CN1340059A - 肽 - Google Patents

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E·马丁－伦顿
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Abstract

本发明公开了一种非天然存在的I型重复肽(TRP)和它的表达方法。

Description

肽
本发明涉及能抑制内皮细胞的增殖和迁移的I型重复肽(TRPs)。更具体地，本发明涉及TRPs的体外和体内表达以及它们在预防和/或治疗与血管发生和/或癌症相关的疾病或症状中的用途。
血管生成是转移途径的基本组成。大多数实体肿瘤血管形成得很好，当它们生长时产生新的血管。对于很多肿瘤，血管形成密度可以提供转移可能性的诊断指征，高度血管化肿瘤比血管化不好的肿瘤具有更高的转移发生率。通过生血管激活剂和抑制剂的产生调节肿瘤血管生成(有关综述，参见Zetter，BR1998医学综述年鉴(Annu.Rev.Med.)，49∶407-24)。
认为受控和不受控血管生成以类似方式进行。基膜包围的内皮细胞和外膜细胞形成毛细血管。血管生成随着内皮细胞和白细胞释放的酶对基膜的侵吞而开始。然后，顺着血管腔排列的内皮细胞通过基膜而突出出来。病理学异常的细胞增殖导致局部产生允许血管生成的加强持续生长的因子。举例来说，生血管刺激剂，例如血管内皮生长因子(VEGF)，PDGF和bFGF(Kuwabara等PNAS1995 92 4606)能诱导内皮细胞迁移通过啮蚀状的基膜。迁移细胞形成“萌芽”母血管，在那里，内皮细胞进行有丝分裂和增殖。内皮芽彼此合并形成毛细管环，这样产生新的血管。
血管生成在癌症的转移中起着主要作用这一点是清楚的。癌症特别是癌生长需要血管生成来允许持续生长。抑制癌症疾病进程的一项这样的研究是限制新血管形成过程。如果该生血管活性能被抑制或消除，则肿瘤尽管存在，但是不会生长。在其它疾病状态下，血管生成的抑制能避免新的微血管系统的侵入引起的伤害。这样，针对生血管过程的控制的治疗能导致这些疾病的减轻。
组织生长受到营养供给的限制。在生长中，血管生长保持与组织生长的步调以确保细胞接受正确水平的氧和营养供给。如果细胞增殖超过了血管供给，则细胞变得受到氧的限制。这种氧的限制，称之为含氧量低的应激，引起基因表达中的变化。大多数这些变化涉及基因表达的增加，包括使厌氧呼吸的糖酵解中涉及的那些，还有促进血管生成/血管形成的因子。
举例来说，通过HIF-1转录因子提高的稳定性和接下来的该转录因子与位于VEGF基因的5’UTR的增强子元件，低氧响应元件(HRE)的结合，通过低氧来诱导VEGF转录(Forsythe等MCB 1996 164604，Maxwell等PNAS1997 94 8104)。其它例子还包括PDGF和bFGF(Kuwabara等PNAS1995 92 4606)。尽管对导致基因表达中这些变化的信号传输机理有一些信息，但是该过程还没有完全被理解。
因此需要的是抑制不期望的血管生长特别是肿瘤中的血管生长的方法。这可以通过使用促生血管因子的抑制剂而直接地或者通过鉴定能抑制这些因子的诱导的化合物/小分子而间接地实现。这应该包括在转移前肿瘤中克服内源生长因子(例如，αFGF，βFGF，VEGF，IL-8，GM-CSF)的活性和在肿瘤中抑制毛细血管的生成从而抑制肿瘤生长的方法。还应该包括在其它生血管过程例如伤口愈合和再生中调制毛细血管生成的方法。
对胞外基质分子血小板反应蛋白的抗生血管性质进行了大量的研究。已经证实血小板反应蛋白(TSP)是内皮细胞增殖，游动性和形态发生的抑制因子(Bagavandoss和Wilks1990，生物化学生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)170∶867-72；Vogel等，1993细胞生物化学杂志(J Cell Biochem)53∶74-84；Iruela-Arispe等，1991国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)88∶5026-30)。已经证明TSP的表达与p53表达和与人膀胱癌和神经胶质瘤中血管生成反向相关(Grossfeld等，1997：J.Natl.Cancer Inst.，89∶219)。
尽管已经报道过人TSP-1的I型重复肽(TRPs)图谱中的内肽(internal peptide)诱导细胞增殖和内皮细胞迁移(Tolsma等1993细胞生物学杂志(J.Cell Biol)122∶497-511)，但是从cDNA表达这些肽和这样的cDNA在基因治疗中的用途还没有报道过。
本发明想要提供可以在体外和体内条件下表达并且可以在血管生成和/或癌症的预防和/或治疗中应用的具有抗生血管活性的TRPs。
所附的权利要求书和下面的说明书中描述了本发明的各方面。
因此，一方面，本发明提供一种非天然存在的I型重复肽(TRP)。
如这里使用的，术语“I型重复肽(TRP)”指包括在包含TRP的蛋白质中以一个或多个拷贝(TRP排列)存在的I型重复的内肽。根据本发明，“TRP”可以是肽本身，也可以是融合蛋白的一部分。
根据本发明的术语“非天然存在的”TRP指当其处于天然环境时和核苷酸序列处于也处于其天然环境下的其天然启动子的控制下时不是天然的核苷酸编码序列表达的TRP。
因此，本发明不涵盖当其处于天然环境时和当其由也处于其天然环境下的其天然核苷酸编码序列表达时和当核苷酸序列处于也处于其天然环境下的其天然启动子的控制下时根据本发明的天然TRP。
优选地，TRP是分离的TRP和/或纯化的TRP。
TRP可以从任何天然的或非天然的合适的来源获得或产生，或者其可以是合成的TRP，半合成的TRP，衍生的TRP，或者重组TRP。优选地，非天然TRP包括至少一部分由重组DNA技术制备的TRP或者化学合成技术制备的TRP或者它们的组合。
更优选地，应用重组技术制备非天然TRP。
如这里使用的术语“衍生物”包括TRP的化学修饰物。这样的修饰具体说是用烷基，酰基或氨基置换氢。
本发明的TRP的序列可以和天然存在形式相同，或者其可以是它的变体，同系物，片段或衍生物。
如这里使用的术语“氨基酸序列”指肽，多肽或蛋白质序列或者它的部分。
在一个优选方面，本发明提供基本上由TRP构成的多肽。
本发明还涉及编码本发明的TRP的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列是非天然存在形式。因此，本发明不涵盖当其处于也处于其天然环境下的其天然启动子的控制下时其天然环境下的根据本发明的天然的核苷酸编码序列。
TRP编码核苷酸序列的序列可以和天然存在形式相同，或者是它的变体，同系物，片段或衍生物。优选地，TRP编码序列是分离的TRP编码序列和/或纯化的TRP编码序列。TRP编码序列可以从任何天然的或非天然的合适的来源获得或产生，或者其可以是合成的，半合成的或者重组体。
如这里使用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，和它的变体，同系物，片段或衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的DNA或RNA，其可以是双链或单链的，不管是代表有义或者反义链。核苷酸序列不必须需要是完全的天然存在的DNA序列。因此，DNA序列可以是例如合成的DNA序列，重组的DNA序列(即应用重组DNA技术制备的)，cDNA序列或部分基因组DNA序列，包括它们的组合。DNA序列不需要是一个编码区。如果其是一个编码区，其不需要是一个全编码区。另外，DNA序列可以是有义取向或反义取向。优选地，其是有义取向。优选地，DNA是或者包括cDNA。
优选地，术语“核苷酸序列”指DNA。更优选地，术语“核苷酸序列”指应用重组DNA技术制备的DNA(即重组DNA)。因此，优选地，本发明涉及编码TRP的DNA序列(优选cDNA序列)。
在一个优选方面，本发明提供基本上由TRP编码序列构成的核苷酸序列。
术语“重组体I型重复肽(TRP)”指应用重组DNA技术制备的TRP。
可以根据本发明使用的改变的TRP编码多核苷酸序列可以包括导致编码相同的或功能等价TRP的多核苷酸的不同的核苷酸残基，功能等价TRP，其中可以缺失，插入或取代。
如这里使用的“缺失”定义为其中一个或多个核苷酸或氨基酸分别不存在的核苷酸或氨基酸序列中的变化。
如这里使用的“插入”或“添加”是与天然存在的TRP或TRP编码核苷酸序列相比分别导致添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列中的变化。
如这里使用的“取代”从分别用不同的核苷酸或氨基酸置换一个或多个核苷酸或氨基酸而产生。
TRP的等位基因包括在本发明的范围内。如这里使用的，“等位基因”或“等位序列”是TRP的一种改变形式。等位基因由突变即核苷酸序列中的变化产生，并且通常产生其结构或功能可以改变或可以不改变的改变的mRNAs或多肽。任何给定基因可以没有或者具有一个或多个等位基因。得到等位基因的常见的突变通常归因于氨基酸的缺失，添加或取代。这些改变类型的每一种可以单独发生，或者与其它类型组合发生，可以在一个给定序列中发生一次或多次。
本发明还涉及包括SEQ ID No.1的DNA序列或者这样的序列的等位基因变体的DNA片段。
本发明高度优选的方面涉及包括SEQ ID No.2的氨基酸序列的TRP。例如，本发明涉及纯化的包括SEQ ID No.2的氨基酸序列的TRP。
本发明还涉及包括SEQ ID No.1的DNA序列或者其等位基因变体的DNA。
本发明还涉及包括SEQ ID No.1的DNA序列或者其等位基因变体的非天然DNA。
本发明高度优选的方面涉及包括SEQ ID No.1的DNA序列或者其等位基因变体的重组DNA。
如这里使用的，“免疫活性”定义为天然的，重组的或合成的TRP或者其片段在合适的动物或细胞中诱导特异性免疫应答和/或与特异性抗体结合的能力。
在一个优选的实施方案中，核苷酸序列和/或其TRP是分离的和/或纯化的形式。
如这里使用的，术语“分离的”和“纯化的”指从其天然环境回收和/或与至少一种它们与之天然相关的其它成分分离和/或分开的核酸序列或氨基酸序列分子。
本发明的TRP可以从患者的血清，腹水或尿液等体液中分离，或者可以通过本领域技术人员公知的重组DNA方法或合成肽化学方法制备TRP。蛋白质纯化方法也是本领域公知的。
本发明还涉及通过在其中插入有上述DNA序列或其等位基因变体的转化宿主细胞中表达产生的TRP。
术语“载体”包括表达载体和转化载体。
术语“表达载体”指能体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”指能从一个物种转移给另一个物种的构建体。
根据本发明使用的优选的载体是重组病毒载体，特别是重组逆转录病毒载体(RRV)，例如慢病毒载体，腺病毒载体，腺病毒载体包括和运转录病毒的组合。
术语“重组逆转录病毒载体”(RRV)指具有足够的在包装成分的存在下将RNA基因组包装到能感染靶细胞的病毒颗粒中的逆转录病毒基因信息的载体。
靶细胞的感染包括逆转录和整合到靶细胞基因组中的整合作用。RRV携带非病毒编码序列，其通过载体送递给靶细胞。RRV能在最终靶细胞中独立地复制产生感染逆转录病毒颗粒。通常RRV缺失对于复制必需的gag-pol和/或env基因和/或其它基因。
在进一步广义方面中，本发明提供用于体内基因送递的杂交病毒载体系统，该系统包括一个或多个编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能感染第一靶细胞并且在其中表达第二病毒载体，其中第二载体能转导第二靶细胞。
优选地，第一载体从腺病毒载体获得或者以腺病毒载体为基础和/或第二病毒载体从逆转录病毒载体优选慢病毒载体获得或者以逆转录病毒载体优选慢病毒载体为基础。
术语“定向载体”指其感染/转染/转导细胞或靶细胞中表达的能力局限于宿主生物体中某些细胞类型的载体。
优选地，本发明的核苷酸序列与转录单位可操作连接。
如这里描述的术语“转录单位”是包含编码区和实现这些编码区独立于任何其它编码区而表达的信号的核酸区。因此，每一个转录单位一般至少包括一个启动子，一个任选的增强子和一个多腺苷酸化信号。
术语“启动子”以本领域常规意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。启动子可以包含一个增强子元件。
术语“增强子”包括与转录起始复合物的其它蛋白质成分结合因此有利于其相关启动子指导的转录起始的DNA序列。
术语“细胞”包括任何合适的生物体。在一个优选的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一个高度优选的实施方案中，细胞是人细胞。
术语“转化细胞”指具有被修饰的基因结构的细胞。根据本发明，当向细胞导入了根据本发明的载体时，细胞具有被修饰的基因结构。
术语“生物体”包括任何合适的生物体。在一个优选的实施方案中，生物体是哺乳动物。在一个高度优选的实施方案中，生物体是人。
这里术语“转基因生物体”指包括被修饰的基因结构的生物体。根据本发明，因为向生物体导入了根据本发明的载体，因此该生物体具有被修饰的基因结构。
本发明还提供了一种方法，包括用本发明的核苷酸序列转化宿主细胞。
本发明还提供了一种方法，包括在适合所述核苷酸序列编码的TRP表达的条件下培养用根据本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞。
本发明还提供了一种方法，包括在适合所述核苷酸序列编码的TRP表达的条件下培养用根据本发明的核苷酸序列或者其衍生物，同系物，变体或片段转化的宿主细胞，然后从转化的宿主细胞培养物回收所述TRP。
本发明还提供了产生TRP的方法，该方法包括下面的步骤：a)用根据本发明的核苷酸序列或者其衍生物，同系物，变体或片段转化宿主细胞。b)在适合所述TRP产生的条件下培养转化的宿主细胞和c)从宿主细胞培养物回收所述TRP。
与本发明的核苷酸序列相关的术语“变体”，“同系物”，“衍生物”或“片段”包括从该序列或对该序列的一个(或多个)核酸的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，前提是得到的核苷酸序列的表达产物具有内皮细胞增殖和迁移抑制活性，优选地，具有至少和SEQID No.1(图1)表示的序列的表达产物相同的内皮细胞增殖和迁移抑制活性。
特别地，术语“同系物”涵盖关于结构和/或功能的相同，前提是得到的核苷酸序列的表达产物具有内皮细胞增殖和迁移抑制活性。关于序列同一性(即相似性)，优选具有至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％序列同一性。更优选地，具有至少95％，更优选至少98％序列同一性。这些术语也包括这些序列的等位基因变异。
通过一个或多个序列与另一个序列的简单的“眼球”比较(即“严格”比较)来看一看另一个序列与这些序列是否具有例如至少75％序列同一性来确定有关SEQ ID No.1的序列同一性。
通过商业上可获得的计算机程序也可以测定相对序列同源性，所述程序使用确定同一性的任何合适的算法，使用例如默认参数，能计算两个或多个序列之间的同一性百分率。这样一种计算机程序的一个典型的例子是CLUSTAL。有利地，使用BLAST算法，一些参数设为默认值。BLAST算法详细描述于http：//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast-help.html，其在这里引作参考。检索参数如下定义，可以有利地设定为定义的默认参数。
有利地，当用BLAST评价时，“基本上同一性”等于与至少大约7的EXPECT值相匹配，优选至少大约9，最优选10或更大。BLAST检索中EXPECT的默认阈值通常是10。
BLAST(基础局部算法检索工具)是blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx程序使用的直接检索方法；这些程序使用Karlin和Altschul的统计学方法(参见http：//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast-help.html，)(有几处增强)对它们的发现归于有效意义。该BLAST程序为序列相似性检索而设计，例如鉴定与查询序列的同源性。对于序列数据库的相似性检索中基础项目的讨论，参见A1tschul等(1994)自然遗传学(NatureGenetics)6：119-129。
从http：//www.ncbi.nlm.nih.gov可获得5种BLAST程序，完成下面的任务：
blastp-在蛋白质序列数据库中比较一个氨基酸查询序列。
blastn-在核苷酸序列数据库中比较一个核苷酸查询序列。
blastx-在蛋白质序列数据库中比较一个核苷酸查询序列(两个链)的六-读框概念翻译产物。
tblastn-在六阅读框(两个链)中动态翻译的核苷酸序列数据库中比较一个蛋白质查询序列。
tblastx-在核苷酸序列六-读框翻译数据库中比较一个核苷酸查询序列的六-读框翻译产物。
BLAST使用下面的检索参数：
HISTOGRAM-显示各项检索评分的直方图；默认是(参见BLAST指南中的参数H)。
DESCRIPTIONS-将报道的匹配序列的短描述的数目限制到一具体数目；默认限制是100个描述(参见指南页中的参数V)。
EXPECT-报道对数据库序列匹配的统计学意义阈值；默认值是10，这样10匹配预期只是根据Karlin和A1tschul的随机模型(1990)随机发现。如果统计学意义归于匹配大于EXPECT阈值，则不报道匹配。越低的EXPECT阈值越严格，导致更小的机会被报道。分数值是可以接受的(参见BLAST指南中的参数E)。
CUTOFF-报道高分数片段对的截止分数。从EXPECT值计算默认值(见上文)。只有归于它们的统计学意义至少和具有等于CUTOFF值的分数的长HSP一样高时才对数据库序列报道HSPs。越高的CUTOFF值越严格，导致更小的机会被报道(参见BLAST指南中的参数S)。典型地，使用EXPECT，有效阈值可以更加直觉地设置。
ALIGNMENT-将数据库序列限制到一个具体的数，对它们报道高分数片段对(HSPs)；默认限制为50。如果比这更多的数据库序列满足报道的统计学意义阈值(参见下面的EXPECT和CUTOFF)，只报道归于最大统计学意义的匹配(参见BLAST指南中的参数B)。
MATRIX-将BLASTP，BLASTX，BLASTN和TBLASTX的交替评分模型具体化。默认模型是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff，1992)。正确的交替选择包括：PAM40，PAMl20，PAM250和IDENTITY。对于BLASTN没有交替评分模型；将BLASTN请求中的MATRIX指令具体化返回的是错误的响应。
STRAND-将TBLASTN检索限制为只是数据库序列的顶部和底部链；或者将BLASTN，BLASTX或TBLASTX检索限制为只是询问序列的顶部或底部链上的阅读框。
FILTER-根据Wootton&Federhen(1993)计算机和化学(Computerand Chemistry)17：149-163的SEG程序确定的，屏蔽掉具有低组成复杂性的询问序列的区段，或者根据Claverie&States(1993)计算机和化学(Computer and Chemistry)17：191-201的XNU程序确定的，屏蔽掉由短周期性内部重复组成的区段，或者对于BLASTN，通过Tatusov和Lipmand DUSR程序(参见http：//www。ncbi.nlm.nih.gov)。统计学意义估计从blast输出生物学不感兴趣的报告的滤除(例如命中共有的酸性-，碱性-或富脯氨酸区)，剩下对于对数据库序列特异性匹配有用的询问序列的生物学上更感兴趣的区。
过滤程序发现的低复杂度序列被取代，在核苷酸序列中使用字母“N”(例如“NNNNNNNNNNNNN”)，在蛋白质序列中使用字母“X”(例如“XXXXXXXXX”)。
过滤只应用于询问序列(或者其翻译产物)，而不应用于数据库序列。对于BLASTN默认过滤是DUST，对于其它程序是SEG。
当在SWISS-PROT中的序列应用时，SEG，XNU或者两者根本不屏蔽任何东西不是不常见的，这样，过滤不总是期望得到效果。此外，在某些情况下，在其整体内屏蔽序列，指示报道的对未过滤的询问序列的任何匹配的统计学意义将会被预期。
NCBI-gi-引起在输出中除了登记和/或位置名称外给出NCBI gi标识符。
最优选地，使用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的简单BLAST检索算法进行序列比较。
确定两个序列之间同一性和相似性的其它计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等1984核酸研究(Nucleic AcidsResearch)12：387)和FASTA(Atschul等1990，分子生物学杂志(JMolec Bio1)403-410)。
在本发明的一些方面，当确定序列同一性时没有使用间隔补偿(gap penalties)。
本发明还涉及与这里存在的序列互补的核苷酸序列，或者其任何片段或衍生物。如果该序列与其片段互补，则该序列可以用作鉴定其它生物体相同启动子序列的探针。
本发明还涉及能与这里存在的序列杂交的核苷酸序列，或者其任何片段或衍生物。
杂交指“一个核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”(CoombsJ(1994)生物技术词典(Dictionary of Biotechnology)，StocktonPress，纽约NY)以及如Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995，PCR引物，实验手册(PCR Primer，a Laboratory Manual)，冷泉港出版社，Plainview NY)所述在聚合酶链反应技术中进行的扩增反应。
本发明范围内还包括能在中等至最大严格条件下与这里存在的核酸序列杂交的核苷酸序列。杂交条件基于核酸结合复合物的熔点(Tm)，这一点在Berger和Kimmel(1987，分子克隆技术指南，酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)第152卷，科学出版社，San Diego CA)中教导，并且如下面解释给出确定的“严格性”。
最大严格性一般在大约Tm-5℃(低于探针的Tm5℃)下发生；高严格性在低于Tm大约5℃至10℃；中等严格性在低于Tm大约10℃至20℃；和低严格性在低于Tm大约5℃至10℃下。本领域技术人员应该理解，最大严格性杂交可以用来鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交可以用来鉴定或检测相似或相关的核苷酸序列。
在一个优选的方面中，本发明包括能在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)与本发明的核酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明还包括能与这里存在的序列互补的序列杂交的核苷酸序列。同样，本发明包括能与本发明的序列杂交的序列互补的核苷酸序列。这些核苷酸序列类型是核苷酸序列变体的例子。
在该方面，术语“变体”包括与能与这里存在的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。但是，优选地，术语“变体”包括在严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{0.1xSSC＝0.15M氯化钠，0.015柠檬酸三钠pH7.0))与这里存在的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明证明TRPs在体外和体内条件下可以表达。本发明的TRPs在体外和体内条件下的表达是有利的，因为TRPs可以：
(i)作为抗—生血管治疗剂对患有肿瘤的人或动物施用。
(ii)作为前兆标记物对人或动物血清，尿液或组织监测。
(iii)用作对癌症患者的血清和尿液分析相似抗—生血管分子的基础。
(iv)在治疗血管生成和/或癌症中单独使用或者与治疗有用药物结合使用。
本发明还证实了能抑制内皮细胞增殖和迁移活性的包括TRPs的脑血管生成抑制剂(BAI)3的新的同种型的惊奇发现。
术语“血管生成”指新的血管在组织或器官中生成。在正常的生理条件下，人或动物只有在非常限制的条件下才经历血管生成。例如，正常情况下在伤口愈合，胎儿/胚胎发育和黄体，子宫内膜和胎盘的形成中发现血管生成。
术语“血管生成抑制剂”用来描述能防止血管的生长进入组织例如没有血管化的和血管化肿瘤的任何物质。该术语可以描述一般情况下分子抑制血管生成的能力，例如抑制在生血管刺激剂存在下在培养基中牛和/或人毛细管内皮细胞的生长的能力。该术语包括基质金属蛋白酶(MMPs)这样的物质，其是血管生成和肿瘤转移的天然存在的抑制剂，因为它们有降解胞外基质的能力。
术语“内皮”指位于浆液腔，淋巴管和血管的脂肪内皮细胞的一薄层。
术语“生血管刺激剂”包括但不限于例如能刺激内皮细胞增殖和迁移的血管内皮生长因子(VEGF)，PDGF和bFGF(Kuwabara等PNASl995，92，4606)这样的因子。术语“生血管刺激剂”与术语“促生血管因子(proangiogenic)”互换使用。
为了由于各种各样的原因而改变TRP编码核苷酸序列，本发明的核苷酸序列可以进行基因工程处理，包括但不限于修饰基因产物的克隆，方法和/或表达的改变。例如，利用本领域公知的技术可以引入诱变，例如插入新的限制性酶切位点的定点诱变，来改变糖基化模式或改变密码子偏倚性。
在本发明的另一个实施方案中，编码天然的，修饰的或重组TRP的核苷酸序列可以与异源序列连接来编码一种融合蛋白。例如，为了对肽文库筛选TRP活性的抑制剂，其可以用来编码表达被商业上可获得的抗体识别的异源表位的嵌合TRP。
本发明还涉及包括连接一种亲和性标记物例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，生物素，His6，c-myc标记物(参见Emrich等1993生物化学生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)197(1)：214-220)，血凝素(HA)(如Wilson等1984细胞37 767所述)或FLAG表位(Ford等1991Protein Expt Purif Apr；2(2)：95-107)的TRP或者其酶学活性片段或衍生物的融合蛋白的用途。
在另一个优选的方面，所述融合重组蛋白包括抗原性共蛋白质，例如GST，β-半乳糖苷酶或来自流感嗜血菌的脂蛋白D，它们是相对大的共蛋白质，是可溶解的并且有利于其生产和纯化。或者，所述融合重组蛋白可以包括一种载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。在本发明的一些实施方案中，标记序列是一个六—组氨酸肽，在pQE载体中提供(Qiagen Inc)并且描述于Gentz等(1989PNAS86：821-824)。这样的融合蛋白容易在酵母培养基中表达(如Mitchell等1993酵母5：715-723中所述)并且容易通过亲和层析纯化。一种融合蛋白还可以进行基因工程处理使包含位于编码TRP和异源蛋白质的核苷酸序列之间的切割位点，这样可以将TRP切割并且纯化，离开异源部分。在另一个实施方案中，可以使用完整的结合的融合蛋白进行靶蛋白质的分析。或者，就提供免疫系统产生的刺激作用的意义来说，共蛋白质可以作为助剂起作用。共蛋白质可以连接第一蛋白质的氨基或羧基末端。
虽然标记基因表达的存在/不存在提示核苷酸序列和/或其TRP也存在，其存在和表达应该被证实。例如，如果TRP编码核苷酸序列被插入在一个标记基因序列之中，则包含该TRP编码区的重组细胞可以由标记基因功能的不存在而被鉴定。或者，标记基因可以与TRP编码核苷酸序列串联放置，处于单一启动子的控制下。响应于诱导或筛选的标记基因的表达通常也表明TRP的表达。
定量测定具体分子表达的另外的方法包括放射性标记(MelbyPC等1993免疫方法杂志(J Immunol Methods)159：235-44)或生物素化(Duplaa C等1993生物化学年鉴(Anal Biochem)229-36)核苷酸，控制核酸的共同扩增，试验结果可以在其上进行内插法的标准曲线。通过以ELISA方式进行测定可以加速大量样品的定量测定，在ELISA中感兴趣的TRP以各种稀释度存在，分光光度或量热响应给出快速定量测定。
本发明还涉及就筛选能影响TRP表达或活性的物质来说用于体内或体外生产TRP的包括TRP编码核苷酸序列或者其变体，同系物，片段或衍生物的表达载体和转化的宿主细胞。
根据本发明，TRP编码核苷酸序列，TRP片段，融合蛋白或者其功能等价物，可以用来产生指导其在合适的宿主细胞中表达的重组DNA分子，在本发明的一个实施方案中，编码TRP的本发明核苷酸序列操作连接于能指导TRP编码核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的启动子序列。当插入到宿主细胞中时，可以在合适的条件下培养转化的宿主细胞直到达到足够水平的TRP，然后可以裂解细胞并分离TRP。
利用熟悉的发酵技术和遗传材料序列分析技术可以从细胞分离TRP编码核苷酸序列本身，包括使用寡核苷酸探针和PCR扩增技术，来鉴定已知的靶序列或怀疑与该靶序列具有大的序列同源性的序列。
利用重组DNA技术生产TRP的方法的一个例子具体包括下面的步骤(1)鉴定和纯化包含TRP的蛋白质例如血小板反应蛋白(TSP)’，(2)合成制备用于TRP序列的5’和3’DNA寡核苷酸引物，(3)使用聚合酶扩增TRP核苷酸序列，(4)将扩增的TRP编码核苷酸序列插入合适的载体例如表达载体中，(5)将包含TRP编码核苷酸序列的载体插入能表达TRP编码核苷酸序列的微生物或其它表达系统中，(7)分离重组产生的TRP。上述技术更详细地描述于实验手册，例如“分子克隆：实验手册”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第二版，Sambrook等，冷泉港出版社，1989。
也可以从表达高水平TRP的细胞或组织(例如肿瘤细胞)分离TRP核苷酸序列，通过(1)从组织中分离信使RNA，(2)使用逆转录酶产生相应的DNA序列，然后(3)利用合适引物的PCR扩增TRP编码核苷酸序列。
产生TRP，或者其生物活性片段的另一个方法是通过肽合成。一旦利用下面更详细描述的测定系统发现TRP的一个生物活性片段，就可以例如通过自动肽测序方法测序。或者，一旦例如通过上述方法分离了编码TRP的核苷酸序列，就能确定该DNA序列，其接着提供有关氨基酸序列的信息。因此，如果通过具体方法，例如胰蛋白酶消化而产生生物活性片段，或者如果该片段是N-末端测序的，则可以从相应的DNA序列确定残留的氨基酸序列。
根据本发明可以使用的改变的TRP核苷酸序列包括导致编码相同或功能等价物TRP的核苷酸序列的不同核苷酸残基的缺失，插入或取代。
蛋白质也可以具有产生保守变化并导致功能等价物TRP的氨基酸残基的缺失，插入或取代。只要TRP的生物活性保留，考虑的氨基酸取代可以以残基的极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性和/或两亲性性质为基础进行。例如带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性首基的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
TRP也可以表达为有有利于蛋白质纯化的一个或多个另外的多肽区加入的重组蛋白质。这样的有利于纯化的区包括但不限于金属螯合肽，例如使在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸分子(PorathJ(1992)Protein Expr Purif3-263281)，使在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A区，和在FLAGS扩延/亲和纯化系统(ImmunexCorp，Seattle，WA)中使用的区。纯化区和TRP之间的可裂解连接序列例如因子XA或肠激酶的包函物(Invitrogen，San Diego，CA)对有利于纯化是有用的。
用TRP编码核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合TRP表达和从细胞培养物中回收TRP的条件下培养。重组细胞产生的蛋白质可以被分泌或者细胞内保留，取决于使用的序列和/或载体。本领域技术人员将明白，可以用信号序列设计包含TRP编码核苷酸序列的表达载体，所述信号序列指导TRP编码核苷酸序列通过特别是原核生物或真核生物细胞膜的分泌。其它重组构建可以向编码一个有利于可溶性蛋白质的纯化的多肽区的核苷酸序列连接TRP编码核苷酸序列(Kroll DJ等(1993)DNA细胞生物学(DNA Cell Bio1)12：441-53，参见上述包含融合蛋白的载体的讨论)。
一旦已知TRP的氨基酸序列，则该片段可以通过本领域公知的技术合成，正如“固相肽合成：实施方法”(Solid Phase PeptideSynthesis：A Practical Approach)E.Atherton和R.C.Sheppard，IRL Press，Oxford，英国。类似地，可以合成多片段，将它们依次连接在一起形成更大的片段。这些合成的肽片段也可以用在具体位点的氨基酸取代来制备，为了试验体外和体内诊断和拮抗活性。可以使用具有与组织结合的高亲和性的肽片段来在亲和柱上分离TRP受体。
分离和纯化TRP受体对阐明TRP作用机理是有用的步骤。这有利于开发调制潜在的TRP受体的活性的药物。分离TRP受体使得构建核苷酸探针使用原位和溶液杂交技术来监测受体的位置和合成。
本发明包括具有内皮细胞增殖和迁移抑制活性的所有的TRP衍生物。本发明包括完整TRP，TRP衍生物和生物活性TRP片段。这些包括具有内皮细胞增殖和迁移抑制活性的TRP，其具有氨基酸取代或者具有与氨基酸功能基团连接的糖或其它分子。本发明还包括编码TRP和TRP受体的核苷酸序列，和这些核苷酸序列表达的TRPs。
可以合成不同的片段用于各种应用，包括但不限于下面的：作为开发特异性抗血清的抗原，作为在TRP结合位点有活性的激动剂和拮抗剂，作为与细胞毒性物质连接用于定向杀死结合TRP的细胞的肽。以它们在分子的前缘部的位置为基础筛选包含这些肽的氨基酸序列，并且可用于与抗血清的结合。向不包含酪氨酸或赖氨酸的片段加入酪氨酸或赖氨酸以有利于肽上反应性氨基和羟基的标记。利用GenBank，Brookhaven Protein，SWISS-PROT和PIR数据库将这些肽序列与已知序列相比较来确定潜在的序列同源性。该信息有利于去除与其它分子表现出高度序列同源性的序列，从而在开发对TRP的抗血清，激动剂和拮抗剂中加强高度特异性的效力。
可以在标准微量化学仪器中合成TRPs或TRP片段，并且用HPLC和质谱检查纯度。肽合成方法，HPLC纯化和质谱是本领域技术人员公知的。
TRPs和TRP片段可以在重组大肠杆菌或酵母表达系统中产生，并且用柱层析纯化。
TRPs和TRP片段可以应用标准方法与其它分子偶联。可以用很多技术将TRP的氨基和羧基末端同位素和非同位素标记，例如利用常规技术(酪氨酸残基—氯胺T，iodogen，乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)放射性标记。这些偶联技术是本领域技术人员公知的。以氨基酸上可获得的功能基团为基础选择偶联技术，包括但不限于氨基，巯基，羧基，酰胺，苯酚和咪唑。用来进行这些偶联的各种试剂其中包括戊二醛，重氮化联苯，碳化二亚胺和对-苯醌。
TRPs和TRP片段化学偶联于同位素，酶，载体蛋白质，细胞毒性物质，荧光分子，放射性核苷酸和用于各种应用的其它化合物。应用适合具体反应的不同技术确定偶联反应的效率。例如，使用高比活的氯胺T和Na125I实现用125I对TRP肽的放射性标记。用偏亚硫酸氢钠中止反应并且在一次性柱上将该混合物脱盐。从柱子上洗脱标记的肽并且收集级分。从各级分中取出各等份并且在γ计数器上测定放射性。以这种方法，从标记的TRP肽分离未反应的Na125I。储存具有最高特异性放射性的肽级分用于下面的应用，例如对与TRP抗血清结合的能力的分析。
利用TRPs和TRP片段开发用于从培养的肿瘤细胞分离TRP受体的亲和柱。分离和纯化TRP受体之后进行氨基酸测序。接着，开发核苷酸探针用于插入用于表达受体的载体中。这些技术是本领域技术人员公知的。将TRP受体转染到肿瘤细胞中增强这些细胞对内源或外源TRP的反应性，从而降低转移灶生长速度。
合成的TRP片段具有各种各样的用途。具有高特异性和亲合力的与TRP受体结合的TRP或TRP片段被放射性标记并且用于结合位点的目测和定量测定，利用自动放射照相和膜结合技术。本申请提供了重要的诊断和研究工具。TRP受体结合性质的知识有利于研究与受体连接的转导机理。
另外，用短寿命同位素标记这些肽使得使用正电子发射X射线照相术或其它现代放射照相技术体内观察受体结合位点，为了定位携带TRP结合位点的肿瘤。
这些合成的肽中氨基酸的系统取代得到针对TRP受体的高亲和性肽激动剂和拮抗剂，其增强或消弱TRP对其受体的结合。使用这样的激动剂抑制微转移灶的生长，从而抑制肿瘤的扩散。在不适当血管化的情况下使用对TRP的拮抗剂，来阻断TRP的抑制作用并且可能促进血管生成。该治疗对促进糖尿病患者的伤口愈合具有治疗效果。
肽偶联物的另一个应用是用于多克隆抗血清的生产。例如，使用戊二醛使含有赖氨酸残基的TRPs和TRP片段与纯化的牛血清白蛋白连接。通过测定放射标记的肽的掺入量来测定反应效率。通过透析分离未反应的戊二醛和肽。将该偶联物贮存备用。
本发明的TRPs和TRP片段可以用来产生对TRP特异性的抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。这些与TRPs或TRP受体特异性结合的抗体可以在本领域技术人员公知的诊断方法和试剂盒中使用来检测体液或组织中TRPs或TRP受体的存在或定量测定。可以利用这些试验获得的结果来诊断或预测癌症和其它生血管介导的疾病的发生或复发。
可以产生抗TRPs的抗血清。肽合成和纯化之后，使用本领域技术人员公知的技术产生单克隆和多克隆抗血清。例如，可以在兔，绵羊，山羊或者其它动物中产生多克隆抗血清。与载体分子例如牛血清白蛋白偶联的TRPs，或者TRP本身，与佐剂混合物混合，乳化，并且在背部，颈部，侧腹，有时在足掌多个位点处皮下注射。以有规律的时间间隔进行加强注射，例如每2-4周。每次注射之后大约7-10天，通过静脉穿刺术获得血样，例如使用膨胀后的耳缘静脉。使血样在4℃下凝结过夜并且在4℃下以大约2400×g离心大约30分钟。取出血清，分成等份并且在4℃下贮存以备马上使用或者在-20℃至-90℃下贮存以备接下来的分析。
对产生多克隆抗血清的所有血清样品和产生单克隆抗血清的培养基样品分析确定滴度。通过几种方法确定滴度，例如，使用印迹和密度分析，以及使用放射性标记的肽-抗体复合物的沉淀，用蛋白质A，第二抗血清，冷乙醇或活性炭-葡聚糖，接着用γ计数器测定活性。最高滴度抗血清还用商业上可获得的亲和柱纯化。在亲和柱上TRPs与凝胶偶联。抗血清样品通过柱子，抗-TRP抗体保留与柱子结合。接着洗脱这些抗体，收集并且评价，测定滴度和特异性。
试验最高滴度TRP抗血清，确定下面的情况：a)用于抗血清的最高特异性结合和最低非特异性结合的最佳抗血清稀释度，b)在标准置换曲线中结合递增量的TRPs的能力，c)与相关肽和蛋白质的潜在的交叉反应性，包括纤溶酶原还有相关物种的TRPs，d)在血浆，尿液，组织和在细胞培养基的抽提物中检测TRPs的能力。
使用特异性结合TRPs的抗体的被动抗体治疗可以被用来调制生血管-依赖性过程，例如新生，发育和伤口愈合及组织修复。另外，可以施用针对TRP抗体的Fab区的抗血清阻断内源TRP抗血清结合TRPs的能力。
本发明还包括用于检测和测定生物体液和组织中的TRPs，和用于TRPs在组织中的定位的诊断方法和试剂盒。
也可以在能结合TRP的抗体的检测和定量测定的诊断方法和试剂盒中使用TRPs。这些试剂盒允许检测循环的TRP抗体，其指示在原发肿瘤原位分泌的TRP的存在下微转移灶的扩散。携带这样的循环抗—TRP抗体的患者可能更可能患肿瘤和癌症，并且可能更可能在治疗后和缓解期间复发。这些抗-TRP抗体的Fab片段可以被用作产生抗-TRPFab-片段抗血清的抗原，后者可以用来中和通过抗-TRP抗体对循环TRP的去除。
作为本发明的一部分也涉及测定TRPs的试剂盒。具有最高滴定度和特异性并且可以在血浆，尿液，组织和细胞培养基的提取液中检测TRPs的抗血清可以进一步被检测来容易建立并使用试剂盒来快速，可靠，灵敏和特异性测定和定位TRPs。这些试剂盒包括但不限于下面的技术：竞争和非竞争测定，放射免疫测定，生物发光和化学发光物质测定，荧光测定，夹心测定，免疫放射测定，点印迹，酶联测定，包括ELISA，微量滴定平板，快速监测尿液或血液的抗体包被条或蘸杆，和细胞免疫化学。对于每一种试剂盒，可以确立测定的范围，灵敏性，精确性，可靠，特异性和可重复性。替换或活性的标准曲线上内部测定和相互之间测定变化占20％，50％和80％点。
在研究和临床中通常使用的测定试剂盒的一个例子是放射免疫测定(RIA)试剂盒。成功地将TRP或TRP片段放射碘标记和纯化之后，以几种稀释度向盛有在一个合适的缓冲液体系中含有相对不变量的放射性(例如10000cpm)的试管加入具有最高滴定度的抗血清。其它试管含有缓冲液或免疫前血清来测定非特异性结合。4℃下孵育24小时之后，加入蛋白质A，并且使这些试管涡流搅拌，在室温下孵育90分钟，4℃下以大约2000-2500xg离心以沉淀与标记的抗原结合的抗体的复合物。通过吸出去除上清液并且在γ计数器上测定沉积物的放射性。进一步表征扣除非特异性结合之后的结合大约10-40％标记的TRP或TRP片段的抗血清稀释液。
接着，通过向含有放射性标记的肽和抗血清的试管中加入已知量的肽来评价产生抗血清所用的TRP或TRP片段的稀释范围(大约0.1pg-10ng)。再孵育一段时间例如24-48小时之后，加入蛋白质A并且离心试管，去除上清液并且测定沉积物中的放射性。用未标记的TRP或TRP片段(标准物)替换标记的TRP或TRP片段的结合提供了标准曲线。向测定试管中加入不同浓度的其它TRP片段，来自不同物种的TRP，和同源的肽来表征TRP抗血清的特异性。
本发明的另一个方面是阻断过量内源TRP的作用的方法。这可以通过用对该系统中不期望的TRP特异性的抗体将人或动物被动免疫来进行。这项处理在治疗异常排卵，月经和胎盘形成和血管生成中可能是重要的。这为检查去除TRP对转移过程的影响提供了有用的工具。TRP抗体的Fab片段包含针对TRP的结合位点。利用本领域技术人员公知的技术从TRP抗体分离该片段。将TRP抗血清的Fab片段用作抗原来产生抗-Fab片段血清。输入该抗TRP的Fab片段的抗血清防止TRP与TRP抗体结合。通过阻断TRP与抗TRP的Fab片段的结合通过中和内源抗-TRP抗体而获得治疗上的利益。该项处理的净效果有利于内源循环TRP达到靶细胞的能力，从而减轻转移灶的扩散。
另一种试剂盒用来在组织和细胞中定位TRP。这种TRP免疫组织化学试剂盒提供了说明，TRP抗血清和可能的阻断血清和与荧光分子例如异硫氰酸荧光素或者与用来目测第一抗血清的一些其它试剂连接的第二抗血清。免疫组织化学技术是本领域技术人员公知的。这种TRP免疫组织化学试剂盒允许使用光和电显微镜在组织切片和培养的细胞中定位TRP。这用于研究和临床目的。例如，将肿瘤活组织检查，并且用切片机将组织切片，检查TRP产生的位点。这样的信息对癌症的检查和治疗中的诊断和可能的治疗目的是有用的。
本发明还涉及通过体内调节TRP编码核苷酸序列的基因治疗。例如，通过施用与TRP编码核苷酸序列结合的化合物，或者与TRP编码核苷酸序列相关的控制区，或者改变转录或翻译的速度的其相应的RNA转录本，可以实现表达调节。
例如，本发明的TRP编码核苷酸序列可以处于表达调控元件，通常是启动子或启动子和增强子的表达控制之下。所述增强子和/或启动子在低氧或局部缺血或低葡萄糖环境下可以是优先活性的，这样，TRP编码核苷酸序列优先在具体的感兴趣的组织中表达，例如在肿瘤，关节或者其它局部缺血位点的环境下表达。因此，可以减缓或消除TRP编码核苷酸序列对正在治疗的个体的任何生物学作用或有害作用。对受控表达有贡献的增强子元件或其它元件可以以多个拷贝存在。同样，或者另外，增强子和/或启动子可以在一个或多个特殊细胞型中优先是活性的-例如任何一种或多种巨噬细胞，内皮细胞或者其组合。其它实施例包括呼吸道内皮细胞，肝细胞，肌肉细胞，心肌肌细胞，滑膜细胞，初级乳房内皮细胞和有丝分裂后最后分化的非复制细胞例如巨噬细胞神经元。
增强子和/或启动子可以组成型有效，或者它们的活性受组织或时间的限制。启动子/增强子限制的合适的组织的例子是在肿瘤细胞中高度活性的那些，例如来自MUC1基因，CEA基因或5T4抗原基因的启动子/增强子。时间限制的启动子/增强子的例子是对局部缺血和/或低氧响应的那些，例如低氧响应元件或grp78或grp94基因的启动子/增强子。α-胎儿球蛋白(AFP)启动子也是一种肿瘤-特异性启动子。一个优选的启动子—增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增强子组合。
优选地，本发明的启动子是组织特异性的。即，它们能在一种组织中驱动TRP编码核苷酸序列的转录而在其它组织类型中大量保持“沉默”。
术语“组织特异性”指不是将活性限制于单一组织类型的启动子，但是其从来不表现出选择性，在于它们在一组组织中可能是有活性的而在其它组组织中几乎没有活性或沉默。本发明的启动子的期望的特征是它们在没有激活的低氧-调节的增强子元件的存在下，即使在靶组织中也具有相对低的活性。实现它的一个方法是使用在不存在低氧下抑制选择的启动子的活性的“沉默”元件。
术语“低氧”指一种条件，在该条件之下特殊的器官或组织接受不适当的氧供给。
在特殊启动子的控制下TRP编码核苷酸序列的表达水平可以通过操作该启动子区来调制。例如，启动子区内的不同的结构域可以具有不同的基因调节活性。这些不同区的作用典型地使用携带特殊区缺失的该启动子的不同变体载体构建体评价(即缺失分析)。该方法可以用来鉴定，例如能赋与组织特异性的最小的区或者赋与低氧敏感性的最小的区。
如上所述的多种组织特异性启动子在实施本发明中是特别有利的。在大多数情况下，这些启动子可以作为适合在选择的载体中克隆的常规的限制性酶切消化片段而被分离出来。或者，可以应用聚合酶链反应分离启动子片段。通过在引物的5’末端插入限制性酶切位点可以有利于扩增的片段的克隆。
TRPs和TRP片段可以和用于治疗疾病的其它组合物和方法结合使用。例如，TRPs和TRP片段可以和促生血管因子(生血管刺激物)的抑制剂或者能抑制这样的因子的诱导的化合物/小分子结合使用。如已经提到的，低氧诱导这些促生血管因子/生血管刺激物中的一些的表达。例如，低氧诱导VEGF转录，通过HIF-1转录因子提高的稳定性和接下来的该转录因子与增强子元件的结合，所述增强子元件是位于该VEGF基因的5’UTR中的低氧响应元件(HRE)(Forsythe等MCB1996 16 4604，Maxwell等PANS1997 94 8104)。预期HIF/HRE信号传导途径的潜在的拮抗剂抑制生血管因子的低氧介导的诱导，因此是转录血管化的抑制剂。一系列报道基因构型与HREs连接，并且在各种各样的载体骨架和各种各样的细胞类型中表现出有功能(参见PCT/GB98/02885)。可以将这些报道基因构型用来进行小分子筛选来发现有利地与本发明的TRPs和TRP片段结合的拮抗剂。
TRPs或TRP片段也可以与常规的疾病治疗结合使用。例如，可以对患者依次施用与TRPs或TRP片段结合的手术，放疗或化疗或者TRPs或TRP片段常规治疗肿瘤，以延长微肿瘤转移的休眠期和稳定任何残留的原发性肿瘤。
在同时和相同的位点可以用治疗有效物质送递TRP。或者可以在不同的时间对不同的位点送递TRP和治疗有效物质。甚至可以在用于预防和/或治疗血管生成和/或癌症的相同的送递载体中送递TRP和治疗有效物质。
TRPs或TRP片段可以与用于预防和/或治疗血管生成和/或癌症的细胞毒性物质结合使用。细胞毒性物质例如与TRP，高亲和性TRP片段，TRP抗血清，TRP受体激动剂和拮抗剂连接的蓖麻蛋白为破坏结合TRP的细胞提供了工具。可以在很多位置，包括但不限于微转移灶和原发性肿瘤中发现这些细胞。
TRPs或TRP片段可以与基因治疗中的前药激活酶结合使用。代替在靶组织中选择性表达或者和在靶组织中选择性表达，TRPs或TRP片段可以与编码前药激活酶或在用一种或多种酶对其作用的前药治疗个体之前没有显著影响或没有有害影响的酶的感兴趣的另一个核苷酸序列(NOI)或NOIs结合使用。在活性NOI存在下，用合适的前药对个体治疗导致增强程度的肿瘤生长或存活的减轻。
前药激活酶可以被送递到肿瘤位点来治疗癌症。在一种情况下，与合适的前药激活酶结合在对患者的治疗中使用合适的前药。与载体一起施用合适的前药。前药的例子包括：磷酸表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(用碱性磷酸酶，Senter等1988，国家科学院院刊(Pro Natl AcadSci)85：4842-4846)；5-氟胞嘧啶(用胞嘧啶脱胺酶，Mullen等1994癌症研究(Cancer Res)54：1503-1506)；阿霉素-N-对-羟基苯氧基乙酰胺(用青霉素-V-酰胺酶，Kerr等1990Cancer ImmunolImmunother31：202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸酯(用羧基肽酶G2)；头孢菌素氮芥子氨基甲酸酯(用β-内酰胺酶)；SR4233(用P450还原酶)；9-[1，3-二羟基-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(用HSV胸苷激酶，Borrelli等1988国家科学院院刊(Pro Natl AcadSci)85：7572-7576)；芥子前药(用氮还原酶，Friedlos等1997，药物化学杂志(J Med Chem)40：1270-1275)和环磷酰胺(用P450Chen等1996癌症研究(Cancer Res)56：1331-1340)。
在本发明中使用的合适的前药激活酶的例子包括胸苷磷酸酶，其激活5-氟-尿嘧啶前药capcetabine和furtulon；来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶，其激活9-[1，3-二羟基-2-丙氧甲基]鸟嘌呤；细胞色素P450，其将前药，例如环磷酰胺激活为DNA破坏物质；胞嘧啶脱胺酶，其激活5-氟胞嘧啶。优选地，使用人源酶。
在本发明中使用的其它合适的NOI序列包括治疗和/或诊断应用的那些，例如但不限于编码下面物质的序列：细胞因子，趋化因子，激素，抗体，基因工程免疫球蛋白类分子，单链抗体，融合蛋白，酶，免疫共刺激分子，免疫调节分子，反义RNA，靶蛋白质的转优势阴性突变体，毒素，条件毒素，抗原，肿瘤抑制蛋白和生长因子，膜蛋白，血管活性蛋白和肽，抗病毒蛋白和核酶和它们的衍生物(例如有相关的报道基因基团)。当包括时，这样的编码序列可以典型地与合适的启动子操作连接，所述启动子可以是驱动核酶表达的启动子，或在一种或几种特殊的细胞类型中一种或几种不同的启动子。
NOIs编码的表达产物可以是细胞分泌的蛋白质。或者NOI表达产物在细胞中不分泌并且是有活性的。在两种情况下，优选证明旁观者效应子或远距离旁观者效应的NOI表达产物是优选的；即在一个细胞中表达产物的产生导致近处或远处(例如转移)具有共同的表型的另外的相关的细胞的杀死。
在本发明中在治疗或预防癌症中使用的合适的NOIs包括编码蛋白质的NOIs，所述蛋白质：破坏靶细胞(例如核糖体毒素)，作为：肿瘤抑制剂(例如野生型p53)；抗肿瘤免疫机理的激活剂(例如细胞因子，共刺激分子和免疫球蛋白)；血管生成的抑制剂；或者提供增强的药物致敏性的物质(例如前药激活酶)；天然效应细胞对靶细胞的间接刺激破坏(例如，刺激免疫系统或者将前体物质转化为破坏靶细胞的有毒物质的强抗原)(例如前药激活酶)。编码的蛋白质也破坏旁观者肿瘤细胞(例如用分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒素融合蛋白)，旁观者肿瘤细胞的间接刺激破坏(例如刺激免疫系统的细胞因子或者引起局部血管闭塞的前凝血质蛋白)，或者将前体物质转化为破坏旁观者肿瘤细胞的毒性物质(例如将前药激活为可扩散的药物)。
还有干扰细胞基因的表达使肿瘤存留的反义转录本或核酶的编码NOIs的送递(例如抗非洲淋巴瘤中异常myc转录本和抗慢性骨髓白血病中bcr-abl转录本)。也想到使用这样的NOIs的组合。
治疗或预防局部缺血心脏病中使用的合适的NOIs包括NOIs编码纤溶酶原激活物。用于治疗或预防类风湿性关节炎或脑瘴气的合适的NOIs包括抗炎症蛋白质，抗α肿瘤坏死因子(TNF)抗体，和抗附着分子(例如对于附着分子特异性的抗体分子或受体)的编码基因。
PCT/GB95/00322(WO-A-95/21927)中可以发现低氧可诱导治疗性NOIs的例子。
正如本领域公知的，载体是使或者有利于本体从一个环境转移给另一个的工具。根据本发明，举例来说，重组DNA技术中使用的一些载体使本体，例如DNA的片段(例如异源DNA片段，例如异源cDNA片段)，转移给靶细胞。任选地，一旦在靶细胞中，该载体可以服务于将该异源DNA保持在细胞中，或者可以作为DNA复制的一个单元起作用。重组DNA技术中使用的载体的例子包括质粒，染色体，人工染色体或病毒。
病毒或非病毒技术可以送递载体。
非病毒送递体系包括但不限于DNA转染方法。这里转染包括利用非病毒载体将一个基因送递给靶哺乳动物细胞的方法。
典型的转染方法包括电穿孔，DNA biolistics，脂质介导的转染，紧密的DNA介导的转染，脂质体，免疫脂质体，脂质转染，阳离子物质介导的，阳离子表面亲水脂分子(CFAs)(自然生物技术(NatureBiotechnology)1996 14：556)，多价阳离子，例如精胺，阳离子脂质或聚赖氨酸，1，2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)-胆固醇复合物(Wolff和Trubetskoy1998  自然生物技术(NatureBiotechnology)16：421)和它们的组合。
病毒送递体系包括但不限于腺病毒载体，慢病毒载体或杆状病毒载体。
逆转录病毒的例子包括但不限于：鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，马感染性贫血病毒(EIAV)，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，Fujinami肉瘤病毒(FuSV)，Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)，FBR鼠骨肉瘤病毒(FRB MSV)，Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)，Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)，Avianmyelocytomatosis病毒-29(MC29)，和禽类成红细胞增多症病毒-29(MC29)。
在Coffin等(“逆转录病毒”1997Cold Spring HarbourLaboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp.758-763)中可以发现逆转录病毒的详细目录。
可以将慢病毒分为灵长目动物和非灵长目动物组。灵长目动物慢病毒的例子包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)，人自身免疫缺陷综合症成因物质(AIDS)，和猿免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长目动物组包括原型“慢病毒”绵羊髓鞘脱落病毒/呼吸困难病毒(VMV)，和相关的山羊关节炎-大脑炎病毒(CAEV)，马感染性贫血病毒(EIAV)，和最近公开的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒家族和其它类型逆转录病毒之间的区别在于慢病毒具有感染分裂的和没有分裂的细胞的能力(Lewis等1992EMBO.J11：3053-3058；Lewis和Emerman1994J.Viro1.68：510-516)。相反，其它逆转录病毒-例如MLV-不能感染没有分裂的细胞，例如那些组成例如肌肉，脑，肺和肝组织的细胞。
载体的其它例子包括来自体内的送递系统，包括但不限于DNA转染方法，例如电穿孔，DNA biolistics，脂质介导的转染，紧密的DNA介导的转染。
所述载体可以是质粒DNA载体。或者载体可以是重组病毒载体。合适的重组病毒载体包括腺病毒载体，与腺体相关的病毒(AAV)载体，疱疹病毒载体或者优选的逆转录病毒载体。在病毒载体的情况下，基因送递由靶细胞的病毒感染介导。
本发明的载体可以装配成割裂内含子载体。割裂内含子描述于PCT专利申请GB98/02885(WO99/15684)和GB/98/02867(WO99/15683)。
如果腺病毒的特性与逆转录病毒/慢病毒的遗传稳定性结合，则基本上腺病毒可以用来转导靶细胞，变成为瞬时逆转录病毒产生细胞，其可以稳定感染相邻细胞。本发明这样的经基因工程处理表达TRP和/或NOI(s)的逆转录病毒产生细胞可以移植到生物体中例如动物或人体中用于治疗血管生成和/或癌症。
本发明TRP的剂量取决于治疗的疾病状态或条件和其它临床因素，例如人或动物的体重和条件和施用化合物的途径。根据TRP在特定动物或人体内的半衰期，可以每天几次至一星期一次施用TRP。要明白本发明对人和兽均适用。本发明的方法包括单次和多次施用，同时或者经一段延长时间施用。
适合肠胃外施用的制剂包括含水和不含水灭菌注射液，其可以含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和使得制剂与接受者的血液等张的溶剂；含水和不含水灭菌悬浮液，其可以含有悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，在使用之前只需要立即加入灭菌液体载体，例如注射用水。可以从先前描述过的灭菌粉末，颗粒和片剂类型制备当场用的注射液和悬浮液。
TRPs在治疗血管生成介导的或涉及血管生成的疾病或过程中是有效的。本发明包括用有效量的TRP或TRP激动剂和/或拮抗剂治疗血管生成介导的疾病的方法。利用本领域技术人员公知的配制方法，可以以分离的基本上纯的蛋白质和蛋白质片段在药学可接受组合物中提供TRPs和TRP片段。可以通过标准途径施用这些组合物。这些包括但不限于：口服，直肠，眼(包括玻璃体内或角膜内)，鼻，局部(包括口腔和舌下)，子宫内，阴道或肠胃外(包括皮下，腹膜内，肌内，静脉内，真皮内，颅内，气管内，硬膜外)，经皮，腹膜内，颅内，脑室内，大脑内，阴道内，子宫内或肠胃外(包括静脉内，脊柱内，皮下或肌内)途径。
TRP制剂可以常规地以单位剂量形式存在，并且可以通过常规制药技术制备。这样的技术包括将活性成分和药物载体或赋形剂混合的步骤。一般情况下，通过均匀地首先将活性成分与液体载体混合或者和研细的固体载体或者两者混合，然后，如果需要，将产品成型。
另外，本发明的TRPs可以掺入到使化合物缓释的生物可降解聚合物中，将聚合物包埋在药物预期送递点附近，例如肿瘤位点，或者包埋，使得TRP缓慢地全身释放。所述生物可降解聚合物及其应用详细描述于，例如Brem等，神经外科杂志(J.Neurosurg)74：441-446(1991)。也可以使用渗透小泵通过套管将高浓度的TRPs受控送递到感兴趣的位点，例如直接送到转移生长位点或者送到对肿瘤供给的血管中。
以设计以最大送递量给预期位点的方式灌输与细胞毒性物质连接的肽。例如，通过套管将蓖麻子白蛋白连接的高亲和性TRP片段送递给供应靶位点的血管或者直接送递到靶物中。通过与灌输套管连接的渗透泵以受控方式也送递这样的物质。
优选的单位剂量制剂是如上所述的含有日剂量或单位，日分剂量的那些，或者其合适的施用成分的级分。要明白除了上面特别提到的成分外，就所指的制剂类型来说，本发明的制剂可以包括本领域常规使用的其它物质。
可以在血管生成和/或癌症的治疗中使用含有有效量的本发明的TRP表达产物或TRP编码核苷酸序列的药物组合物。在多种疾病状态，肿瘤转移和内皮细胞异常生长中发生持续的不受调控的血管生成，并且支持这些症状中见到的生理伤害。其中存在不受调控血管生成的多种病理学疾病状态一起分为生血管介导的疾病一组。血管生成介导的疾病包括但不限于：实体肿瘤；血骨肿瘤，例如白血病；肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤，听觉神经瘤，神经纤维瘤，颗粒性结膜炎，生脓的风湿性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣，眼睛生成血管疾病，例如糖尿病视网膜病，视网膜早熟，斑点降解，角膜移植排异，新血管青光眼，晶状体后的纤维组织形成，潮红；Osler-Webber综合症；心肌血管生成；血小板新血管化；毛细管扩张；血友病关节；血管纤维瘤；伤口肉芽；corornay侧突；大脑侧突；动静脉畸形；局部缺血肢血管生成；新血管青光眼；晶状体后的纤维组织形成；糖尿病新血管化；日常细菌相关的疾病，骨折，血管发生，血细胞生成，排卵，月经和胎盘形成。
TRPs用于治疗内皮细胞过量或异常刺激疾病的治疗。这些疾病包括但不限于肠粘着，动脉粥样硬化，硬皮病，疤痕肥大即瘢痕瘤。通过抑制胚胎移植需要的血管生成，TRP可以用作出生控制剂。在作为病理学结果的血管生成疾病例如猫抓痕疾病(Rochele minalia quintosa)和溃疡(Helobacter pylori)的治疗中TRP是有用的。
附图
现在本发明参照下面的附图以举例的方式进一步描述：图1是SEQ ID No.1代表的来自hTSP-1基因的1-型重复的核苷酸序列。通过PCR加入HindII和NotI限制性酶切位点有利于这些片段克隆到哺乳动物表达载体中；图2是人血小板反应蛋白-1(hTSP-1)I型重复肽(TRP)的氨基酸序列(SEQ ID No.3)；图3是hTSP-1TRP的扩增中使用的引物；图4是质粒pSecTag.2A的图示。该质粒包含一个前导序列和c-myc表位标记；图5是hTSP-1调控肽的扩增中使用的引物；图6是使用第三TSP1-型重复的BLAST检索结果；图7是SEQ ID No.2代表的共有TRP氨基酸序列。其也给出了来自人TSP-1(SEQ ID No.3)，KIAA0550(SEQ ID No.4)和KIAA0688(SEQ IDNo.5)的TRPs；图8是使用KIAA0688蛋白质的BLAST检索结果；图9是使用KIAA0550蛋白质的BLAST检索结果；图10是KIAA0550和BAI3蛋白质之间的图示比较；图11是逆转录病毒载体基因组中质粒OB80的构型的示意图；图12是构建重组腺病毒载体的示意图。为了解释，Adeno PGKLacZ是来自插入到Microbix转移载体pE1sp1A中的OB37质粒的OBHRELacZ盒；图13是质粒pONY4慢病毒载体基因组的示意图；图14是质粒pONY2.1慢病毒载体gag-pol表达盒的示意图；图15是包括OBHRE启动子控制下的治疗基因的逆转录病毒XiaGen-P450载体的图谱；图16是HIF/HRE信号传导途径；和图17是包括测定报道基因和用于克隆筛选的标记物的整合的转录盒的构型。
实施例实施例1编码1-型重复片段的表达载体的构建
从人聚A+mRNA扩增相应于人血小板反应蛋白-1(TSP-1)开放阅读框(图2)的cDNA片段。扩增通过RT-OCR进行，其中首先使用逆转录酶(RT)将mRNA逆转录给cDNA，其次，通过聚合酶链反应(PCR)扩增该cDNA。在5’末端携带商售载体pSecTag2.A(Invitrogen，图4)的HindIII位点的读框内和3’末端携带相同载体的NotI位点的读框内设计了在该反应中使用的特异性引物(图3)。产生的质粒称之为pSecTag2-TRP1。
5’HindIII XXA AGC TTX
3’NotI XGC GGC CGC
在相同读框内也将相应于人TSP-1的C-末端部分(图2)的非制管张素对照肽(或者不包含TRP的肽)克隆到上述载体中。设计编码对照肽的一套四个合成的寡核苷酸(图5)并且克隆到用HindIII和NotI酶消化过的pSecTag.2A(图4)，产生pSecTag2-TRP2。
载体pSecTag2包含使TRPs分泌的鼠Ig口链前导序列。其还包含将在TRPs的C-末端插入的c-myc表位。这使得用抗c-myc抗体检测融合蛋白。最后，pSecTag2在c-myc表位下游包含6x组氨酸标记物，其有利于与容易对融合蛋白纯化的Ni2+螯合树脂结合的高亲和性。这些构建体允许从人CMV立即早期启动子-增强子有效地高水平表达重组多肽。
通过标准技术(例如磷酸钙)将质粒转染到293T细胞中，并且通过蛋白质印迹证实在转染的细胞中融合多肽的表达。使用以pSecTag2.A为基础的前列腺-特异性抗原(PSA)表达质粒pSecTag2/PSA(Invitrogen)作为对照。通过一个0.45微米孔径过滤器(MilliporeInc.)过滤转染细胞在其中生长的培养基，并且分析分泌的融合蛋白。使用20微升等份的条件培养基进行10-12％SDS/PAGE。凝胶被电印迹到Immobilon膜(Millipore Inc.)上。使用以1∶1000稀释的抗c-myc小鼠单克隆抗体(Boehringer)和以1/2000稀释的兔HRP结合的抗-小鼠IgG(Dako)进行蛋白质印迹分析。使用ECL试剂盒(Amersham International，UK)进行化学生色团检测。也在转染细胞的总的蛋白质提取物中检测重组融合蛋白的产生。转染细胞用PBS洗涤，溶解于含有1mM新制备的PMSF的RIPA缓冲液，并且使用Bradford’s BioRad试剂(BioRad)，根据厂商的说明，测定总蛋白质浓度。细胞溶解物(20-50微克的总蛋白质)在10-12％SDS/聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。将蛋白质转移到Immobilon膜上，并且如上所述进行蛋白质印迹。实施例2体外内皮细胞增殖测定
通过内皮细胞增殖测定体外测定不同的重组TRPs的抗-生血管作用。先前对于抗生血管因子例如endostatin，一种血管生成内源抑制因子(O’Reilly等1997细胞88∶1)或白细胞介素4(Volpert等1998，实验药物杂志(J.Exp Med)188：1039-1046)描述过类似的方法。
使用人肾细胞系293T，使用pSecTRP表达载体，产生高水平的分泌重组TRPs。通过磷酸钙方法，每10cm2组织培养皿用20微克每一种载体瞬时转染293T细胞。转染后48小时，通过一个0.45微米孔径过滤器(Millipore)从转染的细胞过滤培养基并且加入到内皮细胞。用于本发明的体外内皮细胞增殖测定中的包涵物的内皮细胞包括但不限于人脐静脉内皮细胞(HUYEC)；人真皮微血管内皮细胞(HDMVEC)；和牛肾上腺毛细血管内皮细胞(BACE)。
对于增殖测定，在PBS中洗涤内皮细胞并且分散在0.05％胰蛋白酶溶液中。用含有10％胎牛血清的合适的内皮细胞培养基制备细胞悬浮液(2500细胞/毫升)，涂布在明胶化24-孔组织培养皿(0.5毫升/孔)上并且培养24小时。在合适的生长因子的存在下，该培养基与0.5毫升来自293T转染细胞的一系列条件培养基稀释物和基础培养基一起放置。在将它们分散在胰蛋白酶和将它们再悬浮于Hematall(isherScientific，Pittsburgh，PA)之前将内皮细胞培养72小时。在Counter计数器上计数细胞。实施例3体外内皮细胞迁移测定
该实施例通过体外抑制内皮细胞迁移来测定不同的重组TRPs是否具有抗生血管作用。通过将重组TRPs加入到培养的内皮细胞，即牛肾上腺毛细血管内皮细胞(BACE)，HUVE细胞和HDMVE细胞，测定不同的血管内皮细胞类型的迁移。
使用类似于实施例2的方法，在人肾细胞系293T中产生重组TRPs。通过一个0.45微米孔径过滤器(Millipore)过滤来自转染细胞的培养基并且加入到内皮细胞。该内皮细胞涂布在反转的修饰的Boyden小室中的明胶化Nucleopore膜上(对于BACE是5微米孔，对于其它是8微米孔)。2小时之后，再次反转小室并且将试验物质加入到各孔的顶部。具体地说，细胞群暴露给单独的培养基(对照)，含有10ng/ml bFGF(基础成纤维生长因子)的培养基，或者含有递增浓度的重组TRPs和10ng/ml bFGF的培养基。让细胞迁移3-4小时。之后，固定膜并且染色，计数迁移的细胞数。实施例4 1-型重复肽的鉴定
我们使用了第三1-型重复hTSP-1的氨基酸序列进行序列分析。通过使用高级BLAST2.0网络服务器(Altschul等，1997核酸研究(Nucleic Acide)Res.25，3389-3402)在生物技术信息国家中心(NCBI)进行检索。使用nr数据库进行匹配，其中序列衍生自来自核苷酸数据库的序列的概念性翻译。
使用TSP-1TRP(图6)进行BLAST检索发现来自不同物种的人TSP-1，TSP-1母体和TSP-相关的蛋白质的同一性。也给出与人semaphorin F同系物，Sco-spondin(Bostaurus)和F-spondin的同源性，这些蛋白质都是在中枢神经系统中表达的蛋白质，并且表现出对轴突导向负责。TSP-1TRP也表现出与脑血管生成抑制剂(BAI)1，2和3蛋白质和两种新的人蛋白质KIAA0550和KIAA0688蛋白质有同源性(图7)，所有这些蛋白质都在脑组织中表达。实施例5 1-型重复肽的进一步鉴定
先前描述过BAI1基因的分子克隆和表征(Nishimori等，1997，癌基因(Oncogene)15，2145-2150)。已经证明BAI1特异性地在脑中表达，并且实验中其在大鼠角膜模型中抑制血管生成。在成胶质细胞瘤细胞系中BAI1基因的表达不存在或者明显减少。最近，报道了该家族的另外两个基因BAI2和BAI3的克隆和表征(Shiratsuchi等，1997Cytogenet Cell Genet，79，103-108)，后者在几个成胶质细胞瘤细胞系中不存在。
使用相同的NCBI的BLAST网络系统，使用KIAA0550蛋白质(登记号AB011122)或KIAA0688(登记号AB014588)进行第二序列分析和排列。用KIAA0688进行分析，得到与分泌的包含1型重复TSP-1和与细胞表面抗原MS2和金属蛋白酶同源性的区的蛋白质的同源性(图8)。基质金属蛋白酶(MMPs)构成血管生成和肿瘤转移这两者的天然存在的抑制剂的另一个例子(Powell WC和Matrisian LM1996 Curr TopMicrobiol Immunol 213：1-21)，因为它们有降解胞外基质的能力。
令人惊奇地，用KIAA0550进行分析，得到与BAI3，BAI2和BAI1蛋白质的同源性(图9)。KIAA0550(985aa)和BAI3(1523aa)蛋白质之间的比较证明这两种蛋白质表现出高度的序列同一性(图10)。KIAA0550代表包括两种蛋白质的头967个氨基酸的BAI3的大约2/3，并且包含相同的1-型重复。但是BAI3包含1-型重复下游22个氨基酸的插入物。它们的不同之处还在于C-末端结构域，其中BAI3延伸了另外536个氨基酸。这些发现提示BAI3和KIAA0550可能是相同RNA转录本可变剪接产生的相同的蛋白质的两种异构体。实施例6用于送递1-型重复片段的病毒载体的构建
MLV基载体
通过将来自pSecTRPs的重组TRPs作为NcoI-PmeI片段克隆到OBM80中构建MLV基逆转录病毒载体(图11)。将编码TRP的核苷酸序列插入到OBM80中置换人细胞色素P450。该载体使来自MLV LTR启动子的重组TRP在转导细胞中表达。将载体基因组构建为单一的转录单位，包含IRES和细菌LacZ基因。β-半乳糖苷酶的表达用作转导对照。
在下面的实施例中，使用先前描述的三种质粒转染方法(Soneoka等，1995核酸研究(Nucl.Acids.Res.)23：628)产生VSV-G假型载体。该实验中使用的质粒如下：pHIT60和pRV67分别编码MLV gag-pol核苷酸编码序列和VSV-G包膜(env)糖蛋白核苷酸编码序列(Soneoka等，1995，上文)。在开始实验时，对于6-孔组织培养皿的每一个孔各用pHIT60和pRY67 8微克将8微克的OBM80-TRP共转染。
如先前所述(Soneoka等，1995上文)在人肾细胞系293T中进行转染产生载体颗粒。转染后36小时收集培养上清液并且通过0.45微米孔径过滤器(Millipore)过滤。使用两个细胞系，HT1080细胞和D17细胞，和使用狗黑素瘤细胞系来滴定用VSV-G假型化的逆转录病毒载体。
在每孔用3×105细胞转染之前的这一天将细胞接种到6-孔组织培养板中。向这些细胞加入用合适的质粒向293T细胞转染假型MLV-TRP载体而制备的病毒上清液。在转导时向每一个孔加入1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(8微克/毫升)到用于转染的培养上清液中。转染之后12小时，用新鲜培养基替换培养上清液。为了测定病毒滴定度，洗涤细胞，固定并且在转染之后48小时染色。从β-半乳糖苷酶阳性克隆的数目估计病毒滴度。
腺病毒载体
首先产生的重组腺病毒载体由缺失通常使外源DNA插入与左侧插入的末端重复(ITR)邻接的病毒的左臂中的E1和E3区的病毒组成。病毒包装信号(184-358nt)与E1a增强子重叠，因此在大多数E1缺失载体中存在。该序列可以转运到病毒基因组的右端(Hearing和Shenk，1983，细胞33，695)。因此，在E1缺失载体中可以缺失3.2kb(358-3525nt)。
腺病毒能包装105％长度的基因组，这样使增加额外2.1kb。因此，在E1/E3缺失的病毒载体中克隆能力变为7-8kb。因为重组腺病毒缺失基本的E1早期基因，所以它不能在非-E1补体细胞系中复制。Graham等(1977，J Gen Virol36，59)研究出293细胞系并且从包括ITR，包装信号，E1a，E1b和pIX的Ad5基因组的左端包含大约4kb。该细胞稳定表达E1a和E1b基因产物，但是不表达晚蛋白质，尽管pIX序列在E1b中。在非-补体细胞中E1缺失病毒转导细胞并且运送给细胞核，但是没有从E1缺失基因组表达。
图12中的图说明用来使用Microbix Biosysrems-NBL基因科学体系产生重组腺病毒的一般策略。
一般策略涉及将外来DNA克隆到E1穿梭载体中，在那里外源DNA盒替换了E1区(402-3328bp)。然后用pJM17质粒将该重组质粒共转染到293细胞中。pJM17包含E3区的缺失和原核生物pBRX载体(包括氨苄青霉素抗性和细菌ori序列)以3.7制图单位插入到E1区中的插入。因此该40kb质粒太大不能包装到腺核壳中，但是可以在细菌中增殖。在293细胞中的胞内重组导致用外源DNA插入物替换ampr和ori序列。
这里提到的实施例中使用了两个转移载体。第一个从Microbix获得，称之为pE1sp1A，第二个是从Quantum Biotechnologies获得的pADBN。pADBN质粒的优点在于外源DNA可以在任一方向插入。在两种情况下，第二DNA是腺病毒基因组的缺陷版本，作为质粒(例如pJM17)或者作为病毒DNA的一部分(例如Ad5的右臂)。同源重组产生最后的基因转移载体。
包含治疗基因和报道基因的单一转录单元具有下面的构型，组成型启动子例如CMV驱动的TRP-IRES-LacZ。这些构型插入到pADBN转移质粒(Quantum Biotechnologies)中产生AdeOBTRP-1，-2，-3和-4。重组AdeOBTRPs转移载体被线性化(AseI)，并且和纯化的Ad5病毒(来自ClaI位点)的右臂一起共转染使发生体内同源重组，导致期望的重组腺病毒的产生。通过表达LacZ的靶向细胞的数目测定病毒滴定度。这些构型不排除用不同的报道基因或者另一种治疗基因替代LacZ。
慢病毒载体
TRPs构型到EIAV慢病毒载体pONY4(图13)中，在那里两个基因被表达为单一转录单元和相关的载体pONY2.1(图14)。两者均衍生自感染的原病毒EIAV克隆pAPEIAV19(Payne等，1998，病毒学杂志(J.Vriol)72，483)。单一转录单元具有下面的构型TRPs-IRES-LacZ。慢病毒载体不必须包含报道基因，第二治疗基因可以替代LacZ而包括在其中。如上所述在一个暂时的三质粒体系(Soneoka等，1995，上文)中产生包含pONY-TRP基因组的病毒颗粒。在D17细胞上滴定VSV-G假型化EIAV载体。从β-半乳糖苷酶阳性克隆的数目估计病毒滴定度。
调控的病毒载体
本发明包括调控的病毒载体送递抗生血管TRP的用途。例如NOI和TRP编码核苷酸序列在调控的启动子OBHRE1的控制下表达。Xia-Gen-P450载体基因组用作起始分子。将TRPs克隆到Xia-Gen-P450中置换P450(图15)。该构型使在转导细胞中在HRE启动子控制下表达TRPs。RRV也包含一个报道基因，其是LacZ或者GFP，和一个选择性标记物，其是新霉素抗性基因。如上所述制备病毒颗粒并且用来转导D17细胞。转导的细胞群在正常含氧量(21％氧)和低氧(0.1％氧)下分裂并培养过夜。通过X-gal组织化学将细胞染色并且计算终点滴定度。用β-半乳糖苷酶基因表达计量滴定度并且反映低氧和正常含氧量条件下细胞群之间的基因表达的变化。
实施例7编码与前药激活酶结合的TRPs的病毒载体的构建
本发明不局限于产生编码TRPs的病毒载体。在这些载体中可以构造前药激活酶与TRPs结合。Xia-Gen-P450(图15)包含一个激活抗癌化合物环磷酰胺的人细胞色素的治疗基因。CYP2B6基因由CMV启动子驱动。该治疗基因表达为单一转录单元，其中TRPs从IRES下游克隆并且置换LacZ基因。因此该构型是P450-IRES-TRPs。在该构型中可以使用任何其它前药激活酶。在本发明中任选地使用组成型启动子。另一个构型包括低氧调节的启动子HRE，其能驱动上述单一转录单元的表达。实施例8-神经胶质瘤细胞系的转导
a)  用重组病毒载体转导神经胶质瘤细胞系
    用表达本发明的TRPs，人细胞色素P450或这两者的重组病
毒载体转导人神经胶质瘤细胞系U87MG。在6孔培养皿中接种105
个U87MG细胞，并且向细胞中加入如上所述制备的病毒颗粒培养
24-48小时。在400毫克/毫升遗传霉素存在2星期下筛选稳定转
化的细胞。通过DNA印迹和蛋白质印迹鉴定稳定G418抗性克隆
中的TRPs和/或P450的表达。
b)  体外内皮细胞增殖测定
    在六孔平板中放置HUVEC细胞(105)，并且向1毫升正常HUVE
细胞培养基中加入U87MG，U87MG-neo，U87MG-TRPs，U87MG-
P450和U87MG-TRP/P450的培养上清液稳定转导的神经胶质瘤
细胞。三天之后，用2mCi[3H]胸苷标记HUVE细胞，并且通过闪烁
计数法定量测定掺入进DNA的该化合物。
    在该共同培养分析中，在细胞培养插入物的上室平铺相同的
神经胶质瘤细胞(2x105)，并且在下室平铺HUVE(105)细胞。三天
之后，如上所述标记HUVE细胞，并且测定增殖速度。
c)  U87MG对环磷酰胺(CPA)的体外敏感性
    在微孔皿中接种U87MG，U87MG-neo，U87MG-TRP，U87MG-
P450和U87MG-TRP/P450稳定转导的神经胶质瘤细胞(5x103)，
并且24小时之后用不同剂量的CPA(0-1000mM)处理24小时。接
着将细胞洗涤并向其中加入新鲜培养基。48小时之后，通过锥虫
蓝排除测定评价细胞的死亡。实施例9肿瘤中血管生成的体内抑制
a)  用编码TRPs的载体转导脑内肿瘤
a.1)皮下肿瘤的移植
    在Balb C裸鼠(Nu/Nu)的右侧腹皮内注射悬浮于100毫升
HBSS中的U87MG，U87MG-TRP，U87MG-P450和U87MG-TRP/P450
神经胶质瘤细胞(106)。移植后20天杀死小鼠，并且利用下面的公
式测定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长度[mm]x(宽[mm])2x1/2。
a.2)下肾(subrenal)肿瘤的移植
    用腹膜内注射巴比妥和环巴比妥麻醉Balb C裸鼠(Nu/Nu)，并且
在左肾的下肾内囊注射悬浮于100毫升HBSS中的U87MG，U87MG-
TRPs，U87MG-P450和U87MG-TRP/P450神经胶质瘤细胞(106)。
20天之后杀死小鼠，取出两个肾测定肿瘤体积，重量和多血管状
态。在与抗因子-VIII-相关的抗原(Von Willebrand因子)的抗
体反应的低聚甲醛固定的切片中测定肿瘤多血管状态，并且通过
生物素化次级和ABC目测。苏木素对比染色之后在最高密度脉管
染色的肿瘤区使用200倍光学显微镜计数微血管。
a.3)脑内肿瘤的移植
    用巴比妥和环巴比妥麻醉Balb C裸鼠(Nu/Nu)，并且放置在
立体注射定位仪上，并且使用下面的候选区通过小环孔向右尾注
射悬浮于10毫升HBSS中的U87MG神经胶质瘤细胞(5x103)：前卤
点，2.25mm侧面，2.5mm垂直于硬脑膜。用Hamilton注射器用5
分钟进行注射，并且在缓慢收缩之前再放置5分钟。
b)  用编码两种制管张素肽的载体与P450B6一起转导脑内肿瘤
    并且用CPA处理
    使用相同的环孔和立体注射定位仪，在接受肿瘤注射10毫
升编码(1)neo或(2)TRPs或(3)P450或(4)TRP/P450的重组病毒
(108颗粒或者LFU/毫升)之后4天将小鼠接着分为5个不同的
组。(3)和(4)组中的一半动物在2-4天之后也接受腹膜内注射
CPA(100毫克/毫升)。测定这些动物的成活率并且在急性和慢性
死亡之后对所有组的肿瘤进行组织学检查。利用Kaplan-Meier
成活率曲线的对数排列分析评价不同组之间的统计学意义。实施例10能抑制促生血管因子的物质或能抑制可以与本发明的TRP片段的TRPs结合的这样的因子的诱导的物质的鉴定1.   如图16所示用于筛选增加或干扰HRE依赖性转录的物质的指
示细胞系的选择。选择指示细胞系的筛选来满足下面的要求：(i)  最佳指示细胞系能介导对低氧刺激的强应答，并且在合适的报
道基因上游稳定整合转录盒(测定读出)。该转录单元能与固有性
质的细胞系共同操作以表现出在低氧刺激下具有高诱导报道基
因活性的正常氧张力中低基础活性。这提供了评价在筛选的预定
化合物/小分子的存在下转录响应中的变化的合适的工作范围。
作为转录控制元件特征的例子，OB HRE1(参见
PCT/GB98/02885(WO99/15684))将符合该要求。(ii)优选的靶细胞系优选对低氧刺激有高度响应。这最初可以由瞬
时转染测定或低氧响应转录因子的内源水平来确定，所述低氧响
应转录因子代表性的那些是根据条带移位分析或蛋白质印迹分
析确定的bHLH-PAS家族，例如HIF1a，HIF2a，HIF3a。(iii)细胞系优选在生物学上是稳定的，以保证使用关于培养参数的
简单生产参数下的测定可重复性。此外，优选选择细胞系，使得为
了使其作为广泛用途和实用性的基准细胞系被识别而适合临床
靶组织。插入报道基因盒需要以保持低氧响应控制元件完整这样
一种方式进行。作为结果，使多个拷贝和随机重组的标准转染技
术确实是不合适的。导入这样一个转录盒的优选的方法是通过单
个拷贝逆转录病毒转导的定向整合。如果亲本细胞系的转导在低
感染多重性(MOI)下进行，则可以选择单一拷贝整合体。用上面得到的特征分离克隆
插入筛选标记物有利于具有上面得到的特征的克隆的分离。筛选可以是抗生素抗性标记物，例如新霉素，在这种情况下，可以通过在G418中培养来筛选克隆。更优选的标记物是可以使用FACS技术分辨的标记物，例如GFP或LacZ(使用FDG底物)。理想的是，以和测定用的报道基因一样的方式控制筛选标记物。对于使用IRES序列产生共同调节的双顺反子信息，该调节是有利的。
使用FACS可以分辨的标记物使得快速筛选在低氧诱导下表现出低水平表达并且在正常含氧量中表现出低基础水平的克隆。几轮阳性筛选和阴性筛选有利于能表现出低基础和高可诱导活性的细胞集合的产生。从这样一个细胞集合可以分离单一克隆并且扩增用于最后的筛选。对于细胞基础测定筛选需要clonality。低氧调制的逆转录病毒的构建
病毒制备和转导方法是标准的(参见PCT/GB98/02885(WO99/15684))。图17给出了转导时基因组构型。
用作宿主测定细胞的合适的细胞系包括但不限于T47D细胞系(参见PCT/GB98/02885(WO99/15684))小鼠骨骼肌细胞系C2C12和大鼠肌细胞系H9C2。稳定整合了HRE调控的逆转录病毒基因组的筛选
利用LacZ的表达通过FACS-分辨筛选表现出好的低氧调节的细胞。简要地说，通过在低氧(0.1％)条件下过夜培养而诱导转导的细胞。对该刺激有响应的细胞表达LacZ(参见图17)。可以使用Fluoreporter lacZ流式细胞仪染色试剂盒(分子探针)根据生产商的说明在FACS上检测LacZ表达。分离表现出最高水平表达的细胞，然后又进行几轮阳性FACS筛选。正常含氧量和低氧中分类的细胞的Xgal染色有助于监测筛选。通过使用FACS的阴性筛选去除表现出在非诱导的正常含氧量条件下表达的细胞。这导致表现出紧密调节的异源细胞系。单一细胞克隆使得产生同源细胞群体。这要求保证测定的一致性和细胞系稳定性。筛选测试
LacZ调节的选择也分离类似地调节荧光素酶作为基因组构型的结果的细胞。如下进行使用荧光素酶微量滴定发光计测定的荧光素酶表达检测测定(参见PCT/GB98/02885)：
简要地说，以每孔大约104个细胞(这将取决于细胞类型)在96-孔平板上放置“指示剂细胞”，使得在制备平板之后24-48小时细胞70％汇合。向有相关对照(化合物缓冲液)的重复孔(x4或更大)加入靶化合物。平板重复操作，一个在正常含氧量下培养过夜(例如18小时)，另一个在低氧下培养过夜。通过加入荧光素酶测定溶解缓冲液就地溶解细胞(在生产商指南中给出，然后测定荧光素酶活性)。
从正常含氧量和低氧平板获得的数据表明了低氧诱导与对照(没有加入化合物或者加入对照缓冲液)的比较的调节作用。
结论低氧响应基因表达的抑制
我们设计了一个高产出测定，其使得快速筛选能抑制HIF/HRE信号传导途径的分子，如图16所示。该测定可以通过干扰HRE依赖性基因的转录来鉴定在以新血管生成为基础的疾病例如癌症的治疗中使用的候选化合物。这些分子可以与本发明的TRP或TRP片段结合用于治疗血管生成和/或癌症。
该测定可以用来鉴定能作为激动剂或拮抗剂(即调制剂)在图16给出的一些其它治疗靶物途径中起作用的化合物。这些治疗靶物途径包括但不限于遍在蛋白化，蛋白酶降解，激酶/磷酸酶，二聚化，DNA结合，转录复合体的形成，与p300相互作用，使用含血红素蛋白的氧感应测定，氧化还原反应和/或激酶信号传导途径。
序列表
SEQ ID No.1是编码图1所示人TSP-1TRP的核苷酸序列。
SEQ ID No.1是图7所示的共有TRP氨基酸序列。该共有氨基酸序列(SEQ ID No.2)从容易并且确切匹配的相同长度的20个不同的TRP序列衍生。至少10个序列共有相同残基。
图7也给出了SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，和SEQ ID No.5。
上面说明书中提到的所有的公开物在这里引作参考。不超出本发明的范围和精神，本发明所述方法和系统的多种修饰和变化对于本领域技术人员是显而易见的。尽管本发明结合具体优选的实施方案进行了描述，但是应该明白本发明权利要求不只是局限于这些具体的实施方案。事实上，在分子生物学和相关领域显而易见的进行本发明的所述方式的多种修饰也包括在下面的权利要求书的范围内。

Claims (38)

1.一种非天然存在的I型重复肽(TRP)。
2.根据权利要求1的TRP，其至少包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者它的变体，同系物，片段或衍生物。
3.根据权利要求2的TRP，其中TRP包括SEQ ID No.2所示的序列。
4.根据权利要求1的TRP，其包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或者它的变体，同系物，片段或衍生物。
5.根据权利要求1-3任一项的TRP，其中TRP包括SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或者它的变体，同系物，片段或衍生物。
6.根据权利要求1-3任一项的TRP，其中TRP包括SEQ ID No.5所示的氨基酸序列或者它的变体，同系物，片段或衍生物。
7.编码根据权利要求1-6任一项的TRP的核苷酸序列。
8.编码TRP的核苷酸序列，其中核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列或者它的变体，同系物，片段或衍生物。
9.编码TRP的核苷酸序列，其中核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。
10.能与根据权利要求7-9任一项的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或者与可杂交核苷酸序列互补的序列。
11.根据权利要求7-10任一项的核苷酸序列，其中核苷酸序列与启动子可操作连接。
12.包括根据权利要求7-11任一项的核苷酸序列的构建体。
13.包括权利要求7-11任一项的核苷酸序列的载体。
14.包括权利要求7-11任一项的核苷酸序列的质粒。
15.包括权利要求7-11任一项的核苷酸序列的宿主细胞。
16.包括权利要求7-11任一项的核苷酸序列的宿主生物体。
17.根据权利要求1-6任一项的TRP的制备方法，包括表达根据权利要求7-11任一项的核苷酸序列，或者当存在于权利要求12-13任一项的发明主体中时也进行表达，任选地分离和/或纯化TRP。
18.根据权利要求17的方法产生的TRP。
19.与抗根据权利要求1-6或权利要求18之任一项的纯化的TRP的抗体起免疫反应的TRP。
20.鉴定一个本体是否是TRP的测定方法，其中该测定方法包括：
(a)在一定条件下将内皮细胞孵育足够时间使得细胞进入在培养基中生长的对数期；
(b)将生血管刺激物加入到培养基中诱导内皮细胞增殖和迁移；
(c)加入该本体；
(d)鉴定该本体是否能够体外抑制内皮细胞增殖和迁移活性，这样体外抑制内皮细胞增殖和迁移活性表明该本体是TRP。
21.根据权利要求20的测定方法，其中所述测定是筛选在血管生成和/或癌症的治疗中有用的TRP。
22.一种方法，包括下面的步骤：
(a)进行根据权利要求20或权利要求21的测定；
(b)鉴定一种或多种能体外抑制内皮细胞增殖和迁移活性的TRPs；和
(c)制备一定量的那些一种或多种TRPs。
23.一种方法包括下面的步骤：
(a)进行根据权利要求20或权利要求21的测定；
(b)鉴定一种或多种能体外抑制内皮细胞增殖和迁移活性的TRPs；和
(c)制备含有那些一种或多种鉴定的TRPs的药物组合物。
24.一种方法包括下面的步骤：
(a)进行根据权利要求20或权利要求21的测定；
(b)鉴定一种或多种能体外抑制内皮细胞增殖和迁移活性的TRPs；
(c)修饰那些一种或多种鉴定的能体外抑制内皮细胞增殖和迁移活性的TRPs；和
(d)制备含有那些一种或多种修饰的TRPs的药物组合物。
25.通过权利要求20或权利要求21的测定方法鉴定的TRP。
26.根据权利要求1-6或权利要求18或权利要求19或 25任一项的TRP，其中TRP是血管生成抑制蛋白(例如人血小板反应蛋白-1，脑血管生成抑制因子1，脑血管生成抑制因子2和脑血管生成抑制因子3)。
27.根据权利要求26的TRP，其中脑血管生成抑制因子是脑血管生成抑制剂3的一种同种型。
28.用TRP体内影响血管生成和/或癌症的方法；其中在体外测定方法中TRP能抑制内皮细胞增殖和迁移活性；和其中体外测定方法是权利要求20或权利要求21定义的测定方法。
29.根据权利要求1-6或权利要求18或权利要求19或 25-27之任一项的TRP制备药物组合物的用途。
30.含有TRP和另一种治疗有效药剂的药物组合物。
31.根据权利要求30的药物组合物，其中所述另一种治疗有效药剂是前药激活酶。
32.根据权利要求31的药物组合物，其中所述另一种治疗有效药剂是能抑制促生血管因子或这样的因子的诱导的药剂。
33.根据权利要求29或权利要求30的药物组合物，其中TRP是根据权利要求1-6或权利要求18或权利要求19或权利要求25-27之任一项的TRP。
34.TRP与前药激活酶或编码该酶的目标核苷酸(NOI)或能抑制促生血管因子或这样的因子的诱导的药剂结合治疗与血管生成和/或癌症相关的症状的用途。
35.TRP在制备用于治疗与血管生成和/或癌症相关的症状的权利要求29或权利要求33的药物组合物中的用途。
36.可从含TRP的蛋白质获得的TRP，其中TRP不是血小板反应蛋白(TSP)TRP。
37.包含TRP的融合蛋白。
38.基本上如这里所述的和参照附图的TRP。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110227159A (zh) * 2018-03-05 2019-09-13 义慧科技(深圳)有限公司 改善实体肿瘤对抗血管药物耐药性的药物及CPT1a抑制剂在其中的应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7696307B2 (en) * 2004-04-12 2010-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Function and regulation of ADAMTS-1
WO2008157572A2 (en) * 2007-06-19 2008-12-24 Emory University A method of treating abnormal angiogenesis via the bai family of proteins and their protein fragments
WO2010017332A2 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Radioprotectants targeting thrombospondin-1 and cd47

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5491130A (en) * 1992-11-10 1996-02-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Peptide inhibitors of fibronectin and related collagen-binding proteins
JPH11508126A (ja) * 1995-05-23 1999-07-21 モルフォシス ゲゼルシャフト ファー プロテインオプティマイルング エムベーハー 多量体タンパク質

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110227159A (zh) * 2018-03-05 2019-09-13 义慧科技(深圳)有限公司 改善实体肿瘤对抗血管药物耐药性的药物及CPT1a抑制剂在其中的应用
CN110227159B (zh) * 2018-03-05 2021-09-21 义慧科技(深圳)有限公司 改善实体肿瘤对抗血管药物耐药性的药物及CPT1a抑制剂在其中的应用

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PB01 Publication
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication