CN101144081B - 核苷酸分子trail及其在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种可以特异性杀伤肿瘤细胞但对正常细胞无明显毒副作用的蛋白质多肽TRAIL(Tumor Necrosis Factor-Apoptosis InducingLigand)，以及利用基因工程原理表达纯化该TRAIL多肽和开发以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体以TRAIL为“弹头”的口服基因治疗技术。该多肽主要是由人TRAIL基因编码产物的部分细胞外区域所组成。TRAIL可以非常有效地诱导肿瘤细胞凋亡；减毒鼠伤寒沙门氏菌可作为载体介导TRAIL在肿瘤细胞中表达并杀伤肿瘤细胞。此技术可用于肿瘤的靶向基因治疗。

Description

核苷酸分子TRAIL及其在制备治疗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种可以特异杀伤肿瘤细胞但对肿瘤细胞无毒副作用的核苷酸分子及其表达产物，以及利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体表达该核苷酸分子用于肿瘤靶向基因治疗的技术。

背景技术

肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国内外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对肿瘤的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。

TRAIL(Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Inducing Ligand)是肿瘤坏死因子家族成员之一，实验证据表明TRAIL通过诱导细胞凋亡而特异性地杀伤肿瘤细胞，但对正常细胞无明显的毒副作用，因而被认为是一个非常具有开发前景的抗癌药物。

减毒鼠伤寒沙门氏菌被证实它不仅可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长，同时也可作为工程菌运输载体来表达外源基因且具有良好的肿瘤细胞靶向性，因而，减毒伤寒沙门氏菌介导的肿瘤基因治疗将会为癌症的治疗开辟一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡但对正常细胞无毒副作用的核苷酸分子。

本发明的另一目的是提供一种可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡但对正常细胞无毒副作用的多肽类药物。

本发明的另一目的是提供上述核苷酸分子的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述核苷酸分子介导的肿瘤靶向基因治疗技术。

本发明提供了一种核苷酸分子(其全长核苷酸序列见NCBI NM003810)。本发明中的核苷酸分子为部分核苷酸片段(#283-843)其序列如SEQ.ID.NO.1所示，其表达产物具有抗肿瘤活性。本发明中将核苷酸分子对应的基因称为TRAIL。

在本发明中，术语“TRAIL核苷酸分子”指其表达产物具有抗肿瘤活性并且其序列具有如SEQ.ID.NO.1所示序列或者其简并序列的核苷酸分子。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的ORF(开放阅读框)中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1序列的ORF核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ IDNO.2所述的序列。该术语还包括其表达产物具有抗肿瘤活性并且其序列具有如SEQ.ID.NO.1所示序列的核苷酸分子的变异形式。这些变异形式不影响其表达产物的抗肿瘤活性，包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明还提供了一种多肽，该多肽是上述TRAIL核苷酸分子的表达产物。较好的，该多肽的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

在本发明中，所述多肽是分离提取后的基本纯的TRAIL多肽。“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“TRAIL多肽”指具有抗肿瘤活性且含有如SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有抗肿瘤活性且含有如SEQ ID NO.2序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括TRAIL多肽的活性片段和活性衍生物。

本发明还提供TRAIL多肽的类似物。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括TRAIL多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内TRAIL多肽的表达。

本发明还提供了一种表达TRAIL核苷酸分子的载体。该载体含有TRAIL核苷酸分子。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。可以选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。包括真核载体、原核载体和病毒载体等。

如本文所用，“可操作地连于”指这样?种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同yi,gif线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。yi,gif般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌及伤寒沙门氏菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CH零,gif细胞、C零,gifS细胞等。常用的病毒宿主，如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒(lenti-virus)等。

另yi,gif方面，本发明还提供了TRAIL核苷酸分子的制备方法，即通过常规PCR对人cDNA文库进行扩增得到TRAIL核苷酸分子。例如，采用人肾cDNA文库作为扩增模板。

PCR扩增引物对应于TRAIL多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度yi,gif般为15-50个核苷酸。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。通常，可先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

本发明从人cDNA表达文库筛选到上述编码序列(561bp)，利用常规基因工程技术表达该蛋白，该多肽分子量约为19KD(图1)。所述常规基因工程技术表达方法，可以按照如下步骤进行：

(1)通过PCR对人肾cDNA表达文库进行筛选，得到TRAIL核苷酸分子的cDNA克隆；

(2)将六聚组氨酸纯化标签引入该(1)所述cDNA克隆的N-端，并克隆到原核表达载体中；

(3)在原核宿主中复制表达，收集裂解液；

(4)纯化并且经透析复性后最终得到目的多肽。

另一方面，本发明还提供了TRAIL核苷酸分子及其表达产物在制各治疗肿瘤药剂中的应用。本发明所用TRAIL核苷酸分子即561bp的cDNA片段而非整个TRAIL基因，该部分片段用于治疗肿瘤尚无报道。

本发明的TRAIL可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡但对正常细胞基本无毒副作用。本发明的TRAIL可以用于诱导人结肠癌细胞、人胰腺癌细胞、肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、骨肉瘤细胞、人急性T淋巴细胞性白血病细胞和人急性早幼粒白血病细胞等肿瘤细胞的凋亡。

本发明的一个实施例中，用不同浓度的TRAIL处理人结肠癌(HCT116)细胞4小时，流式细胞仪检测结果提示TRAIL可以非常显著地诱导细胞凋亡；10ng/ml TRAIL处理4小时便可诱导60-70％人结肠癌(HCT116)细胞发生凋亡；随着TRAIL浓度的增加其诱导细胞凋亡的效率增强(图2)。

本发明的另一个实施例中，检测了TRAIL在减毒鼠伤寒沙门氏菌及哺乳动物细胞中的表达及其诱导的细胞凋亡。本发明用PCR的方法来检测TRAIL在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达，结果提示与空白对照菌株比较，TRAIL可在减毒鼠伤寒沙门氏菌中表达，其PCR产物为561bp(图3)。表达TRAIL的减毒鼠伤寒沙门氏菌感染人肿瘤细胞(HeLa)后，可诱导明显的肿瘤细胞凋亡；随着感染时间的增加，更多的肿瘤细胞发生凋亡(图4，5)。以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体以TRAIL为“弹头”的口服基因治疗试药可以抑制肿瘤细胞在体内的生长。由于减毒鼠伤寒沙门氏菌可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖同时它是兼性厌氧菌可在肿瘤组织的缺氧区生长。所以通过口服给药后，减毒鼠伤寒沙门氏菌可由肠道通过不同途径到达肿瘤部位进而持续表达TRAIL，从而提高药物的肿瘤靶向性和效率。

本发明中，所述的治疗肿瘤药剂为肿瘤靶向基因治疗药物。

本发明中，将含有效应用量的TRAIL多肽分子和药学上的载体或者赋形剂就组成了治疗肿瘤药剂。

本发明中，可以首先将TRAIL核苷酸分子克隆到真核表达载体中，然后修饰DNA，再次转化入减毒的病毒载体并提取经过修饰的TRAIL核苷酸分子的克隆；最后将上述克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

本发明中，可以首先将TRAIL核苷酸分子克隆到真核表达载体中，然后将重组质粒转化原核宿主LB5000，从LB5000中提取质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌终宿主SL3261，并分离纯化含有TRAIL核苷酸分子的克隆；最后将含有效治疗量的上述克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

本发明TRAIL核苷酸分子、TRAIL多肽及其类似物等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的TRAIL多肽为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的TRAIL多肽可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的TRAIL多肽还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的TRAIL多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约20毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

常规化疗与放疗方法由于它们的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。本发明提供的这种多肽TRAIL对肿瘤细胞有极高的选择性杀伤作用。因此，是一个非常具有开发前景的抗癌药物。基因工程药物的新剂型和新型给药系统的研制是医药领域寻求创新的一个方向。由于基因工程药物大多是多肽类药物，一般只有注射给药一种途径，这对于长期给药的病人而言极不方便。蛋白多肽药物的鼻腔给药、肺部给药、口服给药等将成为注射给药的替代途径；基因给药则需解决靶向性等一系列十分复杂的技术难题。减毒鼠伤寒沙门氏菌被证实它不仅可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长，同时也可作为工程菌运输载体来表达外源基因且具有良好的肿瘤细胞靶向性，因而，减毒伤寒沙门氏菌介导的肿瘤基因治疗将会为癌症的治疗开辟一条新的途径。以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体将TRAIL特异地导入肿瘤细胞进而抑制肿瘤细胞的生长的技术在国内外均属首创。开发以携带TRAIL的沙门氏菌为口服基因治疗新药不仅解决了蛋白质多肽药物的非注射给药途径的难题更重要的是将会为肿瘤治疗提供一种安全，有效，特异及经济的方法。

附图说明

图1为TRAIL的表达和纯化结果图。TRAIL多肽经表达纯化后，利用SDS-PAGE来检测其纯度。可见，在分子量为19KD处有一条带，即为本发明的TRAIL多肽。图中所示条带分别用1，5，10微克的蛋白质来电泳。

图2为TRAIL诱导人结肠癌细胞凋亡结果图。用图中所示的不同浓度的TRAIL处理人结肠癌HCT116细胞4小时，收集细胞后经PI染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。可见，不同浓度TRAIL处理的人结肠癌HCT116细胞后，所得的G1亚期细胞的百分含量不断增加，并在使用100ng/ml的TRAIL处理后G1亚期细胞的百分含量达到约75％。这说明，TRAIL可抑制人结肠癌细胞增殖，并且其效应随着TRAIL浓度的增加而增强。

图3为TRAIL基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达电泳图。(克隆1与克隆2为两个阳性克隆，左侧第一条带为DNA MARKER)可见，在约561BP处有一条带。

图4为减毒鼠伤寒沙门氏菌诱导肿瘤细胞发生凋亡的流式细胞仪检测结果图。其中，纵坐标为细胞数量，横坐标为染色体数的相对值，“Apoptosis”为凋亡细胞，”Dip G1”为G1期细胞，”Dip G2”为G2期细胞，”Dip S”为S期细胞。CHANNEL(FL2-H)为检测所用的光束参数。该图是图5，即表达TRAIL的减毒鼠伤寒沙门氏菌诱导肿瘤细胞发生凋亡的流式细胞仪检测结果图，的空白对照。

图5为表达TRAIL的减毒鼠伤寒沙门氏菌诱导肿瘤细胞发生凋亡的流式细胞仪检测结果图。纵坐标为细胞数量，横坐标为染色体数和相对值，“Apoptosis”为凋亡细胞，”Dip G1”为G1期细胞，”Dip G2”为G2期细胞，”Dip S”为S期细胞。CHANNEL(FL2-H)为检测所用的光束参数。TRAIL表达载体及空载体转染的减毒鼠伤寒沙门氏菌分别亲染肿瘤细胞72小时，收集细胞后经PI染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。可见，与图4相比，受检测细胞中，凋亡细胞(横坐标约为20处的峰)大大增加。

具体实施方式

实施例1TRAIL基因片段的获得

用PCR从人肾cDNA表达文库扩增出TRAIL的部分cDNA片段，长度为561bp；经过测序后确认。本发明中应用的核苷酸分子为人TRAIL的部分核苷酸片段(#283-843)，其全长核苷酸序列见NCBI(NM003810)。该部分cDNA片段即561BP而非整个TRAIL基因的编码产物，用于治疗肿瘤尚无报道。

实施例2TRAIL多肽的获得

将实施例1所得的核苷酸分子克隆入原核和真核表达载体中表达。

将该基因克隆到原核载体中，在该cDNAN-端引入6×his纯化标签(tag)，然后转化大肠杆菌，筛选阳性转化子。挑取阳性克隆于液体培养基中培养并进行诱导。首先在37℃中生长3小时左右(OD600至0.5-0.6)，用0.5mM IPTG诱导表达。发酵结束后离心收集菌体，裂解菌体以提取包涵体，包涵体经初纯后用Ni-NTA琼脂糖柱亲和纯化，经透析复性后最终得到目的蛋白。用SDS-PAGE来检测蛋白质纯度。

实施例3TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡

人结肠癌细胞HCT116由ATCC提供。细胞株使用GIBCO公司Macoy’s5A完全培养基(含10％小牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)。用不同浓度纯化后的TRAIL处理HCT116细胞4小时，收集细胞后进行常规PI染色，利用流式细胞仪来检测细胞凋亡。

由图5和图4可见，TRAIL可诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡。

实施例4表达TRAIL的减毒鼠伤寒沙门氏菌可诱导肿瘤细胞发生凋亡

用无抗性完全培养基RPMI1640培养HeLa细胞，用250MOI(病毒颗粒数与受试细胞数的比例)的表达TRAIL及阴性对照减毒鼠伤寒沙门氏菌感染细胞3小时，随后用含有抗生素及100μg/ml G418的完全培养基来培养细胞。在不同的时间点来分别感染细胞，检测表达TRAIL的减毒鼠伤寒沙门氏菌对肿瘤细胞凋亡的诱导。

由图5和图4可见，表达TRAIL的减毒鼠伤寒沙门氏菌可较好的诱导肿瘤细胞凋亡。

序列表

<110>复旦大学

<120>核苷酸分子TRAIL及其在制备治疗肿瘤药物中的应用

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>561

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(561)

<223>

<400>1

<210>2

<211>187

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Claims (8)

1.一种核酸分子，其特征在于，该核酸分子的序列如SEQ.ID.NO.1所示，其表达产物具有抗肿瘤活性。

2.一种多肽，其特征在于，该多肽是权利要求1所述核酸分子的表达产物。

3.一种含有如权利要求1所述的核酸分子的载体。

4.一种如权利要求1所述核酸分子的制备方法，其特征在于，通过常规PCR对人cDNA文库进行扩增得到如权利要求1所述的核酸分子。

5.一种如权利要求1所述核酸分子在制备治疗肿瘤药剂中的应用。

6.一种如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的治疗肿瘤药剂为肿瘤靶向基因治疗药物。

7.一种如权利要求5所述的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的核酸分子克隆到真核表达载体中，然后将重组质粒转化原核宿主LB5000，从LB5000中提取质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌终宿主SL3261，并分离纯化含有权利要求1所述的核酸分子的克隆；最后将含有效治疗量的上述克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

8.权利要求2所述多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用，是将含有效应用量的权利要求2所述多肽和药学上的载体或者赋形剂组成治疗肿瘤药剂。

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