EA006874B1

EA006874B1 - Полипептид, обладающий активностью rap [белка, ассоциированного с rip (взаимодействующим с рецептором белком)], кодирующая его последовательность днк и способы их получения и использования

Info

Publication number: EA006874B1
Application number: EA199900842A
Authority: EA
Inventors: Дэвид Валлах; Андрей Коваленко
Original assignee: Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд.
Priority date: 1997-03-19
Filing date: 1998-03-19
Publication date: 2006-04-28
Also published as: CN1250479A; JP2001519656A; US20030039646A1; US7189535B2; IL131929A0; CA2281738A1; AU6634798A; US20020058024A1; NO994524L; EP0972033A1; UA72186C2; KR20000075718A; HK1025127A1; IL131929A; EA199900842A1; BR9808915A; US7083788B2; WO1998041624A1; CN1189564C; AU747005B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым полипептидам RAP, которые способны модулировать/опосредовать функцию RIP, к последовательностям ДНК, их кодирующим, способам получения указанных полипептидов и последовательностей ДНК, векторам, содержащим указанную последовательность ДНК, их применению, а также фармацевтической композиции.

Description

В общих чертах, настоящее изобретение относится к области рецепторов, принадлежащих к надсемейству рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ, и к регулированию их биологических функций. Надсемейство рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ включает такие рецепторы, как рецепторы фактора некроза опухоли р55 и р75 (ΤΝΡ-К, далее именуемых р55-К и р75-К) и рецептор ΡΆδ-лиганда (называемый также ΡΆ8/ΆΡ01 или ΡΆ8-Κ и далее называемый ΡΆ8-Κ) и другие. В частности, настоящее изобретение относится к новым белкам, связывающимся с другими белками, которые сами по себе прямо или опосредованно связываются с членами семейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ и другими внутриклеточными модуляторными белками, а более конкретно, настоящее изобретение относится к одному из таких белков, обозначенных в настоящем описании КАР (ΚΙΡ-ассоциированный белок-2), который связывается с К1Р(белок, взаимодействующий с рецептором) который, в свою очередь, связывается сам с собой и с ΜΟΚΤ-1, РА8-К, р55-К, ΤΚΑΌΌ и Τταί2.

В соответствии с этим, настоящее изобретение, в общих чертах, относится к новым белкам, которые способны модулировать или опосредовать функцию ΚΙΡ, и, тем самым, способны прямо или опосредованно модулировать или опосредовать функцию других белков, которые непосредственно или опосредованно связываются с ΚΙΡ. В частности, настоящее изобретение относится к КАР, к его получению и использованию, а также к любым изоформам, фрагментам и производным ΚΑΡ, к их получению и использованию.

Предпосылки создания изобретения

Фактор некроза опухоли (ΤΝΡ-α) и лимфотоксин (ΤΝΡ-β) (далее обозначение ΤΝΡ относится как к ΤΝΡ-α., так и к ΤΝΡ-β) представляют собой полифункциональные провоспалительные цито-кины, образуемые, главным образом, мононуклеарными фагоцитами, которые обладают множественным действием на клетки (^а11асй, Ό. (1986), в: 1п1сгГсгоп 7 (Ιοη Сгсззсг. ек.), рр.83-122, Асакет1с йгсзз. Ьопкои; и Веикет & Сегат1 (1987)). Эффекты как ΤΝΡ-α, так и ΤΝΡ-β инициируются их связыванием с рецепторами клеточной поверхности. Некоторые из этих эффектов являются, вероятно, благоприятными для организма: они могут разрушать, например, опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки, и усиливать антибактериальную активность гранулоцитов. Таким образом, ΤΝΡ обеспечивает защиту организма от опухолей и инфекционных агентов, и способствует его восстановлению от повреждения. Поэтому ΤΝΡ может быть использован в качестве противоопухолевого агента, который связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток, и, тем самым, инициирует процессы, приводящие к гибели опухолевых клеток. ΤΝΡ может быть также использован в качестве противоинфекционного агента.

Однако, как ΤΝΡ-α, так и ΤΝΡ-β обладают также неблагоприятным действием. Имеются данные, что сверхпродуцирование ΤΝΡ-α может играть главную роль в патогенезе некоторых заболеваний.

Так, например, известно, что действие ΤΝΡ-α, главным образом, на сосудистую сеть, является основной причиной возникновения симптомов септического шока ^тасеу е! а1., 1986). При некоторых заболеваниях, ΤΝΡ может вызывать чрезмерную потерю веса (кахексию), подавляя активность адипоцитов и стимулируя анорексию, из-за чего ΤΝΡ-α ранее называли кахетином. Этот факт был также описан как медиатор повреждения ткани при ревматических болезнях (ВеиЙет & Сегат1, 1987) и как главный медиатор повреждения тканей, наблюдаемого при реакциях трансплантат против хозяина (Ρί€]ΐ.^1 е! а1., 1987). Кроме того, известно, что ΤΝΡ участвует в процессах воспаления и во многих других заболеваниях.

Вышеуказанные биологические эффекты ΤΝΡ инициируют и/или опосредуют два различных, независимо экспрессируемых рецептора ΤΝΡ-К, р55 и р75, которые специфически связываются как с ΤΝΡ-α, так и с ΤΝΡ-β. Эти два рецептора имеют структурно различающиеся внутриклеточные домены, что дает основание предположить, что они различным образом передают сигнал (см., Нойтаии е! а1., 1989; Еиде1таии е! а1., 1990; Вгоскйаиз е! а1., 1990; Ьео^сйег е! а1., 1990; 8сйа11 е! а1., 1990; Ыорйат е! а1., 1990; διηίΐΐι е! а1., 1990; & Не11ег е! а1., 1990). Однако еще предстоит выяснить клеточные механизмы, например различные белки и возможно другие факторы, которые участвуют во внутриклеточной передаче сигнала ΤΝΡ-рецепторами р55 и р75. Внутриклеточная передача сигнала, происходит, очевидно, после связывания лиганда, то есть, ΤΝΡ (α или β), с рецептором, ответственным за инициацию каскада реакций, которые, в конечном счете, приводят к наблюдаемому ответу клетки на ΤΝΡ.

Что касается вышеупомянутого цитоцидного эффекта ΤΝΡ, то в большинстве клеток, исследованных до настоящего времени, этот эффект стимулируется, главным образом, рецептором р55 ΤΝΡ-К. Антитела против внеклеточного домена (домена, связывающегося с лигандом) р55 ΤΝΡ-К, сами могут стимулировать цитоцидный эффект (см., ЕР 412486), который коррелирует с эффективностью перекрестного сшивания рецептора с антителами, что, очевидно, является первой стадией генерирования процесса внутриклеточной передачи сигнала. Кроме того, исследования мутаций (Втакейизсй е! а1., 1992; Τа^ίадйа е! а1., 1993) показали, что биологическая функция р55 ΤΝΡ-К зависит от целостности внутриклеточного домена, и в соответствии с этим было высказано предположение, что инициация передачи внутриклеточного сигнала, приводящая к цитоцидному эффекту ΤΝΡ, происходит в результате асоцииации двух или более внутриклеточных доменов р55 ΤΝΡ-К. Более того, ΤΝΡ (α или β) присутствует в форме гомотримера, и было высказано предположение, что в этой форме он индуцирует внутриклеточную передачу

- 1 006874 сигнала посредством р55 ΤΝΕ-К благодаря его способности связываться и перекрестно сшиваться с молекулами рецептора, то есть, вызывать агрегацию рецепторов.

Другим членом суперсемейства рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε является рецептор ЕА8 (ЕА8-К), который также был назван ЕА8-антигеном, белком клеточной поверхности, экспрессируемым в различных тканях и имеющим гомологию с рядом рецепторов клеточной поверхности, включая ΤΝΕ-К и ΝΟΕ-К. ЕА8-К опосредует гибель клеток в форме апоптоза (1!ой е! а1., 1991), и, очевидно, служит в качестве негативного селектора аутореактивных Т-клеток, то есть, в процессе созревания Т-клеток, ЕА8-К опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих свои собственные антигены. Было также обнаружено, что мутации в гене ЕА8-К (1рг) вызывают лимфопролиферативные расстройства у мышей, напоминающие аутоиммунное заболевание человека, системную красную волчанку (СКВ) (Аа1аиаЬе-Ецкииада е! а1., 1992). Очевидно, что лиганд для ЕА8-К представляет собой ассоциированную с клеточной поверхностью молекулу, присутствующую, среди прочих, на Т-клетках-киллерах (или цитотоксических Т-лимфоцитах ЦТЛ), а поэтому при контактировании ЦТЛ с клетками, несущими ЕА8-К, они способны индуцировать апоптотическую гибель ЕА8-К-несущих клеток. Кроме того, были получены моноклональные антитела, которые являются специфичными для ЕА8-К, и эти моноклональные антитела способны индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущих ЕА8-К, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей человеческий ЕА8-К (Ной е! а1., 1991).

Заявителями был разработан ряд методов (см., например, Европейские заявки №№ ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) регуляции неблагоприятных эффектов ЮТ, предусматривающих ингибирование связывания ЮТ с их рецепторами с использованием антител против ΤNΕ или с использованием растворимых ТКЕ-рецепторов (в основном, растворимых внеклеточных доменов этих рецепторов) для конкурирования с ТКЕ за связывание со связанными с клеточной поверхностью ЮТ-К. Кроме того, исходя из того факта, что связывание ЮТ со своим рецептором является необходимым для ТКЕиндуцирования клеточных эффектов, заявителями были разработаны способы (см., например, ЕР 568925) модуляции ТКЕ-эффекта путем модуляции активности ТКЕ-К.

Вкратце, ЕР 568925 относится к способу модуляции передачи сигнала и/или расщепления ТКЕ-К, благодаря чему пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, что приводит к модуляции нормальной функции ТКЕ-К. В ЕР 568925 описаны конструирование и характеризация различных мутантных р55 ЮТ-К, имеющих мутации во внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах р55 ТКЕ-К. Таким образом, области, присутствующие в вышеуказанных доменах р55 ЮТ-К, были идентифицированы как области, имеющие важное значение для функционирования рецептора, то есть, для связывания лиганда (ТЫЕ) и последующей передачи активирующего сигнала и каскада реакций внутриклеточного распространения сигнала, которые, в конечном счете, приводят к наблюдаемому воздействию ТКЕ на клетки. Кроме того, был также описан ряд способов выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, способных связываться с различными участками в вышеуказанных доменах ЮТ-К, где указанные белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модуляции активности ЮТ-К. В ЕР 568925 описан также ряд способов выделения и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; способов конструирования экспрессирующих векторов для продуцирования этих белков и пептидов; и способов получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с ЮТ-К или с вышеуказанными белками и пептидами, связывающимися с различными областями ЮТ-К. Однако, в ЕР 568925 не указаны конкретные белки и пептиды, которые связываются с внутриклеточными доменами ТКЕ-К (например, р55 ТКЕ-К), а также не описан способ с использованием двойных дрожжевых гибридов для выделения и идентификации таких белков или пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами ТКЕ-К. Аналогичным образом, в ЕР 568925 не описаны белки или пептиды, способные связываться с внутриклеточным доменом ЕА8-К.

Хотя известно, что рецепторы фактора некроза опухоли (ТКЕ) и структурно родственный рецептор ЕА8-К запускают в клетках после их стимуляции лейкоцит-продуцированными лигандами, деструктивную активность, что приводит к их собственной гибели, механизмы данного запуска пока еще мало понятны. Исследования мутаций показали, что в передаче сигнала цитотоксичности рецептором ЕА8-К и рецептором р55 ЮТ-К (р55-К) участвуют различные области внутриклеточных доменов этих рецепторов (ВгакеЬикей е! а1., 1992; Тайадйа е! а1., 1993; Ной & Када!а, 1993). Данные области (домены гибели) имеют схожие последовательности. Домены гибели как рецептора ЕА8-К, так и рецептора р55-К имеют тенденцию к самоассоциации. Их самоассоциация, очевидно, стимулирует агрегацию этих рецепторов, которая необходима для инициации передачи сигнала (см. 8оид е! а1., 1994; Аайаей е! а1., 1994; Во1Ши е! а1., 1995), и, при высоких уровнях экспрессии рецептора, она может приводить к стимуляции лиганднезависимой передачи сигнала (Во1Ши е! а1., 1995).

Подобно другим рецептор-индуцированным эффектам, индуцирование гибели клеток рецепторами ЮТ и ЕА8-К осуществляется посредством серии белок-белковых взаимодействий, происходящих в результате связывания лиганда с рецептором, и, в конечном счете, активации ферментных эффекторных функций, которые в конкретных исследованиях пролили свет на неферментативные белок-белковые взаимодействия, которые инициируют передачу сигнала гибели клеток: связывание молекул тримерного

- 2 006874

ΤΝΡ или ΕΆ8-Κ-лиганда с рецепторами, что приводит к взаимодействию их внутриклеточных доменов (ВтакеЬиксй е! а1., 1992; ТаПадйа е! а1., 1993; Ной & №да!а, 1993), усиленному благодаря способности мотивов доменов гибели к самоассоциации (Βο1άίη е! а1., 1995а), и индуцированному благодаря связыванию двух цитоплазматических белков (которые могут также связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов МСЖТ-1(или ΕΆΌΌ) с ЕЛ8-К (Βοϊάίη е! а1., 1995Ь, СЫппа1уаи е! а1., 1995; 1<15с11ке1 е! а1., 1995) и ΤΚΑΌΌ с р55-К (Нки е! а1., 1995; Нки е! а1., 1996). Три белка, которые связываются с внутриклеточным доменом ЕЛ8-К и р55-К в области домена гибели, участвующей в индуцировании гибели клеток благодаря рецепторам посредством гетероассоциации гомологичных областей, и которые также способны независимо стимулировать гибель клеток, были идентифицированы методом скрининга с использованием дрожжевого двойного гибрида. Одним из них является белок, ΜΟΚΤ-1 (Βο1άίη е! а1., 1995Ь), также известный как ΕΆΌΌ (СЫппа1уап е! а1., 1995), который специфически связывается с ЕЛ8-К. Второй белок, ΤΚΑΌΌ (см. также Н§ц е! а1., 1995,1996), связывается с р55-К, а третий белок, ΚΙΡ (см. также 8!аидет е! а1., 1995), связывается как с РЛ8-К, так и с р55-К. Помимо их связывания с РЛ8-К и р55Κ, эти белки также способны связываться друг с другом, что приводит к функциональным помехам между РЛ8-К и р55-К. Это связывание происходит посредством консервативного мотива последовательности, модуля домена гибели, общего для рецепторов и ассоциированных с ними белков. Кроме того, хотя в тесте с использованием дрожжевого двойного гибрида было показано, что ΜΟΚΤ-1 спонтанно связывается с РЛ8-К в клетках млекопитающих, однако это связывание имеет место только после стимуляции рецептора, что дает основание предположить, что ΜΟΚΤ-1 участвует в инициировании событий передачи сигнала РЛ8-К. ΜΟΚΤ-1 не содержит ни одного мотива последовательности, характерного для ферментативной активности, а поэтому, способность ΜΟΚΤ-1 стимулировать гибель клеток, очевидно, не является его собственной присущей ему активностью, а скорее, она является следствием активации некоторого другого белка(ов), который связывается с ΜΟΚΤ-1 и является следующим звеном каскада реакций передачи сигнала. Было показано, что клеточная экспрессия мутантов ΜΟΚΤ-1, в которых отсутствует М-концевая часть молекулы, блокирует индуцирование цитотоксичности белками ΡΆ8/ΆΡΘ1 (РЛ8-К) или р55-В (Н§ц е! а1.. 1996; СЫппа1уаи е! а1., 1996), что указывает на то, что эта Ν-концевая область передает сигнал цитоцидного действия обоих рецепторов посредством белок-белковых взаимодействий.

Таким образом, очевидно, что мотивы домена гибели рецепторов р55-К и РЛ8-К, а также три ассоциированных с ними белка ΜΟΚΤ-1, ΚΙΡ и ΤΚΑΌΌ являются участками белок-белковых взаимодействий. Эти три белка ΜΟΚΤ-1, ΚΙΡ и ΤΚΑΌΌ взаимодействуют с внутриклеточными доменами р55-К и РА8-К посредством связывания их доменов гибели с рецепторами; что же касается ΚΙΡ и ΤΚΑΌΌ, то их домены гибели также способны к самоассоциации, хотя ΜΟΚΤ-1 отличается от них в этом отношении, и его домен гибели не способен к самоассоциации. Кроме того, ΜΟΚΤ-1 и ΤΚΑΌΌ различным образом связываются с РА8-К и р55-К, а также связываются друг с другом. Более того, как ΜΟΚΤ-1, так и ΤΚΑΌΌ эффективно связываются с ΚΙΡ. В соответствии с этим, очевидно, что взаимодействие между тремя белками ΜΟΚΤ-1, ΚΙΡ и ΤΚΑΌΌ является важной частью всей модуляции внутриклеточной передачи сигнала, опосредованной этими белками. Препятствие взаимодействию между этими тремя внутриклеточными белками будет приводить к модуляции эффектов, вызываемых этим взаимодействием. Так, например, ингибирование связывания ΤΚΑΌΌ с ΜΟΚΤ-1 может модулировать взаимодействие РА8-К с р55 ΤNΡ-Κ. Аналогичным образом, ингибирование ΚΙΡ, помимо вышеуказанного ингибирования связывания ΤΚΑΌΌ с ΜΟΚΤ-1, может кроме того, модулировать взаимодействие РЛ?^ с р55 ΤΝΡ-Κ.

Моноклональные антитела, продуцированные против домена гибели р55-^ а в частности, против связывающего центра участков ΤΚΑΌΌ и ΚΙΡ, могут быть также использованы для ингибирования или предотвращения связывания этих белков, и таким образом, для модуляции взаимодействия между ΡΑ8-Κ ир55-К

Более того, недавно было также обнаружено, что помимо вышеуказанной цитотоксической активности и ее модуляции, опосредованной различными рецепторами и связывающимися с ними белками, включая ΡЛ8-Κ. р55-^ ΜΟΚΤ-1, ΤΚΑΌΌ, ΚΙΡ, ΜΑΟΉ, Μ№4 и 01, ряд этих рецепторов и связывающихся с ними белков также участвуют в модуляции активности ядерного фактора транскрипции №-кВ, который является ключевым медиатором выживания клеток или их жизнеспособности, и который является ответственным за регуляцию экспрессии многих генов иммунного и воспалительного ответа. Так, например, было установлено, что Τ^-α может фактически стимулировать активацию №-кВ, а поэтому Τ^-α, способен индуцировать два вида сигнала в клетках, один сигнал, вызывающий гибель клетки, и другой сигнал, защищающий клетки от гибели путем индуцирования экспрессии гена посредством №кВ (см, Вед & ВаШтоте, 1996; \Уапд е! а1., 1996; Уап Αη!^ιρ е! а1., 1996). Аналогичный двойной эффект был также описан для ΡΑ8-Κ (см. ссылку на этот эффект, приводимую в вышеуказанной работе Уап Αηί^е^р е! а1., 1996). Из этого следует, что существует хрупкое равновесие между гибелью и выживанием клеток после стимуляции различных типов клеток с ΤNΡ-α и/или ΡΑ8-Κ-лигандом, причем, конечный результат этой стимуляции зависит от того, какой внутриклеточной каскад реакций стимулируется в

- 3 006874 большей степени: тот, что приводит к гибели клетки (обычно по типу апоптоза), либо тот, что приводит к выживанию клетки посредством активации ΝΡ-κΒ.

Кроме того, недавно авторами настоящего изобретения был установлен возможный механизм, посредством которого члены семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ активируют ΝΡ-κΒ (см., Майши с1 а1., 1997, и различные соответствующие ссылки, представленные в этой работе; и совместную одновременно рассматриваемую заявку на патент Израиля №№ 1Ь 117800 и 1Ь 119133). Короче говоря, отсюда следует, что несколько членов семейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ способны активировать ΝΡ-κΒ посредством общего белка-адаптора, Тта£2. Только что выявленная протеин-киназа, названная ΝΙΚ (см. выше, Майши с1 а1., 1997, 1Ь 117800 и 1Ь 119133) способна связываться с ТгаГ2 и стимулировать активность ΝΡ-κΒ. Действительно, было показано (см. вышеуказанную работу Майши с1 а1., и заявки 1Ь), что экспрессия в клетках мутантов, дефицитных по киназе ΝΙΚ, приводит к тому, что эти клетки становятся неспособными к стимуляции ΝΡ-κΒ нормальным эндогенным образом, и также к тому, что в этих клетках блокируется индуцирование ΝΡ-κΒ-активности фактором ΤΝΡ посредством любого ΡΑ8-Κ, и блокируется индуцирование ΝΡ-κΒ белками ΤΚΑΟΌ, ΚΙΡ и МОКТ-1 (которые являются белками-адаптерами, связывающимися с этими рецепторами р55-К и/или ΡΑ8-Κ). Все эти рецепторы р55-К, р75-К, ΡΑ8-Κ и их белки-адапторы МОКГ-1, ΤΚΑΌΌ, и ΚΙΡ прямо или опосредованно связываются с ΤηΓ2. которые, благодаря своей способности связываться с ΝΙΚ, очевидно, модулируют индуцирование ΝΡ-κΒ.

Очевидно, что из вышеуказанных белков-модуляторов, участвующих в хрупком равновесии между гибелью и выживанием клеток после стимуляции ΡΑ8-Κ и/или р55-К, белок ΚΙΡ играет важную роль. Белок ΚΙΡ (см. §1аидет с1 а1., 1995, а также Майши с1 а1., 1997) имеет в своей С-концевой области домен гибели, способный индуцировать цитотоксичность клетки независимым образом, а также путем ассоциации с доменами гибели МОКГ-1, р55-К, ΡΑ8-Κ и ΤΚΑΟΌ. В своей Ν-концевой области, ΚΙΡ также имеет протеин-киназный домен и промежуточный домен, который, очевидно, способен перекрестно взаимодействовать (связываться) с Τη-ιΏ, и, тем самым, участвовать в индуцировании ΝΡ-κΒ. В соответствии с этим, детали, касающиеся характеристик и последовательностей ΚΙΡ (ДНК и аминокислотной последовательности), приводятся в вышеуказанных публикациях (в частности, §(аидег е1 а1., 1995), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является получение нового белка ΚΑΡ, включая все его изоформы, аналоги, фрагменты или производные, способные связываться с белком ΚΙΡ (называемым далее ΚΙΡ). Поскольку ΚΙΡ способен прямо или опосредованно взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами воспаления, клеточной цитотоксичности/клеточной гибели, такими как, р55-К и ΡΑ8-Κ, и с ассоциированными с ними белками-адапторами или белками-модуляторами, такими как, например, МОКГ-1, ΤΚΑΟΌ, МАСН, Мей4, С1 и другие, то из этого следует, что новые белки настоящего изобретения, благодаря своей способности связываться с ΚΙΡ, способны влиять на процесс внутриклеточной передачи сигнала, инициированный связыванием ΡΑδ-лиганда со своим рецептором, и связыванием ΤΝΡ со своим рецептором (р55-К), и что эти новые белки настоящего изобретения, как таковые, являются модуляторами р55-К- и ΡΑδ-Κ-опосредованного воздействия на клетки. Поскольку ΚΙΡ также способен взаимодействовать с ΤΓηΓ2, и, тем самым, способен прямо или опосредованно взаимодействовать с ΝΙΚ, и, кроме того, ΚΙΡ сам по себе действует как модулятор процессов воспаления и выживания клеток, включая индуцирование ΝΡ-κΒ, то следовательно, новые белки настоящего изобретения являются модуляторами ΚΙΡ-ассоциированного воспаления и активности выживания клеток. Аналогичным образом, посредством ΡΑ8-Κ, р55-К и их белков-модуляторов МОКГ-1 и ΤΚΑΌΌ, способных индуцировать ΝΡ-κΒ и выживание клеток либо прямо, либо опосредованно путем связывания с ΚΙΡ или путем связывания с ΤΓηΓ2, с которыми связывается ΚΙΡ, белки настоящего изобретения могут быть также медиаторами процессов выживания клеток, действуя посредством общих или сходных механизмов внутриклеточной передачи сигнала, где различные вышеуказанные белки индуцируют выживание клеток. Аналогичным образом, поскольку р75-К связывается с ΤΓηΓ2, с которым связывается ΚΙΡ, то новые белки настоящего изобретения могут быть также модуляторами ΚΙΡ-ассоциированного опосредования р75-Р-опосредованной активности.

Другой целью настоящего изобретения является получение антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений, или даже некоторых изоформ) по отношению к вышеуказанным новым белкам ΚΑΡ, их изоформам, аналогам, фрагментам и производным, которые могут быть использованы для ингибирования процесса передачи сигнала, или, более конкретно, процессов воспаления, цитотоксичности, или выживания клеток, если это необходимо.

Другой целью настоящего изобретения является использование вышеуказанных новых белков ΚΑΡ, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных для выделения и характеризации дополнительных белков или факторов, которые могут участвовать в регуляции рецепторной активности, например, других белков, которые могут связываться с белками ΚΑΡ и влиять на их активность, и/или для выделения и идентификации других рецепторов, которые принимают участие в предыдущих или последующих реак

- 4 006874 циях данного процесса(ов) передачи сигнала, и с которыми связываются эти новые белки, их аналоги, фрагменты и производные, а поэтому, в функции которых, эти белки также принимают участие.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение ингибиторов, которые могут быть введены в клетки для связывания или взаимодействия с КАР и с возможными изоформами КАР, где указанные ингибиторы могут ингибировать К1Р-ассоциированную активность в клеточных цитотоксических процессах, а поэтому, если это необходимо, повышать способность клеток к выживанию, либо они могут ингибировать К1Р-ассоциированную активность в процессах выживания клеток, а поэтому, если это необходимо, усиливать клеточную цитотоксичность.

Кроме того, целью настоящего изобретения является использование вышеупомянутых белков КАР, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для получения поликлональных и/или моноклональных антител против этих белков. Эта антитела, в свою очередь, могут быть использованы, например, для выделения новых белков из различных источников, таких как, клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии.

Более того, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей, например, для идентификации расстройств, связанных с неправильным функционированием клеточные эффектов, опосредованных р55-К, БА8-К или других родственных рецепторов.

Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, содержащих вышеуказанные новые белки КАР, их изоформы, или их аналоги, фрагменты или производные, а также фармацевтических композиций, содержащих вышеуказанные антитела или другие антагонисты.

В соответствии с настоящим изобретением был выделен новый белок КАР. КАР способен связываться или взаимодействовать с К1Р, и следовательно, является модулятором или медиатором внутриклеточной активности К1Р. К1Р участвует в модуляции или опосредовании каскадов реакций внутриклеточной передачи сигнала, например процессов, ассоциированных с клеточной цитотоксичностью или с гибелью клеток, в которых К1Р обладает собственной цитотоксической активностью, а также цитотоксической активностью в комбинации, прямо или опосредованно, с рядом других ассоциированных с клеточной гибелью белков, таких как, например, МОКТ-1, ТКАЭБ, МАСН, Ме114. 61, р55-К и БА8-К, с которыми К1Р может ассоциироваться или связываться прямо или опосредованно через мотив/модуль домена гибели, присутствующий в К1Р и во всех вышеуказанных белках; других каскадов реакций, которыми являются процессы воспаления, выживания или жизнеспособность клеток, где К1Р может играть активирующую роль, прямо или опосредованно, благодаря присутствию киназного мотива или домена, присутствующего в К1Р, и способности К1Р связываться с Тга£2, который может связываться с ΝΙΚ, который, в свою очередь, непосредственно участвует в активации ΝΡ-κΒ, играющего центральную роль в воспалении и выживании клеток. Кроме того, р55 и ТКАЭБ способны взаимодействовать с Тга12, а также участвуют в активации ΝΡ-κΒ, и, тем самым, в механизме выживания клеток, а поэтому К1Р, благодаря своей способности связываться или взаимодействовать с р55, БА8-К и ТКАЭБ (а также с Тга12), может также участвовать, посредством этих белков, в модуляции воспаления и активации выживания клеток. В соответствии с этим, К1Р является модулятором или медиатором этих процессов, а значит, КАР настоящего изобретения, благодаря связыванию с К1Р, является модулятором или медиатором указанных внутриклеточных каскадов реакций.

КАР был выделен и клонирован с использованием дрожжевой двухгибридной системы, а также был секвенирован и охарактеризован, и как будет подробно описано ниже, КАР представляет собой высокоспецифический К1Р-связывающий белок, а следовательно он является специфическим К1Рмодулятором/медиатором. КАР не связывается с ТКАЭБ, МОКТ-1, р55-К, р75-К и МАСН. Кроме того, очевидно, что КАР не содержит характерного модуля или мотива домена гибели, что подтверждает обнаруженный факт, что КАР сам по себе не индуцирует клеточную цитотоксичность.

Используемое в настоящем описании понятие К1Р-активность означает его активность в модуляции/опосредовании процессов воспаления и гибели/выживания клеток, и его активность в модуляции/опосредовании процесса выживания клеток. Эти активности описаны выше и ниже в настоящем описании, а также в вышеупомянутых публикациях и патентных заявках, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Аналогично, используемое в настоящем описании понятие КАР-активность означает его активность в модуляции/опосредовании К1Р-активности благодаря своему специфическому связыванию с К1Р, причем, эта КАР-опосредованная модуляция активности К1Р включает модуляцию/опосредование процессов воспаления и гибели/выживания клеток, в которых К1Р участвует прямо или опосредованно, а поэтому, КАР, как таковой, может рассматриваться как непрямой модулятор/медиатор всех вышеупомянутых белков, и возможно, ряда других белков, которые участвуют в воспалении, гибели и выживании клеток, и с которыми связывается К1Р, или с которыми К1Р взаимодействует прямым или непрямым способом.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, был получен новый белок, обозначенный КАР. Как указывалось выше, КАР был выделен и клонирован методом двухгибридного скрининга, и охарактеризован как молекула, которая связывается с К1Р. Секвенирование КАР, которое проводили путем сравнения последовательности КАР с различными последовательностями, имеющимися в базе дан

- 5 006874 ных, например, в СспсЬапк бЬсхГ и в базах данных человеческого генома уровня 1 (Нитап Сспотс Эа1аЬахс). выявило, что он является новым белком, и какой-либо гомологии между последовательностью КАР и известными последовательностями обнаружено не было. Фактически были обнаружены две последовательности ДНК, отличающиеся только своими 5'-некодирующими областями, которые, вероятно, произошли от того же самого гена вследствие альтернативного сплайсинга.

Еще остается выяснить, каким образом КАР связывается с К1Р, а в частности, необходимо определить области гомологии или связывания КАР с К1Р, которые обеспечивают их связывание друг с другом. Очевидно, что КАР не содержит ни модуля домена гибели, ни какой-либо другой известной области ферментативной или другой активности, например, киназного или протеазного домена.

Исходя из вышеупомянутого следует, что, как указано выше и как будет указано ниже, КАР является, по видимому, специфическим К1Р-связывающим белком, а поэтому модулятором/медиатором внутриклеточной активности К1Р.

Таким образом, вполне очевидно, что КАР играет определенную роль в модуляции/опосредовании активности, направленной на воспаление, выживание и/или гибель клеток, в которой К1Р участвует прямо или опосредованно, а особенно, активности, направленной на цитотоксичность и воспаление, вызываемое или индуцированное различными стимуляторами, включая сигналы, передаваемые рецепторами семейства ΤΝΕ/ΝΟΕ и возможно другими рецепторами (для схемы участия К1Р в этих внутриклеточных событиях, а следовательно и участия КАР, см. фиг. 1 в работе Ма11шп с1 а1., 1997).

КАР может также служить в качестве ингибитора клеточной цитотоксичности и воспаления благодаря его присутствию как части комплекса с другими белками, например, с К1Р и белками, связанными с К1Р, и, как таковой, он может влиять на цитотоксические или воспалительные эффекты этих других белков (например, р55-К, ЕА8-К, МАСН, Мсй4, 01 и МОКТ-1), что, в конечном счете, приводит к ингибированию их цитотоксической активности или их активности при воспалении.

КАР может также служить в качестве усилителя или стимулятора клеточной цитотоксичности и воспаления, и данный эффект достигается путем стимуляции активности других белков, например К1Р и других белков, связанных с К1Р, которые, как отмечено выше, обеспечивают К1Р-опосредованный рекрутинг этих белков, причем указанный рекрутинг служит для стимуляции цитотоксической активности различных белков или для стимуляции их воспалительных эффектов.

Аналогичным образом, КАР может также служить в качестве ингибитора или стимулятора каскада реакций, направленных на выживание клеток, благодаря, как отмечено выше, участию К1Р в этом каскаде реакции.

В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей К1Р-ассоциированный белок (КАР), его лизоформы, аналоги или фрагменты, способные связываться с К1Р и модулировать или опосредовать внутриклеточную активность К1Р, причем указанная внутриклеточная активность направлена на модуляцию/опосредование воспаления и/или гибель клеток и/или выживание клеток.

В частности, настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из:

(a) последовательности кДНК, происходящей от кодирующей области нативного белка КАР;

(b) последовательностей ДНК, которые способны гибридизоваться с последовательностью (а) в умеренно жестких условиях и которые кодируют биологически активный белок КАР; и (c) последовательностей ДНК, которые являются вырожденными вследствие вырожденности генетического кода для последовательностей ДНК, определенных в (а) и (Ь), и которые кодируют биологически активный белок КАР.

Другим конкретным вариантом вышеуказанной последовательности ДНК настоящего изобретения является последовательность ДНК, содержащая, по крайней мере, часть последовательности, кодирующей по крайней мере одну изоформу белка КАР. Другим вариантом является последовательность ДНК, кодирующая белок КАР, показанная на фиг. 1. Еще одним вариантом является последовательность белка КАР, показанная на фиг. 2 и выведенная из последовательности ДНК фиг. 1.

Настоящее изобретение относится к белкам КАР и его аналогам, фрагментам или производным, кодированным любой из вышеуказанных последовательностей настоящего изобретения; причем указанные белки, аналоги, фрагменты и производные способны к связыванию с К1Р и к модуляции/опосредованию его биологической активности во внутриклеточных каскадах реакций, направленных на гибель и/или выживание клеток.

Конкретным вариантом настоящего изобретения являются белок КАР, его аналоги, фрагменты и производные. Последовательность белка КАР, выведенная из последовательности ДНК фиг. 1, показана на фиг. 2. Другим вариантом настоящего изобретения является любая изоформа белка КАР, его аналоги, фрагменты и производные.

Настоящее изобретение также относится к векторам, кодирующим вышеуказанный белок КАР, и его аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения, которые содержат вышеуказанную последовательность ДНК настоящего изобретения; причем эти векторы способны экспрессироваться в подходящих эукариотических или прокариотических клетках-хозяевах; к трансформированным эукарио

- 6 006874 тическим или прокариотическим клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы; и к способу продуцирования белка ВАР, или его аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения путем культивирования указанных трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии указанного белка, его аналогов, фрагментов или производных, обеспечения посттрансляционных модификаций указанного белка, необходимых для получения указанного белка, и выделения указанного белка, его аналогов, фрагментов или производных из культуральной среды указанных трансформированных клеток или из клеточных экстрактов указанных трансформированных клеток. Вышеуказанные определения предполагают включение всех изоформ белка ВАР.

В другом своем аспекте настоящее изобретение также относится к антителам или их активным производным или фрагментам, обладающим специфичностью к белку ВАР и его аналогам, фрагментам и производным настоящего изобретения.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к различным способам использования вышеуказанных последовательностей ДНК или белков, кодируемых этими последовательностями в соответствии с настоящим изобретением, причем указанными способами использования являются среди прочих:

(ί) Способ модуляции внутриклеточных каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, модулированных или опосредованных белком ВАР, предусматривающий обработку указанных клеток одним или несколькими белками ВАР, их изоформами, аналогами, фрагментами или производными, способными связываться с В1Р, где указанная обработка указанных клеток предусматривает введение в указанные клетки указанных одного или более белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для их внутриклеточного введения; или введение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанные один или более белков, их изоформ, аналогов, фрагментов, или производных в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность; причем, указанный вектор является пригодным для эффективного введения указанной последовательности в указанные клетки так, чтобы эта последовательность экспрессировалась в указанных клетках.

(ίί) Способ модуляции каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных лигандами семейства ΤΝΡ путем их влияния на клетки посредством действия белка В1Р, как описано выше в (1), где указанная обработка клеток предусматривает введение в указанные клетки указанного белка ВАР или его изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для внутриклеточного введения; или введение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанный белок С1 или его изоформы, аналоги, фрагменты или производные в форме подходящего вектора, несущего указанную последовательность; причем, указанный вектор является пригодным для эффективного введения указанной последовательности в указанные клетки так, чтобы эта последовательность могла экспрессироваться в указанных клетках.

(ΐϊϊ) Способ, аналогичный описанному выше в (и), где указанную обработку указанных клеток проводят путем трансфекции указанных клеток рекомбинантным вектором на основе вирусов животных, и где указанный способ предусматривает проведение стадий:

а) конструирования рекомбинантного вектора на основе вируса животных, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), который способен связываться со специфическим рецептором клеточной поверхности на поверхности РА8-В- или р55-В-несущей клетки, и вторую последовательность, кодирующую белок, выбранный из белка ВАР, и его изоформ, аналогов, фрагментов и производных, который при его экспрессии в указанных клетках, способен модулировать/опосредовать процессы внутриклеточночного воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток; и (Ь) инфицирования указанных клеток указанным вектором (а).

(ίν) Способ модуляции каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных воздействием лигандов семейства ΤΝΡ на клетки посредством действия белка В1Р, где указанный способ предусматривает обработку указанных клеток антителами или их активными фрагментами или производными в соответствии с настоящим изобретением, где указанная обработка предусматривает введение в указанные клетки подходящей композиции, содержащей указанные антитела, их активные фрагменты или производные, и где, в том случае, если внеклеточную поверхность обрабатывают, по крайней мере, частью белка ВАР, то указанную композицию изготавливают для внеклеточного применения, а в случае, если указанные белки ВАР являются полностью внутриклеточными, то указанную композицию изготавливают для внутриклеточного применения.

(ν) Способ модуляции каскадов реакций воспаления, гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных воздействием лигандов семейства ΤΝΡ на клетки посредством действия белка В1Р, где указанный способ предусматривает обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по крайней мере части последовательности белка ВАР настоящего изобретения, где указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка ВАР.

(νί) Способ, описанный в п. (и) для обработки опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток или других патологических клеток, предусматривающий:

- 7 006874

а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок, способный связываться со специфическим рецептором поверхности опухолевой клетки или рецептором поверхности ВИЧ-инфицированной клетки, или рецептором, находящимся на поверхности другой патологической клетки; и последовательность, кодирующую белок, выбранный из белка КАР, его аналогов, фрагментов и производных настоящего изобретения, который, при его экспрессии в указанных опухолевых клетках, ВИЧ-инфицированных клетках или других патологических клетках, способен уничтожать указанные клетки посредством воздействия на них белка К1Р; и (Ь) инфицирования указанных опухолевых клеток, или ВИЧ-инфицированных клеток, или других патологических клеток указанным вектором.

(νίί) Способ модуляции каскадов реакций гибели клеток и/или выживания клеток, опосредованных воздействием лигандов семейства ΤΝΡ посредством действия на клетки белка К1Р, где указанный способ предусматривает процедуру обработки рибозимом, в которой вектор, кодирующий последовательность рибозима, способного взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей белок КАР настоящего изобретения, вводят в указанные клетки в такой форме, которая обеспечивает экспрессию указанной рибозимной последовательности в указанных клетках, и где в случае, если указанная рибозимная последовательность экспрессируется в указанных клетках, то она взаимодействует с указанной клеточной последовательностью мРНК и расщепляет эту последовательность мРНК, что приводит к ингибированию экспрессии указанного белка КАР в указанных клетках.

(νίίί) Способ, выбранный из вышеуказанных способов настоящего изобретения, где указанная последовательность, кодирующая белок КАР, содержит по крайней мере одну из изоформ КАР, или один из его аналогов, фрагментов и производных настоящего изобретения, которые способны связываться с К1Р.

(ίχ) Способ выделения и идентификации белков настоящего изобретения, способных связываться с белком К1Р, предусматривающий проведение процедуры с использованием дрожжевого двойного гибрида, где последовательность, кодирующая указанный белок К1Р, или присутствующая в одном гибридном векторе, и последовательность из библиотеки кДНК или библиотеки геномных ДНК, присутствует во втором гибридном векторе, и где эти векторы затем используют для трансформации дрожжевых клетокхозяев, после чего позитивные трансформированные клетки выделяют, и указанный второй гибридный вектор экстрагируют с получением последовательности, кодирующей белок, который связывается с указанным белком К1Р.

(х) Способ, описанный выше в пп.(1)-(1х), где указанным белком КАР является любая из изоформ КАР, или любой из его аналогов, фрагментов и производных.

(χί) Способ, описанный выше в пп.(1)-(х), где белок КАР или любая из его изоформ, или любой из его аналогов, фрагментов и производных участвует в модуляции клеточного эффекта, опосредованного или модулированного любым другим медиатором или индуктором, с которым указанный белок КАР или его изоформа, аналог, фрагмент или производное может связываться прямо или опосредованно.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для модуляции процессов воспаления, и гибели и/или выживания клеток, опосредованных воздействием семейства ΤΝΡ на клетки посредством действия на вышеуказанные клетки белка К1Р или другого медиатора или индуктора, где указанная композиция включает в качестве активного ингредиента любой из следующих компонентов:

(ί) белок КАР настоящего изобретения или его биологически активные фрагменты, аналоги, производные, или их смеси;

(й) рекомбинантный вектор на основе вируса животного, кодирующий белок, способный связываться с рецептором клеточной поверхности, и кодирующий белок КАР или его биологически активные фрагменты или аналоги настоящего изобретения;

(ш) олигонуклеотидная последовательность, кодирующая антисмысловую последовательность белка КАР настоящего изобретения, где указанный олигонуклеотид может быть второй последовательностью рекомбинантного вектора на основе вируса животного, определенного выше в п.(и).

Настоящее изобретение также относится:

I. К способу модуляции процессов воспаления и внутриклеточных процессов гибели и/или выживания клеток, модулированных/опосредованных белком К1Р или действием любого другого медиатора или индуктора, или любого другого индуктора или ингибитора ΝΡ-κΒ на клетки, где указанный способ предусматривает обработку этих клеток в соответствии со способом настоящего изобретения, описанным выше в пп.(1)-(х), белком КАР, его изоформами, аналогами, фрагментами или производными, или последовательностями, кодирующими белки КАР, или его изоформы, аналоги или фрагменты, где указанная обработка приводит к усилению или к ингибированию указанного К1Р-опосредованного эффекта, и, тем самым, также эффекта, опосредованного РА8-К- или р55-К, либо другим медиатором или индуктором, либо индуктором или ингибитором ΝΡ-κΒ.

- 8 006874

II. К способу, указанному выше, где указанный белок КАР, его аналог, фрагмент или производное является частью белка КАР, который участвует в специфическом связывании с К1Р, или с другим медиатором или индуктором, или с другим индуктором или ингибитором ΝΡ-кБ, либо последовательность указанного белка КАР кодирует часть белка КАР, который участвует в специфическом связывании с К1Р, или с другим медиатором или индуктором, или с другим индуктором или ингибитором ΝΡ-кБ.

III. К способу, описанному выше, где указанный белок КАР является одной из изоформ КАР, способной усиливать К1Р-ассоциированный эффект.

IV. К способу, описанному выше, где указанный белок КАР является одной из изоформ КАР, способной ингибировать КГР-ассоциированное действие на клетки, или действие на клетки, опосредованное другим медиатором или индуктором, и, тем самым, также ингибировать РА8-К- или р55-Кассоциированное действие на клетки, или действие на клетки другого цитотоксического медиатора или индуктора.

V. К способу, описанному выше, где указанный белок КАР, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны усиливать или ингибировать КГР-ассоциированное действие на процесс воспаления и выживания клетки путем прямого или опосредованного ингибирования ΝΡ-кВ, или путем прямой или опосредованной активации ΙΝΚ или киназы р38.

Выделение белков КАР, их идентификация и характеризация могут быть осуществлены любыми стандартными методами скрининга, используемыми для выделения и идентификации белков, например методом с использованием дрожжевого двойного гибрида, методами аффинной хроматографии, и любыми другими хорошо известными стандартными методами, обычно используемыми в этих целях.

Другие аспекты и варианты настоящего изобретения будут также понятны из нижеследующего подробного описания изобретения.

При этом следует отметить, что используемые в описании термины модуляция/опосредование действия ШР, или РА8-К-лиганда, или ΤΝΡ на клетки и любые другие из таких модуляций/опосредований, упомянутых в настоящей заявке, также включают ίη νίίτο и ίη νίνο-обработку, и, помимо этого, также включают ингибирование или усиление/увеличение.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая КАР; и на фиг. 2 показана выведенная аминокислотная последовательность КАР.

Подробное описание изобретения

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к новым белкам КАР, которые способны связываться с белком ШР, и, тем самым, опосредовать или модулировать внутриклеточную активность ШР, особенно в тех случаях, где ШР участвует в модуляции или опосредовании каскадов реакций воспаления, гибели клеток/выживании клеток, подробно описанных выше. Таким образом, КАР может ингибировать активность КГР в каскадах реакций воспаления, гибели клеток/выживания клеток; КАР может усиливать активность ШР в процессах воспаления или гибели/выживания клеток; либо он может усиливать активность КГР в одном из указанных процессов, и ингибировать активность ШР в другом.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому белку КАР. КАР был секвенирован и охарактеризован, и было обнаружено, что КАР представляет собой КГР-связывающий белок, который имеет высокую специфичность по отношению к ШР, но не связывается с рядом белков, о которых известно, что они участвуют во внутриклеточной передаче сигнала, которая приводит к воспалению, гибели клеток или выживания клеток. КАР, очевидно, также не содержит ни одного домена, общего с белками, которые проявляют активность в любом из этих каскадов реакций, то есть, КАР не содержит мотив или модуль домена гибели, и он не содержит киназного мотива или домена, а также он не содержит протеазного домена или мотива. Определенная последовательность КАР также представляет собой уникальную последовательность, как было установлено, исходя из сравнения с последовательностями в ряде баз данных, включая ОепеЬапк, базы данных человеческого генома уровня 1 (Нитап Оепоте ЭаЮЬахе) и кЬех1. Как было подробно описано выше (также со ссылками на все указанные публикации и патентные заявки), ШР участвует во внутриклеточных каскадах реакций воспаления, и гибели/выживания клеток. Поэтому, регуляция или контроль активности ШР может обеспечивать регуляцию любого или всех из этих процессов при инициации этих процессов, например, путем связывания ΤΝΡ- или Рак-лиганда с их рецепторами (в частности, рецепторами для ΤΝΡ, р55-К). КГР может играть ключевую роль в определении, какой из указанных процессов активирован в большей степени, и такое определение может быть осуществлено благодаря способности ШР связываться с рядом цитотоксических белков, содержащих домены гибели, а также с рядом белков, обладающих киназной активностью. В соответствии с этим, белки, такие как белок КАР настоящего изобретения, который может специфически связываться с ШР, может играть важную роль в модуляции КГ-активности, и тем самым в модуляции степени индуцирования одного из процессов по отношению к другим процессам. Таким образом, белок КАР настоящего изобретения является важным модулятором или медиатором внутриклеточного сигнала.

Вследствие уникальной способности рецепторов РА8-К и ΤΝΡ вызывать гибель клеток, а также способности рецепторов ΤΝΡ стимулировать различные другие активности, направленные на разрушение тканей, абберация функции этих рецепторов может особенно пагубно влиять на организм. Действи

- 9 006874 тельно, было показано, что как избыток, так и дефицит функции этих рецепторов способствует развитию патологических симптомов различных заболеваний. Идентификация молекул, которые принимают участие в активности этих рецепторов в передаче сигналов, и выявление механизмов модуляции функции этих молекул, возможно, является ключом для разработки новых терапевтических методов лечения этих заболеваний. В связи с предполагаемой важной ролью КГБ в ЕА8-К- и р55-К-токсичности, а следовательно и предполагаемой важной регуляторной ролью КА₽ в ΡΙΡ-опосредованной модуляции ЕА8-К и ΤΝΡ, очевидно, что особенно важно разработать нужные лекарственные средства, которые могут блокировать цитотоксическую функцию ΡΙΡ, вероятно, посредством блокирования связывания КА₽ с ΡΙΡ или какимлибо другим способом ингибировать взаимодействие между КА₽ и ΡΙΡ в таких условиях, при которых КΑΡ способствует усилению ΡΙΡ-опосредованной цитотоксичности (как показано выше, ΡΙΡ является цитотоксичным сам по себе и в комбинации с другими белками, которые содержат области домена гибели).

Аналогичным образом, также известно (см. выше), что ЕА8-К и р55-К участвуют в активации ΝΡкВ, и, тем самым, в выживании клеток. В соответствии с этим, если нужно уничтожить клетки, например, раковые клетки, ВИЧ-инфицированные клетки и т. п., то необходимо усилить цитотоксическое действие ЕА8-К и р55-К (и ассоциированных с ними белков, таких как, например, ΜΟΡΤ-Ρ МАСН, Мсй4, 01, УКАОВ), и в то же время ингибировать их способность индуцировать ΝΡ-кВ. Следовательно, если взаимодействие или связывание КА₽ с ΡΙΡ приводит к увеличению возможной роли ΡΙΡ в усилении индуцирования ΝΡ-кВ (возможно посредством ΤΓηΓ2, а возможно посредством киназного домена и/или промежуточного домена ΡΙΡ), то необходимо блокировать это взаимодействие между КА₽ и ΡΙΡ в целях ингибирования или, по крайней мере, предотвращения усиления активации ΝΡ-кВ, и, тем самым, сдвига равновесия ΤΝΡ- или ВАЗ-лиганд-индуцированных эффектов в сторону клеточной цитотоксичности, что, в конечном счете, приводит к увеличению гибели клеток.

Аналогичным образом, в противоположной ситуации (той, что указана выше), при которой связывание КА₽ с ΡΙΡ фактически приводит к ингибированию воспалительного или цитоксического действия ВА8-К и р55-К, и при которой желательно блокировать эти цитотоксические эффекты, например, при воспалениях, различных аутоиммунных заболеваниях, и т.п., где необходимо стимулировать выживание клеток, очень важно разработать такие лекарственные средства, которые будут усиливать взаимодействие между КА₽ и ΡΙΡ с усилением общего ингибирования гибели клеток и сдвига равновесия в сторону выживания клеток. Исходя из вышеуказанного, очевидно, что в случае, когда взаимодействие КА₽ с ΡΙΡ вызывает ингибирование функции ΡΙΡ в повышении активации ΝΡ-кВ, и, если выживание клеток является желательным, то необходимо блокировать это взаимодействие между КА₽ и ΡΙΡ, и, тем самым, усилить активность ΡΙΡ в повышении активации ΝΡ-кВ.

Исходя из вышеуказанного, очевидно, что ΡΙΡ играет ключевую роль в равновесии между индуцированием или опосредованием каскадов реакций воспаления, гибели клеток или выживания клеток, а поэтому КА₽ также играет такую же важную роль как и модулятор ΡΙΡ. Влияние на взаимодействие/связывание между КА₽ и ΡΙΡ с применением различных лекарственных средств или курсов лечения, как указано выше и ниже, очевидно, позволит достигнуть сдвига в каскаде реакций внутриклеточной передачи сигнала в направлении от гибели клеток в сторону выживания клеток, или наоборот, если это необходимо.

Настоящее изобретение также относится к последовательности ДНК, кодирующей белок КА₽, и к белкам КА₽, кодируемым этими последовательностями ДНК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически активные аналоги, фрагменты и производные белка КА₽, и к аналогам, фрагментам и производным, кодируемым этими последовательностями. Получение таких аналогов, фрагментов и производных обеспечивается стандартными методами (см. например, ЗатЬтоок е! а1., 1989), где в последовательностях ДНК, кодирующих белок КА₽, один или несколько кодонов могут быть делегированы, добавлены или заменены другими кодонами, с получением аналогов, имеющих, по крайней мере, одну замену аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком.

Из вышеуказанных последовательностей ДНК настоящего изобретения, которые кодируют белок КΑΡ, его изоформу, аналог, фрагмент или производное, также включенных как вариант настоящего изобретения, последовательности ДНК способны гибридизоваться с последовательностью кДНК, происходящей от кодирующей области нативного белка КА₽, где такую гибридизацию осуществляют в умеренно жестких условиях, и где гибридизуемые последовательности ДНК кодируют биологически активный белок КА₽. Следовательно, этими гибридизуемыми последовательностями ДНК являются последовательности ДНК, которые имеют относительно высокую гомологию с последовательностью кДНК нативного КА₽, и, как таковые, представляют собой КАй-подобные последовательности, которые могут быть, например, природными последовательностями, кодирующими различные изоформы КА₽, или природными последовательностями, кодирующими белки, принадлежащие к группе КΑΡ-подобных последовательностей, кодирующих белок, обладающий КΑΡ-активностыо. Кроме того, этими последовательностями могут быть также, например, не встречающиеся в природе синтезированные последовательности, ко- 10 006874 торые являются аналогичными последовательности кДНК нативного КАР, но, при этом, включают ряд нужных модификаций. Следовательно, такими синтетическими последовательностями являются все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные КАР, каждый из которых обладает активностью КАР.

Для получения различных вышеуказанных природных КАР-подобных последовательностей могут быть использованы стандартные методы скрининга и выделения природных образцов ДНК или РНК из различных тканей с использованием природной кДНК КАР или ее части в качестве зонда (см. например, стандартные методы, описанные в руководстве ЗашЬгоок е! а1., 1989).

Аналогично, для получения вышеуказанных различных синтетических КАР-подобных последовательностей, кодирующих аналоги, фрагменты или производные КАР, может быть использован ряд стандартных методов, подробно описанных ниже для получения указанных аналогов, фрагментов и производных.

Полипептид или белок существенно соответствующий белку КАР, означает не только белок КАР, но также и полипептиды или белки, которые являются аналогами КАР.

Аналогами, которые, в основном, соответствуют белку КАР, являются такие полипептиды, в которых одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательности белка КАР были заменены другой аминокислотой, делегированы и/или инсертированы, при условии, что полученный в результате этого белок обладает, в основном, той же самой или более высокой активностью, чем белок КАР, которому он соответствует.

Для получения белка, в основном, соответствующего белку КАР, замены в последовательности белков КАР, таких как, изоформы, являются, в основном, относительно незначительными. Хотя число замен может быть больше десяти, однако, предпочтительно, чтобы таких замен было не более десяти, более предпочтительно, не более пяти, а наиболее предпочтительно, не более трех. Хотя для обнаружения возможных биологически активных белков, которые, в основном, соответствуют белкам КАР, могут быть использованы любые методы, однако, одним из таких методов является использование стандартной техники мутагенеза белок-кодирующей ДНК, которая приводит к небольшим модификациям. Белки, экспрес-сированные такими клонами, могут быть затем скринированы на их способность связываться с ΚΙΡ и модулировать активность ΚΙΡ при модуляции/опосредовании вышеуказанных внутриклеточных каскадов реакций.

Консервативными заменами являются такие замены, которые, как ожидается, не должны изменять активность белка, и которые обычно сначала должны быть оценены, как замены, которые, предположительно, не изменяют размер, заряд или конфигурацию белка, и, таким образом, предположительно, не изменяют его биологических свойств.

Консервативные замены белков КАР включают аналог, где, по крайней мере, один аминокислотный остаток в полипептиде был консервативно заменен другой аминокислотой. Такие замены, предпочтительно, осуществляют в соответствии с нижеследующим списком, представленным в табл. ΙΑ, где замены могут быть определены путем рутинного экспериментирования с получением модифицированных структурных и функциональных свойств синтезированной полипептидной молекулы при сохранении биологической активности, свойственной белку КАР.

ТаблицаΙΑ

Исходный остаток Характерная замена

А1а	С1у,	Зег
Агд	Ъуз
Азп	с£п,	ΗΪ3
Азр	С1и
Суз	Зег
С1п	Азп
С1и	Азр
С1у	А1а,	Рго

- 11 006874

Н13	Азп,	С1п
Не	Ъеи,	Уа1
Ъеи	11е,	Уа1
Ъуз	Агд,	С1п, С1и
Мек	Ъеи,	Туг, 11е
РЬе	Мек,	Ъеи, Туг
Зег	ТЬг
ТЬг	Зег
Тгр	Туг
Туг	Тгр,	РЬе
Уа1	11е,	Ъеи
Альтернативно, другой группой замен в	белке КАР являются	: такие замены, где по крайней мере

один аминокислотный остаток в полипептиде был удален, и вместо него вставлен другой остаток в соответствии с табл. ΙΒ. Типы замен, которые могут быть сделаны в полипептиде, могут быть выбраны исходя из анализа частоты встречаемости аминокислотных замен между гомологичными белками других виде, таких, которые представлены в табл. 1-2 в работе Зсйигг е£ а1., Θ.Ε., Рппсгр1ез о£ Ρτοΐειη 81гис1пге 8рппдет-Уег1ад, Νενν Уотк, ΝΥ, 1978, и Егдз. 3-9 о£ СгегдЫоп, Т.Е., Рго£етз: 81гис1иге апб Мо1еси1аг РторетЬез, \ν.Η. Егеетап & Со., Зап Егапсгзсо, СА, 1983. Исходя из этого анализа, альтернативные консервативные замены определяют в настоящем описании как замены внутри одной из следующих пяти групп:

ТаблицаΙΒ

1. Малые алифатические неполярные или слегка полярные остатки: А1а, 8ег, Т1гг (Рго, С1у);

2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Азр, Азп, О1и, О1п;

3. Полярные положительно заряженные остатки: Нгз, Агд, Ьуз;

4. Крупные алифатические неполярные остатки: Ме£, Ееи, Не, Уа1 (Суз); и

5. Крупные ароматические остатки: Р1ге, Туг, Тгр.

Три аминокислотных остатка, указанных выше в скобках, играют особую роль в укладке белка. Сг1у представляет собой остаток, не имеющий какой-либо боковой цепи, и вследствие этого он сообщает цепи гибкость. В этом случае, однако, имеется тенденция к стимуляции образования вторичной структуры, отличающейся от ос-спирали. Остаток Рго, из-за его необычной геометрии, сильно затрудняет цепь, и, в основном, стимулирует образование β-виток-подобньгх структур, хотя, в некоторых случаях, Суз может оказаться способным участвовать в образовании дисульфидной связи, которая имеет важное значение для укладки белка. Следует отметить, что 8ο1ίιγ1ζ и др., см. выше, должны были объединить группы 1 и 2, указанные выше. Следует также отметить, что Туг, из-за его возможной водородной связи, имеет значительное сродство с 8ег и Т1гг, и т.п.

В соответствии с настоящим изобретением, консервативные аминокислотные замены, представленные выше, известны специалистам, и, как предполагается, после осуществления этих аминокислотных замен должны сохраняться биологические и структурные свойства полипептида. Большинство делений и замен, осуществляемых в соответствии с настоящим изобретением, не вносят существенных изменений в характеристики белка или полипептидной молекулы. Термин характеристики определен неинклюзивным образом и означает как изменение во вторичной структуре, например, в ос-спирали или в β-складке, так и изменение в биологической активности, например, в связывании с ΚΙΡ и/или опосредовании влияния ΚΙΡ на гибель клетки.

Примерами продуцирования аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов белков КАР для использования в настоящем изобретении, являются стадии любых известных методов, таких как, которые описаны в патентах США КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462 (Магк е£ а1.); 5116943 (КоЕгз е£ а1.), 4965195 (№теп е£ а1.), 4879111 (С1юпд е£ а1.), и 5017691 (Бее е! а!.); и белки с заменами лизина, описанные в патенте США № 4904584 (ЗИауу е! а!.).

Помимо консервативных замен, обсуждаемых выше, которые не должны значительно повлиять на активность белка КАР, в объем настоящего изобретения входят либо консервативные замены, либо менее консервативные замены и более произвольные замены, которые приводят к увеличению биологической активности аналогов белков КАР.

Если необходимо точное подтверждение влияния данной замены или делеции, то для любого специалиста очевидно, что влияние данной замены (замен), делеции (делеций), и т.п. может быть оценено путем рутинного анализа на связывание и гибель клеток. Скрининг с использованием такого стандартного теста не предусматривает излишнего экспериментирования.

Подходящими аналогами КАР являются такие аналоги, которые сохраняют, по крайней мере, способность к связыванию с ΚΙΡ, и, тем самым, как указывалось выше, опосредуют активность ΚΙΡ в каскаде внутриклеточных реакций, описанных выше. Таким образом, могут быть продуцированы аналоги, кото- 12006874 рые обладают так называемым доминантно-негативным действием, а именно, аналоги, которые является дефектным либо по связыванию с К1Р, либо по последующей передаче сигнала, либо по какой-нибудь другой активности, продуцируемой после такого связывания. Эти аналоги могут быть использованы, например, для ингибирования действия К1Р или для ингибирования ΝΕ-κΒ-индуцирующего действия К1Р (прямого или непрямого) в зависимости от того, какая из этих активностей является главной активностью, модулированной взаимодействием КАР с К1Р (см. выше), и это ингибирование обеспечивается такими аналогами, которые конкурируют с природным КАР за связывание с К1Р.

На генетическом уровне, эти аналоги обычно продуцируют путем сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок КАР, в результате чего получают ДНК, кодирующую этот аналог, с последующим синтезом этой ДНК и экспрессией полипептида в рекомбинантной клеточной культуре. Этот аналог, обычно, обладает той же самой или повышенной, представляющей особый интерес, биологической активностью по сравнению с природным белком. Аи5иЬе1 с1 а1., Сиггей Рго1осо1х ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬйсайопх апй XVПсу 1п1ег5С1епсе, Νον Уогк, Ν.Υ., 1987-1995; 8атЬгоок е1 а1., (1989), Мо1еси1аг С1оптд: А 1аЬога1огу тапиа1, Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1й 8ргтд НагЬог, ΝΥ, 1989.

Получение белка КАР, как указано выше, или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же самый полипептид, но отличающийся от природной последовательности вследствие замен, допустимых благодаря известной вырожденности генетического кода, может быть осуществлено путем сайт-специфического мутагенеза ДНК, кодирующей ранее полученный аналог или нативный вариант белка КАР. Сайт-специфический мутагенез позволяет продуцировать аналоги посредством использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с нужной мутацией, а также достаточное число смежных нуклеотидов с получением праймерной последовательности достаточного размера и вариабельности для образования стабильного дуплекса на обеих сторонах от делеционно-го стыка. В основном, предпочтительным является праймер длиной от около 20 до 25 нуклеотидов примерно с 5-10 дополнительными нуклеотидами на каждой стороне модифицируемой последовательности. В общих чертах, техника сайт-специфического мутагенеза хорошо известна специалистам, и описана в публикациях, таких как, публикация Айе1тап е1 а1., ΩΝΛ 2:183 (1983), описание которой вводится в настоящую заявку посредством ссылки.

Следует отметить, что в методе сайт-специфического мутагенеза обычно используют фаговый вектор, который существует как в одноцепочечной форме, так и в двухцепочечной форме. Типичными векторами, используемыми в сайт-направленном мутагенезе, являются такие векторы, как фаг М13, описанный, например, в публикации Меххтд е1 а1., ТЫгй С1еуе1апй 8утрохшт оп Масгото1еси1ех апй КесотЫпай ^NА, Еййог А. Vа1ΐои, Е15еу1ег, Атх1егйат (1981), описание которой вводится в настоящую заявку в качестве ссылки. Эти фаги являются коммерчески доступными, и широко используются специалистами. Альтернативно, для получения одноцепочечной ДНК могут быть использованы плазмидные векторы, которые содержат сайт инициации репликации одноцепочечного фага (Уейа е1 а1., Ме111. Епхуто1. 153:3, 1987).

В общих чертах, вышеупомянутый сайт-направленный мутагенез осуществляют сначала путем получения одноцепочечного вектора, который включает в свою последовательность последовательность ДНК, кодирующую соответствующий полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий нужную мутированную последовательность, получают синтетически путем автоматизированного ДНК/олигонуклеотидного синтеза. Затем этот праймер гибридизуют с одноцепочечным вектором, содержащим последовательность нужного белка, и подвергают обработке полимеризующими ДНК ферментами, такими как, фрагмент Кленова полимеразы I Е.со1г для завершения синтеза цепи, несущей мутацию. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь несут нужную мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как, клетки штамма ЙМ101 (Е.сой, и отбирают клоны, которые содержат рекомбинантные векторы, несущие структуру мутированной последовательности.

После отбора такого клона, последовательность мутированного белка КАР может быть удалена и введена в соответствующий вектор, обычно, в вектор переноса или экспрессирующий вектор такого типа, который может быть использован для трансфекции соответствующего хозяина.

В соответствии с этим, ген или нуклеиновая кислота, кодирующая белок КАР, могут быть также детектированы, получены и/или модифицированы ίΐ'ΐ уйго, ίπ хйи, и/или ί п νί\Ό известными методами амплификации ДНК или РНК, такими как, ПЦР и химический олигонуклеотидный синтез. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличивать число копий) специфические последовательности ДНК посредством повторных полимеразных ДНК реакций. Эта реакция может быть использована вместо клонирования, и все, что требуется для ее осуществления - это знание последовательности нуклеиновой кислоты. Для осуществления ПЦР конструируют праймеры, комплементарные нужной последовательности. Затем, эти праймеры генерируют путем автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку могут быть сконструированы праймеры для гибридизации с любой частью гена, то можно создать такие условия, чтобы было допустимым ошибочное спаривание комплементарных оснований. Амплификация участков с таким ошибочным спариванием может приводить к синтезу мутагенизированного продукта, способствующего про

- 13 006874 дуцированию пептида с новыми свойствами (то есть, сайт-направленный мутагенез). См., также АизиЬс1. гл. 16 (см.выше). Может быть также осуществлен синтез путем связывания комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы в ПЦР, при этом РНК может быть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена пролактинового рецептора без клонирования.

Кроме того, могут быть сконструированы ПЦР-праймеры для введения новых сайтов рестрикции или других элементов, таких как, кодоны терминации, на концах амплифицируемого генного сегмента. Это введение сайтов рестрикции в 5'- и З'-концы амплифицированной генной последовательности позволяет продуцировать генные сегменты, которые кодируют белок ВАР или его фрагмент, и которые обычно продуцируют для лигирования с другими последовательностями и/или с клонирующими сайтами в векторах.

ПЦР и другие методы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны специалистам, и могут быть использованы ими в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования, лишь исходя из описания и инструкций, представленных в настоящей заявке. Известными методами амлификации ДНК или РНК являются, но не ограничиваются ими, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и аналогичные способы амплификации (см. например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 (МиШз е! а1.); 4795699 и 4921794 (ТаЬог е! а1.); 5142033 (Ιηηίδ); 5122464 (АШоп е! а1.); 5091310 (Ιηηίδ); 5066584 (СуПепУеп е! а1.); 4889818 (Се1Гапб е! а1.); 4994370 (8Шег е! а1.); 4766067 (Шотаз); 4656134 (В1пдо1б); и Ιηηίδ е! а1., ебз., РСВ Рго!осо1з; А Сшбе !о Ме!йоб апб АррНсабопз), и РНКопосредованная амплификация, где для целевой последовательности используется антисмысловая РНК в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238, Ма1ек е! а1., с торговым знаком NА8ВА); и иммуно-ПЦР, где амплификация ДНК используется вместе с мечением антителом (Ви/юка е! а1., 8с1епсе 260:487 (1993); 8апо е! а1., 8с1епсе 258:120(1992); 8апо е! а1., В|о1ес11пк|ие5 9:1378 (1991); содержание этих патентов во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Аналогичным образом, биологически активные фрагменты белков ВАР (например, фрагменты любого из ВАР или его изоформ) могут быть получены как описано выше для аналогов белков ВАР. Подходящими фрагментами белков ВАР являются такие фрагменты, которые сохраняют свойства ВАР, и которые могут прямо или непрямо модулировать или опосредовать биологическую активность В1Р или других белков, ассоциированных с В1Р. В соответствии с этим, могут быть получены фрагменты белка ВАР. которые обладают доминантно-негативным или доминантно-позитивным действием, как описано выше в связи с аналогами ВАР. При этом, следует отметить, что эти фрагменты представляют специальный класс аналогов настоящего изобретения, а именно, они определяют части белков ВАР, происходящие от полноразмерной последовательности белка ВАР (например, от последовательности любого из ВАР или его изоформ), где каждая такая часть или фрагмент имеет любую из вышеуказанных желательных активностей. Таким фрагментом может быть, например, пептид.

Аналогичным образом, производные могут быть получены посредством стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белка ВАР, его аналогов или фрагментов, либо путем конъюгирования белка ВАР, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, с антителом, ферментом, рецептором, и т.п., как хорошо известно специалистам. В соответствии с этим, термин производные, используемый в настоящем описании, охватывает те производные, которые могут быть получены из функциональных групп, присутствующих в виде боковых цепей на остатках, либо из Ν- или С-концевых групп, способом известным специалистам, и которые входят в объем настоящего изобретения. Этими производными могут быть химические молекулы, такие как, углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет ту же самую или повышенную биологическую активность по сравнению с белками ВАР.

Так, например, такими производными могут быть алифатические сложноэфирные группы, амиды карбоксильных групп, образованные путем реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные или свободные аминогруппы аминокислотных остатков, образованные ацильными группами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или О-ацильные производные свободной гидроксильной группы (например, группы серильных или треонильных остатков), образованные ацильными группами.

Термин производные включает только те производные, которые не содержат аминокислотных замен двадцати природных аминокислот.

ВАР представляет собой белок или полипептид, то есть, последовательность аминокислотных остатков. В понятие такого полипептида также входит полипептид, состоящий из более крупной последовательности, которая включает полную последовательность белка ВАР, определенную в настоящем описании, при условии, что эти добавления не оказывают влияния на основные и новые характеристики белков настоящего изобретения, то есть, при условии, что они либо сохраняют или повышают биологическую активность белка ВАР, либо они могут быть отщеплены с образованием белка или полипептида, имеющего биологическую активность, свойственную активности белка ВАР. Так, например, в объем на

- 14 006874 стоящего изобретения могут входить гибридные белки КАР, образованные с другими аминокислотами или пептидами.

Новый белок КАР, его аналоги, фрагменты и производные имеют ряд возможных применений, например:

(ί) Белок КАР, его аналоги, фрагменты и производные могут быть использованы для модуляции функции К1Р в каскаде реакций воспаления, гибели клеток или выживания клеток, описанных выше. Так, например, если КАР может модулировать воздействие К1Р на активацию КЕ-кВ, 1ЫК (киназу 1иие) или киназу р38, то такое действие КАР приводит к усилению КАР-К1Р-эффекта и в этом случае, его желательно использовать против опухолей, в противо- или провоспалительных реакциях, против ВИЧ, и т.п. В этом случае, белок КАР, его аналоги, фрагменты и производные, которые модулируют воспаление, усиливают цитотоксическое действие, или блокируют эффект выживания клеток, могут быть введены в клетки стандартными способами, известными по существу. Так, например, если белок КАР является полностью внутриклеточным (как предполагается) и должен быть введен только в клетки, где желательно действие ЕА8-К-лиганда или ТКЕ, или другого цитотоксического белка, опосредуемое К1Р, то необходимо использовать систему для специфического введения этого белка в клетки. Одним из путей осуществления этой цели является создание рекомбинантного вируса животного, например, вируса, происходящего от вируса коровьей оспы, в ДНК которого вводят следующие два гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с белками клеточной поверхности, специфически экспрессируемыми клетками, например, такими как, белок др 120 вируса ВИЧ, специфически связывающийся с некоторыми клетками (СП4-лимфоцитами и родственными клетками лейкоза), или любой другой лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими ЕА8-К или р55-К, так, чтобы этот рекомбинантный вирусный вектор был способен связываться с указанными ЕА8-К- или р55-К-несущими клетками; и ген, кодирующий белок КАР. Таким образом, экспрессия связывающегося с клеточной поверхностью белка на поверхности вируса будет направлена на вирус, специфичный к опухолевой клетке или другой ЕА8-Кили р55-К-несущей клетке, после чего последовательность, кодирующая белок КАР, будет введена в клетки посредством этого вируса, и затем экспрессирована в этих клетках, что приведет к усилению К1Ропосредованного действия ЕА8-К-лиганда или ТКЕ или независимого действия К1Р. Конструирование такого рекомбинантного вируса животного осуществляют стандартными методами (см., например, 8атЬгоок и др., 1989). Другим возможным способом является введение последовательностей белка КАР (например, любого из КАР или его изоформ) в форме олигонуклеотидов, которые могут быть абсорбированы клетками и экспрессированы в них.

(ίί) Они могут быть использованы для ингибирования действия ЕА8-К-лиганда, или ТКЕ, или родственного белка, опосредованного К1Р или независимого действия К1Р, например, в таких случаях, как повреждение ткани при септическом шоке, реакции трансплантат против хозяина, или острый гепатит, при которых желательно блокировать внутриклеточную передачу сигнала ЕА8-К-лигандом или ТКЕиндуцированным рецептором ЕА8-К или р55-К, или независимого действия К1Р, либо передачу сигнала, опосредованную другим белком; и, в то же самое время, они могут быть использованы для усиления каскада реакций выживания клеток. В этом случае, можно, например, ввести в клетки, стандартными методами, олигонуклеотиды, имеющие антисмысловую кодирующую последовательность для белка КАР, которая должна эффективно блокировать трансляцию мРНК, кодирующей белок КАР, и, тем самым, блокировать его экспрессию и приводить к ингибирова-нию действия ЕА8-К-лиганда, или ТКЕ, или К1Р, или другого белка. Такие олигонуклеотиды могут быть введены в клетки методом с использованием вышеуказанного рекомбинантного вируса, второй последовательности, присутствующей в этом вирусе, и являющейся олигонуклеотидной последовательностью.

Аналогично указанному выше, в зависимости от природы взаимодействия КАР-К1Р, с использованием вышеуказанных способов (1) и (и) могут быть также усилены или ингибированы клеточные воспалительные реакции и реакции выживания клеток, если это необходимо.

Другим возможным способом является использование антител, специфичных для белка КАР, в целях ингибирования его активности во внутриклеточной передаче сигнала.

Еще одним способом ингибирования К1Р-опосредованного действия или независимого действия К1Р является недавно разработанный способ с использованием рибозима. Рибозимы представляют собой каталитические РНК-молекулы, которые специфически расщепляют РНК. Рибозимы могут быть сконструированы для расщепления выбранных целевых РНК, например, мРНК, кодирующих белок КАР настоящего изобретения. Такие рибозимы должны иметь последовательность, специфичную для мРНК белка КАР, и должны быть способны к взаимодействию с нею (комплементарному связыванию) с последующим расщеплением мРНК, что приводит к снижению (или к полной потере) экспрессии белка КАР. причем, уровень снижения экспрессии зависит от уровня экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для введения рибозимов в выбранные клетки (например, в клетки, несущие ЕА8-К или р55-К), может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмидные векторы, векторы на основе вирусов животных (ретровирусов), которые обычно используются в этих целях (см., также выше п.(1), где этот вирус имеет в качестве второй последовательности кДНК, кодирующую выбранную рибозимную последовательность). (Обзор методов, касающихся рибозимов, см. Сйеи е! а1., 1992; 2йао & Рюк, 1993; 8йоге е! а1.,

- 15 006874

1993; 1о5ер11 & Вигке, 1993; 8Ытауата е! а1., 1993; Сап!ог е! а1., 1993; Ваппада, 1993; СгЩеИ е! а1., 1993 и Κοίζιιιηί е! а1., 1993). Этот метод применим в том случае, если взаимодействие КАР-К1Р усиливает цитотоксичность клеток тогда, когда это необходимо для блокирования этой цитотоксичности, или в том случае, если взаимодействие КАР-К1Р ингибирует активацию ΝΡ-κΒ также тогда, когда это необходимо для блокирования этого ингибирования в целях повышения указанной активации ΝΡ-κΒ, т.е., в обоих случаях, когда необходимо стимулирование выживания клеток, как описано выше в п.(и).

(ίίί) Белок КАР, а также его аналоги, фрагменты или производные могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е., белков, связывающихся с К1Р или с функционально родственными рецепторами или белками, участвующими в процессах внутриклеточной передачи сигнала. В этих целях может быть использована вышеупомянутая дрожжевая двухгибридная система, или может быть использована недавно разработанная система с использованием нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим ПЦР-клонированием (\νί11<5 е! а1., 1989). В этой публикации, ^11к§ и др. описывают идентификацию и клонирование двух предполагаемых протеинтирозинкиназ посредством нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим клонированием с помощью ПЦР на основе известной последовательности киназного мотива, выявленной киназной последовательности. Этот метод может быть осуществлен в соответствии с настоящим изобретением с использованием последовательности белка КАР для идентификации и клонирования последовательностей родственных К1Р-связывающих белков.

(ίν) Еще одним вариантом применения белка КАР настоящего изобретения или его аналогов, фрагментов и производных является их использование в методах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например, других белков или факторов, участвующих в процессах внутриклеточной передачи сигнала. В этом варианте применения, белок КАР настоящего изобретения, его аналоги, фрагменты или производные, могут быть отдельно связаны с матрицами, используемыми в аффинной хроматографии, а затем подвергнуты контакту с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, предположительно, участвуют в процессе внутриклеточной передачи сигнала. После проведения аффинной хроматографии, другие белки или факторы, которые связываются с белком КАР настоящего изобретения, или с его аналогами, фрагментами или производными, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.

(ν) Как указано выше, белок КАР настоящего изобретения, или его аналоги, фрагменты или производные могут быть также использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для продуцирова-ния антител, специфичных для этих белков. Эти антитела могут быть также использованы для очистки белка КАР (например, КАР или любой из его изоформ) либо из клеточных экстрактов, либо из трансформированных клеточных линий, продуцирующих белок КАР, или его аналоги, или фрагменты. Кроме того, эти антитела могут быть использованы в целях диагностики для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием системы К1Р-опосредованного ЕА8-К-лиганда или ΤΝΡ, или с независимой К1Р-активностью, например, с клеточными эффектами, индуцированными сверхактивным или недостаточно активным ЕА8-К-лигандом или ΤΝΡ и опосредованными К1Р, или со специфическим воздействием на клетки самого К1Р. Таким образом, если такие эффекты связаны с недостаточно функционирующей системой внутриклеточной передачи сигнала, включающей белок К1Р, или различные вышеупомянутые К1Р-связывающие белки или сам белок КАР, то такие антитела должны служить в качестве важного диагностического инструмента.

Следует также отметить, что выделение, идентификация и характеризация белка КАР настоящего изобретения могут быть осуществлены любыми хорошо известными стандартными методами скрининга. Так, например, один из этих методов скрининга, то есть, метод с использованием дрожжевого двойного гибрида, описанный ниже, был использован для идентификации белка КАР (см. §!апдег е! а1., 1995), а затем других различных белков КАР настоящего изобретения (помимо различных других новых вышеуказанных и нижеуказанных белков, описанных в совместных одновременно рассматриваемых заявках). Аналогичным образом, как указывается выше и ниже, для выделения, идентификации и характеризации белка КАР настоящего изобретения, или для выделения, идентификации и характеризации дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.д., способных связываться с белком КАР настоящего изобретения могут быть использованы другие способы, такие как, аффинная хроматография, метод гибридизация ДНК, и т.п. хорошо известные специалистам.

Как указывалось выше, белок КАР может быть использован для генерирования антител, специфичных к белкам КАР, например, к КАР и его изоформам. Эти антитела или их фрагменты могут быть использованы способом, подробно описанным ниже, где будет очевидно, что в этих применениях, антителами или их фрагментами являются антитела, специфичные для белков КАР.

В соответствии с настоящим изобретением, исходя из того факта, что КАР специфически связывается с К1Р, и, как таковой, является медиатором/модулятором К1Р, а поэтому, может опосредовать/модулировать К1Р-активность в каскадах реакций воспаления, гибели или выживания клеток, таким образом, что К1Р функционирует независимо или в сочетании с другими белками (например, с ЕА8-К, р55-К, МОКГ-1, МАСН, Ме114. С1 и ΤΕΔΩΩ в каскадах реакций гибели клеток, или с Τγ;·ιΓ2 в каскадах

- 16 006874 реакций выживания клеток), важное значение имеет получение лекарственных средств, которые могут усиливать или ингибировать взаимодействия ΚΑΡ-ΚΙΡ, если это необходимо, и в зависимости от того, какие из этих каскадов реакций усиливаются/ингибируются взаимодействием ΚΑΡ-ΚΙΡ. Имеется много заболеваний, при которых использование таких лекарственных средств может оказать значительное благотворное воздействие. Такими заболеваниями, среди прочих, являются острый гепатит, при котором острое поражение печени является, очевидно, следствием опосредованной ΡΑδ-Κ-лигандом гибели клеток печени, аутоиммунно-индуцированной гибели клеток, такой как, гибель β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, которая приводит к диабету; гибель клеток при отторжении трансплантата (например, почки, сердца и печени), гибель олигодендроцитов в головном мозге при рассеянном склерозе, и ВИЧ-ингибированное самоубийство Т-клеток, которое вызывает пролиферацию вируса ВИЧ, и тем самым вызывает СПИД.

Возможно, что ΚΑΡ или один или несколько его возможных изоформ могут служить природными ингибиторами ΚΙΡ в одном или нескольких вышеуказанных каскадов реакций, а поэтому они могут быть использованы в качестве вышеуказанных специфических ингибиторов ΚΙΡ. Аналогичным образом, другие вещества, такие как пептиды, органические соединения, антитела, и т. д., могут быть также скринированы с получением специфических лекарственных средств, которые способны ингибировать взаимодействие ΚΑΡ-ΚΙΡ.

Неограничивающий пример способа конструирования и скрининга пептидных ингибиторов взаимодействия ΚΑΡ-ΚΙΡ основан на предварительном изучении пептидных ингибиторов ΙΕΈ или Ιί,Έподобных протеаз, субстратной специфичности ΙΟΕ, и стратегий анализа эпитопов с использованием пептидного синтеза. Было обнаружено, что наименьшим требованием для обеспечения расщепления пептида посредством ΙΕΈ является включение четырех аминокислот слева от сайта расщепления со значительным предпочтением для аспарагиновой кислоты в положении Ρ1 и метиламина, который достаточно включить справа от положения Ρ₁ (Ыеа111 е! а1., 1990; Но\уагй е! а1., 1991; ΤΙιογπ^γγυ е! а1., 1992). Кроме того, обнаружено, что флуорогенный субстратный пептид (тетрапептид), ацетил-Л5р-С1и-Уа1-Л5р-а-(4метилкумарил-7-амид), сокращенно обозначаемый Αс-^ΕV^-ΑМС, соответствующий последовательности поли-(АОР-рибоза)-полимеразы (ΡΑΚΡ), расщеплялся в клетках сразу после стимуляции ΡΑ8-Κ, а также других процессов апоптоза (КаиГтапп, 1989; КаиГтапп е! а1., 1993; Ьа/еЬюк е! а1., 1994), и эффективно расщеплялся СРР32 (членом семейства СЕП3ЛСЕ-протеазы) и МАСН-протеазами (и также возможно аналогично расщеплялся под действием С1-протеаз - см. например, совместную одновременно рассматриваемую заявку Ш 120367).

Поскольку, очевидно, Α8р в положении Ρ₁ субстрата является важным элементом, то тетрапептиды, имеющие Αφ в качестве четвертого аминокислотного остатка и различные комбинации аминокислот в положениях первых трех остатков, могут быть проанализированы на их связывание с активным центром протеаз, с использованием, например, метода, разработанного Сеукеп (Сеукеп, 1985; Сеукеп е! а1., 1987), где большое число пептидов на твердых носителях было оценено на их специфическое связывание с антителами. Связывание МАСН-протеаз со специфическими пептидами может быть детектировано рядом методов детекции, хорошо известных специалистам, таких как, радиоактивное мечение С1-протеаз, и т.п. Было показано, что этот метод Сеукеп позволяет тестировать за каждый рабочий день по крайней мере 4000 пептидов.

Аналогичным образом может быть выявлена точная область связывания или область гомологии, которая определяет взаимодействие между ΚΑΡ и ΚΙΡ, а затем могут быть скринированы пептиды, которые могут служить для блокирования этого взаимодействия, например синтезированные пептиды, имеющие последовательность, аналогичную последовательности области связывания или комплементарную ей последовательность, которая может конкурировать природным ΚΑΡ за связывание с ΚΙΡ.

Лекарственные или пептидные ингибиторы, которые способны ингибировать ΚΑΡ-активность в воспалении или клеточной гибели путем ингибирования взаимодействия ΚΑΡ с ΚΙΡ, могут быть конъюгированы или объединены в комплекс с молекулами, которые облегчают доступ в клетки.

В патенте США № 5149782 описано конъюгирование молекулы, транспортированной через клеточную мембрану посредством агента смешивания с мембраной, такого как фузогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды, и жирные кислоты с длинной цепью, например, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота. Эти мембраносвязывающие агенты вводят молекулярные конъюгаты в липидный бислой клеточных мембран и облегчают их доступ в цитоплазму.

В патенте США № 5108921 (Ьоте е! а1.) дан обзор подходящих методов трансмембранной доставки молекул, которыми являются, но не ограничиваются ими, белки и нуклеиновые кислоты, благодаря механизму рецептор-опосредованной эндоцитотической активности. Этими системами рецепторов являются такие системы, которые распознают галактозу, маннозу, маннозо-6-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин Βι₂), α-2-макроглобулин, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСЕ). Ьоте и др. указывают, что рецепторы витаминов, такие как рецепторы биотина и фолата, могут быть предпочтительно использованы для усиления транс

- 17 006874 порта через клеточную мембрану благодаря локализации и множественности рецепторов биотина и фолата на поверхности мембраны большинства клеток, и ассоциированных с ними процессов рецепторопосредованного трансмембранного транспорта. Таким образом, комплекс, образованный между соединением, доставляемым в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактирует с клеточной мембраной, несущей рецепторы биотина или фолата, и инициирует механизм рецептор-опосредованного трансмембранного транспорта, что позволяет нужному соединению проникнуть в клетку.

Кроме того, специалистам известно, что присоединение нужной пептидной последовательности к лидерной/сигнальной пептидной последовательности для создания химерного пептида будет обеспечивать транспорт этого химерного пептида через клеточную мембрану в цитоплазму.

Как известно специалистам в области пептидов, термин пептидные ингибиторы взаимодействия ΚΑΡ-ΚΙΡ настоящего изобретения включает в себя псевдопептидные лекарственные средства или ингибиторы, которые могут быть также легко скринированы на связывание с ΚΑΡ/ΚΙΡ-протеазой для получения, вероятно, более стабильных ингибиторов.

Следует также отметить, что те же самые методы для облегчения или усиления транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, обсуждаемые выше, могут быть также применены и к самому ΚΑΡ или его изоформам, а также к другим пептидам и белкам, которые обладают аналогичным внутриклеточным действием.

Что касается антител, упомянутых выше, термин антитело означает поликлональные антитела, моноклональные антитела (ΜΑΤ), химерные антитела, антиидиотипические (анти-Ιά) антитела против антител, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, продуцируемые известными методами, такими как, но не ограничиваясь ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантная техника.

Поликлональные антитела являются гетерогенными популяциями молекул антител, полученных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело содержит, в основном, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигену, при этом указанная популяция содержит, в основном, сходные сайты связывания эпитопа. ΜΑΤ могут быть получены методами, известными специалистам. См., например, КоЫег & ΜίΕΚίη, №!ите, 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; Αи8иЬе1 е! а1., ебк., Наг1о\т & Ьапе, ΑΝΤΙΒΟΌΙΕδ: Α ΕΑΒΟΚΑΤΟΚΥ ΜΑΝυΑΕ, Со1б-8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, (1988); и СоШдай е! а1., ебк., Сиггеп! ГгоЮсо15 ίη Iттиηο1οду, Сгеепе Ριώ1№1ιίι^ Αδ^α апб ^11еу Иегкаепсе, Ν.Υ. (1992-1996), содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Такими антителами может быть любой класс иммуноглобулинов, включая [дС, ^Μ, ^Ε, ^Α, СКВ и их любой подкласс. Гибридома, продуцирующая ΜΑΤ настоящего изобретения, может быть культивирована ίη У11то, ίη δίίπ, или ίη у1уо. Продуцирование высоких титров этого ΜΑΤ ίη У1уо или ίη 81!и делает этот метод продуцирования предпочтительным.

Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых происходят от различных видов животных, такие как молекулы, имеющие вариабельную область, происходящую от мышиного ΜΑΤ, и константную область, происходящую от иммуноглобулина человека. Химерные антитела используются, главным образом, для снижения иммунногенности при их применении и для увеличения выхода при продуцировании; так, например, в том случае, когда мышиные ΜΑΤ имеют более высокие выходы из гибридом, но более высокую иммуногенность для человека, используются такие антитела, как человеческие/мышиные химерные МАТ. Химерные антитела и методы их продуцирования известны специалистам (СаЬШу е! а1., Ρ^οс.Nаίϊ. Αсаά. δα., υδΑ, 81:3273-3277 (1984), Μο^π8οη е! а1., Бгос. №!1. Αсаά. 8с1., υδΑ, 81:6851-6855 (1984); ВоиНаппе е! а1., №!ите, 312:643-646 (1984); СаЬШу е! а1., Европейская патентная заявка 125023 (опубликованная 14 ноября 1984); №иЬетдег е! а1., №!ите, 314:268-270 (1985); Τаη^дисЫ е! а1., Европейская патентная заявка 171496 (опубликованная 19 февраля 1985); Μο^^^коп е! а1., Европейская патентная заявка 173494 (опубликованная 5 марта 1986); ХеиЬегдег е! а1., заявка ₽СТ XVΟ 8601533 (опубликованная 13 марта 1986); Кибо е! а1., Европейская патентная заявка 184187 (опубликованная 11 июня 1986); 8айадаи е! а1., 1. ^типок, 137:1066-1074 (1986); ^Ьтзоп е! а1., Международная патентная заявка № νΟ 8702671 (опубликованная 7 мая, 1987); Ьш е! а1., Бгос. №11. Αсаά. 8ск, υδΑ, 84:3439-3443 (1987); 8ип е! а1., кгос. №!1. Αсаά. δα., υδΑ, 84:214-218 (1987); Вейет е! а1., 8аепсе 240:1041-1043 (1988); и 11аг1о\\ & Ьапе, ΑΝΤΙΒΟΌΙΕδ: Α ΕΑΒΟΚΑΤΟΚΥ ΜΑΝυΑΕ, см. выше. Эти работы вводятся в настоящее описание в качестве ссылки.

Антиидиотипическое антитело (анти-Ιά) представляет собой антитело, которое узнает уникальные детерминанты, в основном, ассоциированные с антигенсвязывающим центром антитела. Ιά-антитело может быть получено путем иммунизации животных того же самого вида и генетического типа (например, мышиного штамма) как источника ΜΑΤ, против которого получено анти-Ιά. Иммунизованное животное будет распознавать и давать ответную реакцию на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антитела против указанных идиотипических детерминант (антитело против Ιά). См. например, патент США № 4699880, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание в качестве ссылки.

Анти-Ιά антитело может быть также использовано в качестве иммуногена для индуцирования иммунного ответа еще у другого животного, с получением так называемого анти-анти-Ιά антитела. Это

- 18 006874 анти-анти-И антитело, по своим эпитопам, может быть идентичным исходному МАТ, которое индуцирует анти-И антитело. Таким образом, с использованием антител против идиотипических детерминант МАТ можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с идентичной специфичностью.

В соответствии с этим, МАТ, генерированные против белков ВАР, их аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения, могут быть использованы для индуцирования анти-И антител у подходящих животных, таких как мыши ВАЬВ/с. Клетки селезенки от таких иммунизованных мышей используют для продуцирования анти-И гибридом, секретирующих анти-И МАТ. Кроме того, анти-И МАТ могут быть связаны с носителем, таким как, гемоцианин лимфы улитки (КЬН), и использованы для иммунизации других мышей ВАЬВ/с. Сыворотка от указанных мышей будет содержать анти-анти-И антитела, которые имеют связывающие свойства исходного МАТ, специфического для эпитопа вышеуказанного белка ВАР, или их аналогов, фрагментов и производных.

Таким образом, анти-И МАТ имеют свои собственные идиотипические эпитопы, или идиотопы, структурно сходные с оцениваемым эпитопом, таким как белок-а СВВ.

Термин антитело, кроме того, относится к обеим интактным молекулам, а также к их фрагментам, таким как, например, РаЬ и (РаЬ')₂, которые обладают способностью связываться с антигеном. РаЬ и (РаЬ'Е-фрагменты не содержат Рс-фрагмента интактного антитела, быстро выводятся из кровотока, и могут обладать более тканеспецифическим связыванием, чем интактное антитело (\Уа111 с1 а1., 1. Ыис1. Меб. 24:316-325 (1983)).

Отсюда ясно, что РаЬ и (РаЬ')₂ и другие фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для детекции и количественной оценки белка ВАР в соответствии с методами, описанными в настоящей заявке для молекул интактного антитела. Такими фрагментами обычно являются фрагменты, продуцированные путем протеолитического расщепления, с использованием ферментов, таких как папаин (для продуцирования РаЬ-фрагментов) или пепсин (для продуцирования (РаЬ')2-фрагментов).

Считается, что антитело способно связываться с молекулой в том случае, если оно способно специфически реагировать с этой молекулой с последующим связыванием этой молекулы с антителом. Термин эпитоп означает часть любой молекулы, способную связываться с антителом, которая также может распознаваться указанным антителом. Эпитопы антигенных детерминант обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как, боковые цепи аминокислот и сахаров, и имеют специфическую трехмерную структуру, а также конкретный заряд.

Термин антиген означает молекулу или часть молекулы, которая способна связываться с антителом, и которая, кроме того, способна индуцировать вырабатывание у этого животного антитела, способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов. Специфическая реакция, упомянутая выше, означает, что антиген будет реагировать с высокой степенью селективности с соответствующим ему антителом, а не с множеством других антител, которые могут быть продуцированы другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для количественного или качественного обнаружения белка ВАР в образце или для обнаружения присутствия клеток, которые экспрессируют белок ВАР настоящего изобретения. Это может быть осуществлено иммуно-флуоресцентными методами с применением флуоресцентно меченного антитела (см. ниже) в сочетании с детекцией, проводимой методами оптической микроскопии, проточной цитометрии или флюрометрии.

Антитела (или их фрагменты), используемые в настоящем изобретении, могут быть использованы в гистологическом анализе, проводимом методами иммунофлуоресцентной или иммуно-электронной микроскопии для ίη 811и-детекции белка ВАР настоящего изобретения. Детекция ίη δίΐιι может быть осуществлена путем взятия гистологического образца у пациента, и получения меченого антитела настоящего изобретения против такого образца. Антитело (или фрагмент) предпочтительно получают путем внесения меченого антитела (или фрагмента) в биологический образец или путем нанесения этого антитела на биологический образец. Этим способом можно определить не только присутствие белка ВАР, но также и его распределение на исследуемой ткани. С использованием настоящего изобретения, для каждого специалиста очевидно, что для достижения такой ίη Ии-детекции может быть модифицирован весь широкий спектр гистологических методов (таких как, методы окрашивания).

Такие анализы для белка ВАР настоящего изобретения обычно предусматривают инкубирование биологического образца, такого как, биологическая жидкость, экстракт из ткани, свежесобранные клетки, такие как, лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в культуре ткани в присутствии детектируемого меченого антитела, способного идентифицировать белок ВАР; и детекцию антитела любым из ряда методов, хорошо известных специалистам.

Биологический образец может быть нанесен на твердофазную подложку или носитель, такой как, нитроцеллюлоза, или другую твердую подложку или носитель, который способен иммобилизовывать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой детектируемым меченым антителом в соответствии

- 19 006874 с настоящим изобретением, как указано выше. Эта твердофазная положка или носитель затем могут быть второй раз промыты буфером для удаления несвязанного антитела. Затем количество связанной метки на указанной твердой подложке или носителе могут быть детектированы стандартными методами.

Термин твердофазная подложка, твердофазный носитель, твердая подложка, твердый носитель, подложка или носитель означает любую подложку или носитель, способные к связыванию с антигеном или антителами. Широко известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, амилазы на найлоне, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габброс и магнетит. В целях настоящего изобретения, носитель, по своей природе, может быть либо до некоторой степени растворимым, либо нерастворимым. Подложка может иметь фактически любую возможную структурную конфигурацию, при условии, что объединенная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, в виде гранулы, цилиндрической, в виде внутренней поверхности тестпробирки, или внешней поверхности стержня. Альтернативно, эта поверхность может быть плоской, такой как, лист, бумажная тест-полоска, и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистироловые гранулы. Специалистам в этой области могут быть известны другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, либо они могут сами выявить нужные носители путем рутинного экспериментирования.

Активность связывания данного количества антитела настоящего изобретения, указанного выше, может быть определена хорошо известными методами. Каждый специалист может самостоятельно определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого теста путем рутинного экспериментирования.

Помимо этих анализов могут быть проведены другие стадии, такие как, промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрование, и т.п., как временные или необходимые стадии для данного и конкретного случая.

Одним из способов, которым антитело настоящего изобретения может быть детектируемо помечено, является связывание этого антитела с ферментом и использование его в иммуноферментном анализе (ИФА). Этот фермент при его последующей обработке соответствующим субстратом, будет, в свою очередь, реагировать с субстратом так, что в результате этого будет продуцироваться химическая молекула, которая может быть детектирована, например, спектрофотометрическим методом, флюрометрическим методом, или путем визуализации. Ферментами, которые могут быть использованы для детектируемого мочения антитела, являются, но не ограничиваются ими, малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-5-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, бетагалактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Эта детекция может быть осуществлена колориметрическими методами, в которых используется хромогенный субстрат для фермента. Детекция может быть также осуществлена путем визуального сравнения степени ферментативной реакции субстрата по сравнению с аналогично полученными стандартами.

Детекция может быть осуществлена с использованием любых других иммуноанализов. Например, путем радиоактивного мечения антител или фрагментов антител, можно детектировать К-РТРазу с использованием радиоиммуноанализа (РИА). Полное описание РИА можно найти в работе ЬаЬога!огу Τескη^^ие8 апк ВюскеткПу ίη Мо1еси1аг В1о1оду, Ьу \Уогк. Τ.8. е! а1., ΝοΠίι Но11апк РиЫкктд Сотрапу, ΝΥ (1978) с конкретной ссылкой на главу, озаглавленную Ап [гИгокисРоп !о Какю1ттипе Аххау апк Ке1а!ек Τескη^^ие8 Ьу Скагк, Т., которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Радиоактивный изотоп может быть детектирован методами с использованием д-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или с помощью авторадиографии.

Антитело настоящего изобретения может быть также помечено флуоресцентным соединением. При экспонировании флуоресцентно меченного антитела светом с соответствующей длиной волны, его присутствие может быть затем обнаружено благодаря флуоресценции. Из большого ряда соединений, обычно используемых для флуоресцентного мечения, могут быть упомянуты флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуоресцамин.

Указанное антитело может быть также детектируемо помечено с использованием флуоресцентных металлов, таких как ¹⁵²Е или других металлов ряда лантаноидов. Эти металлы могут быть связаны с антителом с использованием групп, образующих хелатные комплексы с металлами, таких как диэтилэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА).

Это антитело может быть также детектируемо помечено путем его связывания с хемилюминесцентным соединением. Присутствие антитела, помеченного хемилюминесцентной меткой, затем определяют путем обнаружения присутствия люминесценции, которая продуцируется в процессе химической реакции. Примерами особенно подходящих хемилюминесцентных соединений-меток являются люминол, изолюминол, терароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.

- 20 006874

Аналогичным образом, для мечения антитела настоящего изобретения может быть использовано биолюминесцентное соединение. Биолюминсценция представляет собой тип люминесценции, обнаруживаемой в биологических системах, в которых каталитический белок способствует увеличению эффективности хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют путем обнаружения присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями, которые могут быть использованы для мечения, являются люциферин, люцифераза и экворин.

Молекула антитела настоящего изобретения может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, а также в двухслойном или сэндвич-анализе. В типичном иммунометрическом анализе, определенное количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связывается с твердой подложкой или с твердым носителем, после чего добавляют определенное количество детектируемо меченного растворимого антитела для обнаружения и/или количественной оценки третичного комплекса, образуемого между антителом, связанным с твердой фазой, антигеном и меченым антителом.

Обычно и предпочтительно, иммунометрический анализ представляет собой прямой анализ, в котором антитело, связанное с твердой фазой, сначала подвергают контакту с тестируемым образцом для экстракции антигена из образца путем образования двойного комплекса антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации, твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если он присутствует, а затем подвергают контакту с раствором, содержащим неизвестное количество меченного антитела (которое функционирует как молекула-репортер). После второго периода инкубирования, меченное антитело связывается с комплексом, образованным антигеном, связанным с твердой подложкой или твердым носителем, посредством немеченного антитела, а затем твердую подложку или твердый носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавшего меченного антитела.

Другой тип сэндвич -анализа, который также может быть использован с антигенами настоящего изобретения, представляет собой так называемый одновременный или обратный анализ. Одновременный анализ предусматривает одну стадию инкубирования, поскольку антитело, связанное с твердой подложкой или твердым носителем меченное антитело добавляют к тестируемому образцу одновременно. После завершения инкубирования твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкого образца и меченного антитела, которое не образовало комплекс. Затем присутствие меченного антитела, ассоциированного с твердой подложной или твердым носителем, определяют таким же образом, как это делают в стандартном прямом сэндвич-анализе.

В обратном анализе, используется постадийное добавление сначала раствора меченого антитела в жидкий образец, а затем помеченного антитела, связанного с твердой подложкой или твердым носителем после соответствующего периода инкубирования. После второго инкубирования твердую фазу промывают стандартным способом для удаления остатка тестируемого образца и раствора непрореагировавшего меченного антитела. Затем присутствие меченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или твердым носителем, определяют таким же образом, как это делают в одновременном и прямом анализах.

Белок КА₽ настоящего изобретения может быть получен стандартным методом рекомбинантных ДНК (см., например, ЗатЬгоок е! а1., 1989, и АизаЬе1 е! а1., 1987-1995, см. выше), в котором подходящие эукариотические или прокариотические клетки, хорошо известные специалистам, трансформируют соответствующими эукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими последовательности, кодирующие белки. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к указанным экспрессирующим векторам и трансформированным хозяевам, используемым для продуцирования белков настоящего изобретения. Как упоминалось выше, этими белками также являются их биологически активные аналоги, фрагменты и производные, а поэтому векторами, кодирующими эти белки, также являются векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, а трансформированными хозяевами являются хозяева, продуцирующие такие аналоги и фрагменты. Производными этих белков, продуцированных трансформированными хозяевами, являются производные, полученные посредством стандартной модификации белков, или их аналогов, или фрагментов.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки КА₽, причем этот вектор также кодирует белок вирусной поверхности, способный связываться со специфическими белками поверхности клеток-мишеней (например, раковых клеток), что обеспечивает прямую инсерцию последовательностей белка КА₽ в клетки. Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения в качестве активного ингредиента включают: (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность белка КА₽, или (Ь) лекарственные средства, которые блокируют КΑΡ-КIΡвзаимодействие.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения включают достаточное количество активного ингредиента, необходимого для достижения поставленной цели. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие наполнители или добавки, которые облегчают введение активных соединений в препараты, которые могут

- 21 006874 быть использованы фармацевтически, и которые могут стабилизировать такие препараты для введения нуждающемуся в этом индивидууму, как хорошо известно каждому специалисту.

Белок ВАР и его изоформы или изотипы предположительно экспрессируются в различных тканях на заметно различных уровнях, и очевидно также, что наряду с ними аналогичным образом экспрессируются различные виды изотипов других белков, участвующих в каскадах реакций внутриклеточной передачи сигнала, как это было показано в цитированных выше совместных и одновременно рассматриваемых патентных заявках. Эти различия можно, вероятно, отнести за счет тканеспецифического характера ответа на действие Раз/АРО1-лиганда и ΤΝΡ. Как и в случае других СЕО3/1СЕ-гомологов (Аапд е! а1., 1994; А1пешп е! а1., 1995), авторами настоящего изобретения было ранее показано (в вышеупомянутых заявках), что изоформы МАСН, которые содержат неполные СЕО3/1СЕ-области (например, МАСНа3), обладают ингибирующим действием на активность ко-экспрессированных молекул МАСНа1 или МАСНа2; при этом было также обнаружено, что индуцирование гибели клеток блокируется Раз/АРО1 и р55-В. Экспрессия таких ингибиторных изоформ в клетках может представлять собой механизм самозащиты клеток от Раз/АРО1- и ΤΝΕ-опосредованной цитотоксичности. Подозревается, что аналогичное ингибирующее действие имеют по крайней мере некоторые 01-изоформы (01 представляет собой недавно выделенный новый белок, связывающийся с Мсй4 и возможно с МАСН, а также белок, связывающийся с МОВЪ1, который имеет МОВЪмодули и протеазный домен - см. совместную и одновременно рассматриваемую заявку 1Ь 120367). Широкая гетерогенность изоформ МАСН, и таким образом, предполагаемая аналогичная гетерогенность изоформ 01, которые в значительной степени преобладают над наблюдаемыми любыми другими протеазами семейства СЕО3/1СЕ, должна обеспечивать особенно точную регуляцию функций активных изоформ МАСН, и аналогично активных изоформ 01. Следовательно, как указывается выше, белки ВАР или их возможные изоформы могут обладать различным действием в различных тканях с точки зрения их взаимодействия с В1Р и, тем самым, различным влиянием на равновесие между активацией каскадов реакций гибели клеток и выживания клеток, как описано выше.

Вероятно также, что некоторые возможные изоформы ВАР имеют другие функции. Например, ВАР или некоторые изоформы ВАР могут также действовать как заякоривающие сайты для молекул, которые участвуют в других не-цитотоксических эффектах Раз/АРО1- и ΤΝΡ-рецепторов посредством взаимодействия с В1Р или даже независимо от В1Р.

Вследствие уникальной способности Раз/АРО1- и ΤΝΡ-рецепторов вызывать воспаление, гибель клеток, а также вследствие способности ΤΝΡ-рецепторов стимулировать другие активности, способствующие разрушению ткани, отклонения в функции этих рецепторов должны оказывать особенно неблагоприятное воздействие на организм. Действительно, было показано, что как избыточная, так и недостаточная функция этих рецепторов приводят к патологическим проявлениям различных заболеваний (Уазза111, 1992; №да1а & 0о1з!ет, 1995). Идентификация молекул, которые обеспечивают активность рецепторов в передаче сигнала, и поиск путей модуляции активности этих молекул должны привести к прямому получению новых терапевтических методов. Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующих примеров.

Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих неограничивающих примерах, сопровождаемых чертежами.

При этом следует отметить, что такие процедуры, как (1) двухгибридный скрининг и двухгибридный тест на экспрессию β-галоктозидазы; (и) индуцированная экспрессия, метаболическое мечение, и иммунопреципитация белков; (ш) ίη νίϋΌ-связывание; (ίν) анализ на цитотоксичность; и (ν) нозернанализ и анализ последовательности (см., также Во1бт е! а1., 1995Ь) 2, 3 (см. также Во1бш е! а1., 1996) и 4, см. ниже, относящиеся к МОВЪ1 и МОВЪЕ связывающему белку (например, МАСН), а также к только что выделенному белку 01 (см. II 120367), могут быть в равной степени применены (с некоторыми модификациями) для соответствующего выделения, клонирования и характеризации ВАР настоящего изобретения и его возможных изоформ. Таким образом, эти процедуры рассматриваются как полное описание тех же самых процедур, используемых для выделения, клонирования и характеризации ВАР настоящего изобретения, и подробно описанных, например, в той же самой или эквивалентной форме в совместных и одновременно рассматриваемых заявках на патент Израиля №№ 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и 120367, а также в соответствующей заявке РСТ № РСТ/и896/10521. Кроме того, что касается белка ΝΙΚ и его роли в активации ΝΡ-κΒ, а следовательно и в выживании клеток и роли, которую играет ΤπιΓ2 в этом каскаде реакций выживания клеток, например, во взаимодействии между ΤηΓ2 и В1Р и других белков, то они были подробно описаны авторами настоящего изобретения в совместных и одновременно рассматриваемых заявках 1Ь №№ 117800, 119133 и МаЛшп е! а1., 1997.

Пример. Клонирование и выделение белка ВАР, который связывается с белком В1Р.

(ί) Секвенирование путем двухгибридного скрининга и предварительный анализ.

Методом двухгибридного скрининга (см., например. Е1е1бз & 8опд, 1989, АО/96/18641) с использованием В1Р, у которого отсутствовал домен гибели, в качестве затравки в В-клеточной библиотеке, был выделен и секвенирован клон длиной около 1.9 т.п.о.

- 22 006874

Были сконструированы и получены праймеры от 5'-конца этой последовательности. С использованием ПЦР были скринированы несколько библиотек кДНК. Из библиотеки кДНК толстой кишки и библиотеки кДНК сердца был получен клон длиной около 0,3 т.п.о., и этот клон были лигирован с клоном длиной около 1,9 т.п.о., полученным из В-клеточной библиотеки.

Был секвенирован новый клон длиной около 2,2 т.п.о. (см., фиг. 1) и была определена его выведенная аминокислотная последовательность (фиг. 2).

Анализ этой последовательности показал, что белок КАР, очевидно, не имеет ни домена гибели, ни модуля МОКТ, ни протеазного домена, аналогично семейству 1СЕ, ни киназного домена, ни доменов ТКАЕ (см. вышеуказанные совместные и одновременно рассматриваемые патентные заявки и различные ссылки, а в частности, Майши е! а1., 1997, касающиеся всех различных доменов, участвующих в каскадах реакций внутриклеточной передачи сигнала, ). Исследования связывания выявили, что КАР связывается, главным образом, только с К1Р, и не способен связываться с ТКАОЦ, МОКТ-1, р55-К, р75-К и МАСН.

Поэтому очевидно, что КАР представляет собой специфический К1Р-связывающий белок, который в высокой степени специфически взаимодействует/связывается с К1Р, возможно посредством связывающей области домена, которая не присутствует в других белках, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, и выделенных до настоящего времени. Исходя из этого очевидно, что КАР является модулятором/медиатором внутриклеточной активности К1Р, играющей важную роль в К1Рмодуляции/опосредовании каскадов реакций воспаления и гибели клеток/выживания клеток.

Короче говоря, клон белка КАР получали методом двухгибридного скрининга двухгибридной библиотеки кДНК лимфоцитов периферической крови человека с использованием в качестве затравки фрагмента белка К1Р, у которого отсутствовал домен гибели. Последовательность К1Р была взята из предыдущих публикаций (например, 81аидег е! а1., 1995), и, кроме того, она имеется в банке данных СеиВаик под номером доступа № И25994, и представляет собой последовательность К1Р человека (имеется также мышиная последовательность К1Р под номером доступа № И25995). С использованием данных об этой последовательности были сконструированы соответствующие ПЦР-праймеры с помощью программного обеспечения ОЫСО4™, и был получен фрагмент ДНК, соответствующий кодирующей части К1Р, но без его С-концевого участка домена гибели, посредством ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, происходящей от библиотеки полной РНК фибробластов человека (стандартными методами). Эта кодирующая часть К1Р, в которой отсутствовала область домена гибели К1Р, была затем клонирована в вектор рСВТ-9 (С1ои!есй) и использована в качестве затравки, как указывалось выше, в процедуре двухгибридного скрининга. Посредством этого двухгибридного скрининга был получен ряд клонов, все из которых кодировали белки, являющиеся К1Р-связывающими белками, взаимодействующими с К1Р в той области К1Р, которая находится за пределами домена гибели (С-концевая область К1Р), не присутствующего в К1Р-затравке. В соответствии с последующими процедурами, описанными выше, был получен клон кДНК, последовательность которого показана на фиг. 1.

Анализ вышеуказанных последовательностей клона КАР и последовательностей в базах данных человеческого генома уровня 1 бЬек! (Нитаи Сеиоте Эа1аЬа8е) и базах данных СеиеЬаик показали, что последовательность КАР является уникальной (новой) последовательностью, поскольку известные последовательности не обнаруживали какой-либо заметной гомологии с этой последовательностью КАР.

Для того, чтобы определить, может ли КАР связываться с любым другим из известных белков, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, были проведены аналитические тесты на связывание. В этих тестах белки ТКАЭЭ, МОКТ-1, р55-К, р75-К, МАСН были проанализированы на их способность связываться с КАР. Однако было обнаружено, что КАР не способен связываться ни с одним из этих белков. КАР также не связывается ни с одним из нерелевантных контрольных белков, например ламином, циклином Ό.

Следовательно, все вышеуказанные результаты показали, что новый белок КАР может в высокой степени специфически взаимодействовать с К1Р, и этот белок, как таковой, представляет собой специфический модулятор/медиатор К1Р. Конкретный участок взаимодействия между КАР и К1Р еще необходимо определить, но предполагается, что этот участок является специфичным для К1Р и КАР, и известно, что он не является общим с участками других белков, взаимодействующих с К1Р, например МОКТ-1, ТКАЭЭ, ЕА8-К и возможно также и Тга£2 (см. Майши е! а1., 1977). Из этого также следует (исходя из анализа последовательности и сравнения с последовательностями в различных базах данных, указанных выше), что КАР не имеет ни домена гибели, ни модуля МОКТ, ни протеазного домена (например, мотива 1СЕ/СЕЭ3), ни киназного домена/мотива, и ни домена ТКАЕ. В соответствии с этим, предварительный анализ на биологическую активность также выявил, что КАР очевидно имеет следующие свойства:

(ί) КАР сам по себе не является токсичным для клеток в случае его сверхэкспрессии;

(ίί) КАР не защищает клетки от ТКЕ-уничтожения, и таким образом, очевидно, что он не является ингибитором ТКЕ-индуцированной клеточной цитотоксичности;

(ΐϊϊ) КАР сам по себе не индуцирует КЕ-кВ;

(ίν) КАР блокирует активацию КЕ-кВ под действием ТКАЭЭ, К1Р и ТКЕ-К р55;

(ν) как было обнаружено, КАР также блокирует индуцирование 1КК (киназы йт). вызываемое К1Р.

- 23 006874

Следовательно, в соответствии с вышеуказанным, очевидно, что КАР является в высокой степени специфическим К1Р-связывающим белком, а поэтому он является модулятором/медиатором К1Р, и вероятно, участвует в К1Р-опосредованных процессах внутриклеточной передачи сигнала.

В свете вышеописанного очевидно, что КАР участвует в модуляции/опосредовании внутриклеточных активностей К1Р, где этими активностями являются его участие в каскаде реакций воспаления и гибели клеток (независимо, посредством его домена гибели или посредством взаимодействия с другими белками, такими как, МОКТ-1, ΤΚΑΌΌ, р55-К, РА8-К, и ассоциированными с ними протеазами, такими как, МАСН, Мсй4, С1 и т.п.) и участия К1Р в каскаде реакций выживания клеток (активация ΝΡ-κΒ, возможно посредством взаимодействия с ТгаР2). Возможные механизмы, в соответствии с которыми КАР может модулировать/опосредовать активность К1Р, подробно описаны выше; так, например, КАР-К1Рвзаимодействие может приводить к усилению либо реакций гибели клеток, либо реакций выживания клеток, или оно может приводить к ингибированию либо реакций гибели клеток, либо реакций выживания клеток, и это усиление или ингибирование, возможно, зависит от относительной активности участников этих двух противоположных внутриклеточных процессов. КАР может также действовать как заякоривающий белок, способствующий агрегации ряда молекул К1Р и других К1Р- или КАР-связывающих белков, агрегаты которых могут затем функционировать в направлении гибели клеток или выживания клеток (или даже того и другого) в зависимости от относительных активностей/количеств других участников этих каскадов реакций, происходящих в клетке.

В соответствии с вышеприведенным полным описанием настоящего изобретения следует отметить, что каждому специалисту очевидно, что оно может быть осуществлено с использованием широкого ряда эквивалентных параметров, концентраций и условий, не выходящих за рамки существа и объема изобретения, и без излишнего экспериментирования.

Хотя настоящее изобретение описано на конкретных вариантах его осуществления, однако, в него могут быть внесены дополнительные модификации. Применение настоящего изобретения включает в себя любые его варианты, способы или адаптации, соответствующие в общих чертах идее изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания в том виде, как они следуют из известной или обычной практики, к которой имеет отношение настоящее изобретение, и как они могут быть применены к основным отличительным признакам, описанным выше и сформулированным в нижеследующей формуле изобретения.

Все работы, цитированные в настоящем описании, включая журнальные статьи и рефераты, опубликованные или соответствующие патентные заявки США, или иностранные патентные заявки, выданные патенты США или иностранные патенты, или любые другие работы, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки, включая все данные, таблицы, рисунки и текст, представленные в цитируемых работах. Кроме того, полное содержание работ, цитируемых в настоящей заявке, также во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Ссылки на стадии известных методов, стадии стандартных методов, на известные методы или стандартные методы никоим образом не должны означать, что какой-либо аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения раскрывается, описывается или предполагается в этих работах.

Вышеприведенное описание конкретных вариантов осуществления изобретения настолько полно раскрывает общую идею настоящего изобретения, что другие специалисты, используя данные, известные в этой области (включая содержание цитированной литературы), могут легко модифицировать и/или адаптировать эти конкретные варианты изобретения для различных целей без излишнего экспериментирования, не выходя, однако, за рамки общей концепции настоящего изобретения. Поэтому такие адаптации и модификации, исходя из их описаний и пояснений, представленных в настоящей заявке, также входят в существо и объем настоящего изобретения как эквиваленты описанных вариантов осуществления изобретения. Следует отметить, что фразеология и терминология приводится в настоящей заявке лишь в описательных целях и должна рассматриваться специалистами не как ограничение, а лишь как описание и объяснение в комбинации со знаниями, которым владеет каждый специалист.

Источники:

А1пешп, Е.8. е! а1. (1995) I. ΒίοΙ. Сйеш. 270:4312-4317.

Ваппада, М. (1993) 8е1епее 262:1512-1514.

Вед, А.А. апд Ва1йшоге, Ό. 8с1епее 274:782-784.

Ве1д1ег, I. е! а1., (1995) I. Βίο1. Сйеш. 270:16526-16528.

Вегдег, I. е! а1., (1988) Сепе 66:1-10.

ВеиЙег, В. апд Сегашг С. (1987) ΝΕ.ΙΧ1: 316:379-385.

В1дда, I. е! а1. (1994) I. Ехр. Мед. 180:445-460.

Во1д1п, М.Р. е! а1. (1995а) I. ΒίοΕ Сйеш. 270:337-341.

Во1д1п, М.Р. е! а1. (1995Ь) I. ΒίοΕ Сйеш. 270:7795-7798.

Во1д1п, М.Р. е! а1. (1996) Се11 85:803-815.

ВгакеЬиксй, С. е! а1. (1992) ЕМВО I., 11:943-950.

Вгоскйаик, М. е! а1. (1990) Ргос. Асад. 8с1. И8А, 87:3127-3131.

СапЮг, С.Н. е! а1. (1993) Ргос. Асад. 8сЕ И8А 90:10932-6.

- 24 006874

Сеггей, Э.Р. е! а1. (1992) 8с1епсе 256:97-100.

СЬеп, С.1. е! а1. (1992) Апп. Ν.Υ. Асаб. 8с1. 660:271-3.

СЫппа1уап е! а1. (1995) Се11 81:505-512.

СЫппа1уап е! а1. (1996) 1. Βίο1. СЬет. 271:4961-4965.

Сйопе, М.6. е! а1. (1995) ЕМВО 1. 14:5859-5868.

С1етеп!, М.У. е! а1. (1994) 1. Ехр. Меб. 180:557-567.

Спке11, Р. е! а1., (1993) №с1ек Ас1бк Кек. (Епд1апб) 21 (22):5251-5.

Сшгеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг В1о1оду (АикиЬе1, Е.М., Вгеп!, К., Ктдк!оп, К.Е., Мооге, Ό.Ό., 8е1бтап, 1.6., ЗшйЬ, 1.А., 3!гцЬ1, К., А1ЬпдЬ!, Ь.М, Соеп О.М. & Уагк1, А., ебк.). (1994) рр. 8.1.1-8.1.6 апб 16.716.7.8, бгеепе РиЬЬкЫпд Аккоаа!ек, 1пс. апб ^беу & Зопк, 1пс., №\ν Υο^к.

Эйкк, №., е! а1., (1993) 6епе 128:247-249.

ЭигГее, Τ. е! а1. (1993) 6епек Эеу. 7:555-569.

Е1ксЬеп, С.М. е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 153:1947-1954.

ЕШк, Н.М. е! а1. (1986) Се11 44:817-829.

Епап, М. е! а1. (1995) №йиге 375:78-81.

Епде1тапп, Н. е! а1. (1990) 1. Вю1. СЬет., 265:1531-1536.

РаисЬеи, С. е! а1. (1995) ЕМВО 1. 14:1914-1922.

Еегпапбек-А1петп, Τ. е! а1. (1994) 1. Вю1. СЬет. 269:30761-30764.

Еегпапбек-А1петп, Τ. е! а1. (1995) Сапсег Кек. 55:2737-2742.

Еегпапбек-А1петп, Τ. е! а1. (1996) Ргос. №11. Асаб. δα. И8А 93:7464-7469.

Ие1б. 1. е! а1. (1988) Мо1. Се11 Вю1. 8:2159-2165.

Ие1бк, δ. апб 8опд, О. (1989) 340:245-246. Егапдюш, IV. апб №е1, В.6. (1993) Апа1. ВюсЬет.

210:179-187.

беукеп, Н.М. (1985) 1ттипо1. ^бау 6:364-369.

беукеп, Н.М. е! а1. (1987) 1. 1ттипо1. Ме!Ь. 102:259-274.

боккеп, М. апб Воп)агб, Н. (1992) Ргос. Ν;ι11. Асаб. δα. И8А, 89:5547-5551.

6ге11, М. е! а1. (1994) Еиг. 1. 1ттипо1. 24:2563-2566.

Не11ег, К.А. е! а1. (1990) Ргос. ЫаЙ. Асаб. δα. ИЗА, 87:6151-6155.

Непкай, Р.А. (1996) 1ттипйу 4:195-201.

НоЬтапп, Н.-Р. е! а1. (1989) 1. Вю1. СЬет., 264:14927-14934.

Но^агб, Ά,ϋ. е! а1. (1991) 1. 1ттипо1. 147:2964-2969.

Нки, Н. е! а1. (1995) Се11 81:495-504.

Нки, Н. е! а1. (1996) Се11 84:299-308.

1!оЬ, Ν. е! а1. (1991) Се11 66:233.

1!оЬ, Ν. апб №да!а, δ. (1993) 1. Вю1. СЬет. 268:10932-7.

1окерЬ, δ. апб Вигке, !М. (1993) 1. Вю1. СЬет. 268:24515-8.

Катепк, 1. е! а1. (1995) 1. Вю1. СЬет. 270:15250-15256.

КаиГтапп, З.Н. (1989) Сапсег Кек. 49:5870-5878.

КаиГтапп, З.Н. (1993) Сапсег Кек. 53:3976-3985.

К1ксЬке1, Е.С. е! а1. (1995) ЕМВО 1. 14:5579-5588.

^ίζη^, М. е! а1. (1993) Вю1. РЬагт. Ви11 (1арап) 16 (9):879-83.

Китаг, δ. е! а1. (1994) 6епек Эеу. 8:1613-1626.

Китаг, δ. (1995) ГОепбк ВюсЬет δα. 20:198-202.

СиеВшС ΥΑ. е! а1. (1994) ΝοΛκ 371:346-347.

ЬейЬаикег Ρ. е! а1. (1993) ЬаЬ 1пуек1. 69:415-429.

Ьое!ксЬег, Н. е! а1. (1990) Се11, 61:351-359.

Ьок, М. е! а1. (1995) ΝοΛκ 375:81-83.

МаНшп, ΝΑ. е! а1. (1997) Ыа1иге 385:540-544.

Магйп, δ.Ι е! а1. (1995) 1. Вю1. СЬет. 270:6425-6428.

МакЫта, Τ. е! а1. (1995) ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Соттип. 209:907-915.

МШег, В.Е. е! а1. (1995) 1. 1ттипо1. 154:1331-1338.

М1Шдап, С.Е. е! а1. (1995) Ыешоп 15:385-393.

Мтга, М. е! а1. (1995) Ргос. ЫаЙ. Асаб. δοΐ. ИЗА 22:8318-8322.

Мипбау, КА. е! а1. (1995) 1. Вю1. СЬет. 270:15870-15876.

МигаткЫ, δ. е! а1. (1991) РЬагт. КекеагсЬ 8:649.

№да!а, δ. апб 6о1к!ет, Р. (1995) δ^ΐ'^ 267, 1449-1456.

№сЬо1коп, Ό.№. е! а1. (1995) ЫаШге 376:37-43.

^рЬт, Υ. е! а1. (1990) ЕМВО 1., 9:3269-3278.

Р1С]ие( Р.Е. е! а1. (1987) 1. Ехр. Меб., 166:1280-89.

Кау е! а1. (1992) Се11 69:597-604.

Кидд1его, V. е! а1. (1987) Се11 1ттипо1. 107:317-325.

- 25 006874

8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ.

8сЬа11, Т.1. е! а1. (1990) Се11, 61:361-370.

8сЫеде1, е! а1. (1996) 1. Бю1. Скет. 271:1841-1844.

8скике-Ок!кой', К. е! а1. (1994) ЕМВО 1. 11:4587-4596.

8к1тауата, Т. е! а1., (1993) №.1с1ею Ас1йк 8утр. 8ег. 29:177-8

8коге, 8.К. е! а1. (1993) Опсодепе 8:3183-8.

81еа!к, Р.К. е! а1. (1990) 1. Вю1. Скет. 265:14526-14528.

8тйк, С.А. е! а1. (1990) 8с1епсе, 248:1019-1023.

8опд, Η.Υ. е! а1. (1994) 1. Вю1. Скет. 269:22492-22495.

8г1п1уаки1а, 8.М. е! а1. (1996) Ргос. №11. Асай. 8ск И8А 93.:14486-14491.

8!апдег, Β.Ζ. е! а1. (1995) Се11 81:513-523.

Тайадка, Ь. А. е! а1. (1993) Се11, 74:845-853.

Тетап, М. е! а1. (1995) 1. Вю1. Скет. 270:3255-3260.

Тетап, М. е! а1. (1995а) 1. Вю1. Скет. 270:18738-18741.

Тетап, М. е! а1. (1995Ь) Се11 81:1-20.

ТкотЬеггу, КА. е! а1. (1992) №!иге 356:768-774.

ТкотЬеггу, КА. е! а1. (1994) ВюскетШгу 33:3934-3940.

Тгасеу, 1.Т. е! а1. (1987) Книге, 330:662-664.

Уап АпЦуегр. Ό.Ι. е! а1. (1996) 8с1епсе 274:787-789.

УапйепаЬее1е, Р. е! а1. (1995) Тгепйк Се11 Вю1. 5:392-400.

УаккаШ, Р. (1992) Апп. Кеу. 1ттипо1. 10:411-452.

\а11аск, Ό. (1984) 1. 1ттипо1. 132:2464-9.

\а11аск, Ό. (1986) 1п: ИНегГегоп 7 (1оп Сгеккег, ей.), рр. 83-122. Асайетк Ргекк, Ьопйоп.

\а11аск, Ό. е! а1. (1994) Су!окше 6:556.

Уапд, Ь. е! а1 (1994) Се11 78:739-750.

\апд, С.-Υ е! а1., (1996) 8с1епсе 274:784-787.

\а!апаЬе-Еикипада, К. е! а1. (1992) Книге, 356:314-317.

\а!апаЬе, Е.К. е! а1. (1992) 1. 1ттипо1. 148:1274-1279.

\е1кеп, М. е! а1. (1980) 1. 1ттипо1. 125:719-724.

ЧУИкк, А.Е. е! а1. (1989) Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А, 86: 1603-1607.

\опд е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 152:1751-1755.

Хие, Ό. е! а1. (1995) Книге 377:248-251.

Υопека^а, 8. е! а1. (1989) 1. Ехр. Мей. 169:1747-1756.

Υ^! 1. е! а1. (1993) Се11 75:641-652.

Ζасска^^а, 8. е! а1. (1991) Еиг. 1. Ркагтасо1. 203:353-357.

Ζкао, 1.1. апй Р1ск, Ь. (1993) Книге (Епд1апй) 365:448-51:

- 26 006874

Список последовательностей (1) Общая информация:

(ί) Заявитель:

(A) Название: Уес1а ВеэеагсЬ апй ΟβνθΙοριηθηΕ Со. ΙΛά (B) Улица: ГОехгтапп 1пз£1Еи£е о£ Зсхепсе, Р.О.В. 95 (C) Город: ΚβΗονοΐ:

(Е) Страна: Израиль (Е) Почтовый индекс: 76100 (С) Телефон: 972-8-93344093 (Н) Телефакс: 972-8-9470739 (A) Имя Иа11асЪ, ϋπνίά (B) Улица: 24 ΒοτοοΕον Збгееб (C) Город: ΚβΗονοΕ (Е) Страна: Израиль (Е) Почтовый индекс: 76406 (A) Имя КОУАЬЕЫКО, Апйге!

(B) Улица: ВетЕ С1оге, Ие±гтапп 1пБ£1£.и£е о£ Зс1епсе (C) Город: ΒβνοΗοΕ (Е) Страна: Израиль (Е) Почтовый индекс: 76100 (ϋ) Название изобретения: Модуляторы функции рецепторов семейства рецепторов ΤΝΟ/ЫСЕ и других белков (ΐϋ) Число последовательностей: 2 (ίν) Форма компьютерного считывания:

(A) Тип носителя: гибкий диск (B) Компьютер: ΙΒΜ РС - совместимый (C) Операционная система: ΡΟ-ϋΟ5/Μ3-ϋΟ3 (О) Программное обеспечение: РаЕепЕЁп Ве1еа5е # 1.0, Уегзхоп #1.30 (ν) Данные по настоящей заявке:

Номер заявки: 1Ь РСТ/1Д98/00125 (νϊ) Данные по приоритетной заявке:

(A) Номер заявки: 1Ъ 120485 (B) Дата подачи: 19 марта 1997 г.

(2) Данные последовательности ЗЕО Ю Νο:1:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 2154 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота

-27006874 (С) Количество цепей: одна (ϋ) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Описание последовательности 5Е<2 Ю Νο:1:

ССААААССТТ	СТССАССССС	АТТАССААТС	СССАААСССС	САСССССССС	АСТСТССССС	60
сссттстттт	СССССТТТСС	ССТСАССТАС	СССТСАССТС	СССТАСТССС	САСТСССССС	120
тсстссссст	ттсссссссс	АССТССТССС	СССССССССС	СТСССССТСС	ССССТТСССС	180
СТССАССССС	стсссссссс	СТСССССССТ	САТСАСССТС	сссстссссс	ТТСТСААССС	240
САССТССССС	СТССАССТСС	СССАСССССА	ССССССТССС	СТСССССТСС	ТССАСААСАТ	300
ссссссссст	сссстсссст	стсстсссст	ССТССТТСТА	АТАССССАТТ	ТАСААТТАСА	360
ТТСААСТАСА	АССАТССССТ	САСТССАСАТ	СААСАСАССТ	ТСССТТСАТА	ТСССАТТСТТ	420
ТСТССССАСТ	ТСАТАТСТТТ	САТТСТТСАА	САТСАСАТТС	САСССССТАА	ТАТАССТТСА	480
ТССАСАСАТТ	САСАССАТТС	ТТСАСТССАС	ААТААТСАСС	ААСТССССАС	САССТССААТ	540
САСАСТАССА	ТССАССАТСА	АСААССААСТ	САТТСАТТСС	ААССАСАССС	АССССАСТСТ	600
ССТСТТТССА	АТСАССАСАС	ТАТСТТАССС	ССТАСТСААА	АТТТТСААСС	ТСАСТСААТТ	660
СААСАТААТС	СССАТАТССС	АСАССССАСА	ССТТТСТАТС	ССТСАСААСС	САТССТСТСТ	720
АСТСААТССС	ТССААССССА	АСТСССАСАТ	ТСАТТАСАСА	ССТТСТАТСА	АТСАССТСАС	780
ТСТТСТСАТС	ССААТСАТСС	СТТСАТАСТС	ТТСАТАСАТС	ТТСТСАТСТТ	ССАСТСАССТ	840
ТАСАТАССТС	АССССАСССА	АСССАААССА	СТСТССАТСС	СССАСААСТС	СААСТТСАСС	900
ССССТСТАТА	АССТССАСТА	САТССАТССТ	СТСТСССАСС	ССАССТСССС	ТАСТСТСАСС	960
ТСТСТСССТТ	ТСССАААССТ	САТТСТТСТА	ААТССТАСАС	ТАААААТСАА	СААТСАСАТТ	1020
АСААСТСТСА	АААСАТТССА	ССТССТАССА	СААТСТТТТА	ТТТССАААСА	САААСТАССС	1080
СААААТСТАС	ССААСАТАТА	САААСАТСТТ	САСАААСТСТ	СТССССТСТТ	ТАААСАССАС	1140
СТССТСТАТС	СТСТТТТССС	ТТТТАССССА	СААССАСТСА	АССТАССАСА	ТСТАТТТССС	1200
ТТССТССТСС	ТСССАТТССА	АСТСАААСТА	СССАТСТТСС	САСТТСТССА	тсттссттсс	1260
СТСТТСТСТТ	ТСТСТССССТ	ТТСТССТСАС	СТСТТТАСТС	СТТСАААТСА	СССАСТССТС	1320
ТССАССТТТТ	ТАТАТСТССС	ТСАТТТТССА -САСААТАСТС	ТСАСАСТТСА	АСАСАСАСАТ	1380
ТССАААСААС	ТСТАСАССАА	САСССАСАТА	САААСААААС	ААТСССССАА	АССССССТТТ	1440
СТСАТССТСС	ТСССАТССТС	ААСТСАСАСС	АТТССАТТСТ	АТСССААССС	СТТССАСССТ	1500
АССССАТТТС	СТАССТСССС	ССТТССТССА	ССААТТАТСС	ССССТСААТА	ТСАССАААСА	1560
ССААСАСТТС	ССТАТСТТСС	АСАСССААТС	АСТТСАСТСА	ТТССТССТСС	ТССССАСАСС	1620
СССАСССАСТ	ТТССТССАСТ	САСАССАССС	ТТТСАТССАС	ТТСССССАСТ	ТССАССАССТ	1680
ААССССАТСТ	ТСССАССССС	АССССССССС	ААТСАСАСАТ	ТТСССТТТАС	АСССАССАСС	1740
ССТСССССАА	СТСАТССССС	ССТСТСАТТС	АТСТСАТТСА	ТТТСТААТТТ	САТТТСТССА	1800
ССТССАТТТС	ТТТТТСТТТС	ТАААСТАСАС	АТСТСААСТС	сттсссстсс	ТСАТСТССАС	1860.
ТСТТАТТТТС	ТСАТТСТССТ	СТТСАСАСТТ	ССАСТСССАС	АААССТТТТА	АСАСАТАСАТ	1920
ТТАТАССССТ	АССССТССТА	ТСАСССАААС	СТТССТСТСТ	САСААССТТС	СССТТСССАА	1980
ТАСТТСССТС	ССААТСТССС	ТССТСТТССТ	ТСТССТСТАС	АТТСААСТТТ	СТТТТСТСАТ	2040
ССТСТТСТТА	ССАСАТТААА	АААААСТСТА	ААТТАААААА	АААААААААА	АААААААААА	2100
АААААААААА	ТТССТССССС	СССТССАССА	ТССАТСТАСА	СССССТСАТС	ТААТ	2154

-28006874 (2) Данные последовательности 8Е0 Ю Νο:2 (ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 591 аминокислота (B) Тип: аминокислотная (C) Количество цепей: одна (0) Топология: линейная
(ίϊ) Тип молекулы:	пептид

(χϊ) Описание последовательности 8Е0 Ю Νο:2

Рго Ьуз А1а Зег

Агд Агд

Рго

Ьеи

Рго 11е А1а Ьуз Рго А1а С1у Агд

1

5

10

15

Рго

Ьеи

Тгр

Агд 20

С1у РЬе

РЬе

Зег

Рго РЬе 25

Агд

Ьеи

Зег Туг 30

Рго

Зег

А1а

Рго

Уа1 35

Уа1

А1а Зег

Рго

С1у 40

Зег Зег

Рго

РЬе

С1у А1а 45

С1у

А1а

Агд 50

Рго

Агд

Агд Агд

Рго 55

Агд

Агд Агд

РЬе

Агд 60

Уа1 С1п

А1а

Рго

Агд 65

А1а

Суз

Агд Агд 70

ΗΪ3

С1и

А1а А1а

С1у 75

А1а

А1а Зег

С1и

А1а 80

Азр

Ьеи

А1а

С1у С1у 85

А1а

Агд

61у 61у 90

А1а

61у Тгр 61у

Рго 95

А1а

Рго

С1у

С1и

ΗΪ8 100

С1у Рго

А1а

Зег

Агд С1у 105

Ьеи

Тгр

Зег Рго 110

Рго

Агд

Зег

Азп

ТЬг 115

Агд

РЬе ТЬг

Пе

ТЬг 120

Ьеи Азп

Туг Ьуз

Азр Рго 125

Ьеи

ТЬг

С1у

Азр 130

С1и

ТЬг Ьеи

А1а 135

Зег

Туг 61у

11е

Уа1 140

Зег С1у Азр

Ьеи

Не 145

Суз

Ьеи

11е

Ьеи О1п 150

Азр

Не Рго

А1а 155

Рго

Азп Не

Рго

Зег 160

Зег

ТЬг

Азр

Зег

С1и ΗΪ3 165

Зег

Ьеи С1п 170

Азп

С1и С1п

Ьеи 175

А1а

ТЬг

Зег

Азп 180

61п ТЬг

Зег

Мек

С1п Азр 185

61и

С1п

Рго Зег 190

Азр

Зег

РЬе

61п

61у 195

С1п

А1а А1а

С1п

Зег 200

61у Уа1

Тгр

Азп

Азр Азр 205

Зег

Мек

Ьеи

С1у 210

Рго

Зег

С1п Азп

РЬе 215

б!и

А1а С1и

Зег

Не 220

61п Азр

Азп

А1а

ΗΪ3 225

Мек

А1а

С1и

С1у ТЬг 230

С1у

РЬе

Туг Рго

Зег 235

С1и

Рго Мек

Ьеи

Суз 240

29006874

Зег

С1и

Зег

Уа1

С1и

С1у

С1п

Уа1

Рго

ΗΪ3

Зег

Ьеи

С1и

ТЬг

Ьеи

Туг

245

250

255

С1п

Зег

А1а

Азр

Суз

Зег

Азр

А1а

Азп

Азр

А1а

Ьеи

Не

Уа1

Ьеи

Не

260

265

270

ΗΪ3

Ьеи

Мек

Ьеи

С1и

Зег

С1у

Туг

Не

Рго

61п

С1у

ТЬг

61и

А1а

275 280 285

Ьуз

А1а

Ьеи

Зег

Мек

Рго

С1и

Ьуз

Тгр

Ьуз

Ьеи

Зег

С1у

Уа1

Туг

Ьуз

290

295

300

Ьеи

С1п

Туг

Мек

ΗΪ8

Рго

Ьеи

Суз

С1и

С1у

Зег

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

305

310

315

320

Суз

Уа1

Рго

Ьеи

С1у

Азп

Ьеи

Не

Уа1

Азп

А1а

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

325

330

335

Азп

С1и

Не

Агд

Зег

Уа1

Ьуз

Агд

Ьеи

61п

Ьеи

Рго

61и

Зег

340

345

350

РЬе

Не

Суз

Ьуз

61и

Ьуз

Ьеи

С1у

С1и

Азп

Уа1

А1а

Азп

Не

Туг

Ьуз

355

360

365

Азр

Ьеи

С1п

Ьуз

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азр

С1п

Ьеи

Уа1

Туг

Рго

370

375

380

Ьеи

А1а

РЬе

ТЬг

Агд

С1п

А1а

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Уа1

РЬе

С1у

385

390

395'

400

Ьеи

Уа1

Ьеи

Рго

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Агд

Не

РЬе

Агд

Ьеи

405

410

415

Азр

Уа1

Агд

Зег

Уа1

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Уа1

Суз

Агд Азр

Ьеи

РЬе

420

425

430

ТЬг

А1а

Зег

Азп

Азр

Рго

Ьеи

Тгр

Агд

РЬе

Ьеи

Туг

Ьеи

Агд

Азр

435

440

445

РЬе

Агд

Азр

Азп

ТЬг

Уа1

Агд

Уа1

61п

Азр

ТЬг

Азр

Тгр

Ьуз

<31 и

Ьеи

450

455

460

Туг

Агд

Ьуз

Агд

ΗΪ3

Не

С1п

Агд

Ьуз

С1и

Зег

Рго

Ьуз

С1у Агд

РЬе

4 65

470

475

480

Уа1

Мек

Ьеи

Рго

Зег

ТЬг

Н1з

ТЬг

Не

Рго

РЬе

Туг

Рго

Азп

485

490

495

Рго

Ьеи

Н1з

Рго

Агд

Рго

РЬе

Рго

Зег

Агд

Ьеи

Рго

С1у

Не

500

ч

505

510

Не

(Пу

С1у

С1и

Туг

Азр

С1п

Агд

Рго

ТЬг

Ьеи

Рго

Туг

Уа1

С1у Азр

515

520

525

Рго 11е Зег Зег ]

Беи

Не

Рго

61у

Рго

С1у

С1и

ТЬг

Рго

> Зег С1п РЬе

530 535 540

Рго Рго Ьеи Агд Рго Агд РЬе Азр Рго Уа1 С1у Рго Ьеи Рго С1у Рго

545 550 555560

Азп Рго Не Ьеи Рго С1у Агд 61у С1у Рго Азп Азр Агд РЬе РгоРЬе

565 570575

Агд Рго Зег Агд С1у Агд Рго ТЬг Азр 61у Агд Ьеи Зег РЬе Мек

580 585

Claims

1. Последовательность ДНК, способная гнбридизоваться с последовательностью ДНК, приведенной на фиг. 1, в умеренно жестких условиях и кодирующая полипептид, обладающий активностью КАР [белка, ассоциированного с ΚΙΡ (взаимодействующим с рецептором белком)], причем указанный полипептид обладает следующими свойствами:

(а) сам по себе не токсичен по отношению к клеткам при сверхэкспрессии;

(б) не защищает клетки от уничтожения ΤΝΕ (фактором некроза опухоли) и, таким образом, не является ингибитором ΤΝΕ-индуцируемой цитотоксичности;

-30006874 (в) сам по себе не индуцирует ΝΡ-кВ (ядерный фактор-кВ);

(г) блокирует активацию ΝΡ-кВ ’ГКАОП (доменом гибели, связанным с рецептором фактора некроза опухоли типа 1), ΡΙΡ и ΤΝΡ-К (рецептором фактора некроза опухоли); и/или (д) блокирует индукцию киназы 1ии (ΡΝΚ, аминоконцевой киназы 1ии), вызванную ΡΙΡ.

2. Способ получения последовательности ДНК, охарактеризованной в п.1, предусматривающий применение дрожжевой двухгибридной методики, включающий следующие стадии:

(а) получение одного гибридного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую ΡΙΡ, не содержащий домена гибели, и второго гибридного вектора, содержащего последовательность из библиотеки кДНК или геномных ДНК;

(б) трансформацию дрожжевых клеток-хозяев векторами со стадии (а);

(в) обеспечение взаимодействия белковых продуктов двух векторов с запуском транскрипции репортерного гена;

(г) отбор положительно трансформированных клеток по экспрессии продукта репортерного гена; и (д) выделение из положительно трансформированных клеток со стадии (г) указанного второго гибридного вектора для получения указанной последовательности ДНК, кодирующей полипептид, который связывается с указанным ΡΙΡ.

3. Вектор, содержащий последовательность ДНК, охарактеризованную в п.1.

4. Вектор по п.3, способный экспрессироваться в эукариотической или прокариотической клеткехозяине.

5. Вектор по п.3 или 4, представляющий собой рекомбинантный вектор на основе вируса животного, дополнительно содержащий последовательность ДНК, кодирующую поверхностный вирусный белок (лиганд), который способен связываться со специфичным рецептором поверхности клетки, подлежащей трансфекции указанным вектором.

6. Трансформированная эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по любому из пп.3-5.

7. Способ получения полипептида, обладающего активностью КА₽, предусматривающий культивирование трансформированных клеток-хозяев по п.6 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида с осуществлением посттрансляционных модификаций, и выделение полипептида.

8. Полипептид, обладающий активностью КА₽ и не содержащий домена гибели, модуля ΜΟΡΤ, протеазного домена, киназного домена/мотива и домена ТСАЕ, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК по п.1.

9. Применение полипептида по п.8 в форме, подходящей для внутриклеточного введения, для производства фармацевтической композиции для модуляции или опосредования модулируемых/опосредуемых ΡΙΡ внутриклеточных эффектов на каскады реакций воспаления, клеточной гибели или выживания клеток, в которых ΡΙΡ участвует прямо или опосредованно через другие модуляторы/медиаторы данных каскадов реакции.

10. Применение последовательности ДНК по п.1, кодирующей полипептид по п.8, в составе подходящего вектора, содержащего указанную последовательность, причем данный вектор способен обеспечить экспрессию указанного белка в клетках, для производства фармацевтической композиции для модуляции или опосредования модулируемых/опосредуемых ΡΙΡ внутриклеточных эффектов на каскады реакций воспаления, клеточной гибели или выживания клеток, в которых ΡΙΡ участвует прямо или опосредованно через другие модуляторы/медиаторы данных каскадов реакции.

11. Применение по п.10, согласно которому в указанные клетки вводят вектор по п.5.

12. Применение олигонуклеотидной последовательности, кодирующей антисмысловую последовательность, по крайней мере, по отношению к части последовательности ДНК по п.1, причем указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка КΑΡ, для производства фармацевтической композиции для модуляции К^-модулируемого/опосредуемого воздействия на клетки.

13. Применение по п.12, согласно которому указанную олигонуклеотидную последовательность вводят в указанные клетки с помощью рекомбинантного вектора на основе вируса животного, содержащего последовательность ДНК по п.1 и последовательность ДНК, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), способный связываться со специфичным рецептором на поверхности клетки, подлежащей трансфекции вектором, и где указанная вторая последовательность указанного вируса кодирует указанную олигонуклеотидную последовательность.

14. Применение вектора, кодирующего рибозимную последовательность, способную взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей полипептид по п.8, в такой форме, которая обеспечивает экспрессию указанной рибозимной последовательности в указанных клетках, и где, в случае, если указанная рибозимная последовательность экспрессируется в указанных клетках, она взаимодействует с указанной клеточной последовательностью мРНК и расщепляет указанную последовательность мРНК, что приводит к ингибированию экспрессии указанного полипептида в указанных клетках для производства фармацевтической композиции для модуляции действия ΡΙΡ на клетки.

- 31 006874

15. Способ выделения и идентификации полипептида по п.8, способного непосредственно связываться с ΚΙΡ, предусматривающий применение дрожжевой двухгибридной методики, включающий следующие стадии:

(а) получение одного гибридного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую ΚΙΡ, не содержащий домена гибели, и второго гибридного вектора, содержащего последовательность из библиотеки кДНК или геномных ДНК;

(г) отбор положительно трансформированных клеток по экспрессии продукта репортерного гена; и (д) выделение из положительно трансформированных клеток со стадии (г) указанного второго гибридного вектора для получения последовательности ДНК, кодирующей полипептид, который связывается с указанным ΚΙΡ, и последующее получение полипептида традиционными методами.

16. Применение полипептида по п.8 в форме, подходящей для внутриклеточного введения, для производства фармацевтической композиции для модуляции процессов, которые прямо или косвенно опосредуются/модулируются ΚΙΡ, и которые включают ингибирование ΝΕ-κΕ и 1ΝΚ.

17. Применение последовательности ДНК по п.1, кодирующей полипептид по п.8, в составе подходящего вектора, содержащего указанную последовательность, причем данный вектор способен обеспечить экспрессию указанного белка в клетках, для производства фармацевтической композиции для модуляции процессов, которые прямо или косвенно опосредуются/модулируются ΚΙΡ, и которые включают ингибирование ΝΡ-κβ и 1ΝΚ.

18. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, модулируемых и/или опосредуемых ΚΙΡ, содержащая в качестве активного ингредиента последовательность ДНК по п.1, вектор по п.5, полипептид по п.8, олигонуклеотид, кодирующий антисмысловую последовательность, по крайней мере, по отношению к части указанной последовательности ДНК, или вектор, кодирующий рибозим, способный взаимодействовать с мРНК, кодирующей указанный полипептид, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель.

19. Применение вектора по п.5 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения опухолей, СПИДа и других заболеваний, при которых экспрессируются специфичные рецепторы клеточной поверхности, способные взаимодействовать с ΚΙΡ.

20. Применение последовательности ДНК по п.1 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции действия ΚΙΡ на клетки или для лечения опухолей, воспалительных заболеваний, СПИДа, септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, аутоиммунных заболеваний или сахарного диабета.

21. Применение вектора по п.5 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции действия ΚΙΡ на клетки или для лечения опухолей, воспалительных заболеваний, СПИДа, септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, аутоиммунных заболеваний или сахарного диабета.

22. Применение полипептида по п.8 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции действия ΚΙΡ на клетки или для лечения опухолей, воспалительных заболеваний, СПИДа, септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, аутоиммунных заболеваний или сахарного диабета.

23. Применение олигонуклеотида, кодирующего антисмысловую последовательность по крайней мере к части последовательности ДНК по п.1, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции действия ΚΙΡ на клетки или для лечения опухолей, воспалительных заболеваний, СПИДа, септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, аутоиммунных заболеваний или сахарного диабета.

24. Применение вектора, кодирующего рибозим, способный взаимодействовать с мРНК, кодирующей полипептид по п.8, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции действия ΚΙΡ на клетки или для лечения опухолей, воспалительных заболеваний, СПИДа, септического шока, отторжения трансплантата, острого гепатита, аутоиммунных заболеваний или сахарного диабета.