CN105132444A - 一种草鱼抗出血病性状的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于鱼的分子标记制备技术领域，具体涉一种草鱼抗出血病性状的分子标记及应用。所述的分子标记由草鱼RIG-I基因克隆和转录组测序得到，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示：在该序列的第665位碱基处有一段15bp的碱基片段的插入(缺失)突变，造成草鱼RIG-I蛋白211-215位氨基酸的插入(缺失)(如序列表SEQ？ID？NO：2所示)。草鱼呼肠孤病毒感染试验表明：插入基因型草鱼死亡率显著低于缺失型草鱼死亡率，由此说明草鱼RIG-I基因这段碱基突变与抗草鱼出血病症状相关。本发明为草鱼抗草鱼出血病免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

一种草鱼抗出血病性状的分子标记及应用

技术领域

本发明属于鱼的分子标记制备技术领域，具体涉及一种草鱼抗出血病性状的分子标记及应用。所述的分子标记从RIG-I基因突变中克隆得到，该突变后的RIG-I基因片段可作为草鱼抗草鱼出血病性状的分子标记及应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodonidella，英文名grasscarp)是我国特有的鲤科大型经济鱼类，广泛分布在我国南北水域，是我国四大家鱼之一。草鱼苗养至食用鱼过程中，出血、肠炎、烂鳃、赤皮这四大传染性疾病极易暴发流行，使鱼种成活率低，一般仅为30％左右(苏建国,杨春荣.2000.草鱼主要传染病的免疫学研究进展.动物医学进展,21(4):183-185)，其中由草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)引起的草鱼出血病由于其发病快、流行广、死亡率高，常给养殖者造成重大的经济损失。GCRV基因组由双链核糖核酸(dsRNA)片段组成。有研究提出RNA解旋酶家族成员——维甲酸诱导基因I(RIG-I)是IRF3，TBKl和IKK3的上游信号分子，并可能是dsRNA的直接受体(YoneyamaM等.2004.TheRNAhelicaseRIG-Ihasanessentialfunctionindouble-strandedRNA-inducedinnateantiviralresponses.NatImmunol,5(7):730-737)。目前，对人和鼠的RIG-I的研究已取得了一定的进展，但对鱼类的RIG-I分子结构与功能的研究很少。草鱼、斑马鱼、河豚、青鳉、鲀属基因序列已被报道。这些研究表明，RIG-I在鱼类先天性免疫上发挥着积极的作用。

RIG-I蛋白属含有DExD/HBox的RNA解旋酶家族。其氨基端含2个串联重复的CARD结构域，羧基端含DExD/HBox特征的RNA解旋酶结构域(YoneyamaM等.2004.TheRNAhelicaseRIG-Ihasanessentialfunctionindouble-strandedRNA-inducedinnateantiviralresponses.NatImmunol,5(7):730-737)，此解旋酶又被称作是SF2型DECH-box解旋酶，结构域内含1个ATP-GTP结合位点基序ABox，同时还含1个ResIII位点和一个TAS基序，末端有1个内在的RD结构域(SaitoT等.2007RegulationofinnateantiviraldefensesthroughasharedrepressordomaininRIG-IandLGP2.ProcNatlAcadSciUSA,104(2):582-587)。RIG-I蛋白可以识别细胞质中特定的RNA病毒，这与其特殊的结构相关。敲除RIG-I的CARD结构域后，IFN的表达受到抑制，表明CARD域对病毒天然免疫具有重要的调节作用(LinR等.2006.Negativeregulationoftheretinoicacid-induciblegeneI-inducedantiviralstatebytheubiquitin-editingproteinA20.JBiolChem,281(4):2095-2103)。有研究表明，在静息细胞中RIG-I保持单体形式且处于自我抑制状态，一旦病毒侵入后可改变构向，二聚化并且通过氨基端的CARD-CARD结构域与含单个CARD域的线粒体受体蛋白MAVS结合(YoneyamaM和FujitaT.2009.RNArecognitionandsignaltransductionbyRIG-I-likereceptors.ImmunolRev,227:54-65)，启动信号级联反应，将dsRNA信号通过接头蛋白IPS-1下传给与TRAF家族成员关联的NF-κB激活物结合激酶和NF-κB抑制酶以及IKK复合体，从而分别诱导IRF-3、IRF-7、NF-κB的产生(HemmiH等.2004.TherolesoftwoIkappaBkinase-relatedkinasesinlipopolysaccharideanddoublestrandedRNAsignalingandviralinfection.ExpMed,199(12):1641-1650；WorkenheST等.2010.Thefightbetweentheteleostfishimmuneresponseandaquaticviruses.MolImmunol,47(16):2525-2536)，进而诱导I型IFNs的表达和分泌。

在如此丰富的理论研究基础之上，急需寻求一种健康、可行的方法来选育出抗草鱼出血病的品种。而传统的育种方法耗时、耗力，于是基于分子标记的分子育种方法逐渐被研究者认知。水产动物分子育种技术经过数十年的发展，已经进入基因组时代，并朝着分子设计育种的宏伟目标迈进。随着众多经济生物全基因组测序项目的完成，当务之急是如何将海量的基因序列信息转变为有用的生物学知识，进而使这些知识转化成技术并被产业化应用。在此过程中，遗传多态性监测是基因组测序后续研究的一个重点内容。通过关联分析和连锁分析，将基因结构的变异和表型的变异联系起来，寻找经济性状相关的基因和标记，并将其用于分子育种。在日本牙鲆上，已经有利用微卫星标记育种方法培育出抗病品种的报道，并且该报道证明分子育种是一种行之有效的育种方法(FujiK等.2007.Marker-assistedbreedingofalymphocystisdisease-resistantJapaneseflounder(Paralichthysolivaceus).Aquaculture,272(1-4):291-295)。2011年8月，挪威奥斯陆大学在《nature》杂志报道了鳕鱼基因组测序结果，分析了鳕鱼免疫系统的特点，为抗病抗逆品系的选育、疫苗开发和疾病管理提供了重要基础(StarB等.2011.ThegenomesequenceofAtlanticcodrevealsauniqueimmunesystem.Nature,477(7363):207-210)。

以上这些研究成果都提示我们，可以将这些基础理论研究与实际生产结合起来，对草鱼RIG-I基因的遗传多态性和草鱼出血病进行关联分析，以期获得抗病相关的分子标记。在此研究中，早期发展起来的测序和PCR-RFLP技术又为遗传多态性的研究提供了确切的保障。

本发明申请中，申请人对GCRV感染过后的草鱼脾脏和肾脏组织进行了转录组测序，序列拼接后发现RIG-I基因有两个转录本。表达分析，发现两个转录本在不同抗性表型草鱼中表达量不同。感染实验证明：RIG-I基因中的这段片段突变与草鱼抗草鱼出血病显著相关。这为草鱼抗草鱼出血病的的标记辅助选择提供了新的分子标记。

发明内容

本发明的目在于克服现有技术的缺陷，通过高通量测序方法筛选草鱼与抗草鱼出血病相关的突变位点，利用PCR扩增、Sanger测序技术对候选位点进行验证，再利用PCR或PCR-RFLP技术对验证后的位点进行基因分型，将分型结果与自然草鱼群体的抗草鱼出血病性状关联分析，从而鉴定得到与抗草鱼出血病性状相关的分子标记，为草鱼的抗GCRV感染育种提供一种新的分子标记资源。

本发明的技术方案如下所示：

申请人通过高通量转录组测序的方法，鉴定得到草鱼RIG-I基因有两个转录本，其完整核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。经过两个转录本的比对发现，在该序列的665-679处存在一个15bp的核苷酸片段插入(缺失)突变。该突变造成了正好这5个氨基酸的插入(缺失)(所述的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所述)，可能影响草鱼RIG-I基因的功能。通过专门设计的特异性引物扩增包含着15bp突变的片段后经过测序证实了这段突变的序列为：5’-AAACCACGACGACAG-3’(其核苷酸序列见SEQIDNO：4)。另外，转录组测序结果表明：草鱼RIG-I基因的这两个转录本在抗性和易感草鱼中存在表达差异(见表1)。申请人为了验证这一差异性，对感染后易感和抗性的草鱼经过基因分型和数据统计分析证实这段突变确实与抗草鱼出血病性状存在显著相关性：易感群体中缺失这15bp的核苷酸的个体数要多于抗性群体。由此证明，将这段突变序列作为草鱼抗草鱼出血病性状预测和育种的分子标记是切实可行的。

为了扩增包含这15bp的片段，申请人设计了如下所示的特异性引物对：

正向引物：5’-AAGGGCTGCGGATCGGAT-3’

反向引物：5’-CCTGCCTGACAGACATTTATTGC-3’。

扩增得到如SEQIDNO：3所述的片段，片段全长为748bp.

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一种草鱼抗出血病性状的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述，在所述序列的665‐679处有一个15bp的碱基片段的插入(缺失)的突变；序列表SEQIDNO：1所示序列的665‐679处的15bp的突变碱基片段的序列如序列表SEQIDNO：4所示。

一种草鱼抗出血病性状的分子标记，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示，在所述序列的211‐215处有5个氨基酸的插入(缺失)的突变；在序列表SEQIDNO：2所示序列的211‐215处的5个氨基酸突变序列如序列表SEQIDNO：4所示。

一种检测上述分子标记的引物对，该引物对的序列如下所示：

正向引物：5’-AAGGGCTGCGGATCGGAT-3’

反向引物：5’-CCTGCCTGACAGACATTTATTGC-3’。

申请人还义工了一种筛选草鱼抗出血病性状的分子标记的方法，包括下列步骤：

1)通过草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus)感染实验将自然群体的草鱼分为抗性个体和易感个体；

2)提取草鱼的头肾和脾脏组织的RNA，通过转录组测序筛选分子标记；

3)利用混合池测序来验证转录组中RIG‐I基因的拼接结果，所述的RIG‐I基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

4)利用PCR结合2.5％琼脂糖电泳的方法对RIG‐I基因进行分型；

5)利用在线分析软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)进行性状关联分析。

实践表明，本发明的草鱼抗出血病性状的分子标记可以在草鱼出血病性状检测中的的应用。

本发明的引物对可以在草鱼抗出血病性状检测中的应用。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：

本发明可通过高通量测序筛选与草鱼抗草鱼出血病性状相关的突变位点，根据这些位点再选取在差异表达的转录本作单独试验验证而得到可靠的与抗病性状相关的位点。这种筛选与传统的单基因核苷酸多态位点(SNP)筛选方法相比通量更高、检测更准确、速度也更快，得到的结果也更加可靠。本发明得到的15bp突变位点为今后的抗草鱼出血病育种的标记辅助选择奠定了坚实的基础。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表是本发明中RIG-I基因完整的cDNA核苷酸序列。序列长度为3198bp，在该序列的665-679处存在一个15bp的基因突变。

序列表SEQIDNO：2是本发明中RIG-I基因完整的蛋白质序列。序列长度为947aa，在该序列的211-215处存在5个氨基酸的插入(缺失)。

序列表SEQIDNO：3是本发明中对这15bp的基因突变片段分型设计引物所扩增出来的核苷酸片段。序列长度为745bp，所述的突变存在于该片段的第44-58位的碱基处。

序列表SEQIDNO：4是序列表SEQNO:1所示的15bp的突变片段的核苷酸序列。

序列表SEQIDNO：5和SEQIDNO：6是15bp的突变片段蛋白质的氨基酸序列。

序列表SEQIDNO：5和6是检测本发明分子标记(SEQIDNO：1)的引物对的序列。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：转录组测序策略示意图。

图3：DNA提取过后的琼脂糖电泳图。附图标记说明：图中1泳道：DNA分子量标准(Maker4)；2-7泳道：提取的组织DNA。

图4：15bp片段突变位点不同基因型个体测序结果对比图。

图5：用特异性引物扩增包含15bp碱基突变片段后不同基因型电泳图。附图标记说明：图中1泳道：M，DNA分子量标准(DL2000ladder)；2-3泳道：AA，插入型个体；4-5泳道：AB，杂合型个体；6-7泳道：BB，缺失型个体。

图6：草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus)毒染后三种基因型个体死亡率统计柱形图。附图标记说明:“*”代表差异显著。

具体实施方式

实施例1：草鱼转录组测序

(1)感染试验

试验所需水族箱用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡24小时后清洗干净，并注入清水，安装好充氧泵、加热棒，将温度调为28℃-30℃、开启充氧泵后准备暂养试验用鱼。在GCRV病毒感染之前将草鱼随机分为五组(60尾/组)暂养于准备好的水族箱中，每天两次定点、定时、定量投喂适口颗粒饲料，并及时清理残饵和代谢废物。约一星期，待鱼群日常生理活动正常，生命力活跃后准备病毒感染试验。草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus)即GCRV-097毒株原液由中国科学院水生生物研究所惠赠。感染所用病毒悬液为本实验室上一次感染试验后收集并保存于-80℃，经活化后的悬液。在病毒注射前，向病毒悬液中加入青、链霉素防止注射期间的细菌感染。选取四组草鱼为感染组，另外一组为对照组。于感染组草鱼的腹腔和背鳍肌肉小心注射剂量为0.1mL/体重的病毒悬液，对照组注射相同剂量的生理盐水。

(2)取样

注射结束后，每3小时观察一次水族箱中鱼体的活动状况，及时收集出现草鱼出血病症状的将死之鱼(易感草鱼)并作好样品编号与记录。将在冰上取下的病鱼的部分头肾和脾脏放入1.5mL含有800μL冰Trizol(购自宝生物工程大连有限公司，TAKARA)的无菌离心管中，小心研磨，待无明显块状组织后放入-80℃冰箱中保存；另一部分直接放入空的无菌1.5mL离心管中于-80℃冰箱中保存。感染试验7天之后存活的草鱼被认为是抗性个体。按以上的方法取头肾和脾脏样保存。

(3)提取头肾和脾脏组织总RNA

采用常规Trizol法提取总RNA，按照Trizol试剂说明进行操作。具体操作方法如下(所用微量移液抢的枪头均已用DEPC水处理过)：

1)取草鱼脾脏组织样置于两支装有800μLTrizol试剂的1.5mL离心管(DEPC水处理过的)中；

2)充分研磨后，置冰保存备用(或置-80℃长期保存备用)；

3)每管加160μL氯仿，盖紧上盖，剧烈振摇15s，室温放置3min；

4)4℃、12000rpm离心15min；

5)备2支1.5mL离心管(DEPC水处理过的)，将4)中无色上层水相分别转至其中，加400μL异丙醇，轻缓混匀，室温放置10min；

6)4℃、12000rpm离心10min；

7)吸弃上清，加800μL75％乙醇(DEPC水处理过的)，轻弹管壁漂洗5s；

8)4℃、7500rpm离心5min；

9)吸弃上清，风干10min；

10)加100μLddH₂O(DEPC处理过的)，58℃水浴10min，立即放入-80℃保存。

(4)转录组测序

将提取好的RNA用干冰寄送到上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumila的Miseq平台测序并进行序列拼接、差异表达、聚类等基本分析。测序策略见图2；RIG-I基因两个转录本表达量见表1。

表1转录组测序中RIG-I两个转录本的表达量(FPKM值)

实施例2：RIG-I基因转录本验证及关联分析

(1)草鱼脾脏和头肾组织的DNA提取

采用氯仿法提取基因组DNA。具体操作步骤如下：

1)取0.05g组织(绿豆大小)放1.5mLEP管中，加200μL组织提取液，充分研碎。再加400μL组织提取液和60μL的1mg/mL的蛋白酶K，放55℃水浴(约3h)或者37℃过夜，消化至液体澄清；

2)加600μLTris-饱和酚，充分混合10min，12,000rpm离心10min；

3)转移上清液于新EP管，加500μL氯仿抽提，充分混合10min，12,000rpm离心10min；

4)移取上清于新EP管，加2倍体积的冰乙醇(-20℃)，于-20℃沉淀DNA至少30min，随后12,000rpm离心5min；

5)弃上清，用70％乙醇洗1-2次，室温下风干；

6)加50μL三蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。

提取DNA结束后，取2μL提取的DNA用1％琼脂糖凝胶(含0.01％的核酸染料Gelview)进行电泳检测。检测结果见图3。

(2)引物设计

针对15bp的插入(缺失)突变，利用PrimerPremier5软件设计了一对引物，用于基因型检测，引物在南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所述的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-AAGGGCTGCGGATCGGAT-3’

反向引物：5’-CCTGCCTGACAGACATTTATTGC-3’。

(2)PCR扩增

将合成的引物用ddH₂O稀释至10μM浓度。PCR反应体系总体积为20μL：双蒸水13μL，10xPCRBuffer2μL，Mg²⁺2μL，dNTPMix0.6μL，正向引物0.6μL，反向引物0.6μL，Taq酶0.2μL，cDNA1μL。扩增条件：94℃预变性1min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环、72℃再延伸5min。取2μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，有条带之后直接将PCR产物用DAN纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)纯化后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。多个个体混合池DNA测序结果如图4。

(3)PCR-电泳分型

之前感染试验共获得79条易感草鱼和83条抗性草鱼，经过上述PCR后用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测分型。分型示例电泳图见图5，分型后使用在线分析软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)(ShiYY和HeL.2005.SHEsis,apowerfulsoftwareplatformforanalysesoflinkagedisequilibrium,haplotypeconstruction,andgeneticassociationatpolymorphismloci.CellRes,15(2):97-8)分析，结果见表2和图6。

表2草鱼RIG-I基因15bp片段突变分型统计结果

注：AA代表插入突变纯合子，AB代表杂合子，BB代表缺失纯合子；“*”表示差异显著。

由表1可知，插入突变基因型(AA)转录本在抗性个体中的表达量高于易感个体，缺失突变基因型(BB)转录本在易感个体中的表达量更高些。由表2和图6可知，AA基因型个体中的抗性个体数多于易感个体数；BB基因型个体抗性个体数少于易感个体数(P<0.05)。同样，A等位基因中抗性个体数多于易感个体数，B等位基因中抗性个体数少于易感个体数(P<0.05)。因此可以得知，这15bp所编码的五个氨基酸即“ETTTT”对RIG-I的功能发挥起着重要作用。因此选择A等位基因对草鱼抗出血病性状选择是有利的。

Claims (8)

1.一种草鱼抗出血病性状的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，在所述序列的665‐679处有一个15bp的碱基片段的插入(缺失)的突变。

2.如权利要求1所述的一种草鱼抗出血病性状的分子标记，其特征在于，序列表SEQIDNO：1序列的665‐679处的15bp的突变碱基片段的序列如序列表SEQIDNO：4所示。

3.一种草鱼抗出血病性状的分子标记，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示，在所述序列的211‐215处有5个氨基酸的插入(缺失)的突变。

4.如权利要求3所述的一种草鱼抗出血病性状的分子标记，其特征在于，序列表SEQIDNO：2所示序列的211‐215处的5个氨基酸突变序列如序列表SEQIDNO：4所示。

5.一种检测权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，该引物对的序列如下所示：

正向引物：AAGGGCTGCGGATCGGAT，

反向引物：CCTGCCTGACAGACATTTATTGC。

6.一种筛选草鱼抗出血病性状的分子标记的方法，其特征在于包括下列步骤：

1)通过草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus)感染实验将自然群体的草鱼分为抗性个体和易感个体；

2)提取草鱼的头肾和脾脏组织的RNA，通过转录组测序筛选分子标记；

3)利用混合池测序验证转录组中RIG‐I基因的拼接结果，所述的RIG‐I基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

4)利用PCR结合2.5％琼脂糖电泳的方法对RIG‐I基因进行分型；

5)利用在线分析软件SHEsis进行性状关联分析。

7.权利要求1或2所述的草鱼抗出血病性状的分子标记在草鱼出血病性状检测中的应用。

8.权利要求5所述的引物对在草鱼抗出血病性状检测中的应用。