CN1250479A - Tnf/ngf受体家族中受体功能的调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能够调节/介导RIP功能的蛋白质,其制备方法和用途。

Description

TNF/NGF受体家族中受体功能的调节剂

发明领域

本发明所涉及的领域属于TNF/NGF受体超家族的受体及其生物功能的调控。TNF/NGF受体超家族包括的受体例如p55和p75肿瘤坏死因子受体(TNF-Rs，以下称p55-R和p75-R)，FAS配体的受体(又称FAS/APO1或FAS-R，以下称FAS-R)及其他受体。具体地说，本发明涉及新的蛋白质，它们能与其它蛋白质结合，这些其它蛋白质本身直接或间接地与TNF/NGF受体家族的成员或其它胞内调节蛋白结合，更具体地说，本发明涉及在本文中称为RAP(即RIP结合蛋白)的一种蛋白质，它与RIP(即‘受体相互作用蛋白’)结合，RIP再与自身和与MORT-1、FAS-R、p55-R、TRADD和Traf2结合。

所以，总的说来，本发明涉及的新蛋白质能够调节或介导RIP的功能，所以也能够直接或间接地调节或介导与RIP直接或间接结合的其它蛋白质的功能。具体地说，本发明涉及RAP及其制备与用途，还涉及RAP的各种同种型、同系物、片段和衍生物，以及它们的制备和用途。

相关技术背景

肿瘤坏死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)(后文中，TNF指TNF-α和TNF-β二者)是主要由单核吞噬细胞形成的多功能致炎细胞因子，具有对细胞的多种效应(Wallach，D.(1986)：Interferon 7(Ion Gresser编辑)，pp.83-122，Academic Press，London；和Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通过结合特定的细胞表面受体来引发它们的作用。有些作用对生物体可能是有利的：例如，它们能破坏肿瘤细胞或病毒感染细胞，并能促进粒细胞的抗菌活性。以这种方式，TNF参与生物体抵抗肿瘤和感染因子的防御功能，并有助于创伤的恢复。所以，TNF可用作抗肿瘤药，在此应用中它与肿瘤细胞表面受体结合，由此引发的作用导致肿瘤细胞死亡。TNF还可以用作抗感染药。

但是，TNF-α和TNF-β又都有有害作用。有证据表明，在数种疾病中，TNF-α的过量产生可能起着主要致病作用。例如，已知TNF-α对脉管系统的作用是败血性休克症的主要病因(Tracy等，1986)。在有些疾病中，TNF抑制脂肪细胞的活性和引起厌食，而导致体重过份减轻(恶病质)，所以TNF-α又称为恶病质素。据说，它还是类风湿性疾病中组织损伤的介质(Beutler和Cerami，1987)，并且是移植物抗-宿主反应所见损伤的主要介质(Piquet等，1987)。此外，已知TNF还涉及炎症过程和其它许多疾病。

分别表达的两种不同受体-p55和P75 TNF-Rs-均特异性结合TNF-α和TNF-β，引发和/或介导了TNF的上述生物作用。这两种受体具有结构上不同的胞内域，这表明它们的信号传送是不同的(参见Hohmann等，1989；Engelmann等，1990；Brockhaus等，1990；Leotscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990；和Heller等，1990)。然而，参与p55和P75 TNF-Rs胞内信号传送的细胞机制-例如各种蛋白质及可能的其它因子-还有待阐明。正是这种胞内的信号传送(通常发生在与配体结合之后，亦即TNF(α或β)与受体结合之后)造成了一连串反应的同时发生，最终导致了细胞对TNF的应答反应。

关于上述TNF在多数迄今研究过的细胞中的杀细胞作用，主要是由p55TNF-R引发的。抗p55 TNF-R胞外结构域(配体结合域)的抗体本身能够引发杀细胞作用(参见EP412486)，这种作用与抗体交联受体的效应有关，被认为是产生胞内信号传送过程的第一步。而且，诱变研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)显示，p55 TNF-R的生物功能依赖于其胞内结构域的完整性，所以有人提出：p55 TNF-R的两个或多个胞内结构域结合的结果引发了导致TNF杀细胞作用的胞内信号发送。而且，TNF(α和β)以均三聚体的形式存在，因此被认为凭借其与受体分子结合和交联的能力即引起受体集聚的能力通过p55 TNF-R诱导了胞内的信号传送。

TNF/NGF受体超家族的另一名成员是FAS受体(FAS-R)，又称FAS抗原，是一种在多种组织内表达的细胞表面受体，并与包括TNF-R和NGF-R在内的许多细胞表面受体具有同源性。FAS-R介导细胞的程序性死亡(Itoh等，1991)，而且似乎是以自身反应性T细胞的阴性选择剂而起作用，即，在T细胞成熟过程中，FAS-R介导识别自身抗原的T细胞程序性死亡。还发现，FAS-R基因(lpr)内的突变造成小鼠的淋巴繁殖失调，这类似于人自身免疫病-系统性红斑狼疮(SLE)(Watanable-Fukunaga等，1992)。FAS-R的配体似乎是一种细胞表面结合分子，杀伤T细胞(或细胞毒T淋巴细胞-CTL)是其携带者之一，所以，当这种CTL与带有FAS-R的细胞接触时，它们能够诱导携带FAS-R的细胞程序性死亡。而且，已经制备出针对FAS-R的单克隆抗体，这些单克隆抗体能够诱导携带FAS-R的细胞-包括编码人FAS-R的cDNA转化的小鼠细胞-程序性死亡(Itoh等，1991)。

本发明人采用了许多方法(例如，参见欧洲专利申请Ep186833，Ep308378，Ep398327，Ep412486)来调节TNF的有害作用，即采用抗TNF抗体或采用可溶性TNF受体(主要是此受体的可溶性胞外结构域)同TNF竞争与细胞表面的TNF-R的结合，由此抑制TNF与其受体的结合。而且，因为TNF结合其受体是TNF诱导细胞效应所必需的，所以本发明人尝试了通过调节TNF-R活性来调节TNF效应的方法(参见EP568925)。

简而言之，EP568925涉及调节TNF-R中信号传导和/或切断的方法，借此，肽或其它分子能够与受体本身反应或与同受体反应的效应蛋白反应，由此调节TNF-R的正常功能。EP568925描述了各种突变p55 TNF-R的构建和特征，这些p55 TNF-R在胞外、跨膜和胞内结构域中有突变。由此鉴定到，p55 TNF-R上述结构域内的某些区域对受体的功能是十分重要的，即配体(TNF)的结合以及随后的信号传导和胞内信号传送最终导致TNF对细胞的效应。而且，该专利还描述了一些分离和鉴定能够与TNF上述结构域内不同区域结合的蛋白质、肽或其它因子的方法，这些蛋白质、肽和其它因子可能参与调节TNF-R的活性。该专利中还提出了一些方法，用于分离和克隆编码上述蛋白和肽的DNA序列；用于构建产生这些蛋白和肽的表达载体；和用于制备与TNF-R反应或与上述结合TNF-R不同区域的蛋白质或肽反应的抗体及其片段。但是，EP568925没有具体说明与TNF-R(例如p55 TNF-R)胞内结构域结合的蛋白质和肽，也没有描述用于分离和鉴定与TNF-R胞内结构域结合的蛋白质或肽的酵母双杂交法。而且，EP568925没有公开能够结合FAS-R胞内结构域的蛋白质或肽。

虽然已知肿瘤坏死因子(TNF)受体和结构上有关的受体FAS-R在受白细胞产生的配体刺激后，在细胞内引发破坏性活动导致细胞自身消亡，但对这一引发过程的机制仍然知之甚少。诱变研究显示FAS-R和p55 TNF受体内导致细胞毒性的信号传送与它们胞内结构域中的不同区域有关(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)。这些区域(‘死亡域’)具有序列相似性。FAS-R和p55 TNF的‘死亡域’都具有自身结合的倾向。它们的自身结合显然促进了受体的聚集，这是引发信号传送所必需的(参见Song等，1994；Wallach等，1994；Boldin等，1995)，而且会在受体高水平表达时导致引发配体非依赖性信号传送(Boldin等1995)。

和其它受体诱导的作用一样，由TNF受体和FAS-R诱导的细胞死亡是通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用而发生的，这些相互作用从配体与受体的结合直至最后激活酶效应物功能，这些具体研究已阐明了引发细胞死亡信号传送的非酶促蛋白质-蛋白质相互作用：均三聚体TNF或FAS-R配体分子与受体的结合，由此造成它们胞内结构域之间的相互反应(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)因死亡域基序的自身结合倾向而增强(Boldin等，1995a)，由此诱导两种细胞质蛋白(它们也可能彼此结合)与受体胞内结构域的结合，即MORT-1(或FADD)结合FAS-R(Boldin等，1995b；Chinnaiyan等，1995；Kischkel等，1995)和TRADD结合p55-R(Hsu等，1995；Hsu等，1996)。采用酵母双杂交筛选程序鉴定到了三种蛋白，它们与FAS-R和p55-R胞内域的结合发生在涉及受体通过同源区的异质性结合而诱导细胞死亡的“死亡域”区域，并且它们也能够各自独立的引发细胞死亡。其中之一是MORT-1蛋白(Boldin等，1995b)，又称FADD(Chinnaiyan等，1995)，该蛋白特异性地结合FAS-R。第二种是TRADD(参见Hsu等，1995，1996)，它结合p55-R。第三种是RIP(参见Stanger等，1995)，它结合FAS-R和p55-R。除了与FAS-R和p55-R结合之外，这些蛋白质还能够彼此结合，造成了FAS-R与p55-R之间的功能性“串话”。上述结合是通过一段保守的序列基序，即受体及其结合蛋白质所共有的‘死亡域组件’发生的。而且，MORT-1虽然在酵母双杂交测试中表现能自发结合FAS-R，但是在哺乳动物中，这样的结合只发生在受体被刺激之后，这表明MORT-1参与了FAS-R信号发送的启动过程。MORT-1不含有任何具有酶活性特征的序列基序，所以，其引发细胞死亡的能力似乎与MORT-1本身所固有的活性无关，而与结合MORT-1的其它一些蛋白的激活有关，并在信号传送连续过程的下游起作用。细胞表达缺乏N末端部分的MORT-1显示出抑制了FAS/APO1(FAS-R)或p55-R(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)诱导的细胞毒性，表明该N末端区域通过蛋白质-蛋白质相互作用传递了两种受体的杀细胞效应的信号。

所以，受体p55-R和FAS-R以及它们的三个结合蛋白MORT-1、RIP和TRADD的‘死亡域’基序看来是蛋白质-蛋白质相互作用的部位。MORT-1、RIP和TRADD这三种蛋白通过各自死亡域与受体死亡域的结合而与p55-R和FAS-R的胞内结构域相互作用，RIP和TRADD的‘死亡域’还能自身结合，但是MORT-1在这方面的区别在于它的‘死亡域’不会自身结合。还有，MORT-1和TRADD与p55-R和FAS-R的结合不同，也会彼此结合。而且，MORT-1和TRADD都能与RIP有效结合。所以，MORT-1、RIP和TRADD这三种蛋白之间的相互作用似乎是这些蛋白介导的对胞内信号传送全面调节作用的重要组成部分。于扰这三种胞内蛋白之间的相互作用将得以调节这种相互作用引起的效应。例如，抑制TRADD与MORT-1的结合能够调节FAS-R-p55和TNF-R的相互作用。同样，除上述抑制TRADD外，抑制RIP与MORT-1的结合，将进一步调节FAS-R-p55和TNF-R的相互作用。

还可以使用抗p55-R的‘死亡域’，尤其是抗TRADD和RIP上结合位点的单克隆抗体来抑制或防止这些蛋白的结合，由此调节FAS-R与p55-R之间的相互作用。

而且，最近发现，除了上述细胞毒性和由各种受体及其结合蛋白(包括FAS-R、p55-R、MORT-1、TRADD、RIP、MACH、Mch4和G1)介导的调节作用之外，许多此类受体及其结合蛋白还参与调节核转录因子NF-κB的活性，此因子是细胞生存或活力的重要介质，负责调控许多免疫和炎性应答基因的表达。例如，已经发现，TNF-α可能实际上激活NF-κB，所以，TNF-α在细胞内能够诱导两种信号，一种造成细胞死亡，另一种通过NF-κB诱导基因表达而保护细胞抵抗死亡诱导(参见Beg和Baltimore，1996；Wang等，1996；Van Antwerp等，1996)。据报道，FAS-R也具有类似的双重功能(参见前文Van Antwerp等，1996就这一作用所作的陈述)。所以，各种类型细胞受TNF-α和/或FAS-R配体刺激后，在细胞死亡和细胞存活之间似乎存在着微妙的平衡，刺激的最终结果在很大程度上取决于激活的细胞内通路，一种是导致细胞死亡(通常是凋亡)的通路，另一种是通过激活NF-κB使细胞存活的通路。

此外，本发明人最近还阐明了TNF/NGF受体家族成员激活NF-κB的可能路径(参见Malinin等，1997和前文引用的许多相关参考文献；含有共同拥有的、待批准的以色列专利申请IL117800和119133)。简而言之，文献提出TNF/NGF受体家族中的数名成员能够通过一种共有的衔接蛋白(common adaptorprotein)Traf2来激活NF-κB。一种新近阐明的蛋白激酶NIK(参见前文的Malinin等，1997和IL117800及119133)能够结合Traf2，并能够激活NF-κB。实际上，已证明(参见前述的Malinin等和IL专利申请)激酶缺陷型NIK突变体在细胞内的表达使得细胞不能以正常的内源性方式激活NF-κB，而且导致细胞通过两种FAS-R之一经TNF诱导的NF-κB活性受到阻抑，以及TRADD、RIP和MORT-1(它们是结合p55-R和/或FAS-R受体的衔接蛋白)诱导NF-κB也受到阻抑。受体p55-R、p75-R、FAS-R和它们的衔接蛋白MORT-1、TRADD和RIP都直接或间接结合Traf2，后者显然凭借其结合NIK的能力调节着对NK-κB的诱导。

在参与FAS-R和/或p55-R刺激后细胞死亡与存活之间精细平衡的上述调节蛋白中，RIP蛋白似乎具有重要作用。RIP(参见Stanger等，1995和Malinin等，1997)在C末端有一个‘死亡域’，使得它能够独自或者通过与MORT-1、p55-R、FAS-R和TRADD的死亡域结合来诱导细胞毒性。RIP还在N末端有一个蛋白激酶域和一个中间域，该中间域据信使得它能够与Traf2交连(结合)并因此参与了 NK-κB诱导。所以，上述文献中公开了有关RIP特征和序列(DNA序列和氨基酸序列)的详细信息，这些内容均被本文纳为参考。

发明综述

本发明目的之一是提供一种新的蛋白RAP，包括它的所有同种型、同系物、片段或衍生物，它们能够结合RIP蛋白(后文称‘RIP’)。因为RIP能够直接或间接地与炎症、细胞毒性/细胞死亡的胞内介质(例如p55-R和FAS-R)以及与它们结合的衔接蛋白或调节蛋白(例如MORT-1、TRADD、MACH、Mch4、G1等)相互作用，所以，本发明的新蛋白能够通过结合RIP来影响由FAS配体结合其受体以及TNF结合其受体(p55-R)引发的胞内信号传送过程，而且，本发明的新蛋白因此是p55-R和FAS-R介导的对细胞作用的调节剂。因为RIP还能够与Traf2相互作用，所以能够直接或间接与NIK反应，因而RIP是涉及NF-κB诱导的炎症和细胞存活通路的调节剂，本发明的新蛋白也因此是RIP相关炎症和细胞存活活性的调节剂。同样，因为FAS-R、p55-R及其调节蛋白MORT-1和TRADD能通过直接或间接结合RIP或与RIP所结合的Traf2结合，而诱导NF-κB和细胞存活，本发明的蛋白通过共同的或相关的胞内信号传送通路(上述各种蛋白参与其中以诱导细胞的存活)，还是细胞存活过程的介质。同样，因为p75-R与RIP所结合的Traf2结合，本发明的新蛋白还可能是p75-R所介导活性的RIP相关介导作用的调节剂。

本发明的另一个目的在于提供上述新的RAP蛋白及其同种型、同系物、片段和衍生物的拮抗剂(例如抗体、肽、有机化合物、或者甚至是某些同种型)，它们能够在需要时用来抑制信号传送过程，或者更具体地说，抑制炎性细胞毒性或细胞存活过程。

本发明的目的还在于用上述新的RAP蛋白及其同种型、同系物、片段或衍生物来分离和特征分析其它蛋白质或因子，这些蛋白质和因子可能参与调节受体的活性，例如结合RAP并影响其活性的其它蛋白质，以及/或用于分离和鉴定处于信号传送过程更上游或更下游的其它受体，上述新蛋白及其同系物、片段和衍生物与这些受体结合，也因此参与它们的功能。

本发明的目的还在于提供抑制剂，它们能够被引入细胞与RAP和可能的RAP同种型结合或相互作用，这些抑制剂可以在细胞毒性过程中抑制RIP相关活性，因此在需要时增强细胞的存活，或者在细胞存活过程中抑制RIP相关活性，因此在需要时加强细胞毒性。

而且，本发明的目的还在于用上述新的RAP蛋白及其同种型、同系物、片段和衍生物作为抗原来制备它们的多克隆抗体和/或单克隆抗体。然后可以用这些抗体来从不同的来源(例如细胞提取物或转化的细胞系)提纯此种新蛋白。

此外，这些抗体可以用于诊断，例如用于鉴定与p55-R、FAS-R或其它相关受体介导的细胞效应功能异常有关的疾病。

本发明的目的还在于提供包含上述新的RAP蛋白及其同种型、同系物、片段或衍生物的药物组合物，以及包含上述抗体或其它拮抗剂的药物组合物。

根据本发明，分离得到一种新的蛋白，RAP。RAP能够与RIP结合或相互作用，所以是RIP胞内活性的调节剂或介质。RIP参与调节或介导胞内信号传送通路，例如与细胞毒性或细胞死亡相关的通路，RIP在其中靠其自身或与许多其它细胞死亡相关蛋白直接或间接结合而具有细胞毒性，所述的细胞死亡相关蛋白例如MORT-1、TRADD、MACH、Mch4、G1、p55-R和FAS-R，RIP能够通过自身的和所有这些蛋白中的‘死亡域’基序/组件与它们缔合或结合；另一条胞内路径是炎症、细胞存活路径，RIP在其中具有激活作用，这直接或间接是由于RIP内存在着激酶基序或结构域以及RIP结合Traf2的能力，Traf2能够结合NIK，NIK则直接参与激活NK-κB，NK-κB在炎症和细胞存活中起着中心作用。而且，p55-R和TRADD也能够与Traf2相互作用，也参与NK-κB活化，所以也参与细胞存活路径，因此，RIP因能够与p55-R、FAS-R和TRADD(还有Traf2)结合或相互反应，可能还参与调节由这些蛋白引起的炎症和细胞存活激活作用。所以，RIP是这些通路的调节剂或介质，同样，本发明的新RAP通过结合RIP也是这些胞内通路的调节剂或介质。

用酵母双杂交系统分离和克隆了RAP，并进行了测序和特征分析，并如下文对其详细说明的那样，RAP似乎是高特异性RIP结合蛋白，所以也是特异性RIP调节剂/介质。RAP不结合TRADD、MORT-1、p55-R、p75-R和MACH。而且，RAP似乎不具有特征性死亡域组件或基序，这与RAP自身不能诱导细胞毒性的发现一致。

在本发明全文中，RIP活性意指包括它在炎症和细胞死亡/存活通路中的调节/介导活性，以及它在调节/介导细胞存活通路中的活性。在前文、下文和此处提至的出版文献和专利中都提到了这些活性，文献和专利中的全部内容被本发明纳为参考。同样，RAP活性意指包括它通过特异性结合RIP对RIP活性的调节/介导，这种RAP对RIP的调节/介导包括对RIP直接或间接参与的炎症、细胞死亡和细胞存活路径的调节/介导，RAP因此可被认为是所有上述蛋白和可能还有的许多其它蛋白的间接调节剂/介质，这些蛋白都参与炎症、细胞死亡或细胞存活，并且，RIP以直接或间接方式与它们结合或相互作用。

所以，根据本发明，提供了一种新的称为RAP的蛋白。如前所述，RAP经双杂交筛选试验被分离和克隆，并经特征鉴定是一种结合RIP的分子。RAP测序显示RAP是一种新的蛋白，因为RAP序列与各种数据库(例如Genebank‘dbest’和人类基因组数据库1级Database)中序列之间的比较，显示RAP序列与各种已知序列之间没有明显的同源性。实际上，发现了两段仅在5’非编码区有差异的DNA序列，这可能是来自同一基因但经不同剪接造成的。

仍然有待解释的是RAP如何与RIP结合，具体地说，这需要确定RAP和RIP之间的同源性或结合区域，是这些区域令它们能够彼此结合。RAP显然没有死亡域组件，也没有任何其它已知的酶活性或其它活性区域(例如激酶或蛋白酶结构域)。

因此，如前文和后文所述，RAP显然是一种特异性RIP结合蛋白，因而是RIP胞内活性的调节剂/介质。

所以，RAP的作用在于调节/介导RIP直接或间接参与的炎症、细胞存活和/或细胞死亡活动，尤其是与各种刺激所引起或诱导的细胞毒性和炎症相关的那些活动，各种刺激包括通过TNF/NGF受体家族的受体和可能的其它受体所传递的那些刺激。(例如，Malinin等，1997的图1中显示了RIP参与了这些胞内事件，因而RAP也参与了这些事件。)

RAP还可以作为其它蛋白(例如RIP和与RIP结合的蛋白)复合物的一部分而成为细胞毒性和炎症的抑制剂，并且因而能够影响这些其它蛋白(例如p55-R、FAS-R、MACH、Mch4、G1和MORT-1)的细胞毒性或促炎作用，最终抑制它们的细胞毒性和在炎症中的活性。

RAP还可以起细胞毒性和炎症的增强剂或强化剂作用，通过强化其它蛋白(例如上述RIP和结合RIP的其它蛋白)的活性，协助RIP重新聚集这些蛋白，这种重新聚集强化了各种蛋白的细胞毒性或它们的促炎作用。

同样，以类似的方式，RAP还起着上述细胞存活通路的抑制剂或增强剂作用，因为RIP参与了这一通路。

所以，本发明提供的DNA序列编码了RIP结合蛋白(RAP)、其同种型、同系物或片段，它们能够结合RIP，并能够调节或介导RIP的胞内活性，所述的胞内活性即调节/介导炎症和/或细胞死亡和/或细胞存活。

具体地说，本发明提供了选自以下物质的DNA序列：

(a)衍生自天然RAP蛋白编码区的cDNA序列；

(b)在中度严谨条件下能够与序列(a)杂交，并编码生物活性RAP蛋白的DAN序列；和

(c)(a)和(b)中的DNA序列基因密码形成简并，且编码生物活性的RAP蛋白的DNA序列。

本发明上述DNA序列的另一具体实施例是包含至少一种RAP蛋白同种型编码序列至少一部分的DNA序列。上述DNA序列的另一实施例是编码图1所示RAP蛋白的DNA序列。另一实施例是图2所示的DNA序列。

本发明提供由本发明上述序列中任意一条DNA编码的RAP蛋白、其同系物、片段或衍生物，所述的蛋白、其同系物、片段和衍生物能够结合RIP，并能够调节/介导后者在细胞死亡和/或细胞存活胞内通路中的生物活性。

本发明的具体实施例之一是RAP蛋白、其同系物、片段和衍生物。由图1和图2DNA序列推导的RAP蛋白序列显示在图3中。另一实施例是RAP蛋白的同种型，其同系物、片段和衍生物。

本发明还提供编码上述RAP蛋白及其同系物、片段或衍生物的载体，它们含有本发明上述的DNA序列，这些载体能够在合适的真核或原核宿主细胞内表达；还提供包含所述载体的转化真核或原核宿主细胞；以及生产本发明RAP蛋白、或其同系物、片段或衍生物的方法，即在一定条件下培育转化的宿主细胞(该条件适于所述蛋白、同系物、片段或衍生物的表达)，进行获得所述蛋白所必需的对该蛋白的翻译后修饰，从所述转化细胞的培养基或从所述转化细胞的细胞提取物中提取表达产生的蛋白、同系物、片段或衍生物。上述定义包括RAP蛋白的所有同种型。

另一方面，本发明还提供针对本发明RAP蛋白、其同系物、片段和衍生物的抗体或抗体的活性衍生物或片段。

本发明还有一个方面是提供上述DNA序列或其所编码蛋白质的各种用途，根据本发明，这些用途包括：

(i)对由RIP蛋白调节或介导的胞内炎症、细胞死亡和/或细胞存活通路进行调节的方法，包括：用一种或多种能够结合RIP的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物处理所述细胞，其中所述的处理包括在所述细胞内以适合胞内引导的形式引入一种或多种蛋白质、其同种型、同系物、片段或衍生物，或者在所述细胞内引入编码所述的一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的DNA序列，所述的序列携带在合适的载体内，所述的载体能够将所述序列插入所述细胞内使得所述序列在细胞内被表达。

(ii)根据(i)所述，对TNF家族的配体通过RIP蛋白的作用而介导炎症、细胞死亡和/或细胞存活通路对细胞产生效应进行调节的方法，其中，细胞的处理包括在所述细胞内以适合胞内引导的形式引入所述的RAP蛋白、或其同种型、同系物、片段或衍生物，或者在所述细胞内引入编码所述G1蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的DNA序列，所述的序列携带在合适的载体内，所述的载体能够将所述序列插入所述细胞内使得所述序列在细胞内被表达。

(iii)如以上(ii)所述的方法，其中所述细胞的所述处理是用重组动物病毒载体转染所述细胞，包括的步骤有：

(a)构建重组动物病毒载体，此载体带有编码病毒表面蛋白(配体)的序列，所述的表面蛋白能够结合携带FAS-R或p55-R细胞表面上的特定细胞表面受体，此载体还带有第二段序列，它编码选自RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的蛋白质，当在所述细胞内表达时此蛋白质能够调节/介导胞内的炎症、细胞死亡和/或细胞存活通路；

(b)用(a)所述的载体转染所述细胞。

(iv)对TNF家族的配体通过RIP蛋白的作用而介导的炎症、细胞死亡和/或细胞存活通路对细胞效应进行调节的方法，包括用本发明的抗体或其活性片段或衍生物处理所述细胞，所述的处理即对所述细胞使用含有所述抗体或其活性片段或衍生物的合适的组合物，当至少有部分RAP蛋白暴露在胞外表面时，则将所述组合物配制成胞外使用的，而当所述的RAP蛋白都为细胞内时，则将组合物配制成胞内使用的。

(v)调节TNF家族的配体通过RIP蛋白的作用而介导的胞内细炎症亡和/或细胞存活通路对细胞产生效应进行调节的方法，包括用编码至少部分本发明RAP蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列处理所述细胞，所述的寡核苷酸序列能够阻断种RAP蛋白的表达。

(vi)如(ii)所述的方法，用于处理肿瘤细胞或HIV感染细胞或其它患病细胞，包括：

(a)构建带有病毒表面蛋白编码序列的重组动物病毒载体，该表面蛋白能够结合特定的肿瘤细胞表面受体或HIV感染细胞的表面受体或其它患病细胞携带的受体，此载体还带有另一段编码蛋白的序列，该蛋白选自本发明的RAP蛋白、其同系物、片段和衍生物，当这段序列在上述肿瘤细胞、HIV感染细胞、或其它患病细胞内表达时，表达的蛋白能够通过RIP蛋白的作用杀死所述的细胞；

(b)用(a)所述的载体转染所述的肿瘤细胞或HIV感染细胞或其它患病细胞。

(vii)对TNF家族的配体通过RIP蛋白的作用而介导的细胞死亡和/或细胞存活通路对细胞产生效应进行调节的方法，包括使用核酶，其中载体编码一段核酶序列，该序列能够与编码本发明RAP蛋白的细胞mRNA序列相互反应，将该载体以允许核酶序列在所述细胞内表达的形式引入所述细胞，当所述核酶序列在细胞内表达时，它与细胞mRNA序列相互反应，并将其切断，从而抑制RAP蛋白在细胞内的表达。

(viii)从上述本发明方法中选出的一种方法，其中所述的RAP蛋白编码序列包含能够结合RIP的本发明的RAP同种型、同系物、片段或衍生物的至少一种。

(ix)分离和纯化本发明的能够结合RIP蛋白的蛋白的方法，此方法包括使用酵母双杂交程序，其中，编码RIP蛋白的序列由一杂交载体携带，来自cDNA文库或基因组DNA文库的另一序列由第二载体携带，然后用这两种载体转化酵母宿主细胞，分离出阳性转化细胞，然后提取第二杂交载体获得结合RIP蛋白的蛋白的编码序列。

(x)上述(i)-(ix)方法中的任何一种，其中所述的RAP蛋白是RAP的同种型、同系物、片段或衍生物的任何一种。

(xi)上述(i)-(x)方法中的任何一种，其中的RAP蛋白或其同种型、同系物、片段或衍生物的任何一种参与调节以下的细胞效应，即由所述的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物能够直接或间接结合的任何其它介质或诱导剂所介导或调节的细胞效应。

本发明还提供用于调节炎症、细胞死亡和/或细胞存活通路的药物组合物，此通路由TNF家族通过RIP蛋白的作用介导了对细胞的效应，或者通过前文所述的其它介质或诱导剂的作用介导了对细胞的效应，所述的组合物包含以下物质之一作为活性成份：

(i)本发明的RAP蛋白，其生物活性片段、同系物、衍生物混合物；

(ii)重组动物病毒载体，它编码能够结合细胞表面受体的蛋白，并编码本发明的RAP蛋白或其生物活性片段或同系物；

(iii)编码本发明RAP蛋白的反义序列的寡核苷酸序列，其中所述的寡核苷酸可以是上述重组动物病毒载体(ii)中的第二序列。

本发明还提供：

I.调节炎症、胞内细胞死亡和/或细胞存活通路的方法，所述通路由RIP蛋白、或其它介质或诱导剂、或其它NF-κB诱导剂或抑制剂来调节/介导对细胞的效应，此方法包括：根据方法(i)-(x)中任何一种，用RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物、或用编码RAP蛋白、其同种型、同系物或片段的序列处理所述细胞，这种处理加强或抑制了RIP介导的效应，由此也加强或抑制了FAS-R或p55-R介导的效应、或加强或抑制了所述的其它介质或诱导剂、或其它NF-κB诱导剂或抑制剂的作用。

II.如上所述的方法，其中的RAP蛋白、其同系物、片段或衍生物是RAP蛋白的一部分，RAP蛋白特异性结合RIP或其它介质或诱导剂、或其它NF-κB诱导剂或抑制剂，或者所述的RAP蛋白的DNA序列编码上述RAP蛋白的部分，该部分涉及特异性结合RIP、或其它介质或诱导剂、或其它NF-κB诱导剂或抑制剂。

III.如上所述的方法，其中的RAP蛋白是任意一种RAP同种型，这种同种型能够加强与RIP有关的效应。

IV.如上所述的方法，其中的RAP蛋白是任意一种RAP同种型，这种同种型能够抑制RIP、或其它介质或诱导剂对细胞的效应，由此也抑制FAS-R或p55-R、或其它细胞毒性中体质诱导剂对细胞的效应。

V.如上所述的方法，其中的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物能够加强或抑制RIP对炎症和细胞存活通路的效应，它是通过直接或间接抑制NF-κB，或直接或间接激活JNK或p38激酶实现的。

可以用分离和鉴定蛋白质的各种标准筛选技术来分离、鉴定和特征分析RAP蛋白，例如酵母双杂交法、亲和层析法和各种用于此类目的的其它熟知的标准方法。

以下对本发明的详细说明还包括了本发明的其它内容和实施方式。

需要指出的是，在本说明书全文中所用的以下术语，“调节/介导RIP、或FAS-配体或TNF对细胞的作用”或其它任何“调节/介导”都应该理解成包括体外和体内的处理，而且，包括抑制或加强。

附图说明

图1是RAP的核苷酸序列；

图2是RAP的推定氨基酸序列。

本发明的详细说明

本发明内容之一涉及新的RAP蛋白，该蛋白能够结合RIP蛋白，由此介导或调节RIP的胞内活性，尤其是RIP所参与调节或介导的炎症、细胞死亡和/或细胞存活通路。所以，RAP可以抑制RIP在细胞死亡/炎症存活路径中的活性，RAP可以加强RIP在炎症或细胞存活路径中的活性，或者它能够加强RIP在以上路径之一中的活性而抑制在另一路径中的活性。

更具体地说，本发明提供了一种新的蛋白质RAP。已经对RAP进行了测序和特征分析，发现RAP是一种高特异性RIP结合蛋白，但是不结合已知参与导致炎症、细胞死亡或细胞存活的胞内信号传送通路的许多蛋白。而且，RAP显然没有这两种通路中活性蛋白所共有的结构域，即RAP没有‘死亡域’基序或组件，它没有激酶基序或结构域，也没有蛋白酶结构域或基序。根据与许多数据库包括Genebank、1级人类基因组和‘dbest’数据库中序列的比较，测得的RAP序列是一段独特序列，如前文所详述(同时参考提及的各种公开文献和专利申请)，RIP参与胞内的炎症、细胞死亡和细胞存活通路。所以，当这些通路被TNF或Fas配体与各自受体(TNF结合的是p55-R)的结合所引发时，调节或控制RIP的活性就能够调节两条通路或其中之一。在确定哪条通路被更大程度激活方面，RIP起着关键作用，这是因为它能够结合多种具有死亡域的细胞毒性蛋白和许多具有激酶活性的蛋白。所以，能够特异性结合RIP的蛋白(例如本发明的RAP蛋白)在调节RIP活性中起着重要作用，并由此调节对两条通路的相对诱导程度。因此，本发明的RAP蛋白代表了一类重要的胞内信号调节剂或介质。

因为FAS-R和TNF受体独有的导致细胞死亡的能力，以及TNF受体引发各种其它组织损伤活动的能力，这些受体功能的异常可能对生物体特别有害。实际上已经证明，这些受体的功能亢进和缺陷造成了各种疾病的病理表现。鉴定参与这些受体信号传送活动的分子、并找出调节这些分子功能的方法为这些疾病新的治疗方法提供了潜在的思路。据推测，RIP在FAS-R和p55-R毒性中起着重要作用，并因此推测，RAP通过调节RIP对FAS-R和TNF起着重要的调节作用，看来尤其重要的是设计出能够阻断RIP细胞毒性的药物，它们在RAP加强RIP介导的细胞毒性的情况下，可以通过阻断RAP与RIP的结合、或者抑制RAP和RIP之间的相互作用来获得疗效(如前所述，RIP的细胞毒性可以来自其本身，也可以是通过与其它具有死亡域的蛋白质结合所致)。

同样，已知(参见前文)FAS-R和p55-R参与NF-κB的活化，进而参与细胞存活。所以，当需要杀死细胞，例如癌细胞、HIV感染细胞等时，就需要加强FAS-R和p55-R(及其结合蛋白，例如MORT-1、MACH、Mch4、G1和TRADD)的细胞毒性，同时抑制它们诱导NF-κB的能力。因此，当RAP与RIP的相互作用或结合导致加强了RIP可能具有的增强NF-κB诱导的作用(可能是通过Traf2或者可能通过RIP的激酶结构域和/或中间结构域)时，就需要阻断RAP与RIP之间的相互作用来抑制、或者至少阻碍对NF-κB活化的增强，由此将TNF或FAS配体诱导的效应之平衡向细胞毒性方向移动，最终提高细胞死亡率。

同样，当与上述情况相反时，即RAP与RIP的结合实际上抑制了FAS-R和p55-R的炎症或细胞毒性作用而且需要阻断制这种细胞毒性作用(例如炎症、各种自身免疫病等)并寻求增加细胞存活时，那么重要的是设计出药物来加强RAP与RIP之间的相互作用，进而加强对细胞死亡的全面抑制，并将平衡向细胞存活方向转移。根据前文还可以看出，如果RAP与RIP的相互作用抑制了RIP增强NF-κB活化的功能，那么当需要细胞存活时，则必需阻断RAP与RIP之间的相互作用来加强RIP增强NF-κB活化的能力。

由此可见，RIP在诱导或介导炎症、细胞死亡或细胞存活通路的平衡中具有关键作用，所以，RAP作为RIP的调节剂也具有同等重要的作用。如本文所述，用各种药物或处理方法来影响RAP-RIP相互作用/结合，将可能令胞内的信号传送通路由细胞死亡向细胞存活转移，或者如果需要，反过来也是如此。

本发明还涉及编码RAP蛋白的DNA序列，和此DNA序列编码的RAP蛋白。

而且，本发明还涉及编码RAP蛋白的生物活性同系物、片段或衍生物的DNA序列，以及由此DNA编码的同系物、片段和衍生物。这些同系物、片段和衍生物是用标准程序制备的(参见，Sambrook等，1989)，其中，编码RAP蛋白的DNA序列中的一个或多个密码子可能缺失、增加或被其它密码子取代，由此得到至少有一个氨基酸残基与天然蛋白不同的同系物。

以上编码RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的本发明DNA序列中还包括(如本发明实施例)能够与天然RAP蛋白编码区衍生所得cDNA序列杂交的DNA序列，所述的杂交在中度严谨条件下进行，可杂交的DNA序列编码具有生物活性的RAP蛋白。所以，这些可杂交的DNA序列包括与天然RAP cDNA序列具有相对高同源性的DNA序列，因此它们代表了RAP样序列，这类序列可以是(例如)天然衍生的编码各种RAP同种型的序列，或天然存在的编码具有RAP活性的蛋白质的RAP样序列。这些序列还可以包括(例如)非天然存在的、人工合成的序列，它们与天然RAP cDNA序列类似，但是掺入了所需的许多修饰。所以，此类合成序列包括编码RAP的同系物、片段和衍生物(它们都有RAP活性)的所有可能的序列。

为了获取上述各种天然存在的RAP样序列，可以采用标准方法从不同组织中筛选分离天然衍生的DNA或RNA样品，其中使用天然RAP cDNA或其一部分作为探针(参见，Sambrook等，1989中所述的标准程序)。

同样，为了制备编码RAP的同系物、片段或衍生物的上述各种合成的RAP样序列，可以采用许多下文中详述的有关制备此类同系物、片段或衍生物的标准方法。

与RAP蛋白“基本相应”的多肽或蛋白质不仅包括RAP蛋白还包括与RAP同系的多肽和蛋白质。

与RAP蛋白基本相应的同系物是如下多肽，即RAP蛋白氨基酸序列中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代、缺失和/或插入，产生的蛋白质表现出与相对应的RAP蛋白基本上相同或更高的生物活性。

为了与RAP蛋白基本相应，在RAP蛋白序列中的变化，例如同种型中的变化，一般相对很小。虽然变化的数量可以超过10个，但以10个以下为宜，5个以下更好，3个以下最好。虽然任何技术都可以用来寻找与RAP蛋白基本相应的有潜在生物活性的蛋白，此类技术之一是对编码此蛋白质的DNA进行常规诱变，产生新的修饰。然后可以筛选由这些克隆表达的蛋白，选择它们结合RIP的能力，和在调节/介导上述胞内通路中调节RIP活性的能力。

“保守性”改变指，不会改变蛋白质活性并且最早被筛选出来的那些改变，因为这样的改变不显著改变蛋白质的大小、电荷或构型，所以不改变其生物特性。

RAP蛋白的保守性取代包括这样的同系物：其中该多肽的至少一个氨基酸被另一不同的氨基酸保守性取代。这样的取代最好按照表IA进行，为了修饰合成多肽分子的结构或功能特性，同时又保留RAP蛋白特有的生物活性，可以通过常规实验来确定进行何种取代。

             表IA

      原残基                 取代举例

Ala                              Gly；Ser

Arg                              Lys

Asn                              Gln；His

Asp                              Glu

Cys                             Ser

Gln                             Asn

Glu                             Asp

Gly                             Ala；Pro

His                             Asn；Gln

Ile                             Leu；Val

Leu                             Ile；Val

Lys                             Arg；Gln；Glu

Met                             Leu；Tyr；Ile

Phe                             Met；Leu；Tyr

Ser                                  Thr

Thr                                  Ser

Trp                                  Tyr

Tyr                             Trp；Phe

Val                             Ile；Leu

或者，RAP蛋白的另一组取代是：按照下表IB，多肽中的至少一个氨基酸残基被去除，而在该位置插入另一残基。可以在多肽中进行的取代的类型是根据对不同物质的同源蛋白之间氨基酸改变的频率所做的分析，例如Schulz等，G.E.，Principle of Protein Stracture Springer-Verlag，New York，NY，1798中的表1-2；和Creighton，T.E，蛋白质：结构与分子特性中的图3至9，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA 1983。根据这样的分析，其它保守性取代为以下5组每组内的互换：

                    表IB

1.小脂肪族、非极性或轻度极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性带负电的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性带正电的残基：His、Arg、Lys；

4.大脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；

5.大芳香族残基：Phe、Tyr、Trp。

括弧中的三种氨基酸残基在蛋白质的结构中具有特殊的作用。Gly是唯一没有侧链的残基，因此会赋予肽链柔韧性，但倾向于促进形成非α螺旋的二级结构，Pro，因为其特殊的几何特性，会紧紧地约束肽链，通常倾向于促进形成β转角样结构，虽然，有时Cys能够参与二硫键的形成，这对蛋白的折叠十分重要。注意上文的Schulz等将以上1组和2组合并。还要注意的是Tyr，因为它具有形成氢键的潜力，与Ser和Thr等有显著的亲近关系。

如上所述本发明的保守性氨基酸取代是本领域内公知的，在氨基酸取代后预计能够保留多肽的生物特性和结构特性。本发明的大多数缺失和取代对蛋白质或多肽分子的特性不会造成严重的改变。“特性”广义的定义为，例如α螺旋或β折叠之类二级结构的改变，以及例如结合RIP和/或介导RIP对细胞死亡效应之类生物活性的改变。

在蛋白质中产生氨基酸取代，用于获得本发明所用的RAP蛋白质的同系物，包括以下已知的方法步骤：Mark等的美国专利RE33,653，4,959,314，4,588,585和4,737,462；Koths等的5,116,943；Namen等的4,965,195；Chong等的4,879,111；和Lee等的5,017,691，和美国专利4,904,584(Shaw等)中的赖氨酸被取代的蛋白质。

除了上述不明显改变RAP蛋白活性的保守性取代之外，导致RAP蛋白同系物生物活性提高的保守性取代或低保守性取代或更为随机的取代也属于本发明范围之内。

如需要确认取代或缺失的确切效果，本领域技术人员知道，取代、缺失等的效果将由常规的结合试验或细胞死亡试验来评价。用这种标准测试进行的筛检并不涉及过多的实验。

可接受的RAP同系物是：至少保留了结合RIP的能力，由此介导了RIP在上述胞内通路中的活性。用这种方式可以产生具有所谓显性负作用的同系物，即在结合RIP、或这种结合后的后续信号发送或其它活性方面具有缺陷的同系物。例如，可以利用这类同系物与天然RAP竞争与RIP的结合，来抑制RIP的作用，或抑制RIP诱导NF-κB的作用(直接或间接的)，这取决于RAP与RIP相互作用主要调节的是上述活性中的那一种。

在基因水平上，这些同系物通常通过编码RAP蛋白的DNA内的定点诱变来制备，从而产生编码这些同系物的DNA，然后合成这些DNA，并在重组细胞培养物内表达这些多肽。同系物通常表现出与天然蛋白相同的或更好的生物活性，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications and WileyInterscince，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。

可以对编码是先制备的同系物或编码天然RAP蛋白的DNA进行定点诱变来制备本发明的RAP蛋白、或制备编码相同多肽但与天然序列不同(由于已知的密码子简并性在而允许的改变所造成)的核苷酸序列。定点诱变通过使用特定的寡核苷酸序列(编码具有所需突变的DNA序列)以及足够数量的毗邻核苷酸产生同系物来提供引物，该引物序列具有足够的大小和序列复杂度能在待跨越的缺失连接处两侧形成稳定的双螺旋，通常，引物长度20-25个核苷酸为宜，携带有被改变的序列两侧各5至10个互补性核苷酸。总的说来，定点诱变技术是本领域公知的，例如Adelman等，DNA 2：183(1983)所公布的实例，本文将其中的内容纳为参考。

可以理解的是，定点诱变技术一般采用单链或双链形式的噬菌体载体。定点诱变所用的典型载体包括M13噬菌体，例如Messing等，Third ClevelandSymposium on Macromolecules and Reconbinant DNA，A.Walton编辑，Elsevier，Amsterdan(1981)中的内容，本文纳为参考。这些噬菌体可方便地购得，它们的使用是本领域技术人员公知的。或者，可用含有单链噬菌体复制起点的的质粒载体(Veira等，Meth.Enzymol.153：3，1987)来获取单链DNA。

总而言之，进行本发明的定点诱变首先获取包含编码相关多肽的DNA序列的单链载体。利用自动DNA/寡核苷酸合成法来制备带有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后该引物与含有蛋白质序列的单链载体退火结合，并由DNA聚合酶(例如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段)完成突变链的合成。这样，突变序列和第二链就带有了所需的突变。然后用这种异源双螺旋载体来转化合适的细胞例如大肠杆菌JM101细胞，选出包含重组载体(此载体带有突变序列)的克隆。

挑出这样的克隆后，可以取出突变的RAP蛋编码白序列并置于合适的载体内，通常是置于将用于转染合适宿主的转移载体或表达载体内。

所以，利用已知的DNA或RNA扩增技术，例如RCR和寡核苷酸化学合成，可以在体内、原位和/或体外检测、获取和/或修饰编码RAP蛋白的基因或核酸。RCR通过反复的DNA聚合酶反应可以扩增(增加数量)特定的DNA序列。可以用该反应复制克隆，所需的只是对核酸序列的了解。为了进行PCR，要设计与感兴趣序列互补的引物。然后用自动DNA合成法来生成引物。因为可以设计引物与基因的任意部位杂交，所以可以创造条件使互补碱基对之间的错配能够被容忍。这些错配区域的扩增产生了诱变产物，继而产生具有新的性能的肽(即定点诱变)。参见Ausubel，同上，Ch.16。而且，用PCR以逆转录酶合成配对的互补DNA(cDNA)，可以用RNA作为起始物质来合成促乳素受体的胞外结构域，而无需克隆。

而且，可设计PCR引物包含新的限制性位点或其它特性(例如在待扩增基因片段的末端包含终止密码子)。在扩增基因序列的5’端或3’端置入限制性位点可使编码RAP蛋白或其片段的基因段按惯例设计成适合与其它序列连接、或连接到载体的克隆位点内。

PCR和其它扩增RNA和/或DNA的方法是本领域公知的，根据本发明的说明和指导，无需过多的试验即可运用。已知的DNA或RNA的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)及相关的扩增方法(参见Mullis等的美国专利4,683,195,4,683,202，4,800,159，4,965,188；Tabor等的4,795,699和4,921,794；Innis的5,142,033；Wilson等的5,122,464；Innis的5,091,310；Gyllensten等的5,066,584；Gelfand等的4,889,818；Silver等的4,994,370；Biswas的4,766,067；Ringold的4,656,134和Innis等编辑的PCR Protocols：AGuide to Method and Applications)和RNA介导的扩增，此法使用针对靶序列的反义RNA作为合成双链DNA的模板(Malek等的美国专利5,130,238，商品名为NASBA)；和DNA扩增与抗体标记相结合的免疫PCR(Ruzicka等，Science260：487(1993)；Sano等，Science 258：120(1992)；Sano等，Biotechniques9：1378(1991))，以上专利和文献中的内容均被本发明纳为参考。

根据以上就RAP蛋白同系物所述的内容，以类似的方式可以制备生物活性的RAP蛋白片段(例如RAP或其同种型中任意一种)。合适的RAP蛋白片段是：保留RAP的功能，能够调节或介导RIP或与RIP直接或间接结合的其它蛋白的生物活性。所以，象上文就同系物所述，可以制备具有显性负作用或显性正作用的RAP蛋白片段。应当指出的是，这些片段代表了本发明一类特殊的同系物，即，它们被定义为衍生自全长RAP蛋白序列的RAP蛋白的一部分(例如衍生自RAP或其同种型中的任意一种)，每个这样的部分或片段都具有上述所需的活性。例如，这样的片段可以是肽。

同样，如同本领域公知的那样，采用各种标准方法修饰RAP蛋白、其同系物或片段中一个或多个氨基酸残基的侧链基团，或者将RAP蛋白、其同系物或片段与另一个分子(例如抗体、酶、受体等)交联来制备衍生物。所以，本发明的“衍生物”包括采用本领域已知技术从残基侧链的功能基团或N末端或C末端基团制备的衍生物。所述的衍生物可以具有碳水化合物或磷酸酯残基之类化学部分，只要这些组分具有与RAP蛋白相同的或更高的生物活性。

例如，衍生物包括羧基的脂族酯，羧基与氨，或与伯胺或仲胺反应形成的酰胺，氨基酸残基的游离氨基与酰基(例如链烷醇基或环芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离羧基(例如丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基)与酰基形成的O-酰基衍生物。

术语“衍生物”只包括没有一个氨基酸改变成20个常见的天然氨基酸中另一个的那些衍生物。

RAP是一种蛋白质或多肽，即氨基酸残基组成的序列。包含RAP蛋白完整序列的较长序列的多肽，根据本发明的定义，也包括在所述多肽的范围之内，只要增加的序列不影响本发明的基本特性和新特性，即，条件是它们保留或提高了RAP蛋白的生物活性，或者可以经剪切释放出具有RAP蛋白生物活性的蛋白质或多肽。所以，本发明包括(例如)RAP蛋白与其它氨基酸或肽的融合蛋白。

新的RAP蛋白、其同系物、片段和衍生物具有许多可能的用途，例如：

(i)RAP蛋白、其同系物、片段和衍生物可以用来调节RIP在炎症、细胞死亡或细胞存活通路中的功能。例如，如果RAP能够调节RIP活化NF-κB、JNK(June激酶)或p38激酶的作用，RAP的这两种作用都加强RAP-RIP作用，正如在抗肿瘤、抗炎或促炎、抗HIV应用中所希望的那样。此时，调节炎症、加强细胞毒效应或阻断细胞存活效应的RAP蛋白、其同系物、片段或衍生物可以通过已知的标准方法引入细胞。例如，当RAP蛋白完全在细胞内(根据推测)，而且只应引入需要RIP介导的FAS-R配体或TNF或其它细胞毒性蛋白的作用的细胞内时，必须要有将这种蛋白特异性引入细胞的一种系统。这样做的一个方法是创建一种重组动物病毒，例如重组牛痘病毒，在此病毒DNA中将引入以下两段基因：编码配体的基因，该配体能与该细胞特异性表达的细胞表面蛋白结合，例如特异性结合某些细胞(CD4淋巴细胞及相关白血病细胞)的艾滋(HIV)病毒gp120蛋白，或者特异性结合携带FAS-R或p55-R的细胞的其它配体，使得重组病毒载体能够结合这类携带FAS-R或p55-R的细胞；以及编码RAP蛋白的基因。这样，细胞表面结合蛋白在病毒表面的表达，将病毒特异性地导向肿瘤细胞或其它带有FAS-R或p55-R的细胞，RAP蛋白编码序列然后通过病毒被引入细胞，它们在细胞内一旦表达将导致加强RIP对FAS-R配体或TNF作用的介导或RIP独自的作用。这种重组动物病毒是利用标准技术构建的(参见Sambrook等，1989)。另一种可能性是引入能被细胞吸收并表达的寡核苷酸形式的RAP蛋白编码序列。

(ii)它们可以用来抑制RIP介导的FAS-R配体或TNF或有关蛋白的作用，或抑制RIP独自的作用，例如在诸如败血性休克中的组织损伤，移植物抗宿主排斥反应或急性肝炎情况下，需要阻断FAS-R配体或TNF诱导的FAS-R或p55-R胞内信号传送或RIP的独自作用，或其它蛋白介导的信号传送，同时需要增强细胞存活通路。在这种情况下，可以(例如)用标准方法在细胞内引入具有RAP蛋白反义编码序列的寡核苷酸，这样的寡核苷酸能够有效阻断编码RAP蛋白的mRNA的翻译，由此阻断蛋白的表达，抑制FAS-R配体或TNF或RIP或其它蛋白的作用。这样的寡核苷酸可以用上述重组病毒方法引入细胞，该寡核苷酸序列是病毒携带的第二序列。

同样，如前所述，根据RAP-RIP相互作用的特点，在需要时可以通过以上(i)和(ii)来加强或抑制细胞炎症和存活通路。

还可以用RAP蛋白的特异性抗体来抑制其胞内信号传送活动。

抑制RIP介导的作用或RIP独自的作用的另一种方法是利用最近开发的核酶方法。核酶是特异性切割RNA的催化性RNA分子。核酶经基因工程改造来切割选定的RNA，例如编码本发明RAP蛋白的mRNA。这样的核酶具有针对RAP蛋白mRNA的特定序列，并能够与之反应(互补结合)，然后切割该mRNA，结果降低(或者完全丧失)RAP蛋白的表达，表达的降低程度取决于靶细胞内核酶的表达程度。为了将核酶引入选定的细胞(例如带有FAS-R或p55-R的细胞)，可以使用常用于此目的的合适的载体，例如质粒、动物病毒(逆转录病毒)载体(参见上文(i)，其中的病毒具有第二序列，即编码编码选定核酶的cDNA)。(有关核酶的方法的综述可参见Chen等，1992；Zhao和Pick，1993；Shore等，1993；Joseph& Burke，1993；Shimayana等，1993；Cantor等，1993；Barinaga，1993；Crisell等，1993；Koizumi等，1993)。这种方法适合于以下情况：当RAP-RIP相互作用加强了细胞毒性，但是需要阻断这种毒性时，或者当RAP-RIP相互作用抑制了NF-κB活化但需要阻断这种抑制来加强NF-κB活化时，即上文(ii)中都需要加强细胞存活的两种情况。

(iii)RAP蛋白、其类似物或衍生物还可用来分离、鉴定和克隆参与胞内信号传送过程的同类其它蛋白，即结合RIP或结合其功能相关受体或蛋白的那些蛋白。在上述应用中可以使用酵母双杂交系统，或者使用最近开发的先用非严谨性Southern杂交后接RCR克隆的系统(Wilks等，1989)。Wilks等出版物描述了两种推定的蛋白质-酪氨酸激酶的鉴定和克隆，其中根据已知的激酶基序的序列(设想的激酶序列)采用非严谨性Southern杂交，然后进行PCR克隆。在本发明中，上述方法可以结合使用RAP蛋白的序列来鉴定和克隆那些相关的RIP结合蛋白。

(iv)使用本发明RAP、蛋白或其同系物、片段或衍生物的另一种方法是将它们用于亲和性层析来分离和鉴定能够与之结合的其它蛋白或因子，例如参与胞内信号传送过程的蛋白或因子。在这种应用中，本发明的RAP蛋白、其同系物、片段或衍生物可以分别与亲和性层析基质连接，然后与细胞提取物或与怀疑参与胞内信号传送过程的蛋白或因子接触。进行亲和性层析之后，可以对结合RAP蛋白、或其同系物、片段或衍生物的蛋白或因子进行洗脱、分离和特征分析。

(v)如前所述，本发明的RAP蛋白、或其同系物、片段或衍生物还可以用作免疫原(抗原)来产生它们的特异性抗体。这些抗体又可以用于从产生RAP蛋白的细胞提取物或转化细胞系中纯化RAP蛋白(例如RAP或其同种型)。而且，这些抗体还可以用于诊断，鉴定与RIP介导的FAS-R配体或TNF系统功能异常有关的疾病，或与RIP的独自作用有关的疾病，例如RIP介导的FAS-R配体或TNF诱导的细胞效应亢进或低下或RIP本身造成的细胞效应。所以，如果疾病与涉及RIP蛋白、或上述各种其它RIP结合蛋白或RAP蛋白本身的胞内信号传送系统错乱有关，上述抗体就可以作为重要的诊断工具。

应当指出的是，本发明RAP蛋白的分离、鉴定和特征分析可以利用各种已知的标准筛选方法来进行。例如，其中之一是后文所述的酵母双杂交法，它被用来鉴定RIP蛋白(参见Stanger等，1995)，因而也就能够鉴定本发明的各种RAP蛋白(还包括本说明书提到的共同拥有和待审专利申请中的其它各种新蛋白)。同样，如上下文所述，还可用其它方法来分离、鉴定和特征分析本发明的RAP蛋白，或分离、鉴定和特征分析能够结合本发明RAP蛋白的其它蛋白、因子和受体等，这些方法例如亲和性层析、DNA杂交等，都是本领域公知的。

如前所述，RAP蛋白可用来产生针对RAP蛋白(即RAP及其同种型)的特异性抗体。这些抗体或其片段如后文详细说明的那样来使用，可以理解的是，在这类应用中，抗体或其片段是特异性针对RAP蛋白的。

RAP特异性结合RIP，所以是RIP的介质或调节剂，因而能通过RIP本身的功能或与其它蛋白(例如在细胞死亡通路中的FAS-R、p55-R、MORT-1、MACH、Mch4、G1和TRADD，或是与细胞存活通路中的Traf2)结合方式介导/调节炎症、细胞死亡或细胞存活通路中的RIP活性，重要的是，按照需要并且根据RAP-RIP相互作用所要增强/抑制的上述通路中那一条通路，设计出能增强或抑制RAP-RIP相互作用的药物。有许多这类药物可以给予极大帮助的疾病中，造成急性肝脏损伤的急性肝炎似乎反映了FAS-R配体介导的肝细胞死亡；自身免疫诱导的细胞死亡例如导致糖尿病的胰岛βLangerhans细胞死亡；移植(例如肾、心和肝的移植)排斥中的细胞死亡；AIDS诱导的T细胞自杀而致AIDS病毒增殖，因此患AIDS病。

可能，RAP或其一种或多种可能存在的同种型可以在一条或多条上述路径中作为RIP的“天然”抑制剂起作用，所以，它们可以用作前述RIP的特异性抑制剂。同样，也可以筛选(例如)肽、有机化合物、抗体等其它物质来获取能够抑制RAP-RIP相互作用的特殊药物。

如何设计和筛选RAP-RIP相互作用的肽抑制剂的非限定性实施例是根据以往对ICE或ICE样蛋白酶的肽抑制剂、ICE的底物特异性和利用肽合成的表位分析方法所获得的研究结果。据发现，用ICE有效剪切肽的最基本要求涉及4个氨基酸，它们位于剪切位点的左侧，对于P1位是天冬氨酸且P1位右侧有足够甲胺的情况具有强烈的偏好性(Sleath等，1990；Howard等，1991；Thornberry等，1992)。而且发现，产荧光底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆素-7-酰胺)，缩写为Ac-DEVD-AMC，对应于聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)中的一段序列，在细胞内在FAS-R刺激以及其它凋亡过程后很快被剪切(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)，而且是被CPP32蛋白酶(CED3/ICE蛋白酶家族的成员之一)和MACH蛋白酶有效剪切(还可能被G1蛋白酶剪切-参见共同拥有待批的专利申请IL120367)。

因为底物肽P1位置处的Asp看来很重要，所以可以迅速筛选得到结合所用蛋白酶上活性位点的、以Asp为第四氨基酸残基和以各种氨基酸组合为前三个残基的四肽，筛选方法可用例如Geysen的方法(Geysen，1985；Geysen等，1987)，该方法在固相载体上对大量的肽筛选其与抗体的特异性作用。MACH蛋白酶与特定肽的结合可用多种本领域技术人员公知方法测定，例如G1蛋白酶放射性标记法等。Geysen的方法每天至少能够测定4000条肽。

用类似的方法可以阐明决定RAP与RIP之间相互作用的确切结合区或同源区，然后可以筛选能够阻断这种相互作用的肽，例如序列与结合区相似或与之互补的合成肽，它们可以与天然RAP竞争结合RIP。

可以将药物或肽抑制剂(它们即能够通过抑制RAP-RIP相互作用来抑制RAP的炎症或细胞死亡活性)与促进其进入细胞的其它分子偶联或复合。

美国专利5,149,782公开了将有待跨膜转运的分子与某种膜混合剂(membraneblending agent例如融合多肽、离子通道形成性多肽、其它膜多肽和豆蔻酸、棕榈酸之类长链脂肪酸)偶联的技术。这类膜混合剂将分子偶联物插入细胞膜的脂质双层，并促进它们进入细胞质。

Low等的美国专利5,108,921概括了利用受体介导的胞吞机制来跨膜递送蛋白质和核酸等分子的现有方法。这类受体系统包括识别半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸酯、运铁蛋白、脱唾液酸蛋白、钴胺传递蛋白(维生素B₁₂)、α-2巨球蛋白、胰岛素和表皮生长因子(EGF)之类的其它肽生长因子。Low等讲述了营养素受体(诸如生物素和叶酸的受体)的优点在于：因为生物素和叶酸的受体位于大多数细胞的表面而且数量很多，并且结合后的受体能介导跨膜转运过程，所以可以用来加强跨膜转运。因此，将有待向细胞质内传递的化合物与诸如生物素或叶酸的配体形成复合物，使该复合物与携有生物素或叶酸受体的细胞膜接触，由此引发受体介导的跨膜转运机制，从而允许所需化合物进入细胞。

此外，本领域已知将所需的肽序列与一前导/信号肽序列融合成“嵌合”肽，将可使得这样的“嵌合”肽能够穿越细胞膜进入细胞质。

对于肽领域技术人员可以理解的是，本发明RAP-RIP相互作用的抑制剂意欲包括拟肽(peptidomimetic)类药物或抑制剂，可视其结合RAP/RIP蛋白酶的能力对它们作快速筛选，由此设计可能更稳定的抑制剂。

可以理解的还有：上述促进或加强肽抑制剂跨细胞膜转运的方法也同样适用于RAP或其同种型本身以及在细胞内起作用的其它肽和蛋白质。

就本说明书中的抗体而言，术语“抗体”指包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、抗体的抗独特型抗体(抗Id)，它们都能够以可溶或结合形式加以标记，还包括利用已知技术(例如酶切、肽合成或重组法等)得到的它们的片段。

多克隆抗体是用抗原免疫动物后从其血清得到的异源抗体分子群。单克隆抗体则含对抗原特异的基本同源的抗体群，这群抗体含有基本相同的表位结合位点。mAb可以利用本领域技术人员已知的方法获得。参见例如Kohler & Milstein，Nature，256：495-497(1975)；美国专利4,376,110；Ausubel等编辑，Harlow & Lane的ANTIBODIES：A LABORATORY MANNUAL，Cold Spring HarborLaboratory(1988)；和Colligan等编辑的Current Protocols in Immunology，GreenPublishing Assoc. & Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，以上均被本文纳为参考。这类抗体可以是各类免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它们的各种亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。体内或原位生产mAb的效价高使得它成为目前被优选的生产方法。

嵌合抗体是由来自不同动物种属的不同部分构成的分子，例如具有小鼠mAb可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。嵌合抗体主要用来降低应用时的免疫原性和提高产量，例如，鼠mAb杂交瘤的产量较高但用于人体时免疫原性较高，故采用人/鼠嵌合mAb。嵌合抗体及其制备方法是本领域已知的(Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-3277(1884)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984)；Boulianne等，Nature 321：643-646(1984)；Cabilly等，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Neuberger等，Nature 314：268-270(1985)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(1986年3月5日公开)；Neuberger等，PCT申请WO8601533(1986年3月13日公开)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日)；Sahagan等，J.Immunol.137：1066-1074(1986)；Robinson等，国际专利申请WO8702671(1987年5月7日公开)；Liu等，Proc.Natl.Acad.SciUSA 84：3439-3443(1987)；Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：214-218(1987)；Better等，Science 240：1041-1043(1988)；和Harlow & Lane，ANTIBODIES：ALABORATORY MANNAL)。以上内容均被本发明纳为参考。

抗独特型(抗Id)抗体是识别抗体上与抗原结合位点有关的独特决定簇的抗体。Id抗体可以通过免疫同种同基因型的动物(例如小鼠)来制备，该动物即mAb的来源，欲制备的抗Id即针对该mAb。被免疫的动物将识别免疫用抗体的独特决定簇并对其产生应答，即产生针对这些独特决定簇的抗体(抗Id抗体)。参见美国专利4,699,880，本发明将其纳为参考。

抗Id抗体还可以用作“免疫原”在另一动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗Id抗体的表位与诱导抗Id的mAb是相同的。这样，利用针对mAb独特决定簇的抗体就能够鉴定出表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。

所以，本发明中针对RAP蛋白、其同系物、片段或衍生物产生的mAb可用于在合适的动物(例如BALB/c小鼠中)诱导产生抗Id抗体。可以用免疫小鼠的脾细胞来生产分泌抗Id mAb的抗Id杂交瘤。而且，可将抗Id mAb与钥孔血蓝蛋白(KLH)之类载体偶联，用于免疫其它BALB/c小鼠。这些小鼠的血清中将含有抗-抗Id抗体，它们具有原来mAb针对上述RAP蛋白、或其同系物、片段和衍生物的结合特异性。

抗Id mAb因而具有自己的独特表位或称“独特型”，其结构上与被评价的表位例如GRB蛋白-a类似。

术语“抗体”还包括抗体完整的分子及其片段，例如Fab和F(ab’)2，它们都能够结合抗原。缺失了完整抗体Fc段的Fab和F(ab’)2片段从血液循环系统中被清除的速度更快，与完整抗体相比，其非特异性组织结合较低(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。

可以理解的是，本发明使用的抗体的Fab和F(ab’)2以及其它片段，可以按照本发明就完整抗体分子而采用的方法用于检测和定量RAP蛋白。这类片段一般通过木瓜蛋白酶(用于生产Fab片段)或胃蛋白酶(用于生产F(ab’)2片段)进行蛋白水解剪切而产生。

如果抗体能够与分子特异性反应并使该分子与抗体结合，则称该抗体“能够结合”该分子。术语“表位”指某分子能够被抗体结合并被该抗体识别的部分。表位或“抗原决定簇”通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖的侧链)构成，并具有特殊的三维结构特征和特殊的电荷特征。

“抗原”是能够被抗体结合并能诱导动物产生能够结合该抗原某表位的抗体的分子或分子的一部分。抗原可以具有一个或一个以上表位。前述的特异性反应指：抗原以高度的选择性方式与相应的抗体反应，而不与由其它抗原激发产生的许多其它抗体反应。

本发明所用的抗体(包括其片段)可用来定量或定性检测样品中的RAP蛋白，或检测是否存在表达本发明RAP蛋白的细胞。这可以通过免疫荧光技术来做到，即使用荧光标记的抗体(见下文)以及光学显微镜、流式细胞计数仪或荧光检测器。

本发明所用的抗体或其片段可以用于组织学，例如在免疫荧光或免疫电子显微镜技术中用于原位检测本发明的RAP蛋白。可以如下进行原位检测：获取患者的组织样品，在样品中加入本发明的标记抗体。抗体或其片段的提供最好是将标记抗体施加在或覆盖在生物样品上。通过上述过程，不仅可以检测是否存在RAP蛋白，还可以检测出其在组织内的分布。利用本发明，本领域一般技术人员很容易理解的是：可以对多种组织学方法(例如染色法)加以改进来实现原位检测。

这种检测本发明RAP蛋白的试验通常包括：在带有可测标记的、能够鉴定RAP蛋白的抗体存在下，培养生物样品，例如生物流体、组织提取物、新鲜收获的淋巴细胞或白细胞等细胞、或培育在组织培养物中的细胞，以及用本领域公知的任何一种方法来检测该抗体。

生物样品可用诸如硝酸纤维素之类固相载体处理，或用能够将细胞、细胞颗粒或可溶蛋白固定化的其它固相载体处理。然后用合适的缓冲液洗涤载体再用本发明前文所述的带可测标记的抗体来处理。然后用缓冲液第二次洗涤固相载体，以洗去不结合的抗体。然后就可用常规方法来测定固相载体上结合的标记量。

“固相载体”或“载体”指能够结合抗原或抗体的各种载体。熟悉的载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然或改性纤维素、聚丙烯酰胺、gabbros和磁体。就本发明目的而言，载体可以具有某种程度的可溶性，也可以是不溶性的。载体材料实际上可以具有各种可能的结构构型，只要偶联的分子能够与抗原或抗体结合。所以，载体形状可以是球形(例如珠)、圆柱形(例如试管内表面或短棍的外表面)。或者，可以是平表面，例如薄片、测试条等。较好的载体是聚苯乙烯微珠。本领域技术人员知道用于结合抗体或抗原的其它合适载体，或者将能够通过常规实验来找到这样的载体。

本发明给定的某批抗体的结合活性可以用公知方法来测定。本领域技术人员可通过常规实验来确定各次测定的操作条件和最佳分析条件。

按照常规或根据特殊情况的需要可在试验中加入其它步骤，例如洗涤、搅拌、振荡、过滤等。

对本发明的抗体作可检测标记的方法之一是将抗体与酶连接并用于酶免疫试验(EIA)。当酶与相应的底物接触后会与之反应产生可被测到的化学组份，测定方法例如分光光度法、荧光光度法或目测。可用来标记抗体的酶包括(但不限于)苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-甾体异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可用比色法进行测定，即使用酶的生色底物。也可以通过目测比较来进行，即将底物的酶反应程度与以类似方法制备的标准物作比较。

测定可以用多种其它免疫试验中的任何一种来进行。例如，用放射性标记的抗体或抗体片段可以用放发射免疫试验(RIA)来检测R-RPT酶。有关RIA的详细说明可参见Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，TS等，North Holland Publishing Company，NY(1978)中的Chard.T的“放射性免疫实验及其相关技术的介绍”章节，本发明将其纳为参考。放射性同位素的检测可通过例如γ计数仪或闪烁计数仪或放射性自显影来进行。

还可以用荧光化合物来标记本发明抗体。当荧光标记的抗体接触适当波长的光时，可以通过荧光而测得其存在。最常用的荧光标记化合物有、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、绿脓菌素、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和fluorescamine。

还可以用荧光发射性金属-例如¹⁵²E或其它镧系金属-来标记抗体。可以利用诸如二亚乙基三胺五乙酸(ETPA)的金属螯合基团将这类金属与抗体连接。

还可以将抗体与化学发光化合物偶联来标记抗体。通过检测化学反应过程中产生的发光来测定是否存在带有化学发光标记的抗体。特别有用的化学发光标记化合物例如鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

同样，可以用生物发光化合物来标记本发明的抗体。生物发光剂是存在于生物系统内的一类化学发光剂，在生物系统中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。是否存在生物发光蛋白是通过检测是否有发光现象来测定的。标记用的重要生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母蛋白。

可对本发明的抗体分子加以改进使之适用于免疫试验又称为“双位点”或“夹心”试验。在典型的免疫试验中，一定量的非标记抗体(或抗体片段)与固相载体结合，然后加入一定量的带可测标记的可溶性抗体，检测和/或定量测定固相载体、抗体、抗原和标记抗体形成的四元复合物。

通常较好的免疫试验包括“正向”试验，其中结合在固相载体上的抗体先与待测样品接触，通过形成固相抗体-抗原二元复合物来提取抗原。培育适当时间后，洗去固相载体上残留的液体样品，包括可能存在的未反应的抗原，载体然后与含有未知量的标记抗体(作为“报告分子”)的溶液接触。第二次培育后，标记抗体得以通过非标记抗体与结合在固相载体上的抗原复合，再次洗涤固相载体去除未反应的标记抗体。

在另一类“夹心”试验(同样适用于本发明抗原)中，使用了所谓的“同时”和“反向”试验。同时试验包括一步培育步骤，即将结合在固相载体上的抗体和标记抗体同时加入待测样品。培育完成后，洗去固相载体上残留的液体样品和未复合的标记抗体。然后按照常规“正向”夹心试验中那样测定是否存在与固相载体结合的标记抗体。

“反向”试验中，分步骤先在液体样品中加入标记抗体溶液，然后在培育适当时间后加入与固相载体结合的非标记抗体。第二次培育后，常规洗去固相载体上的残留样品和未反应的标记抗体。然后按照“同时”和“正向”试验中那样检测与固相载体结合的标记抗体。

本发明的RAP蛋白可以用标准重组DNA法来制备(参见Sambrook等，1989和Ansabel等，1987-1995，文献同上)，该方法中用含有此蛋白编码序列的适当真核或原核载体转化本领域熟知的合适的真核或原核宿主细胞。所以，本发明还涉及用于生产本发明蛋白的那些表达载体和转化宿主。如前所述，这些蛋白还包括它们的生物活性同系物、片段和衍生物，所以编码它们的载体还包括编码这些蛋白的同系物和片段的载体，转化宿主还包括生产这些同系物和片段的宿主。由转化宿主生产这些蛋白的衍生物是对这些蛋白质或其它同系物或片段进行标准修饰后产生的衍生物。

本发明还涉及包含编码RAP蛋白的重组动物病毒载体的药物组合物，这些载体还编码能够结合特定的靶细胞(例如癌细胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，以将RAP蛋白的序列插入细胞。而且，本发明的药物组合物以下述物质作为活性成份：(a)编码RAP蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列；或(b)阻断RAP-RIP相互作用的药物。

本发明药物组合物包含用以达到其预期目的的足量活性成份。此外，药物组合物可以包含药学上认可的合适载体，例如赋形剂和辅剂，它们有助于将活性化合物加工成可药用的制剂，并且可使此类制剂稳定以给予需要者，这些都是本领域技术人员所熟知的。

猜测RAP蛋白及其同种型可能在不同的组织中以明显不同的水平和不同的方式表达，这就和涉及上述共同拥有的待审专利申请中所指明的胞内信号传送通路中其它各种蛋白的表达类似。可能是这些差异造成了对Fas/AOP-1配体和TNF应答的组织特异性特征。以其它CED3/ICE同系物为例(Wang等，1994；Alnemri等，1995)，本发明人已显示，发现含有不完整CED3/ICE区(例如MACHα3)的MACH同种型对共表达的MACHα1或MACHα2分子的活性具有抑制作用；还发现它们能阻断Fas/AOP-1和p55-R诱导的死亡。这些抑制性同种型在细胞内的表达可能构成一种细胞抗Fas/AOP-1和TNF介导的细胞毒性的自我保护机制。猜测至少某些G1同种型也可能具有类似的抑制作用(Gl是最近分离的新的Mch4-和可能的MACH-结合蛋白，而且是MORT-1结合蛋白，具有MORT组件和蛋白酶结构域，参见共同拥有的待审专利IL120367)。MACH同种型有广泛的异源性，猜测G1同种型的异源性可能也一样，远远超过观察到的CED3/ICE家族中任一其它蛋白酶的异源性，这使得有活性的MACH同种型的功能具有特别好的协调性，有活性的G1同种型可能也一样。因此，如前所述，RAP蛋白或其可能的同种型在不同组织中就其与RIP之间相互作用而言具有不同的作用，因而它们对前述激活细胞死亡或细胞存活通路之间平衡的作用也不同。

也有可能某些可能的RAP同种型具有其它功能。例如，RAP或某些RAP同种型还可以作为某些分子的停靠位点，这些分子参与Fas/AOP-1和TNF受体通过与RIP相互作用或仅由RIP单独产生的其它非细胞毒性作用。

因为Fas/AOP-1和TNF受体特有的致炎症、细胞死亡的能力，以及TNF受体引发其它组织损伤活动的能力，这些受体的功能异常可能对生物体特别有害。实际上已显示，这些受体的功能亢进和底下都会造成多种疾病的病理表现(Vassalli，1992；Nagata & Golstein，1995)。通过鉴定参与受体信号传送活动的分子并发现调节这些分子活性的方法可以得到新的治疗方法。从以下实施例可以清楚地看到本发明的其它方面。

以下非限定性实施例并结合附图将对本发明进行更详细的说明。

应注意以下方法同等地(加以修改)适用于相应分离、克隆和特征分析本发明的RAP及其可能的同种型：i)双杂交筛选和双杂交β-半乳糖苷酶表达试验；(ii)蛋白质的诱导表达、代谢性标记和免疫沉淀；(iii)体外结合；(iv)细胞毒性评价；和(v)有关MORT-1和MORT-1结合蛋白(如MACH)以及新分离的G1(参见IL120367)的Northern和序列分析(参见Boldin等，1995b)2，3(参见Boldin等，1996)和后文的4。这些过程充分揭示与用来分离、克隆和特征分析本发明RAP的过程相同，详细说，与以下共同拥有的待批以色列专利申请中的相同或相当：申请号114,615，114,986，115,319，116588，117,932和120367，以及相应的PCT申请PCT/US96/10521。而且，有关NIK蛋白及其在活化NF-κB继而在细胞存活中的作用，以及Traf2在细胞存活通路中的作用，例如Traf2与RIP及其它蛋白之间的相互作用，已经由本发明人在共同拥有的待审批专利IL117800，IL119133和Malinin等1997中详细说明了。实施例：结合RIP蛋白的RAP蛋白的克隆和分离

(i)双杂交筛选测序和预分析

以没有死亡域的RIP作为B细胞文库中的诱饵进行双杂交筛选(参见Fields &Song，1989，WO/96/18641)，分离到到一个约1.9kb的克隆，对它进行了测序。

设计并制备了该序列5’末端的引物。利用PCR筛选了几个cDNA文库，从结肠cDNA文库和心脏cDNA文库中都筛选到一个0.3kb的克隆，将该克隆与B细胞文库中获得的约1.9kb的克隆连接。

对新的约2.2kb的克隆进行了测序(见图1)，并确定了它的推定氨基酸序列(图2)。

序列分析显示，RAP蛋白显然不具有‘死亡域’，没有MORT组件，没有蛋白酶结构域，和ICE家族成员一样，它即没有激酶结构域也没有TRAF结构域(参见前文中共同拥有的待审批专利申请和各种参考文献，特别是Malinin等，1997，关于胞内信号传送通路中的所有结构域)。结合研究揭示，RAP基本上只结合RIP，RAP，不能结合TRADD、MORT-1、p55-R、p75-R和MACH。

所以，看来RAP是一种特异性的RIP结合蛋白，高度特异性地与RIP相互作用/结合，这可能是通过了迄今分离到的其它胞内信号传送蛋白中所没有的一个结合结构域。由于RAP是RIP胞内活性的特异性调节剂/介质，所以在RIP调节/介导的炎症和细胞死亡/细胞存活通路中起着重要作用。

简而言之，用没有RIP‘死亡域’的RIP蛋白片段作为诱饵，以双杂交法筛选人外周血淋巴细胞双杂交cDNA文库，得到一个RAP蛋白克隆。RIP序列可以从现有文献(例如Stanger等，1995)中获得，在GenBank数据库中的登录号为U25994，它是人的RIP序列(还有小鼠的RIP序列，登录号为U25995)。利用这一序列信息，用OLIGO4^TM软件设计出合适的PCR引物，并且以来自人成纤维细胞文库总RNA的cDNA(利用标准方法)为模板，经PCR获得没有C末端‘死亡域’的对应于RIP编码部分的DNA片段。然后将这一段没有‘死亡域’的RIP编码部分克隆到pGBT-9载体(Clontech)中用作为诱饵，进行如前所述的双杂交筛选。在这次双杂交筛选中，获得了许多克隆，它们都编码RIP结合蛋白，而且编码的蛋白与RIP内一个非‘死亡域’(RIP的C末端区)以外的一个区域相互作用，‘此区域’在RIP诱饵中不存在。如前所述进行试验，于是得到该cDNA克隆，其序列见图1。

对上述RAP克隆的序列以及‘dbest’数据库、1级人基因组数据库和GenBank数据库中的序列进行分析显示该RAP序列是独特(新的)序列，因为已知序列与它都没有明显的同源性。

通过结合试验来测定RAP是否能够与其它已知胞内信号蛋白结合。在这类测试中，对蛋白TRADD、MORT-1、p55-R、p75-R和MACH测试了它们结合RAP的能力。然而，发现RAP不能与上述蛋白中的任何一种结合。RAP也不能结合诸如核纤层蛋白、细胞周期蛋白D之类无关对照蛋白。

以上结果都表明，新的RAP蛋白可能以很高的特异性方式与RIP相互作用，所以它代表了RIP的特异性调节剂/介质。RAP与RIP之间相互作用的确切位点还有待确定，但是该位点似乎是RIP和RAP特有的，而其它的(如TRADD、MORT-1、FAS-R)已知能与RIP相互反应的蛋白，以及可能还有Traf2都没有该位点(参见Malinin等，1997)。还发现(根据与前述各数据库中序列的分析和比较)，RAP既没有‘死亡域’，MORT组件、蛋白酶结构域(如ICE/CED3基序)、激酶结构域/基序，也没有TRAF结构域。与此一致的是，生物活性初步分析也显示RAP显然具有以下特征：

(i)过量表达时，RAP本身对细胞无毒；

(ii)RAP不能保护细胞免受TNF杀伤，所以显然不是TNF诱导的细胞死亡的抑制剂；

(iii)RAP本身不诱导NF-κB；

(iv)RAP不阻断TRADD、RIP和p55-TNF-R活化NF-κB；

(v)还发现RAP能阻断RIP引起的JNK诱导(Jun激酶)。

鉴于以上所述，RAR看来是一种高特异性的RIP结合蛋白，因而也就是RIP调节剂/介质，它很可能参与RIP介导的胞内信号通路。

根据以上所述，RAP看来参与调节/介导了RIP的胞内活性，这些活性就是RIP参与的炎症和细胞死亡通路(分别通过其‘死亡域’或通过与TRADD、MORT-1、FAS-R及各自偶联蛋白MACH、Mch4、G1等其它蛋白的相互作用)，和RIP参与的细胞存活路径(NF-κB活化，可能是通过与Tarf2相互作用)。前文已经详细说明了RAP调节/介导RIP活性的可能途径，例如RAP-RIP相互作用可加强细胞死亡或细胞存活通路，或者抑制细胞死亡或存活通路，这种加强或抑制作用可能取决于这两条相反胞内通路中其它成员的相对活性。RAP还可能作为许多RIP分子和其它RIP-或RIP-结合蛋白凝聚的结合蛋白，这种凝聚作用然后可能在导向细胞死亡或细胞存活(或两者)中起作用，这取决于细胞内各通路中其它成员的相对活性/数量。

以上是对本发明的充分说明，本领域技术人员能够理解的是，在广泛的同等参数、浓度和调节范围内都可进行相同的实施，这些都属于本发明的宗旨和范围，并不需要过多的试验。

虽然已经结合具体实施例对本发明进行了说明，但是可以理解还可作进一步的改进。本申请欲覆盖主要按照本发明原理对本发明所做的各种改变、应用或改进，也包括未在此公开但是属于本领域已知或惯用的其它实施方式，本申请的基本技术特征按照权利要求书所设定的范围予以应用。

说明书中引用的所有参考文献，包括期刊论文或摘要、公开或相关的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利、或任何其它参考文献都被本发明纳为参考，包括其中的数据、表格、附图和文本。此外，此处引用的参考文献中引用的参考文献中全部内容也被本发明纳为参考。

对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的参考并不表示本发明的内容、说明或实施方式都已经在现有技术中被公开、说明或提出过。

以上对具体实施方式的说明充分公开了本发明的总体特征，其它人利用本领域的技术(包括本文中参考文献中的内容)可针对各种应用方便地加以修改，这些实施方式不需要过多的试验，都属于本发明范围之内。所以，根据以上说明和指导，这样的修改应该属于与在此公开的实施方式相对等的意义和范围内。应该理解的是，本文所用术语和措词是为了说明而不是限定本发明，所以对于这些术语的理解应该以本说明书为依据并结合本领域一般技术人员的常识。

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Claims (28)

1.编码RIP结合蛋白RAP、其同种型、片段或同系物的DNA序列，所述的RAP、其同种型、片段或同系物能够结合RIP并调节或介导RIP的胞内活性。

2.根据权利要求1所述的DNA序列，它选自：

(a)衍生自天然RAP蛋白编码区的cDNA；

(b)能够与(a)序列在中等严谨条件下杂交并编码生物活性RAP蛋白的DNA序列；和

(c)序列(a)和序列(b)中的DNA序列基因密码子形成简并并编码生物活性RAP蛋白的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的DNA序列，它包含图1中的序列。

4.根据权利要求1或2所述的DNA序列，它包含图1中的序列，并编码至少一个活性RAP蛋白、其同种型、同系物或片段。

5.一种载体，它包含权利要求1至4中任一项所述的DNA序列。

6.根据权利要求6所述的载体，它能够在真核宿主细胞内表达。

7.根据权利要求6所述的载体，它能够在原核宿主细胞内表达。

8.转化的真核或原核宿主细胞，其中含有权利要求5至7中任一项所述的载体。

9.RAP蛋白、其同种型、片段、功能性同系物或衍生物，它们由权利要求1至4中任一项所述的DNA序列编码，所述的蛋白、其同种型、片段、同系物及衍生物能够结合RIP蛋白，并能够调节或介导RIP在炎症、细胞存活或细胞死亡通路中的胞内活性，RIP直接参与这些通路，或通过与这些通路中的其它胞内调节剂或介质结合而间接参与其中。

10.根据权利要求10所述的RAP蛋白、其同种型、片段、同系物或衍生物，所述的蛋白、其同种型、片段、同系物或衍生物至少具有图2所示氨基酸序列的一部分。

11.生产权利要求9或10所述蛋白、其同种型、片段、同系物或衍生物的方法，包括：在适宜表达所述蛋白、其同系物或衍生物的条件下培育权利要求10所述的转化的宿主细胞，根据需要进行翻译后修饰来获取所述的蛋白、其片段、同系物或衍生物，并分离所述的表达的蛋白，其片段、同系物或衍生物。

12.抗体或其活性片段或衍生物，它们对权利要求9或10所述RAP蛋白、其同种型、片段、同系物或衍生物具有特异性。

13.调节或介导由RIP调节/介导的对有其直接参与或通过通路中其它调节剂/介质而间接参与的炎症、细胞死亡或细胞存活通路的胞内作用的方法，该方法包括：用一种或多种权利要求9或10所述能够结合RIP并调节或介导所述RIP胞内活性的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物处理所述细胞，所述的处理包括将一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物以适合胞内引导的形式引入所述细胞，或者将编码一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的DNA序列以携带有所述序列的合适载体形式引入所述细胞，所述的载体能够以使所述系列在所述细胞中表达的方式将所述序列插入所述细胞内。

14.根据权利要求14所述的调节由RIP调节/介导的对细胞的效应的方法，所述的细胞处理包括将编码一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的DNA序列以携带有所述序列的合适载体形式引入细胞，所述的载体能够以使所述系列在所述细胞中表达的方式将所述序列插入所述细胞内。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的细胞处理是用重组动物病毒载体转染所述细胞，步骤包括：

(a)构建重组动物病毒载体，该载体携有编码病毒表面蛋白即配体的序列，此蛋白能够结合待处理细胞表面上的特定细胞表面受体，该载体还携有第二段序列，此序列编码选自权利要求9或10所述的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段和衍生物的编码序列，当它们在所述细胞内表达时能够调节/介导RIP的活性；和

(b)用(a)中的载体转染所述细胞。

16.调节由RIP调节/介导的对细胞的效应的方法，包括用权利要求12所述的抗体或其活性片段或衍生物处理所述细胞，所述的处理是将含有所述抗体或其活性片段或衍生物的合适组合物施加于所述细胞，当所述细胞在其胞外表面表达RAP蛋白或其一部分时，所述组合物应配制成胞外使用的，当所述的RAP蛋白在胞内时，所述组合物应配制成胞内使用的。

17.调节由RIP调节/介导的对细胞的效应的方法，包括用编码权利要求1至4中任一项所述的RAP蛋白的DNA序列至少一部分的反义序列的寡核苷酸处理所述细胞，所述的寡核苷酸能够阻断RAP蛋白的表达。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的寡核苷酸序列用权利要求15所述的病毒引入所述细胞，其中所述病毒的第二序列编码所述的寡核苷酸。

19.处理肿瘤细胞或HIV感染细胞或其它患病细胞的方法，包括：

(a)构建重组动物病毒载体，该载体携有编码病毒表面蛋白的序列，此蛋白能够结合特定肿瘤细胞表面受体或HIV感染细胞的表面受体或其它患病细胞携带的受体，该载体还携有编码选自权利要求9或10所述的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段和衍生物的序列，当它们在所述的肿瘤细胞、HIV感染细胞或其它患病细胞内表达时能够加强RIP调节/介导的直接或间接杀死所述细胞；和

(b)用(a)所述的载体感染所述的肿瘤、HIV感染细胞或其它患病细胞。

20.调节RIP对细胞效应的方法，包括使用核糖酶方法，该方法中将编码核糖酶序列的载体以允许所述核糖酶序列在所述细胞内表达的形式引入所述细胞，所述的核糖酶序列能够与编码权利要求9或10所述的RAP蛋白的细胞mRNA序列相互作用，当所述的核酸酶序列在所述细胞内表达时，它能够与所述细胞的mRNA序列相互作用并剪切所述的mRNA，从而抑制所述RAP蛋白在所述细胞内的表达。

21.分离和鉴定权利要求9或10所述能够与RIP直接结合的蛋白的方法，包括使用酵母双杂交法，该方法中一个杂交载体携带编码所述RIP的序列，第二个杂交载体携带来自cDNA或基因组DNA文库的序列，然后用两载体转化酵母宿主细胞，分离出转化阳性细胞，然后提取所述的第二杂交载体以获得编码结合所述RIP的蛋白的序列。

22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述的蛋白至少是RAP同种型、其同系物、片段或衍生物之一。

23.用于调节RIP对细胞效应的药物组合物，它包含权利要求9或10所述的RAP蛋白、其生物活性片段、同系物、衍生物或其混合物中的至少一种作为活性成份。

24.用于调节RIP对细胞效应的药物组合物，它包含重组动物病毒载体作为活性成份，该载体编码能够结合细胞表面受体的蛋白，还编码权利要求9或10所述RAP蛋白、其同种型、活性片段或同系物中的至少一种。

25.用于调节RIP对细胞效应的药物组合物，它包含编码权利要求1至4中任一项所述的RAP蛋白DNA序列的反义序列的寡核苷酸序列作为活性成份。

26.调节由RIP直接或间接调节/介导的过程的方法，包括用一种或多种权利要求9或10所述的能够结合RIP的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物处理所述细胞，所述的细胞处理包括将一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物以适合其胞内引导的形式引入所述细胞，或者将编码一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的DNA序列以携带有所述序列的合适载体形式的引入所述细胞，所述的载体能够以使所述序列在所述细胞中表达的方式将所述序列插入所述的细胞内。

27.调节由RIP直接或间接调节/介导的过程的方法，包括抑制NK-κB和JNK，这种抑制包括用一种或多种权利要求9或10所述能够结合RIP的RAP蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物处理所述细胞，所述的细胞处理包括将一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物以适合其胞内引导的形式引入所述细胞，或者将编码一种或多种蛋白、其同种型、同系物、片段或衍生物的DNA序列以携带有所述序列的合适载体的形式引入所述细胞，所述的载体能够以使所述序列在所述细胞中表达的方式将序列插入所述细胞。

28.根据权利要求9所述的片段，它是肽。

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