CN101525380B

CN101525380B - 近江牡蛎体内抗人类肿瘤HL60的sTRAIL蛋白质及其引物

Info

Publication number: CN101525380B
Application number: CN2009100974830A
Authority: CN
Inventors: 吴信忠; 杨受保
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2029-04-07
Also published as: CN101525380A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供近江牡蛎体内抗人类肿瘤HL60的sTRAIL蛋白质及其引物。该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；编码该蛋白质的基因具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列本发明还用于扩增权利要求2所述蛋白质的基因的寡聚核苷酸引物。本发明利用基因工程技术开发的牡蛎中sTRAIL蛋白质产品，对HL60肿瘤细胞具有杀伤性强、特异性高、安全性好、能够大量生产、易于贮存等优点。

Description

近江牡蛎体内抗人类肿瘤HL60的sTRAIL蛋白质及其引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种近江牡蛎体内抗人类肿瘤急性早幼粒白血病细胞株(HL60)的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质及其引物。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称为凋亡素2配体(APO2 ligand，APO-2L)(Wiley et al.，1995；Pitti et al.，1996)，其胞外结构域在金属蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的细胞因子sTRAIL(SolubleTRAIL)，sTRAIL具有TRAIL的生物学功能(Bodmer et al.，2000)。TRAIL是TNF超家族中一类重要的跨膜细胞因子(Wiley et al.，1995；Pitti et al.，1996)，可选择性地引起人类大多数肿瘤细胞发生细胞凋亡：包括脑、肾、肝、肺、胃、结肠、乳腺、前列腺、胰腺、胆管、宫颈、皮肤和造血系统来源的肿瘤细胞，而对正常细胞无或仅具有极低的毒性(Dphil，2007；马远方，2007)。

我国是水产大国，牡蛎等贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一。根据联合国粮农组织(FAO)的数字显示，我国每年牡蛎的产量具全世界首位，达到300多万吨(湿重)，占我国海洋水产养殖总产量(约1000万吨)的约三分之一。牡蛎不仅肉质细嫩、肉味鲜美、营养价值高，还具有抗癌降血脂等功效，有“海洋牛奶”之美誉，是世界性的水产佳肴。目前国内外通过提取牡蛎等贝类体内的多糖等生物活性物质，并开发出了保健食品。但以上多为多糖等物质的混合物，是免疫调节产品，并且基础研究资料少，对肿瘤细胞的毒性作用较低，对其功效及副作用等所知不多。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种近江牡蛎中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质及其引物。

为达到以上目的，本发明是通过这样的技术方案来实现的：提供一种近江牡蛎体内抗急性早幼粒白血病细胞株(HL60)的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码前述蛋白质的基因，该基因具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于扩增前述蛋白质的基因的寡聚核苷酸引物，其结构为：

TRAILf：5’-GTGAGAGAAAGAG-3’

TRAILr：5’-TTAGCCAACTTAAAAG-3’。

本发明的有益效果在于：

本发明利用基因工程技术开发的牡蛎中sTRAIL蛋白质产品，对HL60肿瘤细胞具有杀伤性强、特异性高、安全性好、能够大量生产、易于贮存等优点。

具体实施方式

本发明的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。

本发明中，近江牡蛎sTRAIL蛋白质即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质，简称CasTRAIL，其中Ca代表近江牡蛎，sTRAIL代表肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子；HL60即急性早幼粒白血病细胞株。

本发明的实现步骤包括：

1、以近江牡蛎cDNA为模板，设计扩增sTRAIL蛋白质基因的引物，获得编码sTRAIL蛋白质的基因全序列。

2、利用DNA重组技术将sTRAIL基因片段克隆到合适的pMD19-T载体(购自Takara公司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28(a)原核表达载体(购自Novagen公司，美国)相连接，获得表达载体pET-28a(+)-sTRAIL。

3、sTRAIL蛋白质的体外诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)等方法鉴定目的蛋白质。

4、利用亲和柱分离纯化目的蛋白质，获得重组的sTRAIL蛋白质。

5、培养急性早幼粒白血病细胞株HL-60(购买自中国科学院上海细胞生物研究所，中国)，添加纯化的近江牡蛎sTRAIL(CasTRAIL)重组蛋白质，培养细胞0-24小时。

6、分别收集细胞，利用以下两种方法鉴定HL60细胞的凋亡：用流式细胞仪检测凋亡率；提取DNA检测DNA ladder的形成。

具体的操作步骤如下：

1、引物设计与合成

设计用于扩增sTRAIL蛋白质基因的寡聚核苷酸引物为：

TRAILf：5’-GTGAGAGAAAGAG-3’(SEQ ID NO：3)

TRAILr：5’-TTAGCCAACTTAAAAG-3’(SEQ ID NO：4)。

2、PCR扩增与表达载体的构建

以近江牡蛎cDNA为模板扩增目的片段，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3分钟；35个循环：94℃30秒钟，56℃30秒钟，72℃45秒钟；72℃10分钟。PCR产物连入pMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109(购自Takara公司，日本)，涂布含氨苄青霉素的LB筛选平板，挑若干个克隆进行酶切和PCR鉴定，选一阳性克隆扩大培养，以碱法抽提质粒.将制备好的质粒以NdeI和XhoI限制性内切酶(购自Takara公司，日本)双酶切，连入经过同样双酶切的pET-28a(+)载体的相应位点上，转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Tiangen公司，德国)。PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET-28a(+)-sTRAIL。

经上述方式获得来自于近江牡蛎体内特有的sTRAIL蛋白质(CasTRAIL)，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；编码该蛋白质的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3、重组蛋白质的表达与鉴定

将阳性重组质粒pET-28a(+)-sTRAIL转化表达宿主菌BL21感受态，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LB培养液，37℃振摇培养过夜。取适量菌液，按1∶100扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(购自Sangon公司，加拿大)，使其终浓度在0-1.0mmol/L，继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后，离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳。

4、重组蛋白质的纯化与抗体制备

利用组氨酸亲和层析柱对表达产物进行分离纯化。以上述方法大量制备超声裂解的菌液，离心分离上清液，进行蛋白质的纯化和洗脱操作，并采用12％的SDS-PAGE进行鉴定。

挑选体重约1.5kg的健康新西兰白雄兔进行免疫。经过一次初始免疫和两次加强免疫后，颈动脉取血，分离血清，存储于-80℃。

5、蛋白质定量与抗体效价的检测

按Brad-ford法对蛋白质进行定量(Bradford MM.A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding.Anal Biochem.1976，72：248-254)。

免疫后的兔血清用ELISA方法检测效价，具体操作如下：

(1)包被与封闭：用包被缓冲液将蛋白质稀释至1-10μg/ml。在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。弃去孔内溶液，5％的脱脂奶粉封闭2小时，用PBST洗3次，每次3分钟。

(2)加样：加指定稀释倍数的待检样品(待检测的抗血清稀释于PBST)0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，PBST洗3次，每次3分钟(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃1小时，PBST洗3次，每次3分钟。

(4)加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的OPD底物溶液0.1ml，37℃显色10-30分钟。

(5)终止反应：于各反应孔中加入2M反应终止液0.05ml。

(6)结果分析：用酶标仪490nm测各孔OD值，大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。计算抗体效价公式：(样本OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)。

6、Western blot(免疫印迹)

Western blot操作按文献(Sambrook J，Russell DW著.黄培堂等译.分子克隆实验指南，第3版.北京：科学出版社，2002.(Sambrook J，Russell D W.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)，具体如下：

(1)蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳

(2)转膜(电转)：电泳结束后将胶条割至合适大小，浸入转膜缓冲液平衡20分钟。预先裁好与胶条同样大小的滤纸和PVDF膜(购自Millipore公司)，浸入转膜缓冲液中15分钟。转膜装置的搭建：按从下至上顺序依次为阴极塑料板、3层滤纸、PVDF膜、凝胶、3层滤纸、阳极塑料板，滤纸、凝胶、膜精确对齐，每一步去除气泡，吸干多余的液体。恒压38V，转移3小时。

(3)免疫杂交反应：

a用PBST洗膜，5分钟×3次；

b加入封闭液，平稳摇动，室温2小时；

c弃封闭液，用PBST洗膜，10分钟×3次；

d将膜转入一抗杂交液(抗血清按预定比例稀释于封闭液)，室温杂交2小时。阴性对照中以免疫前的血清取代一抗，其余步骤与实验组相同；

e弃杂交液，用PBST洗膜，10分钟×3次；

f将膜转入二抗杂交液(辣根过氧化物酶偶联的二抗按合适稀释比例稀释于PBST)，平稳摇动，室温2小时；

g弃杂交液，用PBST洗膜，10分钟×3次；

h加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

具体的实施例子：

1、sTRAIL重组蛋白质的表达与鉴定：

将阳性pET-28a(+)-sTRAIL重组质粒转化表达宿主菌BL21感受态，涂布LBA平板，37℃培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LBA培养液，37℃振摇培养过夜。取适量菌液，按1∶100扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入IPTG，使其终浓度在0-1.0mmol/L，继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后，离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳。

2、sTRAIL重组蛋白质抗肿瘤活性检测

(1)HL60细胞株悬浮生长于RPMI1640培养液(购自Gibco公司，美国)中，内含：10％小牛血清、1mmol/L谷胺酰胺、青霉素和链霉素各100U/L。于37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每2-3天传代1次，于对数生长期时做后续实验。

(2)将纯化的CasTRAIL重组蛋白质，加入HL60细胞中至5μg/ml，分别培养0或24小时。

(3)分别收集细胞，用以下两种方法鉴定HL60细胞的凋亡：用分别含1ug/ml的FITC-Annexin V和PI标记细胞(购自联科生物，中国)，流式细胞仪检测凋亡率；用DNA提取试剂盒(购自北京赛百盛，中国)提取DNA检测DNA ladder的形成。近江牡蛎sTRAIL(CasTRAIL)重组蛋白质24小时内平均可使近20％的HL60细胞发生凋亡，具有很强的抗癌作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干具体实施例框架。显然，本发明不限于以上实施例，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

gtgagagaaa gaggtcctca gagagtagca gctcacataa ctgggaccag aggaagaagc 60

aacacattgt cttctccaaa ctccaagaat gaaaaggctc tgggccgcaa aataaactcc 120

tgggaatcat caaggagtgg gcattcattc cagagcaact tgcacttgag gaatggtgaa 180

ctggtcatcc atgaaaaagg gttttactac atctattccc aaacatactt tcgatttcag 240

gaggaaataa aagaaaacgc aaagaacgac aaacaaatgg tccaatatat ttacaaatac 300

acaagttatc ctgaccctat attgttgatg aaaagtgcta gaaatagttg ttggtctaaa 360

gatgcagaat atggactcta ttccatctat caagggggaa tatttgagct taaggaaaat 420

gacagaattt ttgtttctgt aacaaatgag cacttgatag acatggacca tgaagccagt 480

tttttcgggg ccttttaa 498

SEQ ID NO：2

15 Met Glu Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala Hi sIle Thr

30 Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys

45 Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser

60 Arg Ser Gly His Ser Phe Gln Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly

75 Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln

90 Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Ala Lys Asn

105 Asp Lys Gln Met Val Gln TyrIle Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro

120 Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser

135 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile

150 Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn

165 Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala

169 Phe Ser Val Gly

SEQ ID NO：3

gtgagagaaa gag 13

SEQ ID NO：4

ttagccaact taaaag 16

Claims

1.一种近江牡蛎体内抗人类肿瘤HL60的sTRAIL蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种用于扩增权利要求2所述基因的寡聚核苷酸引物，其结构为：

TRAILf：5’-GTGAGAGAAAGAG-3’

TRAILr：5’-TTAGCCAACTTAAAAG-3’。