本発明の一つの態様は同種移植片に対する寛容の誘導である。同種移植片の拒
絶は、移植片上の組織適合抗原に応答する移植片レシピエントのT細胞により開
始する免疫学的現象であることが分かっている。刺激の際、移植片特異的T細胞
のクローンが活性化され、サイトカインの増殖および産生を引き起こし、それが
反応を延長および強化する。先天的免疫不全または実験操作によりT細胞を欠失
する実験動物は、組織適合性の著しい相違を発現する同種移植片を無期限に許容
するよう条件付けることができる。クローン発現されたT細胞の認識を介した同
種抗原のT細胞認識は、T細胞活性化で完結する一連の細胞内生化学的事象を開始
させる抗原特異的シグナル(シグナル1)を変換する。しかしながら完全なT細胞活
性化にはシグナル1単独では不充分であり、抗原提示細胞(APC)により提供される
さらなる同時刺激シグナル(シグナル2)もまた、同種移植片拒絶のエフェクター
機構の発生にとって必要である。シグナル2不在下でのシグナルの変換は、ナイ
ーブT細胞の機能的沈黙(アネルギー)または物理的排除(アポトーシス)をもたら
し得る。活性化されるとT細胞は抗原により誘発される増殖の状態となり、それ
により1200倍に及ぶクローン拡大がなされる。続いて死の段階が起こり、その間
に活性化T細胞の95%以上がアポトーシス(プログラム細胞死)を受け、一方系内の
抗原量が減少するにつれて残りの細胞は記憶細胞へと分化する。
【００１３】 アポトーシスまたは「プログラム細胞死」は多細胞生物の発生とホメオスタシ
スの両者において中心的役割を果たしている。アポトーシスは、幾つかの「死レ
セプター」とそれらのリガンド[腫瘍壊死因子(TNF)レセプター／リガンドスーパ
ーファミリーに属する]の間の複数の相互作用から成る最終エフェクター機構に
集束する複数の独立したシグナル伝達経路によって誘導され得る。最もよく特性
決定がなされている死レセプターは、CD95(「Fas」)、TNFR1(p55)、死レセプタ
ー3(DR3またはApo3/TRAMO)、DR4およびDR5(apo2-TRAIL-R2)である。最終エフェ
クター機構はカスパーゼ群のタンパク質によって仲介される。さらに、或る種の
天然または合成ペプチドもまた、恐らくは内因性カスパーゼの活性化により、細
胞内に運ばれた時にアポトーシスを誘導することが判明している。この後者の群
には、RGD、AMAGPHPVIVITGPHEE、KLAKLAKKAKLAK、シトクロムC(「cyto」)および
DIABLO/SMAC(「SMAC」)が包含され、まとめてカスパーゼ活性化因子(CAF)と呼ば
れている。
【００１４】 カスパーゼはアポトーシスにおいて最も決定的な役割を演じており、Caenorha
bditis elegansからヒトに至る生物に見出されている。13以上の哺乳動物カスパ
ーゼがこれまでに同定されている。カスパーゼはアミノ酸配列、構造、および基
質特異性に類似性がある。これらは全て、3個のドメインを含む30ないし50kDaの
不活性プロ酵素；およびN末端プロドメインとこれに続く大(20kDa)および小(約1
0kDa)サブユニットとして発現される。これら3個のドメインがタンパク質分解的
開裂により物理的に分離した後、大および小サブユニットが結合してヘテロ二量
体が形成される。次いで2個のヘテロ二量体が結合して、独立して機能するよう
に思われる2個の触媒部位から成る四量体を形成することができる。複数のアポ
トーシスシグナルと補助因子が、下流のカスパーゼのタンパク質分解的開裂およ
び活性化ならびにアポトーシス機構の遂行にとって決定的であるイニシエーター
カスパーゼの初回活性化に関わっている。カスパーゼ-3が活性化される時点まで
のこの連続的事象の各工程が、調節可能である。
【００１５】 移植片特異的活性化T細胞にアポトーシスを誘導するための好ましい物質とし
て、カスパーゼ-3を選択した。カスパーゼ-3は、その活性化が直接細胞死を招く
ことから、アポトーシス経路において必要且つ十分な重要酵素である。例えば、
カスパーゼ-3と合成ペプチドとの架橋は、その活性化と当該細胞のアポトーシス
とを引き起こし、この事は、活性カスパーゼ-3それ自体がアポトーシスプロセス
にとって充分であり、これが正常の生理環境でアポトーシスを制限する細胞内チ
ェックポイントを迂回できることを示している。カスパーゼ-3プロ酵素はN末端
プロドメインと、これに続く触媒的システイン残基を含むp17ドメイン、およびp
12ドメインを含んでいる。プロドメイン／p17とp17/p12ドメインの間には2個の
カスパーゼ開裂部位が存在する。このプロ酵素型は不活性である。しかしながら
これは、アポトーシスシグナル伝達の最中に、上流のカスパーゼ、例えばT細胞
中のカスパーゼ-8により開裂し、不活性プロドメインの喪失と活性p17/p12ヘテ
ロ二量体および／またはヘテロ四量体の形成を産む。カスパーゼ-3は不活性プロ
カスパーゼ-3の開裂を自己触媒でき、それによりアポトーシスシグナルをさらに
増大させる。CAFは活性カスパーゼ-3の添加なしにプロカスパーゼを活性化でき
ることが判明している。
【００１６】 死の最終決定(カスパーゼ-3の活性化)の前にさらなる調節を行うことが望まし
い場合は、本明細書に開示する技術および方法に従い、他のカスパーゼのうち任
意のものを搬送ビヒクルに連結させることができる。
【００１７】 本発明の目的のための搬送ビヒクルは、アポトーシスの標的にすべき細胞上に
ユニークに存在する、またはユニークに高レベルで存在する、任意のレセプター
に対するリガンドとして定義する。標的がT細胞のような活性化された免疫細胞
である場合、このクラスの化合物は、本発明の背景に開示した死レセプター／リ
ガンドおよびインターロイキンを包含する。インターロイキン(IL)は一般的には
サイトカインと呼ばれる化合物のクラスに属する。ILに対するレセプターは免疫
細胞が活性化された時に誘導される。免疫細胞がアポトーシスの標的である場合
、搬送ビヒクルのうちで本発明において特に有用なものは、IL-2、IL-4、IL-6、
IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-αおよびTGF-βである。
【００１８】 より一般的には、搬送ビヒクルは細胞表面タンパク質に対するポリクローナル
またはモノクローナル抗体であってよい。より有利なことに、抗体の結合ドメイ
ンVlightおよびVheavyは当分野で周知の方法により構築て、カスパーゼサブユニ
ットまたはCAFにライゲーションすることができる。癌細胞上に通例見出される
細胞表面タンパク質は、癌細胞を標的とする場合に構築物に使用できる。
【００１９】 インターロイキン2(IL-2)は、活性化Tリンパ球のクローン拡大において中心的
役割を演じ、好ましい搬送ビヒクルである。同時刺激シグナル(シグナル2)に随
伴するTCR(シグナル1)による外来抗体のT細胞認識は、T細胞においてIL-2および
高親和性IL-2レセプター(IL-2R)の誘導をもたらす。オートクリンまたはパラク
リン方式でIL-2と高親和性IL-2Rとの相互作用により変換されたシグナルは、T細
胞の活性化、増殖、およびエフェクター機能への分化をもたらす。次いで活性化
T細胞は、外来抗原に対する有効な免疫反応の生成と強化のためのその他の免疫
系細胞に働く、一連のサイトカインを合成および分泌する。
【００２０】 IL-2は、B細胞の成長と分化、リンホカインにより産生されるキラー細胞の産
生、ナチュラルキラー細胞(NK)の増加、および乏突起神経膠細胞の増殖と成熟を
包含する数多くの生物学的プロセスを仲介する。さらに、IL-2はまた、細胞増殖
を調節し、成熟T細胞のアポトーシスをプログラムし、そしてT細胞をアネルギー
から救出することができる。これらの多岐にわたる機能に合致して、IL-2はその
高親和性レセプターとの相互作用を介して広範な細胞型に様々なシグナルを伝達
している。IL-2とその高親和性IL-2Rとが結合した後、二つの経路を経てその複
合体が内部移行する；１つはクラスリン被覆ピットに依存し、他方はクラスリン
被覆ピットに独立している。この複合体のエンドサイトーシス後、IL-2Rのα鎖
は細胞質膜へとリサイクルされて戻り、一方IL-2、ならびにβおよびγ鎖は別個
のインターナライゼーションおよび分解モチーフを経て後期エンドサイトーシス
コンパートメント方面への経路をとる。
【００２１】 活性化Tリンパ球における高親和性IL-2Rの選択的発現は、自己免疫、移植片拒
絶、および或る種の新生物疾患の防止のためのIL-2Rに向けた治療法を用いる一
連のアプローチを導いた。幾つかの毒素が、IL-2のような搬送ビヒクルまたは活
性化T細胞を特異的に標的とするIL-2Rのα鎖に対する抗体にコンジュゲートされ
た。この複合体が内部移行すると毒素が開放され細胞死を惹起する。例えば、IL
-2-PE40(P.exotoxin-IL-2キメラタンパク質)は、活性化した正常T細胞に対する
と同様白血病セルラインに対しても高度に毒性であることが示されている。IL-2
-毒素融合タンパク質は、幾つかの異なる実験設定で、同種移植片拒絶を包含す
る同種反応性を防ぐことのできる強力な免疫抑制剤であることが判明した。しか
しながらこれらの物質は副作用が皆無ではない。
【００２２】 活性化T細胞のアポトーシスは骨髄およびその他の臓器移植を包含する同種移
植片および異種移植片に対する寛容を引き起こす。活性化T細胞の一掃はまた、
アレルギーおよびその他の免疫誘発性疾患の症状を軽減する。多発性硬化症、エ
リテマトーデス、I型糖尿病、サルコイドーシスおよび慢性関節リウマチといっ
た自己免疫疾患が後者に包含される。幾つかの腫瘍を包含する多くの疾病がリン
パ球の機能に依存しており、それがその疾病の持続につながっている。多くの血
液疾患は、外来幹細胞に対する寛容が誘導されるよう免疫反応を調節できたなら
ば、骨髄幹細胞移植によって治療することができる。これらの疾病には白血病、
リンパ腫、再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血およびクーリー貧血などがある。こ
れらの疾患は全て、T細胞を包含する活性化免疫細胞のアポトーシスによって永
続的または一時的に制圧できる。
【００２３】 本発明は、アポトーシス誘発分子に機能的に結合した活性化T細胞を特異的に
標的とする搬送ビヒクルの機能的部分をコードしているキメラcDNAの構築を含む
、免疫調節戦略を開示するものである。カスパーゼにより誘導される挿入物を伴
うキメラタンパク質に加えて、驚くべき事に、二つのさらなるクラスの細胞内タ
ンパク質がアポトーシスの促進に有用であることが判明した。これらのクラスの
例は、(a)ミトコンドリア中に見出されるシトクロムc(「cyto」)、および(b)ア
ポトーシスの内因性インヒビターに結合してその活性を測定し、それによりアポ
トーシスを促進する、新たに発見されたタンパク質DIABLO/SMAC(「SMAC」)であ
る。
【００２４】 第I表は構築物の一覧である。構築物の選択は、適応免疫を引き起こす外来抗
原の性格；求められる軽減が一時的であるかまたは永続的であるか；死の決定付
けが望ましいのか、またはアポトーシスの下流調節が好ましいのか、といったよ
うな因子に基づくことができる。列挙した構築物は本発明の代表例に過ぎず、限
定的ではないことを理解されたい。当業者は不必要な実験を行うことなく、搬送
ビヒクルと機能的に結合させた14のカスパーゼ、CAF、cyto c、またはSMACのう
ち任意のものを有する構築物を容易に作製できる。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
【００２７】 アポトーシスの誘発に要する用量は、搬送ビヒクルの親和性と特異性およびア
ポトーシス物質の活性に依存する。好ましい態様では、アポトーシス効果のため
には細胞あたり10ないし100分子のIL-2/カスパーゼ-3で充分であるが、より活性
の低い構築物では1000ないし10000分子が必要となり得る。搬送ビヒクルとアポ
トーシス物質の選択は、所望される活性に依存するであろう。好ましい態様IL-2
/カスパーゼ-3およびIL-2CAFの構築を図1に模式的に示し、その作用様式を図2に
示す。
【００２８】 このDNA構築物によりコードされているキメラタンパク質を産生するための好
ましい産生細胞は、市販品が入手できるDrosophila系である。しかしながら、キ
メラタンパク質を産生する当業者は、本発明に係るキメラタンパク質の産生には
他の多くの発現系およびベクターが好適であることを認めるであろう。Escheric
hia coli、酵母および哺乳動物細胞培養がこれらその他の系に包含される。
【００２９】 当業者は、本発明に開示する方法を用いて、白血球以外の細胞がアポトーシス
を受けるようにすることができることを容易に認めるであろう。種々の細胞に特
異的な細胞表面タンパク質が当分野でよく知られている。例えば、癌細胞は、特
異抗体を産生できる腫瘍抗原を持っている。これらの抗体をコードしているDNA
を、p12またはp17のようなカスパーゼ由来DNA配列、またはシトクロムcのような
内因性カスパーゼのアクティベーターをコードしているDNAとライゲーションす
ることができる。より有利な、抗体の特異的結合ドメイン(二つのタンパク質鎖
の可変領域VlightおよびVheavy)を利用できる。これらのドメインを取得する方
法は当分野で周知である。例えば、Bird et al., Science 242, 423-426(1988)
またはHuston,J.S. et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,5879-5883(1988)を参照
されたい。 発明の詳細な説明 本明細書に記載の実験方法は、カスパーゼ系の操作により免疫系を調節するた
めの方法および組成物の代表例である。本発明の教示に従い、そして当分野で既
知の組成物を使用して、既知の13種のカスパーゼのうち任意のものを、選択され
た細胞を標的とする搬送ビヒクルを伴う構築物へと構築できる。カスパーゼの選
択は、カスパーゼ-3による死の決定付けが望まれるのか、またはその後の調節を
可能にするカスケード上流のカスパーゼが望ましいのかに依存する。標的化する
搬送ビヒクルは、任意の細胞表面タンパク質の既知のリガンド、例えばサイトカ
インまたは抗体または抗体のフラクションとすることができる。これとは別に、
内因性カスパーゼを活性化するキメラタンパク質を構築ることもできる。これら
のキメラタンパク質をコードしているDNAは遺伝子治療に使用できる。
【００３０】 一般に、標的細胞のサイトゾルへのキメラタンパク質の接近は、ウイルスペプ
チド、合成ペプチドおよび融合誘導薬物の同時適用によって促進できる。これら
の調合物は当業者によく知られている。
【００３１】 一つの態様では、標的とされる細胞は活性化リンパ球であり、求められる結果
は同種移植片寛容であって、この寛容は、IL-2/p17、IL-2/p12またはIL-2R/CAF
キメラタンパク質を用いるカスパーゼ-3の活性型の、同種反応性免疫細胞内への
デリバリーを介して、好ましい態様IL-2R標的化カスパーゼ-3を適用し、それに
よりアポトーシスによる死を惹起することにより得られる。これらのタンパク質
は、ドナー特異的長期生存および／または寛容を誘導するために、様々な組み合
わせで移植片レシピエント中に注入する。別法として、このようなキメラタンパ
ク質をコードしているDNAを、IL-2のような搬送ビヒクルにカップリングさせた
発現ベクター中にタンパク質レベルでクローニングし、エクスビボまたはインビ
ボで適用して、アポトーシスが誘導される活性化レシピエントT細胞の永続的形
質転換を導くことができる。
【００３２】 第二の態様では、活性化免疫細胞のアポトーシスを惹起するキメラタンパク質
を使用して免疫細胞のエクスビボ一掃のための親和カラムを構築して、免疫活性
化に起因する疾病の症状を軽減する。これらの疾病には、自己免疫疾患、アレル
ギー、喘息および毒素性ショックが包含される。
【００３３】 第三の態様では、本発明方法を適用してカスパーゼまたはCAFおよびアポトー
シスを受けるべき細胞にユニークな表面タンパク質のリガンドを含むキメラタン
パク質を構築する。好ましいリガンドは、このようなユニークな細胞表面タンパ
ク質に対する抗体または係る抗体の結合ドメインである。これらの疾病には良性
および悪性腫瘍が包含される。
【００３４】 1. 産生細胞における発現のためのキメラ遺伝子の構築。
【００３５】 ヒトJurkatセルラインから全RNAを調製し、オリゴ(dt)18を逆転写酵素のプラ
イマーとして使用してこのRNA 2μgをDNAの第一鎖に変換した。次に、三つの別
々のPCR増幅においてヒトIL-2、p17およびp12に特異的な三組のセンスおよびア
ンチセンスプライマーを使用して、このcDNA調製物の十分の一を増幅した。カス
パーゼ-3開裂部位(DEVD)とEcoRI部位をコードしているヌクレオチドを含むよう
設計したIL-2 3’アンチセンスが、構築のためのIL-2と共にフレーム内にあった
。図3に示すように、これらのプライマーは目的とする3種類の遺伝子全てについ
て、予想されたサイズのDNAバンドを増幅した。次いでこれらのPCR生成物をTAク
ローニングベクター(Invitrogen、サンディエゴ、CA)中にクローニングし、この
材料から作製したライブラリーを同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPC
R増幅でスクリーニングした。陽性クローンを、EcoR1で消化したが、これはTAベ
クターの複数のクローニング部位の周りに2個の部位を持っている。図4および5
に示すように、EcoR1消化は各々の遺伝子について予想されたサイズのフラグメ
ントの放出をもたらした。
【００３６】 6xHis-IL-2およびIL-2/p17分子のための機能的cDNAを、高収量昆虫発現系(DES
(登録商標)、Invitrogen)での発現のため、pMT/Bip/V5-HisAベクターで、Drosop
hila BiP分泌シグナルによりフレーム内サブクローニングした。燐酸カルシウム
を用いて組換えベクターをDrosophila S2細胞中に一時的にトランスフェクトし
た。次に細胞を硫酸銅でパルスして、キメラタンパク質の発現を駆動する誘導メ
タロチオネインプロモーターを活性化した。活性化後の様々な時間に培養基を集
め、透析して硫酸銅を除去し、ELISA、ウェスタンブロットおよびCTLL-2増幅検
定を用いてキメラタンパク質を分析した。
【００３７】 ELISAは、培養上清を吸収のためのNi-NTA被覆96滴定プレートで一夜4℃でイン
キュベートすることにより実施したが、Ni-NTAは6xHis標識したタンパク質に特
異的に結合し、そのまま特異性と感受性を付与する。燐酸緩衝化塩溶液(PBS)で
数回洗浄した後、ウェルを様々な希釈のウサギ抗ヒトプロカスパーゼ-3ポリクロ
ーナル抗体と共に室温で1時間インキュベートした(PharMingen、サンディエゴ、
CA)。アルカリホスファターゼコンジュゲート化したヤギ抗ウサギIgG抗体を標準
ELISAプロトコルでの検出に使用した。図6に示すように、S2トランスフェクト体
からの上清は顕著なレベルのキメラIL-2/p17タンパク質を発現した。6xHis-IL-2
構築物でトランスフェクトしたS2細胞由来の培養上清は負の対照としての働きを
した。
【００３８】 次に、タンパク質の存在を証明しその分子量についての情報を得るため、上清
をウェスタンブロットで分析した。ヒトプロカスパーゼ-3に対する抗血清はIL-2
/p17トランスフェクト体の上清に約34kDaの分子を検出したが、6xHis-IL-2でト
ランスフェクトしたS2細胞の上清にも、非トランスフェクトS2細胞にも検出しな
かった。各々のタンパク質は全体サイズに対し約17kDAの貢献をしていることか
ら、これはキメラIL-2/p17に対して予想された分子量である。
【００３９】 第I表中のその他のクローンを同様の方法を用いて構築し、特性決定した。示
された全てのクローンを配列決定し、予想された性質を持っていることが判明し
た。図6は、このキメラタンパク質がヒトカスパーゼ-3の免疫学的性質を保持し
ていることを示している。同様の実験は、IL-2部分がヒト抗IL-2と反応すること
を示す。図7はこれらのキメラタンパク質の模式的表示である。
【００４０】 2. キメラタンパク質はIL-2依存性CTLL-2細胞の増殖を支持する。
【００４１】 キメラタンパク質中のIL-2が機能的であるかどうかを証明するため、上清また
は精製タンパク質を、IL-2Rを構成的に発現し増殖に関してIL-2依存性のマウス
リンパ腫ラインであるIL-2依存性CTLL-2セルラインの増殖を支持することについ
て試験した。
【００４２】 IL-2Rを構成的に発現し増殖に関してIL-2依存性のCTLL-2マウスリンパ腫セル
ライン上で組み換えタンパク質を試験した。個別的または様々な組み合わせの様
々な量の組換えタンパク質の存在下で、U底86微量滴定プレートに入れた、総体
積200μlの培地中5000細胞／ウェルで、培地中最適の細胞増殖に要する10UのIL-
2に相当する濃度から初めて、細胞を培養した。IL-2を加えた、そしてIL-2を加
えない培養がそれぞれ正および負の対照の役割を果たした。18時間のインキュベ
ーションの後、1μCiの3H-チミジン／ウェルでさらに8時間パルスした。グラス
ファイバーフィルター上に培養を収穫し、フィルターに結合した放射性を微量プ
レートシンチレーションカウンターで計数して、増殖反応を決定した。図8に示
すように、IL-2/p12およびIL-2/p17組換えタンパク質はCTLL-2細胞の増殖を用量
依存的に支持した。細胞増殖の支持に関してIL-2/p17はIL-2/12よりも幾分活性
であるように見受けられたが、上清は一定の組換えタンパク質含有量まで正規化
されなかった。トランスフェクト体は、組織培養基1mlあたり250-2800単位の市
販IL-2に相当する、著明な量の組換えタンパク質を発現した。これはDES(登録商
標)系の有効性を立証している。これらのデータは、 (1) カスパーゼ-3サブユニットとの融合はIL-2の機能を妨害しない、 (2) キメラタンパク質は個別的には細胞に対し毒性でない、そして、 (3) キメラタンパク質はDES(登録商標)系を用いて効率的且つ機能的に発現さ
れ得る、 という事の直接の証拠を提供する。
【００４３】 組換えタンパク質をCTLL-2セルライン上で試験した。正常マウスA20またはア
ポトーシスを誘導するための外部シグナルとしてのFasLのアポトーシス型で処理
したA20から細胞溶解液を調製し、次に細胞溶解液を、表示のキメラタンパク質(
図9)と共にカスパーゼ-3色素産生基質Z-DEVD-AFCの存在下で4時間インキュベー
トした。次いで基質の開裂を405nmで測定した。細胞溶解液単独は負の対照とし
て使用した。 図9に示すように、組換えタンパク質は非処理細胞由来の溶解液
中の内因性カスパーゼ-3を活性化し、さらにアポトーシス細胞由来の溶解液中の
カスパーゼ-3の活性を増大させたが、これは、CAFを含む組換えタンパク質が内
因性カスパーゼ-3を充分に活性化できることを証明するものである。
【００４４】 次に、搬送ビヒクルとしてサイトカイン(この場合IL-2)を用いて、IL-2レセプ
ターを発現する活性化リンパ球中にカスパーゼ誘導CAFを特異的にデリバリーす
ることによって内因性カスパーゼ-3を活性化した。T細胞マイトジェンとしてコ
ンカナバリンA(ConA)を使用し、ラット脾臓細胞を18時間活性化した。次いでこ
れらの細胞をよく洗浄して過剰のConAを除去し、様々な用量および組み合わせの
組換えタンパク質と共に18時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、カスパ
ーゼ-3 PhiPhiLux-G1D2(GDCDGI)蛍光生成基質(10μM；OcoImmun,Inc.、ゲイサー
ズバーグ、MD)と共にさらに1時間インキュベートした。次に細胞をよく洗浄し、
アポトーシス活性についてFL1チャンネルで分析した。図10に示すように、組換
えIL-RGDは、負の対照IL-2Hisに比して活性化リンパ球の著明なアポトーシスを
惹起した(R1=43%に対して72%)。これらのデータは、この組換えタンパク質がIL-
2Rを介して内部移行し、細胞を死へと決定付ける内因性カスパーゼ-3を活性化で
きることを明瞭に証明している。
【００４５】 3. 同種寛容の誘導のためのインビトロ試験 インビボでアポトーシスを誘導するキメラタンパク質の有効性を、3種の異な
る系統のラットの組み合わせにおける心臓同種移植片に対する寛容の誘導につい
て試験する。インビボ試験のための準備において、同種反応性応答を阻害するキ
メラIL-2/p12および/p17の能力を、モデル系としての同種異型混合リンパ球培養
中、インビトロで試験した。副次的およびMHC抗原相違を有する幾つかの異なる
ラット系統から脾臓細胞を採取し、様々な用量および組み合わせの組換えタンパ
ク質の存在下で標準MLR検定に使用した。図11に示すように、最大の阻害は、IL-
2/p17/IL-1/p12分子の混合物と共にインキュベートしたMLR培養について観察さ
れた。S2上清および細胞単独(ACIおよびIU)を対照として使用した。このデータ
は3回の独立した実験の代表値である。
【００４６】 この方法の阻害効果は60%-80%以内の範囲であり、試験した上清の1:50希釈で
観察された。キメラ分子は、個別的に使用した場合、対照のS2上清に比してMLR
反応を中等度に阻害した。しかしながら、最大の阻害効果を得るための適用用量
および時間を最適化するには、さらなる検討が必要である。これらのデータは、
カスパーゼ-3活性化タンパク質分子のIL-2Rを標的とするデリバリーは、高親和
性IL-2Rを発現する活性化リンパ球を特異的に排除するための有効な手段として
働き得るという仮説の論拠を提供する。
【００４７】 4. 同種反応性の阻害に関するインビボ研究 さらなる研究をACI-to-LEWマウスの組み合わせで計画するが、これは、副次的
および主要組織適合抗原について異なっており、且つ寛容誘導のため緊縮条件を
必要とする高応答の組み合わせである。よってこれはそれ自体人間の臨床状況に
似ている。さらに、細胞性免疫反応、特に直接経路により仲介される反応は、こ
のモデルの移植片拒絶において主要な役割を演じる。一方PVG.R8-to-PVG.IUのモ
デルは、7日以内に急性の拒絶を引き起こす激しい免疫反応を開始するに充分で
ある、１つの孤立したクラスI、RT1.Aa抗原で差異を含んでいる。液性免疫反応
はこのモデルの急性移植片拒絶に決定的な役割を演じている。PVG.IU-to-PVG.R8
の組み合わせはさらに、１つの孤立したクラスI、RT1.AU(このモデルにおいて心
臓同種移植片の慢性拒絶を引き起こす分子)についても異なっている。間接的認
識経路は、PVG.R8およびPVG.1Uモデルにおいて拒絶を仲介する同種反応性免疫反
応の重要な構成成分である。これら三つの同種移植片モデルの使用は、直接的お
よび間接的経路により開始されるT細胞における、そしてB細胞における、寛容の
誘導について当該キメラタンパク質の有効性を試験するものである。これらのキ
メラタンパク質が遅延性の移植片不全の主原因である慢性拒絶を防止するかどう
かを試験することは特に重要である。
【００４８】 腹腔内および頸部異所性心移植片を触診によって毎日その機能を評価する。1
x 107の照射したドナー脾臓細胞または頸部移植片を腹腔内異所移植の2週間前に
i.p.注射することにより、将来の同種移植片レシピエントの前感作を行う。移植
片レシピエントは、0.02ないし2.0、最も好ましくは0.25μgの組換えキメラタン
パク質で、移植前および後に様々な回数でi.p.またはi.v.のいずれかで処置する
。
【００４９】 移植片の生着を、移植された心臓を触診することによって急性拒絶について評
価する。慢性拒絶は組織学的検査により評価する。
【００５０】 これらのインビトロ研究に基づき、本発明に係るキメラタンパク質で処置した
動物に同種寛容が誘導されることが予想される。
【００５１】 5. 活性化T細胞のエクスビボアポトーシス 幾つかの臨床状況においては、永続的効果を誘導せずに患者の活性化T細胞を
一掃することが推奨されるかもしれない。身体から血液を連続的に取り除き、こ
れを体外で処理し、その後戻す多くの技術が知られている。自己免疫疾患の患者
は特に白血球搬出法で恩恵を被るが、この方法では、白血球を連続的に採取し、
その後本発明に係るキメラタンパク質のうちの１つでこれを処理する。アポトー
シスによって殺滅された活性化T細胞を取り除き、白血球を患者に戻す。このよ
うにして、リンパ球の中にある活性化抗原と活性化リンパ球は、血流中に放出さ
れずに患者の身体から除去される。
【００５２】 単離されたヒトリンパ球は実施例3の方法を適用することによりアポトーシス
の誘導が惹起され得る。
【００５３】 6. その他の組織において誘導されるアポトーシス 活性化リンパ球以外の組織でアポトーシスを誘導する本発明方法を使用するた
めには、同定された標的に対しユニークで且つ当該細胞中に内部移行する細胞表
面タンパク質を同定しさえすればよい。数多くのこのような細胞表面タンパク質
が知られている。これらのタンパク質に対する抗体は、当業者に周知の技術によ
り作製できる。カスパーゼサブユニットまたは内因性カスパーゼを活性化する化
合物、例えばシトクロムcをこの抗体またはこの抗体の可変領域にライゲーショ
ンして投与し、望ましくない細胞にアポトーシスを誘導することができる。
【００５４】 7. 本発明に係るキメラ遺伝子を使用する遺伝子治療 実施例1または6のDNA構築物を遺伝子治療の手段としてのデリバリー系に連結
することができる。このDNAは目的とする細胞へのデリバリーを目標としてアポ
トーシスを誘導し、免疫反応の永続的調節を付与することになる。
【００５５】 本発明は様々な好ましい態様に関して記載してきた。本発明の精神および範囲
から乖離することなく、本明細書に開示した化合物または方法の修飾、逸脱およ
び置換を行い得ることは、当業者には容易に認められるであろう。このような修
飾、逸脱および置換は全て本発明の請求項の範囲内にあると考えられる。ここに
引用した参照文献は、引用により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 IL-2/カスパーゼ-3およびIL-2-2C/CAFの構築を示す。
【図２】 図1に記載の構築体の作用態様を示す。
【図３】 PCR生成物を示す。
【図４】 陽性クローンのEcoR1消化を示す。
【図５】 陽性クローンのEcoR1消化を示す。
【図６】 キメラタンパク質の産生を示す。
【図７】 キメラタンパク質の模式的表示を示す。
【図８】 キメラタンパク質の存在下でのIL-2依存性CTLL-2細胞の増殖を示す。
【図９】 内因性カスパーゼ-3の活性化を示す。
【図１０】 活性化リンパ球において誘発されたアポトーシスを示す。
【図１１】 キメラタンパク質による同種反応性リンパ球応答の阻害を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月１０日（２００２．７．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 37/08 37/08 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA02 EA04 GA11 GA18 HA03 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 4B065 AA93X BB19 CA44 4C084 AA02 BA44 DA12 DA14 DA16 DA19 DA25 MA01 NA13 NA14 ZB072 ZB082 ZB132 ZB212 ZB262 4C087 AA01 AA02 BB43 CA04 MA01 NA13 NA14 ZB07 ZB08 ZB13 ZB21 ZB26

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a)標的細胞中に取り込まれた場合にアポトーシスを誘導す
    るカスパーゼ関連分子をコードしているDNAと機能的に結合した、当該標的細胞
    と選択的に結合するタンパク質をコードしているDNAを含むベクターによって産
    生細胞をトランスフェクトし、ここでこの産生細胞は、当該DNAを転写および翻
    訳してキメラタンパク質を産生することができ； (b)このようなキメラタンパク質を回収し；そして、 (c)このキメラタンパク質の有効量を標的細胞中に導入する、 ことを含む、カスパーゼにより誘導されるアポトーシスを標的細胞に引き起こ
    す方法。
  2. 【請求項２】 細胞が活性化リンパ球であり、カスパーゼ関連タンパク質が
    IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-α、GM-CSFまたはTGF-βであり
    、そしてアポトーシス誘導分子がカスパーゼ1ないし14、またはカスパーゼ活性
    化因子のうちの１つである、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 産生細胞がショウジョウバエ（Drosophila）細胞である、請
    求項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 標的細胞およびカスパーゼ関連アポトーシス誘導分子に選択
    的に結合するタンパク質を含むキメラタンパク質。
  5. 【請求項５】 当該タンパク質が活性化リンパ球に選択的に結合し、アポト
    ーシス誘導分子がIL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-α、GM-CSFま
    たはTGF-βであり、そしてアポトーシス誘導分子がカスパーゼ1ないし14、また
    はカスパーゼ活性化因子のうちの１つである、請求項4に記載のキメラタンパク
    質。
  6. 【請求項６】 請求項5に記載のキメラタンパク質の有効量の投与を含む、
    同種移植片寛容を誘導する方法。
  7. 【請求項７】 対象のリンパ球を請求項5に記載のキメラタンパク質とエク
    スビボで接触させ、この浄化したリンパ球を当該対象に戻すことを含む、活性化
    リンパ球を対象から浄化する方法。
  8. 【請求項８】 対象が自己免疫疾患またはアレルギーを有する、請求項7に
    記載の方法。
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