CN102174524B

CN102174524B - 脉羊耳兰凝集素基因、蛋白及其应用

Info

Publication number: CN102174524B
Application number: CN2011100236167A
Authority: CN
Inventors: 鲍锦库; 吴传芳; 罗萍; 何雪梅; 张潇月; 徐怀龙
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2031-01-21
Also published as: CN102174524A

Abstract

本发明从兰科脉羊耳兰根状茎和叶中分离纯化出脉羊耳兰凝集素蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。本发明通过对分离纯化所获脉羊耳兰凝集素蛋白进行N端氨基酸序列的测定，得到N端29个氨基酸序列组成，并以此设计简并引物，用3’RACE和5’RACE的方法克隆脉羊耳兰凝集素的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。本发明通过实验证明了脉羊耳兰凝集素蛋白对农业有害真菌具有明显的抑制作用，可在制备抗农业有害真菌的农药中应用，可在植物对有害真菌抗性改良中应用。

Description

脉羊耳兰凝集素基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明属于凝集素领域，特别涉及脉羊耳兰凝集素基因、脉羊耳兰凝集素蛋白以及脉羊耳兰凝集素蛋白在抗农业有害真菌中的应用。

背景技术

脉羊耳兰(Liparis nervosa)属于被子植物门(Angiospermae)、单子叶植物纲(Monocotyledoneae)、百合亚纲(Liliidae)、兰目(Orchidales)、兰科(Orchidaceae)、羊耳蒜属(Liparis)，是一种名贵中草药，主治：吐血，咯血，肠风下血，血崩，手术出血，小儿惊风，热毒疮疡，蛇咬伤等。有关脉羊耳兰的研究主要集中在止血功能方面(见周继铭，刘常五，冉崇行等.复方脉羊耳兰外用止血药的初步研究.中国医院药学杂志，1983，3(3)：5-7)，经动物试验和临床试验证明，脉羊耳兰可以缩短凝血时间、减少出血量并且无继发性出血，是一种有效可靠的止血药。关于脉羊耳兰所含蛋白的分离提取、关于编码脉羊耳兰蛋白的基因迄今未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脉羊耳兰凝集素基因、脉羊耳兰凝集素蛋白，并证明脉羊耳兰凝集素蛋白的用途，以扩大脉羊耳兰的应用范围。

本发明所述脉羊耳兰凝集素蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。该蛋白可直接从兰科植物脉羊耳兰中分离纯化而获得，也可通过基因重组技术制备。从兰科植物脉羊耳兰中分离纯化采用柱层析法，所用介质依次为DEAE-Sepharose(DEAE-琼脂糖凝胶)，Mannose-sepharose 4B(甘露糖-琼脂糖凝胶4B)，Sephacryl S-100(丙烯葡聚糖凝胶S-100)。脉羊耳兰凝集素蛋白经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测为单一蛋白染色带。Sephacryl S-100分子筛凝胶过滤测得脉羊耳兰凝集素的表观分子量为13KD，SDS-PAGE显示其亚基分子量约为13.0KD，表明脉羊耳兰凝集素分子为由单个亚基组成的蛋白。糖抑制实验表明脉羊耳兰凝集素为甘露糖结合凝集素，甘露糖的最低抑制浓度为0.39mM。

本发明所述脉羊耳兰凝集素基因，具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。通过对分离纯化所获脉羊耳兰凝集素蛋白进行N端氨基酸序列的测定，得到N端29个氨基酸序列组成，并以此设计简并引物，用3’RACE(快速扩增cDNA末端法)和5’RACE的方法克隆脉羊耳兰凝集素的基因。

本发明通过实验证明：脉羊耳兰凝集素蛋白对农业有害真菌具有明显的抑制作用。当受试真菌为稻瘟病菌Piricularia oryzae Cav.时，脉羊耳兰凝集素蛋白的最低抑制浓度为0.5mg/ml；当受试真菌为玉米小斑病菌Bipolaris maydis时，脉羊耳兰凝集素蛋白的最低抑制浓度为0.25mg/ml；当受试真菌为棉花枯萎菌Fusarium oxysporum vasinfectum时，脉羊耳兰凝集素蛋白的最低抑制浓度为0.125mg/ml。因此，脉羊耳兰凝集素蛋白可在抗农业有害真菌中应用。所述应用包括：脉羊耳兰凝集素蛋白在制备抗农业有害真菌的农药中的应用；脉羊耳兰凝集素蛋白在植物对有害真菌抗性改良中的应用(通过转基因技术实现)。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次从兰科脉羊耳兰根状茎和叶中分离纯化出脉羊耳兰凝集素蛋白，对其基因进行克隆，并证明了脉羊耳兰凝集素蛋白对农业有害真菌具有明显的抑制作用，不仅扩大了脉羊耳兰的应用范围，而且为农作物抗农业有害真菌提供了新的技术支持。

2、脉羊耳兰凝集素蛋白既可直接从兰科植物脉羊耳兰中分离纯化而获得，又可通过基因重组技术制备，因而便于工业化生产。

附图说明

图1是本发明所述脉羊耳兰凝集素蛋白经阴离子层析柱分离纯化后的效果图，图中P₂有活性。

图2本发明所述脉羊耳兰凝集素蛋白经亲和柱分离纯化后的效果图，图中M₂有活性。

图3是本发明所述脉羊耳兰凝集素蛋白经分子筛分离纯化后的效果图，图中S有活性。

图4是本发明所述脉羊耳兰凝集素蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，泳道1为脉羊耳兰凝集素蛋白粗品，泳道2为脉羊耳兰凝集素蛋白经亲和柱分离纯化后的有活性部分，泳道3为加β-巯基乙醇的脉羊耳兰凝集素蛋白纯品，泳道4为未加β-巯基乙醇的脉羊耳兰凝集素蛋白纯品，泳道5为标准分子量蛋白。

图5是本发明所述脉羊耳兰凝集素蛋白对农业有害真菌的抑制效果图，图中：A为对稻瘟病菌P.oryzae Cav.的抑制效果图(1：生理盐水、2：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.25mg/ml、3：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.5mg/ml、4：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度1mg/ml)；B为对玉米小斑病菌B.maydis的抑制效果图(1：生理盐水、2：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.25mg/ml、3：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.5mg/ml、4：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度1mg/ml)；C为对棉花枯萎菌F.oxysporum vasinfectum的抑制效果图(1：生理盐水、2：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.5mg/ml、3：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.25mg/ml、4：脉羊耳兰凝集素蛋白浓度0.125mg/ml)。

具体实施方式

实施例1：脉羊耳兰凝集素蛋白的制备

本实施例中，脉羊耳兰凝集素蛋白制备方法如下

1、粗品制备

将脉羊耳兰根状茎和叶洗净，用搅拌器匀浆至糊状，然后加入糊状脉羊耳兰2倍体积的0.2M氯化钠溶液，在4℃下放置12小时，4层纱布过滤，离心(4℃，5,000g，30min)，收集上清，并向所获上清中加入固体硫酸铵达50％饱和度，于4℃放置6小时，离心(4℃，10,000g，20min)去沉淀，向所获上清继续加硫酸铵至80％饱和度，于4℃放置12小时，离心(4℃，10,000g，20min)收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥得脉羊耳兰凝集素蛋白粗品。

2、阴离子交换层析分离纯化

将步骤1制备的脉羊耳兰凝集素蛋白粗品用50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液溶解，以相同缓冲液平衡DEAE-Sephrose(DEAE-琼脂糖凝胶)离子交换柱，脉羊耳兰凝集素蛋白粗品溶液以2ml/min的流速上柱，用相同缓冲液配制的0～1M NaCl溶液连续梯度以流速为2ml/min连续洗脱，经280nm处测定紫外吸收值(分离纯化结果见图1)，以处理好的新鲜兔血细胞检测活性，收集活性组分并透析除盐，用于后续实验。

3、亲和柱分离纯化

将步骤2DEAE-Sepharose层析所获活性组分放于50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液中透析，并以相同缓冲液平衡Mannose-sepharose 4B(甘露糖-琼脂糖凝胶4B)柱，将透析好的活性组分以2ml/min的流速上柱，用相同缓冲液以5ml/min流速冲洗至OD₂₈₀＜0.02，换用含500mM甘露糖溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，流速15ml/h，收集管经280nm处测定紫外吸收值(分离纯化结果见图2)，再将样品用生理盐水透析，以处理好的新鲜兔血细胞检测活性，收集活性组分并透析除盐，用于后续实验。

4、分子筛纯化

将步骤3Mannose-sepharose 4B层析后的活性组分样品按如下步骤进行浓缩：将活性组分样品装入透析袋中，置于PEG-20000(聚乙二醇-20000)中约5小时除去大量水分，再将装有浓缩样品的透析袋放置于烧杯中流水透析12小时，收集浓缩样品。

取3ml浓缩样品，用灭菌生理盐水平衡的Sephacryl S-100(丙烯葡聚糖凝胶S-100)进行分子筛层析，控制流速在0.5～1ml/min之间，经280nm处测定紫外吸收值(分离纯化结果见图3)，以处理好的新鲜兔血细胞检测活性，收集活性组分，透析除盐，冷冻干燥得到纯化的脉羊耳兰凝集素蛋白样品，经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测为单一蛋白组分(见图4)。

实施例2：脉羊耳兰凝集素的基因克隆(采用快速扩增cDNA末端法，即3’/5’RACE法)

1、材料和方法

1.1材料

脉羊耳兰凝集素蛋白样品：采用实施例1所述方法制备。

植物材料：脉羊耳兰根状茎和叶采集自中国四川省彭州市，直接使用或者迅速冷冻保存于-70℃。

菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)Top10(购自Invitrogen公司)。

质粒载体：PUC18-T vector(购自TaKaRa宝生物工程有限公司)。

酶及试剂盒：Taq DNA聚合酶、MLV反转录酶、TdT(核苷酸末端转移酶)RNase Inhibitor、RNase A(核苷酸酶)、RNA提取试剂盒、3’/5’RACE试剂盒等均购自TaKaRa宝生物工程有限公司(中国大连)、柱式胶回收试剂盒购自Omiga公司。

培养基：LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，用5N NaOH调pH至7.0，高压灭菌)；LB固体培养基(在液体培养基的基础上加10g/L琼脂粉)。SOB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 0.5g/L，250mmol/L的KCl溶液10ml，用5mmol/L的NaOH调pH至7.0，高压灭菌)，用前加入2mol/L灭菌过的MgCl₂溶液5ml；SOC液体培养基(SOB液体培养基+20ml经抽滤灭菌过的1mol/L的葡萄糖溶液)。

其它化学药品均为分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1脉羊耳兰凝集素N端序列获得(采用Edman降解法)

根据Edman降解法，先将脉羊耳兰凝集素蛋白做SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，再转膜至考马斯亮蓝R-250染色的聚氟(二)乙烯膜(PVDF)上，从膜上将脉羊耳兰凝集素蛋白样品相关的条带切离，再用Hewlett-Packard HP G1000AEdman降解装置和HP 1000HPLC系统(安捷伦公司)测脉羊耳兰凝集素蛋白N端序列。

1.2.2总RNA提取、质量检测及反转录

将脉羊耳兰植株幼嫩部分捣碎，使用RNA提取试剂盒(TaKaRa宝生物工程有限公司)提取总RNA，再在微量离心管中配制如下反应液去除总RNA中的DNA：

将上述微量离心管中的反应液于37℃反应20-30min，加入50μl DEPC-H₂O，加入100μl的苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)，离心，取上层移至另一微量离心管中，加入10μl的3M的醋酸钠溶液(pH5.2)，再加入250μl无水乙醇，于-20℃放置30-60min，离心回收沉淀，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥得到样品RNA。

再用紫外分光光度法检验RNA质量：用蒸馏水对待测RNA样品做一定倍数稀释至稀释后体积可用于测OD值，另取蒸馏水为空白对照，分别在波长为260nm、280nm、310nm处测定RNA样品OD值，根据公式ssRNA＝40×(OD₂₆₀-OD₃₁₀)×稀释倍数计算RNA浓度，根据OD₂₆₀/OD₂₈₀判断所提取RNA的纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀约2.0质量较好，进而确定是否需要重新提取RNA。

再参照TakaRa反转录酶操作方法将总RNA反转录合成cDNA。具体操作步骤如下：

(1)向0.5ml的离心管中加入如下成分：

反转录引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT18-3’

(2)将步骤(1)所述的混合物置于70℃10min，使RNA变性；置冰上2min；离心5秒收集混合物至管底，并加入如下成分：

加入上述成分后，步骤(1)、(2)总体积为24μl。

(3)轻轻振荡，混匀，离心5秒收集化合物至管底，置42℃孵育1min；

(4)加入1μl MLV(反转录酶)，42℃水浴孵育1-2小时；

(5)70℃放置15min从而中止反应；

(6)经离心约5秒收集反应物cDNA置于冰上，可储存在-20℃备用。

1.2.33’RACE PCR反应

1.2.3.1根据纯化所得脉羊耳兰凝集素蛋白N端序列设计引物

根据测得的脉羊耳兰凝集素蛋白的N端29个氨基酸序列DNRLNAGNSLGTGQSLAEGAYIFVIQNDC中划线部分氨基酸设计简并引物，所述简并引物如下：

引物1：5’-GAYAAYMGNYTNAAYGCNGGNAA-3’

引物2：5’-ARGGNGCNTAYATHTTYGT-3’

1.2.3.2第一轮PCR扩增反应

按以下方案配制PCR扩增反应液：

通用引物AP1：5’-GTCAACGATACGCTACGTAACG-3’

按以下条件进行PCR反应：将cDNA产物置90℃，30分钟热变性，再扩增(94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟；重复30次)，再于72℃置10分钟。反应在GeneAmp PCRSystem 2400热循环仪(Promega公司，北京)上进行。

1.2.3.3第二轮PCR反应

第二轮PCR反应以本实施例1.2.3.2中所述的第一轮PCR反应产物为模板，将第一轮PCR产物用蒸馏水稀释10倍，用本实施例1.2.3.1中所述引物2与通用引物AP2代替引物1和通用引物AP1再次按本实施例1.2.3.2条件配制PCR扩增反应液并进行PCR扩增。

通用引物2(AP2)：5’-TACGTAACGGCATGACAGTG-3’

1.2.3.4PCR扩增片段的回收、连接

第二轮PCR反应获得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用柱式胶回收试剂盒进行纯化(Omiga公司，实验步骤按照该公司的柱式胶回收试剂盒说明书进行)，再将纯化所获片段克隆到PUC18-T vector载体(克隆步骤按照TaKaRa宝生物工程有限公司的PUC18-T vector试剂盒说明书进行)。

1.2.3.5感受态细胞的制备

参照CaCl₂法(汪谦，现代医学实验方法，人民卫生出版社，2008，496-497)进行感受态细胞的制备。

1.2.3.6转化

将10μl本实施例1.2.3.4中获得的连接片段与本实施例1.2.3.5制备的50μl感受态细胞混合，放置于冰上30min，然后在42℃水浴中放置90秒，再放置冰上1-2min，继后加入800μlSOC液体培养基，培养1小时；取100μl上述培养液涂LB平板(含Amp)；37℃正向放置1小时以吸取多余的液体，然后倒置培养12小时获转化子。

1.2.3.7阳性克隆鉴定，测序分析

取形态规则的单菌落用菌落PCR法和酶切法鉴定转化子。菌落PCR法和酶切法确认含所需的插入片段后，参照Sambrook等(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis，Molecular Cloning(ALabortory Mannual)(2nd ed).Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989.911)的方法作穿刺培养，37℃培养12小时。

将穿刺培养物送上海基天生物工程技术服务有限公司测序。序列用NCBI(美国国家生物技术信息中心)的Blast进行分析。同时采用DNAMAN5.2.2.0软件和Vector NTI9.0进行序列分析。

1.2.4 5’RACE PCR反应

1.2.4.1引物设计

根据3’RACE PCR反应测出的序列设计5’RACE PCR反应所需引物，引物如下：

引物3：5’-GATAACGACGTTGCGATCTC-3’

引物4：5’-GCTGAGAATGCAGTTGGAGG-3’

引物5：5’-CCTGAAGCCCAAACTGCCTG-3’

1.2.4.2反转录及cDNA纯化

用本实施例1.2.4.1中所述引物3作为反转录引物，按照本实施例1.2.2所述方法进行RNA反转录，反转录完成后再向反应体系中加入2-3ul的RNase A(TaKaRa宝生物工程有限公司)，37℃水浴30min去除RNA后，用胶回收试剂盒(Omiga公司)直接回收得到cDNA产物。

1.2.4.3cDNA的同聚合物加尾

采用TdT(核苷酸末端转移酶)对cDNA进行加尾，TdT加尾反应中使用的cDNA量依据目的mRNA的丰度而定。

加入以下成分并轻轻混匀：

在94℃温育2-3min，冰上冷却1min，经离心5秒后收集样品，放于冰上；再加1μl TdT轻轻混匀，37℃温育30min；最后于70℃10min热失活TdT，经离心5秒收集样品并放于冰上。

1.2.4.4PCR扩增反应

用本实施例1.2.4.1中所述的引物4与通用引物AP1按本实施例1.2.3.2所述条件进行第一轮PCR，反应完成后用蒸馏水将PCR产物稀释10倍；用本实施例1.2.4.1中所述的引物5与通用引物AP2再次按本实施例1.2.3.2所述条件进行PCR扩增。

按照本实施例1.2.3.4所述方法回收纯化PCR产物，克隆到PUC18-T vector载体，按本实施例1.2.3.6所述方法转化至感受态Top10细胞，根据本实施例1.2.3.7所述方法进行阳性克隆鉴定及测序分析。

1.2.5全长cDNA序列的获得

根据本实施例中3’RACE PCR反应和5’RACE PCR反应所得的PCR扩增产物设计全长cDNA扩增引物如下：

正向引物：5’-ATCCCAACAAAGCAGCCAACC-3’

反向引物：5’-AAATTCACACAAGCAAC-3’

再次按本实施例1.2.3.2所述条件进行PCR扩增，按本实施例1.2.3.4所述方法回收纯化PCR产物，克隆到PUC18-T vector载体，按本实施例1.2.3.6所述方法转化至感受态Top10细胞，根据本实施例1.2.3.7所述方法进行阳性克隆鉴定及测序分析，得到脉羊耳兰凝集素基因的全长核苷酸序列(cDNA序列)，如序列表中SEQ ID NO：1所示。

从SEQ ID NO：1可以看出，脉羊耳兰凝集素的基因全长为715bp，包含一个525bp的阅读框(如序列表中SEQ ID NO：2所示)，编码174个氨基酸(如序列表中SEQ ID NO：3所示)，起始密码子位于28-30bp，终止密码子位于550-552bp。起始密码子上游有一个由27bp组成的非编码区；终止密码子下游有一个由155bp组成的非编码区；其后面还有一段真核生物mRNA所特有的poly(A)序列。经预测，该蛋白含29个氨基酸组成的信号肽，成熟肽区域包含第30-139位氨基酸。序列分析结果表明，脉羊耳兰凝集素蛋白与其他兰科凝集素蛋白具有很高的序列同源性，都含有甘露糖结合凝集素家族保守序列QDNVY。可见克隆的是脉羊耳兰凝集素的全长核苷酸序列，且该凝集素属于兰科甘露糖结合凝集素家族。

1.2.6由脉羊耳兰凝集素cDNA序列推导其氨基酸序列

根据脉羊耳兰凝集素全长cDNA序列推导其氨基酸序列，并用DNA Tools 6.0翻译序列得到脉羊耳兰凝集素的成熟蛋白序列。

实施例3：脉羊耳兰凝集素蛋白对农业有害真菌的抑制作用

1.材料和方法

1.1材料

脉羊耳兰凝集素蛋白：采用实施例1所述方法制备。

农业有害真菌：稻瘟病菌P.oryzae Cav.，玉米小斑病菌B.maydis，棉花枯萎菌F.oxysporum vasinfectum，均购自上海富众生物科技发展有限公司。

1.2方法

采用纸片法

1.2.1滤纸片的准备

选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径6.25mm圆片，121℃高压灭菌40分钟，烘干后备用。

1.2.2菌悬液与土豆琼脂培养平板的制备

将高压灭菌后的生理盐水和玻璃珠分别加入三个无菌锥形瓶内，然后取活化的稻瘟病菌P.oryzae Cav.斜面菌种、玉米小斑病菌B.maydis斜面菌种、棉花枯萎菌F.oxysporumvasinfectum斜面菌种分别用接种环挑取菌苔，并分别加入三个无菌锥形瓶内振荡混匀，稀释制成浓度约10⁵cfu/L～10⁶cfu/L的三种菌悬液。将高温灭菌的土豆琼脂培养基冷却至60℃分别倒在不同的平板上，以上操作于超净工作台完成。

1.2.3样品制备

用无菌生理盐水将脉羊耳兰凝集素蛋白配制成浓度为0mg/ml，0.125mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml的样品液。操作于超净工作台完成。

1.2.4涂布平板及加样

用无菌移液器分别吸取三种菌悬液(约400μl)均匀涂布于本实施例1.2.2步骤制备的土豆琼脂培养平板上。用无菌镊子在含有三种不同菌悬液的平板上放置无菌滤纸片，每个平板4片，再向每片滤纸片上加等量(10μl)不同浓度的脉羊耳兰凝集素蛋白样品，盖上平皿盖。以上操作于超净工作台完成。放置于28℃培养72小时，观察结果。

实验结果如图5所示，实验结果表明，脉羊耳兰凝集素蛋白对菌稻瘟病菌P.oryzae Cav.，玉米小斑病菌B.maydis，棉花枯萎菌F.oxysporum vasinfectum均有明显的抑制作用，且随样品浓度升高抑制效果增强。脉羊耳兰凝集素蛋白对菌稻瘟病菌P.oryzae Cav.的最低抑制浓度为0.5mg/ml，脉羊耳兰凝集素蛋白对玉米小斑病菌B.maydis的最低抑制浓度为0.25mg/ml，脉羊耳兰凝集素蛋白对棉花枯萎菌F.oxysporum vasinfectum的最低抑制浓度为0.125mg/ml。

Claims

1.一种脉羊耳兰凝集素基因，其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

2.一种脉羊耳兰凝集素蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

3.权利要求2所述脉羊耳兰凝集素蛋白在抗农业有害真菌中的应用，所述农业有害真菌为稻瘟病菌Piricularia oryzae Cav.、玉米小斑病菌Bipolaris maydis、棉花枯萎菌 Fusarium oxysporum vasinfectum中的一种。