CN1744919A - 使用凋亡的选择性诱导来治疗肿瘤的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过由死亡配体TRAIL介导的凋亡来诱导癌细胞死亡的组合物和方法。所述方法包括下列步骤：将表达载体导入包括表达TRAIL的受体的细胞在内的一组细胞。所述表达载体包括编码TRAIL的多核苷酸序列，所述TRAIL的表达优选由该载体内的条件启动子来调节。导入了所述表达载体的细胞在条件适宜激活所述条件启动子时表达TRAIL。所表达的TRAIL通过TRAIL与诸如DR4和DR5这样的受体之间的相互作用诱导表达TRAIL受体的那些细胞死亡。该方法可以用于以肿瘤位点特异性和剂量可调节方式治疗肿瘤。

Description

使用凋亡的选择性诱导来治疗肿瘤的方法和组合物

                        发明背景

发明领域

本发明涉及用于诱导癌细胞中的程序性细胞死亡(凋亡)的组合物和方法，且更具体地说，本发明涉及通过使用表达诸如Fas配体(Apo-1配体)和TRAIL(Apo-2配体)这样凋亡信号配体的表达载体来治疗肿瘤的组合物和方法。凋亡信号配体的表达，诱导表达诸如Fas(Fas配体的受体)和DR4或DR5(TRAIL的受体)这样介导凋亡的受体的细胞的凋亡。

发明背景

目前用于癌性肿瘤的主要治疗方法是手术摘除组织、器官或腺体中的受侵害区域。例如，对乳腺癌的最新治疗手段集中在摘除患病乳腺，随后合并化疗和放疗。然而，高复发率是完全根除癌细胞的主要障碍。有人认为尽管可以经手术除去恶性肿瘤中的癌细胞，但是已经侵害周围组织或淋巴结的癌细胞通常导致肿瘤复发。肿瘤频繁复发的一个原因可能是在原发性癌发展过程中，通过手术过程完全除去癌细胞极其困难。剩余的癌细胞通常保持长时间的静息状态，其被称为作肿瘤休眠。Meltzer等(1990)“休眠与乳腺癌(″Dormancy and breast cancer″)”-《肿瘤学手术杂志》(J.Surg.Oncol.)43：181-188。一旦经手术摘除了主要组织，则手术损伤可以刺激组织和血管在伤口部位上迅速再生。这些再生过程通过例如组织和血管生长因子给周围组织释放出了正信号。这些因子和迅速增殖的环境诱导剩余的肿瘤细胞从休眠状态转变成迅速增殖的状态且由此导致癌症复发。

所有的癌细胞均共有两种基本的特征：无法控制的细胞循环；和不能进入程序性细胞死亡、即凋亡的途径。凋亡或程序性细胞死亡(PCD)是细胞自杀的遗传控制反应。凋亡的症状是伴随细胞溶解旺盛、染色质凝聚和DNA片段化的活力损耗。Wyllie等(1980)“细胞死亡：凋亡的显著性”(″Cell death：the significance of apoptosis″)-《国际细胞学综述》(Int.Rev.Cytol.)68：251-306。凋亡过程在调节组织发育、器官大小与形状和细胞寿命方面具有重要作用。在组织和器官发育过程中，凋亡是在脊椎动物发育的组织模型化过程中，造成在正常组织更新过程中生理细胞死亡的大部分或全部PCD的原因。凋亡也是引起在免疫反应的负选择过程中B和T细胞系的细胞被广泛消除的原因。

凋亡作为预防细胞和组织过度生长的保护措施起作用。PCD机制中形成的缺陷，可以延长细胞寿命并可以使肿瘤细胞扩张。此外，PCD中的缺陷可以通过允许促进抗基于免疫的破坏和赋予细胞毒性药物和照射耐受性的基因突变的遗传不稳定性和累积，而产生致癌作用。在对这些治疗没有反应的恶性细胞中确实观察到了这些表现。尽管放疗、化疗和适宜的激素疗法均可在肿瘤细胞中诱导一定程度的凋亡，但是可能需要较高剂量的药物或照射来抑制癌细胞生长，这反过来也会对患者产生严重的副作用。

发明内容

发明概述

本发明提供了通过以位点特异性和受控的方式表达诸如FasL和TRAIL这样的凋亡信号配体来治疗癌症、特别是实体瘤的新型方法和组合物。

本发明在一个方面中，提供了在表达介导凋亡的受体的细胞内诱导死亡的方法。

该方法在一种实施方案中包括下列步骤：将表达载体导入一组表达介导凋亡的受体的细胞。所述的表达载体包括编码凋亡信号配体的多核苷酸序列，所述的凋亡信号配体的表达优选受到所述载体内的条件启动子的调节。导入了所述表达载体的细胞在适于激活所述条件启动子时表达凋亡信号配体。所表达的凋亡信号配体通过凋亡信号配体与介导凋亡的受体之间的相互作用，诱导表达介导凋亡的受体的那些细胞死亡。

按照该实施方案，介导凋亡的受体可以是膜结合受体，诸如Fas配体的受体、Fas、以及TRAIL、DR4和DR5的受体。任选地，介导凋亡的受体是肿瘤坏死因子(TNF)的受体，尽管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系统性毒性。

同样，按照该实施方案，凋亡信号配体可以是能够结合介导凋亡的受体的任意蛋白质。例如，凋亡信号配体是能够结合表达Fas(或DR4/DR5)的细胞内的介导凋亡的信号Fas(或DR4/DR5)和Fas(或DR4/DR5)的抗体。可以使用本发明的表达载体将该抗体表达为单链抗体且该抗体在介导凋亡的受体上与其关联抗原结合。

凋亡信号配体优选是膜蛋白，诸如FasL和TRAIL。凋亡信号配体任选地是TNF，不过，TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系统性毒性。

此外，凋亡信号配体任选地是非膜结合的蛋白质，它可以在胞内表达时诱导凋亡。这类胞内凋亡信号配体的实例包括但不限于Bax、Bad、Bak和Bik。

同样，按照该实施方案，所述的表达载体可以是质粒。可以通过脂质体介导的转运或其它转染方法将该质粒转染入癌细胞。

优选所述的表达载体是病毒载体。该病毒载体可以是腺病毒、腺伴随病毒、牛痘、反转录病毒或单纯疱疹病毒载体。

最优选所述的表达载体是腺病毒载体。所述的腺病毒载体可以是有能力复制型或无能力复制型载体，这取决于将要进入肿瘤部位的凋亡信号配体的给予剂量。

凋亡信号配体的表达受到该表达载体内条件启动子的调节。该调节启动子可以是组织特异性启动子，诸如前列腺特异性启动子、乳腺特异性启动子、胰腺特异性启动子、结肠特异性启动子、脑特异性启动子、肾特异性启动子、膀胱特异性启动子、肺特异性启动子、肝特异性启动子、甲状腺特异性启动子、胃特异性启动子、卵巢特异性启动子和子宫颈特异性启动子。

所述的前列腺特异性启动子的实例包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)启动子及其突变体APSA、ARR2PB和前盆(probasin)(PB)启动子、gp91-phox基因启动子和前列腺特异性激肽释放酶(hKLK2)启动子。

所述的肝特异性启动子的实例包括但不限于肝清蛋白启动子、α₁-胎蛋白启动子、α₁-抗胰蛋白酶启动子和运铁蛋白运甲状腺素蛋白启动子。

所述的结肠特异性启动子的实例包括但不限于碳酸酐酶I启动子和癌胚的(carcinoembrogen′s)抗原启动子。

所述的卵巢特异性启动子或胎盘特异性启动子的实例包括但不限于雌激素响应启动子、芳香酶细胞色素P450启动子、胆固醇侧链分裂(cholesterol side chain cleavage)P450启动子、17α-羟化酶P450启动子。

所述的乳腺特异性启动子的实例包括但不限于G.I.erb-B2启动子、erb-B3启动子、β-酪蛋白、β乳球蛋白和WAB(乳清酸性蛋白)启动子。

所述的肺特异性启动子的实例包括但不限于表面活性剂蛋白C尿球蛋白(Uroglobin)(cc-10，Cllacell 10kd蛋白)启动子。

所述的皮肤特异性启动子包括但不限于K-14-角蛋白启动子、人角蛋白1或6启动子和罗伊细克林(loicrin)启动子。

所述的脑特异性启动子的实例包括但不限于胶质原纤维酸性蛋白启动子、成熟星形胶质细胞特异性蛋白启动子、髓鞘质启动子和酪蛋白羟化酶启动子。

所述的胰腺特异性启动子的实例包括但不限于绒毛蛋白启动子、胰高血糖素启动子和胰岛素胰岛(Insulin Islet)淀粉样多肽(糊精)启动子。

所述的甲状腺特异性启动子的实例包括但不限于甲状腺球蛋白和降钙素启动子。

所述的骨特异性启动子的实例包括但不限于α1(I)胶原蛋白启动子、骨钙素(osteocalcin)启动子和骨唾液酸糖蛋白启动子。

所述的肾特异性启动子的实例包括但不限于肾素启动子、肝/骨/肾碱性磷酸酶启动子和红细胞生成素(epo)启动子。

另一方面，所述的条件启动子可以是在有诱导剂存在的情况下受到激活或抑制的诱导型启动子，所述的诱导剂诸如有：四环素或其衍生物或其类似物(例如强力霉素)；类固醇，诸如糖皮质激素、雌激素、雄激素和孕酮。

同样，该方法的实施方案进一步包括创建适于激活所述条件启动子的条件的步骤，诸如：将四环素或强力霉素(deoxycycline)转运至所述细胞组；和将类固醇转运至所述细胞组，所述的类固醇选自糖皮质激素、雌激素、雄激素和孕酮。

同样，按照实施方案，所述的表达载体进一步包括报告基因。该表达载体将报告基因表达为含有凋亡信号配体的融合蛋白。或者，该表达载体通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制，可以将所述的报告基因双顺反子地表达为带有凋亡信号配体的单一蛋白。

所述的报告基因优选编码荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白，而且更优选绿色荧光蛋白(GFP)。

同样，按照该实施方案，所述的表达载体进一步包括编码调节蛋白的多核苷酸序列。可以将所述的调节蛋白表达为带有凋亡信号配体的融合蛋白，或者从表达载体上的不同启动子表达为单一蛋白。任选地，该表达载体通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制，可以将所述的调节蛋白双顺反子地表达为带有凋亡信号配体的单一蛋白。

例如，所述的调节蛋白可以是引起凋亡信号配体组织特异性定位的蛋白。

可以将本发明的方法用于治疗肿瘤。因此，将被诱导凋亡的细胞组包含于实体瘤中。实体瘤的实例包括但不限于乳腺、前列腺、脑、膀胱、胰腺、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、头颈、结肠、胃、支气管和肾的肿瘤。

可以通过使用药物上可接受的任意给药途径将所述的表达载体导入肿瘤。例如，可以通过下列方式将所述的表达载体导入所述的肿瘤细胞组：通过非肠道、腹膜内、静脉内、动脉内(intraartierally)、经皮(transdermally)、舌下、肌肉内、直肠、经口含化(transbuccally)、鼻内、以脂质体方式、通过吸入、阴道、眼内、通过导管或斯滕特(stent)固定模的局部转运、皮下、关节内、鞘内或使用缓释剂型。

优选可以通过将所述的表达载体直接注入肿瘤病灶来将表达载体导入肿瘤部位。

任选地，该方法可以以离体(ex vivo)方式进行，其中在取自患癌症的患者的样品中或细胞培养物中，包含导入了所述表达载体的细胞组。

可以将所述的表达载体导入表达Fas的细胞和不表达Fas的细胞的混合细胞中。

任选地，可以将所述的表达载体导入不表达Fas的细胞。

同样任选地，可以将所述的表达载体导入确实表达Fas的细胞。

同样任选地，可以将所述的表达载体导入不表达Fas的细胞。通过″旁观者效应″，在那些被载体转导的细胞附近表达Fas的那些癌细胞，被Fas-FasL相互作用杀灭。

本发明在另一个方面中提供了可以用于诱导癌细胞凋亡的腺病毒表达载体。该腺病毒载体包括：条件启动子；和编码表达受到载体内条件启动子调节的膜结合配体的多核苷酸序列，所述的配体在表达介导凋亡的受体的细胞内发出凋亡信号。

同样，按照该实施方案，所述的膜结合配体可以是能够结合癌细胞表面上介导凋亡的受体的任意蛋白质。所述的膜结合蛋白优选是FasL或TRAIL。膜结合蛋白任选地是TNF，尽管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系统性毒性。

此外，按照该实施方案，所述的腺病毒载体可以是有能力复制型或无能力复制型的载体，这取决于进入肿瘤部位的配体的给药剂量。

所述配体的表达受到腺病毒表达载体内的条件启动子的调节。所述的条件启动子可以是组织特异性启动子，诸如前列腺特异性启动子、乳腺特异性启动子、胰腺特异性启动子、结肠特异性启动子、脑特异性启动子、肾特异性启动子、膀胱特异性启动子、肺特异性启动子、肝特异性启动子、甲状腺特异性启动子、胃特异性启动子、卵巢特异性启动子和子宫颈特异性启动子。

本发明在另一个实施方案中，提供了一种腺病毒表达载体，其用于严格控制靶蛋白响应于四环素表达。所述的腺病毒表达载体包括：四环素效应元件；编码能够结合四环素效应元件的反式激活蛋白的多核苷酸序列；和编码其表达受到反式激活蛋白与四环素效应元件结合所调节的靶蛋白的多核苷酸序列。

按照该实施方案，四环素效应元件和编码反式激活蛋白的多核苷酸序列位于所述腺病毒载体的对侧端。例如，四环素效应元件位于腺病毒载体的E4区内，而编码反式激活蛋白的多核苷酸序列位于腺病毒载体的E1内。

所述的腺病毒载体任选地不包括腺病毒的E3区。

同样，所述的腺病毒载体任选地不包括除E4区的Orf6之外的腺病毒E4区。

可以在有四环素或强力霉素存在的情况下抑制所述靶蛋白的表达。或者，可以在有强力霉素存在的情况下激活所述靶蛋白的表达。

同样，按照该实施方案，所述的靶蛋白可以是膜结合的凋亡信号蛋白质，诸如FasL和TRAIL。

同样，按照该实施方案，所述的病毒表达载体可以进一步包括编码报告基因蛋白的多核苷酸序列。可以将所述的报告基因蛋白和靶蛋白编码为融合蛋白，或者通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制将其双顺反子地表达为带有所述靶蛋白的单一蛋白。

所述的报告基因优选编码诸如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白这样的荧光蛋白，而且更优选绿色荧光蛋白(GFP)。

此外，按照该实施方案，所述的表达载体进一步包括编码调节蛋白的多核苷酸序列。可以将所述的调节蛋白表达为带有凋亡信号配体的融合蛋白或表达为来自该表达载体上不同启动子的单一蛋白。任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制将所述的调节蛋白双顺反子地表达为带有凋亡信号配体的单一蛋白。

例如，所述的调节蛋白可以是导致凋亡信号配体的组织特异性定位的蛋白质。

该实施方案的腺病毒载体的实例包括但不限于pAd^TET和Ad/FasL-GFP^TET。

还可以将本发明的表达载体与诸如化疗剂(例如烷基化剂、抗生素制剂、抗代谢制剂、激素制剂和植物衍生剂)和生物制剂(例如细胞因子、癌症疫苗和转运肿瘤抑制基因的基因疗法)这样的其它抗癌药联用。例如，对癌症患者共同给予编码TRAIL的表达载体和诸如阿霉素这样的抗癌药，应该通过由所述药物抑制凋亡抑制性分子或上调前凋亡(pro-apoptotic)分子而以协同方式使癌细胞对TRAIL-介导的凋亡敏感来克服这一障碍。因此，通过使用本发明的联合疗法，可以用亚毒性量的化疗剂治疗癌症患者且仍然获得了较好的临床功效而不带有与使用高剂量化疗剂相关的严重副作用。

附图简述

附图1A、1B和1C以图解方式分别表示了pLAd-C.tTA载体、pRAd.T.GFsL载体和rAd/FasL-GFP^TET载体。在附图1A中，表示了pLAd-C.tTA载体。该质粒含有Ad5基因组最左侧的450bp、后面是强CMVie增强子/启动子和来自插入MCS的pUHD15-1的tTA基因。接头含有限制性位点Xba1、Avr2和Spe1，它们均产生与Xba1相容的粘端。在装配入rAd载体后，E1A polyA用于有效的tTA表达。将类似的策略用于构建含有其它转基因的pLAd载体。在附图1B中，表示了pRAd.T.GFsL载体。该质粒含有从唯一EcoR1位点(27333bp)到右侧ITR(35935bp)的Ad5(sub360)序列，其中缺失了E3和E4(保留了E4的Orf6)。该图表示由TRE启动子、FasL-GFP融合蛋白和牛生长激素(BGH)polyA组成的可调节FasL-GFP表达盒的结构。将此盒插入35810bp处的MCS。附图1C中表示了rAd/FasL-GFPTET载体的体外装配。详述了GFP与FasL读框之间的连接区。使用类似策略生成其它rAd载体。

附图2是表示293和293CrmA细胞中具有FasL活性的rAd载体滴度比较的示意图。给12孔平板接种10⁴个293或293CrmA细胞并在1天后以MOI为5感染r-Ad/FasL、rAdFasL-GFP_TET或rAd/LacZ。转导后48小时收集细胞并使之裂解。滴定裂解物并对293CrmA细胞测定PFU/ml。结果代表了2组独立实验的平均值和平均误差。

附图3说明了：除了使用有利于TRAIL和GFP这两种基因双顺反子表达的IRES来分离这两种基因，通过使用与附图1图例说明中所述的类似方法来构建TRAIL表达载体Ad.TRAIL/GFP^TET。

附图4表示癌细胞对FasL-和TRAIL-诱导的凋亡的不同敏感性。分析癌细胞A459、HeLa、LnCP和C3A对腺病毒感染的敏感性和对FasL-和TRAIL-诱导的凋亡的敏感性。使细胞以MOI 10感染AdGFP(从左侧数第一和第二列中的组)、Ad/FasL GFP^TET(第三列)和Ad.TRAIL/GFP^TET(第四列)。细胞的腺病毒感染的敏感性由GFP表达细胞的数量来代表(第一列)，细胞形态显示在明视野图中(第二列)。感染了Ad/FasL-GFP^TET和Ad.TRAIL/GFP^TET的细胞形态分别显示在第三列和第四列中的组中。

附图5表示TRAIL表达不会在未转化的成纤维细胞中诱导凋亡。为了测定TRAIL表达是否会诱导正常细胞中的凋亡，使低传代的人包皮成纤维细胞感染AdGFP、Ad/FasL-GFP^TET和Ad.TRAIL/GFP^TET，MOI约为10。明视野图中显示了转导了AdGFP的成纤维细胞的正常形态(GFPhFF组)。成纤维细胞显示出难以被腺病毒感染，正如GFP表达细胞的少量表达所示(GFP组)。然而，这些细胞对FasL诱导的凋亡高度敏感(FasL组)。相反，在TRAIL转导的细胞(TRAIL组)中没有观察到明显的凋亡，甚至在5倍的MOI(TRAIL×5组)时也是如此。

附图6表示通过注射包括Fas配体的本发明腺病毒载体(Ad/FasL-GFP^TET载体)抑制植入裸鼠的人乳腺肿瘤生长的情况。将等数量的乳腺癌细胞植入6只小鼠的每一侧。给小鼠右侧面上的肿瘤注射Ad/FasL-GFP^TET载体，而给同一小鼠左侧上面的肿瘤注射对照载体Ad/LacZ。在6只小鼠中的4只中，在一次注射后大部分肿瘤块消失(由黄色箭头指示)。在这些小鼠中的2只中，与同一小鼠对照侧面上的肿瘤相比，肿瘤生长的抑制率大于80％(黑色箭头)。

发明详述

本发明提供了通过以位点特异性和受控方式表达诸如FasL和TRAIL这样凋亡信号配体来治疗癌症、特别是实体瘤的新型方法和表达载体。这些凋亡信号配体的受控表达应显著降低与未加控制的全身给予这些配体相关的细胞毒性。

依照本发明，可以通过许多药物上可接受的给药途径，将表达载体诸如携带编码凋亡信号配体(例如FasL和TRAIL)基因的腺病毒载体导入肿瘤部位。由腺病毒转导的细胞表达所述配体、优选将其表达为膜结合蛋白。通过细胞中凋亡信号配体(例如TRAIL)与介导凋亡的受体(例如DR4和DR5)之间的相互作用，发生信号转导的级联。这种情况引起了多个凋亡途径，其中所述的凋亡信号通过多种凋亡酶诸如蛋白酶和内切核酸酶的表达而得到放大。由于所述配体与所述受体之间的相互作用可以在两细胞之间发生，所以可以诱导未由腺病毒转导的肿瘤细胞进行因″旁观者效应″导致的凋亡。这种作用可能是由于腺病毒转导的细胞中表达的凋亡信号配体与在未转导的肿瘤细胞表面上表达的介导凋亡的受体之间的相互作用所导致的。因此，通过使用本发明的方法，细胞杀伤效率应高于那些包括直接注射作为蛋白质的配体或表达该配体的细胞的手段。

本发明的一个重要特征在于凋亡信号配体的表达受到诸如组织特异性启动子或诱导型启动子这样的条件启动子的控制。通过以位点特异性方式(例如使用组织特异性启动子)和/或灵活调节的剂量(例如使用诱导型启动子)来控制所述配体的表达，所述配体潜在的系统性毒性应该被显著降低。

特别是，可以将编码所述配体的腺病毒载体直接注入肿瘤部位并将该配体局部转入肿瘤细胞。依赖于所要转运配体剂量的不同，所述的腺病毒载体可以是有能力复制型或无能力复制型的载体。一旦注入了肿瘤，则腺病毒转导肿瘤细胞，结果是局部表达了高水平的配体。通过肿瘤细胞表面上表达的配体与受体的相互作用，通过沿配体诱导的凋亡的途径表达多个蛋白质和酶，凋亡信号得到放大。因此，可以根除大肿瘤细胞块而对周围健康组织的损伤程度最低。在某种意义上，本发明提供的这种手段类似于″分子手术″，它比包括无差别、未加控制的给予癌症治疗剂的常规手段更为精确且更为安全。

通过使用本发明的方法可以根除原发性肿瘤，而同时可以通过在肿瘤部位上激活癌细胞的凋亡来防止癌症复发。

本发明在一个方面中提供了在表达介导凋亡的受体的细胞中诱导死亡的方法。死亡的方式可以是坏死、凋亡或两者的组合。

该方法包括下列步骤：将表达载体导入一组这样的细胞，这些细胞含有表达介导凋亡的受体的细胞。所述的表达载体包括编码凋亡信号配体的多核苷酸序列，所述凋亡信号配体的表达优选受到所述载体内的条件启动子的调节。导入了所述表达载体的细胞在适于激活所述的条件启动子时表达凋亡信号配体。所表达的凋亡信号配体，通过凋亡信号配体与介导凋亡的受体之间的相互作用，诱导那些表达介导凋亡的受体的细胞死亡。

按照该实施方案，介导凋亡的受体可以是膜结合受体，诸如Fas配体的受体、Fas、和TRAIL、DR4和DR5的受体。介导凋亡的受体任选地是肿瘤坏死因子(TNF)的受体，尽管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系统性毒性。

同样，按照该实施方案，凋亡信号配体可以是任意能够结合介导凋亡的受体的蛋白质。例如，凋亡信号配体是能够结合表达Fas(或DR4/DR5)的细胞内的介导凋亡的信号Fas(或DR4/DR5)和Fas(或DR4/DR5)的抗体。可以使用本发明的表达载体将该抗体表达为单链抗体且该抗体在介导凋亡的受体上与其关联抗原结合。

优选地，所述的凋亡信号配体是膜蛋白，诸如FasL和TRAIL。凋亡信号配体任选地是TNF，尽管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系统性毒性。

1.介导凋亡的受体和凋亡信号配体

本发明介导凋亡的受体是在与凋亡信号配体结合时介导程序性细胞死亡的死亡受体。该受体可以是膜结合的细胞表面受体，或者保留在细胞质或细胞核中。在一个优选的实施方案中，这类介导凋亡的受体是细胞膜结合的受体。这类介导凋亡的受体的突出实例属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族。

TNF受体超增家族由存在相关的富含半胱氨酸的胞外结构域来定义。TNF受体的实例包括但不限于NTR/GFR(p75)，诸如NGF、BDNF、NT-3和NT-4、TNF-R1(CD120a)、TNF-R2(CD120b)、Fas(CD5/Apo-1)、DR3(TRAMP/WSL-1)、DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)、CD30、CD40、Cd27、4-1BB(CD137)、OX-40、LT-βR、人HVEM(疱疹病毒早期介体)、OPG(osteoprotegerin)/OC1F和RANK。Ashkenazi和Dixit(1999)“死亡和假受体对凋亡的控制”(″Apoptosis control by death and decoy receptors″)-《最新细胞生物学观点》(Curr.Opin.Cell Biol.)11：255-260。

所有的受体均是带有由2-6个富含半胱氨酸的结构域组成的胞外区的I型跨膜蛋白，所述的富含半胱氨酸的结构域在数量上约有25％的同一性且用于与配体的结合。Fas、TNF-R1、TRAIL-DR4、DR5、TRAMP(DR3)、CAR1具有相似的胞质结构域。对这些受体的胞内区进行的序列比较显示出了被称作死亡结构域的约80个氨基酸的同源充分保守区。Orlinck和Chao(1998)“TNF相关配体及其受体”(″TNF-related ligandsand their receptors″)-《细胞信号》(Cell Signal)10：543-551。死亡结构域是涉及凋亡的细胞信号分子(接头蛋白质)的特异性补充所需要的。Nagata(1997)“死亡因子导致的凋亡”(″Apoptosis by death factor″)-《细胞》(Cell)88：355-365。

与TNF受体超家族中的受体结合的配体包括但不限于促神经素(neorotrophins)、TNF-α、Fas配体(FasL/CD-95L/Apo-1L)、TRAIL/Apo-2L、CD30L、CD40L、CD27L、4-1BBL、OX-40L和淋巴毒素(LT)α，β。除LT-α外，所有配体被合成为II型膜蛋白；其N-末端位于细胞质内且其C-末端扩展入胞外区。Nagata(1997)“死亡因子导致的凋亡”(″Apoptosis by death factor″)-《细胞》(Cell)88：355-365。在TNF家族成员中胞外结构域内的约150个氨基酸残基的区有20-25％是同源的。

配体的一个共同特征在于所有活性配体均由三个相同的亚单位(三聚体)组成并通过寡聚化激活其各自受体。Schulze-Osthoff等(1998)“死亡因子导致的凋亡”(″Apoptosis by death factor″)-《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)254；439-459。尽管发现大部分成员为膜结合分子；但是特异性金属蛋白酶能够产生可溶性形式。称作TACE的TNF-a的锌依赖性的金属蛋白酶是这类特异性金属蛋白酶的一个实例。Orlinck和Chao(1998)“TNF相关配体及其受体”(″TNF-related ligands and theirreceptors″)-《细胞信号》(Cell Signal)10：543-551。

2.Fas配体介导的凋亡

在一个优选的实施方案中，凋亡信号配体是Fas配体。按照本发明，使用肿瘤部位内的表达载体对Fas配体进行的控制表达，应通过Fas-FasL相互作用诱导表达Fas的细胞内的凋亡，而同时将与对同样表达Fas的那些正常细胞进行不加区分的Fas配体攻击相关的副作用减小到最低限度。

Fas(APO-1，CD95)或Fas配体受体是45kDa的1型膜蛋白且属于TNF/神经生长因子受体超家族。Bajorath，J.和A.Aruffo.(1997)“通过可比拟的分子模型化预测人Fas受体的三维结构”(″Prediction of thethreedimensional structure of the human Fas receptor by comparativemolecular modeling″)-《计算机辅助的分子研究》(J.Comput Aided MolDes)11：3-8；和Watanabe Fukunaga，R.，C.1.Brannan，N.Itoh，S.Yonehara，N.G.Copeland，N.A.Jenkins和S.Nagata“小鼠Fas抗原的cDNA结构、表达和染色体定位”(″The cDNA structure，expression，and chromosomalassignment ofthe mouse Fas antigen″)-《免疫学杂志》(J.Immunol.)148：1274-9。

Fas的配体FasL是40-kDa的II型膜蛋白，它属于肿瘤坏死因子家族。Takahashi，T.，M.Tanaka，J.Inazawa，T.Abe，T.Suda和S.Nagata.(1994)“人Fas配体：基因结构、染色体定位和种类特异性”(″Human Fas ligand：gene structure，chromosomal location and species specificity″)-《国际免疫学》(Int.Immunol.)6：1567-74。FasL(和某些抗-Fas抗体)与Fas的结合导致受体寡聚化并通过半胱氨酸天冬酶(caspase)途径传输信号，从而导致含有受体的细胞经凋亡而迅速死亡。Larsen，C.P.，D.Z.Alexander，R.Hendrix，S.C.Ritchie和T.C.Pearson.(1995)“Fas-介导的细胞毒性。T细胞-介导的免疫反应中的免疫效应物或免疫调节途径？”(″Fas-mediated cytotoxicity.An immunoeffector or immunoregulatory pathway in Tcell-mediated immune responses？″)-《移植》(Transplantation)60：221-4；Longthome，V.L.和G.T.Williams.(1997)“定向于Fas-介导的凋亡需要半胱氨酸天冬酶活性”(″Caspase activity is required for commitment toFas-mediated apoptosis″)-《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO.J.)16：3805-12；Nagata，S.和P.Golstein.(1995)“Fas死亡因子”(″The Fas deathfactor″)-《科学》(Science)267：1449-56；和Ogasawara，J.，R.Watanabe-Fukunaga，M.Adachi，A.Matsuzawa，T.Kasugai，Y.Kitamura，N.Itoh，T.Suda和S.Nagata.(1993)“小鼠体内抗-Fas抗体的致死作用”(″Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice″)[公开的排印错误出现在(1993)10月7日的《自然》(Nature)；365(6446)：568中]-《自然》(Nature)364：806-9。

Fas表达在几乎所有细胞类型中，当Fas与FasL结合时，它通过白细胞介素偶联酶(ICE)或半胱氨酸天冬酶的级联表达激活了遗传程序性细胞死亡。Chandler等(1998)“Fas诱导的小鼠肝脏内凋亡后半胱氨酸天冬酶-3和半胱氨酸天冬酶-7的不同亚细胞分布”(″Different subcellulardistribution of caspase-3and caspase-7following Fas-induced apoptosis inmouse liver″)-《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)273：10815-10818；Jones等(1998)“小鼠肝细胞内Fas-介导的凋亡涉及半胱氨酸天冬酶的加工和激活”(″Fas-mediated apoptosis in mouse hepatocytes involves theprocessing and activation of半胱氨酸天冬酶″)-《肝脏病学》(Hepatology)27：1632-1642。

由于配体和受体均为膜蛋白，所以一般通过细胞-细胞接触来介导Fas诱导的凋亡。然而，FasL的可溶形式也由某些细胞产生且已经证实它具有一定程度改变的活性，这取决于靶细胞。Tanaka.M.，T.Itai，M.Adachi和S.Nagata(1998)“通过释放减量调节Fas配体”(″Downregulation of Fasligand by shedding″)[参见注解]-《天然药物》(Nat.Med.)4：31-6；和Tanaka，M.，T.Suda，T.Takahashi和S.Nagata(1995)“活化淋巴细胞中的人fas配体的功能性可溶形式的表达”(″Expression of the functionalsoluble form of human fas ligand in activated lymphocytes″)-《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO.J.)14：1129-35。

例如，本发明提供了通过载体介导的将Fas配体基因转运至细胞来诱导表达Fas的肿瘤细胞(Fas⁺细胞)死亡的方法。在该方法中，被表达Fas配体的载体转导的细胞，诱导Fas⁺肿瘤细胞发生凋亡并死亡。可以用注射器或微型泵将所述载体注入肿瘤，由此不需要常规手术而除去了肿瘤。

被载体转导的癌细胞可能通过多种机制表达FasL。可以以几种方式诱导癌细胞死亡：1)FasL与相邻肿瘤细胞上的Fas结合并诱导其凋亡；2)FasL诱导内皮细胞的凋亡并破坏供应肿瘤的血管；3)对肿瘤细胞上FasL的表达诱导周围组织凋亡并除去了肿瘤细胞的任何依托支持物；和4)凋亡防止了可以重新激活导致癌症复发的静息肿瘤细胞的正因子释放。

这种手段的主要优点在于Fas-FasL相互作用是激活p53-依赖性和非依赖性途径后的几种凋亡途径的主要信号事件。Callera等(1998)“使用来自可塑性贫血的淋巴细胞中bcl-2和p53的正常表达的Fas-介导的凋亡”(″Fas-mediated apoptosis with normal expression of in lymphocytesfrom plastic anemia″)-《英国血液病学杂志》(Br.J.Haematol.)100：698-703。因此，凋亡信号传导通过一种以上酶的级联表达而得到扩增，且凋亡不依赖于p53或其它细胞周期关卡蛋白。例如，尽管使用p53基因的基因疗法已经在治疗癌症的过程中显示出巨大的希望，(Boulikas(1997)“前列腺癌的基因疗法：p53、自杀基因和其它靶物”(″Gene therapyof prostate cancer：p53，suicidal genes，and other targets.″)-《抗癌研究》(Anticancer Res.)17：1471-1505)，但是p53基因疗法可以在约50-60％具有p53突变的肿瘤细胞中有效。Iwaya等(1997)“作为无结节乳腺癌早期复发指标的组织学等级和p53免疫反应”(″A histologic grade and p53immunoreaction as indicators of early recurrence of node-negative breastcancer″)-《日本临床肿瘤学杂志》(Jpn J Clin Oncol)27：6-12。

另一个优点在于FasL一般是膜激活信号传导蛋白而不是诸如p53和半胱氨酸天冬酶这样的胞内蛋白。细胞表面上FasL的表达将凋亡信号通过强″旁观者效应″传递给周围癌细胞且不需要将治疗基因转入所有的癌细胞。因此，本发明满足了对非手术性癌症疗法的需求，它提供了超过目前基因疗法的显著改善、避免了毒性药物的应用且有助于防止肿瘤复发。

通过以受控方式表达Fas配体、例如通过控制组织特异性启动子或诱导型启动子，可以通过在肿瘤中选择性地促进凋亡来抑制肿瘤生长并可以降低Fas配体的系统性毒性。

3.TRAIL-介导的癌细胞的选择性凋亡

TRAIL或Apo-2配体是281个氨基酸的II型跨膜蛋白且与FasL最为相关(28％氨基酸同源性)。类似于FasL，TRAIL可以在4-8小时内杀伤许多敏感性肿瘤细胞系。相反，TNF在24小时以上的时间内杀伤肿瘤细胞系。Wiley等(1995)“诱导凋亡的TNF家族的新成员的鉴定和特征记述”(″Identification and characterization of a new member of the TNFfamily that induces apoptosis″)-《免疫》(Immunity)3：673-682。类似于全长Fas受体的TRAIL受体DR4和DR5含有可能与衔接分子发生相互作用的死亡结构域(例如FADD(Fas-连接的死亡结构域)-类似于连接物)以便介导凋亡信号。

TRAIL-介导的凋亡的引发过程包括通过受体与配体(TRAIL)交联而使三个DR4或DR5聚集在靶细胞表面上的步骤。在受体寡聚化时，与FADD相似的衔接分子通过死亡结构域的相互作用补充DR4或DR5受体群。Chinnaiyan等(1996)“通过含有死亡结构域的与TNFR-1和CD95相关的受体DR3的信号转导”(″Signal transduction by，a death-domain-containing receptor related to TNFR-1and CD95″)-《科学》(Science)274：990-992。可以使用假受体(DcR1和DcR2)抑制兴奋性受体DR4和DR5与TRAIL交联。Sheridan等(1997)“信号和假受体家族对TRAIL-诱导的凋亡的控制”(″TRAIL-induced apoptosis by a family of signalingand decoy receptors″)-《科学》(Science)277：818-821。所述的假受体能够抑制TRAIL-介导的凋亡，因为它们缺乏介导死亡信号的功能性死亡结构域且它们可以通过DR4和DR5与TRAIL竞争性结合。Griffith等(1999)“使用单克隆抗体对TRAIL受体的功能性分析”(″Functionalanalysis of TRAIL receptors using monoclonal antibodies″)-《免疫学杂志》(J.Immunol.)162：2597-2605。

与FADD相似的TRAIL衔接分子可能含有与FLICE(capase-8)结合的死亡效应物结构域，所述的FLICE(capase-8)即引起产生最终凋亡表型的半胱氨酸天冬酶放大级联的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。Muzio(1998)“通过蛋白酶解的信号传导：死亡连接物诱导凋亡”(″Singling byproteolysis：death adaptors induce apoptosis″)-《国际临床实验室研究杂志》(Int.J.Clin.Lab.Res.)28：141-147。当所述连接物补充至TRAIL受体DR4或DR5的死亡结构域时，FLICE酶原通过FADD样连接物彼此相互接触并通过FLICE自我切割而得到激活。由TRAIL受体-连接物-FLICE组成的FLICE活化复合物称作DISC(死亡诱导信号传导复合物)。Kischkel等(1995)“与细胞毒性相关的依赖性APO-1(Fas/CD95)-相关蛋白质形成带有所述受体的诱导死亡的信号复合物(DISC)”(″Cytotoxicity-associated dependent APO-1(Fas/CD95)-associated protein form a death-inducing signaling complex(DISC)with the receptor″)-《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)14：5579-5588。FLICE酶随后通过切割半胱氨酸天冬酶-3和其它半胱氨酸天冬酶的酶原形式激活半胱氨酸天冬酶-3和其它半胱氨酸天冬酶。Martinez-Lorenzo等(1998)“Jurkat和人外周血液T细胞的活化诱导的死亡中涉及的Apo-2配体/TRAIL”(″Involvementof Apo-2ligand/TRAIL in activation-induced death of Jurkat and humanperipheral blood T cells″)-《欧洲免疫学杂志》(Euro.J.Immunol.)28：2714-2725。然后活性半胱氨酸天冬酶-3可以裂解ICAD(半胱氨酸天冬酶活化的脱氧核糖核酸酶的抑制剂)，从而释放出将DNA切割成凋亡典型标记的180-220bp片段的活性核酸酶。

已经在各种人体组织中检测到了TRAIL的表达，其中在脾、肺和前列腺中发现的表达水平最高。Wiley等(1995)“诱导凋亡的新TNF家族成员的鉴定和特征记述”(″Identification and characterization of a newmember of the TNF family that induces apoptosis″)-《免疫》(Immunity)3：673-82。在本发明中，经证实，与正常细胞相比，癌细胞对TRAIL-诱导的凋亡具有选择敏感性。诸如LNCAP(前列腺)、HeLa(子宫颈)、A549(肺)和C3A(肝)这样的人癌细胞系对TRAIL-介导的凋亡敏感，而来自包皮样品的初级人成纤维细胞在表达相似水平TRAIL的细胞中不受影响。因此，与FasL相比，TRAIL以更具肿瘤特异性的方式诱导凋亡，由此在体内表达时可能具有更低的系统性毒性。

存在许多为何肿瘤细胞特别对TRAIL-介导的凋亡敏感的可能的原因。一种可能性在于健康的正常细胞可以表达胞内调节物，诸如阻断导致细胞死亡的生化信号途径的FLICE-抑制蛋白(FLIPs)。Griffith等(1998)“人黑素瘤细胞中TRAIL-诱导的凋亡的胞内调节”(″Intracellularregulation of TRAIL-induced apoptosis in human melanoma cells″)-《免疫学杂志》(J.Immunol.)161：2833-2840。另外可能的情况是对正常细胞缺乏TRAIL的细胞毒性作用可能是由于诸如DcR1和DcR2这样的假受体的表达所造成的，所述的假受体通过与结合TRAIL的DR4或DR5竞争来抑制TRAIL-介导的凋亡。

通过使用本发明的方法，可以通过诸如腺病毒载体这样的条件表达载体将TRAIL导入癌细胞并选择性诱导癌细胞的凋亡。由于TRAIL给正常细胞施加了较低的毒性且其表达可以以受控位点特异性方式和剂量依赖性方式受到控制，所以这种配体的系统性毒性应得到降低。

4.用于凋亡信号配体的表达载体

可以用于实施本发明方法的表达载体可以是任意的转移基因的载体。该表达载体可以是编码凋亡信号配体(例如TRAIL)的质粒。可以通过脂质体介导的转运或其它转染方法将这种质粒转染入癌细胞。

优选所述的表达载体是病毒载体。该病毒载体可以是腺病毒、腺伴随病毒、牛痘、反转录病毒或单纯疱疹病毒的载体。

本发明提供了优选用于以位点特异性和受控方式诱导癌细胞死亡的腺病毒载体。可以通过使用组织特异性启动子或诱导型启动子控制凋亡信号配体的表达。另一方面，凋亡信号配体的表达在转导细胞中可以是组成型的。可以在体外和体内将腺病毒表达载体用于将凋亡信号配体转运至广泛细胞类型。此外，可以严格调节凋亡信号传导的表达，这不仅有利于产生编码凋亡信号的腺病毒表达载体，而且提供了用于体内控制所述配体表达的方式以便将系统性毒性降低到最低限度。此外，本发明还提供了便利而可靠地对外源性凋亡信号配体的水平和细胞定位进行定量的方式。

在一个优选的实施方案中，所述的腺病毒载体包括：条件启动子；和编码表达受到所述载体内条件启动子调节的膜结合配体的多核苷酸序列；所述配体在表达介导凋亡的受体的细胞中传导凋亡信号。该腺病毒载体可以是有能力复制型或无能力复制型的载体，这取决于进入肿瘤部位的凋亡信号配体的给药剂量。

所述的膜结合配体可以是能够与癌细胞表面上介导凋亡的受体结合的任意蛋白质。优选所述的膜结合蛋白是FasL或TRAIL。这种膜结合蛋白可以是TNF，尽管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系统性毒性。

或者，所述的腺病毒载体可以编码另一种类型的凋亡信号配体，使得当将所述配体导入细胞时，所转导的细胞在胞内表达所述配体。配体与介导凋亡的受体之间的相互作用使细胞发生凋亡。这类凋亡信号传导分子的实例包括但不限于Bax、Bad、Bak和Bik。Adams等“死亡细胞的控制”(″Control of cell death″)《WEHI年鉴报告》(WEHI AnnualReport)1996/1997。

在本发明的另一个实施方案中，编码凋亡信号配体的表达载体还可以编码可以用于调节所述配体表达的另一种蛋白质，诸如调节蛋白。例如，所述的调节蛋白可以使细胞膜上的Fas配体发生组织特异性定位，或另一方面，所述的调节蛋白导致非靶细胞中的Fas配体过早更新或通过调节转录和/或翻译调节来FasL的表达。

还可以使用同时或依次与编码所表达的蛋白质的核酸一起转运至细胞的另一种表达载体来编码所述的调节蛋白。在该实施方案中，两种表达载体可以具有不同的序列，诸如不同的启动子，使得它们可以独立地受到调节，例如通过给予选择性调节所述启动子之一或两者的药物，例如通过使用类固醇激素，所述的类固醇激素例如是可以调节由该激素诱导的启动子的糖皮质激素。可以使用的其它类固醇激素包括但不限于雌激素、雄激素和孕酮。

还可以将凋亡信号配体表达为带有另一种蛋白质的融合蛋白。这种与该配体融合的蛋白质可以用于以下目的：诸如蛋白质定位、配体的活化或失活、监测配体的定位、配体的分离和对该配体的量进行定量。

在一种实施方案中，所述的融合蛋白包括Fas配体和诸如荧光蛋白(FP)这样的报告基因蛋白。报告基因蛋白的实例包括但不限于GFP(绿色荧光蛋白)基因、YFP(黄色荧光蛋白)基因、BFP(蓝色荧光蛋白)基因、CAT基因、neo基因、潮霉素基因等。表达FasL-GFP融合蛋白的构建体的实例如附图1中所示且在本文中进一步描述。

或者，可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制将所述的报告基因双顺反子地表达为带有凋亡信号配体的单一蛋白。

所述的表达载体可以进一步编码能够调节凋亡信号配体的表达的序列。例如，该载体可以含有糖皮质激素调节元件(GRE)，使得可以将糖皮质激素用于调节Fas配体的表达。

可以调节相邻基因表达的调节序列的另一个实例通过将诸如H10和H19这样的RNA类似物(aptamer)克隆入启动子区而得到，由此给予诸如烟酸己可碱染料(Hoechst dye)33258这样的药物可以在体内阻断所述基因的表达。Werstuck等(1998)“通过小分子-RNA相互作用控制活细胞中的基因表达”(″Controlling gene expression in living cells throughsmall molecule interactions″)-《科学》(Science)282：296-298。

在本发明的其它实施方案中，所述的调节序列包括Tet-操纵子或lac操纵子或可以起真核细胞中调节序列作用的任意其它操纵子。

在一个优选的实施方案中，凋亡信号配体的表达处于四环素调节的基因表达系统的控制下，其中对所述配体的表达受到tet-效应元件的控制，其中所述配体的表达需要tet-效应元件和反式激活蛋白的相互作用。

在一个更为优选的实施方案中，使用Ad载体严格控制所述配体的表达，其中将tet-效应元件和反式激活蛋白元件插入同一载体的相对的端以便避免增强子的干扰。表达可以便利地受到四环素或其任意衍生物(包括但不限于强力霉素)剂量依赖性方式的调节。例如，该载体在体外将FasL-GFP有效地转运至细胞，而且融合蛋白的表达水平可以受到培养基中强力霉素浓度的调节。这类调节系统的实例特别如本文所述。

在本发明的一种实施方案中，所述的启动子是本领域技术人员可以理解的组织特异性启动子，它可以将组织特异性传递给编码诸如FasL和TRAIL这样凋亡信号配体的核酸。

例如，所述的组织特异性启动子可以是前列腺特异性启动子、乳腺特异性启动子、结肠特异性启动子、胰腺特异性启动子、脑特异性启动子、肾特异性启动子、肝特异性启动子、膀胱特异性启动子、骨特异性启动子、肺特异性启动子、甲状腺特异性启动子、胃特异性启动子、卵巢特异性启动子或子宫颈特异性启动子。

如果所述的组织特异性启动子是前列腺特异性启动子，那么该启动子包括但不限于PSA启动子、ΔPSA启动子、ARR2PB启动子、PB启动子、gp91-phox基因启动子和前列腺特异性激肽释放酶(hKLK2)启动子。

如果所述的组织特异性启动子是乳腺特异性启动子，那么该启动子包括但不限于MMTV启动子、G.I.erb-B2启动子、erb-B3启动子、β-酪蛋白、β乳球蛋白和WAB(乳清酸性蛋白)。

如果所述的组织特异性启动子是肝特异性启动子，那么该启动子包括但不限于肝清蛋白启动子、α₁-胎蛋白启动子、α₁-抗胰蛋白酶启动子和运铁蛋白运甲状腺素蛋白启动子。

如果所述的组织特异性启动子是脑特异性启动子，那么该启动子包括但不限于JC病毒早期启动子、酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺羟化酶启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、胶质原纤维酸性蛋白启动子、成熟星形胶质细胞特异性蛋白启动子和髓磷脂启动子。

如果所述的组织特异性启动子是结肠特异性启动子，那么该启动子包括但不限于MUCl启动子、碳酸酐酶I启动子和癌胚抗原启动子。

如果所述的组织特异性启动子是卵巢特异性启动子或胎盘特异性启动子，那么该启动子包括但不限于雌激素效应启动子、芳香酶细胞色素P450启动子、胆固醇侧链分裂P450启动子和17α-羟化酶P450启动子。

如果所述的组织特异性启动子是肺特异性启动子，那么该启动子包括但不限于表面活性剂蛋白C尿球蛋白(cc-10，Cllacell 10kd蛋白)启动子。

如果所述的组织特异性启动子是皮肤特异性启动子，那么该启动子包括但不限于K-14-角蛋白启动子、人角蛋白1或6启动子和罗伊细克林启动子。

如果所述的组织特异性启动子是胰腺特异性启动子，那么该启动子包括但不限于绒毛蛋白启动子、胰高血糖素启动子和胰岛素胰岛淀粉样多肽(糊精)启动子。

如果所述的组织特异性启动子是甲状腺特异性启动子，那么该启动子包括但不限于甲状腺球蛋白启动子和降钙素启动子。

如果所述的组织特异性启动子是骨特异性启动子，那么该启动子包括但不限于α1胶原蛋白启动子、骨钙素启动子和骨唾液酸糖蛋白启动子。

如果所述的组织特异性启动子是肾特异性启动子，那么该启动子包括但不限于肾素启动子、肝/骨/肾碱性磷酸酶启动子和红细胞生成素(epo)启动子。

应注意人类基因组计划和其它人类基因发现的努力揭示出了其它组织特异性启动子。这些启动子可以用作由本发明的表达载体指导组织特异性表达的适宜方式。

此外，本领域技术人员易于了解如何鉴定对特定细胞类型具有特异性的启动子。例如，通过比较不同组织类型中的不同基因表达、例如使用基因芯片技术可以鉴定仅在一种特定组织类型中的表达的基因。然后可以将这些基因分离并测序且可以分离其启动子并在动物模型中测试其驱动异源基因的组织特异性表达的能力。这类方法也属于本领域技术人员的能力范围。可以在Greenberg等(1994)《分子内分泌学》(MolecularEndocrinology)8：230-239中找到可以使用的鉴定组织特异性启动子的该方法的实例。

还可以通过选择具有高度组织特异性的表达载体来实现组织特异性。例如，可以选择这样的载体，该载体选择性感染诸如与结肠癌相关这样的粘膜细胞，然后，任选地，与特殊的转运方法例如使用栓剂相结合，将编码诸如Fas和TRAIL这样凋亡信号配体的核酸选择性地转运至那些所需的细胞中。

本领域技术人员会认识到不同的载体随特定宿主的不同或多或少均具有应用性。用于将核酸导入特定宿主的特定技术的实例是应用可以包装重组反转录病毒基因组的反转录病毒载体系统。例如，参见Pastan等(1988)“携带MDRl cDNA的反转录病毒可以在MDCK细胞中产生多种药物耐受性和P-糖蛋白的极化表达”(″A retrovirus carrying an confersmultidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCKcells.″)一《美国国家科学院学报》(Proc.Nat.Acad.Sci.)85：4486；和Miller等(1986)“避免导致辅助病毒产生的重组的反转录病毒包装细胞系的重新设计”(″Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoidrecombination leading to helper virus production.″)-《分子细胞生物学》(Mol.Cell Biol.)6：2895。然后可以将产生的重组反转录病毒用于感染且由此将编码凋亡信号配体的核酸序列转运至受感染的细胞。当然，将核酸导入哺乳动物细胞的确切方法并不限于应用反转录病毒载体。用于该过程的其它技术可以广泛得到，包括应用腺病毒载体(Mitani等“用腺病毒载体转导人骨髓”(″Transduction of human bone marrow byadenoviral vector.″)-《人基因疗法》(Human Gene Therapy)5：941-948(1994))、腺伴随病毒载体(Goodman等“重组腺伴随病毒介导的基因转入造血先祖细胞”(″Recombinant adenoassociated virus-mediated genetransfer into hematopoietic progenitor cells.″)-《血液》(Blood)84：1492-1500(1994))、慢病毒载体(Naidini等“使用慢病毒载体进行的体内未分裂细胞的基因转运和稳定转导”(″In vivo gene delivery and stabletransduction of nondividing cells by a lentiviral vector.″)-《科学》(Science)272：263267(1996))、假型反转录病毒载体(Agrawal等“血液衍生的CD34⁺细胞中的细胞周期动力学和VSV-G假型反转录病毒介导的基因转移”(″Cell-cycle kinetics and VSV-G pseudotyped retrovirusmediated gene transfer in blood-derived CD34⁺cells.″)-《实验血液学》(Exp.Hematol.)24：738-747(1996))、牛痘载体和物理转染技术(Schwarzenberger等“通过c-kit受体向人造血先祖细胞的靶向基因转移”(″Targeted gene transfer to human hematopoietic progenitor cell linesthrough the c-kit receptor.″)-《血液》(Blood)87：472-478(1996))。可以将本发明与这些或其它常用的基因转移方法中任意一项结合使用。在本发明的一个优选的实施方案中，用于转运编码Fas配体的核酸的特异性载体包括腺病毒载体。

5.编码反式调节蛋白的表达载体

因为需要能够调节凋亡信号配体的表达，所以本发明还提供了用于严格控制靶蛋白(例如FasL和TRAIL)表达的可调节表达的表达载体。

该表达载体包括：转录调节序列；编码能够结合所述转录调节序列的反式作用调节蛋白的多核苷酸序列；和编码表达受到反式作用调节蛋白与所述转录调节序列结合的调节的靶蛋白的多核苷酸序列。

转录调节序列和编码反式作用调节蛋白的多核苷酸序列可以位于腺病毒载体的相对的端。例如，所述的转录调节序列位于腺病毒载体的E4区内且编码反式作用蛋白的多核苷酸序列位于腺病毒载体的E1内。

在该载体中，编码靶蛋白的核酸可以与转录调节序列有效地连接。所述靶蛋白的表达可以是诱导型的，例如，除非存在用于特定转录调节序列的适宜激活物，否则不进行FasL或FasL融合体的表达。

或者，靶蛋白的表达可以是阻抑型的，即除非存在用于特定转录调节序列的适宜阻抑物，否则进行FasL或FasL融合体的表达。

反式作用调节蛋白与转录调节序列发生相互作用以便影响靶蛋白的转录。如果所述的转录调节序列是诱导型的，那么所述的反式作用调节蛋白是反式激活物。如果所述的转录调节序列是阻抑型的，那么所述的反式作用因子是反式阻抑物。

在一个更优选的实施方案中，所述的转录调节序列是tet效应元件(TRE)且所述的反式作用因子是tet-效应反式作用表达元件(tTA)。

在最优选的实施方案中，本发明应用了载体Ad/FasL-GFPTET。它是表达鼠FasL与绿色荧光蛋白(GFP)的融合体的复制缺陷型腺病毒载体。FasL-GFP保留了野生型FasL的全部活性，同时使得易于在活细胞或固定的细胞中进行肉眼观察和定量。该融合蛋白处于四环素调节的基因表达系统的控制下。通过创建这种新型″双重组″腺病毒载体来进行严格的控制，其中将tet-效应元件和反式激活蛋白元件插入同一载体的相对的端以便避免增强子的干扰。

可以便利地通过四环素或其任意衍生物(包括但不限于强力霉素)以剂量依赖性方式调节FasL-GFP融合体的表达。所述载体将FasL-GFP基因有效地转运至体内和体外的细胞且该融合蛋白的表达水平受到添加到培养基或给予受试者的强力霉素的浓度的调节。正如可以在下面的实施例中观察到的，Ad/FasL-GFP^TET能够通过经改变培养基中强力霉素水平调节的那些细胞中的融合蛋白的表达而将FasL-GFP转运至转化的和初级的细胞系。易于通过FasL-GFP中GFP成分的荧光来检测FasL-GFP的量并对其进行定量且该量与靶细胞和相邻细胞中凋亡水平相关。

这种转运整个的tet-调节的基因表达系统的载体的设计比使用多载体的策略更为有效和经济，而且可以将其用于需要调节蛋白质表达的任意情况。

因此，本发明提供了用于严格控制对四环素或四环素衍生物的反应的靶蛋白的表达的表达载体。该表达载体包括：四环素效应元件；编码能够结合四环素效应元件的反式激活蛋白的多核苷酸序列；和编码表达受到所述反式激活蛋白与四环素效应元件结合的调节的靶蛋白的多核苷酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述的载体是病毒载体。在一个更为优选的实施方案中，所述的病毒载体是腺病毒载体。在这种腺病毒载体中，四环素效应元件和编码反式激活蛋白的多核苷酸序列位于所述腺病毒载体的相对的端。例如，所述的四环素效应元件位于腺病毒载体的E4区内且编码所述反式激活蛋白的多核苷酸序列位于所述腺病毒载体的E1中。任选地，该腺病毒载体不包括腺病毒的E3区。同时任选地，该腺病毒载体不包括除E4区的Orf6外的腺病毒E4区。

可以在有四环素或强力霉素存在的情况下抑制靶蛋白的表达。另一方面，可以在有强力霉素存在的情况下激活靶蛋白的表达。

应注意该载体也可以是任意类型的病毒载体，包括但不限于腺伴随病毒载体、牛痘病毒载体或反转录病毒载体。

所述的表达载体可以进一步包括编码报告基因蛋白的多核苷酸序列。可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制将所述的报告基因蛋白和靶蛋白编码为融合蛋白或双顺反子地表达为带有靶蛋白的单一蛋白。

所述的报告基因优选编码荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白且更优选绿色荧光蛋白(GFP)。

例如，可以通过将pLAd-C.tTA和pRAd-TGFsL与Ad5基因组部分(snb 360)连接而产生如下所述和如附图1A-C中所示的载体Ad/FasL-GFP^TET，来构建用于表达融合蛋白的腺病毒载体。

可以通过使用带有被编码靶序列的多核苷酸取代的FasL-GFP融合序列的类似腺病毒载体(命名为pAd_TET)，来调节除FasL-GFP融合体以外的靶蛋白的表达。可以按照与附图1A-C中描述生产载体Ad/FasL-GFP^TET相同的方式，通过从载体pRAd-TGFsL中除去FasL-GFP融合序列、将靶序列插入该位点并将所得载体与pLAd-C.tTA连接来构建载体pAd^TET。可以将载体pAd^TET用于需要严格调节其表达的、无限种类的异源蛋白。

所述的表达载体可以进一步包括选择标记，可以将这种选择标记用于筛选那些含有所述载体并表达所述选择标记的细胞。按照这种方式可以便利地分离那些含有核酸或载体并表达来自含有所述核酸或载体、但不表达所述选择标记的选择标记的细胞和来自那些不含所述核酸或载体的细胞的选择标记。所用的特异性选择标记当然可以是可以用于对不含和表达所述选择标记的真核细胞进行筛选的任意的选择标记。这种选择可以基于不含和表达所述选择标记的细胞的死亡，诸如其中所述的选择标记是编码耐药蛋白的基因。这类用于真核细胞的耐药基因的实例是新霉素抗性基因。表达新霉素抗性基因的细胞能够在由抗生素G418或遗传霉素7存在的情况下存活，而在有G418存在的情况下筛选那些不含或不表达新霉素抗性基因的真核细胞。本领域技术人员会理解存在其它选择标记的实例，诸如可以选择与抗生素潮霉素B一起使用的hph基因或可以选择与抗生素麦考酚酸一起使用的大肠杆菌Ecogpt基因。所用的特异性选择标记由此是可变的。

所述的选择标记还可以是可以用于通过在有抗生素存在情况下生长的能力分离那些含有和表达来自不含和/或不表达选择标记基因的选择标记基因的细胞的标记。例如，所述的选择标记可以编码在表达时使那些表达编码所述标记的选择标记的细胞得到鉴定的蛋白质。例如，所述的选择标记可以编码发光蛋白，诸如荧光素酶蛋白或绿色荧光蛋白，且可以从那些不含或不表达编码发光蛋白的选择标记的细胞中鉴定表达编码发光蛋白的选择标记的细胞。另一方面，所述的选择标记可以是编码诸如氯霉素乙酰转移酶(CAT)这样的蛋白质的序列。通过本领域中众所周知的方法可以便利地鉴定产生CAT的那些细胞并使之与那些不产生CAT的细胞区别开来。

6.本发明表达载体的构建

可以通过使用重组DNA技术构建本发明的表达载体。例如，上述可调节的腺病毒载体可以来源于5型腺病毒并可以将其修饰成包括编码凋亡信号配体(例如Fas和TRAIL)和转录调节序列的异源序列。

本领域技术人员会理解存在大量可获得的技术，通过这些技术可以获得编码凋亡信号配体的核酸序列和任选的诸如一种或多种转录调节序列这样的其它序列。获得所述核酸的一种方法通过经合成重组DNA分子构建该核酸来进行。例如，寡核苷酸合成步骤在本领域中是常用的且编码特定蛋白质或调节区的寡核苷酸易于通过自动DNA合成而获得。可以合成用于双链分子中的一链的核酸并使之与其互补链杂交。可以设计这些寡核苷酸，使得产生的双链分子带有内部限制位点或在用于克隆入合适载体的末端上带有适宜的5′或3′突出端。可以通过首先构建编码蛋白质特定区域或调节区的几种不同双链分子、随后将这些DNA分子彼此连接来合成编码相对较大的蛋白质或调节区的双链分子。例如，Cunningham等已经在(1989)“通过同源物-扫描诱变鉴定的人生长激素中的受体和抗体表位”(″Receptor and Antibody Epitopes in Human GrowthHormone Identified by Homolog-Scanning Mutagenesis″)-《科学》(Science)，243卷，1330-1336页中通过首先构建重叠和互补合成的寡核苷酸并将这些片段彼此连接而构建了编码人生长激素基因的合成基因。另外参见Ferretti等(1986)《国家科学院学报》(Proc.Nat.Acad.Sci.)82：599-603，其中公开了由合成的寡核苷酸合成1057个碱基对的合成牛视紫红基因。一旦合成了合适的DNA分子，则可以克隆这种DNA适宜启动子的下游。诸如此类的技术在本领域中是常用的且是充分公开的。

获得编码凋亡信号配体的核酸的另一种方法的实例是从生物体中分离相应的野生型核酸，在所述的生物体中可以找到这种野生型核酸并将其克隆入合适的载体。例如，可以构建DNA或cDNA文库并筛选存在的有意义的核酸。这类文库的构建和筛选方法在本领域中是众所周知的且进行构建和筛选步骤的试剂盒是商购的(例如，Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA)。一旦分离，则可以将这种核酸直接克隆入合适的载体，或如果必要可以将其修饰以有利于随后的克隆步骤。这类修饰步骤是常规的，其实例是添加含有至所述核酸末端的限制位点的寡核苷酸接头。一般方法列在Sambrook等的《分子克隆实验指南》(″MolecularCloning，a Laboratory Manual″)Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中。一旦分离，则可以使用例如PCR这样的标准实验室技术改变选择的密码子。

获得编码凋亡信号配体的核酸的方法的另一个实例，是扩增在含有野生型核酸的宿主生物体内发现的相应的野生型核酸，并在合适的载体中克隆这些被扩增的核酸。本领域技术人员会理解：可以使用与靶核酸不完全同源的引物，将该扩增步骤与突变步骤合并使用，以便例如同时扩增所述核酸并改变该核酸的特定位置。

通过使用这些重组DNA技术，可以构建编码凋亡信号配体的无能力复制型腺病毒载体。例如，可以构建编码TRAIL的复杂腺病毒载体并将其用于感染肿瘤细胞。将还包括与TRAIL一起被双顺反子表达的GFP的载体，命名为Ad.TRAIL/GFP_TFT。

载体Ad.TRAIL/GFP^TET是表达多种基因和调节机制的复合腺病毒载体。将该腺病毒载体的构建描绘在附图3中。使用穿梭载体将编码由IRES分离的TRAIL和GFP的序列克隆入5型腺病毒基因组的右侧端(E4区)，从而得到穿梭载体pRAdTRE-TRAIL/GFP。该pRAdTRE-TRAIL/GFP穿梭载体含有包括右侧长末端重复R-TR在内的腺病毒基因组的右侧端。

另一种穿梭载体pLAd-C.tTA含有5型腺病毒基因组E1区内的四环素反式激活蛋白基因tTA。该载体pLAd-C.tTA还含有包括左侧长末端重复L-TR和腺病毒包装信号ψ的腺病毒基因组的左侧端。同时将载体pRAdTRE-TRAIL/GFP和pLAd-C.tTA线性化，并且被连接到腺病毒骨架以形成重组腺病毒载体Ad.TRAIL/GFP^TET。

7.给药途径和制剂

可以通过使用任意药物上可接受的给药途径导入编码凋亡信号配体的表达载体。例如，可以通过非肠道、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌内、直肠、经口含化、鼻内、以脂质体方式、通过吸入、阴道、眼内、通过导管或斯滕特固定模的局部转运、皮下、关节内、鞘内或使用缓释剂型将所述的表达载体给药入一组肿瘤细胞。

本领域技术人员会认识到本方法的该方面可以包括将编码凋亡信号配体(例如FasL和TRAIL)的序列稳定或短瞬时导入所述细胞。另外，被稳定或瞬时导入的配体编码序列可能整合入宿主基因组，也可能没有整合入宿主基因组。

本领域技术人员会认识到将所述表达载体导入所述细胞的精确过程，当然可以是变化的，并且可能取决于细胞的特定类型或同一性。将表达载体导入细胞的方法的实例包括但不限于电穿孔、细胞融合、DEAE-葡聚糖介导的转染、磷酸钙介导的转染、使用病毒载体感染、微注射、脂转染物-介导的转染、脂质体转运和粒子轰击技术，包括各种″裸DNA″转运的步骤。任选地，该方法以离体方式进行，其中在取自患有癌症的患者的样品中或在细胞培养物中，包含有被导入了所述表达载体的细胞组。

例如，可以将所述的表达载体导入表达Fas的细胞和不表达Fas的细胞的混合细胞中。任选地，可以将所述的表达载体导入不表达Fas的细胞。同样可以任选地将所述的表达载体导入确实表达Fas的细胞。通过″旁观者效应″，经Fas-FasL相互作用，杀灭那些接近于被表达载体转导的细胞的那些表达Fas肿瘤细胞。

可以将用于表达凋亡信号配体的各种载体和宿主用于在细胞培养物中或在体外表达所述配体。例如，可以将编码Fas配体的表达载体导入组织培养细胞系、诸如COS细胞并在该细胞培养物中表达。本领域技术人员可以按照这种方式选择可能在宿主生物体中具有有限寿命的细胞类型，使得宿主可以在一定时间期限内有效地清除表达凋亡信号配体的细胞，从而可以将对非靶的周围细胞或组织的任何可能的凋亡作用减少到最低限度。

或者，可以从受试者体内取出来自受试者的细胞，对其给予编码凋亡信号配体的表达载体，然后将其重新置入所述的受试者。在这种离体治疗过程中，可以操作所述细胞以有利于编码凋亡信号配体的核酸的摄取，而对受试者没有不必要的不良作用。

可以将用于表达凋亡信号配体的各种载体和宿主用于在体内表达核酸。例如，可以将编码FasL的表达载体导入真核宿主细胞、优选肿瘤细胞以便在原位治疗Fas⁺肿瘤细胞。

正如上面简述的，本领域技术人员会理解：可以通过对宿主选择性给予所述载体来治疗特定组织。例如，可以通过气溶胶、诸如通过使用吸入器，选择性地将所述载体给予肺，以此进行腺病毒载体的给予。可以任选地将使用的栓剂对结肠细胞选择性给予所述载体。

同样，任选地以诸如霜剂这样的形式局部转运所述载体，可以选择性地将所述载体或核酸转运至皮肤细胞或子宫颈。

本领域技术人员会理解各种通常可以用于将所述表达载体选择性转运至特定器官或细胞的方法。例如，通过诸如将载体注入选择部位这类方法，可以以手动方式促进表达载体的转运。例如，直接注射可以被用于将所述载体转运至特定的脑和/或乳腺部位。在本发明的一种实施方案中，将编码Fas配体或TRAIL的载体的直接注射用于将其转运入乳腺肿瘤块。

计划通过使用本发明的方法和载体将凋亡信号配体给予细胞、或受试者、最优选是人，以治疗优选是癌症的疾病。可以通过非肠道(例如通过静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、局部、经皮等方式给予本发明的载体，无论是单独的载体、与另一种化合物或组合物(例如化疗剂)的组合、还是基于载体的转运系统的部分，不过，一般优选局部给药。

所需这类核酸、组合物、载体等的确切量可以随受试者的不同而改变，这取决于受试者的种类、年龄、体重和一般情况、所治疗疾病或情况的严重程度、所用的特定化合物或组合物、其给药方式等。因此，无法或不必要详细指定确切的量。然而，本领域技术人员可以使用本领域中众所周知的方法来测定适宜的量(例如，参见Martin等，1989)。

就局部给药而言，本发明的组合物可以是固体、半固体或液体剂型形式的药物组合物，诸如：例如粉剂、液体、混悬剂、洗剂、霜剂、凝胶等，优选适合于单一给予确切剂量的单位剂型。该组合物一般可以包括有效量的选择的核酸、组合物或与药用载体相结合的载体，此外，还可以包括其它医学制剂、药学制剂、载体、佐剂、稀释剂等。

所谓″药物上可接受的″指的是无生物活性的或者是非必需的物质，即可以将其与选择的核酸、其组合物或载体一起给予个体、但不会产生任何不需要的生物作用或以有害方式与所述药物组合物中包含的任意其它成分发生相互作用的物质。

作为选择或者另外，如果使用非肠道给药，那么非肠道给药的特征一般在于注射，例如静脉内注射，包括经供应含有靶细胞的组织或器官的血管进行的区域性灌注。可以将可注射的物质制成常用剂型，如液体溶液或混悬液、适合于在注射前制成液体溶液或混悬液的固体剂型或乳剂。非肠道给药还可以使用缓慢释放或缓释系统以便维持恒定的剂量水平(例如，参见美国专利US 3,710,795)。可以将化合物直接注入表达Fas⁺表型的细胞或组织部位，或可以注射它们以便它们扩散或循环至Fas⁺表型细胞部位。

剂量取决于给药方式、所治疗的疾病或情况和个体受试者的情况。剂量还取决于所给予的物质，例如核酸、包括核酸的载体或另一种类型的化合物或组合物。这类剂量在本领域中是公知的。此外，可以根据用于所治疗特定疾病或情况的典型剂量来调整这一剂量。

此外，可以将靶细胞类型的培养细胞用于使体内靶细胞用的剂量最优化，而且可以监测来自与靶细胞类型相同类型的培养细胞中达到的不同剂量的转化。通常单剂量可能足够；然而，如果需要可以重复该剂量。该剂量不应大至产生不良副作用。一般来说，该剂量将随年龄、疾病、性别和患者体内的疾病程度的不同而改变且可以由本领域技术人员确定。各临床医师还可以在任何并发症的情况中调整这一剂量。在实施例中给出了非人动物中的有效剂量的实例。基于现有技术中接受的公式，通常可以由提供并被证实有效的剂量来计算人体内的有效剂量。

就对受试者体内的细胞给药而言，一旦给予了所述受试者所述的化合物或组合物，则它们当然会调节至受试者的体温。就离体给药而言，可以通过维持细胞存活力的任意标准方法来给予所述的化合物或组合物、诸如通过将其添加到培养基(适于所述靶细胞)中并将该培养基直接加入所述细胞。正如从本领域中得知的，本方法中所用的任何培养基可以是含水的且是无毒性的以便不使细胞无法存活。此外，如果需要，它可以含有用于维持细胞存活的标准营养物。

就体内给药而言，例如，可以将所述的复合物添加到来自患者的血液样品或组织样品中，或加入到例如盐水和缓冲盐水这样的药物上可接受的载体中，并通过本领域中公知的任意几种方式进行给药。

给药的其它实例包括：气溶胶吸入；皮下或肌内注射；将编码所述化合物的核酸序列直接转染入例如为移植和随后植入受试者而制备的骨髓细胞，其中该化合物是核酸或蛋白质；和直接转染进入随后植入受试者的器官。

其它给药方法包括：口服给药，特别是当将组合物包囊时更是如此；或直肠给药，特别是当组合物是栓剂形式时更是如此。药物上可接受的载体包括无生物活性的否则就是非必需的物质，即可以将该物质与选择的复合物一起给予个体、但不会产生任何不需要的生物作用或以有害方式与所述药物组合物中包含的任意其它成分发生相互作用的物质。

特别地，如果例如通过器官或肿瘤的区域灌注，来靶向体内的特定细胞类型，那么可以对来自靶组织的细胞进行活检并可以如本文所述和本领域中公知的方法在体外测定进入该组织的最佳剂量以便使包括浓度和时间期限在内的体内剂量最优化。

或者，还可以将相同细胞类型的培养细胞用于最优化体内靶细胞的剂量。例如，可以使用可控制的泵、诸如计算机控制的泵或微温性泵来控制肿瘤内的注射量和比例以便控制肿瘤或组织内的核酸或载体的比例和分布。实施例4证实了用于小鼠体内乳腺和脑肿瘤的体内治疗的Ad/FasL-GFP^TET的有效剂量。本领域技术人员易于得知如何外推这些附图以便确定有效的人体剂量。

就离体或体内应用而言，可以以任意有效浓度给予所述的核酸、载体或组合物。有效浓度是导致转化表型的细胞死亡、减少、抑制或阻止的量。

可以以组合物的形式给予本发明的表达载体。例如，该组合物可以进一步包括其它医学制剂、药学制剂、载体、佐剂、稀释剂等。此外，该组合物除包括所述核酸或载体外还可以包括脂类，诸如脂质体，如阳离子型脂质体(例如DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子型脂质体。如果需要，脂质体可以进一步包括蛋白质以便有利于靶向特定细胞。包括核酸或载体和阳离子型脂质体的组合物，可以被给药入传入靶器官的血液，或者使其吸入呼吸道至呼吸道的靶细胞。关于脂质体，例如参见Brigham等《美国呼吸道细胞分子生物学杂志》(Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.)1：95-100(1989)；Felgner等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)84：7413-7417(1987)；美国专利US 4,897,355。此外，可以将所述的核酸或载体作为可以靶向至诸如巨噬细胞这样特定细胞类型的微囊成分给药，或者其中将从微囊扩散的化合物或转运的化合物设计成特定的比例或剂量。

可以通过本发明的方法治疗表达介导凋亡信号的受体的任意细胞、特别是肿瘤细胞。例如，Fas是主要的表面蛋白，而且可以通过Fas-FasL凋亡诱导将表达FasL的细胞用于治疗表达Fas的细胞。表达FasL的细胞可以通过细胞表面上Fas与FasL的相互作用与表达Fas的细胞发生相互作用，并且由此治疗表达FasL的细胞可以接触到的、表达Fas的细胞。另外，产生FasL的细胞也可以通过产生随后与Fas发生相互作用且还诱导表达Fas的细胞凋亡的可溶性FasL，来调节表达Fas的细胞。

Fas与FasL相互作用的典型情况是配体-受体结合，不过，这种相互作用本身可能并不一定需要结合，而包括因Fas与FasL的任何相互作用导致的任意细胞反应。因此，本文关注任何经由Fas的这样的细胞凋亡，此细胞凋亡由通过表达Fas配体的同一细胞或第二种细胞表达FasL而产生。

尽管使用本发明的方法可以诱导表达Fas的任意细胞发生凋亡，但是优选的实施方案是使用这些方法诱导Fas⁺肿瘤细胞发生凋亡。在该实施方案中，可以选择性诱导这些肿瘤细胞发生凋亡且随后死亡，由此治疗肿瘤。

在另一个优选的实施方案中，所述的肿瘤是实体瘤，并且给该肿瘤注射可以感染肿瘤细胞且由此导致它们表达FasL的重组病毒，由此，表达FasL的细胞与表达Fas的细胞发生的相互作用导致Fas⁺细胞发生凋亡。

由表达FasL的细胞侵染的表达Fas的细胞一般是与表达FasL的细胞相邻的细胞，因为细胞与细胞的接触一般是发生凋亡信号所必不可少的。不过，诸如如果表达FasL的细胞已经移动和/或如果表达FasL的细胞产生可溶性FasL，那么可以从表达FasL的细胞的邻近周围除去感染的Fas细胞。

表达FasL的细胞还可以导致其自身死亡，条件是那些细胞也是Fas⁺细胞。在这种手段中，本发明的方法可以使Fas⁺细胞死亡，由此消除可能在其它情况下使肿瘤回归的那些肿瘤细胞。

8.联合疗法

本发明还提供了使用联合疗法的方法，所述的联合疗法将凋亡信号配体的表达与给予抗癌药合并使用。据信：通过共同给予抗癌药，癌细胞的凋亡可以得到强化或敏化，尤其是在那些耐FasL-或TRAIL-介导的凋亡的癌细胞中更是如此。

治疗癌症中的主要障碍在于耐药肿瘤细胞的形成和形成了可以解读FasL或TRAIL对凋亡敏感的抗凋亡机制。理想的情况是对TRAIL(或Fas)抗性肿瘤细胞给予亚毒性浓度的化疗药和TRAIL(或Fas)，该过程应产生最大的肿瘤抑制作用和最小的、与给予高剂量化疗药相关的副作用。

本发明的联合疗法可以通过多种作用机理克服肿瘤对Fas-或TRAIL-介导的凋亡的耐受性。诸如化疗剂或细胞因子这样的抗癌药，可以通过1)抑制抗凋亡分子和/或2)增量调节前凋亡分子，来敏化Fas-或TRAIL-介导的凋亡。例如，可以通过抗癌药来调节线粒体凋亡途径的主要抑制剂Bel-x_L和Bcl-2。低浓度的、植物来源的抗癌药紫杉醇可以通过诱导Bcl-2磷酸化降低Bcl-2的活性。

此外，药物和细胞因子还可以增量调节前凋亡分子的表达以降低诱导TRAIL-介导的凋亡所需的信号传导阈值。例如，可以使用基因毒性药物和TNF-α诱导DR5(一种死亡诱导TRAIL受体)的表达。DR5的诱导似乎同时受到p53-依赖性和p53-非依赖性机制的调节。Sheikh等(1998)“对基因毒性应激和肿瘤坏死因子α的反应的死亡受体KILLER/DR5基因表达的p53-依赖性和非依赖性调节”(″p53-dependentand independent regulation of the death receptor gene expression in responseto genotoxic stress and tumor necrosis factor alpha″)-《癌症研究》(CancerRes.)58：1593-1598。此外，可以使用γ-干扰素增量调节半胱氨酸天冬酶(半胱氨酸天冬酶-1、-2、-6、-8和-9)的mRNA。这些半胱氨酸天冬酶的增量调节应增强了对本发明凋亡信号配体诱导的凋亡的敏感性。

可以共同给予范围很广的抗癌药和本发明的表达载体。所述抗癌药的实例包括但不限于烷基化剂、抗生素制剂、抗代谢制剂、激素制剂、植物衍生制剂和生物制剂。

烷基化剂的实例包括但不限于二氯乙胺类(氮芥子气，例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、尿嘧啶氮芥)、氮丙啶类(例如噻替派)、烷基酮磺酸盐类(例如白消安)、硝基脲类(例如卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星)、非传统的烷基化剂(六甲蜜胺、达卡巴嗪和丙卡巴肼)、铂化合物(卡铂(carboplastin)和顺铂)。

抗生素制剂的实例包括但不限于蒽环霉素类(anthracyclines)(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和蒽二酮)、丝裂霉素C、博来霉素、更生霉素、普里卡诺霉素(plicatomycin)。

抗代谢制剂的实例包括但不限于氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、亚叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他丁、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(2-CDA)、门冬酰胺酶和吉西他滨。

这类激素制剂的实例是合成雌激素类(例如己烯雌酚)、抗雌激素类(例如他莫昔芬、托瑞米芬、氟羟甲基固醇(fluoxymesterol)和雷洛昔芬)、抗雄激素类(比卡鲁胺、尼鲁米特、氟他胺)、芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特、阿纳托司唑和四唑)、酮康唑、醋酸性瑞林、亮丙瑞林、去氢甲孕酮和米非司酮。

植物衍生的制剂的实例包括但不限于长春花生物碱(例如长春花新碱、长春花碱、长春地辛、长春利定和长春瑞滨)、鬼臼毒素类(例如依托泊苷(VP-16)和替泥铂苷(VM-26))、喜树碱及其衍生物(例如9-硝基-喜树碱和9-氨基-喜树碱)和紫杉烷类(例如紫杉醇和紫杉萜)。

生物制剂的实例包括但不限于免疫调节蛋白，诸如细胞因子、针对肿瘤抗原的单克隆抗体、肿瘤抑制基因和癌症疫苗。可以与本发明组合物联用的白细胞介素的实例包括但不限于白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素12(IL-12)。

可以与CPT联用的干扰素的实例包括但不限于干扰素α、干扰素β(成纤维细胞干扰素)和干扰素γ(成纤维细胞干扰素)。这类细胞因子的实例包括但不限于红细胞生成素(红细胞生成素α(epoietin α))、粒细胞-CSF(非尔司亭)和粒细胞巨噬细胞-CSF(沙莫司亭)。非细胞因子的其它免疫调节剂包括但不限于卡介苗、左旋咪唑和奥曲肽。

针对可以与CPT联用的肿瘤抗原的单克隆抗体的实例包括但不限于HERCEPTIN_(Trastruzumab)和RITUXAN_(Rituximab)。

肿瘤抑制基因的实例包括但不限于DPC-4、NF-1、NF-2、RB、p53、WT1、BRCA1和BRCA2。

癌症疫苗的实例包括但不限于神经节苷脂(GM2)、前列腺特异性抗原(PSA)、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)(由结肠癌和例如乳腺、肺、胃和胰腺癌这样的其它腺癌产生)、黑素瘤相关抗原(MART-1、gp100、MAGE 1，3酪氨酸酶)、乳头瘤病毒E6和E7片段、自体肿瘤细胞和同种异体肿瘤细胞的完整细胞或部分/裂解物。

可以将佐剂用于增强对TAAs的免疫反应。佐剂的实例包括但不限于卡介苗(BCG)、内毒素脂多糖类、匙孔血蓝蛋白(GKLH)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，和环磷酰胺，这是一种据信在低剂量给药时可减少肿瘤诱导抑制作用的化疗药。

在一个实施方案中，可以将抑制RNA合成并减少Bd-x_L表达的药物放线菌素D，用于在癌细胞中、例如在与AIDS相关的卡波西氏肉瘤(KS)的癌细胞中，以敏化TRAIL-介导的凋亡。KS是在带有HIV感染的人中产生的最常见的恶性肿瘤(AIDS-KS)。尽管已经将许多方式使用了15年，但是仍然无法使用目前可得到的治疗方式治愈KS或使其长期完全缓解。Lee和Mitsuyasu(1996)“与AIDS相关的卡波西肉瘤的化疗”(″Chemotherapy of AIDS-related Kaposi′s sarcoma″)-《北美临床血液学与肿瘤学》(Hematol.Oncol.Clin.North Am.)10：1051-1068。在AIDS-KS损害中检测到了高水平的Bcl-x和Bcl-x_L，这一结果可能是KS细胞对化疗药和NK细胞的抗性所导致的。因此，对KS患者共同给予编码TRAIL的表达载体和一种或多种基因毒性药物，应该通过经由所述基因毒性药物抑制Bcl-x和Bcl-x_L水平而以协同方式使癌细胞对TRAIL-介导的凋亡敏感，从而克服了这一障碍。

在另一个实施方案中，可以将多柔比星与表达TRAIL的表达载体联用以治疗患前列腺癌的患者。前列腺癌是美国男性中最普遍的癌症之一且患晚期前列腺癌的患者的存活率目前较低。Landis等″Cancer statitics″一《CA临床癌症杂志》(CA Cancer J.Clin.)49：8-31。尽管手术、激素疗法和化疗可以除去前列腺癌的大部分，但是可以发生晚期癌转移的复发。由于激素难以治愈的前列腺细胞，对放疗和化疗也不敏感，因此当这些细胞发展成更为恶性的肿瘤时，它们可能产生对各种刺激物诱导的所有凋亡过程的耐受性。然而，共同给予基因毒性药物和编码TRAIL的表达载体，应该通过经抑制凋亡抑制分子或增量调节前凋亡分子而使前列腺癌细胞对TRAIL-介导的凋亡敏感，从而克服了这一障碍。

可以将本发明的表达载体在表达用于治疗癌症(或其它疾病)的凋亡信号配体时，与其它抗癌(或所治疗的其它疾病)的治疗剂联合给药，对该表达载体的给药可以在给予所述的其它治疗剂之前、过程中或之后进行。可以按照已知或测定为有效的剂量给予这些治疗剂，而且由于存在由本发明载体表达的凋亡信号配体，因而可以以减少的剂量给予它们。

在下面的实施例中更具体地描述本发明，但这些实施例仅作为解释目的，因为本领域技术人员显然可以对其中的内容进行修改和改变。

实施例

实施例1  Fas配体的表达载体

在上述和附图1中描绘的方法实例中，构建含有编码鼠Fas配体的核酸的重组腺病毒。另外，构建含有编码鼠Fas配体且还编码水母绿荧光蛋白(GFP)的核酸的重组腺病毒，使得最终翻译出融合蛋白。将这种融合蛋白用于监测蛋白质在用所述腺病毒载体转导后的培养细胞和动物组织中的表达和定位。

三种不同的肿瘤细胞系分离自乳腺癌患者，它们均对使用所述腺病毒载体的Fas配体疗法表现出高度的敏感性。这一结果表明可以使用这些方法有效治疗或杀灭肿瘤细胞。平行进行的实验还证明几种前列腺癌细胞系对Fas-介导的凋亡极其敏感，因为使用腺病毒介导将编码Fas配体的核酸导入这些细胞，可以将这些细胞完全杀灭。

实施例2：使用复合腺病毒载体进行的FasL-GFP融合蛋白的受控转运

Fas配体(FasL)诱导表达Fas受体的细胞凋亡，而且其在免疫反应、变性和淋巴组织增生性疾病和肿瘤发生中起重要作用。它还涉及免疫特异性位点的生产且由此对基因疗法领域而言具有意义。我们描述了表达鼠FasL和绿色荧光蛋白(GFP)融合体的可复制缺陷型腺病毒载体的构建和特征。FasL-GFP保留了野生型FasL的全部活性，同时使得在活细胞和固定细胞中的肉眼观察和定量更为便利。该融合蛋白处于四环素调节的基因表达系统的控制下。通过创建新型A双重组Ad载体来进行严格控制，其中将tet-效应元件和反式激活蛋白插入同一载体的相对的端以避免增强子的干扰。可以便利地以剂量依赖性方式使用四环素或其衍生物调节表达。所述载体能够在体外有效转运FasL-GFP基因且通过培养基中强力霉素的浓度来调节融合蛋白的表达水平。这种调节使得我们通过抑制在CrmA表达细胞系中FasL的表达而生产了高滴度的载体。在所测试的全部细胞系中均显示出凋亡的诱导作用。这些结果表明我们的载体是用于基于FasL的癌症基因疗法和用于研究FasL/Fas-介导的凋亡和免疫特异性的有潜在价值的工具。

材料和方法

细胞：HeLa细胞和293细胞获自美国典型培养物保藏中心(分别为ATCC CCL-2.1和ATCC CRL-1573)并将其作为单层维持在37℃下和5％CO2中的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Gibco BRL)中，该培养基中补充了10％小牛血清(BCS；HyClone)和1％青霉素/链霉素(Cellgro)。将培养的大鼠成肌细胞维持在补充了20％胎牛血清(FBS；HyClone)和1％青霉素/链霉素和1％两性霉素的H-21(Cellgro)培养基。

为了进行DNA转染，使用LipofectAMINE(Gibco BRL)、按照制造商的说明书以5×10⁵个细胞/孔接种6孔平板(Greiner)且此后转染24小时。

为了生产表达细胞因子应答调节物A(CrmA)的293细胞系，将pCrmA-I-Neo转染入HEK293细胞。通过以0.4g/L将G418加入到培养基中4周来选择Neo阳性克隆，结束时取出各个克隆、使其增殖并根据其对FasL-诱导的凋亡的耐受性检测CrmA的表达。

质粒和重组腺病毒载体的构建：

载体pEGFP-1和pEGFP 1-C1获自Clontech。它们含有野生型绿色荧光蛋白(wt GFP)基因的红移变体(red-shifted variant)，具有较亮的荧光和″人源化″密码子选择。(Zhang，G.，V.Gurtu和S.R.Kain.1996“增强的绿色荧光蛋白允许对哺乳动物细胞中的基因转移进行敏感性检测”(″An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of genetransfer in mammalian cells.″)(《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem Biophys Res Commun)227：707-11。)在本实施例中将这种蛋白质称作″GFP″。在基因库中得到的小鼠FasL cDNA序列位于Bluescript(Invitrogen)载体中。载体pUHD10-3和pUHD15-1(Gossen，M.和H.Bujard，“通过四环素效应启动子严格控制哺乳动物细胞中的基因表达”(″Tight control of gene expression in mammalian cells bytetracyclineresponsive promoters″)-《美国国家科学院学报》(Proc NatlAcad Sci USA)89：5547-51，1992)获自Clontech。通过插入编码pEGFP-C1中GFP序列的小鼠Fas配体读框下游aa 11-aa 279的DNA以产生pC.GFsl来构建GFP-FasL融合基因。将来自pC.GFsI的融合基因插入pUHD10-3以产生p10-3.GFsl。pcDNA3载体中的牛痘病毒(Chordopoxvirinae)细胞因子应答效应物A(crmA；CPV-W2)cDNA获自Genentech。从pcDNA3中切下CrmA基因并插入pIRES-Neo载体(Clontech)而生成pCrmA-I-Neo。

将GFP、FasL、FasL-GFP和LacZ基因克隆入E1穿梭载体pLAd-CMV以分别形成pLAd-C.Gf、pLAd-C.Fsl、pLAd-C.GFsl和pLAd-C.Lz构建体(附图1A)。从pUHD15-1中提取Tet-OFF融合活化子蛋白表达盒并将其插入pLAd-CMVie而生成pLAd-C.tTA。从p103.GFsl中切下GFP-FasL融合基因表达盒并在Ad5的右侧ITR与E4之间的转基因插入处，插入到穿梭载体pRAd.mcs中。所得构建体称作pRAd-T.GFsl(附图1B)。

Ad/FasL-GFP^TET载体的装配如附图1C中所示。使用类似策略构建本研究中所用的其它rAd基因组。所有载体均基于Ad5sub360(AE3)，其中另外缺失了除ORF6外的所有E4ORFs。(Huang，M.M.和P.Hearing.1989)。腺病毒早期区域4开放阅读框6/7蛋白通过直接复合调节细胞转录因子E2F的DNA结合活性。(《基因开发》(Genes Dev)3：1699-710)。病毒载体的增殖：

使用含有rAd载体DNA的连接混合物、应用LipofectAMINE法转染提供反式Ad5E1a和E1b功能的293细胞(Graham，F.L.，J.Smiley，W.C.Russell和R.Naim；“通过来自人5型腺病毒的DNA转化的人细胞系的特征”(″Characteristics of a human cell line transformed by DNA fromhuman adenovirus type 5″)(《遗传病毒学杂志》(J Gen Virol)36：59-74，1977)。培养转染的细胞直到观察到与腺病毒相关的致细胞病变效应(CPE)为止(一般在7-14天)，在该时间点收集细胞。然后通过标准技术进行载体增殖和扩增。在293或293CrmA细胞上滴定原液并且评价噬斑以将载体产率确定为PFU/ml。如果合适，还使用GFP荧光或X-gal染色来滴定载体。在两种情况中，滴度估计值完全符合PFU/ml。

蛋白质印迹分析：

给10cm平板(Greiner)接种10⁶个初级大鼠成肌细胞的细胞。24小时后，以感染多重度(MOI)为2使平板感染Ad/FasL-GFP^TET或对照载体。感染后24小时将该平板用PBS洗涤2次。收集细胞并使之在含有50mMTris-HCl(pH 7.8)、1mM EDTA、2％SDS、0.1％溴苯酚蓝、1mM PMSF(Sigma)、50μg/ml亮异蛋白酶肽(Sigma)、2μg/ml抑酶肽(Sigma)和1ng/ml胃酶抑制剂(Sigma)的细胞裂解缓冲液中裂解。将样品煮沸5分钟，在每个8％SDS-PAGE微型凝胶(BioRad)的泳道中加入原始量(10⁶个细胞)的1/10，使该步骤在20mA下进行3小时。人重组FasL(C-末端)获自SantaCruz Laboratories。使用半干的凝胶转移装置(BioRad)将该蛋白质转到硝化纤维膜(Pharmacia Biotech)上。通过在含有10mM Tris-HCl(pH 7.5)、140mM NaCl、3％(w/v)BSA、5％(w/v)奶粉、0.2％(v/v)Tween-20(Amresco，Solon，OH)和0.02％(w/v)叠氮化钠(Sigma)的溶液中保温而将该膜封闭。使用封闭溶液按1∶100稀释多克隆兔抗-FasL抗体(Santa Cruz)并在环境温度下与所述膜一起保温2小时。用10mM Tris-HCl(pH 7.5)和140mMNaCl溶液将印迹洗涤2次，然后与按1∶10000稀释的、共扼了HRPO(Caltag，Burlingame，CA)的羊抗兔IgG一起温育。使该印迹在ECL试剂(Amersham Life Science)中显影过夜并用KodakX光片观察。

凋亡的检测：

通过使用原位细胞死亡检测试剂盒AP(Boehringer Mannheim)、按照制造商的说明书来完成对培养的粘着细胞的凋亡的早期检测。该试剂盒使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)法将荧光素导入游离3′-OH DNA末端，并使用与碱性磷酸酶共扼的抗荧光素抗体检测它。在底物反应后，可以使用光学显微镜观察染色细胞。

结果：

FasL和FasL-GFP蛋白的功能分析：

为了证实Fas配体-GFP(FasL-GFP)融合蛋白保留了全部FasL活性，我们已经通过使用将DNA瞬时转染入对Fas-介导的凋亡敏感的细胞而分析和比较FasL和FasL-GFP蛋白的功能。使用表达FasL、GFP-FasL或作为对照品的GFP-半乳糖苷酶的载体转染一式三份孔的HeLa细胞。在转染后24小时，将细胞固定并通过使用TUNEL试剂盒对凋亡进行分析。一般来说，如通过使用pcDNA3-LacZ转染的细胞的X-Gal染色所测定，获得了10-25％的转染效率。用表达FasL或FasL-GFP的载体转染的大量HeLa细胞显示出凋亡形态(诸如膜起泡且粘着力下降)且在TUNEL试验中染色呈阳性。极少量感染了对照质粒的细胞发生凋亡。用FasL-GFP载体转染的孔中凋亡细胞的数量以可再现的方式与用FasL载体感染的那些细胞的数量相似，从而提示野生型蛋白和融合蛋白具有可比的活性。

腺病毒载体的构建和特征：

我们的目的是生产大量的FasL表达可以得到调节的腺病毒载体。这种调节使FasL在靶细胞中的表达水平得到控制且由此有利于对其生物效应的研究。此外，预计在293细胞中以组成型方式表达FasL或FasL-GFP的rAd载体的扩增可产生低的滴度，因为FasL表达引起产生病毒的细胞的凋亡。Muruve，D.A.，A.G.Nicolson，R.C.Manfro，T.B.Strom，V.P.Sukhatme和T.A.Libermann.(1997)“全身给药后Fas配体的腺病毒介导的表达诱导肝凋亡且离体的凋亡感染胰岛同种异体移植物和同种移植物”(″Adenovirus-mediated expression of Fas ligand induceshepatic apoptosis after Systemic administration and apoptosis of ex vivoinfected pancreatic islet allografts and isografts″)-《人类基因疗法》(HumGene Ther)8：95563。为了实现FasL-GFP的受控表达，我们设计了Ad/FasL-GFP^TET载体，其中由TRE启动子表达FasL-GFP。Gossen，M.和H.Bujard.(1992)“通过四环素效应启动子严格控制哺乳动物细胞中的基因表达”(″Tight control of gene expression in mammalian cells bytetracycline-responsive promoters″)-《美国国家科学院学报》(Proc NatlAcad Sci USA)89：5547-51。我们将CMVie启动子驱动的tTA基因(“tet-关闭”元件)插入Ad5E1区且TRE-控制的FasL-GFP融合蛋白接近右侧ITR。

这种策略基于如下考虑。首先，这种策略使用单一载体而不是如上所述的两种Ad载体来转运完整的tet-调节的表达系统。Harding，T.C.，B.J.Geddes，D.Murphy，D.Knight和J.B.Uney.(1998)“使用腺病毒四环素可调节系统接通转基因表达”(″Switching transgene expression in the brainusing an adenoviral tetracycline-regulatable system″)，参见《国家生物技术》(Nat Biotechnol)16：553-5备注。单一载体的应用使得向靶细胞的转运更为有效且对蛋白质表达的调节更为均匀。这种策略还在CMVie启动子与TRE启动子的增强子元件之间实现了最大可能的分离，从而将FasL-GFP蛋白的背景(未调节的)表达减少到最低限度(附图1B和1C)。通过在Ad5基因组的右侧端放置TRE启动子，获得了与位于Ad5包装信号内的E1A增强子元件相似的结果。Hearing，P.和T.Shenk.1983。5型腺病毒E1A转录控制区含有重复的增强子元件。《细胞》(Cell)33：695-703。已经报导了这些元件与克隆入E1区的某些启动子发生相互作用。Shi，Q.，Y.Wang和R.Worton.(1997)“腺病毒载体中细胞启动子的特异性和活性的调节”(″Modulation of the specificity and activity of acellular promoter in an adenoviral vector″)-《人类基因疗法》(Hum GeneTher)8：403-10。

如附图1C所示，以大规模连接反应体外组装用于本发明的重组腺病毒载体基因组。然后对这些基因组进行凝胶纯化并转染入293细胞且使所得的培养物进行增殖，直到观察到病毒诱导的CPE为止。就表达-半乳糖苷酶或GFP的载体而言，CPE发生的时间点明显早于表达FasL或FasL-GFP的时间点，从而表明腺病毒载体的复制可能因FasL活性而具有有害的影响。按照已有的技术扩增原始载体储备液，并提取重组腺病毒DNA且使用限制酶消化液检验结构完整性。

293细胞中Ad/FasL和Ad/FasL-GFP^TET的滴度一般低于Ad/LacZ或Ad/GFP的滴度30-100倍。Ad载体的滴度与FasL活性的比较证实：当它们在293CrmA细胞中产生时(附图2)，这些载体的产率明显增加(8-12倍)。正如附图2中所示，293或293CrmA细胞中对照载体Ad/LacZ的扩增使产率基本上相同。随后，在293CrmA细胞中进行具有FasL活性的所有载体的生产和扩增。

通过腺病毒介导的FasL表达诱导凋亡：

为了在功能上证实腺病毒介导的FasL表达，我们用Ad/FasL-GFP^TET以不同的MOI转导HeLa细胞。转导后24小时，分析细胞的凋亡情况。感染了Ad/FasL-GFP^TET的细胞显示出典型的凋亡形态。凋亡细胞的数量随载体滴度的增加而增加。相反，以相同MOI转导了对照载体Ad/LacZ的平板，在过量的未转导的对照品中没有产生凋亡的细胞。通过X-gal染色测定转导的总效率且证实-半乳糖苷酶阳性细胞的数量随MOI的增加而增加。我们已经观察到凋亡的细胞的数量显著高于带有可检测到GFP荧光的细胞或同时转导的X-gal染色细胞的数量。因此，通过感染细胞表面上FasL与其相邻细胞表面上Fas受体的相互作用，导致未感染所述载体而与所述细胞相邻的细胞发生凋亡。

FasL-GFP融合蛋白的检测和细胞定位：

野生型FasL是II型膜蛋白。为了证实FasL-GFP融合蛋白也靶向至细胞膜，我们利用了其GFP成分的荧光，可以使用带FITC滤光片部件的荧光显微镜在活细胞中检测到这种荧光。我们已经将这种技术用于在由rAd载体表达时观察我们的FasL-GFP融合蛋白的表达和细胞定位。在HeLa细胞中，FasL-GFP的表达在接近GFP检测阈值的蛋白质水平上导致凋亡。因此，分析初级大鼠成肌细胞中FasL-GFP的表达，我们发现这些细胞相对耐受FasL-诱导的凋亡。在用Ad/FasL-GFP^TET以MOI为10感染后24小时，在成肌细胞中可以检测到高水平的FasL-GFP表达。在大部分转导细胞中，FasL-GFP的膜相关表达是明显的。相反，GFP自身的荧光模式在细胞质中分布均匀，而通常不分布在细胞核。这些定位差异在较高的放大倍数下的转导的293CrmA细胞中也是明显的。这些结果表明FasL-GFP融合蛋白定向于细胞表面，在那里它以与野生型FasL类似的方式与Fas受体发生相互作用。

由rAd载体调节FasL-GFP的表达：

为了证实本发明的载体具有调节靶细胞中由我们的rAd载体产生的FasL活性的量的能力，我们已经进行了实验来在诱导或非诱导条件下和蛋白质合成与功能水平上建立FasL表达水平。在Ad/FasL-GFP^TET载体中，将FasL-GFP融合蛋白的表达设计成被tetR-VP16融合蛋白(由相同载体的组成型表达；参见附图1C)与最小CMVie启动子的tet-操纵子上游的七聚物结合所激活。Gossen，M.和H.Bujard.(1992)“使用四环素效应启动子严格控制哺乳动物细胞中的基因表达”(″Tight control of geneexpression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters″)-《美国国家科学院学报》(Proc Natl Acad Sci USA)89：5547-51。细胞中存在的强力霉素应抑制这种结合且由此以浓度依赖性方式抑制FasL-GFP的表达。

首先，我们通过蛋白质印迹分析测定了转导细胞中产生的FasL-GFP的量。我们在没有或有四环素衍生物强力霉素存在的情况下以MOI为2使初级大鼠成肌细胞感染了Ad/FasL-GFP^TET。选择低MOI以便使转导了所述载体单拷贝的细胞数量达到最大值。48小时后，使细胞裂解并通过蛋白质印迹分析、使用针对FasL胞外结构域的多克隆抗体分析该裂解物。检测到了大于预计大小的wt FasL的单特异性带。带的强度随强力霉素浓度的增加而降低且在有0.5mg/L或0.5mg/L以上浓度强力霉素存在情况下培养的细胞裂解物中不能检测到这种带。在转导了对照载体的细胞中没有观察到FasL-特异性带。在细胞裂解物或培养基上清液中没有检测到相当于分解或裂解产物的尺寸较小的带。这些结果表明由Ad/FasL-GFP^TET载体在细胞中产生的GFP-FasL蛋白的量可以受到培养基中强力霉素浓度的调节且这种蛋白质是稳定的，而且一旦出现在细胞表面上则不会发生明显的裂解。

我们还分析了FasL活性的调节，即在Fas-阳性靶细胞中诱导凋亡。以MOI为2给HeLa细胞的孔转导Ad/FasL-GFP^TET并在由不同浓度强力霉素存在的情况下培养。在转导后24小时时，分析细胞的凋亡表型。结果证实可以用强力霉素调节转导了Ad/FasL GFP^TET的细胞中凋亡的诱导。

在我们选择的调节蛋白表达系统中，存在的强力霉素抑制了tTA与TRE的结合并以剂量依赖性方式切断了FasL-GFP的转录。我们选择将以组成型方式表达的活化子插入E1区并将FasL-GFP表达盒插入Ad5的E4启动子与右侧ITR之间的新克隆位点，推断这种排列将腺病毒包装区内存在的E1A启动子和TRE上tTA启动子内的CMVie增强子的作用减小到最低限度，并由此在抑制剂存在情况下减少了所述融合蛋白的背景表达。该系统成功地在腺病毒载体内使用，使得FasL-GFP的表达可以通过改变培养基内强力霉素的浓度来有效调节。

在我们的实验过程中，我们已经观察到293细胞对FasL-诱导的凋亡敏感。这种效应起显著限制表达FasL的rAd载体滴度的作用。这一结果即使在将调节的或组织特异性启动子用于表达FasL蛋白时也是确实的，因为高水平的蛋白质表达在293细胞内载体复制过程中是不可避免的。为了克服这一问题，我们已经生产了以组成型方式表达CrmA的293细胞系。这种蛋白质特异性地起抑制半胱氨酸天冬酶的活性的作用，半胱氨酸天冬酶对Fas凋亡途径而言是必不可少。通过在这些细胞中生产我们的含有FasL的载体，我们已经在载体滴度上获得了显著改善。

总之，我们已经开发并测试了在四环素调节的基因表达系统控制下表达新型FasL-GFP融合蛋白的rAd载体。这种载体将向分裂与未分裂细胞的高滴度和有效转基因转运与在活细胞和固定细胞中蛋白质表达的便利调节和融合蛋白的方便检测结合起来。这种载体是用于通过免疫学、移植和癌症疗法治疗疾病的有价值的工具。

实施例3：使用Fas配体融合基因的腺病毒转运的旁观者基因疗法

本实施例描述了使用通过旁分泌/自分泌机制诱导前列腺腺癌发生凋亡(程序性细胞死亡)的Fas配体-融合基因手段的一类旁观者基因疗法。这项工作为治疗前列腺癌(PCa)提供了新型和有效的疗法。此外，可以使用组织特异性启动子获得对前列腺或任意其它组织的特异性以便以非肠道方式转运治疗转移型疾病的病毒。

我们的治疗手段是用E1A、E3和E4缺失的第二代腺病毒转运并表达Fas配体(CD95L-融合基因)。CD95L的表达受到允许在体外和体内进行强力霉素调节的Tet操纵子的控制。本建议中所用的CD95L是这样的鼠CD95L cDNA，在鼠CD95L cDNA的N末端截短了10个氨基酸并且其被融合在这样的框架中，该框架在增强的GFP的C末端带有一个4氨基酸接头。

表1中列出了我们使用5种PCa细胞系的数据且一般性地证实了文献报导(Hedlund等《前列腺》(The Prostate)36：92-101，1998；和Rokhlin等《癌症研究》(Can.Res.)57：1758-1768，1997)，其证实：PCa细胞系对CH-11兴奋剂活性有耐受性。相反，目前我们证实了迄今为止测试的全部5种PCa细胞系中对AdGFP-FasL和C2-神经酰胺的敏感性。

使用MTS测定法测定细胞毒性百分比。简单地说，将细胞接种入含有1ml培养基的12孔平板。在处理前使细胞生长至75％的融合率并用500ng/ml CH-11抗-Fas抗体、500ng/ml正常小鼠血清或30μM C2-神经酰胺处理。为了进行腺病毒转导，以MOI为10-1000用Ad/CMVGFP或Ad/GFP-FasL^TET处理约1×10⁵个细胞/孔。就每一细胞系而言，对阳性对照不作处理并将1ml培养基用作阴性对照。将细胞在37℃下保温48小时以最大限度地杀灭细胞。吸出培养基并用0.5ml新鲜培养基+100μlCell Titer 967Aqueous One Solution试剂/孔替代。在37℃下将细胞再保温1-3小时。保温后，将120μl培养基放入96孔平板并使用Vmax动态微量培养板读出器在490nm处读取吸收度读数。如下计算细胞毒性百分比：％细胞毒性＝[1-(实验孔的OD/阳性对照孔的OD)]×100。为了进行神经酰胺试验，将1×10⁴个细胞/孔接种在96孔平板上。第二天早上洗涤细胞并与100μl的30μM二氢-神经酰胺或C2-神经酰胺一起(稀释自10mM的乙醇原液)在不含血清的RPMI 1640中温育。24小时后，向各孔中加入20μl Celltiter 967Aqueous One Solution试剂并将平板再温育1-4小时。如上所述测定吸收度和％细胞毒性。在每一实验中均将数据点进行一式三份的记录。

结果：

表1中分析的5种PCa细胞系显然对CH-11极不敏感。对剂量为30μl的C2-神经酰胺的敏感性相对一致，从而提示凋亡途径是完整的。最重要的是所有的细胞系均对给予AdGFP-FasL有响应，其中DU145最不敏感。

通过这些实验得到了重要的几点。首先，我们使用FACS分析证实就我们使用的所有细胞系而言，对全部候选PCa细胞系表达了CD95(Fas受体)。其次，我们证实阻断抗体(ZB4)的fas受体不会通过AdGFP-FasL防止诱导凋亡。我们已经使用不同剂量的ZB4进行了几次这种实验，结果始终是病毒在有或没有所述抗体存在下诱导的凋亡程度相同。这一结果提示新合成的CD95-CD95L可能会在达到质膜的途中或在达到细胞表面时作为执行的和功能性凋亡信号复合体在高尔基体中发生相互作用(Bennett等《科学》(Science)282：290-293，1998)。第三，我们的结果证实了不存在有利于PCa中诱导凋亡的腺病毒的内在特性。这一结果通过用对照病毒(AdCMVGFP)+500ng/ml CH11感染PCa而得到证实。结果是CH-11仍然难以诱导凋亡。这些结果表明凋亡仅在CD95⁺-CH11抗性PCa细胞系中发生，此时发生病毒指导的CD95L胞内表达且它不依赖于病毒。

最终和最相关的部分信息涉及我们是否可以给予AdGFP-FasL^TET而不会对受试者产生致死性。这在重要性方面非常关键，因为当以非肠道方式给药时，低至2×10⁸pfu的病毒剂量会杀死小鼠。针对这个问题，使PPC1异种移植物在Balbc nu/nu小鼠体内发育并用不同剂量的AdCMVGFP对照或AdGFP-FasL病毒治疗。从这些单剂量研究中。我们已经证实肿瘤细胞的生长得到延缓或终止。此外，用病毒治疗的14只动物中没有1只因这种病毒而死亡。总之，我们得出结论：我们的Ad5转运系统中的GFP-FasL融合蛋白对治疗PCa具有强有力的治疗潜能。由强力霉素增量调节的AdGFP-FasL类型的研制

以原位方式(orthotopically)将我们目前的病毒用于给予PCa。如果该病毒脱离了肿瘤并进入体内，那么它可能是致死性的，条件是足够的病毒到达网状内皮系统(主要是肝脏)。通过给予强力霉素(dox)，可以减量调节由AdGFP-FasL表达CD95L且避免这种危险。通过使用实施例1中所列的Tet调节元件构建由表现出″极低″基础活性强力霉素诱导的表达载体。相对于GFP-FasL的表达，这种载体在没有dox存在的情况下被完全抑制，且在10ng/ml下开始诱导，最大诱导值为100-500ng/ml。这样的剂量在人体中容易实现(一般剂量水平为1-3μlg/ml)。如果观察到不良作用，则终止给予dox。然而，强力霉素具有16小时的血清半衰期，我们认为添加dox以减量调节Fas配体的表达这一论断，对治疗患者体内的不良作用而言可能是较好的论断，因为我们可以通过非肠道给药在几分钟内迅速获得有效的强力霉素剂量。如果必要，PEST信号的添加可以加速降解(参见Clontech目录)。

方法：

我们用rTSkid B/C和rtTA系统替换了我们目前的Tet阻抑物和操纵子系统(Freundlieb等《基因药物杂志》(J.Gene Med.)1：4-12，1999)。早已指出，我们可以将我们的前列腺特异性启动子(PSA、PSADBam、PB和ARRPB2，附录)放入病毒(取代CMVie)以获得组织特异性，其中仅前列腺内皮细胞能够调节rtTA。通过标准技术使所有病毒从经PCR评价野生型腺病毒为阴性的3X噬斑纯化的样品中生长。使所有病毒在有1μg/ml强力霉素存在情况下在以组成型方式表达牛痘病毒细胞因子应答调节物crmA的HEK 293包装细胞系中生长。Rubinchik等。这对防止在所述的包装细胞系中发生GFP-FasL诱导的凋亡而言是必不可少的。始终通过在CsCl上等密度离心来纯化病毒、通过层析法脱盐、通过过滤浓缩并以少量等分部分形式冻存在10％甘油的PBS中，冻存温度为-80℃。仅使病毒融化一次并在麻醉条件下、通过如上所述以15μl/分钟输注或通过尾静脉使用结核菌素注射器将其给予动物。收集肿瘤和动物组织，如果合适将其制成切片、或者固定并包埋，并且通过H&E进行分析、通过隧道(tunel)试验分析凋亡、并使用免疫染色以便测定嗜中性白细胞浸润和相关的GFP表达。

测试Balbc nu/nu小鼠中前列腺癌同种异体移植物的原始AdGFP-FasL_Tetd(dox减量调节的)。进行这些实验以建立毒理学和功效参数。具体地说，我们将增加剂量的1×10⁹-5×10¹⁰pfu AdGFP-FasL_Tetd输注入75-100mm³肿瘤以便测定：A)原位给予病毒后减少75％或75％以上肿瘤体积所需的最低成功剂量，其中每4天给予1次剂量和3次剂量。肿瘤形成自CD95L敏感性PPC1、即刻敏感性LnCAP C2-4和更具耐受性的Du145细胞系。基于使用始终为肿瘤消退的终点的结果显示给药的其它参数。B)原位给药后的最高耐受病毒剂量(达5×10¹⁰pfu)。C)确定肿瘤是否在以后的时间(6-12个月)的相同或较远的部位上重新发生(C4-2)。D)50％小鼠存活的静脉内给予(尾静脉)的最高剂量。E)使用来自D的数据测试强力霉素给药对动物存活曲线的作用和强力霉素保护作用期限(Balbc nu/nu小鼠对CTL没有响应，所以腺病毒可能长时间存活)。使用应用单侧t-检验的统计学分析。F)通过在有1μg/ml dox存在情况下使用FACS分析监测GFP(作为GFP-FasL融合体)来测定K562细胞(CD95L抗性，参见表1)中GFP-FasL的半衰期。

使用如上所述构建的Tet诱导型病毒进行与如上述B1中所述相同的一组实验。

给予正常实验室小猎犬的AdGFP-FasL_Tetu(增量调节的)和AdGFP-FasL_Tetd(减量调节的)的毒理学测试。尽管存在大量PCa用动物模型，但是只有狗模型可以充分代表病理学和解剖学上的人体疾病。目前已经证实人AdRSVbgal(血清型5)腺病毒可以在体外和体内感染狗内皮细胞，包括前列腺肿瘤细胞。Andrawiss等《前列腺癌与前列腺疾病》(ProstaticCan.Prostatic Dis.)2：25-35，1999。对目前这种Ad/GFP-Fas^TET在狗(免疫活性)与免疫缺失小鼠(Balbc nu/nu)体内的比较，为这种基因疗法手段的人体I期临床试验再次提供了支持。

在下面的部分中，对性成熟正常狗进行实验以便观察将Ad/GFP-FasL^TET正位转运至激素前列腺是否具有最低程度的损害或没有附带的损害。

通过腹部手术手段将纯化的浓缩腺病毒(均为血清型5的增量调节和减量调节的Ad/GFP-FasL^TET和报告基因病毒Ad/CMV-LacZ)注入狗的一叶前列腺。此方法优选跨直肠导入，因为据信对前列腺直接观察可以在首先进行的这一系列实验中使病毒的导入更为精确。其次，由于狗前列腺的高血管密度特性，所以直接进行肉眼观察允许我们使用局部组织粘性物和手指压力来密封针迹，从而防止病毒从注射部位渗漏。基于这些结果，将3D超声引导的跨直肠导入用于模拟提出的人体手段之一。

在400μl的恒定体积中使用5×10⁹；1×10¹⁰、和5×10¹⁰的病毒剂量：2条狗为一组地接受5×10¹⁰pfu的Ad/CMV-LacZ以便对病毒扩散进行组织化学监测。在接近前72小时内监测狗的任何痛苦的症候。收集粪便并通过PCR分析病毒释放情况。另外用foley导管收集尿并通过PCR对293细胞检测释放的病毒。在第7天时使用戊巴比妥钠实施安乐死(2条狗/病毒剂量)并如上所述进行处理。(Andrawiss等《前列腺癌与前列腺疾病》(Prostatic Can.Prostatic Dis.)2：25-35，1999)。将所有的组织样品冷冻在OCT中，而将剩余物固定并进行处理以用于组织学分析(tunel、免疫组织化学)或冷冻储存在-80℃下用于DNA提取和使用病毒特异性引物的PCR。在Ad/CMV-LacZ组中检验LacZ的表达以监测病毒在全身的扩散情况。

实施例4：Ad/GFP-FasL^TET的肿瘤内导入，在小鼠体内抑制了乳腺肿瘤和脑肿瘤生长

在本实验中，我们将10⁶个MCF-7细胞从双侧面植入Balbc nu/nu小鼠(附图6)。当肿瘤大小达到5mm直径时，我们使用Harvard输注泵在超过10分钟的期限内，以15μl/分钟将2×10⁹pfu Ad/GFP-FasL^TET输注入小鼠右侧面上的肿瘤或将2×10⁹pfu Ad/LacZ输注入小鼠左侧面。在注射后3周时，与对照组治疗的肿瘤相比，注射了Ad/FasLGFP^TET的所有肿瘤均显示出了约80-100％的肿瘤消退。特别是在6只治疗小鼠中的4只中，在注射一次后大部分肿瘤块消失(黄色箭头指示的)。在6只小鼠中的另外2只中，对肿瘤生长块的抑制比同一小鼠对照侧面上的肿瘤高80％(黑色箭头指示的)。相反，所有注射了Ad/LacZ的肿瘤在植入后3周时直径均生长至约2cm。对某些小鼠残余肿瘤的组织学分析仅显示了浸润的免疫细胞和成纤维细胞，没有明显的癌细胞残留。这一结果表明可以将FasL-诱导的凋亡用作治疗乳腺癌的新型疗法。

类似地，我们将10⁶个SF767细胞植入了Balbc nu/nu小鼠双侧面。当肿瘤大小达到5mm直径时，我们使用Harvard输注泵在超过10分钟的期限内，以15μl/分钟将2×10⁹pfu Ad/GFP-FasL^TET输注入小鼠右侧上的肿瘤或将2×10⁹pfu Ad/LacZ输注入小鼠左侧。与未治疗的肿瘤相比，经治疗肿瘤内的肿瘤抑制率约为80-100％。相反，所有注射了Ad/LacZ的肿瘤在植入后3周时直径均生长至约2cm。这一结果表明可以将FasL-诱导的凋亡用作治疗脑癌的新型疗法。

实施例5：在体外，癌细胞对FasL-和TRAIL-诱导的凋亡的敏感性比较

在本实施例中，在体外比较了不同癌细胞系(来源于前列腺、子宫颈和肝癌)对FasL-和TRAIL-介导的凋亡的敏感性。

将TRAIL，Ad.TRAIL/GFP^TET的表达载体用于在这些癌细胞中表达TRAIL。附图3中说明了Ad.TRAIL/GFP^TET的构建。与Ad/FasL-GFP^TET相似，该载体含有由E1区中CMV启动子驱动的反式激活蛋白和处于E4区中TRE启动子控制下的TRAIL-IRES-GFP表达盒，这样，可以通过向培养基中添加强力霉素来调节TRAIL和GFP的表达。脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)允许由相同的mRNA转录物表达两种基因。尽管GFP不与凋亡蛋白TRAIL融合，但是其表达与TRAIL的表达相关。由于TRAIL位于GFP和IRES序列之前，其表达水平应高于GFP几倍。Liu等(2000)“以预定水平稳定表达多基因的哺乳动物细胞的产生”(″Generation of mammalian cells stably expressing multiple genes atpredetermined levels″)-《分析生物化学》(Anal.Biochem.)280：20-28。这一结果确保了在可以使用UV显微镜观察到GFP表达的细胞中TRAIL的高水平表达。

为了测定TRAIL表达是否可以诱导癌细胞的凋亡，我们将TRAIL转导入4种不同的癌细胞系：LNCaP(前列腺)、HeLa(子宫颈)、A549(肺)和C3A(肝)。我们用Ad.TRAIL/GFP^TET在相同的MOI为10的情况下感染了这些细胞。所有这些细胞均表现出对TRAIL诱导的凋亡的敏感性，其敏感性水平不同，且这些敏感性看起来低于癌细胞对FasL的敏感性。为了证实这一观察结果，我们已经在平行实验中比较了FasL-GFP与TRAIL在诱导凋亡中的功效。我们用Ad/GFP、Ad/FasLGFP^TET和Ad.TRAIL/GFP^TET以类似的MOI感染了所述癌细胞。与FasL-敏感性研究相似(如上所述)，通过表达GFP的细胞的数量分析这些细胞的敏感性，并且基于在这些初步实验中的细胞形态确定对FasL和TRAIL诱导的凋亡的敏感性。正如附图4中的″TRAIL″组所示，细胞表现出不同水平的凋亡。在所有经测试的细胞中，在Ad.TRAIL/GFP^TET感染孔中发生凋亡的细胞数量少于感染了Ad/FasL-GFP^TET的孔中发生凋亡的细胞数量(用″FasL″标记的组)，从而提示LNCaP、HeLa、A549和C3A细胞对FasL诱导的凋亡比对TRAIL-诱导的凋亡更为敏感。

实施例6.腺病毒介导的TRAIL表达，在癌细胞、而不是正常成纤维细胞中诱导凋亡

认为TRAIL肿瘤疗法的主要优点之一在于据推定TRAIL表达对正常细胞的毒性远低于FasL的毒性，而仍然会诱导肿瘤细胞中的凋亡。为了测试这种″肿瘤特异性″，我们用Ad.TRAIL/GFP^TET以MOI约为10转导了正常人成纤维细胞。我们从包皮样品中获得了初级早期传代的成纤维细胞并对其测试了它们对我们的Ad/FasL-GFP^TET和Ad.TRAIL/GFP^TET载体诱导的凋亡的敏感性。我们已经发现初级人成纤维细胞对FasL-GFP诱导的凋亡十分敏感，使得即使在低转导效率下，它们中的大部分也会显示出标准的凋亡形态(附图5，FasL组)。相反，用表达TRAIL的腺病毒载体转导的初级成纤维细胞基本上不受影响，即使在MOI高于用于转运FasL-GFP的MOI 5倍的情况下也是如此(附图5，TRAIL×5)。我们由此证实了这一发现：即使在来自我们腺病毒载体的高表达水平的情况下，TRAIL也不会在正常细胞中诱导明显的凋亡。这些结果提示载体介导的TRAIL的肿瘤内转运可能甚至比FasL更为安全。

尽管已经参照本发明的某些实施方案的特定记载描述了本发明，但是并不应将这类描述看作对本发明范围的限制，除非它们包含在待批权利要求的范围内。

在本申请中，参照各种公开文献。

将这些公开文献的全部公开内容引入本文作为参考以便更完整地描述本发明涉及的现有技术的情况。

表1：用抗-Fas抗体、C2-神经酰胺(22小时)或Ad/GFP-FasL^TET

     治疗48小时的前列腺癌细胞系中Fas-介导的细胞

             毒性(表示为％细胞毒性SD)

细胞系	正常小鼠血清(500ng/ml)	C2-神经酰胺(30±M，22小时)	抗-FasIgM(CH-11)(500ng/ml)	Ad/CMV-GFP AFP(MOI 100)	Ad/GFP-FasLTET(MOI 100)
						DU145	0.8±7.1	61±5	6.0±10.4	1.9±2.8	69.6±4.5
PC-3	1.3±5.8	76±9	1.3±2.2	0.9±5.0	84.8±1.1
						PPC-1	2.3±0.3	58±7	29.2±2.3	2.3±6.1*	98.0±7.1*
LNCaP	7.5±14.2	ND	11.6±13.7	1.6±3.2	96.4±4.3
						TSU-Prl	-3.5±2.3	72±9	-1.9±2.8	11.6±7.0	81.3±5.0
Jurkat(+ctrl)	2.1±5.3	98±2	72.3±0.9	-19.5±22.5H	93.0±3.4H
						K-562(-ctrl)	-		-	-1.3±5.5H	-11.4±8.1H

^*MOI 10，^HMOI 1000。在全部实验中N＝3(除了在使用TSU和PC-3的神经酰胺实验时，N＝2)。使用MTS测定法测定细胞毒性百分比。简单地说，将细胞接种入含有1ml培养基的12孔平板。在处理前使细胞生长至75％的融合率并用500ng/ml CH-11抗-Fas抗体、500mg/ml正常小鼠血清或30μM C2-神经酰胺处理。为了进行腺病毒转导，以MOI为10-1000用Ad/CMVGFP或Ad/GFP-FasL^TET处理约1×10⁵个细胞/孔。就每一细胞系而言，对阳性对照不作处理并将1ml培养基用作阴性对照。将细胞在37℃下保温48小时以最大限度地杀灭细胞。吸出培养基并用0.5ml新鲜培养基+100μl Cell Titer 967Aqueous One Solution试剂/孔替代。在37℃下将细胞再保温1-3小时。保温后，将120μl培养基放入96孔平板并使用Vmax动态微量培养板读出器在490nm处读取吸收度读数。如下计算细胞毒性百分比：％细胞毒性＝[1-(实验孔的OD/阳性对照孔的OD)]×100。为了进行神经酰胺试验，将1×10⁴个细胞/孔接种在96孔平板上。第二天早上洗涤细胞并与100μl的30μM二氢-神经酰胺或C2-神经酰胺一起(稀释自10mM的乙醇原液)在不含血清的RPMI 1640中保温。24小时后，向各孔中加入20μl Celltiter 96Aqueous One Solution试剂并将平板再温育1-4小时。如上所述测定吸收度和％细胞毒性。在每一实验中均将数据点进行一式三份的记录。

Claims (58)

1.用于诱导TRAIL-介导的癌细胞死亡的方法，该方法包括下列步骤：

将表达载体导入包括表达TRAIL的受体的细胞在内的一组细胞中，所述的表达载体包括编码TRAIL的多核苷酸序列，所表达的TRAIL通过TRAIL与所述受体之间的相互作用诱导那些表达TRAIL受体的细胞死亡。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的TRAIL受体是膜结合受体。

3.权利要求2所述的方法，其中所述的TRAIL受体是DR4或DR5。

4.权利要求1所述的方法，导入了所述表达载体的细胞组包括表达TRAIL受体的细胞与不表达TRAIL受体的细胞的混合细胞。

5.权利要求4所述的方法，其中将所述的表达载体导入不表达TRAIL受体的细胞。

6.权利要求4所述的方法，其中将所述的表达载体导入确实表达TRAIL受体的细胞。

7.权利要求4所述的方法，其中将所述的表达载体导入不表达TRAIL受体的细胞和确实表达TRAIL受体的细胞。

8.权利要求1所述的方法，其中所述的细胞组被包含在实体瘤中。

9.权利要求8所述的方法，其中所述的实体瘤选自乳腺、前列腺、脑、膀胱、胰腺、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、头颈、结肠、胃、支气管和肾的肿瘤。

10.权利要求1所述的方法，其中将表达载体导入所述细胞组的步骤通过非肠道、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌肉内、直肠、经口含化、鼻内、以脂质体方式、通过吸入、阴道、眼内、通过导管或斯滕特固定模的局部转运、皮下、关节内、鞘内或以缓释剂型来进行操作。

11.权利要求1所述的方法，其中导入所述表达载体的步骤是通过将所述表达载体直接注入所述的细胞组中来进行的。

12.权利要求1所述的方法，其中所述的表达载体是质粒。

13.权利要求1所述的方法，其中所述的表达载体是病毒载体。

14.权利要求13所述的方法，所述的病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、牛痘、反转录病毒和单纯疱疹病毒载体。

15.权利要求13所述的方法，所述的腺病毒载体是有能力复制的或无能力复制的腺病毒载体。

16.权利要求1所述的方法，其中TRAIL的表达通过所述载体内的条件启动子来调节，导入了所述表达载体的细胞在适宜激活所述条件启动子的条件下表达TRAIL。

17.权利要求16所述的方法，其中所述的条件启动子是组织特异性启动子。

18.权利要求17所述的方法，其中所述的组织特异性启动子选自前列腺特异性启动子、乳腺特异性启动子、胰腺特异性启动子、结肠特异性启动子、脑特异性启动子、肾特异性启动子、膀胱特异性启动子、肺特异性启动子、肝特异性启动子、甲状腺特异性启动子、胃特异性启动子、卵巢特异性启动子和子宫颈特异性启动子。

19.权利要求16所述的方法，其中所述的细胞组是前列腺癌细胞且所述的表达载体的条件启动子是前列腺特异性启动子。

20.权利要求19所述的方法，其中所述的前列腺特异性启动子选自PSA启动子、ΔPSA启动子、ARR2PB启动子、前盆启动子、gp91-phox基因启动子和前列腺特异性激肽释放酶启动子。

21.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是肝特异性启动子。

22.权利要求21所述的方法，其中所述的肝特异性启动子选自肝清蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、α1-抗胰蛋白酶启动子和运铁蛋白运甲状腺素蛋白启动子。

23.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是结肠特异性启动子。

24.权利要求23所述的方法，其中所述的结肠特异性启动子选自碳酸酐酶I启动子和癌胚的抗原启动子。

25.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是卵巢特异性启动子或胎盘特异性启动子。

26.权利要求25所述的方法，其中所述的卵巢特异性启动子或胎盘特异性启动子选自雌激素效应启动子、芳香酶细胞色素P450启动子、胆固醇侧链分裂P450启动子和17α-羟化酶P450启动子。

27.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是乳腺特异性启动子。

28.权利要求27所述的方法，其中所述的乳腺特异性启动子选自G.I.erb-B2启动子、erb-B3启动子、β-酪蛋白、β乳球蛋白和乳清酸性蛋白启动子。

29.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是肺特异性启动子。

30.权利要求29所述的方法，其中所述的肺特异性启动子是表面活性剂蛋白C尿球蛋白启动子。

31.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是皮肤特异性启动子。

32.权利要求31所述的方法，其中所述的皮肤特异性启动子选自K-14-角蛋白启动子、人角蛋白1启动子、人角蛋白6启动子和罗伊细克林启动子。

33.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是脑特异性启动子。

34.权利要求33所述的方法，其中所述的脑特异性启动子选自胶质原纤维酸性蛋白启动子、成熟星形胶质细胞特异性蛋白启动子、髓鞘质启动子和酪蛋白羟化酶启动子。

35.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是胰腺特异性启动子。

36.权利要求35所述的方法，其中所述的胰腺特异性启动子选自绒毛蛋白启动子、胰高血糖素启动子和胰岛素胰岛淀粉样多肽启动子。

37.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是甲状腺特异性启动子。

38.权利要求37所述的方法，其中所述的甲状腺特异性启动子选自甲状腺球蛋白和降钙素启动子。

39.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是骨特异性启动子。

40.权利要求39所述的方法，其中所述的骨特异性启动子选自α1胶原蛋白启动子、骨钙素启动子和骨唾液酸糖蛋白启动子。

41.权利要求16所述的方法，其中所述的表达载体的条件启动子是肾特异性启动子。

42.权利要求41所述的方法，其中所述的肾特异性启动子选自肾素启动子、肝/骨/肾碱性磷酸酶启动子和红细胞生成素启动子。

43.权利要求16所述的方法，其中所述的条件启动子是诱导型启动子。

44.权利要求43所述的方法，其中所述的诱导型启动子是可由四环素或强力霉素诱导的启动子。

45.权利要求43所述的方法，其中所述的诱导型启动子是可由类固醇诱导的启动子。

46.权利要求45所述的方法，其中所述的类固醇选自糖皮质激素、雌激素、雄激素和孕酮。

47.权利要求16所述的方法，该方法进一步包括创建适于激活所述条件启动子的条件的步骤。

48.权利要求47所述的方法，其中创建适于激活所述条件启动子的步骤包括将四环素或强力霉素转运至所述细胞组。

49.权利要求47所述的方法，其中创建适于激活所述条件启动子的步骤包括将类固醇转运至所述细胞组，所述的类固醇选自糖皮质激素、雌激素、雄激素和孕酮。

50.权利要求1所述的方法，其中所述的表达载体进一步包括报告基因。

51.权利要求50所述的方法，其中所述的表达载体将报告基因表达为带有TRAIL的融合蛋白。

52.权利要求50所述的方法，其中所述的表达载体通过内部核糖体进入位点(IRES)或剪接供体/受体位点机制将所述的报告基因双顺反子地表达为带有TRAIL的单一蛋白。

53.权利要求50所述的方法，其中所述的报告基因编码绿色荧光蛋白。

54.权利要求1所述的方法，其中所述的表达载体进一步含有编码调节蛋白的多核苷酸序列。

55.权利要求54所述的方法，其中所述的表达载体将所述的调节蛋白表达为带有TRAIL的融合蛋白。

56.权利要求55所述的方法，其中所述融合蛋白中的调节蛋白是引起凋亡信号配体组织特异性定位的蛋白质。

57.权利要求1所述的方法，其中该方法以离体方式进行，其中在取自癌症患者的样品中含有导入了所述表达载体的细胞组。

58.权利要求1所述的方法，其中该方法在体外进行，其中在细胞培养物中含有导入了所述表达载体的细胞组。

Images