CN101671694B - 一种调控表达丙型肝炎病毒ns3/ns4a蛋白酶的构建方法 - Google Patents
一种调控表达丙型肝炎病毒ns3/ns4a蛋白酶的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种调控表达蛋白酶的构建方法，尤其是调控表达表达丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的构建方法，所述转基因动物的基因组中含有编码丙型肝炎病毒NS3/NS4A的转基因DNA，并在所述目的基因HCV NS3/4A DNA前加入调控基因序列及报告基因序列，能在调控因素存在下表达活性的NS3/4A蛋白酶。包含以下内容：(1)构建包含LoxP位点、Luciferase和polyA等调控序列，受Tet和Cre/LoxP系统双重调控表达HCV NS3/4A蛋白酶的真核表达载体。(2)得到NS3/4A首建鼠，得到遗传背景基本接近于该种野生型小鼠的转基因杂合子小鼠。本发明获得的HCV NS3/NS4A转基因小鼠模型可用于与双转基因小鼠的杂交，进而获得三转基因小鼠并在HCV致病机理研究和药物的筛选与评价中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种调控表达蛋白酶的构建方法，尤其是调控表达丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的构建方法及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒是引起慢性肝病的主要病原体，严重危害人类健康，已成为全球性的、重要的公共卫生问题，迄今，尚缺乏有效的抗病毒治疗措施及有效的疫苗。
目前HCV最有效的治疗仅仅是干扰素和利巴韦林联合使用，效果在不同基因型之间有很大差异，疗效低于40％，而且副作用非常大。随着临床上蛋白酶和逆转录酶抑制剂在治疗HIV中的应用及取得的良好疗效，近年来以在病毒基因组复制和多聚蛋白前体加工成熟中起着关键作用的酶类(如丝氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA聚合酶)为靶点，寻找特异有效的治疗药物已经成为HCV防治研究的重要方向。
HCV NS3蛋白的编码基因全长共1893个核苷酸，位于基因组序列的nt 3420～5312位点，编码631个氨基酸的NS3蛋白。NS3蛋白近N端1/3(aa 1～180)具有丝氨酸蛋白酶活性，近C端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPase)和解旋酶(Helicase)活性。NS3蛋白发挥蛋白水解酶功能需与NS4A蛋白协同，将多聚蛋白前体的非结构蛋白切割成为成熟蛋白。鉴于HCV NS3/NS4A蛋白具有多功能生物活性，在HCV基因组的复制与多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要的作用。还可以反式激活宿主细胞内多种基因的表达，对肝细胞的生长、代谢、甚至是恶性转化产生重要影响，近年来，它已经成为抗HCV感染研究的主要靶位。而有研究表明HCV NS3/NS4A蛋白酶抑制剂可明显降低HCV的病毒水平，因此建立表达丙型肝炎病毒HCV NS3/NS4A蛋白酶的方法对筛选抗HCV药物和研究NS3/4A蛋白酶功能有重要意义。
长期以来，由于缺乏稳定、可靠的动物模型，极大地制约着对HCV致病机制、搞病毒药物筛选和疫苗等研究的深入和发展。
目前，HCV动物模型的研究主要集中在感染动物模型、人-鼠肝脏嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型三个方面。由于感染动物模型所采用的黑猩猩来源不便，及嵌合小鼠模型操作难度大，成本高等原因，应用上存在很大的局限性。HCV转基因小鼠是目前研究应用最多且相对成熟的动物模型。
转基因动物是指以实验方法，把外源基因导入到动物体内，这种外源基因与动物本身的染色体整合，外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能传给子代。自1981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术以来，转基因动物研究在许多领域都取得了令人瞩目的成就，并在诸多领域具有广阔的应用前景。转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，并可以用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可调控型表达HCV蛋白酶的构建方法，所述转基因小鼠的基因组中含有编码丙型肝炎病毒NS3/NS4A的转基因DNA，并在所述目的基因HCV NS3/NS4A DNA前加入调控基因序列及报告基因序列，能在调控因素存下表达活性的HCV NS3/NS4A蛋白酶。本发明还涉及所述转基因动物的筛选及评价方法以及构建该可调控型表达HCV蛋白酶转基因小鼠模型在HCV致病机理研究和药物的筛选与评价中的应用。
本发明的目的是通过下述方法实现的，调控表达丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的构建方法，其特征在于：将运用双重调控系统表达HCV NS3/NS4A蛋白酶的真核表达载体导入小鼠基因组，由此获得的HCV NS3/NS4A转基因小鼠模型可用于与双转基因小鼠的杂交，进而获得三转基因小鼠并用于HCV致病机理研究和药物的筛选与评价。
所述转基因动物的基因组中含有编码丙型肝炎病毒NS3/NS4A的转基因DNA，并在所述目的基因HCV NS3/NS4A DNA前加入调控基因序列及报告基因序列，能在调控因素存在下表达活性的NS3/NS4A蛋白酶。该蛋白酶是在肝脏内特异性表达活性的HCVNS3/NS4A蛋白酶。
所述转基因动物的基因组中含有萤光素酶报告基因和β-半乳糖苷酶报告基因；能在启动萤光素酶报告基因表达的同时，也能启动β-半乳糖苷酶报告基因的表达，双报告基因的设计易于筛选。
所述构建调控序列包含LoxP位点、Luciferase和polyA序列，受Tet和Cre/LoxP系统双重调控表达。
所述转基因小鼠基因组整合的调控序列LoxP位点具有SEQUENCE ID NO.1所示的序列。
所述转基因小鼠基因组整合的调控序列Luciferase报告基因具有SEQUENCE IDNO.2所示的序列。
所述转基因小鼠基因组整合的调控序列polyA具有SEQUENCE ID NO.3所示的序列。
所述转基因小鼠基因组整合的HCV NS3/NS4A编码基因具有SEQUENCE ID NO.5所示的序列。
所述构建转基因载体采用了重组真核表达载体PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A。所述质粒PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A是以含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体PBI-3为载体，顺序加入lacZ、loxP、Luciferase、polyA、loxP调控基因序列及报告基因序列和NS3/NS4A编码基因序列所构建的重组转基因真核表达载体。
所述构建易于筛选并受Tet和Cre/LoxP系统双重调控表达HCV NS3/NS4A蛋白酶的真核表达载体是通过下述方法实现的：
构建用于受精卵表达NS3/NS4A丝氨酸蛋白酶的真核表达载体：为了快速方便筛选转基因小鼠，在载体的构建中使用了含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体，应用分子克隆技术，在启动子的一侧包含β-半乳糖苷酶报告基因(lacZ)，在另一侧及其下游NS3/NS4A基因之间特别插入了由萤光素酶报告基因和多聚腺苷酸尾(polyA)组成的终止序列(该序列将序列表)，使小鼠能在启动萤光素酶报告基因表达的同时，也能启动β-半乳糖苷酶报告基因(lacZ)的表达。而终止序列的两侧再分别插入了一个LoxP位点，这样不仅能更加严格地避免漏过性表达，而且双报告基因的设计为筛选背景表达低、诱导性能强的转基因小鼠提供了简便准确灵敏的检测方法。
应用分子克隆技术，在已构建好的含lacZ、PCMV、tetO、PCMV、loxP、Luciferase、loxP基因的真核表达载体上，克隆入NS3/NS4A或蛋白酶基因，测序正确后用Ase I单酶切上述构建载体，大片段经回收纯化后备用于受精卵显微导入。
显微导入上述真核表达载体并制备转基因小鼠：选取7～8周龄雌性小鼠作为供体，另取数只2月龄以上的母鼠作为受体，与结扎公鼠合笼。有精栓者取出受精卵，培养后用把上述转基因载体分别移入受精卵，然后将受精卵原核植入假孕雌鼠宫腔，放入转基因动物培养室饲养。
筛选背景表达低和诱导性能强的肝脏表达NS3/NS4A蛋白酶的转基因小鼠：提取组织DNA，用PCR和Southern blot对NS3/NS4A基因或RdRp基因进行检测；选取检测阳性的小鼠进行耳成纤维细胞的体外培养并进行荧光素酶活性检测，然后对转基因小鼠进行繁殖保种。
所述转基因动物的检测方法是通过荧光素酶活性检测：将培养的耳成纤维细胞计数后转入培养板，培养基中分别含有和不含有dox终浓度为1ug/ml，用PCMV-rtTA质粒转染细胞，继续培养30h后按照荧光素酶检测试剂盒说明对细胞裂解上清使用Luminmeter仪进行检测。
该调控表达丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的转基因小鼠模型可作用于与双转基因小鼠的杂交，进而获得三转基因小鼠并在HCV致病机理研究和药物的筛选与评价中应用。
本发明的特点：目前常用研究中作为HCV感染模型的转基因小鼠在传代时一出生就表达目的基因，机体识别误认为是自身蛋白而使小鼠终生处于免疫耐受状态，与HCV自然感染状态差异较大，由此得出的数据和结果缺乏可信度，使其在致病机制和抗病毒药物的评价上受到了一定限制。而本发明中所涉及的转基因小鼠在实际应用中，在Tet-on和Cre重组酶双重调控因素存在并调节下，可调控地在肝脏特异性表达HCVNS3/NS4A蛋白酶，由于此时表达的NS3/NS4A蛋白酶是后天人工诱导产生的，所以小鼠产生的针对NS3/NS4A丝氨酸蛋白酶的免疫病理变化更接近自然感染，不会产生免疫耐受，更适合于HCV致病机理的研究和抗HCV NS3/NS4A蛋白酶抑制剂的筛选和评价，是HCV致病机理和防治研究的有效的小鼠动物模型。
附图说明
图1是肝组织特异性表达NS3/NS4A蛋白酶的真核表达载体的构建图。
图2是重组质粒PBI-3-Luc-pA酶切鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图。
图3是重组质粒PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A酶切鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图。
图4是NS3/NS4A转基因小鼠的制备技术路线示意图。
图5是NS3/NS4A首建鼠PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图。
图6是NS3/NS4A阳性转基因小鼠的Southern blot检测结果。
图7是NS3/NS4A转基因小鼠耳成纤维细胞Dox诱导与未诱导组荧光素酶相对活性的比值。
图8是NS3/NS4A的转基因小鼠与正常小鼠交配后得到F1代小鼠。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，需要说明的是，下述实施例并不用于限制本发明的实施范围。
1、构建表达NS3/NS4A蛋白酶的转基因载体。(见附图1)
附图1中：Laz：β-半乳糖苷酶报告基因；PCMV：CMV启动子；tetO：四环素操纵元件；Ptetbi-1：由tetO序列及其两侧的PCMV组成的双向启动子；LoxP：Cre重组酶酶切位点；dox：盐酸强力霉素；Luc：萤光素酶报告基因；pA：polyA尾。
(1)在含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体PBI-3上顺序加入lacZ、loxP、Luciferase、polyA、loxP调控基因序列及报告基因序列的转基因真核表达载体PBI-3-Luc-pA。(见附图2)
附图2中：1：DNA分子量标记一DL2000Marker，2：PBI-3-Luc-pA经PstI和NotI双酶切后，大片断为PBI-3，小片断为调控基因loxP+Luciferase+polyA+loxP。
(2)将上述调控基因序列及报告基因序列的转基因载体用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶回收大片段，纯化后-20℃贮存备用。
(3)设计NS3/NS4A蛋白酶编码基因的上下游引物：上游引物为：5′-GAAGCGGCCGCATGGCGCCTATTACGGCCT-3′，含Not I酶切位点；下上游引物为：5′-GCCCTCGACTCAGCACTCTTCCATCTCAT-3′，含Sal I酶切位点。PCR常规扩增NS3/NS4A蛋白酶编码基因。
(4)PCR扩增产物纯化后用同样的限制性内切酶Sal I和Not I双酶切，回收片段并纯化。
(5)把酶切纯化片段与上述纯化的载体进行常规连接和转化，然后用酶切法筛选阳性克隆PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A，并送公司测序鉴定。(见附图3)
附图3中：1：DNA分子量标记-DL2000Marker，2：PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A经SalI和Not I双酶切后，大片断为PBI-3-Luc-pA，小片断为NS3/NS4A。
(6)测序正确后用Ase I单酶切上述构建载体，小片段大小为1235bp，大片段经回收纯化后置-20℃贮存备用。
2、把上述载体分别显微介导入受精卵原核并植入假孕雌鼠宫腔。(见附图4)
(1)选取7～8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，每只小鼠腹腔导入10IU的PMSG。47～48小时后，每只小鼠腹腔导入0.8IU的HCG，并与正常公鼠合笼；另取数只2月龄以上的母鼠作为受体，与结扎公鼠合笼。
(2)取出受精卵并放在M2溶液，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，用M2液洗涤，最后放在M16液中，放入5％CO2，37℃培养箱培养。培养后在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
(3)在高倍镜下将把上述载体分别显微导入受精卵原核。让DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将上述载体导入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将导入过的和未导入过的受精卵上下分开放置，不致于混淆，然后放入5％CO2，37℃培养箱培养。
(4)将受精卵移植入假孕雌鼠，把植入受精卵的小鼠放入转基因动物培养室饲养。动物饲养室的光周期为8:00～20:00时，暗周期为20:00～8:00时。
3、筛选背景表达低、诱导性能强的表达NS3/NS4A的转基因小鼠。(见附图4)
(1)提取组织DNA：取2周龄的新生小鼠，用无菌剪刀剪取约0.5cm长的鼠尾放入Eppendorf管中，加入500μL消化液，55℃温浴过夜。用酚/氯仿，氯仿各抽提一次，用2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，干燥后溶于200μL的灭菌去离子水中，-20℃保存备用。
(2)出生小鼠的PCR检测：NS3/4A基因用上述合成引物常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。合成Luc基因上下游引物，上游引物为：5′-ACTGGCCGTCGTTITACAACGTCGTCA-3′；下上游引物为：5′-ATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCT-3′。常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。(见附图5)选取PCR双阳性结果的小鼠进一步用Southern blot检测。
附图5中：1：DNA分子量标记-DL2000Marker，2-7：NS3/NS4A阳性转基因小鼠的PCR结果，8：阳性对照。
(3)Southern blot检测：PCR阳性小鼠基因组DNA 20μg，用HindIII酶切消化，经0.6％的凝胶电泳，转移到尼龙膜上。在尼龙膜上42℃杂交5h后，用32P dCTP标记的探针杂交过夜，-70℃放射自显影。(见附图6)
附图6中：1-6：Southern blot杂交结果为阳性。
(4)选取上述检测阳性的小鼠进行耳成纤维细胞的体外培养：取一小块约3×3mm大小的小鼠耳部组织，无菌条件下切成小块，立即放入含有2ml混合RPMI 1640的培养基的平皿中，消化过夜，用培养基小心吹散细胞团块后转入新平皿中培养36h，用PBS将贴壁细胞在平皿内洗一遍后换液，继续培养3d，使其达到80％的汇合率时用于以下实验。
(5)荧光素酶活性检测：将培养的耳成纤维细胞计数后转入24孔培养板2×105细胞/孔，培养基中分别含有和不含有dox(终浓度为1ug/ml)，用PCMV-rtTA质粒转染细胞，继续培养30h后按照荧光素酶检测试剂盒说明对细胞裂解上清使用Luminmeter仪进行检测。(见附图7)
附图7中：6只小鼠表达的荧光素酶相对活性的比值分别为61.8，69.8，35.6，82.4，44.6和60.6。
(6)转基因小鼠的繁殖保种：将上述得到的背景表达低、诱导性能强的表达NS3/NS4A的转基因小鼠与正常小鼠交配，得到F1代小鼠，同上以PCR法和Southernblot法检测筛选NS3/NS4A和荧光素酶活性双阳性的小鼠，然后继续与正常小鼠交配，繁殖扩群，同上方法检测其外源基因稳定传至子代。(见附图8)
附图8中：黑色鼠为C57BL/6J正常小鼠的遗传背景，灰色鼠为NS3/NS4A的转基因小鼠的遗传背景。
本发明构建的可调控表达HCV NS3/NS4A转基因小鼠模型可用于与双转基因小鼠的杂交，进而获得三转基因小鼠并在HCV致病机理研究和药物的筛选与评价中应用。
序列表
调控序列与ns3/ns4A基因整合后的DNA新序列
ATAACTTCCTATACCATACATTATACCAACTTAT(SEQUENCE ID NO.1)
ATCCAACACCCCAAAAACATAAACAAACCCCCCCCCCCATTCTATCCCCTACACCATCCAACCCCTCCACACCAACTCCATAACCCTATCAACACATACCCCCTCCTTCCTCCAACAATTCCTTTTACACATCCACATATCCACCTCAACATCACCTACCCCCAATACTTCCAAATCTCCCTTCCCTTCCCACAACCTATCAAACCATATCCCCTCAATACAAATCACACAATCCTCCTATCCACTCAAAACTCTCTTCAATTCTTTATCCCCCTCTTCCCCCCCTTATTTATCCCACTTCCACTTCCCCCCCCCAACCACATTTATAATCAACCTCAATTCCTCAACACTATCAACATTTCCCACCCTACCCTACTCTTTCTTTCCAAAAACCCCTTCCAAAAAATTTTCAACCTCCAAAAAAAATTACCAATAATCCACAAAATTATTATCATCCATTCTAAAACCCATTACCACCCATTTCACTCCATCTACACCTTCCTCACATCTCATCTACCTCCCCCTTTTAATCAATACCATTTTCTACCACACTCCTTTCATCCTCACAAAACAATTCCACTCATAATCAACTCCTCTCCATCTACTCCCTTACCTAACCCTCTCCCCCTTCCCCATACAACTCCCTCCCTCACATTCTCCCATCCCACACATCCTATTTTTCCCAATCAAATCATTCCCCATACTCCCATTTTAACTCTTCTTCCATTCCATCACCCTTTTCCAATCTTTACTACACTCCCATATTTCATATCTCCATTTCCACTCCTCTTAATCTATACATTTCAACAACACCTCTTTTTACCATCCCTTCACCATTACAAAATTCAAACTCCCTTCCTACTACCAACCCTATTTTCATTCTTCCCCAAAACCACTCTCATTCACAAATACCATTTATCTAATTTACACCAAATTCCTTCTCCCCCCCCACCTCTTTCCAAACAACTCCCCCAACCCCTTCCAAAACCCTTCCATCTTCCACCCATACCACAACCATATCCCCTCACTCACACTACATCACCTATTCTCATTACACCCCACCCCCATCATAAACCCCCCCCCCTCCCTAAACTTCTTCCATTTTTTCAACCCAACCTTCTCCATCTCCATACCCCCAAAACCCTCCCCCTTAATCACACACCCCAATTATCTCTCACACCACCTATCATTATCTCCCCTTATCTAAACAATTCCCCAACCCACCAACCCCTTCATTCACAACCATCCATCCCTACATTCTCCACACATACCTTACTCCCACCAACACCAACACTTCTTCATACTTCACCCCTTCAACTCTTTAATTAAATACAAACCATACCACCTCCCCCCCCCTCAATTCCACTCCATATTCTTACAACACCCCAACATCTTCCACCCCCCCCTCCCACCTCTTCCCCACCATCACCCCCCTCAACTTCCCCCCCCCCTTCTTCTTTTCCACCACCCAAACACCATCACCCAAAAACACATCCTCCATTACCTCCCCACTCAACTAACAACCCCCAAAAACTTCCCCCCACCACTTCTCTTTCTCCACCAACTACCCAAACCTCTTACCCCAAAACTCCACCCAACAAAAATCACACACATCCTCATAAACCCCAACAACCCCCCAAACTCCAAATCTAA(SEQUENCE ID NO.2)
CTCTCCCTTCTACTTCCCACCCATCTCTTCTTTCCCCCTCCCCCCTCCCTTCCTTCACCCTCCAACCTCCCACTCCCACTCTCCTTTCCTAATAAAATCACCAAATTCCATCCCATTCTCTCACTACCTCTCATTCTATTCTCCCCCCTCCCCTCCCCCACCACACCAACCCCCACCATTCCCAACACAATACC
ACCCATCCTCCCCATCCCCTCCCCTCTATCC(SEQUENCE ID NO.3)
ATAACTTCCTATACCATACATTATACCAACTTAT(SEQUENCE ID NO.4)
CCCCCTATTACCCCCTACTCCCAACACACCCCACCCCTACTTCCCTCCATCATCACTACCCTCACACCCCCCCACACCAACCACCTCCACCCCCACCTCCAACTCCTCTCCACCCCAACACAATCTTTCCTCCCCACCTCCCTCAATCCCCTCTCTTCCACTCTCTATCATCCTCCCCCCTCAAACACCCTTCCCCCCCCAAACCCCCCAATCACCCAAATCTACACCAATCTCCACCACCACCTCCTCCCCTCCCAACCCCCCCCCCCCCCCCCTTCCTTCACACCATCCACCTCCCCCACCTCCCACCTTTACTTCCTCACCACCCATCCCCATCTCATTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCACACCACCCCCACCCTACTCTCCCCCACCCCCCTCTCCTACTTCAACCCCTCTTCCCCCCCTCCACTCCTCTCCCCCTCCCCCCACCCTCTCCCCATCTTTCCCCCTCCCCTCTCCACCCCACCCCTTCCCAACCCCCTCCACTTTCTACCCCTCCACTCTATCCAAACCACTATCCCCTCCCCCCTCTTCACCCACAACTCCTCCCCTCCCCCCCTACCCCACACATTCCACCTCCCCCATCTACACCCCCCTACTCCTACCCCCAACACCACTAACCTCCCCCCTCCCTATCCACCCCAACCCTATAACCTCCTTCTCCTCAACCCCTCCCTCCCCCCCACCCTACCTTTCCCCCCCTATATCTCTAACCCACATCCTATCCACCCTAACATCACAACCCCCCTAACCACCATCACCACCCCTCCCCCCATCACCTACTCCACCTATCCCAACTTTCTTCCCCACCCTCCTTCCTCTCCCCCCCCCTATCACATCATAATATCTCATCACTCCCACTCAACTCACTCCACCACTATCCTCCCCATCCCCACACTCCTCCACCAACCCCACACCCCTCCACCCCCACTCCTCCTCCTCCCCACCCCTACCCCTCCCCCATCCCTCACCCTCCCACATCCAAACATCCACCACCTCCCTCTCTCCACCACTCCACAAATCCCCTTTTATCCCAAACCCATCCCCATCCACACCATCAACCCCCCCACCCACCTCATTTTCTCCCATTCCAACAACAAATCTCATCACCTCCCCCCCAACCTCTCCCCCCTCCCACTCAATCCTCTACCATATTACCCCCCCCTTCATCTATCCCTCATACCAACTACCCCACACCTCATTCTCCTACCAACCCACCCTCTAATCACCCCCTTTACCCCCCATTTCCACTCACTCATCCACTCCAATACATCTCTCACCCACACACTCCACTTCACCCTCCACCCCACCTTCACCATTCACACCACCACCCTCCCACAACACCCCCTCTCACCCTCCCACCCCCCACCCACCACTCCTACCCCCACCATCCCCATTTACACCTTTCTCACTCCACCACAACCCCCCTCCCCCATCTTCCATTCCTCCCTTCTCTCCCACTCCTATCACCCCCCCTCTCCTTCCTACCACCTCACCCCCCCCCACACCTCACTTACCTTCCCCCCTTACCTAAACACACCACCCTTCCCCCTCTCCCACCACCATCTCCACTTCTCCCACACCCTCTTTACACCCCTCACCCACATACACCCCCATTTCTTCTCCCACACTAACCACCCACCACACAACTTCCCCTACCTCCTACCATACCACCCTACCCTCTCCCCCACCCCTCACCCTCCACCTCCATCCTCCCACCAAATCTCCAACTCTCTCATACCCCTAAACCCTACCCTCCACCCCCCAACCCCCCTCCTCTATACCCTCCCACCCCTTCAAAACCACCTTACTACCACACACCCCATAACCAAATACATCATCCCATCCATCTCCCCTCACCTCCACCTCCTCACCACCACCTCCCTCCTCCTACCCCCACTCCTACCACCTCTCCCCCCCTATTCCCTCACAACACCCACCCTCCTCATTCTCCCCACCATCATCTTCTCCCCAAACCCCCCCATCATTCCCCACACCCAACTCCTTTACCCCCACTTCCATCACATCCAACACTCC(SEQUENCE ID NO.5)
Claims (1)
1.一种转基因小鼠的构建方法，其特征在于：将运用双重调控系统表达HCV NS3/NS4A蛋白酶的真核表达载体导入小鼠基因组，由此获得的HCVNS3/NS4A转基因小鼠模型可用于与双转基因小鼠的杂交，进而获得三转基因小鼠并用于HCV致病机理研究和药物的筛选与评价；所述转基因动物的基因组中含有编码丙型肝炎病毒NS3/NS4A的转基因DNA，并在所述目的基因HCVNS3/NS4A DNA前加入调控基因序列及报告基因序列，能在调控因素存在下表达活性的NS3/NS4A蛋白酶；所述能在调控因素存在下表达活性的NS3/NS4A蛋白酶是在肝脏内特异性表达活性的HCV NS3/NS4A蛋白酶；所述转基因动物的基因组中含有萤光素酶报告基因和β-半乳糖苷酶报告基因；能在启动萤光素酶报告基因表达的同时，也能启动β-半乳糖苷酶报告基因的表达，双报告基因的设计易于筛选；所述构建调控序列包含LoxP位点、Luciferase和polyA序列，受Tet和Cre/LoxP系统双重调控表达；所述转基因小鼠基因组整合的调控序列LoxP位点具有SEQUENCE ID NO.1所示的序列；所述转基因小鼠基因组整合的调控序列Luciferase报告基因具有SEQUENCE ID NO.2所示的序列；所述转基因小鼠基因组整合的调控序列polyA具有SEQUENCE ID NO.3所示的序列；所述转基因小鼠基因组整合的HCV NS3/NS4A编码基因具有SEQUENCEID NO.5所示的序列；所述构建转基因载体采用了重组真核表达载体PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A；所述质粒PBI-3-Luc-pA-NS3/NS4A是以含有双向启动子Ptetbi-1的真核表达载体PBI-3为载体，顺序加入lacZ、loxP、Luciferase、polyA、loxP调控基因序列及报告基因序列和NS3/NS4A编码基因序列所构建的重组转基因真核表达载体。
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| CN101671694A (zh) | 2010-03-17 |
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