CN102121019A - 一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH及其编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH。所述茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH含有所述CsGDH基因的cDNA全长1667bp，其包括长度为1236bp的开放阅读框(ORF)以及173bp的5′端非翻译区和258bp的3′端非翻译区。将本发明茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH与表达载体pMAL-p2X连接，转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，经诱导表达，获得了可溶性融合蛋白MBP-CsGDH。本发明茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH在转基因植物中具有重要的应用价值，可用于茶树的基因改良，通过转入CsGDH基因，可调节茶树体内的氮素代谢，提高茶叶中的氨基酸，特别是谷氨酸的含量。

Description

一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH及其编码蛋白

技术领域

本发明涉及茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH、该基因编码的蛋白以及该基因的应用，通过茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH基因工程技术的研究，培育氨基酸含量高的茶树新品种，属于基因工程技术领域。

背景技术

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehyd rogenase，GDH；EC 1.4.1.2)普遍存在于植物体内，该酶主要位于植物线粒体内，由两个亚基(α和β)按不同比例组成七种同工酶形式。GDH既能催化铵与α-酮戊二酸结合生成谷氨酸，也能催化谷氨酸氧化脱羧。GDH曾被认为是植物同化铵的主要酶，直到1974年证实谷氨酰胺合成酶(GS)-谷氨酸合酶(GOGAT)循环才是高等植物体内铵同化的主要途径，因此，对于高等植物的GDH功能的研究与解释一直存在争议。较为普遍的观点认为，GDH在植物体内只要行使同化铵离子的功能，是高等植物N代谢途径中的一个重要成员。

基于GDH在植物氮素吸收利用过程中的重要作用，近年来关于利用GDH基因进行转基因植物的研究比较多。已有研究表明，将大肠杆菌的gdhA转入烟草，提高了烟草产量，转基因烟草中游离氨基酸和碳水化合物的含量与野生型相比有所提高。将大肠杆菌的gdhA转入玉米，同样提高了玉米的产量，并且同时提高了玉米对于干旱的耐受力。将小球藻GDH基因转入烟草内，增加了烟草对于铵离子的吸收和利用，提高了烟草对氮素的利用效率。将番茄GDH基因legdh1转入番茄后，转基因番茄中总游离氨基酸的量是正常番茄的2.3倍，特别是谷氨酸的含量明显增加。GDH基因能够显著改变植物生长状态，提高植物的产量以及对于一些胁迫环境的耐受力，具有重要的应用价值。

茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。茶树是重要的叶用经济植物，因此是喜氮作物，对氮的需求量最大。氮素被茶树吸收后，在茶树体内主要转化为各类氨基酸。氨基酸是茶叶鲜爽为的主要物质，是决定茶叶香、味的主要化学成分，尤其对绿茶滋味的影响尤为明显，与茶叶品质呈显著正相关。因此，通过植物基因工程技术，培育氨基酸含量高的茶树新品种，具有重要的经济价值。

发明内容

本发明所要解决的第一个问题是提供一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH，其具有如序列表SEQ ID NO：1所示的基因序列。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH，通过设计一对简并引物RD01和RD02进行PCR扩增，其主要特点是：

简并引物RD01，其序列为：5-CGC CCG GGG CCC NAT GAARGG-3；

简并引物RD02，其序列为：5-TCA CGC CCA GGG TGA ANG CNCCCAT-3；

茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH保守片段的PCR扩增条件为：94℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终止延伸10min。

扩增反应后得到序列长度为965bp的CsGDH基因的保守序列片段。

对CsGDH基因进行5′RACE和3′RACE操作。根据已经获得的CsGDH保守片段设计两个基因特异性引物，其主要特点是：

基因特性引物5′-GSP，其序列为：5′-AGT GAC ATC ACC GGA GCAGTT AAG A-3′；

基因特性引物3′-GSP，其序列为：5′-ACC ACG TCC AGT TGC AGCCTC CCT A-3′。

5′RACE PCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸40s，35个循环；72℃终止延伸10min。3′RACEPCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸40s，35个循环；72℃终止延伸10min。

通过5′RACE和3′RACE，分别获得了长度为512bp和498bp的CsGDH基因的5′端和3′端序列(图4)。将三段基因片段拼接后获得了CsGDH的cDNA序列，如序列表SEQ ID NO：1所示。CsGDH全长1667bp。

本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质CsGDH及其制备方法，其具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

通过ORFinder软件预测，CsGDH基因编码一个411个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明所要解决的第三个问题是提供含有茶树CsGDH基因的重组质粒pMAL-CsGDH及其构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

利用设计的两种扩增引物CsGDH-P1和CsGDH-P2进行PCR扩增。所述两种扩增引物的序列分别为：CsGDH-P1：5′-AAT ATC GCG GATCCA TGA ACG CTC TCG CCG CCA CAA ACC-3′；CsGDH-P2：5′-ATAAGA ATA AGC TTC GCT TCC CAA CCC CTT AAT ACA GTT-3′。

所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，反应35个循环；72℃延伸10min。扩增产物与载体pMAL-p2X分别经BamHI和HindIII双酶切4小时候后进行连接，获得原核表达质粒pMAL-CsGDH。

本发明所要解决的第四个问题是提供在大肠杆菌中异源表达的茶树CsGDH蛋白。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

构建了一种含有茶树CsGDH基因的重组质粒pMAL-CsGDH。将该重组质粒转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，挑取单克隆于5ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，培养12h。取1ml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD₆₀₀≈0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.5mM，22℃诱导表达20h。将诱导后的菌液于4℃，5,000rpm，离心5min，收集菌体，超声波破碎后SDS-PAGE检测，发现重组蛋白MBP-CsGDH存在于可溶性的上清蛋白中(图4)。

本发明所要解决的第五个问题是提供茶树CsGDH基因在转基因植物中的应用。

本发明的有益效果是：茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。茶树是重要的叶用经济植物，因此是喜氮作物，对氮的需求量最大。氮素被茶树吸收后，在茶树体内主要转化为各类氨基酸。氨基酸是茶叶鲜爽为的主要物质，是决定茶叶香、味的主要化学成分，尤其对绿茶滋味的影响尤为明显，与茶叶品质呈显著正相关。因此，通过植物基因工程技术，培育氨基酸含量高的茶树新品种，具有重要的经济价值。

附图说明

图1茶树总RNA电泳图。

图2茶树总cDNA电泳图。

图3CsGDH基因的保守片段、5′RACE产物以及3′RACE产物电泳图。

M，DNA marker；lane 1，CsGDH基因的保守片段，965bp；lane2，CsGDH基因5′RACE产物，512bp；lane 3，CsGDH基因3′RACE产物，498bp。

图4MBP-CsGDH融合蛋白SDS-PAGE电泳图。

M，protein molecular marker；lane 1，pMAL-p2X空载质粒转化Rosetta(DE3)菌，诱导表达后的上清蛋白，融合标签MBP蛋白分子量约为43kDa；lane 3，pMAL-CsGDH重组质粒转化Rosetta(DE3)菌，诱导表达后的上清蛋白，CsGDH本身分子量约为45kDa，MBP-CsGDH融合蛋白分子量约为88kDa。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例一：一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH。

采用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取茶叶总RNA(图1)。提取的总RNA利用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)进行反转录，合成cDNA第一链(图2)。依据谷氨酸脱氢酶蛋白家族的保守性，设计一对简并引物RD01(5-CGC CCG GGG CCC NATGAA RGG-3)和RD02(5-TCA CGC CCA GGG TGA ANG CNC CCAT-3)进行PCR扩增。PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终止延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图3)。使用DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收PCR产物。将该DNA片段连接到pMD 19-T载体(TaKaRa)，阳性克隆送到上海生工生物工程公司进行测序，得到965bp CsGDH基因的保守序列片段。

使用GeneRacer^TM Kit(Invitrogen)进行CsBDP的5′RACE和3′RACE操作。根据已经获得的CsBDP的保守片段设计两个基因特异性引物，分别为5′-GSP(5′-AGT GAC ATC ACC GGA GCA GTT AAG A-3′)和3′-GSP(5′-ACC ACG TCC AGT TGC AGC CTC CCT A-3′)。

5′RACE PCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸40s，35个循环；72℃终止延伸10min。3′RACEPCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸40s，35个循环；72℃终止延伸10min。

1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶回收PCR产物。使用TOPO TACloning Kit(Invitrogen)克隆RACE PCR产物，操作按说明书进行。将阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司测序。通过5′RACE和3′RACE，分别获得了512bp和498bp的CsBDP的5′端和3′端序列(图3)。将三段基因片段拼接后获得了CsBDP的全长cDNA序列，如序列表SEQ ID NO：1所示。CsBDP全长1667bp。

实施例二：一种由CsGDH基因编码的蛋白质CsGDH。

通过ORFinder软件预测，CsBDP基因编码一个411个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO：2所示。

实施例三：一种含有茶树CsGDH基因的重组质粒pMAL-CsGDH。

利用CsGDH-P 1(5′-AAT ATC GCG GAT CCA TGA ACG CTC TCGCCG CCA CAA ACC-3′)和CsGDH-P2(5′-ATA AGA ATA AGC TTCGCT TCC CAA CCC CTT AAT ACA GTT-3′)进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，反应35个循环；72℃延伸10min。扩增产物与载体pMAL-p2X(NewEngland Biolabs)分别经BamHI和HindIII双酶切4小时候后进行连接，获得原核表达质粒pMAL-CsGDH。

实施例四：一种含有茶树CsGDH蛋白的融合蛋白MBP-CsGDH。

将pMAL-CsGDH重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，挑取单克隆于5ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，培养12h。取1ml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD₆₀₀≈0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.5mM，22℃诱导表达20h。

将诱导后的菌液于4℃，5,000rpm，离心5min，收集菌体，超声波破碎后SDS-PAGE检测，发现重组蛋白MBP-CsGDH存在于可溶性的上清蛋白中(图4)。

                        序列表

SEQUENCE LISTING

<110>安徽师范大学

<120>茶树CsGDH基因序列

<130>1

<140>1

<141>2009-11-27

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1667

<212>DNA

<213>茶树(Camellia sinensis)

<400>1

tcgactggag cacgaggaca ctgacatgga ctgaaggagt agaaaattcc

tttgatccat                                          60

tataatctct cactacacag tttccattta tatatatata tacataatat

tttgaactgt                                         120

ttgatccatt ttagtttctg ggtattgctt gtttgagtga ttctcacaca

accatgaacg                                         180

ctctcgccgc cacaaaccgc aactttcgtc gtgcggctcg cattcttgga

ttggactcta                                         240

ggattgagaa gagtcttttg attccgttca gagaaatcaa ggtagaatgc

acaattccta                                         300

aggatgatgg aactctggtg tcctacgttg gattcagagt ccaacatgat

aattctcgag                                         360

gccccatgaa aggagggatc agataccatc ctgaggttga tcctgatgag

gtaaatgctc                                         420

tagctcaatt gatgacatgg aagactgctg tagcagacat tccttatggt

ggagctaagg                                         480

gtggaattgg atgcaagcca aaggatttag gtaatagtga attggaacgt

ctcactcggg                                         540

tcttcactca aaaaattcat gatctaattg gggttaatag ggatgtccct

gcgccggaca                                         600

tggggactaa tgcacagacc atggcttgga ttttggatga atactcgaag

tttcatggtc                                         660

attcaccagc tgttgtgacc gggaagccca tagatcttgg tgggtccctg

ggtagggagg                                         720

ctgcaactgg acgtggtgtt atttatgcca cagaagcttt actcgctgaa

tatggaaaat                                         780

caatcaagga tttgacattt gccatacagg gttttggcaa cgtggggtct

tgggcagcaa                                         840

ggcttattca tgagagaggt ggtaaggtca ttgcagtgag tgacatcacc

ggagcagtta                                         900

agaacccaaa tgggattgat attccaattt tgcttaatca taaggaagca

acggggagct                                         960

tgaaaaattt tgatggtgga gatgccatgc atccaaatga attgctccta

cataaatgtg                                        1020

atgtcctgat tccatgtgcc ttgggaggag ttatcaacag agaaaacgct

gataatgtaa                                        1080

gggccaagtt cattgtagga gcggcaaatc atcctactga tccagaggca

gatgagattc                                        1140

tatctaagaa aggagttata atactacctg atatatatgc aaattctgga

ggtgtgacgg                                        1200

tcagctattt tgagtgggtc cagaatattc aaggtttcat gtgggacgaa

gagaaggtga                                        1260

acaaagagct tcataggtac atgacaagag ctttcggtaa catcaaaagc

atgtgtcaga                                        1320

cacacaattg caacctccga atgggtgcgt tcacgctggg agtgaatcgt

gttgcacggg                                        1380

caactgtatt aaggggttgg gaagcgtgat taaatcacct tcacattcta

tttctccttt                                                  1440

ttttcgtctt acaaataaat gcatttttgc cgctgaagaa tgcagcttga

tagcggttct                                                  1500

ttgttttttt tttttgggta agtaattgat agccgttctt accctcccatttatagactg

                                                            1560

tccgtgactt gaactcacgc tttcaggacg ctggtcttaa aaaagttaaa

agactgtgta                                                  1620

ctgttgtctg aaaatttgag gatcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa

                                                            1667

<210>1<211>411

<212>RT

<213>茶树(Camellia sinensis)

<400>2

Met Asn Ala Leu Ala Ala Thr Asn Arg Asn Phe Arg Arg Ala Ala Arg

1             5                 10              15

Ile Leu Gly Leu Asp Ser Arg Ile Glu Lys Ser Leu Leu Ile Pro Phe

         20                  25              30

Arg Glu Ile Lys Val Glu Cys Thr Ile Pro Lys Asp Asp Gly Thr Leu

     35                  40              45

Val Ser Tyr Val Gly Phe Arg Val Gln His Asp Asn Ser Arg Gly Pro

 50                  55              60

Met Lys Gly Gly Ile Arg Tyr His Pro Glu Val Asp Pro Asp Glu Val

65               70              75                  80

Asn Ala Leu Ala Gln Leu Met Thr Trp Lys Thr Ala Val Ala Asp Ile

                 85                  90             95

Pro Tyr Gly Gly Ala Lys Gly Gly Ile Gly Cys Lys Pro Lys Asp Leu

            100                 105             110

Gly Asn Ser Glu Leu Glu Arg Leu Thr Arg Val Phe Thr Gln Lys Ile

        115                 120             125

His Asp Leu Ile Gly Val Asn Arg Asp Val Pro Ala Pro Asp Met Gly

    130                 135             140

Thr Asn Ala Gln Thr Met Ala Trp Ile Leu Asp Glu Tyr Ser Lys Phe

145                 150             155             160

His Gly His Ser Pro Ala Val Val Thr Gly Lys Pro Ile Asp Leu Gly

                165             170             175

Gly Ser Leu Gly Arg Glu Ala Ala Thr Gly Arg Gly Val Ile Tyr Ala

            180             185             190

Thr Glu Ala Leu Leu Ala Glu Tyr Gly Lys Ser Ile Lys Asp Leu Thr

        195             200             205

Phe Ala Ile Gln Gly Phe Gly Asn Val Gly Ser Trp Ala Ala Arg Leu

    210             215             220

Ile His Glu Arg Gly Gly Lys Val Ile Ala Val Ser Asp Ile Thr Gly

225             230             235             240

Ala Val Lys Asn Pro Asn Gly Ile Asp Ile Pro Ile Leu Leu Asn His

            245             250             255

Lys Glu Ala Thr Gly Ser Leu Lys Asn Phe Asp Gly Gly Asp Ala Met

        260             265             270

His Pro Asn Glu Leu Leu Leu His Lys Cys Asp Val Leu Ile Pro Cys

    275             280             285

Ala Leu Gly Gly Val Ile Asn Arg Glu Asn Ala Asp Asn Val Arg Ala

        290             295             300

Lys Phe Ile Val Gly Ala Ala Asn His Pro Thr Asp Pro Glu Ala Asp

    305             310             315             320

Glu Ile Leu Ser Lys Lys Gly Val Ile Ile Leu Pro Asp Ile Tyr Ala

                325             330             335

Asn Ser Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Ile

            340             345             350

Gln Gly Phe Met Trp Asp Glu Glu Lys Val Asn Lys Glu Leu His Arg

        355             360             365

Tyr Met Thr Arg Ala Phe Gly Asn Ile Lys Ser Met Cys Gln Thr His

    370             375             380

Asn Cys Asn Leu Arg Met Gly Ala Phe Thr Leu Gly Val Asn Arg Val

385             390             395             400

Ala Arg Ala Thr Val Leu Arg Gly Trp Glu Ala

            405             410

Claims (4)

1.一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH，其特征在于，含有所述CsGDH基因的cDNA全长1667bp，其包括长度为1236bp的开放阅读框(ORF)以及173bp的5′端非翻译区和258bp的3′端非翻译区。

2.一种由权利要求1所述的茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质为CsGDH基因编码的含有411个氨基酸的多肽。

3.一种含有如权利要求1所述的茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH的重组质粒pMAL-CsGDH，其特征在于，由两种扩增引物CsGDH-P1和CsGDH-P2经过PCR扩增反应后，扩增产物与载体pMAL-p2X分别经BamHI和HindIII双酶切4小时候后进行连接获得；所述PCR方法中设计的两种扩增引物CsGDH-P1和CsGDH-P2的基因型分别为：CsGDH-P1：5′-AAT ATC GCG GAT CCA TGA ACG CTC TCG CCG CCA CAAACC-3′和CsGDH-P2：5′-ATA AGA ATA AGC TTC GCT TCC CAACCC CTT AAT ACA GTT-3′；所述PCR方法反应条件为：95℃，预变性3min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min 30s，反应35个循环；72℃延伸10min。

4.一种含有如权利要求2所述的茶树谷氨酸脱氢酶CsGDH的重组蛋白MBP-CsGDH，其特征在于，该重组蛋白是将pMAL-CsGDH重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，经过扩大培养和诱导表达并通过超声波破碎的方法获得。

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