CN101878747B - 一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法 - Google Patents
一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，分别以基因组重组了RdRp可调控表达载体的转基因小鼠和Cre/Lap双转基因小鼠为亲本进行杂交，选择繁殖能力强的亲本的子代，且通过PCR扩增鉴定基因组包含Cre、Lap和RdRp基因的个体，作为Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠的F1代子代；分别以F1代子代和正常的小鼠为亲本进行杂交，筛选繁殖能力强，并且基因组包含Cre、Lap和RdRp基因的子代个体，继续与正常小鼠交配，繁殖扩群，直至得到Cre/Lap/RdRp稳定遗传的模型小鼠。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及新型HCV感染动物模型的构建，特别涉及一种RdRp可调控表达和观测的小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝病的主要病原体，全世界约有1.7～2.0亿的感染者，我国HCV感染者约5000万人。被HCV感染后，50％～85％的感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％的感染者发展为肝硬化，部分发展为肝癌。HCV严重危害人类健康，已经成为全球性的、重要的公共卫生问题。迄今，尚缺乏有效的抗HCV治疗措施，也无疫苗可用。
HCV基因组全长约9.6kb，含有单一开放读框(ORF)，该ORF编码大约3010～3033个氨基酸的多聚蛋白前体；所编码的蛋白前体在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的共同作用下分解成10个成熟的蛋白或酶。HCV至少编码4种病毒复制所需的酶，分别是NS2/3白体蛋白酶、NS3NTP酶/解旋酶、NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA多聚酶(一种依赖RNA的RNA聚合酶，简称RdRp)。
在病毒复制中起着关键作用的酶是目前抗HCV的靶位，在已创建HTS分析、确定晶体结构并可证实有效抑制剂技术的机构中，大多数研究的工作重点都放在NS3/4A丝氨酸蛋白酶和RdRp的特异性抑制剂上。RdRp在HCV基因组复制中起着关键作用，这种酶是病毒复制中各RNA合成步骤所必需的，对这种关键酶活性的抑制会导致HCV在感染细胞中复制的降低。而且，被RdRp催化的酶反应，RNA依赖的RNA合成，是一种通常不在非感染细胞中发生的反应。晶体结构显示RdRp有着经典的RdRP聚合酶的结构特征和保守基序。RdRp还有着独特的结构：拇指-手掌-手指形成独特的相互作用，RdRp的活性位点由拇指与手指结构域的相互作用形成一个完全环绕的区域，它用双或三核苷酸去有效的起始RNA复制，而且由聚合酶、模板、引物形成的起始复合物，在3UTR处组装。这与其它已知的DNA与RNA聚合酶不同，提示它是一个非常有潜力的靶点。所以NS5B RNA聚合酶是理想的抗HCV靶位之一，如果发现这种酶的特异性抑制剂，就能阻断HCV的复制。
长期以来，HCV的研究一直面临一大难题：缺少稳定可靠的HCV感染动物模型，严重阻碍了对HCV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗研究等进程。目前，HCV动物模型的研究主要集中在感染动物模型、人-鼠肝脏嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型三个方面，但都存在很大的局限性。
HCV的感染动物模型主要包括黑猩猩和树鼩。黑猩猩是迄今为止惟一适合HCV感染并支持其复制的动物模型，但我国不产黑猩猩，完全需要引进，并受《国际公约》严格限制，而且繁殖率低，数量有限，费用昂贵，因此，其来源与应用受到了极大限制。虽然研究表明树鼩可形成HCV急性感染症状，但HCV感染树鼩后病毒的复制及表达水平不高，也难以建立HCV慢性感染模型，加之其是野生动物，很难在实验室中喂养，从而限制了它们的应用。
人-鼠肝脏嵌合小鼠模型的缺点是人肝细胞供体来源有限，移植技术难度大，移植成功率低，不适于大样本筛选和统计分析。
转基因小鼠作为HCV感染动物模型存在的主要问题是：转基因小鼠在传代是一出生就表达目的基因，使机体误识别为自身蛋白而使小鼠终生处于免疫耐受状态，与HCV自然感染状态差异较大，由此得出的数据和结果缺乏可信度，使其在致病机制和抗病毒药物评价上受到了一定限制。
因此建立一种新型HCV感染动物模型，用于对HCV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗，对早日解决HCV对人类健康的危害人类非常重要。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，构建RdRp受到严格调控表达，并且能够利用活体成像技术直观观测RdRp抑制剂效果的新型HCV感染动物模型，用于致病机理的研究和抗HCV抑制剂筛选。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
1)分别以基因组重组了RdRp可调控表达载体的转基因小鼠和Cre/Lap双转基因小鼠为亲本进行杂交：由1只雄性Cre/Lap双转基因小鼠与2只雌性RdRp单转基因小鼠进行交配，或者由1只雄性RdRp单转基因小鼠与2只雌性Cre/Lap双转基因小鼠进行交配；
2)选择繁殖能力强的亲本的子代，且通过PCR扩增鉴定基因组包含Cre、Lap和RdRp基因的个体，作为Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠的F1代子代；
3)分别以F1代子代和正常的小鼠为亲本进行杂交：由1只雄性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠与2只雌性正常小鼠进行交配，或者由1只雄性正常小鼠与2只雌性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠进行交配；
筛选繁殖能力强，并且基因组包含Cre、Lap和RdRp基因的子代个体，继续与正常小鼠交配，繁殖扩群，直至得到Cre/Lap/RdRp稳定遗传的模型小鼠。
所述的RdRp可调控表达载体为PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体，包含有RdRp-双向启动子Ptetbi-1-lacZ-loxP-Luciferase-polyA-loxP的元件排列。
所述的PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体的构建为：
1)在含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体PBI-3的lacZ报告基因的另一侧顺序加入loxP、Luciferase、polyA、loxP调控元件及报告基因，构建真核表达载体PBI-3-Luc-pA；
loxP、Luciferase、polyA调控元件的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～3所示；
2)以引物对P为引物，以包含RdRp基因的载体或基因组为模板，PCR扩增RdRp基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；所述的引物对P为：
上游引物：gaagcggccg catgtcgatg tcctacacat 30；
下游引物：gccgtcgact catcggttgg ggagtagat 29；
3)用Sal I和Not I双酶切表达载体PBI-3-Luc-pA并回收的大片段，将回收的大片段用T4连接酶与同样Sal I和Not I双酶切的RdRp基因扩增片段连接，得到表达载体PBI-3-Luc-pA-RdRp。
所述的Cre/Lap双转基因小鼠为表达Cre重组酶基因和Lap肝脏启动子的小鼠，受到盐酸强力霉素调控诱导后荧光素酶在肝脏开始表达的小鼠。
所述的Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠在受到盐酸强力霉素诱导后，Cre重组酶被启动表达表达，并特异性地切除两个loxP位点之间包括polyA的终止序列，rtTALAP-1中的rtetR分子与Ptetbi-1中的tetO序列特异性结合，RdRp基因开始表达。
所述的用于杂交的亲本小鼠为6～8周龄。
与现有HCV转基因动物模型和技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明构建的RdRp可调控表达和观测的小鼠模型是一种Cre/Lap/RdRp三重转基因小鼠，该小鼠模型是RdRp严格调控表达的模型，在没有dox诱导时RdRp不表达，在dox诱导时RdRp在肝脏开始表达；由于该模型当中RdRp的是表达通过dox饲喂后的诱导表达，其诱发的生理病理变化更接近HCV自然感染动物；
而且由于Cre/Lap/RdRp三重基因的共调控表达，RdRp与荧光素酶被同时在肝脏部位诱导表达，这样能够利用小鼠活体成像技术直观观察不同情况下RdRp的表达情况(比如在不同的RdRp抑制剂存在的情况)，在诱导剂dox存在的情况下，或者其他HCV抑制剂存在的情况。
2、本发明在Cre/Lap双转基因小鼠与RdRp单转基因小鼠杂交中，采取由1只雄性Cre/Lap双转基因小鼠与2只雌性RdRp单转基因小鼠进行交配，或者由1只雄性RdRp单转基因小鼠与2只雌性Cre/Lap双转基因小鼠进行交配，记录其繁殖能力；在筛选子代基因阳性的基础上，去除繁殖能力差和PCR检测阴性的小鼠，筛选背景表达低、诱导性能强的RdRp三重转基因小鼠，克服了转基因小鼠生育率低的缺点，缩短了实验周期。
3、本发明提供的RdRp可调控表达和观测的小鼠模型应用于HCV抑制剂或药物的筛选、评价和致病机理研究：
a、在小鼠模型被dox诱导饲喂后，体内注射HCV抑制剂或药物，通过活体成像技术观察RdRp的表达情况，在众多药剂中筛选对HCV RdRp有抑制作用的抑制剂或药物；或者评价其他方法初筛到的对HCV RdRp抑制剂或药物的体内作用效果。由于其诱发的生理病理变化更接近HCV自然感染动物，应用该模型筛选和评价HCV药物时得到的数据更客观。
b、在小鼠模型被dox诱导饲喂后，诱导RdRp高、低、中表达，检测各种先天性免疫因子的变化，用于RdRp在HCV发病机理中的研究。
附图说明
图1为pBI-3表达载体质粒图谱；
图2为PCR扩增的RdRp基因的凝胶电泳结果图；
图3为PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体的Sal I/Not I双酶切鉴定结果图；
图4为PCR鉴定RdRp单转基因小鼠的阳性结果；
图5为PCR鉴定Cre/Lap双转基因小鼠Cre阳性结果图；
图6为PCR鉴定Cre/Lap双转基因小鼠Lap阳性结果图；
图7为小鼠活体成像仪检测Cre/Lap双转基因子代鼠的结果图；
图8为PCR鉴定Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠子代鼠的RdRp阳性结果图；
图9为PCR鉴定Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠子代鼠的Cre阳性结果图；
图10为PCR鉴定Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠子代鼠的Lap阳性结果图；
图11为小鼠活体成像仪检测可严格调控表达Cre/Lap/RdRp三重转基因子代鼠的结果。
具体实施方式
本发明提供一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法。首先，将RdRp基因克隆于特异性表达载体，然后，将RdRp可调控表达的单转基因小鼠与Cre/Lap双重转基因小鼠杂交，筛选得到繁殖能力强、背景表达低、诱导性能强的RdRp/Cre/Lap三重转基因小鼠，所筛选的小鼠能够通过dox诱导严格调控RdRp的表达，通过转基因技术制备RdRp可调控表达的单转基因小鼠，该小鼠在正常饲喂时RdRp不被表达，经过dox饲喂诱导后，RdRp在肝脏开始表达；又能利用小鼠活体成像技术直观观察RdRp抑制剂效果；最后，通过RdRp/Cre/Lap三重转基因小鼠与普通小鼠的杂交繁殖扩群，直至外源基因能够稳定传代。下面结合附图对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、RdRp可调控表达的单转基因小鼠的构建
1.1构建表达RdRp的转基因载体
1.1.1在含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体PBI-3(其质粒图谱如图1所示)的lacZ报告基因的另一侧顺序加入loxP、Luciferase、polyA、loxP调控元件及报告基因，构建真核表达载体PBI-3-Luc-pA；loxP、Luciferase、polyA调控元件的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1、2、3所示，其中，lacZ是β-半乳糖苷酶报告基因；前后两个loxP序列的排列顺序相同，这样Cre重组酶就会特异性地切除两个LoxP位点之间的目的基因，从而达到特异性地敲除目的基因的目的，Luciferase为荧光素酶报告基因，polyA多聚腺苷酸尾终止序列的添加是为了更加严格地避免RdRp的漏过性表达。
1.1.2将真核表达转基因载体PBI-3-Luc-pA用限制性内切酶Sal I和NotI双酶切，琼脂糖凝胶回收大片段，用试剂盒纯化后-20℃贮存备用。
1.1.3PCR扩增RdRp蛋白酶编码基因
以引物对P为引物，HCV 1b型Con1株基因组DNA为模板，PCR扩增RdRp基因，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分50秒，共进行35个循环。
所述的引物对P为：
上游引物：gaagcggccg catgtcgatg tcctacacat 30；
下游引物：gccgtcgact catcggttgg ggagtagat 29；
该对引物能够扩增大小为1773bp的RdRp基因，其中，上游引物含SalI酶切位点，下游引物含Not I酶切位点；将PCR扩增的产物进行凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，其中，泳道1为Marker，泳道2为扩增的片段；
将扩增的RdRp基因片段用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切的，回收片段并纯化。
1.1.4将同样用Sal I和Not I双酶切的RdRp基因扩增片段与表达载体PBI-3-Luc-pA回收的大片段，用T4连接酶连接构建表达载体PBI-3-Luc-pA-RdRp；并将PBI-3-Luc-pA-RdRp转染感受态的大肠杆菌，扩增后提取质粒用Sal I/Not I双酶切法筛选阳性克隆，鉴定结果如图3所示，其中，泳道1为Marker，泳道2为双酶切后的载体，可以看到被切成大小两个片段，其中小片段为插入的RdRp基因片段；将鉴定正确的载体进行测序鉴定，RdRp基因的测序结果如SEQ.ID.NO.4所示。
1.1.5用Ase I单酶切PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体载体，由于pBI-3有两处能够被Ase I识别的位点(如图1所示)，则酶切后获得两个片段，小片段大小为1235bp，包含插入的调控元件和RdRp基因的大片段大小为10317bp，回收纯化大片段后置-20℃贮存备用。
1.2把Ase I单酶切PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体载体后纯化回收的大片段显微注射入受精卵原核，并植入受精卵受体
1.2.1选取7～8周龄雌性小鼠，作为提供受精卵的供体，每只小鼠腹腔注射10IU的孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonado tropinPMSG)，47～48小时后，每只小鼠腹腔注射0.8IU的人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin HCG)，并与正常雄鼠合笼；另取数只2月龄以上的母鼠作为受体(作为受精卵胚胎发育的母体)，与结扎公鼠合笼。
1.2.2第二天观察供体、受体，将有精栓的供体和受体取出备用。
断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入终浓度为300μg/mL的透明质酸酶的M2培养液(Sigma公司)中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞一同流出。
1.2.3仔细观察放在M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，用M2培养液洗涤，最后放在M16培养液中(Sigma公司)，放入5％CO2，37℃培养箱培养。
1.2.4受精卵培养后，在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
1.2.5在显微微量操作器上安装持卵针和注射针，使其末端平行于微量注射台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
1.2.6在高倍镜下，将预先吸入PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体酶切后纯化回收的大片段DNA的注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，注射DNA直至看到原核膨大即退出。将注射过载体DNA的和未注射过的受精卵分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入M16培养液中，5％CO2，37℃培养箱培养。
1.2.7将作为受体的雌性小鼠麻醉，腹腔注射1％戊巴比妥钠0.01ml/g。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。移植管吸取注射载体后经培养成活的受精卵，吸取时吸成四段液体三个气泡。
1.2.8将移植管口插入输卵管开口，轻轻将移植管内的液体吹入，直到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，重组受精卵移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
1.2.9把植入重组受精卵的小鼠放入转基因动物培养室正常饲养。动物饲养室的光周期为8:00～20:00，暗周期为20:00～8:00。
1.3筛选背景表达低的表达RdRp的转基因小鼠。
1.3.1取植入重组受精卵的小鼠所生的3周龄的新生的RdRp的转基因小鼠，用无菌剪刀剪取约0.5cm长的鼠尾放入Eppendorf管中，加入500μL消化缓冲液(含20mg/ml蛋白酶K、25Mm EDTA、1％SDS的Tris-HCL)，55℃温浴过夜。用1∶1酚/氯仿、氯仿各抽提一次，合并两次抽提液用2倍体积的无水乙醇沉淀，将沉淀的DNA再用70％乙醇洗涤，干燥后将提取的DNA溶于200μL的灭菌去离子水中，-20℃保存备用。
1.3.2新生转基因小鼠的PCR检测：以提取的基因组DNA作为模板，引物对P为引物，PCR扩增检测RdRp基因，PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，最左侧的泳道为Marker，其他显示出RdRp条带的泳道为RdRp阳性的小鼠。
1.3.3转基因小鼠的繁殖保种：
将上述得到的背景表达低的表达RdRp的转基因小鼠与正常小鼠交配，得到F1代小鼠，以PCR法检测筛选RdRp双阳性的小鼠，然后继续与正常小鼠交配，繁殖扩群，同样的方法筛选RdRp双阳性小鼠，直至外源基因RdRp稳定传至子代。
2、Cre/Lap双转基因小鼠的筛选
2.1Cre、Lap单转基因小鼠胚胎的复苏：Cre和Lap单转基因小鼠胚胎均由德国海德堡大学赠送。这两种小鼠分别表达Cre重组酶基因和Lap肝脏启动子。解冻时将冷冻管从液氮中取出立即置于0℃冰水浴中，一旦融解立即放入4℃以下的50％玻璃化溶液VS中10min，再置4℃以下的25％玻璃化溶液VS中10min，然后升温至20℃，再置磷酸盐缓冲液PBS中冲洗数次后移入假孕母鼠子宫，培养后产出Cre和Lap单转基因小鼠。
2.2Cre/Lap/双转基因小鼠的构建
2.2.1Cre单转基因小鼠与Lap单转基因小鼠的杂交
选择6～8周龄的Cre单转基因小鼠与Lap单转基因小鼠作为杂交的亲本，分为不同的小组进行交配，每组分别由1只雄性Cre单转基因小鼠(或Lap单转基因小鼠)与2只雌性Lap单转基因小鼠(或Cre单转基因小鼠)进行交配，所产生子代基因型无区别。观察各组子代小鼠的生育状况，收集亲本生殖能力强的子代鼠用于筛选检测。
2.2.2Cre/Lap/双转基因小鼠的鉴定
取3周龄的新生杂交小鼠，用无菌剪刀剪取约0.5cm长的鼠尾放入Eppendorf管中，加入500μL消化缓冲液(含20mg/ml蛋白酶K、25MmEDTA、1％SDS的Tris-HCL)，55℃温浴过夜。用1∶1酚/氯仿，氯仿各抽提一次，用2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，干燥后溶于200μL的灭菌去离子水中，-20℃保存备用。以提取的基因组DNA为模板，引物对P1、P2为引物分别PCR扩增Cre和Lap基因，检测子代小鼠的基因型，P1引物对设计如下：
上游引物：gcggtctggc agtaaaaact atc 23；
下游引物：gtgaaacagc attgctgtca ctt 23；
P2引物对设计如下：
上游引物：ccatgtctag actggacaag a 21；
下游引物：ctccaggcca catatgatta g 21；
PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，能够检测到Cre基因条带的PCR鉴定Cre阳性的结果如图5所示，最左侧的泳道为Marker，其他显示出Cre条带的泳道为Cre阳性的小鼠；如图6所示，最左侧的泳道为Marker，其他显示出Lap条带的泳道为Lap阳性的小鼠；
筛选Cre和Lap基因均显示为阳性的小鼠，即基因型为Cre/Lap双阳性的双转基因小鼠。
2.3筛选在可严格调控表达Cre重组酶双转基因小鼠
2.3.1盐酸强力霉素(dox)及活体动物成像技术检测荧光素酶活性：
取4周龄基因型阳性Cre/Lap双转基因小鼠。使用含有0.2～2mg/ml dox和质量分数5％蔗糖的饮水饲养1周，饲养室的光周期为8:00～20:00，暗周期为20:00～8:00。由于PLap启动子限制rtTA基因只在肝脏细胞特异性表达，而rtTA是四环素控制的反向四环素调控转录激活因子，当Cre/Lap双转基因小鼠被dox饲喂诱导后，此双转基因小鼠肝脏部位的Ptetbi-1双向启动子被被特异性的激活，分别启动下游Cre重组酶及荧光素酶(Luciferase)报告基因的表达。在饲养1周后，每只小鼠腹腔注射375mg/kg的D-虫荧光素(D-luciferin)然后采用3～4％异氟烷吸入麻醉，麻醉后用生物发光成像系统(Xenogen IVIS 200，Caliper，CA，USA)进行荧光信号检测。只有肝脏部位的Ptetbi-1双向启动子被被特异性的激活，启动荧光素酶表达的小鼠才能够与特异性的D-虫荧光素作用，所以只有在Cre/Lap表型阳性的双转基因小鼠可检测到肝脏部位特异性强荧光信号，而作为阴性对照的无Lap表型的小鼠的对照组则无荧光信号。如图7所示的检测结果：(荧光信号的强弱以不同的颜色表示，红色为最强)，其中，模型1为Cre/Lap/RdRp表型阳性的转基因小鼠，在小鼠的肝脏可以看到强荧光信号(显示为红色的荧光)，模型2为表型阴性小鼠，模型3为作为对照的正常小鼠。
对比模型可以看出：Cre/Lap双转基因小鼠被dox饲喂诱导之后，能够被调控表达，在注射D-虫荧光素之后，表型阳性小鼠能够通过荧光检测系统而被清晰的显示。
2.3.3转基因小鼠的繁殖保种：
筛选出在dox诱导条件下可严格调控表达Cre/Lap重组酶的双转基因小鼠(未诱导则不表达)，然后连续传代，对基因型和表型均保持稳定的转基因小鼠与其他正常小鼠杂交，然后筛选其后代当中严格调控表达Cre/Lap双转的基因型，进行繁殖保种。
3、Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠模型的构建
3.1Cre/Lap双转基因小鼠与RdRp单转基因小鼠的杂交
选择受到严格调控表达的6～8周龄的Cre/Lap双转基因小鼠与RdRp单转基因小鼠作为杂交的亲本，分为不同的小组进行杂交：
一种组别为：由1只雄性Cre/Lap双转基因小鼠与2只雌性RdRp单转基因小鼠进行交配；
另外一种组别为：由1只雄性RdRp单转基因小鼠与2只雌性Cre/Lap双转基因小鼠进行交配；
这两种杂交方式所产生子代基因型无区别，都为Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠。
Cre/Lap双转基因小鼠是可在dox诱导调控下表达Cre重组酶的双转基因小鼠，并且RdRp单转基因小鼠所包含的表达载体当中的具有以下的元件排列：RdRp-双向启动子lacZ-Ptetbi-1-loxP-Luciferase-polyA-loxP，杂交后获得的Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠，在不使用dox诱导时，rtTALAP-1中的rtetR分子不能与Cre双转基因小鼠调控序列中的tetO序列结合，Cre重组酶不表达，RdRp亦不表达，此时，即便RdRp中的启动子与其它转录因子存在少量的非特异性结合，但启动子下游插入的终止序列最终将阻止RdRp的漏过性表达。相反，在使用dox诱导时，Cre重组酶表达，并特异性地切除RdRp表达载体中两个loxP位点之间的终止序列，rtTALAP-1中的rtetR分子与Ptetbi-1中的tetO序列特异性结合，RdRp开始表达，由于此时表达的RdRp是后天人工诱导产生的，所以小鼠产生的针对RdRp的免疫病理变化更接近自然感染，不会产生免疫耐受，更适合于HCV致病机理的研究和抗RdRp抑制剂的筛选和评价。
观察各组子代小鼠的生育状况，选择繁殖能力强的亲本的子代，这样就克服了转基因小鼠生育率低的缺点，有利于缩短了实验周期。
3.2Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠的鉴定
取上述两种杂交产生的所有2周龄子代鼠，剪尾提取基因组DNA，以其为模板，PCR分别扩增RdRp基因、Cre基因和Lap基因，检测子代小鼠的基因型，PCR扩增引物分别为P、P1、P2。
将PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR鉴定RdRp基因、Cre基因和Lap基因同时为阳性的子代鼠即为基因型阳性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠。RdRp基因、Cre基因和Lap基因的检测结果分别如图8、图9、图10所示，可以看到筛选的Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠其RdRp基因、Cre基因和Lap基因的检测结果均为阳性。
3.3筛选可严格调控表达RdRp蛋白酶的三转基因小鼠。
3.3.1盐酸强力霉素(dox)诱导及活体成像仪检测RdRp的诱导表达
对Cre/Lap/RdRp检测阳性的4周龄的子代小鼠，用含有0.2～2mg/ml dox和质量分数5％蔗糖的饮水进行饲养1周，饲养室的光周期为8:00～20:00，暗周期为20:00～8:00。
饲养1周后，每只小鼠腹腔注射375mg/kg的D-虫荧光素(D-luciferin)然后采用3～4％异氟烷吸入麻醉，麻醉后用生物发光成像系统(Xenogen IVIS200，Caliper，CA，USA)进行荧光信号检测，Cre/Lap/RdRp表型阳性小鼠可检测到肝脏部位特异性强荧光信号，表型阴性小鼠及对照组无荧光信号。具体的检测结果如见图11所示，模型1为Cre/Lap/RdRp表型阳性的转基因小鼠，在小鼠的肝脏可以看到强荧光信号(显示为红色的荧光)，模型2为表型阴性小鼠，模型3为作为对照的正常小鼠。
3.4Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠的繁殖保种
选择鉴定阳性的6～8周龄Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠与正常小鼠作为亲本，分为不同的小组，每组分别由1只雄性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠与2只雌性正常小鼠进行交配，或者由1只雄性正常小鼠与2只雌性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠进行交配，其所产生子代基因型无区别。得到F1代小鼠，经基因型和表型检测后，以F1代小鼠继续与正常小鼠交配，繁殖扩群，直至外源基因稳定传至后代。
核苷酸序列表
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法
<160>4
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210>2
<211>1653
<212>DNA
<213>luciferase
<400>2
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
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<211>225
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<213>人工合成
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<210>4
<211>1773
<212>DNA
<213>Hep atitis C virus
<400>4
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gtaggggtag gcatctatct actccccaac cga 1773
Claims (5)
1.一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）分别以基因组重组了RdRp可调控表达载体的转基因小鼠和Cre/Lap双转基因小鼠为亲本进行杂交：由1只雄性Cre/Lap双转基因小鼠与2只雌性RdRp单转基因小鼠进行交配，或者由1只雄性RdRp单转基因小鼠与2只雌性Cre/Lap双转基因小鼠进行交配；
所述的RdRp可调控表达载体为PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体，包含有RdRp-双向启动子Ptetbi-1-lacZ-loxP-Luciferase-polyA-loxP所示的元件排列；
2）选择繁殖能力强的亲本的子代，且通过PCR扩增鉴定基因组包含Cre、Lap和RdRp基因的个体，作为Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠的F1代子代；
3）分别以F1代子代和正常的小鼠为亲本进行杂交：由1只雄性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠与2只雌性正常小鼠进行交配，或者由1只雄性正常小鼠与2只雌性Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠进行交配；
筛选繁殖能力强，并且基因组包含Cre、Lap和RdRp基因的子代个体，继续与正常小鼠交配，繁殖扩群，直至得到Cre/Lap/RdRp稳定遗传的模型小鼠。
2.如权利要求1所述的RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的PBI-3-Luc-pA-RdRp表达载体的构建为：
1）在含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体PBI-3的lacZ报告基因的另一侧顺序加入loxP、Luciferase、polyA、loxP调控元件及报告基因，构建真核表达载体PBI-3-Luc-pA；
loxP、Luciferase、polyA调控元件的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～3所示；
2）以引物对P为引物，以包含RdRp基因的载体或基因组为模板，PCR扩增RdRp基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；所述的引物对P为：
上游引物：gaagcggccg catgtcgatg tcctacacat 30；
下游引物：gccgtcgact catcggttgg ggagtagat 29；
3）用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切表达载体PBI-3-Luc-pA并回收大片段，将回收的大片段用T4连接酶与同样Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切的RdRp基因扩增片段连接，得到表达载体PBI-3-Luc-pA-RdRp。
3.如权利要求1所述的RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的Cre/Lap双转基因小鼠为表达Cre重组酶基因和Lap肝脏启动子的小鼠，受到盐酸强力霉素调控诱导后荧光素酶在肝脏开始表达的小鼠。
4.如权利要求1所述的RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的Cre/Lap/RdRp三转基因小鼠在受到盐酸强力霉素诱导后，Cre重组酶被启动表达，并特异性地切除两个loxP位点之间包括polyA的终止序列，rtTALAP-1中的rtetR分子与Ptetbi-1中的tetO序列特异性结合，RdRp基因开始表达。
5.如权利要求1所述的RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的用于杂交的亲本小鼠为6～8周龄。
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