CN101979581A - 一种草鱼呼肠孤病毒株的s7基因、编码的重组蛋白及其获取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因、编码的重组蛋白及其获取方法和应用。本发明草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核苷酸序列编码的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将本发明草鱼呼肠孤病毒株的S7基因克隆到原核表达载体上，构建重组表达载体，转化至大肠杆菌中，经诱导表达，所得蛋白为草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白。该蛋白对草鱼出血病具有较好的免疫保护作用。

Description

一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因、编码的重组蛋白及其获取方法和应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因、编码的重组蛋白及其获取方法和应用。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，ARV)(Franki，1991)，是我国从鱼类分离到的第一个病毒，直径约70nm，球形颗粒，无囊膜，具双层衣壳，含有11个双链RNA片段，总分子量15.46×10³kD。根据其基因片段大小，将基因组片段按分子量分为3个组，分别命名为L1-L3，M4-M6，S7-S11。这11个双链RNA片段可以编码12种多肽，其中有7种结构多肽，分别命名为VP1-VP7，其余为非结构性多肽，命名为NS1-NS5。由于病毒基因组是分节段的，所以会造成不同病毒株的复杂性和高度可变性，草鱼出血病病毒目前已经报道了10多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、H962、ZV-8802、GCHV-854等。

草鱼呼肠孤病毒主要侵染草鱼的肝脏、心脏、肌肉、肾脏、脾、鳃、肠道等组织的细胞，引起草鱼出血病，导致化学药物难于达到治疗效果。当水温在27℃以上时为该病的流行高峰期，可达80％以上的死亡率，严重地威胁草鱼的养殖生产。在草鱼出血病的免疫预防中，研究最早并应用最广的是草鱼出血病组织灭活疫苗，但是须含有足够的病毒才能引起免疫应答，而大剂量又可引起局部或全身的反应，并且所获得的免疫性一般是短暂的，须激发注射，且疫苗研制受病鱼组织来源的限制，难于大批量生产。与其相比，基因疫苗有一些明显优点，其抗原蛋白成份单一明确，能够刺激机体产生较强和较持久的免疫应答，并可规模化生产。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的草鱼出血病灭活疫苗中存在的剂量小不足以引起免疫应答，剂量大又容易引起局部或全身反应，获得的免疫性多为短暂，需多次注射，且原材料来源受限等问题，提供一种可作为基因工程疫苗的草鱼呼肠孤病毒株的S7基因。

本发明另一目的在于提供上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白。

本发明另一目的在于提供含有上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的重组表达载体。

本发明另一目的在于提供含有上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的重组菌株。

本发明另一目的在于提供上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法。

本发明还有一个目的在于提供上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因及其编码的重组蛋白的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所选择的草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108，采自广东省水产养殖场。将从病鱼体上分离的病毒感染草鱼成纤维细胞，提取病毒RNA，以其为模板进行RT-PCR扩增，得到1500bp的特异条带，切胶回收目的条带并连接到pMD19-T载体，并连接转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，挑选阳性重组克隆。

本发明通过对以上重组克隆进行序列测定，得到草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108的S7基因的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，并通过基因工程方法表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。新基因编码512个氨基酸，等电点5.08，分子量为56.03kD。

本发明通过设计了一对含有限制性内切酶酶切位点的引物，将草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108的S7基因用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核表达载体pET30c上，构建原核表达质粒pET-S7并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pET-S7)以T7为启动子，重组蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中表达，载体pET30c上有6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，S7融合蛋白的表达量可以达到10mg/L。

本发明还优化了S7蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白。

本发明还通过间接Elisa法检测重组蛋白与草鱼抗GCRVGD108株抗体的结合反应，显示该蛋白具有较强的抗原性。

与现有技术相比，本发明具有如下效果：

本发明获得的重组蛋白对草鱼出血病具有较好的免疫效果。健康草鱼经S7重组蛋白免疫后，用草鱼呼肠孤病毒株GCRV-GD108进行攻毒试验，相对成活率达70％以上。

附图说明

图1为RNA提取结果，其中，1为GCRVGD108的RNA条带，M为markerIII；

图2为RT-PCR扩增结果，其中，1为GCRVGD108的RT-PCR产物，M为marker III；

图3为pET-S7表达载体构建及酶切鉴定图，其中，1为pET30c-S7，2为pET-S7BamH I单酶切，3为pET30c-S7Xho I单酶切，4为pET-S7BamH I/Xho I双酶切；

图4为诱导表达图，其中，M为低分子量标准蛋白marker，1为空载pET；2为未诱导pET-S7；3为诱导后pET-S7；4为pET-S7上清；5为pET-S7沉淀；

图5为重组蛋白过柱纯化图，其中，M为低分子量标准蛋白marker；1为pET空质粒；2为pET-S7未诱导；3为pET-S7诱导超声破碎上清；4为pET-S7诱导超声破碎沉淀；5为蛋白过柱流通液；6为Elute Buffer流通液。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108RNA的提取和RT-PCR扩增

病毒RNA的提取和cDNA的合成：草鱼成纤维细胞接种病毒7d后，细胞反复冻融2～3次，4℃，4000rpm，离心30min，取上清再以30,000rpm超高速离心沉淀病毒，然后用Trizol试剂提取病毒dsRNA，步骤参见Trizol说明书。提取的dsRNA经SDS-PAGE电泳检测可见清晰的11条带。利用“anchor primer”反转录合成cDNA(Maan et al，2007)，然后利用S7特异引物进行扩增。

每20μl PCR反应体系中加入3μl cDNA单链作为模板，PCR扩增，电泳检测，发现在约1540bp处出现预期的特异性扩增带，回收此带(图1～2)。

PCR反应体系：

反应条件：94℃预变性3min后进入循环：94℃变性50s，62℃退火50s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

实施例2草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108的S7基因序列的测定和分析

将回收产物与pMD19-T Easy Vector载体连接，连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，挑选阳性克隆测序。将该序列在NCBI上进行Blast同源分析，结果显示与番鸭细胞吸附蛋白σC以及鸟类正呼肠孤病毒σC同源性最高，综合评分高达43.5。

实施例3重组S7基因表达质粒的构建

依据S7基因的两端序列合成一对引物，上游引物含BamH I酶切位点，下游引物含Xho I酶切位点。

上游引物(F)：5′TCGCGGATCCTAATGGCCACTCGTGAC 3′BamH I

下游引物(R)：5′TCTCCGCTCGAGCTTACAGCAAACTAC 3′Xho I

以含S7基因的pMD19-T质粒为模板，F、R为引物进行PCR扩增，得到特异的单一条带，产物大小在1540bp左右。PCR扩增产物进行BamH I/Xho I酶切，连接至原核表达载体pET30c。转化E.coli DH5α，筛选挑取阳性克隆，提取质粒，转化E.coli BL21(DE3)。重组质粒用BamH I/Xho I进行双酶切鉴定，外源基因经测序鉴定正确(图3)。

实施例4重组S7基因融合蛋白的表达

将pET-S7转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与预测的理论值56kD相符(图4)。

经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索：菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较，基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨苄抗性LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L氨苄抗性LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.6左右(扩大培养约3.5h)，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，37℃，200rpm诱导5h后离心收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下S7融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的17.5％，基本处于包涵体状态。

实施例5重组S7基因融合蛋白的纯化

将收获的总菌体用PBS洗涤并悬浮，加入20％TritonX-100超声破碎，SDS-PAGE检测重组蛋白主要以包涵体的形式表达，裂解后包涵体经脲变性，透析复性，经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析进行纯化，经SDS-PAGE电泳分析表明融合蛋白的纯度很高，占总蛋白量的92.5％。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约10mg纯化的融合蛋白(图5)。

实施例6Elisa检测重组蛋白的抗原性

Elisa分析按如下操作进行：

1)包被：将抗原(重组蛋白)溶解为0.01g/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次，每次3min。

2)加样：加入0.1ml按比例稀释的草鱼抗GCRVGD108株抗体(稀释比例分别为：1∶200，1∶400；1∶800；1∶1600；1∶3200，第1-6孔)，阴性血清按同样的稀释比例加入(第7-12孔)于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h。然后用PBST洗涤缓冲液洗涤5次，每次3min，每次向后甩干洗涤液，最后倒扣滤纸或卫生纸上吸干液体。同时做空白孔与阴性对照孔。

3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗草鱼抗体(1∶10000稀释)0.1ml，37℃孵育1h，同上法洗涤5次。

4)加底物液显色：于各反应孔中加入用前新配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃作用10～30min。

5)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml终止反应。

6)结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。结果见表1。

实施例7免疫保护作用评价

以体重25～30g的草鱼为免疫对象，在水泥池中暂养一周后进行免疫试验。实验开始前取5尾鱼的血清，以作为阴性对照。实验组分4组，注射剂量(蛋白量/鱼的体重)分别为：2μg/g、4μg/g、8μg/g和空白组，每组30尾。把重组蛋白S7用PBS稀释至所需浓度与等体积的弗氏不完全佐剂混匀至油包水状态，以每尾0.2ml的注射量进行腹腔注射。免疫2周后，再用相同剂量加强免疫一次。分别从免疫2周和加强免疫两周后的每组鱼中取3尾鱼的血清。

加强免疫2周后，用纯化GCRV进行攻毒。观察2周，每日纪录发病和死亡鱼的数量，统计死亡率，计算免疫保护率。

免疫实验结果显示重组蛋白具有较好的保护率，经重组蛋白免疫的各实验组存活率均＞70％，而对照组的死亡率则100％。

表1ELISA检测重组蛋白的免疫原性

注：1-6为阳性抗血清不同稀释浓度，依次为10²，2X10²，4X10²，8X10²，16X10²，32X10²，7-12为阴性血清不同稀释浓度，稀释倍数同阳性抗血清。

Claims (10)

1.一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要求1所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因克隆到原核表达载体pET30c上得到。

4.一种重组株，其特征在于所述重组株是将权利要求3所述重组表达载体转化至大肠杆菌BL21中得到。

5.权利要求2所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法，其特征在于包括如下步骤：将草鱼呼肠孤病毒株的S7基因克隆到原核表达载体pET30c上，得到重组表达载体pET-S7，转化至大肠杆菌BL21中，经诱导表达，得到草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白。

6.根据权利要求5所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法，其特征在于所述诱导为IPTG诱导。

7.根据权利要求5所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法，其特征在于所述诱导表达后，所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白以包涵体的形式表达。

8.权利要求1所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因在防治草鱼出血病中的应用。

9.根据权利要求8所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的应用，其特征在于所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因作为基因疫苗，通过重组表达获得重组蛋白，用于防治草鱼出血病。

10.权利要求2所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白在防治草鱼出血病中的应用。

Images