CN106047870B - 树鼩mhc-drb1*1101基因序列及其应用 - Google Patents

树鼩mhc-drb1*1101基因序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开树鼩MHC‑DRB1*1101基因序列及其应用，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示；该树鼩MHC‑DRB1*1101基因序列应用于建立HCV模型，大大提高建立树鼩HCV模型的效率，并且减少资源的损失。结合已经建立成功的HCV树鼩模型，可能为该疾病的治疗找到一个新的靶点，为下一步开展HCV树鼩模型的治疗研究提供一个最基本资料，为开展的树鼩其它等位基因研究提供一个开始。

Description

树鼩MHC-DRB1*1101基因序列及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及树鼩MHC-DRB1*1101基因序列及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染在中国和世界范围内已成为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要病因之一。目前全球约有1.7亿HCV感染者，中国有3700～4000万。HCV感染的主要危险因素是静脉注射吸毒和输血。每年新增病例约300～400万，其中80%的感染者会发展为慢性肝炎，30%进展为终末期肝病，包括肝硬化、肝癌等。HCV急性感染后可引起机体一系列固有及适应性免疫反应。15～25%的HCV感染可被宿主免疫反应所自限清除，而大多数则呈慢性持续性感染，发展为慢性活动性肝炎、肝硬化及肝细胞癌。HCV的高度变异性、泛嗜性、免疫耐受、免疫损伤等因素，是导致HCV感染慢性化的重要原因。
虽然目前聚乙二醇干扰素和利巴韦林的联合应用明显提高了对慢性丙型肝炎患者的治疗效果，但仍有近50%的患者表现出持续性的病毒反应。这可能与不同个体的遗传学差异有关，此种差异可能是导致机体对HCV感染表现出不同的免疫反应的原因。近年来国内外有关宿主遗传基因与疾病关系的研究表明，人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）在宿主免疫基因系统的免疫应答中起着举足轻重的作用，编码HLA抗原的主要组织相容性复合体（major histo⁃compatibility complex，MHC）是脊椎动物中一个与免疫相关的多基因家族，是生物体重要的免疫遗传系统，也是目前已知的多态性最丰富的一个基因系统，拥有极大数量的等位基因，赋予种群巨大潜力以适应多变的内外环境，其丰富的等位基因水平被认为是生物体识别外来寄生物（细菌、病毒、原生动物及其他寄生虫和噬菌体）能力的重要部分。目前关于HCV感染的宿主遗传背景研究主要有4个方面，即HCV清除、HCV易感性、HCV持续性、HCV进展至肝硬化。就目前而言，HCV感染的宿主遗传背景的研究主要集中在HCV的清除方面。
已经有众多的研究结果表明HLA等位基因与HCV清除有关，虽然其它许多等位基因存在争议，但HLA-DQB1*0301、DRB1*1101和DRB1*1301是三个已为不同研究者在多个种族的研究中所证实的慢性丙型肝炎患者中有利于HCV清除的保护性基因位点，其可能的机制是DQB1*0301、DRB1*1101和DRB1*1301基因能有效地将HCV递呈给T淋巴效应细胞，激活或介导细胞免疫反应，从而发挥对HCV感染的保护作用。
树鼩（tree shrews, Tupaia belangeri）是一类树栖的攀鼩目（Scandentia）树鼩科（Tupaiinae），外型酷似松鼠的小型哺乳动物，进化上接近灵长类，分布与菲律宾、印度和我国西南部地区，我国主要分布于云南、广西、海南等地。我国有2个种、6个亚种，云南省最丰富。昆明地区主要分布的是滇西亚种（Tupaia Belangeri Chinensis），由于树鼩其特殊的分类地位和体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，方便实验操作、饲养成本低，新陈代谢等生理特征和解剖结构比犬、鼠等动物更接近于非人灵长类动物，以及存在诸多自发性疾病等特性，自上世纪80年代开始，就相继用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，用以作为某些人类重大疾病研究的动物模型，在医学实验中已被广泛应用。如丙型肝炎动物模型、乙型肝炎模型、手足口病模型、内分泌系统疾病等。
近几年对树鼩开发利用已进入了一个新的发展时期，在建立HCV动物模型方面也取得了较好的进展，然而，目前对树鼩的群体遗传结构还知之甚少，特别是关于树鼩MHC方面研究的国内还没有报道，这极大地限制了其在疾病动物模型研究的应用，也是其品系资源创制的瓶颈。故有必要发掘和利用树鼩对HCV易感、抗病的基因，为开展人类HCV模型建立、药物筛选、安全性评价以及滇西亚种树鼩的遗传监测等提供科学依据。
发明内容
本发明目的在于提供树鼩MHC-DRB1*1101基因序列及其应用，为高效建立理想的HCV树鼩模型提供保障。
本发明通过下列技术方案实现：树鼩MHC-DRB1*1101基因序列，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示。
所述树鼩MHC-DRB1*1101基因序列，其引物序列为：
引物序列上：5'-GTT TCT TGG AGT ACT CTA CGT C-3'
引物序列下：5'-CTG CAC TGT GAA GCT CTC AC-3'。
本发明的另一个目的在于提供所述树鼩MHC-DRB1*1101基因序列在HCV模型建立上的应用。
本发明的核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：（1）用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的核苷酸序列；和（2）表达文库的抗性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序列片段。
本发明具备的优点及效果：
人HLA-DRB1*1101基因与HCV病毒清除感染有关，即携带HLA-DRB1*1101等位基因的人群不容易感染HCV病毒；而现在用树鼩建立HCV模型效率仍很低，一些树鼩不容易感染HCV病毒，鉴于此，发掘树鼩体内与HCV病毒清除有关的DRB1*1101基因，在建模之前对树鼩DRB1*1101基因进行检测，如果结果为阳性，则不用来感染HCV病毒，而筛选DRB1*1101基因呈阴性的树鼩来感染HCV，这样将会大大提高建立树鼩HCV模型的效率，并且减少资源的损失。另外，本发明提供基因序列是与HCV清除有关的有效基因，序列大小为267bp，在本物种是第一次被检测发现，本序列对这个群体的遗传背景提供了很重要的信息，为开展其他疾病动物模型研究提供一个最基本资料，并且为大量高效建立HCV动物模型提供最首要信息。
另外HCV急性感染后可引起机体一系列固有及适应性免疫反应。15～25%的HCV感染可被宿主免疫反应所自限清除，而大多数则呈慢性持续性感染，发展为慢性活动性肝炎、肝硬化及肝细胞癌。其中被宿主自限清除的原因和机制迄今尚不完全清楚，特别DRB1*1101对HCV的清除的调控机制知之甚少，用现代分子遗传学，寻找这些疾病相关的具体基因或相关DNA序列，是病因学研究的切入点之一。本基因序列的发现就起到了这样一个作用。
本发明提供的基因序列在人类已被明确证实是HCV有效清除的一个基因，即也是一个抗病的基因，以该基因入手，结合已经建立成功的HCV树鼩模型，可能为该疾病的治疗找到一个新的靶点，为下一步开展HCV树鼩模型的治疗研究提供一个最基本资料，为开展的树鼩其它等位基因研究提供一个开始。
附图说明
图1为本发明所得树鼩MHC-DRB1*1101基因序列与genebank中最相似的序列(AC234247.1)的比对图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1
实验动物：滇西亚种树鼩（Tupaia belangeri chinensis），由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供。
主要试剂：SanPrep柱式DNA提取试剂盒（购自生工生物工程有限公司）；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（购自生工生物工程有限公司）；DH5α菌种（购自北京百泰克生物技术有限公司）；PMD19-T载体（购自宝生物工程有限公司）；Tris-base、Na2EDTA·2H2O、冰乙酸、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、1×TAE缓冲液、琼脂糖、花青素（核酸染料）、DNA Marker（DL2000）、无菌双蒸水、无水乙醇、0.1MCaCl2溶液、NaCl（重庆川东化工有限公司）、Prptone、Yeast Extract（生工生物工程有限公司）、Agar（日本）、琼脂糖（香港）。
引物：参照人类已知的HLA-DRB1*1101基因序列引物对树鼩MHC-DRB1*1101进行了扩增。
引物序列上：5'-GTT TCT TGG AGT ACT CTA CGT C-3'
引物序列下：5'-CTG CAC TGT GAA GCT CTC AC-3'
根据上述材料，树鼩MHC-DRB1*1101基因序列获取的步骤如下：
（1）取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。（对如果全血起始量小于200ul，则用缓冲液BB补足到200ul。如果起始量介于200～300ul之间，则后续操作需要按比例增加试剂用量。）
（2）加入20ul蛋白酶K（20mg/ml）溶液，室温15分钟（期间颠倒混匀几次），加入200ul结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，70℃放置10分钟，溶液变清亮。
（3）加入100ul异丙醇（陈旧血加200ul异丙醇），剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
（4）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，（吸附柱放入收集管中）10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
（5）加入500ul抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
（6）加入700ul漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
（7）加入500ul漂洗液（WB），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
（8）将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量出去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
（9）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热），室温放置3～5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。
（10）采用分光光度法测定其含量和吸光度值，存放在2～8℃下备用。
其DNA扩增步骤如下：
（11）PCR的体系：将PCR缓冲液80ul、双蒸水105.8ul和Taq酶（5U/ul）1.2ul混匀，取混匀液体10ul加至PCR试剂板的污染监控孔中（即阴性对照孔）。向剩余的混合液中加DNA样品（50ng/ul）2ul，混匀。除污染监控孔外，每孔加上述混合液10ul。贴上封板膜，标记样品号。10×buffer 5ul、dNTP 4ul、引物上下各2ul、DNA样本各16ul、Taq 0.4ul、H2O 20.6ul，总共配成50ul体系进行PCR扩增；标记样本号。
（12）热循环条件如下：
最后72℃延伸12min。
（13）琼脂糖凝胶电泳：2.0%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察。
其琼脂糖凝胶回收步骤如下：
（14）通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。
（15）根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖（如胶块不足100mg则用水补充至100mg）加300-600ul的比例加入Buffer B2。
凝胶浓度≤1%，每100mg凝胶加入300ul Buffer B2；
凝胶浓度＞1%，≤1.5%，每100mg凝胶加入400ul Buffer B2；
凝胶浓度＞1.5%，≤2%，每100mg凝胶加入500ul Buffer B2；
凝胶浓度＞2%，每100mg凝胶加入600ul Buffer B2；
（16）将离心管置于50℃水浴5-10min,间或混匀，直至胶块完全融化。
（17）将融化好的溶液全部移入吸附柱，80000×g 离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（18）向吸附柱中加入300ul Buffer B2，9000×g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（注：Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确的无水乙醇。）
（19）向吸附柱中加入500ulWash Solution，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（20）重复步骤6一次。
（21）将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。
（22）在吸附膜中央加入15-40ulElution Buffer，室温静置1～2min，9000×g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
其基因克隆及测序的步骤为：
（23）连接：取胶回收到的PCR产物4ul与pMD19-Tvector 1ul、H2O 1ul、solution I5ul，配成 11ul 的连接体系在16℃进行过夜连接。
（24）1～80℃冰箱中取出预先制备好的DH5α感受态细胞悬浮液（100ul/支），立即置于冰上解融。
（25）等DH5α感受态细胞悬浮液解融后，立即将连接好的10ul全量连接产物加入100ul/支（1.5ml 离心管）DH5α感受态细胞悬浮液中，标记样本号，置冰上冰浴30分钟。
（26）42℃水浴中热激90秒或37℃水浴热激3～5分钟后，迅速置冰上冰浴3～5分钟。
（27）按上述处理后，分别向上述1.5ml的离心管中加入自制的1ml不含氨苄（AMP）的LB培养基，轻轻震荡混匀后，在37℃的恒温震荡摇床上37℃、250rpm震荡培养1小时（使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素，抗性基因AMPr）。
（28）将上述培养的菌液，在4000rpm离心5分钟，弃上清液保留400ul左右，混匀菌液，取200ul涂布于含 50ug/mlAMP的筛选LB培养基培养皿上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，放在细菌培养箱中，37℃恒温培养16小时，细菌生长良好，单个较大菌落比较多，取出，置4℃冰箱保存。同时做对照组，以相同体积的无菌双蒸水代替菌液，其他操作和上述操作相同，对照组正常情况下在含有50ug/ml氨苄的LB培养基培养皿上应无任何菌落出现。
（29）培养16小时后，LB培养基平皿上菌落生长良好，双蒸水代替菌落的培养皿上无菌落出现。每个培养平皿中挑5个单个较大的圆滑菌落于预先准备好的5mlLB液体培养基（含50ug/ml的氨苄AMP）管中，在恒温培养摇床，37℃、250rpm恒温震荡培养16小时后，培养基变得很浑浊，菌液很稠，证明细菌生长良好，将中管中的菌液取出，8000rpm离心5分钟浓缩菌液，弃上清，保留1.5ml，混匀菌液，标记样本号，送上海生工生物工程有限公司做测序。
经过上述步骤后，其PCR检测结果为MHC-DRB1*1101基因片段的大小分别为267bp，用分子量 DL2000 Marker标准检测，与预计片段符合。
采用测序仪器为：3730xl DNA Analyzer，测序试剂为：BigDye terminator v3.1，得到大小片段为267bp的长序列如下：
tgtgaagct ctcaccaagt gattctgcaa actagtagaa aaataaacat aagcaagattattgacgtaa ttattcccaa gaaataccat aaaggatggt aatgcatgtt aaaaggatta gtgcttttacaaaggggttt ttagaagaca ttgcatatct ccacttaaca tatactgactc tctgcactgt cgtagagactgaaagactgg agaacataaa agtattaaaa attgtaatgg actctagagt caaagtggaa agagagt
本次获得的树鼩MHC-DRB1*1101基因与genebank中没有找到完全相同的序列，即是树鼩的一条新的序列，并且通过5个以上单克隆证实无误，并且除了人类外，这个等位基因序列在其它物种被发现的也很少。与genebank中最相似的序列（北方树鼩，the northerntree shrew，AC234247.1）比对，相似度为90%（见图1）。
黑猩猩是迄今为止HCV感染最好的动物模型，但由于资源的稀缺，找寻一种经济、简便、容易饲养的动物将可能替代这个动物成为HCV较好的替代模型，本发明所得树鼩MHC-DRB1*1101基因的同源性比对得知与genebank中黑猩猩MHC-DRB1*1001（M94942.1）同源性达34.17%、人类HLA-DRB1*1101（AM689932.1）的同源性均达36.53%。
将上述树鼩MHC-DRB1*1101基因序列应用于HCV模型的建立，具体步骤如下：
（1）挑选滇西亚种树鼩200只（由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供），4-8周龄，雌、雄各半。
（2）尾部静脉采血（抗凝处理），按上述常规方法提取血液DNA样本。
（3）用之前设计好的树鼩MHC-DRB1*1101引物和建立好的PCR反应体系及反应条件，来扩增这些DNA样本。
（4）跑胶验证结果：如果树鼩MHC-DRB1*1101基因显示阳性，则挑选出该样本重新PCR，进行再验证。
（5）只有在至少两次的重复性条件下验证为MHC-DRB1*1101基因阳性的样本不用来感染HCV病毒，而挑选MHC-DRB1*1101阴性（也是经过重复性验证为阴性）的树鼩用来建立HCV模型。
（6）结果：树鼩HCV感染模型效果更稳定，成模效率更高。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人名称 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 发明名称树鼩MHC-DRB1*1101基因序列及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 267
<212> DNA
<213> Tupaia belangeri
<400> 1
tgtgaagct ctcaccaagt gattctgcaa actagtagaa aaataaacat aagcaagatt 60
attgacgtaa ttattcccaa gaaataccat aaaggatggt aatgcatgtt aaaaggatta 120
gtgcttttac aaaggggttt ttagaagaca ttgcatatct ccacttaaca tatactgactc 180
tctgcactgt cgtagagact gaaagactgg agaacataaa agtattaaaa attgtaatgg 240
actctagagt caaagtggaa agagagt 267
<210> 2
<213> Tupaia belangeri
<400> 2
gtttcttgga gtactctacg tc 22
<210> 3
<213> Tupaia belangeri
<400> 3
ctgcactgtg aagctctcac 20

Claims (2)

1.树鼩MHC-DRB1*1101基因序列，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的树鼩MHC-DRB1*1101基因序列，其特征在于：所述树鼩MHC-DRB1*1101基因序列的引物序列为：
引物序列上：5'-GTT TCT TGG AGT ACT CTA CGT C-3'
引物序列下：5'-CTG CAC TGT GAA GCT CTC AC-3'。
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