CN101429515B

CN101429515B - 拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因

Info

Publication number: CN101429515B
Application number: CN2008102438994A
Authority: CN
Inventors: 李顺鹏; 何健; 王保战; 郭鹏; 李恋; 杭宝剑
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2028-12-17
Also published as: CN101429515A

Abstract

本发明拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因，属于应用环境微生物领域。本发明提供了菊酯类杀虫剂水解酶基因及其所推导的菊酯水解酶蛋白质。该基因全长为843bp，G+C含量为66.55％，编码280个氨基酸。利用该基因构建的工程菌株能高效表达菊酯水解酶，生产的酶制剂可用于土壤、蔬菜、茶叶、水果、中草药、烟草等的菊酯残留去除，及农产品深加工中降解菊酯农药残留，提高产品品质及增加附加值。并可进一步用于构建转基因作物彻底解决植株中农药残留问题，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。

Description

拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因

技术领域

本发明涉及拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因(亦称降解基因)，属于应用环境微生物领域，用于农作物及土壤中菊酯类杀虫剂残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。

背景技术

农药的使用虽然提高了农业的生产效率及作物产量，但同时带来严重的环境问题，造成生态失衡农产品品质下降，并直接影响人民的身体健康。拟除虫菊酯杀虫剂是1974年M.Eliiott等人发现的一种高效广谱杀虫剂，目前，拟除虫菊酯类杀虫剂的年销售额为13-14亿美元，占世界农药销售额的20％，随着世界各国对高毒的有机磷、有机氯杀虫剂的限制使用，拟除虫菊酯的使用量将进一步增加。虽然菊酯类杀虫剂属于低毒类杀虫剂，但是它能损害人和动物中枢神经系统、具有致癌作用，尤其对蜜蜂、鱼类等具有强烈的毒害作用。随着近些年来环境保护的呼声越来越高，农药使用带来的环境问题日益引起人们的重视。有机农业、绿色农业的兴起就是在这种背景下发生的。但就目前的形势而言，人类仍面临饥饿、贫穷的困扰，全面实行有机农业、绿色农业生产，禁止农药的使用是不现实的。为了达到高产高效的目标，农药的地位在短期内是无法取代的。为了既能充分发挥农药高效保护效果，又能够解决农药残留，国内外进行了多方面的研究，提出了化学方法、物理方法、生物学方法等多种解决途径。在这些方法中生物学方法具有无毒、无残留、无二次污染的优势。微生物在农药残留的生物学解决途径中有着独特的作用。利用从微生物中提取的降解酶系来消除农药残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。

将农药残留降解基因通过基因工程技术转移到作物中构建转基因作物，可以从根本上防止农药在作物体内积累，消除农药残留的危害。国外已有转抗除草剂基因水稻的报道，菊酯降解基因在该领域有巨大的应用潜力。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因(亦称降解基因)，用于农作物及土壤中菊酯类杀虫剂残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。

技术方案

菊酯类杀虫剂水解酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为843bp，G+C含量为66.55％，编码280个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

菊酯类杀虫剂水解酶基因片段与酶切好的PET-29a(+)进行酶连获得含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒。

酶连好的含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。

上述菊酯类杀虫剂水解酶基因可以在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面得到应用。其所涉及的菊酯水解酶可以在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面应用。

有益效果

1.用鸟枪法成功的从JQ1-11(Sphingomonas sp.JQ1-11，其GenBank注册号为DQ132883)中克隆出菊酯降解酶基因。

2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为843bp，G+C含量为66.55％，编码280个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含NdeI和XhoI酶切位点的完整的菊酯水解酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体PET-29a(+)(购自Novegen公司)的NdeI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。

4.本发明对菊酯水解酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的降解甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯。对100ppm上述的各类菊酯降解效果均大于93％。

5.利用该基因构建的工程菌株能高效表达菊酯水解酶(活性水解酶蛋白的含量占细胞总蛋白含量的35％)，生产的酶制剂可用于土壤、蔬菜、茶叶、水果、中草药、烟草等的农药残留去除，及农产品深加工中降解农药残留，提高产品品质及增加附加值，它比其它的降解方法更加高效、经济、安全。并可进一步用于构建转基因作物彻底解决植株中农药残留问题，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复菊酯污染的水体等环境。

附图说明

图1菊酯水解酶基因克隆的策略图

图2菊酯水解酶基因的DNA序列

图3推测的菊酯水解酶氨基酸序列

图4菊酯水解酶基因在BL21(PET-29a(+))中高效表达实验方案图

具体实施方式

1.菊酯水解酶基因的克隆

1.1Sphingomonas sp.JQ1-11(GenBank注册号为DQ132883)总DNA的提取

采用CTAB法提取高纯度、大分子量的JQ1-11总DNA，溶于TE(PH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

1.2PUC118(BamHI)购买于宝生物工程(大连)有限公司。

1.3总DNA的酶切Sphingomonas sp.JQ1-11总DNA采用Sau3AI部分酶切。

1.4DNA的回收

酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygen biosciences(China)回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris·Cl(PH8.0)中，置于-20℃保藏。

1.5酶连建立如下反应体系：

PUC118(BamHI) 0.1μg

总DNA片段 0.1μg

10×连接酶缓冲液 1μl

T4DNA连接酶 0.5μl

加蒸水至 10μl

16℃温育12小时

1.6制备大肠杆菌DH5a高效感受态细胞，具体方法参照J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

1.7转化取10μl酶连产物转化200μl感受态细胞，具体方法参照J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。涂含有甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯)，农药为甲醇或者丙酮溶解成的10,000mg/L的母液)200mg/L，Amp100mg/L的LB平板，培养24小时候挑取有透明水解圈的转化子，即是含菊酯水解酶基因的阳性转化子。

1.8基因核苷酸序列测定宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定，菊酯类杀虫剂水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，根据菊酯类杀虫剂水解酶基因核苷酸序列所推到的280个氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.菊酯水解酶基因在BL21(PET-29a(+))中的高效表达

以左端：5’-AGTCATCTCGAGCGGTAGATCAGCTCGGTCGGCT-3’和右端：

5’-AGTCCATATGACCGTCACCGATATCATCCTG-3’为引物，用PCR从Sphingomonas sp.JQ1-11中扩增菊酯水解酶基因片段.

扩增体系：

LATaq(5U/μl) 0.5μl

10×LA PCR BufferII(Mg²⁺Plus) 5μl

dNTP Mixture(各2.5mM) 8μl

模板DNA 10ng

引物1(20μM) 1μl

引物2(20μM) 1μl

灭菌蒸馏水 up to 50μl

PCR扩增程序：

a.95℃变性3min

b.95℃变性1.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.0min，进行30个循环

c.72℃延伸10min，冷却到室温

PCR产物用NdeI和XhoI双酶切

酶切体系：NdeI 1μl

XhoI 1μl

DNA ≤1μg

灭菌的蒸馏水up to 20μl

在37℃水浴中，反应3小时以上

酶切产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

PET-29a(+)用NdeI和XhoI双酶切(参考2.2)。

2.3中的回收片段和2.4中酶切好的PET-29a(+)进行酶连(参考1.5)。

酶连好的含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。涂含有甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、功夫菊酯)200mg/L，Kan 50mg/L，IPTG 24mg/L的平板。

挑取有透明水解圈的阳性转化子。

验证阳性转化子表达的酶对菊酯类农药的降解功能

阳性转化子在LB培养基中培养至0D₆₀₀0.6到0.8之间，加IPTG至浓度1mM，30℃培养4个小时。100ml菌液离心，用10ml(50mM，pH 7.0)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science，UH-650B ultrasonic processor，30％intensity)5分钟。取200μl粗酶液加到3ml含100ppm甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯)的(50mM，pH 7.0)PBS缓冲液中，在37℃的水浴5个小时。

用6ml二氯甲烷分两次充分提取3ml的反应液，用气相色谱检测降解效果，检测条件如下：ECD检测器，SPB-5(30m×250μm×0.25μm)；进样口温度，260℃；柱温，240℃；检测器温度，300℃；气体流速，N₂40mL/min。甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯降解效果均在93％以上(如下表)。

农药名称	降解率
农药名称	降解率	甲氰菊酯	100.0％
氯氰菊酯	99.8％	甲氰菊酯	100.0％
氯氰菊酯	99.8％	高效氯氰菊酯	99.5％
功夫菊酯	100.0％	高效氯氰菊酯	99.5％
功夫菊酯	100.0％	溴氰菊酯	96.0％
氰戊菊酯	93.0％	溴氰菊酯	96.0％

序列表

<110>南京农业大学

<120>拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因

<130>说明书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>843

<212>DNA

<213>JQ1-11菌株(Sphingomonas sp.)

<220>

<221>菊酯水解酶基因

<222>(1)..(843)

<223>

<400>1

atgaccgtca ccgatatcat cctgatccac ggcgccttga accgcggcgc ctgctatgac 60

gcggtcgtcc cgcttctcga agcgcgcggc taccgcgtcc atgcgcccga cctgaccggc 120

catacgcccg gcgatggcgg ccatttgtcg gtcgtcgaca tggagcatta tacccgccca 180

gtcgctgaca tcctggcacg ggccgagggg cagtcgatcc ttctggggca cagcttgggc 240

ggtgcatcca tctcgtggct ggcgcagcac catcccgaca aggtggccgg gctgatctac 300

ctgaccgcgg tcctcaccgc gcccggtgta acgccggaaa ccttcgtcct gcccggcgag 360

cccaaccggg gcacgccgca cgcgctggac ctgatccagc cggtcgacga gggacgtggg 420

ctacaggcgg atttctcgcg actggaacgg ctccgcgaag ttttcatggg cgattatccc 480

ggcgagggaa tgccgcctgc cgaacatttc atccagaccc agtcgaccgt gccctttggc 540

acgcccaatc cgatggaggg gcgcgcgctg gaaatcccac gcctctatat cgaggcgctg 600

gacgatgtcg tgcttccgat cgccgtgcag cgtcagatgc agaaggagtt ccccggtccg 660

gtcgcggtcg tgtcgctgcc ggccagccat gcgccctatt actcgatgcc cgaacggctg 720

gccgaggcga tcgccgattt cgccgatgcc ccggccgagt atcgccagac ggcgacgaag 780

gctgggcctg atcgaccagc tggagcggac gggggtcgag ccgaccgagc tgatctaccg 840

tga 843

<210>2

<211>280

<212>PRT

<213>JQ1-11菌株(Sphingomonas sp.)

<220>

<221>菊酯类杀虫剂水解酶基因所推导的蛋白质

<222>(1)..(280)

<223>

<400>2

Met Thr Val Thr Asp Ile Ile Leu Ile His Gly Ala Leu Asn Arg Gly

1 5 10 15

Ala Cys Tyr Asp Ala Val Val Pro Leu Leu Glu Ala Arg Gly Tyr Arg

20 25 30

Val His Ala Pro Asp Leu Thr Gly His Thr Pro Gly Asp Gly Gly His

35 40 45

Leu Ser Val Val Asp Met Glu His Tyr Thr Arg Pro Val Ala Asp Ile

50 55 60

Leu Ala Arg Ala Glu Gly Gln Ser Ile Leu Leu Gly His Ser Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ser Ile Ser Trp Leu Ala Gln His His Pro Asp Lys Val Ala

85 90 95

Gly Leu Ile Tyr Leu Thr Ala Val Leu Thr Ala Pro Gly Val Thr Pro

100 105 110

Glu Thr Phe Val Leu Pro Gly Glu Pro Asn Arg Gly Thr Pro His Ala

115 120 125

Leu Asp Leu Ile Gln Pro Val Asp Glu Gly Arg Gly Leu Gln Ala Asp

130 135 140

Phe Ser Arg Leu Glu Arg Leu Arg Glu Val Phe Met Gly Asp Tyr Pro

145 150 155 160

Gly Glu Gly Met Pro Pro Ala Glu His Phe Ile Gln Thr Gln Ser Thr

165 170 175

Val Pro Phe Gly Thr Pro Asn Pro Met Glu Gly Arg Ala Leu Glu Ile

180 185 190

Pro Arg Leu Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Asp Val Val Leu Pro Ile Ala

195 200 205

Val Gln Arg Gln Met Gln Lys Glu Phe Pro Gly Pro Val Ala Val Val

210 215 220

Ser Leu Pro Ala Ser His Ala Pro Tyr Tyr Ser Met Pro Glu Arg Leu

225 230 235 240

Ala Glu Ala Ile Ala Asp Phe Ala Asp Ala Pro Ala Glu Tyr Arg Gln

245 250 255

Thr Ala Thr Lys Ala Gly Pro Asp Arg Pro Ala Gly Ala Asp Gly Gly

260 265 270

Arg Ala Asp Arg Ala Asp Leu Pro

275 280

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>从JQ1-11扩增菊酯水解酶基因引物左端

<222>(1)..(34)

<223>

<400>3

agtcatctcg agcggtagat cagctcggtc ggct 34

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>从JQ1-11扩增菊酯水解酶基因引物右端

<222>(1)..(31)

<223>

<400>4

agtccatatg accgtcaccg atatcatcct g 31

Claims

1.菊酯类杀虫剂水解酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的菊酯类杀虫剂水解酶基因核苷酸序列所编码的菊酯水解酶蛋白质，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

3.含权利要求1所述菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒。

4.含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。

5.权利要求1所述菊酯类杀虫剂水解酶基因在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面的基因工程应用。

6.权利要求2所述菊酯水解酶蛋白质在农作物、农产品、土壤、水体的菊酯残留去除方面的应用。