CN101705306B - 应用as-pcr检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物疾病检测技术领域，具体涉及应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。制备了一种用于牛尿苷酸合酶缺乏症检测方法的特异性PCR引物，它包括：UMPS基因扩增引物：突变型：反向引物3’端倒数第三位引入错配，扩增产物长度为261bp；1F：5’ATGGGAGAAGGGGATAGGAG 3’，1R：5’TCTGGTTTCATGCTTACGCA3’；野生型：正向引物3’倒数第三位引入错配产物，长度90bp；2F：5’ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC 3’，2R：5’AGGCTTACCTCCTGCTTCTA 3’。本发明制备的牛尿苷酸合酶缺乏症的方法的特异性引物，可直接应用于开展牛尿苷酸合酶缺乏症的致病基因的筛选，以利于对患病个体进行早期淘汰。

Description

应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法

技术领域

本发明属于动物疾病检测技术领域，具体属于一种牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)检测技术领域，涉及应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。

背景技术

牛尿苷酸合酶缺乏症(Deficiency of uridine monophophate synthase，DUMPS)是一种常染色体隐性遗传疾病，会造成母牛流产、死胎、整个牛群的繁殖力下降、产奶量下降等。由于人工授精技术的广泛应用，使DUMPS在全世界流传，直接影响了奶牛业的经济效益。DUMPS的病因主要是由于编码尿苷酸合酶的基因，在密码子405处存在C/T的突变，从而造成原编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子TGA，因而转录产物最终只能翻译成一段C-末端缺失76个氨基酸催化亚基的短蛋白，该残缺蛋白不能催化乳清酸转化为鸟苷酸，故不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸，导致胚胎在妊娠40～60d死亡，死亡率高达100％[1][2]。美国等国家根据DUMPS的致病机制，建立了DUMPS的分子检测方法和育种方案，要求对荷斯坦种公牛必须进行隐性遗传疾病的检测。据报道美国大概有2％的荷斯坦奶牛携带DUMPS的致病基因[3]。我国荷斯坦种公牛主要从美国、加拿大、德国、以及澳大利亚和新西兰等国进口，包括进口的活牛和胚胎。以前我国对该疾病没有足够的认识和重视，引入了大量潜在的DUMPS携带者，同时引入的大量没有系谱资料的荷斯坦母牛，同样是潜在的携带者。这些引进的种公牛在我国的大量使用，使得我国的DUMPS携带者数目增加，由于没有自主产权的检测技术，因而无法公布母牛的检测结果，很难根据系谱推断DUMPS的传播途径。我国针对遗传性疾病展开的工作刚刚起步，在奶牛实际育种中开展的工作还不多，并且仅局限在实验室中[4]，我们应该在生产实践中及时检测出冷冻精液及母牛中DUMPS的携带者并予以淘汰，以减少经济效益的损失。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻找一种简便有效的用于牛尿苷酸合酶缺乏症的检测方法。

实现本发明的技术路线如下所示：

本发明建立了一种快速、准确检测牛尿苷酸合酶缺乏症的AS-PCR方法，其具体步骤如下：

(1)引物设计：根据GenBank提供的牛UMPS序列(登录号：NC_007299)，根据AS-PCR的特性，利用生物学引物设计软件Premier 5，设计了AS-PCR扩增引物。该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该引物序列详见具体实施方式中的实施例1。

(2)AS-PCR：提取牛血样基因组DNA，根据PCR扩增可直接判断结果。若个体扩增出的目的片段为261bp(见SEQ ID NO：1)，则为致病纯合子；若扩增出的目的片段为261bp和90bp，则为杂合子，即DUMPS疾病携带者；若扩增的目的片段为90bp(见SEQ ID NO：2)，则为健康个体(见序列表SEQ IDNO：1和2)。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

提供了一种快速准确筛选分型DUMPS的方法和特异性引物，直接应用于牛开展DUMPS的致病基因筛选，以利于DUMPS患病个体的早期淘汰。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是本发明扩增的牛尿苷酸合酶缺乏症的目的片段，SEQ ID NO：3-6是扩增牛尿苷酸合酶缺乏症基因UMPS的特异引物。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：用血样DNA对UMPS基因进行AS-PCR扩增，琼脂糖检测电泳图。琼脂糖凝胶浓度为2％。图中编号说明如下：1，2，3，4泳道为健康牛群基因型，扩增的产物长度为90bp；5为隐性携带者牛群基因型，扩增的产物长度为261bp和90bp；M为MarkerI(600bp)。

图3：是本发明扩增的牛尿苷酸合酶缺乏症的目的片段，图中下划线的序列是扩增的261bp片段和90bp片段的共用区。

具体实施方式

下面结合实施实例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1：牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)基因型鉴定

1、奶牛血样的采集及处理

取奶牛血样约10mL，加入0.5mol/L的EDTA500μL(使终浓度为25mmol/L)抗凝，4℃离心(8000rpm)10min，弃上层清，分离白细胞，加入蒸馏水，摇匀，使红细胞破裂，离心10min，弃上层清液。重复两次后，在沉淀中加入1×SET 1mL和10％十二烷基硫酸钠(SDS，终浓度为0.5％)，再缓慢加入蛋白酶K(终浓度为50～100μg/mL)，置于55℃水浴锅消化8～10h，4℃冰箱中保存备用。

2、从奶牛血样中提取NDA

(1)取消化后的试样，加入等体积的平衡酚(pH 8.0)，缓慢颠倒离心管10min，4℃离心(8000rpm)10min。

(2)小心吸取含有DNA的上清液，移至另一离心管中，再次加入平衡酚，重复上述操作。

(3)吸取的上清液中加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，4℃离心(8000rpm)10min。

(4)吸取上清液后加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，4℃8000rpm离心10min。

(5)吸取上清液，加入1/10体积3mol/L NaAC及2倍体积的无水乙醇，迅速转动离心管，可见白色的絮状物，即DNA，于-20℃放置30min。

(6)取出冷冻后的样品，于10000rpm转速离心5～8min，去掉上层乙醇，加入70％的乙醇1mL洗涤沉淀，离心(80000rpm)5～8min。

(7)加入70％的乙醇重复洗涤一次，离心(80000rpm)5～8min。

(8)弃去乙醇，在室温下挥发残留乙醇，加入适量的TE溶解DNA。

(9)将DNA样稀释成一定的浓度，存放于-20℃冰箱保存备用。

3、引物设计

根据牛尿苷酸合酶缺乏症基因UMPS序列(登录号：NC_007299)，利用生物学引物设计软件Premier 5，设计AS-PCR扩增引物。该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

引物序列如下：

突变型(产物长度为261bp)：反向引物3’端倒数第三位引入错配；

1F：5′ATGGGAGAAGGGGATAGGAG 3′(见序列表SEQ ID NO：3)，

1R：5′TCTGGTTTCATGCTTACGCA 3′(见序列表SEQ ID NO：4)；

野生型(产物长度为90bp)：正向引物3’倒数第三位引入错配；

2F：5′ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC 3′(见序列表SEQ ID NO：5)，

2R：5′AGGCTTACCTCCTGCTTCTA 3′(见序列表SEQ ID NO：6)。

4、AS-PCR扩增

PCR反应总体积为20μL(见表1)。扩增程序是：：94℃预热10min→94℃变性45s→63.3℃45s→72延伸45s(从第二步94℃变性到第四步72延伸进行35个循环)，72℃延伸10min→15℃10min。

表1  PCR反应体系

1F/1R与2F/2R扩增出的PCR产物，分别取3μL混合，2％琼脂糖凝胶电泳(100V，电泳20min)，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像系统观察条带。

5、DUMPS基因型结果判定

牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)基因型鉴定结果如图2所示，在基因UMPS的AS-PCR产物电泳图谱中，若个体扩增出的目的片段为261bp，则为致病纯合子；若扩增出的目的片段为261bp和90bp，则为杂合子，即DUMPS疾病携带者；若扩增的目的片段为90bp，则为健康个体。

参考文献

[1]Schober，S.，Simon，D.，Schwenger，B.Sequences of the cDNA encoding bovine uridine monophosphatesynthase.Gene，1992，124：307-308.

[2]Schwenger，B.，Schober，S.，Simon，D.DUMPS cattle carry a point mutation in the uridine monophosphatesynthase gene.Genomics，1993，16：241-244

[3]Shanks，R.D.，Dombrowski，D.B.，Harpestad，G.W.，Robinson，J.L.Inheritance of UMP synthase in dairycattle.J.Hered，1984，75：337-340.

[4]李艳华等.中国荷斯坦牛脊椎畸形综合征的研究现状与展望.中国奶牛.2008，6：27-29。

序列表

<110>华中农业大学

<120>应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法

<130>

<141>2009-12-01

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

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<211>261

<212>DNA

<213>牛(Bos primigenius)

<400>1

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Claims (1)

1.应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法的特异性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下所示：

基因UMPS的扩增引物：

突变型：反向引物3’端第三位引入错配，扩增产物长度为261bp，

1F：5′ATGGGAGAAGGGGATAGGAG  3′，

1R：5′TCTGGTTTCATGCTTACGCA  3′；

野生型：正向引物3’端第三位引入错配，扩增产物长度为90bp；

2F：5′ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC  3′，

2R：5′AGGCTTACCTCCTGCTTCTA    3′。

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