CN102352379B - 通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法，是将线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体转染牛体细胞，通过同源重组获得替换整合素αv亚基基因的核供体细胞，将核供体细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕牛子宫中，得到的子代即为整合素αv亚基基因被敲除的杂合子转基因牛。杂合子转基因牛经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因牛。用本方法获得的转基因牛低表达或不表达口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因，使FMDV感染率明显下降，其具备了抗FMD的能力。该发明打破了传统的通过免疫学手段预防FMD的思维模式，为控制和消灭牛FMD开辟了新的途径。

Description

通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法

技术领域

本发明涉及一种动物转基因技术，尤其涉及一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素(Integrin)αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法，属于细胞工程领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth di sease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth di sease virus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，占其国内生产总值的1.1％；2005年我国部分地区暴发Asia I型FMD，2009年初多个省区又发生了A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。

目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始关注病毒与宿主之间的关系，尤其是病毒受体在病毒感染过程中的作用，期望通过敲除、沉默或封闭病毒的关键受体阻断病毒的感染，进而达到控制和根除FMD的目的。

病毒受体是能够被病毒识别并与之结合，进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，是病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素。FMDV体外感染的受体包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及细胞培养适应毒株可利用HSPGs感染体外培养的细胞(O’Donnell等，2008)，但HSPGs可能只作为一种附属分子增强其它受体的效率，尚无证据表明其在FMDV野毒株感染细胞过程中起作用(Monaghan等，2005)。

整合素是一种跨膜的由α和β亚基以非共价结合形成的胞外基质异二聚体糖蛋白，包括有18种不同的α亚基(α1～α11、αD、αE、αL、αM、αv、αX、αIIb)和8种β亚基(β1～β8)形成24种不同的αβ异二聚体，属于I型穿膜蛋白，每个亚基包括一个大的胞外区、一个跨膜区和一个短的胞浆区。α亚基含有结合二价阳离子的结合位点，β亚基含有4个富含半胱氨酸的重复序列。α和β亚基N-末端形成的球形区域为胞外配体结合域(Arnaout等，2005)，由αv亚基的β螺旋结构域和plexin-semaphorin-integrin(PSI)结构域，以及β亚基的βI-like或βA结构域或混合域组成，每个整合素都有各自的配体结合特异性及组织、细胞分布特异性。RGD结合位点位于β螺旋与βI-like结构域之间的分界面，来自于这两个结构域的氨基酸直接与配体的RGD肽相互作用(Takada等，2007)。一些整合素，如αvβ3、αvβ6、αvβ1、αvβ8、αvβ5、α5β1、α8β1通过结合于RGD基序来识别其配体，尽管有一个RGD，但FMDV似乎也无法使用所有依赖RGD的整合素作为其最初的受体。到目前为止，只有整合素αv亚家族成员αvβ3、αvβ6、αvβ1和αvβ8等4种依赖RGD的整合素可能是FMDV受体(Gutiérrez-Rivas等，2008；Berryman等，2005；Jackson等，2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Sáenz等，2009；Johns等，2009)，其中αvβ6被认为是FMDV最主要的受体(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006；O′Donnell等，2009；Ferris等，2005；Burman等，2006；DiCara等，2008；Duque等，2004；Duque等，2003；Jackson等，2000；

等，2007)。尽管αvβ1、αvβ3和αvβ8等3种整合素受体的作用尚待进一步研究，但通用亚基αV在病毒感染中起到了至关重要的作用。

转基因动物的制作方法主要有逆转录病毒法、受精卵原核显微注射法、精子载体法、ES细胞技术和转基因体细胞核移植技术等。其中受精卵原核显微注射法和转基因体细胞克隆是目前世界各国科学家比较常用的家畜转基因技术，前者最早由美国人Gordon发明，是经典的制作转基因动物的方法。Hammer等利用该方法成功地制作了转基因兔、绵羊和猪，这些研究被认为是动物转基因研究历程上的里程碑。总体上看显微注射法生产转基因动物的效率较低，后代嵌合体比例较高，尤其是大动物，受体需要量大，维持大量动物的饲养成本与试验成本昂贵，研发成本高，风险大。

转基因体细胞克隆技术是基因组修饰技术与动物体细胞核移植技术有机结合而产生的一种新的转基因动物制作技术，它部分地克服了传统转基因动物外源基因整合率低、大动物生产成本高的技术瓶颈，代表当前转基因动物制作的主流方向。在该方法中，核供体细胞在核移植前要经过转染、筛选和鉴定等环节，提高了转基因动物的阳性率。Schnieke等(1997)用新霉素抗性基因neo和用于治疗血友病的人凝血因子IX共转染绵羊胎儿成纤维细胞，以随机整合的转基因细胞为核供体生产出转基因绵羊，凝血因子IX在乳中的表达量达到125μg/mL，这一研究成果为利用克隆技术迅速扩大转基因动物开辟了一条新的途径。随后，转基因克隆牛、山羊、猪等相继诞生。

外源基因随机整合的缺点主要是容易引起被插入基因的突变、易受到插入位点临近基因的影响而表达水平不稳定、胎胚发育及出生后生长不正常等，为克服上述部分缺点，基因打靶(gene targeting)技术应运而生。

基因打靶是在胚胎干细胞和同源重组技术基础上产生的，是改变生物体遗传信息的转基因技术，包括通过同源重组将外源基因/修饰的自身基因定点整合到受体细胞基因组(knock in)及将宿主细胞特定基因区段敲除(knock out)。该技术在小鼠转基因中被广泛应用，但是，由于大动物没有公认的家畜ES干细胞系而无法在ES干细胞水平上进行基因打靶，1997年多莉羊的诞生为体细胞基因打靶制备转基因动物开辟了新的途径。用体细胞介导的基因打靶技术制备转基因动物突出的优点是：(1)可以避开复杂的ES细胞技术；(2)可以不经过嵌合体中间步骤；(3)可以控制转基因动物性别；(4)能够在体细胞体外培养水平进行整合筛选和基因打靶，因而可以显著降低制备转基因动物，特别是转基因家畜的成本，在生物技术领域具广阔前景。尽管体细胞体外培养传代的有限性是体细胞基因打靶研究的难点并且成功率低，但是近年来体细胞基因打靶研究也获得了一些突破性进展。2000年，McCreath等首次将α-抗胰蛋白酶(AAT)基因定位整合到绵羊胎儿成纤维细胞的a1原胶原基因座上，获得了AAT较高表达水平的转基因克隆绵羊。随后，国内外科学家相继利用体细胞克隆和基因打靶手段研制出不同的转基因动物。

Yu等(2006)报道利用基因打靶技术获得敲除了朊病毒一个PrP基因位点的体细胞克隆山羊，经过3个月观察这些基因敲除羊没有异常表现。Richt等(2007)利用基因打靶技术灭活牛的PRNP基因，获得生长发育正常、存活2年以上的转基因牛，它们能够很好地抵抗疯牛病的传染。

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发明内容

针对上述现有技术，本发明的发明人进行了研究，研究表明，整合素αv亚基基因被替换或敲除的杂合子或纯合子转基因牛低表达或不表达口蹄疫病毒受体αV亚基，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。因此，通过敲除整联蛋白αv亚基的方法是获得抗FMD的转基因牛的最佳方法之一。

本发明的目的是提供一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法。通过本发明的方法获得的转基因牛低表达(杂合子)或不表达(纯合子)口蹄疫病毒受体整合素αV亚基，其FMDV感染率明显下降。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法，是将碱基序列如序列表中序列1所示的线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体转染正常牛的牛胎儿成纤维细胞，通过同源重组获得替换整合素αv亚基基因的核供体细胞，将核供体细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕牛子宫中，得到的子代即为整合素αv亚基基因被敲除的杂合子转基因牛。

还包括以下方法：杂合子转基因牛经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因牛；或：杂合子转基因公牛和杂合子转基因母牛正常交配繁殖而获得纯合子转基因牛。

所述牛为奶牛或肉牛。

所述牛胎儿成纤维细胞为45～150日龄胎儿不同组织来源的胎儿成纤维细胞，包括耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞或卵丘细胞，优选皮肤成纤维细胞。

所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体转染牛胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法、病毒载体法或磷酸钙沉淀法，优选脂质体转染法。

所述脂质体转染法的条件为：线性化的载体DNA浓度不低于1μg/μL，DNA∶脂质体LTX＝1∶3。

所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的核供体细胞核导入牛的去核卵母细胞的方法为显微注射法。

所述去核卵母细胞不带有第一极体。

本发明利用同源重组和体细胞克隆的方法将线性化的携带有突变的整合素αv亚基基因的第一次打靶载体转染牛胎儿成纤维细胞，获得整合素αv亚基基因敲除的核供体细胞，将其细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕牛子宫中，得到的子代即为整合素αv亚基基因敲除的杂合子转基因牛。杂合子转基因牛经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因牛。用本方法获得的转基因牛低表达(杂合子)或不表达(纯合子)口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。本发明打破了传统的通过免疫学手段预防FMD的思维模式，为控制和消灭牛FMD开辟了新的途径，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为体细胞克隆整合素αv亚基被敲除的转基因牛的生产流程图。

图2为整合素αv亚基基因打靶载体的构建示意图。

图3为整合素αv亚基基因左侧同源臂重组克隆质粒酶切鉴定结果，其中，M：DL marker10,000；1：Xho I/Xba I酶切pMD19-αVLeft载体；2Xho I/Xba I酶切pUC19。

图4为整合素αv亚基基因右侧同源臂重组克隆质粒酶切鉴定结果，其中，M：DL marker10,000；1：EcoR I/Sal I酶切pUC19；2：EcoR I/Sal I酶切pMD19-αVRight。

图5为整合素αv亚基基因第一次打靶载体的质粒酶切鉴定结果，其中，M：DL marker10,000；1：Xho I/Xba I酶切pLN-αV-KO；2：EcoR I/Sal I酶切pLN-αV-KO。

图6为打靶载体与牛细胞整合素αv亚基基因发生同源重组后αv基因敲除结构示意图，pLN-αV-KO第一次打靶后，Integrin αv基因的第二外显子至第十八外显子被PGK-neo基因所替换；pLN-GFP-αV第二次打靶后，另一条染色体上Integrin αv基因的第二外显子至第十八外显子被PGK-GFP基因所替换。

图7为用于αv基因发生第一次同源重组PCR鉴定方法中阳性模板质粒的酶切鉴定结果，其中，M：DL marker 10,000；1：EcoR I/Sal I酶切pLN-αV-ko-model。

图8为转基因奶牛杂合子胎儿成纤维细胞PCR鉴定结果，pLN-αV-KO打靶奶牛成纤维细胞后形成的单克隆，在跨αVRight小臂的引物P1，P2的引导下，PCR扩增4529bp的片段。

图9为αv基因敲除杂合子奶牛的Southern杂交鉴定结果，其中，1为普通荷斯坦奶牛胎儿，2为转基因奶牛。

图10为转基因杂合子奶牛αv基因mRNA的Real-time RT-PCR检测结果，正常及转基因荷斯坦奶牛各6头，以正常荷斯坦奶牛αv基因mRNA表达量的平均值为标准，计算转基因牛mRNA的相对表达量。其中，1为正常荷斯坦奶牛，2为转基因奶牛。

图11为接种病毒后奶牛出现临床体症时间的比较结果，接种病毒的正常奶牛组奶牛全部发病(3/3)，发病率100％，而接种病毒的转基因奶牛组中抗病毒感染的奶牛2头，发病奶牛1头(1/3)，发病率33.3％；接种病毒后，与正常奶牛比较，发病的转基因奶牛出现临床体症时间明显的滞后。其中，1为正常荷斯坦奶牛，2为转基因奶牛。

图12为整合素αv亚基基因第二次打靶载体的质粒酶切鉴定结果，其中，M：DL marker10,000；1：Not I酶切pLN-GFP-αV；2：Kpn I/Cla I酶切pLN-GFP-αV。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明。

下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均购自Sigma公司。

实施例1：体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的杂合子转基因奶牛的生产及分子生物学检测

体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的杂合子转基因奶牛的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：

1.整合素αv亚基基因敲除的第一次打靶载体的构建

整合素αv亚基基因敲除第一次打靶载体的构建如图2所示，具体方法如下：

以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pαV-Left upper：

5’-CCGCTCGAGTGGAGAGTCCTGCGGAGTA-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶XhoI的识别位点)

和引物pαV-Left lower：

5’-CTAGTCTAGAATATGTCAGGCCAACAGTCAAC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶XbaI的识别位点)

引导下，PCR克隆片段为1779bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s 58℃20s 68℃2min，25个循环；68℃5min。反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收1779bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒。酶切鉴定出含有αVLeft片段的菌落命名为pMD19-αVLeft(图3)，将pMD19-αVLeft用XhoI和XbaI酶切后回收αVLeft片段与经相同酶切的载体pLN连接，然后将连接产物转化E.coliDH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-αVLeft，该载体含有Integin αv基因部分第一外显子区与部分第一内含子区。

以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pαV-Right upper：

5’-ACGCGTCGACTGGGCTATTGGTTTCCTC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶SalI的识别位点)

和引物pαV-Right lower：

5’-CCGGAATTCTGGTGTTCAACAGCGTCT-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶EcoRI的识别位点)

引导下，PCR克隆片段为3083bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s 58℃20s 68℃3min，25个循环；68℃7min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收3083bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒，酶切鉴定出含有αVRight片段的菌落命名为pMD19-αVRight(图4)，将pMD19-αVRight用SalI和EcoR I酶切后回收αVRight片段与经相同酶切的载体pLN-αVLeft连接，然后将连接产物转化E.coliDH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-αV-KO，pLN-αV-KO的αVRight片段含有部分第十八、第十九内含子、第十九外显子和部分第二十外显子。通过Xho I和XbaI、SalI和EcoR I分别双酶切pLN-αV-KO，检测结果显示αVLeft同源臂与αVRight同源臂片段均已插入pLN-αV-KO中(图5)。pLN-αV-KO经序列分析表明，载体上的Integin αv开放阅读框获得了插入突变。

将载体pLN-αV-KO经过限制性内切酶NotI线性化，用TaKaRa DNA Fragment PurificationKit Ver.2.0(TaKaRa公司)回收浓缩纯化12462bp的线性片段，将其溶解在灭菌的超纯水中，-20℃保存。该片段自5’端第7-1785位DNA序列为Integin αv基因部分第一外显子区与部分第一内含子区；第1822-1855位DNA序列为Loxp位点；第1875-3694位DNA序列为PGK-Neo序列；第3701-3734位DNA序列为Loxp位点；第3741-6823位DNA序列为Integin αv基因部分第十八、第十九内含子、第十九外显子和部分第二十外显子；第6830-9155位DNA序列为PGK-TK序列，见序列表1。

pLN-αv-KO打靶后，Integin αv基因的第二外显子至第十八外显子将被PGK-neo基因所替换，如图6所示。

2.牛胎儿皮肤成纤维细胞系的建立

选用2月龄的荷斯坦奶牛胎儿(购自山东奥克斯生物技术有限公司)，用70％酒精清洗包被奶牛胎儿的羊膜数次后，刺穿羊膜，取出奶牛胚胎，于PBS液中洗数遍，取胎儿皮肤组织，剪碎成小块(体积小于1mm3)，再用PBS洗2遍后，加入10mL的胶原酶和胰蛋白酶混合液37℃消化20-40min后，加入20mL含10％胎牛血清的DMEM：F12营养液分散，1000rpm 10min，再加入10％胎牛血清的DMEM：F12营养液重新悬浮，细胞计数，按3.0×10⁵的细胞量接种于100mm的培养皿中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养2-3d，待细胞生长至单层后，用0.25％胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存(冻存液成分为：80％DMEM：F12，10％FBS和10％DMSO)，获得牛胎儿皮肤成纤维细胞系。

3.牛胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选

处于对数生长期的牛胎儿皮肤成纤维细胞，用Opti-MEM洗1次细胞，将载体DNA线性化后，浓缩浓度不低于1μg/μL，经脂质体LTX转染细胞(DNA∶脂质体LTX＝1∶3)，24h后加入700μg/mL G418和8μM Gancvilor作为筛选压力进行筛选，每3d换液1次，10d后用0.25％胰蛋白酶消化形成的克隆细胞，培养2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。

4.卵母细胞的成熟培养

将取自周边地区屠宰场的成年奶牛和黄牛的卵巢，用37℃的PBS液清洗3遍后，用直径为0.7mm的针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体，将其用成熟液(M199培养液中添加10％FBS，0.01U/mL bFSH，0.01U/mL bLH和～g/mL雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养约20h，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min后，用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞和卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀，并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。

5.核移植和克隆胚胎的体外培养

将步骤3获得的第一极体的卵母细胞移入操作液(M199培养液中添加10％FBS，7.5μg/mL细胞松弛素B)中，在200倍显微镜下用玻璃针于极体上方的透明带切一小口，再用内径20μm的玻璃管将第一极体及其下方的卵母细胞的染色体一并吸除，再用含20％的FBS的M199液体培养基洗3遍，置于38.5℃、5％CO₂的培养箱中备用。将步骤2获得的转基因细胞活化至长满单层，用0.25％胰蛋白酶消化，悬浮细胞，离心，再加微量的营养液悬浮，用玻璃针选择直径为10-12μm的胎儿皮肤成纤维细胞的细胞核，用20μm的玻璃管将其移入去核的卵母细胞的透明带内，然后将其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/L Ca²⁺和0.15mmol/L Mg²⁺的溶液中，3-5min后放入融合槽内，转动卵母细胞使供体细胞核与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5KV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入添加10％FBS的M199培养液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步的激活处理，将重构胚放入5μmol/L离子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5％FBS的CRIaa液中，在38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养，分别在2d和7d后观察胚胎的发育状况。

6.胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d和90d进行直肠检测以确定妊娠率。共移植受体牛42头，移植60d后的直肠检测表明，其中18头怀孕。手术取2个胎儿进行鉴定，均为转基因阳性，制备成纤维细胞，一部分用于体细胞克隆制备杂合子转基因牛，一部分用于二次打靶和体细胞克隆制备纯合子转基因牛。

7.转基因杂合子阳性细胞、胎儿及克隆牛的分子生物学鉴定

(1)PCR鉴定

1)用于PCR鉴定的αv基因发生第一次同源重组的阳性模板质粒的构建

克隆Integin αv基因Right同源臂3’下游+88347至+92190[NC_007300.4(10，230，629..10，234，472)]片段，以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pαV-Rightupper：

5’-ACGCGTCGACTGGGCTATTGGTTTCCTC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶SalI的识别位点)

与引物pαV-Right-model lower：

5’-CCGGAATTCTTGCTAAGGCCTTTGATAGACGA-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶EcoRI的识别位点)

的引导下，PCR克隆片段为3844bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s 55℃20s68℃3min，25个循环；68℃7min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。将该片段用SalI和EcoRI酶切后回收与经相同酶切的载体pLN连接，然后将连接产物转化E.coliDH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-αV-ko-model(图7)，该质粒包含第一次打靶质粒pLN-αV-KO的右侧同源臂和报告基因neo，在pLN-αV-ko-model：base 1302-1319位点设计上游引物P1：5’-GGACCGCTATCAGGACAT-3’，在PGK-neo开放阅读框，pLN-αV-ko-model：base5830-5808上设计下游引物P2：5’-TTGCTAAGGCCTTTGATAGACGA-3’，PCR扩增产物为4529bp，可做pLN-αV-KO打靶后发生同源重组的细胞/胎儿/转基因牛跨越式PCR鉴定的模板。

2)发生同源重组的跨越式PCR鉴定

以经pLN-αV-KO打靶获得的牛胎儿成纤维neo抗性克隆、转基因克隆胎儿或转基因牛的基因组DNA为模板，在用于PCR鉴定的αv基因发生同源重组的阳性模板质粒的构建中的引物P1，P2的引导下，PCR扩增4529bp的片段为同源重组阳性。PCR反应条件：94℃30s；94℃20s 55℃20s 68℃4min，35个循环；68℃9min。转基因牛胎儿成纤维细胞鉴定结果如图8所示，M：DL marker 10,000(Takara公司)，第1泳道为发生同源重组的阳性模板质粒pLN-αV-ko-model，第24泳道为以非转基因奶牛成纤维细胞DNA为模板的阴性对照，第2-23泳道为单克隆细胞基因组DNA，其中第3，7，8，10，11，15，16，20，21和23泳道为同源重组阳性转基因细胞，将其依次命名为oα77w、oα81w、oα82w、oα84w、oα85w、oα96w、oα97w、oα106w、oα107w和Tα50L，其余均为阴性。

(2)Southern杂交鉴定

取约10μg转基因克隆牛胎儿或新生犊牛耳部组织的基因组DNA，用限制性内切酶SmaI酶切消化，30V低压电泳，转膜后，进行Southern杂交。杂交所用探针为利用rediprimer^TM IIrandom primer labeling system(amersham)、由[α-³²P]dCTP同位素标记的、经限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切消化的pLN载体neo基因(报告基因)回收产物，以普通荷斯坦奶牛胎儿或新生犊牛的基因组DNA作为阴性对照，杂交阳性信号为9.2kb片段，结果如图9所示(泳道1为普通荷斯坦奶牛，泳道2为转基因奶牛，转基因结果为阳性)。上述结果表明，在整合素αV亚基基因座位上发生了预期的同源重组。

(3)Real-time RT-PCR鉴定

利用Trizol(Invitrogen)提取正常和转基因牛胎儿或新生犊牛的甲状腺或舌上皮组织总RNA，按TaKaRa RNAPCRKit(AMV)Ver3.0反转录试剂盒说明书操作步骤反转录，得到cDNA模板。反转录体系为：MgCl22.0μl，10×RT Buffer 1.0μl，dNTP Mixture 1.0μl，RNAseInhibitor 0.25μl，RNAse Free dH2O 3.75μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5μl，提取RNA 1.0μl，Oligo(dT)0.5μl，总体系10.0μl。在上游引物：P5：5′-TCTTCAGGACGGAACAAA-3′和下游引物：P6：5′-AACTACCAGGACCACCAA-3′的引导下，Real Time PCR扩增αv片段为143bp；在上游引物：P3：5′-GCACAATGAAGATCAAGATCATC-3′和下游引物：P4：5′-CTAACAGTCCGCCTAGAAGCA-3′的引导下，Real Time PCR扩增β-actin片段173bp。RealTime PCR反应条件是：95℃30s；95℃5s，60℃31s，40个循环。根据其扩增曲线和融解曲线，制作PCR定量标准曲线，通过求其平均值可以分析出转基因胎儿或新生犊牛αv基因表达的变化。图10显示了6头新生转基因牛的αv基因mRNA的表达量明显下降。

8.转基因牛的FMDV攻毒实验

(1)牛半数感染量(ID₅₀)的测定

选取未接种FMD疫苗、无FMDV中和抗体、6月龄荷斯坦奶牛12头，分成4组，每组3头，分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量分别为0、10⁵、10⁶和10⁷TCID₅₀，观察8天，未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的实验组病牛表现为蹄、口腔及其周围和母畜的乳头等部位出现水泡。统计发病牛的数量，按照Reed-Muench方法计算ID₅₀，该组织培养毒的ID₅₀为4×10⁶。

(2)转基因牛的FMDV攻毒实验

选取未接种FMD疫苗、无FMDV中和抗体、6月龄左右正常及转基因荷斯坦奶牛各6头，分为4组，每组3头。正常及转基因牛中，各有一组不接种病毒，另一组分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量为100ID₅₀，观察8天。未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的正常奶牛组奶牛全部发病，统计转基因发病牛的数量并与正常组发病牛的症状进行比较，计算发病率。实验结果见图11，接种病毒的正常奶牛组奶牛全部发病(3/3)，发病率100％，而接种病毒的转基因奶牛组中抗病毒感染的奶牛2头，发病奶牛1头(1/3)，发病率33.3％；接种病毒后，与正常奶牛比较，发病的转基因奶牛出现临床体症时间明显的滞后。上述结果表明，通过敲除αv亚基基因的获得杂合子转基因奶牛的方法，可培育出抗FMD的转基因奶牛。

实施例2：体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的纯合子转基因奶牛的生产及分子生物学检测

体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的纯合子转基因奶牛的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：

1.整合素αv亚基基因敲除的二次打靶载体的构建

在整合素αv亚基基因敲除第一次打靶载体的基础上用报告基因GFP替换neo，获得第二次打靶载体。具体方法如下：

以pLN为模板，在引物pGK1upper：

5’-CGGATCGATGCGGCCAATTCTACCGGGT-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶ClaI的识别位点)

与引物pGK1lower：

5’-

TGTTCAATGGCCGATCCCATATTGGCTGCAGGTCGAAAG-3’(带下划线的碱基为GFP基因5’序列)

的引导下，PCR克隆片段为557bp的pGK启动子片段；以pEGFP-N1为模板，在引物pGFP upper：

5’-CCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3’(带下划线的碱基为pGK启动子3’序列)

与引物pGFP lower：

5’-TCTGCAGACTTACAGCGGATCCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’(带下划线的碱基为pGK终止子5’序列)，PCR克隆片段为770bp的GPF基因片段；以pLN为模板，在引物pGK2upper：

5’-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGGGATCCGCTGTAAGTCTGCAG-3’与引物pGK2lower：

5’-CCCGGTACCCTCGACGGTATCGAGCTTC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶KpnI的识别位点)

PCR克隆片段为522bp的pGK终止子片段。将纯化的557bp PCR产物与750bp PCR产物混合作为两步法PCR反应的拼接模板，在引物pGK1upper与引物pGFP lower的引导下，获得1302bp的PCR产物。反应条件为：94℃30s；94℃20s 56℃20s 68℃1min，25个循环；68℃5min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收1302bp片段；以纯化的1302bp PCR产物与522bp PCR产物混合作为两步法PCR反应的拼接模板，在引物pGK1upper与引物pGK2lower的引导下，PCR克隆1754bp片段，将该片段用KpnI和ClaI酶切后回收该片段与经相同酶切的载体pLN-αV-KO回收10642bp片段连接，然后将连接产物转化E.coliDH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切(图12)和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-GFP-αV(序列表2)。

2.杂合子转基因奶牛胎儿皮肤成纤维细胞系的建立

选取2月龄的实施例1中获得的杂合子转基因胎儿，其胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法与实施例1奶牛胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法相同。

3.杂合子转基因奶牛胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选

处于对数生长期的杂合子转基因牛胎儿皮肤成纤维细胞，用Opti-MEM洗1次细胞，将二次打靶载体线性化后，浓缩浓度不低于1μg/μL，经脂质体LTX转染大量细胞，24h后培养液中含有700μg/mL G418和8μM Gancvilor，每3d换液1次，96h后用0.25％胰蛋白酶消化细胞并进行流式细胞分选，含有GFP的细胞接种于细胞培养皿中，100个细胞/培养皿，用700μg/mL G418和8μM Gancvilor继续进行正负筛选，培养10d后，在荧光倒置显微镜下挑选有绿色荧光的细胞克隆(具备G418和Gancvilor抗性且产生绿色荧光的细胞可能是αv基因敲除的纯合子细胞)，扩繁2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。

4.卵母细胞的成熟培养、去核

与实施例1卵母细胞的成熟培养、去核方法相同。

5.核移植和克隆胚胎的体外培养

与实施例1核移植和克隆胚胎的体外培养方法相同。

6.胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d和90d进行直肠检测以确定妊娠率。共移植受体牛28头，移植后的第60d直肠检测表明，其中12头怀孕。

7.转基因纯合子阳性细胞及克隆牛的分子生物学鉴定

(1)PCR鉴定

1)用于PCR鉴定的第二条染色体αv基因发生同源重组的阳性模板质粒的构建

以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pαV-Right upper：

5’-ACGCGTCGACTGGGCTATTGGTTTCCTC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶SalI的识别位点)

与引物pαV-Right-model lower：

5’-CCGGAATTCTTGCTAAGGCCTTTGATAGACGA-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶EcoRI的识别位点)

的引导下，PCR克隆片段为3844bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s 55℃20s68℃3min，25个循环；68℃7min。反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。将该片段用SalI和EcoRI酶切后回收与经相同酶切的载体pLN-GFP-αV回收9295bp片段连接，然后将连接产物转化E.coliDH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-αV-ko-model2，该质粒包含第二次打靶质粒pLN-GFP-αV的右侧同源臂和报告基因GFP，可做pLN-GFP-αV二次打靶后发生同源重组的细胞/胎儿/转基因牛跨越式PCR鉴定的模板。在(PGK-GFP开放阅读框，pLN-αV-ko-model2：base 3062-3079)上游引物P7：5’-CCTGCTGGAGTTCGTGAC-3’，与(pLN-αV-ko-model2：base 7001-7984)下游引物P8：5’-AACCATGAGTGCATTTCG-3’，的引导下，PCR克隆片段为3940bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s 55℃20s 68℃4min，35个循环；68℃9min。

2)αv基因敲除纯合子的跨越式PCR鉴定

以二次打靶获得的牛胎儿成纤维neo抗性及绿色荧光克隆或转基因牛的基因组DNA为模板，跨越式PCR鉴定引物P1和P2及P7和P8的分别引导下，PCR扩增4529bp及3940bp的片段分别为第一次和第二次同源重组阳性。PCR反应条件：94℃30s；94℃20s 55℃20s68℃4min，35个循环；68℃9min。

(2)Southern杂交鉴定

取约10μg转基因克隆牛胎儿组织或转基因牛耳部组织的基因组DNA，以普通荷斯坦奶牛或鲁西黄牛的基因组DNA作为阴性对照，用限制性内切酶SmaI酶切消化，30V低压电泳，转膜后，进行Southern杂交。杂交所用探针分别为利用rediprimer^TM II random primer labelingsystem(amersham)、由[α-³²P]dCTP同位素标记的、经限制性内切酶XhoI和SalI酶切消化的pLN载体neo基因或pLN-GFP-αV载体GFP基因回收产物，第一次打靶(αv被neo基因替换)的杂交阳性信号为9.2kb片段，第二次打靶(αv被GFP基因替换)的杂交阳性信号为9.1kb片段。

(3)Real-time RT-PCR鉴定

与实施例1Real-time RT-PCR方法相同。

8.转基因牛的FMDV攻毒实验

与实施例1转基因牛的FMDV攻毒实验方法相同。

实施例3：体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的杂合子转基因黄牛的生产及分子生物学检测

体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的杂合子转基因黄牛的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：

1.整合素αv亚基基因敲除的打靶载体

鲁西黄牛和荷斯坦奶牛αv基因同源性很高，故本研究中使用了实施例1中所用的奶牛打靶载体。

2.鲁西黄牛胎儿皮肤成纤维细胞系的建立

选取2月龄的鲁西黄牛胎儿(购自山东省鲁西黄牛原种场)，其胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法与实施例1奶牛胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法相同。

3.鲁西黄牛胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选

与实施例1奶牛胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和正负筛选方法相同。

4.卵母细胞的成熟培养、去核

与实施例1卵母细胞的成熟培养、去核方法相同。

5.核移植和克隆胚胎的体外培养

与实施例1核移植和克隆胚胎的体外培养方法相同。

6.胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d和90d进行直肠检测以确定妊娠率。共移植受体牛46头，移植后的第60d直肠检测表明，其中19头怀孕。手术取2个胎儿进行鉴定，制备转基因阳性胎儿成纤维细胞，一部分用于体细胞克隆制备杂合子转基因牛，一部分用于二次打靶和体细胞克隆制备纯合子转基因牛。

7.转基因杂合子阳性细胞、胎儿及克隆牛的分子生物学鉴定

(1)PCR鉴定

具体方法同实施例1。

(2)Southern杂交鉴定

具体方法同实施例1。

(3)Real-time RT-PCR鉴定

具体方法同实施例1。

8.转基因牛的FMDV攻毒实验

具体方法同实施例1。

实施例4：体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的纯合子转基因黄牛的生产及分子生物学检测

体细胞克隆整合素αv亚基基因敲除的纯合子转基因黄牛的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：

1.整合素αv亚基基因敲除的二次打靶载体

鲁西黄牛整合素αv亚基基因敲除的二次打靶载体同实施例2中所用的奶牛打靶载体。

2.鲁西黄牛转基因杂合子胎儿皮肤成纤维细胞系的建立

选取2月龄的鲁西黄牛转基因杂合子胎儿(由实施例3获得)，其胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法与实施例2转基因奶牛胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法相同。

3.鲁西黄牛转基因杂合子胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选

与实施例2转基因杂合子奶牛胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和正负筛选方法相同。

4.卵母细胞的成熟培养、去核

与实施例1卵母细胞的成熟培养、去核方法相同。

5.核移植和克隆胚胎的体外培养

与实施例1核移植和克隆胚胎的体外培养方法相同。

6.胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d和90d进行直肠检测以确定妊娠率。共移植受体牛29头，移植60d后直肠检测表明，其中13头怀孕。

7.转基因纯合子阳性细胞、胎儿及克隆牛的分子生物学鉴定

(1)PCR鉴定

具体方法同实施例2。

(2)Southern杂交鉴定

具体方法同实施例2。

(3)Real-time RT-PCR鉴定

具体方法同实施例1。

8.转基因牛的FMDV攻毒实验

具体方法同实施例1。

Claims (6)

1.一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛重构胚的方法，其特征在于：是将碱基序列如序列表中序列1所示的线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体转染正常牛的牛胎儿成纤维细胞，通过同源重组获得替换整合素αv亚基基因的核供体细胞，将核供体细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚；

所述牛胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞或卵丘细胞；

所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体转染牛胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法、病毒载体法或磷酸钙沉淀法；

所述线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体是通过以下构建方法得到的：

以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pαV-Left upper：

5’-CCGCTCGAGTGGAGAGTCCTGCGGAGTA-3’

和引物pαV-Left lower：

5’-CTAGTCTAGAATATGTCAGGCCAACAGTCAAC-3’

引导下，PCR克隆片段为1779bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s58℃20s68℃2min，25个循环；68℃5min；反应结束后对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收1779bp片段，TA克隆至pMD19-T载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒；酶切鉴定出含有αVLeft片段的菌落命名为pMD19-αVLeft，将pMD19-αVLeft用Xho I和Xba I酶切后回收αVLeft片段与经相同酶切的载体pLN连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-αVLeft；

以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pαV-Right upper：

5’-ACGCGTCGACTGGGCTATTGGTTTCCTC-3’

和引物pαV-Right lower：

5’-CCGGAATTCTGGTGTTCAACAGCGTCT-3’

引导下，PCR克隆片段为3083bp片段，反应条件为：94℃30s；94℃20s58℃20s68℃3min，25个循环；68℃7min；反应结束后对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，回收3083bp片段，TA克隆至pMD19-T载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒,酶切鉴定出含有αVRight片段的菌落命名为pMD19-αVRight，将pMD19-αVRight用Sal I和EcoR I酶切后回收αVRight片段与经相同酶切的载体pLN-αVLeft连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLN-αV-KO。

2.根据权利要求1所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛重构胚的方法，其特征在于：所述牛胎儿成纤维细胞为45～150日龄胎儿不同组织来源的成纤维细胞。

3.根据权利要求1所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛重构胚的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的打靶载体转染牛胎儿成纤维细胞方法为脂质体转染法。

4.根据权利要求3所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛重构胚的方法，其特征在于：所述脂质体转染法的条件为：线性化的载体DNA浓度不低于1μg/μL，DNA：脂质体LTX=1：3。

5.根据权利要求1所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛重构胚的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素αv亚基基因的核供体细胞核导入牛的去核卵母细胞的方法为显微注射法。

6.根据权利要求1所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛重构胚的方法，其特征在于：所述去核卵母细胞不带有第一极体。

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