CN116723765A - 用于可扩展大规模生产微细胞的生物处理系统和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了具有限定的发酵参数的用于增强微细胞生产的受控制的生物处理系统、和所述生物处理系统的方法以及使用生物反应器或发酵罐从所述生物处理系统生产微细胞的方法。

Description

用于可扩展大规模生产微细胞的生物处理系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月11日提交的美国临时申请号63/124,559的优先权权益，其据此以全文引用的方式并入。

技术领域

本公开总体上涉及生物处理系统和方法，并且更具体地，涉及用于从生物反应器系统生产微细胞的生物处理系统和方法。

背景技术

当从生物反应器生产生物材料时为了实现可靠、稳健和经济的制造程序，由生物过程系统生产的高质量和大量的生物材料是至关重要的。

提高质量和维持产物可比性，同时最大限度地提高大规模生产的生产率，给生物过程开发带来了挑战。培养基组成会影响细胞生长、生产率和用于大规模生产的感兴趣细胞的翻译后修饰。

然而，尽管微细胞正在被开发为用于人类治疗和诊断、疫苗、化学药剂、农用化合物和生物活性剂的重要递送系统，但是就微细胞生产而言，没有太多关于培养基对细胞表现和产物质量的影响的研究。

因此，需要引入一种生物过程来优化以实时和大规模生产实现微细胞产物的所需结果的生物过程。结果可以是用于微细胞生产的更安全、更节能和环境可持续的制造生物过程。

发明内容

本公开提供了一种用于微细胞生产的生物处理系统，所述生物处理系统包括：(a)至少一个生物反应器；(b)用于微细胞生产的基本培养基；和(c)至少一种能够产生无染色体微细胞群的细菌细胞株。在实施方案中，所述生物反应器被布置用于维持被配置成提供所述无染色体微细胞群的连续生物过程。在实施方案中，所述生物反应器设置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长。在实施方案中，所述生物处理系统中的微细胞生产产率是不受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率的至少1.1倍。在实施方案中，所述进料速率为0至约10mL/min/L。在实施方案中，所述温度为约10℃至约70℃。在实施方案中，所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。在实施方案中，所述溶解氧为0至100％。在实施方案中，所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。在实施方案中，所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。在实施方案中，所述氧气为0至100％。在实施方案中，所述pH为约3至约10。在实施方案中，所述接种物为约0.1％至约20％。在实施方案中，所述发酵时长为约12小时至约200小时。在实施方案中，所述微细胞的长度为约150nm至约950nm。在实施方案中，所述碳源是甘油或葡萄糖。在实施方案中，所述不受控制的生物处理系统是培养箱系统或摇瓶系统。在实施方案中，在所述生物处理之后的微细胞比率是生物反应器中总细胞的至少40％。

本公开教导由本文所教导的生物处理系统生产的微细胞能够包封农用药剂。在实施方案中，所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。在实施方案中，所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。在实施方案中，所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。在实施方案中，核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。在实施方案中，精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

本公开提供生物处理系统，所述生物处理系统是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理系统。在实施方案中，部分地收获所述生产的微细胞并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。在实施方案中，从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

本公开提供了一种生物处理方法，所述方法包括以下步骤：(a)将至少一种细菌细胞株引入包含基本培养基的生物反应器环境中；(b)在所述生物反应器环境中培养来自(a)的所述细菌细胞株以生产无染色体微细胞群，其中所述细菌细胞株是生产微细胞的细菌细胞株，其中所述无染色体微细胞群从步骤(b)生产，并且其中所述生物反应器环境配置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧、pH、接种物和发酵时长，如表1中所列。在实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)从步骤(b)收获包含所述细菌细胞和新生产的微细胞群的一个批次的细胞；(d)纯化所述批次的细胞；(e)从所述批次的细胞中过滤或分选出所述无染色体微细胞群；和(f)浓缩所述微细胞。在实施方案中，所述纯化是通过盘式叠层离心(disc stack centrifugation)进行的。在实施方案中，所述浓缩的微细胞以液体形式或粉末形式储存。在实施方案中，所述粉末形式通过冷冻干燥、真空干燥或加热干燥所述浓缩的微细胞来制备。在实施方案中，所述生物处理是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理。在实施方案中，部分地收获所述生产的微细胞，并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。在实施方案中，从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

本公开提供了通过本文所述的方法生产的微细胞。在一些实施方案中，在所述生物处理环境中生产的所述微细胞是在不受控制的生物处理环境中生产的微细胞的至少1.1倍。

附图说明

图1A-1D显示了在第1小时、第2小时、第3小时、第16小时在使用摇床的不受控制的生物过程系统中从P6*细菌株进行微细胞生产的时间进程。所述株在具有溶源性肉汤(LB)、极品肉汤(Terrific Broth，TB)或类似复合培养基的摇瓶中于37℃下生长。在约0.5um的第一个峰捕获微细胞，并且在>1um的第二个峰捕获亲本细菌细胞。每个图(图1A-1D)代表来自n＝4次重复运行的数据。在第1小时(图1A)、第2小时(图1B)、第3小时(图1C)和第16小时(图1D)测量微细胞生产。

图1E展示了图1A-1D中所显示的实验数据的实际数字，包括在不同的孵育时间(1小时；2小时；3小时；和16小时)的微细胞尺寸范围(nm)、总微细胞、平均微细胞长度(nm)、亲本细菌尺寸范围(nm)、总细菌细胞、平均细菌长度(nm)、总对象和微细胞比率(％)。

图2A-2D示出了使用生物反应器/发酵罐在受控制的生物过程系统中从P6*细菌株生产微细胞的四次单独运行。所述株在具有限定的基本培养基的生物反应器中于37℃下生长。在约0.5um的第一个峰捕获微细胞，并且在>1um的第二个峰捕获亲本细菌细胞。每个图(图2A-2D)代表来自n＝4次重复运行的数据。在完成四次36小时发酵的单独发酵运行之后收集每个数据。从不同天数的四次独立受控制的生物过程运行中测量微细胞生产；运行1(图2A)、运行2(图2B)、运行3(图2C)和运行4(图2D)。

图2E展示了图2A-2D所显示的实验数据的实际数字，包括来自四次36小时发酵的单独运行的微细胞尺寸范围(nm)、总微细胞、平均微细胞长度(nm)、亲本细菌尺寸范围(nm)、总细菌细胞、平均细菌长度(nm)、总对象和微细胞比率(％)。

图3示出了呈现使用生物反应器在受控制的生物处理系统的各种参数组合中保持的增强的微细胞生产的表格。对于组合测试的参数是氧气传输(如通过摄氧速率OUR测量的)、气流(VVM)和氧气(O₂)的存在。

图4A-4C示出了各种参数对微细胞生产的影响。氧气传输(如通过OUR测量的)与微细胞生产产率的关系(图4A)、气流(VVM)与微细胞生产产率的关系(图4B)和氧气(O₂)供应与微细胞生产产率的关系(图4C)。

图5示出了温度对从P826株进行微细胞生产的影响。

图6A-6B示出了在两种生物处理系统(不受控制的与受控制的)之间从P826株进行微细胞生产的比较。不受控制的生物过程系统在无法不断地控制给定参数的摇床中进行(图6A)。自动地控制受控制的生物过程系统以维持给定参数(pH为6.7，溶解氧(DO)为约30％，并且温度为25℃)。

图6C-6D示出了除了温度设定为35℃之外使用图6A-6B的相同设置从P826株进行微细胞生产的比较。

图7A-7D示出了在限定的参数范围内在受控制的生物处理系统中从还表达生物分子(RNA/蛋白质/代谢物)的生产微细胞的细菌株进行的微细胞产生。测试了不同的细菌细胞系的微细胞生产；生产微细胞的P8-T7细胞株(图7A)；携带表达荧光dsRNA发夹的构建体的源自BL21-AI的R1菌株(图7B)；携带表达dsRNA的构建体以控制昆虫的生产微细胞的R1株(图7C)；携带表达dsRNA的构建体以控制真菌的R1株(图7D)。

图7E示出了在受控制的生物处理系统中但在本公开的限定参数范围之外从携带表达dsRNA的构建体以控制昆虫的生产微细胞的细菌株(R1)进行的微细胞生产。

具体实施方式

为了维持高质量和大量的微细胞生产并最大限度地提高生产率，需要一种新的生物处理系统来确保用于微细胞生产的安全、可扩展、节能、环境可持续和具有成本效益的制造生物过程。

本公开涉及使用生物反应器/发酵罐系统进行的受控制的微细胞生产。本公开还涉及一种用于优化生物过程以在大规模生产中实现微细胞产物的所需结果的方法。

定义

虽然相信本领域的普通技术人员很好地理解以下术语，但是阐述了以下定义以方便对本公开的主题进行说明。

术语“一个”或“一种”是指一个/一种或多个/多种该实体，即可以指复数指代物。因此，术语“一个”或“一种”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可互换使用。此外，提及被不定冠词“一个”或“一种”修饰的“一个/一种元件”并不排除存在多于一个/一种元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种且只有一个/一种元件。

如本文所用，术语“细胞生物体”、“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”应广义理解。这些术语可互换使用，并且包括但不限于两个原核生物域(细菌(Bacteria)和古细菌(Archaea))以及某些真核真菌和原生生物。

术语“原核生物”是本领域公知的并且是指不含有细胞核或其他细胞器的细胞。原核生物通常被分类为两个域之一，即细菌和古细菌。在古细菌域和细菌域的生物体之间的明确差异是基于16S核糖体RNA中核苷酸碱基序列的根本差异。

术语“古细菌”是指疵壁菌门(division Mendosicutes)的生物体分类，通常在不寻常的环境中发现，并且通过几个标准与其余原核生物区别开来，所述标准包括核糖体蛋白的数量和细胞壁中缺少胞壁酸。在ssrRNA分析的基础上，古细菌由两个系统发育上不同的组组成：泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)。根据其生理学，古细菌可以被分为三种类型：产甲烷菌(产生甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(生活在非常高浓度的盐(NaCl)中的原核生物；和极端(超)嗜热菌(生活在非常高温度下的原核生物)。除了将它们与细菌区别开来的统一古细菌特征(即，细胞壁中没有胞壁质、酯连接的膜脂等)，这些原核生物表现出独特的结构或生化属性，使它们适应其特定的栖息地。泉古菌门主要由超嗜热性硫依赖性原核生物组成，并且广古菌门含有产甲烷菌和极端嗜盐菌。

“细菌”或“真细菌”是指原核生物体的一个域。细菌包括至少11个不同的组，如下所示：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中有两个主要的亚门：(1)高G+C组(放线菌(Actinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、微球菌属(Micrococcus)等)，(2)低G+C组(芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、支原体(Mycoplasmas))；(2)变形菌(Proteobacteria)，例如，紫色光合+非光合革兰氏阴性细菌(包括最“常见”的革兰氏阴性细菌)；(3)蓝藻(Cyanobacteria)，例如，产氧性光养生物；(4)螺旋体(Spirochetes)及相关物种；(5)浮霉状菌属(Planctomyces)；(6)拟杆菌属(Bacteroides)、黄杆菌属(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也称厌氧光养生物)；(10)抗辐射微球菌及其亲属；(11)栖热袍菌属(Thermotoga)和嗜热热袍菌(Thermosipho thermophiles)。

“真核生物”是其细胞含有细胞核和其他包裹在细胞膜内的细胞器的任何生物体。真核生物属于分类单元真核域或真核生物。将真核细胞与原核细胞(上述细菌和古细菌)区分开来的决定性特征是它们具有膜结合的细胞器，尤其是含有遗传物质并且被核膜包裹的细胞核。

术语“遗传修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组株”在本文中可互换使用，并且是指已经通过本公开的克隆和转化方法进行遗传修饰的宿主细胞。因此，所述术语包括已经被遗传改变、修饰或工程化使得如与其来源的自然存在的生物体相比其表现出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的宿主细胞(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞、CHO、人类细胞等)。应当理解，在一些实施方案中，所述术语不仅指所讨论的特定重组宿主细胞，而且还指这种宿主细胞的后代或潜在后代。

术语“野生型微生物”或“野生型宿主细胞”描述自然界中存在的细胞，即尚未经遗传修饰的细胞。在本公开中，“野生型株”或“野生株”或“野生型细胞系”是指可以生产微细胞的细胞株/系。在一些实施方案中，野生型细菌株和/或细胞系诸如大肠埃希氏菌(E.coli)株p678-54和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)株CU403可以使微型细胞缺乏DNA。用于生产此类微细胞的方法是本领域已知的。参见例如，Adler等人,1967,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57:321-326；Inselburg J,1970J.Bacteriol.102(3):642-647；Frazer 1975,Curr.Topics Microbiol.Immunol.69:1-84；Reeve等人1973,J.Bacteriol.114(2):860-873；以及Mendelson等人1974J.Bacteriol.117(3):1312-1319。

术语“基因工程的”可以指对宿主细胞基因组的任何操作(例如通过核酸的插入、缺失、突变或替换)。

如本文所用，术语“基因工程”是指对一个或多个细胞进行遗传操作的技术，其中所述一个或多个细胞的基因组已被修饰、插入、缺失、突变或替换了至少一个DNA序列。候选DNA序列包括但不限于非自然存在的基因、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达的”)的DNA序列、以及人们希望引入一个或多个细胞中的其他基因或DNA序列。

如本文所用，“基因编辑”或“基因组编辑”是一种技术，其中可以使用靶向核酸内切酶和单链核酸来编辑(例如，修饰)受试者体内的一个或多个细胞中存在的内源性染色体序列。基因组编辑方法可以导致在基因组内的特定区域插入核酸序列、从基因组中切除特定序列和/或用新的核酸序列替换特定基因组序列。在某些实施方案中，基因组编辑技术可以导致基因表达的抑制。例如但不限于，可以在融合基因的染色体断点处插入核酸序列。用于所公开方法的基因组编辑技术的非限制性实例是CRISPR系统，例如CRISPR/Cas 9系统。此类基因组编辑技术的非限制性实例在PCT申请号WO 2014/093701和WO 2014/165825中有公开，所述申请的内容据此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，基因组编辑技术可以包括使用与基因组内的特定序列(即靶)互补的一种或多种指导RNA(gRNA)(包括前间区序列邻近基序(PAM))以指导核酸酶(例如内切核酸酶)到特定的基因组序列。在某些实施方案中，基因组编辑技术可以包括使用与邻近靶和/或重叠靶的序列互补的一种或多种指导RNA(gRNA)以指导一种或多种核酸酶。

术语“对照”或“对照宿主细胞”是指用于确定遗传修饰或实验处理的效果的适当的比较宿主细胞。在一些实施方案中，对照宿主细胞是野生型细胞。在其他实施方案中，除了区分处理宿主细胞的遗传修饰之外，对照宿主细胞在遗传上与经遗传修饰的宿主细胞相同。

如本文所用，术语“等位基因”意指基因的一种或多种替代形式中的任何一种，所有这些等位基因都与至少一种性状或特征相关。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应基因座。

如本文所用，术语“基因座”(复数基因座)意指染色体上其中例如发现基因或遗传标记的一个或多个特定位置或位点。

如本文所用，术语“遗传连锁”是指两个或更多个性状在育种期间以高比率共同遗传，使得它们难以通过杂交分离。

如本文所用，“重组”或“重组事件”是指染色体交换或独立分配。

如本文所用，术语“表型”是指单个细胞、细胞培养物、生物体或生物体群的可观察特征，所述特征是由个体的基因构成(即，基因型)和环境引起的。

如本文所用，术语“嵌合”或“重组”在描述核酸序列或蛋白质序列时是指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单一的单个大分子或者重排至少一个天然核酸或蛋白质序列的一个或多个元件的核酸或蛋白质序列。例如，术语“重组”可以是指例如通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的核酸区段来人工组合两个原本分离的序列区段。

如本文所用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是已知在自然界中不存在或并非自然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其他自然存在的核苷酸序列相比时，这种合成核苷酸序列将包含至少一个核苷酸差异。

如本文所用，“合成氨基酸序列”或“合成肽”或“合成蛋白质”是已知在自然界中不存在或并非自然存在的氨基酸序列。通常，当与任何其他自然存在的蛋白质序列相比时，这种合成蛋白质序列将包含至少一个氨基酸差异。

如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。该术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。其还包括经修饰的核酸，诸如甲基化和/或封端的核酸、含有经修饰的碱基、主链修饰等的核酸。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。

如本文所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的任何DNA区段。因此，基因包括但不限于编码序列和/或它们表达所必需的调控序列。基因还可以包括例如形成其他蛋白质的识别序列的非表达DNA区段。基因可以从多种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计成具有所需参数的序列。

如本文所用，术语“同源的”或“同源物”或“直向同系物”是本领域已知的并且是指共享共同祖先或家族成员并且基于序列同一性程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源的”、“基本上相似的”和“基本上对应的”在本文中可互换使用。它们是指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指本公开的核酸片段的修饰(诸如一个或多个核苷酸的缺失或插入)，其相对于初始的未修饰的片段基本上不改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员将理解的那样，应当理解，本公开不仅仅涵盖具体的示例性序列。这些术语描述了在一个物种、亚种、品种、栽培变种或品系中发现的基因与另一个物种、亚种、品种、栽培变种或品系中的对应或等价基因之间的关系。出于本公开的目的，比较了同源序列。“同源序列”或“同源物”或“直向同系物”被认为、相信或已知在功能上相关。功能关系可以以多种方式中的任何一种表示，包括但不限于：(a)序列同一性程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，(a)和(b)都被指出。可以使用本领域容易获得的软件程序来确定同源性，诸如在CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,编辑,1987)增刊30,第7.718节,表7.71中所讨论的那些。用于比较序列的局部比对算法的实例是用于结合序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用的NCBI基本局部比对搜索工具(Altschul等人1990J.Mol.Biol.215:403-10)，其可获自几个来源，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,Md.)和互联网。其可以通过国家医学图书馆(NLM)的万维网URL在互联网上访问。NLM网站上的BLAST教程提供了有关如何使用此程序确定序列同一性的描述。用于序列全局比较的数学算法的另一个实例是Clustal W and ClustalX(Larkin等人2007Bioinformatics,23,2947-294,Clustal W和Clustal X 2.0版)以及Clustal omega。除非另有说明，提及本文所用的序列同一性是指NCBI基本局部比对搜索工具/>

如本文所用，术语“内源性”或“内源性基因”是指自然存在的基因，其位于宿主细胞基因组内自然存在的位置。在本公开的上下文中，将异源性启动子与内源性基因可操作地连接意味着在现有基因之前、在该基因自然存在的位置处遗传插入异源性启动子序列。如本文所述的内源性基因可以包括已经根据本公开的任何方法突变的自然存在的基因的等位基因。

如本文所用，术语“外源的”可与术语“异源的”互换使用，并且是指来自与其天然来源不同的一些来源的物质。例如，术语“外源蛋白质”或“外源基因”是指来自非天然来源或位置并且已经被人工提供给生物系统的蛋白质或基因。

如本文所用，术语“核苷酸改变”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入，如本领域所熟知的。例如，突变含有产生沉默取代、添加或缺失的改变，但不会改变编码蛋白质的特性或活性或制得蛋白质的方式。

如本文所用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入，如本领域所熟知的。

如本文所用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”意指具有此类序列的最小尺寸特征的部分，或全长分子的任何较大片段，直到并包括全长分子。本公开的多核苷酸片段可以编码遗传调控元件的酶促活性部分。遗传调控元件的酶促活性部分可以通过分离包含遗传调控元件的本公开多核苷酸之一的一部分并且如本文所述评估活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等，直到全长多肽。待使用的部分的长度将取决于特定的应用。用作杂交探针的核酸部分可以短至12个核苷酸；在一些实施方案中，其为20个核苷酸。用作表位的多肽部分可以短至4个氨基酸。执行全长多肽功能的多肽部分通常长于4个氨基酸。

变体多核苷酸还涵盖源自诱变和重组基因程序(诸如DNA改组)的序列。用于这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如，Stemmer(1994)PNAS 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等人(1997)PNAS 94:4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

对于本文所公开的多核苷酸的PCR扩增，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应以从提取自任何感兴趣的生物体的cDNA或基因组DNA扩增对应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常是本领域已知的并且在以下文献中有公开：Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Plainview,New York)。还参见Innis等人,编辑(1990)PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Academic Press,New York)；Innis和Gelfand,编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)；以及Innis和Gelfand,编辑(1999)PCRMethods Manual(Academic Press,New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

如本文所用的术语“引物”是指如下的寡核苷酸，其能够与扩增靶退火从而允许DNA聚合酶附着，从而当置于诱导引物延伸产物合成的条件下(即，在核苷酸和用于聚合的试剂(诸如DNA聚合酶)的存在下以及在合适的温度和pH下)时作为DNA合成的起始点。(扩增)引物优选地是单链的以实现最大扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在用于聚合的试剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括引物的温度和组成(A/T与G/C含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，如在DNA扩增领域中(诸如在PCR扩增中)常用的。

如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在一些实施方案中，启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后一种元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的先天元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以完全源自天然基因，或由来源于自然界中存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员将理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或响应于不同的环境条件的表达。应进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，所以一些变异的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所用，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。此外，“构建体”、“载体”和“质粒”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段的人工组合，例如，在自然界中不一起存在的调控序列和编码序列。例如，嵌合构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源但以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可以它自己单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖包含本公开的任何分离的核酸片段的宿主细胞而必须存在于载体上的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(Jones等人,(1985)EMBO J.4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol.Gen.Genetics 218:78-86)，并且因此必须筛选多个事件以便获得显示所需表达水平和模式的系。这种筛选可以通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成。载体可以是自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是不会自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一条链内的DNA和RNA两者构成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等。如本文所用，术语“表达”是指功能性终产物例如mRNA或蛋白质(前体或成熟的)的产生。

“可操作地连接”在上下文中意指根据本公开的启动子多核苷酸与另外的寡核苷酸或多核苷酸的顺序排列，导致所述另外的多核苷酸的转录。

如本文所用，术语“显示”是指感兴趣的多肽暴露在微细胞的外表面上。作为非限制性实例，所显示的多肽可以是蛋白质或蛋白质结构域，其在微细胞膜上表达或与微细胞膜结合使得细胞外结构域或感兴趣的结构域暴露在微细胞膜的外表面上(在微细胞表面上表达和显示，或者在亲本细胞中表达以在分离/出芽的微细胞的表面上显示)。在所有情况下，“显示的”蛋白质或蛋白质结构域可用于与细胞外组分相互作用。膜相关蛋白可以具有多于一个细胞外结构域，并且本公开的微细胞可以显示多于一种膜相关蛋白。

如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质”和“蛋白质结构域”是指由氨基酸单链通过肽键连接而成的大分子。本公开的多肽可以包含自然存在的氨基酸、合成氨基酸、遗传编码氨基酸、非遗传编码氨基酸及其组合。多肽可以包括L型和D型氨基酸。

如本文所用，术语“酶促活性多肽”是指编码酶促功能蛋白质的多肽。术语“酶促活性多肽”包括但不限于执行生物学功能的融合蛋白。示例性酶促活性多肽包括但不限于特异性地结合某些受体或生物/化学底物以实现生物功能诸如生物信号转导或化学失活的酶/酶部分(例如野生型、变体或工程化变体)。

如本文所用，术语“蛋白酶缺乏株”是指缺乏一种或多种内源性蛋白酶的株。例如，可以通过缺失、去除、敲除、沉默、抑制或以其他方式至少下调内源性蛋白酶来产生蛋白酶缺乏。所述蛋白酶可以包括激变的蛋白酶。例如，BL21(DE3)大肠埃希氏菌株缺乏蛋白酶Lon和OmpT。大肠埃希氏菌株具有可以显著降低蛋白质产生和定位到膜上的细胞质蛋白酶和膜蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶缺乏株可以最大限度地提高感兴趣的蛋白质的产生和定位到细胞膜。“蛋白酶缺乏的”在本公开中可以与“无蛋白酶”互换使用。

如本文所用，术语“去核细胞”是指缺乏细胞核并且也缺乏染色体DNA的细胞，并且其也可以被称为“无核细胞”。因为真细菌和古细菌细胞与真核细胞不同，自然地没有细胞核(一种含有染色体的独特细胞器)，这些非真核细胞当然更准确地描述为“没有染色体”或“无染色体”。尽管如此，本领域技术人员除了其他真核微细胞外当提及细菌微细胞时经常使用术语“去核的”。因此，在本公开中，术语“微细胞”涵盖缺少染色体的真细菌细胞的衍生物；缺少其染色体的古细菌细胞的衍生物，以及缺少细胞核因而缺少染色体的真核细胞的无核衍生物。因此，在本公开中，“去核细胞”或“无核细胞”可以与术语“无染色体细胞”互换使用。

如本文所用，术语“非表达的”农用化合物是指不由宿主细胞内源地、先天地或自然地产生的农用化合物。例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigenesis)产生可以杀死植物咀嚼昆虫幼虫以及蚊子幼虫的毒素。这种可以用作农用化合物的毒素是从苏云金芽孢杆菌内源地表达的Cry蛋白。在本公开中，这种自然地表达的Cry蛋白不被认为是非表达的农用化合物。

如本文所用，“载剂”、“可接受的载剂”或“农业上可接受的载剂”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，其可以与组合物一起施用至组合物的靶并且不会不利地影响所述组合物。

如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。该术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。其还包括经修饰的核酸，诸如甲基化和/或封端的核酸、含有经修饰的碱基、主链修饰等的核酸。术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。

如本文所用，术语“蛋白酶缺乏株”是指缺乏一种或多种内源性蛋白酶的株。例如，可以通过缺失、去除、敲除、沉默、抑制或以其他方式至少下调内源性蛋白酶来产生蛋白酶缺乏。所述蛋白酶可以包括激变的蛋白酶。例如，BL21(DE3)大肠埃希氏菌株缺乏蛋白酶Lon和OmpT。大肠埃希氏菌株具有可以显著降低蛋白质产生和定位到膜上的细胞质蛋白酶和膜蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶缺乏株可以最大限度地提高感兴趣的蛋白质的产生和定位到细胞膜。“蛋白酶缺乏的”在本公开中可以与“无蛋白酶”互换使用。

如本文所用，术语“核糖核酸酶缺乏株”是指缺乏一种或多种内源性核糖核酸酶的株。例如，可以通过缺失、去除、敲除、沉默、抑制或以其他方式至少下调内源性核糖核酸酶来产生核糖核酸酶缺乏。所述核糖核酸酶可以包括核糖核酸酶III。例如，HT115大肠埃希氏菌株缺乏RNA酶III。在一些实施方案中，核糖核酸酶缺乏株不能和/或有降低的能力识别dsRNA并在特定靶向位置切割它。“核糖核酸酶缺乏”在本公开中可以与“无核糖核酸酶”互换使用。

如本文所用，术语“无染色体细胞”、“去核细胞”是指缺乏细胞核并且也缺乏染色体DNA的细胞，并且其也可以被称为“无核细胞”。因为真细菌和古细菌细胞与真核细胞不同，自然地没有细胞核(一种含有染色体的独特细胞器)，这些非真核细胞当然更准确地描述为“没有染色体”或“无染色体”。尽管如此，本领域技术人员除了其他真核微细胞外当提及细菌微细胞时经常使用术语“去核的”。因此，在本公开中，术语“微细胞”涵盖缺少染色体的真细菌细胞的衍生物；缺少其染色体的古细菌细胞的衍生物，以及缺少细胞核因而缺少染色体的真核细胞的无核衍生物。因此，在本公开中，“去核细胞”或“无核细胞”可以与术语“无染色体细胞”互换使用。

如本文所用，术语“结合位点”意指分子结构或化合物，诸如蛋白质、多肽、多糖、糖蛋白、脂蛋白、脂肪酸、脂质或核酸；或在此类分子结构或化合物中的特定区域；或此类分子结构或化合物的特定构象；或此类分子结构或化合物的组合或复合物。在某些实施方案中，至少一个结合位点在完整的活植物上。如本文所用，“完整的活植物”意指生长的植物，无论它是生长在土壤中、水中还是人造基质中，也无论它是生长在田间中、在温室中、在庭院中、在花园中、在盆中还是在水培系统中。完整的活植物优选地包括在自然界中通常存在于此类植物上的所有植物部分(根、茎、枝、叶、针叶、刺、花、种子等)，尽管一些植物部分(例如花朵)在植物生命周期的某些时期期间可能不存在。

如本文所用，“结合结构域”意指能够使用特异性分子间相互作用结合至靶分子的蛋白质性质(蛋白质、类蛋白质或含蛋白质的)分子的全部或部分。结合结构域可以是自然存在的分子，其可以来源于自然存在的分子，或者其可以完全是人工设计的。结合结构域可以基于蛋白质中存在的结构域，所述蛋白质包括但不限于微生物蛋白质、蛋白酶抑制剂、毒素、纤连蛋白、脂质运载蛋白(lipocalin)、单链反向平行卷曲螺旋蛋白或重复基序蛋白。此类结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合模块(CBM)，诸如靶向植物的纤维素结合结构域。在一些实施方案中，细胞粘附部分包含结合结构域。

如本文所用，“载剂”、“可接受的载剂”或“生物活性可接受的载剂”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，其可以与组合物一起施用至组合物的靶并且不会不利地影响所述组合物。

如本文所用，“植物”和“植物衍生物”可以是指生长植物的任何部分，包括根、树干、茎、叶、枝、种子、花、果实等。例如，肉桂精油可以来源于从肉桂植物的叶或树皮。

如本文所用，术语“精油”是指从植物材料中提取的芳香的挥发性液体。精油通常是含有挥发性芳香化合物的浓缩疏水性液体。精油化学成分可以归入一般类别，诸如萜烯(例如，对伞花烃、柠檬烯、香桧烯、a-蒎烯、y-萜品烯、b-石竹烯)、萜类化合物(例如，香叶醇、香茅醛、百里酚、香芹酚、香芹酮、龙脑)和类苯基丙烷(例如，肉桂醛、丁香酚、香草醛、黄樟素)。精油可以是天然的(即源自植物)，也可以是合成的。

如本文所用，术语“精油”在本公开的范围内还涵盖植物油和脂质。精油的非限制性实例是芝麻油、除虫菊(提取物)、甘油衍生的脂质或甘油脂肪酸衍生物、肉桂油、香柏油、丁香油、天竺葵油、柠檬草油、当归油、薄荷油、姜黄油、冬青油、迷迭香油、茴香油、豆蔻油、葛缕子油、洋甘菊油、芫荽油、愈创木油、孜然油、莳萝油、薄荷油、欧芹油、罗勒油、樟脑油、依兰油、香茅油、桉树油、小茴香油、姜油、古巴香脂油、紫苏油、柏木油、茉莉油、玫瑰草苏菲亚油、西方薄荷油、八角茴香油、晚香玉油、橙花油、吐鲁香脂油、广藿香油、玫瑰草油、日本扁柏油、罗汉柏精油、檀香油、苦橙叶油、月桂叶油、香根草油、佛手柑油、秘鲁香脂油、玫瑰木油、葡萄柚油、柠檬油、橘子油、橙油、牛至油、薰衣草油、香叶树油(Lindera oil)、松针油、胡椒油、玫瑰油、鸢尾油、甜橙油、红橘油、茶树油、茶籽油、百里香油、百里酚油、大蒜油、薄荷油、洋葱油、沉香油、日本薄荷油、留兰香油、虎杖提取物和本文全文所公开的其他物质。

如本文所用，术语“复合培养基(complex medium或complex media)”是指主要用于细胞培养(例如细菌生长)的营养丰富的培养基，其成分包含胰蛋白胨和酵母提取物。复合培养基含有复杂且昂贵的碳源和氮源，诸如胰蛋白胨和酵母提取物。胰蛋白胨是对生长细菌所需的诸如肽和蛋白胨等必需氨基酸的来源，并且酵母提取物用于提供过剩的有助于细菌生长的有机化合物。溶源性肉汤(LB)和极品肉汤(TB)培养基是复合培养基的实例，它们是最流行和最常用的培养细菌的培养基。

如本文所用，术语“基本培养基”或“限定的基本培养基”是指用于细胞培养的培养基，但其含有商业上可行的碳源和氮源(例如葡萄糖或甘油作为碳源以及磷酸铵作为氮源)，它们比用于上文所述的复合培养基的酵母提取物和胰蛋白胨成本更可行。由成本可行的碳源和氮源构成的基本培养基或培养基对于以经济的方式制造生物材料(例如微细胞)至关重要。在实施方案中，基本培养基用于在本公开的受控制的生物处理系统中使用具有本文所述的限定参数范围的小型、中型或大型生物反应器生产无染色体(或去核)微细胞。

细菌微细胞生产

微细胞是由参与细胞分裂和/或染色体分配的基因发生突变和/或过表达或表达不足的亲本细胞产生的，或者来自暴露于某些条件的亲细胞，这些条件会导致细菌细胞的异常裂殖和/或在细胞裂殖(分裂)期间异常染色体分离的分配。术语“亲本细胞(parentcells或parental cells)”是指产生微细胞的细胞。微细胞，其大部分缺少染色体DNA(Mulder等人,Mol Gen Genet,221:87-93,1990)，通常(但不一定)比它们的亲本细胞小。通常，微细胞产生大肠埃希氏菌细胞通常呈球形，直径为约0.1至约0.5μm，长度小于1μm，然而完整大肠埃希氏菌细胞的直径为约1至3μm，长度为约2至约10μm。已经用与DNA结合的化合物DAPI(4:6-二脒基-z-苯基吲哚)染色的大肠埃希氏菌细胞和微细胞的显微照片显示微细胞不会染色，而亲本大肠埃希氏菌被明亮地染色。此类显微照片表明微细胞中缺少染色体DNA。(Mulder等人,Mol.Gen.Genet.221:87-93,1990)。

微细胞是无染色体的膜包封的生物纳米颗粒(≦1μm)，其由细菌细胞的正常分裂装置破坏后的细菌形成。本质上，微细胞是正常细菌细胞的小的、具有代谢活性的复制品，除了它们不含有染色体DNA并且因此是不可分裂和无活力的。虽然微细胞不含有染色体DNA，但是已经显示质粒、RNA、天然和/或重组表达的蛋白质和其他代谢物的能力全部都会分离到微细胞中。构建生产微细胞的细菌株的一些方法在以下文献中详细进行了讨论：美国专利申请序列号10/154,951(美国公开号US/2003/0194798A1)，其据此以全文引用的方式并入。

在染色体复制和细胞分裂之间的协调的破坏导致由大多数杆状原核生物的极区形成微细胞。通过过表达一些参与隔膜形成和二元裂殖的基因，可以促进在染色体复制和细胞分裂之间的协调的破坏。可替代地，可以在调节隔膜形成和二元裂殖的基因中具有突变的株中产生微细胞。受损的染色体分离机制也可能导致微细胞形成，这已经在许多不同的原核生物中所显示。

可以在例如国际专利申请号WO2018/201160、WO2018/201161和WO2019/060903中找到制得、生产和纯化细菌微细胞的方法的描述，所述申请以引用的方式并入本文。

此外，可以在例如国际专利申请号WO2018/201160、WO2018/201161和WO2019/060903中找到用于生产微细胞的菌株的描述，所述申请以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，本公开教导了一种组合物，所述组合物包含：微细胞和活性剂。在一些实施方案中，微细胞源自细菌细胞。在一些实施方案中，微细胞的直径小于或等于1μm。

微细胞的尺寸为约10nm-约1000nm，尺寸为约50nm-约950nm，尺寸为约100nm-约950nm，尺寸为约150nm-约950nm，或尺寸为约200nm-约900nm。在其他实施方案中，微细胞的尺寸为约250nm–约900nm。在另外的实施方案中，由本公开的受控制的生物处理系统产生的平均微细胞尺寸为约400-约750nm、约450-约700nm和约500-约650nm的长度。

农用药剂

本公开提供了用于在农用药剂和产品上制备多层结构的涂层平台、组合物、制剂、方法。在一些实施方案中，农用药剂是农用化学品、生物活性剂或农用产品。

本公开教导农用药剂是杀虫剂、杀昆虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀病毒剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、施肥剂、驱虫剂、植物生长调节剂或植物改良剂。

在其他实施方案中，农用药剂是核酸、多肽、代谢物、化学信息素、精油或小分子。在一些实施方案中，核酸是DNA、RNA、PNA或杂合DNA-RNA分子。在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)、指导RNA(gRNA)或抑制性RNA。在一些实施方案中，抑制性RNA是RNAi、shRNA或miRNA。在一些实施方案中，抑制性RNA抑制植物中的基因表达。在一些实施方案中，抑制性RNA抑制植物共生体中的基因表达。

在一些实施方案中，核酸是mRNA、经修饰的mRNA，或在植物中增加酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣蛋白的表达的DNA分子。

在一些实施方案中，核酸是反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉代、LNA、piRNA、核酶、DNAzyme、适体、circRNA、gRNA，或在植物中降低酶、转录因子、分泌蛋白、结构因子、核糖蛋白、蛋白质适体、伴侣蛋白、受体、信号传导配体或转运蛋白的表达的DNA分子。

在一些实施方案中，多肽是酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣蛋白。

可以在例如国际专利申请号WO2018/201160、WO2018/201161、WO2019/060903和WO2021/133846中找到对农用药剂和活性成分的描述，所述申请全部以引用的方式并入本文。

农用化学品

在一些实施方案中，农用药剂是农用化学化合物。

如本文所用的术语“农用化学品”意指无论是自然地还是合成地获得的化学物质，其被施用于植物、害虫或其部位以导致表达所需的生物活性。如本文所用，术语“生物活性”意指在植物中或在植物中或植物上存在的害虫诸如病原体、寄生虫或摄食生物体中引发刺激、抑制、调节、治疗、毒性或致死反应，或者在植物的部位、害虫或结构中引发这种反应。术语“植物”包括但不限于所有食品、纤维、饲料和粮草作物(收获前和收获后、种子和种子处理)、树木、草坪和观赏植物。农用化学物质的实例包括但不限于化学杀虫剂(诸如除草剂、除藻剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀病毒剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀疥虫剂、灭鼠剂、杀线虫剂和杀软体动物剂)、除草剂安全剂、植物生长调节剂(诸如激素和细胞生长剂；包括脱落酸、生长素、油菜素内酯、细胞分裂素、乙烯、赤霉素、茉莉酮酸酯、水杨酸、独脚金内酯、植物肽激素、多胺、一氧化氮、卡里金(karrikin)、三十烷醇(triacontano)等)、肥料、土壤调理剂和营养素、杀配子剂、脱叶剂、干燥剂及其混合物。

在一些实施方案中，农用化学品是合成的或合成地获得的。在其他实施方案中，农用化学品是自然存在的或自然获得的。

上述农用化学品的更多实例描述于例如美国专利申请公开号US2012/0016022和US2020/0113177，所述申请以全文引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，农用化合物包括但不限于杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料、营养素、植物生长调节剂(诸如激素或化学生长剂)及其任何组合。

生物活性剂

在一些实施方案中，农用药剂是生物活性剂。

术语“生物活性剂(biologically active agent)”(与“生物活性剂(bioactiveagent)”同义)表示药剂、组合物或化合物其本身具有生物效应，或者其改良、导致、促进、增强、阻断、减少、限制具有生物效应的内源性分子的产生或活性或者与具有生物效应的内源性分子反应或结合。“生物效应”可以是但不限于影响植物中/植物上的生物过程的效应；影响害虫、病原体或寄生虫的生物过程的效应；产生或导致产生可检测信号的效应；等等。生物活性剂、组合物、复合物或化合物可以用于农业应用和组合物。生物活性剂、组合物、复合物或化合物用于引起或刺激对植物、昆虫、蠕虫、细菌、真菌或病毒的期望效应。期望效应的非限制性实例包括例如(i)预防、治疗或治愈植物遭受的疾病或病状；(ii)限制感染植物的害虫、病原体或寄生虫的生长或杀死感染植物的害虫、病原体或寄生虫；(iii)增强植物的表型或基因型；(iv)在植物中刺激发芽、无性生长、开花、施肥、生产果实和/或种子以及收获的积极反应；和(v)控制害虫引起疾病或病症。

在本公开的农业应用的上下文中，术语“生物活性剂”表示药剂、组合物、复合物或化合物具有以下的活性：在积极意义上影响植物的营养生长和生殖生长、在积极意义上影响遭受疾病或病症的植物和/或在消极意义上影响害虫、病原体或寄生虫。因此，生物活性剂、组合物、复合物或化合物可以在植物内引起或促进对以下各项的生长和/或维持有害的生物或生物化学活性：害虫、病原体或寄生虫；或具有异常生长或生物化学特性和/或在宿主(诸如植物)内引起疾病或病症的害虫、病原体或寄生虫的植物的细胞、组织或器官。

在一些实施方案中，生物活性剂是源自活生物体的天然产物。在一些实施方案中，生物活性剂是核酸、多肽、蛋白质、代谢物、化学信息素(诸如信息素)或精油，其是自然产物/自然存在的产物或与自然产物相同。在一些实施方案中，生物活性剂包括下文所述的生物防治剂和生物刺激素。

作为生物活性剂的一个实例，诸如洋薄荷油(PO)、百里香油(TO)、丁香油(CO)、柠檬草油(LO)和肉桂油(CnO)等精油(EO)已经因为它们的抗细菌、抗病毒、抗炎症、抗真菌和抗氧化特性而被使用。萜类化合物诸如薄荷醇和百里酚以及苯丙烯类诸如丁香酚和肉桂醛是EO的主要影响抗细菌活性的组分。例如，百里酚能够通过将其极性头基整合到脂质双层中并增加细胞内ATP浓度来干扰微膜。还发现丁香酚会影响离子通过细胞膜的运输。肉桂醛抑制与细胞因子相互作用相关的酶，并且充当ATP酶抑制剂。

在一些实施方案中，萜烯是广泛存在于自然界中(主要作为精油(EO)的成分存在于植物中)的化学化合物。它们的结构单元是烃异戊二烯(C5H8)n。

在一些实施方案中，萜烯的实例包括但不限于柠檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫罗兰酮、香叶醇、香芹酚、丁香酚、香芹酮、松油醇、茴香脑、樟脑、薄荷醇、柠檬烯、橙花叔醇、framesol、叶绿醇、胡萝卜素(维生素A1)、角鲨烯、百里酚、生育三烯酚、紫苏醇、龙脑、月桂烯、斯烯(simene)、蒈烯、terpenene、芳樟醇及其混合物。在一些实施方案中，精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

在一些实施方案中，精油可以包括来自萜烯类、萜类化合物、苯丙烯类及其组合的类型的油类。如本文所提供的精油还含有源自植物的精油(即，“天然”精油)以及另外地或可替代地它们的合成类似物。

应该注意的是，萜烯也以含有它们的提取物或精油的名称而为人所知，例如洋薄荷油(PO)、百里香油(TO)、丁香油(CO)、柠檬草油(LO)和肉桂油(CnO)。

在一些实施方案中，生物活性剂是营养素，包括碳水化合物、脂肪、纤维、矿物质、蛋白质、碳水化合物、纤维、维生素、抗氧化剂、精油和水。对动物健康的关键营养素的实例可以分类为(i)蛋白质和氨基酸(诸如精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、牛磺酸、胶原蛋白和明胶)，(ii)脂肪(诸如甘油三酯、omega-3、omega-6或omega-9脂肪酸、亚油酸、生育酚、花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA))，(iii)碳水化合物(葡萄糖、半乳糖、和果糖、乳糖、二糖和寡糖)，(iv)纤维(纤维素及其衍生物、多糖和糖胺聚糖)，(v)维生素(A、B族复合物、D、C、E、K、硫胺素和β-胡萝卜素)，(vi)矿物质(常量矿物质，诸如钠、钾、钙、磷、镁)，(vii)已知重要的痕量矿物质，诸如铁、锌、铜、碘、氟、硒、铬，(viii)其他对动物营养有用的矿物质，诸如钴、钼、镉、砷、硅、钒、镍、铅、锡，和(ix)抗氧化剂，诸如抗坏血酸、多酚、单宁、黄酮醇和三萜皂苷(triterpenes glucosides)。

作为非限制性实例，生物活性剂或化合物是核酸、多肽、代谢物、化学信息素或微量营养素。这些生物活性剂可以大致分为生物防治剂和生物刺激素。

(i)生物防治剂

本公开教导了作为生物防治剂的生物活性剂，包括但不限于杀虫剂、杀昆虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀线虫剂、精油、抗微生物剂、抗真菌剂和抗病毒剂。

在一些实施方案中，杀虫剂、杀昆虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀线虫剂、抗微生物剂、抗真菌剂和抗病毒剂是由活生物体产生的自然产物或自然存在的药剂。

本公开教导了作为生物防治剂的生物活性剂，包括但不限于RNAi、原毒素、代谢物、抗体、发酵产物、激素、信息素和化学信息素。在一些实施方案中，生物化学防控剂包括但不限于化学信息素，例如植物生长调节剂、激素、酶、信息素、异种信息素(allomone)和利他素，它们是自然存在的或与自然产物相同，吸引、延迟、破坏或以其他方式发挥杀虫活性。在一些实施方案中，生物防治剂是指生物活性化合物多肽、代谢物、化学信息素、激素、信息素，以及核酸，诸如RNA生物分子，包括反义核酸、dsRNA、shRNA、siRNA、miRNA、核酶和适体。

在一些实施方案中，化学信息素包括信息素、异种信息素、利他素和互利素(synomone)。例如，信息素是一类微生物挥发性有机化合物，可以充当昆虫和其他无脊椎动物的引诱剂和驱避剂。它们可以用作控制各种病原体的生物防治剂以及用于促进植物生长的生物肥料。它们甚至在收获后用于预防植物疾病(Kanchiswamy等人,Trends PlantSci.40(4):206-211,2015)。信息素可以自然地产生或合成地产生。信息素可以用于促进植物生长。一些源自微生物的信息素能够在各种胁迫条件下促进一些植物的生长。例如，已经表明源自芽孢杆菌属的2,3-丁二醇诱导系统抗性并促进植物在胁迫条件如高盐度下的生长(Ryu等人,Plant Physiol.134(3):1017-1026,2004；Ryu等人,PNAS 100(8):4927-2932,2003)。信息素也可以用于害虫管理。通常源自昆虫的某些信息素能够用作生物防治剂。它们可以是能够吸引和杀死靶害虫的制剂的一部分，或者它们可以用于“大规模诱捕害虫种群”(Witzgall等人,J Chem Ecol.36(1):80-100,2010)。例如，已经证明信息素((Z)-9-十六醛、(Z)-ll-十六醛和(Z)-9-十八醛，三化螟(S.incertulas)信息素的组分)能够控制水稻上的钻心虫(三化螟(Scirpophaga incertulas))种群(Cork等人,Bulletin ofEntomological Research,86(5):515-524)。

(ii)生物刺激素

本公开教导了作为生物刺激素的生物活性剂。这些生物刺激素的非限制性实例包括激素和生物化学生长剂。这些活性物包括脱落酸(参与胁迫下的休眠机制)、植物生长素(积极影响植物生长)、细胞分裂素(影响细胞分裂和芽形成)、ACC脱氨酶(降低乙烯的抑制生长作用)、赤霉素(通过伸长茎和刺激花粉管生长积极影响植物生长)，以及许多其他物质(油菜素内酯、水杨酸、茉莉酮酸酯、植物肽激素、多胺、一氧化氮、独脚金内酯、卡里金和三十烷醇)，它们用于正调节和负调节植物的生长。

在一些实施方案中，生物活性化合物是信息素，其改善和改良化学反应以帮助植物生长和作为生物刺激素抵抗胁迫。

在一些实施方案中，生物活性剂是肥料、植物微量营养素和植物常量营养素(包括但不限于氮、钾和磷)以及痕量营养素(诸如铁、铜、锌、硼、锰、钙、钼和镁)。

在一些实施方案中，生物刺激素包含微生物特性，诸如根瘤菌(PGPR)特性、真菌特性、细胞分裂素、植物激素、肽和ACC-脱氨酶。例如，可以通过经由微细胞递送脲酶和/或固氮酶以协助固氮来实现固氮。

在一些实施方案中，生物刺激素包括酸(诸如腐殖质、胡敏素、黄腐酸、B族维生素、氨基酸、脂肪酸/脂质)、提取物(诸如羧基物(carboxyls)、植物性药物、化感物质、甜菜碱、多胺、多酚、壳聚糖和其他生物聚合物)、亚磷酸酯类、磷酸盐增溶剂、含氮化合物、无机盐、蛋白质水解物和有益元素。

作为一个实例，蛋白质水解物具有增加广泛的作物的发芽、生产率和质量的潜力。蛋白质水解物还可以减轻盐度、干旱和重金属的消极影响。蛋白质水解物可以刺激碳和氮代谢，并且干扰激素活性。蛋白质水解物可以增强植物生长基质中营养素的利用率，并且增加植物中的营养素吸收和利用效率。蛋白质水解物还可以刺激植物微生物群；由蛋白质水解物提供的底物诸如氨基酸可以为植物相关微生物提供食物来源。

生物刺激素在整个作物生命周期(从种子发芽到植物成熟)中以多种已证实的方式促进植物发育。它们可以应用于植物、种子、土壤或其他可以增强植物同化营养素和正常发育的能力的生长介质。通过培育补充的土壤微生物并且提高代谢效率、根系发育和营养素递送，生物刺激素可以增加重量、种子和坐果率方面的产率，提高质量，影响糖分含量、颜色和保质期，提高水利用效率，以及加强胁迫耐受力和恢复。这些生物刺激素可以包括信息素或酶(如ACC脱氨酶)。

生物刺激素是产生非营养性植物生长反应并通过增强胁迫耐受力来减轻胁迫的化合物。产生营养反应的肥料可以被视为生物刺激素。生物刺激素的许多重要益处是基于它们影响激素活性的能力。植物中的激素(植物激素)是调节正常植物发育以及对环境的反应的化学信使。根和芽生长以及其他生长反应受植物激素调节。“生物刺激素”中的化合物可以改变植物的激素状态，并且对植物的生长和健康产生重大影响。海藻、腐殖酸和B族维生素是“生物刺激素”的常见组分，它们是影响植物生长和激素活性的化合物的重要来源。抗氧化剂是在调节植物对环境和化学胁迫(干旱、高温、紫外线和除草剂)的反应方面重要的另一组植物化学物质。当植物受到胁迫时，“自由基”或活性氧分子(例如过氧化氢)会破坏植物细胞。抗氧化剂抑制自由基毒性。具有高水平的抗氧化剂的植物在正常环境和胁迫环境下都会产生更好的根和芽生长，保持更高的叶片水分含量和更低的疾病发生率。应用生物刺激素会增强抗氧化活性，其会增加植物的防御系统。维生素C、维生素E和氨基酸诸如甘氨酸是生物刺激素中所含的抗氧化剂。

生物刺激素可能会刺激土壤或其他植物生长介质中存在的微生物的生长。生物刺激素能够刺激微生物接种剂中所含的微生物的生长。因此，希望获得一种生物刺激素，其当与微生物接种剂一起使用时能够增强天然微生物和接种微生物两者的种群。

在一些实施方案中，生物活性化合物可以用作生物防治剂和生物刺激素，它们已成为作物保护和增强的新时代。

生物防治剂的实例是RNAi或RNA干扰，其用于沉默靶害虫中的基因，杀死它们，同时让非靶害虫不受伤害。在无脊椎动物中，长dsRNA可以有效地用于沉默基因表达，而无需激活dsRNA活化的蛋白激酶(PKR)或已显示在哺乳动物细胞系统中发生的干扰素反应。

另一个实例是递送蛋白质毒素来对抗害虫。蛋白质毒素的一个实例是口服活性杀昆虫肽1(OAIP-1)，其对昆虫的高度毒性的效力与合成杀昆虫剂吡虫啉的效力相似。这种OAIP-1毒素可以从澳大利亚狼蛛的毒液中分离，其可以用作本公开中教导的生物活性化合物之一。

几丁质酶可以作为杀真菌剂递送至植物。

植物抗体是另一种形式的生物防治剂，其可以用于特异性地靶向害虫。免疫球蛋白结构域、轻链、重链和CDR、Fv、Fab和Fc区可以被包封为活性化合物并且递送至靶。本公开提供了杀真菌抗体，诸如从葡糖神经酰胺产生的那些。

植物生长调节剂、激素、酶、信息素、异种信息素和利他素也是生物防治剂。信息素可以充当生物防治剂来防止虫子和/或昆虫交配。

生物刺激素在整个作物生命周期(从种子发芽到植物成熟)中以多种已证实的方式促进植物发育。它们可以应用于植物、种子、土壤或其他可以增强植物同化营养素和正常发育的能力的生长介质。通过培育补充的土壤微生物并且提高代谢效率、根系发育和营养素递送，生物刺激素可以增加重量、种子和坐果率方面的产率，提高质量，影响糖分含量、颜色和保质期，提高水利用效率，以及加强胁迫耐受力和恢复。这些生物刺激素可以包括信息素或酶(如ACC脱氨酶)。

生物刺激素是产生非营养性植物生长反应并通过增强胁迫耐受力来减轻胁迫的化合物。产生营养反应的肥料可以被视为生物刺激素。生物刺激素的许多重要益处是基于它们影响激素活性的能力。植物中的激素(植物激素)是调节正常植物发育以及对环境的反应的化学信使。根和芽生长以及其他生长反应受植物激素调节。“生物刺激素”中的化合物可以改变植物的激素状态，并且对植物的生长和健康产生重大影响。海藻、腐殖酸和B族维生素是“生物刺激素”的常见组分，它们是影响植物生长和激素活性的化合物的重要来源。抗氧化剂是在调节植物对环境和化学胁迫(干旱、高温、紫外线和除草剂)的反应方面重要的另一组植物化学物质。当植物受到胁迫时，“自由基”或活性氧分子(例如过氧化氢)会破坏植物细胞。抗氧化剂抑制自由基毒性。具有高水平的抗氧化剂的植物在正常环境和胁迫环境下都会产生更好的根和芽生长，保持更高的叶片水分含量和更低的疾病发生率。应用生物刺激素会增强抗氧化活性，其会增加植物的防御系统。维生素C、维生素E和氨基酸诸如甘氨酸是生物刺激素中所含的抗氧化剂。

生物刺激素可能会刺激土壤或其他植物生长介质中存在的微生物的生长。生物刺激素能够刺激微生物接种剂中所含的微生物的生长。因此，希望获得一种生物刺激素，其当与微生物接种剂一起使用时能够增强天然微生物和接种微生物两者的种群。

在一些实施方案中，本公开提供了工业上合适的基于去核细胞的平台和/或工业制剂，其可以通过使用本文所述的基于去核细胞的平台和/或工业制剂以可扩展的、具有成本效益的方式局部递送生物防治剂和生物刺激素。这种基于去核细胞的平台和/或工业制剂也可以被改良，以侵入性地递送生物防治剂和生物刺激素到植物(包括水产养殖中的植物)。

在一个方面，基于去核细胞的平台和/或工业制剂使用缺少核糖核酸酶(核糖核酸酶III)并且具有T7、T3或Sp6 RNA聚合酶启动子的细菌细胞来产生用于对靶的RNA干扰(RNAi)的dsRNA。然后对该细菌细胞进行修饰以产生在其内包封有dsRNA的微细胞。这有助于简化和降低纯化和包封的成本。通过包封dsRNA，保护dsRNA分子免受环境RNA酶的影响。例如，包括昆虫在内的害虫通过口服消耗用于递送dsRNA的微细胞。一旦进入昆虫体内，dsRNA就会成为RNA酶III样蛋白(称为Dicer或Dicer样蛋白)的底物。Dicer似乎优先在dsRNA的末端启动dsRNA切割，进行连续切割以产生21至24-bp小干扰(si)RNA双链体以沉默和/或抑制其靶转录物并抑制转录物的翻译。所得的siRNA双链体被加载到称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物中，其中乘客(有义)链被去除并且指导(反义)链仍然靶向mRNA以进行沉默。RISC中的指导链使复合物与互补的mRNA转录物碱基配对，并且通过一类称为Argonaute蛋白的蛋白质酶促切割靶mRNA，从而阻止靶mRNA的翻译。这就是导致靶害虫死亡，同时使非靶害虫不受伤害的原因。此外，基于去核细胞的平台和/或工业制剂可以用于包封dsRNA、siRNA、shRNA或miRNA。在其他方面，反义核酸、核酶或适体可以包封在所述平台内。

在一些实施方案中，基于去核细胞的平台和dsRNA由不同的宿主细胞产生，并且在已经完成独立产生之后一起孵育。在一些实施方案中，基于去核细胞的平台可以用于从能够在无核微细胞内部产生dsRNA的重组质粒内部地表达dsRNA。然后，内部产生的dsRNA被递送到其在无核微细胞内的靶。在其他实施方案中，基于去核细胞的平台可以用于包封首先在无核微细胞外部产生的外部和/或外源地产生的dsRNA。然后，包封到微细胞中的外部产生的dsRNA被递送到其在无核微细胞内的靶。在另外的实施方案中，基于去核细胞的平台可以用于在平台内内部地表达dsRNA并且将外源地产生的dsRNA的一个或多个序列包封到平台中以用于靶向一种或多种不同害虫的目的。这需要包封与无核细胞中内部表达的dsRNA序列同源或异源的dsRNA。因此，基于去核细胞的平台可以携带内部表达的dsRNA和外部表达的但包封的dsRNA到其预期的靶。

本公开教导基于去核细胞的平台和/或工业制剂可以将内部产生的dsRNA和外部/外源产生的dsRNA单独地或一起递送至靶细胞。靶细胞不是哺乳动物细胞。

本公开教导了一种用于包封和递送至少一种生物活性化合物的工业上合适的基于去核细胞的平台和/或工业制剂，其包含：源自缺乏核糖核酸酶的亲本细胞的完整去核细胞，该完整去核细胞在所述细胞内包含至少一种生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是核酸，其中所述核酸靶向在靶细胞内编码多肽的转录物，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。基于去核细胞的平台和/或工业制剂还包含至少一种生物学上可接受的载剂。

在一些实施方案中，对于蛋白质介导的生物防治剂，本公开使用缺少蛋白酶并且具有T7、T3或Sp6聚合酶启动子的细菌细胞来产生大量蛋白质。然后对该细菌细胞进行修饰以产生蛋白质固定在其表面或包封在其中的微细胞。将表达蛋白质的质粒整合到细菌的类核DNA中，以安全且有效地产生蛋白质。然后昆虫与表达或保留所需蛋白质的微细胞相互作用或口服消耗所述微细胞。对于抗体介导的生物防治剂，微细胞可以表达或包封抗体以特异性地靶向不需要的害虫。微细胞可以递送用作针对昆虫或真菌病原体的高度特异性生物杀虫剂的抗体或重组抗体(Raymond等人,Fungal Biology Review 25(2):84-88,2011)。

在一些实施方案中，对于生物刺激素，本公开教导微细胞可以将范围广泛的植物生长促进生物分子递送至植物的表面、其种子及其根系。许多这些生物分子由于一些微生物与植物的动态共生关系而的产生，并且响应于某些环境线索或胁迫而自然地产生。微细胞可以被工程化成提供这些植物生长促进生物分子(其在细胞外被固定在所述微细胞的表面上或包封在细胞内)的高有效负载能力，不依赖于微生物或植物自然地产生它们。这使得这些生物分子能够以更高的有效浓度递送到植物微环境，同时还允许对农业投入需求做出更受控制、更适应的反应。许多这些生物分子是细菌在细胞内或细胞外产生的酶，它们在促进土壤肥力和提供对植物病原体的防御力方面起着重要作用(Jog等人,Journal ofAppled Micorbiology113:1154-1164,2012；Sathya等人3Biotech 7:102,2017)。其他物质(如1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶)可以通过降低植物微环境中的乙烯水平在激素水平上调节植物生长(Souza等人,Genet.Mol.Biol.38(4):401-419,2015)。

在一些实施方案中，生物活性化合物是可以使用微细胞产生并递送至植物或其根系的有价值的酶，其包括但不限于纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。除了能够有效地递送酶以促进植物生长之外，本文所述的微细胞还可以递送在促进植物生长中起作用的其他高价值生物分子。这些生物分子包括但不限于植物激素，诸如生长素IAA、肽、初级代谢物和次级代谢物。

在一些实施方案中，生物活性化合物是信息素，其改善和改良化学反应以帮助植物生长和作为生物刺激素抵抗胁迫。

在其他实施方案中，可以通过在微细胞表面上表达的结合结构域来辅助生物防治剂和生物刺激素的递送。例如，微细胞可以表达结合结构域诸如碳水化合物结合模块(CBM)以被靶向到植物。这些结构域允许更好地保留在植物表面，从而防止径流或漂流。在一些实施方案中，微细胞表达包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分的融合蛋白，其中所述靶细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。靶细胞粘附部分包含选自由以下组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。

在其他实施方案中，微细胞还可以表达多种促使它们被植物吸收以通过叶表面或根侵入性递送的蛋白质。在一些实施方案中，微细胞可以在其表面上表达和显示生物活性化合物，诸如多肽和/或蛋白质。在其他实施方案中，微细胞可以在其表面上表达和显示表面表达的结合蛋白和生物活性化合物两者诸如多肽和/或蛋白质。

表面表达的结合蛋白作为上文所述的碳水化合物结合模块(CBM)。表面表达的生物/酶促活性多肽/蛋白质包含细胞刺激部分和/或细胞降解部分。此类活性蛋白质的非限制性实例包括但不限于ACC-脱氨酶、几丁质酶、纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。

在一些实施方案中，这些蛋白质被外源地表达并包封到微细胞中。在其他实施方案中，这些蛋白质在内部表达并固定在微细胞的表面上。诸如此类蛋白质的生物活性化合物在微细胞外表达之后被包封在微细胞内，或者在微细胞内表达并显示在微细胞表面上。在另外的实施方案中，微细胞在其表面上表达至少一种生物活性化合物并且同时包封另一种生物活性化合物。因此，微细胞可以在微细胞内和微细胞表面上携带至少两种生物活性化合物。此类蛋白质的非限制性实例包括但不限于ACC-脱氨酶、纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。

在一些实施方案中，蛋白质是用作生物防治化合物的脂肪酶。在其他实施方案中，蛋白质是用作生物刺激化合物的脂肪酶。在另外的实施方案中，蛋白质是用作生物刺激化合物的ACC脱氨酶。在一些实施方案中，蛋白质是用作生物防治化合物的脂肪酶。在其他实施方案中，蛋白质是用作生物刺激化合物的脂肪酶。在另外的实施方案中，蛋白质是用作生物刺激化合物的ACC脱氨酶。

在一些实施方案中，微细胞表达包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分的融合蛋白，其中所述靶细胞降解部分包含角质酶和纤维素。

本公开教导了在发酵循环期间通过利用微生物的RNA合成和不对称分裂能力生产和包封RNA生物分子，包括反义核酸、dsRNA、shRNA、siRNA、miRNA、核酶或适体。这种基于去核细胞的平台和/或工业制剂解决了三个对将核糖核酸(RNA)递送到系统构成了巨大挑战的关键问题：(1)RNA的可扩展合成和包封；(2)合成的/包封的寡核苷酸有效负载必须在所述过程中存活下来；(3)靶向递送该RNA生物分子，使得其到达感兴趣的组织或细胞并引发所需的表型反应。目前的RNA递送形式是siRNA与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的直接偶联，将RNA(通常经过化学修饰)与阳离子脂质和其他赋形剂一起配制保护寡核苷酸以免环境压缩其尺寸，进行化学修饰以稳定用于RNAi应用的寡核苷酸，诸如用2'-甲氧基和2'-氟部分替代核糖环上的2'-羟基基团。对于dsRNA生产，与体内细菌生产dsRNA相比，体外转录难以置信地昂贵。还有用于生产dsRNA的无细胞和蛋白质衣壳工艺。由于改良物种的增殖，细菌模型伴随着环境污染的风险。这种增殖可能对环境中自然存在的物种具有不利和不可预见的后果。微细胞是由自然发生的突变产生的。使用微细胞来纯化和递送RNA允许利用发酵的益处来扩展dsRNA生产，而没有与使用遗传修饰细菌相关的风险。与使用遗传修饰的细菌作为生物杀虫剂相比，使用微细胞来递送原毒素和酶也更好。

包封在由本公开的受控制的生物处理系统产生的微细胞中的有效负载可以选自多种药剂，例如，包括生物分子(包括例如酶、蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸)、农用药剂(包括合成农用化学品和本文教导的生物活性剂)。农用药剂可以包括但不限于抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、核酸、质粒、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、DNA结合化合物、激素、维生素、蛋白质、肽、多肽、杀虫剂、杀昆虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀线虫剂和精油。

在一些实施方案中，所述微细胞能够包封农用药剂。在一些实施方案中，所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。在一些实施方案中，所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。在一些实施方案中，所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。在一些实施方案中，核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。在一些实施方案中，精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

生物处理系统

在大多数情况下，细菌或酵母的培养适用于摇瓶，并且细胞适用于培养皿中或T形烧瓶摇瓶、细胞培养皿和具有许多与细胞培养相关的应用的T形烧瓶。在本公开中，在实验室中使用摇瓶系统培养生长的原核细胞被认为是不受控制的生物处理系统。

本公开教导生物反应器和发酵罐是允许更大量的细胞/微生物/产物、增加的培养效率、改善的产物质量和/或增强的细胞生长再现性的受控制的的生物处理系统。

从广义上讲，生物反应器和发酵罐是生产细胞或生物体的培养系统。它们用于各种应用，包括基础研究和开发，以及生物制药、食品和食品添加剂、化学品和其他产品的制造。可以在生物反应器和发酵罐中培养广泛的细胞类型和生物体，包括细胞(如哺乳动物细胞系、昆虫细胞和干细胞)、微生物(如细菌、酵母和真菌)以及植物细胞和藻类。培养细菌、酵母或真菌的本领域技术人员经常使用术语发酵罐，而术语生物反应器通常涉及哺乳动物细胞的培养。

在本公开中，生物反应器和发酵罐可互换使用，因为它们基本上是指同一事物。

在一些实施方案中，生物反应器是指培养容器。

在一些实施方案中，生物反应器是1升生物反应器、2升生物反应器、3升生物反应器、4升生物反应器、5升生物反应器、6升生物反应器、7升生物反应器、8升生物反应器、9升生物反应器、10升生物反应器、15升生物反应器、20升生物反应器、100升生物反应器、1000升生物反应器或10,000升生物反应器，包括介于其间的所有值和范围。

在一些实施方案中，用于商业生产的生物反应器是至少10,000升生物反应器、至少20,000升生物反应器、至少30,000升生物反应器、至少40,000升生物反应器、至少50,000升生物反应器、至少60,000升生物反应器、至少70,000升生物反应器、至少80,000升生物反应器、至少90,000升生物反应器、至少100,000升生物反应器、至少200,000升生物反应器、至少300,000升生物反应器、至少400,000升生物反应器、或至少500,000升生物反应器，包括介于其间的所有值和范围。

在其他实施方案中，反应器是具有介于1ml至250ml之间的工作体积的生物反应器。在另外的实施方案中，反应器小至在多孔微量滴定板上的100μl孔，或甚至小至微芯片，或包括介于其间的所有值和范围。

在一些实施方案中，培养容器的尺寸取决于实验参数，诸如细胞类型的数量、培养基的数量、待测试的不同条件的数量等。熟练的技术人员可以容易地确定待使用的适当的细胞培养容器。

在实施方案中，可能的培养容器包括但不限于比色皿、培养板诸如6孔板、24孔板、48孔板和96孔板、培养皿、微芯片、1升或更大的生物反应器、细胞培养烧瓶、滚瓶、培养管、培养小瓶(例如，3、4或5ml小瓶)、软袋等。本公开教导任何类型的容器都可以用作培养容器。

在一个实施方案中，细胞培养在生物反应器罐(也称为容器)中进行，并且通过搅拌(而不是摇动)来混合培养物。搅拌罐生物反应器有不同的尺寸(适用于几毫升到数千升的培养物)。

在一些实施方案中，搅拌罐生物反应器可以用于本公开的微细胞生产。生物反应器由受控制的生物处理系统运行，而摇床或培养箱由不受控制的生物处理系统运行。

如本文所用，“不受控制的生物处理系统”是指培养或发酵/培养参数(诸如pH、温度、溶解氧、气流速率、进料速率、生长速率等)无法在整个生物处理过程中控制和维持所需设定值的生物处理系统。用于细胞培养或生物材料生产的摇床或培养箱是不受控制的生物处理系统的实例。这些发酵/培养参数不能在摇床或培养箱系统中进行控制。

如本文所用，“受控制的生物处理系统”是指其中通过在整个生物处理过程中通过传感器连续监测和始终如一地将参数维持在所需的设定值来控制培养或发酵参数(诸如pH、温度、溶解氧、气流速率和进料速率)的生物处理系统。用于细胞培养的生物反应器或发酵罐是受控制的生物处理系统的实例。

如本文所用，“受控制的连续生物处理”是指通过部分收获批次的约5％至约95％的微细胞，然后补充培养基以继续发酵而连续运行的生物过程。受控制的生物处理不涉及裂解步骤，因此本公开教导受控制的生物处理系统可以连续地运行用于微细胞生产。也就是说，微细胞从批次中部分收获并纯化进一步的步骤，而受控制的生物过程在生物反应器的批次中继续。

本公开教导本文教导的生物处理系统是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理系统。在一些实施方案中，所述生产的微细胞被部分收获并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。在一些实施方案中，所述微细胞从生物反应器中的约1％至约99％、约2％至约98％、约3％至约97％、约4％至约95％、约5％至约90％的总细胞中收获。

生物反应器允许通过培养混合为细胞或微生物的生长创造最佳环境条件。在生物反应器中，用叶轮搅拌培养物。本公开教导不断地混合细菌细胞培养物。

通过用温度传感器连续地监测来控制培养基的温度。容器通常放置在热电偶套管中，用加热毯包裹或带有水套。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将温度控制在约10℃至约70℃、约15℃至约60℃、约20℃至约50℃、约25℃至约40℃、或约30℃至约37℃之间。在另外的实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将温度控制在约15℃至约45℃之间。

与摇床或培养箱不同，通常将生物反应器中的空气或纯氧气(例如来自压缩空气筒)引入培养物中。氧气对于培养物生长很重要，并且用DO传感器连续地测量溶解在培养基中的氧气量(溶解氧浓度，DO)。在一些实施方案中，生物反应器被设定为将DO保持在设定值。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将溶解氧(DO)(即溶解在给定介质中的氧)控制在0％至100％、约1％至约99％、约2％至约98％、约3％至约97％、约4％至约96％、或约5％至约95％之间。

在一些实施方案中，搅拌、气体流速和氧气浓度的最小值和最大值可以根据生物体和工艺需要进行优化。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将搅拌控制在约50至约10,000rpm或约100至约9,000rpm、或约200至约8000rpm之间。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将气流速率控制在约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)、约0.5至约15SLPM、或约1至约10SLPM之间。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将供应到受控制的生物过程系统中的氧气控制在0％至100％、约1％至约99％、约2％至约98％、约3％至约97％、约4％至约96％、或约5％至约95％之间。

在一些实施方案中，将氧气供应至系统以维持限定的值或范围。在另外的实施方案中，将氧气溶解在培养基中，并且溶解氧(DO)的设定水平被维持并可用于细菌消耗以供生长或发酵。

在生物反应器中，使用pH传感器连续地测量培养基pH，并且根据需要添加CO₂。对于生物反应器中的微生物培养，通常将碱性和酸性溶液用于调节pH。这与摇瓶中的培养物不同，摇瓶的培养物pH通常不受控制。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将pH控制在2-11或3-10之间。

将参数控制在设定值。在生物反应器中，不同的组分和控制软件一起工作，以将pH、温度和溶解氧控制在所需的设定值。使用pH、温度和DO传感器不断地测量所述参数。传感器将信息传输到生物过程控制软件，该软件调节CO₂和液体pH试剂的添加、调温装置的活动、搅拌以及空气和/或O₂的通气。

将生物反应器用于特定的实验或生产运行，其取决于生物体和应用可能持续数小时、数天或数周。在实施方案中，在本公开的受控制的生物处理系统中，可以将发酵时长控制在12小时至200小时或16小时至150小时之间。

生物过程运行通常包括以下步骤：

(1)预培养：用预培养物接种生物反应器中的培养基。预培养物可以在摇床或培养箱中生长，或者在较小的生物反应器中生长预培养物以接种较大的生物反应器；(2)生物反应器准备：与接种物制备平行准备生物反应器。准备包括生物反应器、进料管线和传感器的灭菌；向生物反应器中添加培养基；生物反应器与生物过程控制站点的连接；以及生物过程控制软件中工艺参数设定值的定义；(3)接种：将培养基接种到生物反应器中；(4)培养期(迟缓期、指数生长期、稳定期、稳定生长期)：采集培养物样品以分析生物量和代谢物浓度。最后，通过添加营养素溶液来补料培养物；(5)培养物收获：在达到静止生长期时收获培养物；(6)下游处理：对培养物肉汤进行进一步处理，包括但不限于可以通过盘式叠层离心纯化来自培养液肉汤的一个批次的细胞。可以过滤纯化物以进行浓缩。可以过滤(按细胞尺寸、长度或直径等)纯化批次的细胞以进行浓缩，然后作为液体浓缩物储存或通过冷冻干燥、真空干燥或加热干燥而干燥成粉末；(7)生物反应器清洗：对生物反应器进行灭菌以灭活培养物残余物并进行清洗。参见Ulrike Rasche.International BioPharm:bioprocessing basics,2020年6月(eppendorf.com/product-media/doc/en/897339/Fermentors-Bioreactors_Publication_Bioprocess_Bioprocessing-basics.pdf)

本公开教导了生物处理方法，所述生物处理方法包括以下步骤：(a)将至少一种细菌细胞株引入包含基本培养基的生物反应器环境中；(b)在所述生物反应器环境中培养来自(a)的所述细菌细胞株以生产无染色体微细胞群。在所述方法的实施方案中，所述细菌细胞株是生产微细胞的细菌细胞株。在所述方法的实施方案中，所述无染色体微细胞群由步骤(b)生产；(c)从步骤(b)收获包含所述细菌细胞和新生产的微细胞群的一个批次的细胞；(d)纯化所述批次的细胞；(e)从所述批次的细胞中过滤或分选出所述无染色体微细胞群；和(f)浓缩所述微细胞。在实施方案中，所述纯化是通过盘式叠层离心进行的。在实施方案中，所述浓缩的微细胞以液体形式或粉末形式储存。在实施方案中，所述粉末形式通过冷冻干燥、真空干燥或加热干燥所述浓缩的微细胞来制备。

上文所述的生物处理系统不限于细胞培养。本公开教导生物处理系统用于平行生产微细胞以优化条件、确定参数和/或进行比较研究。

在一些实施方案中，将用于微细胞生产的生物处理系统用于培养大量的微细胞。

本公开教导生物反应器可以允许可实现的更高培养物密度，而烧瓶和培养皿中的细胞生长达到稳定期而不进一步增加。

在一些实施方案中，可以进一步向生物反应器中的微生物细胞培养物提供生长限制因子，诸如营养素、氧气和温度控制。在生物反应器中，空气或纯氧气可以通过通气来供应，这比单独摇动或搅拌更有效。如果营养素变得有限，则生长停止。通过使用系统的集成泵添加补料溶液，可以非常轻松地自动补料生物反应器中的培养物。

取决于细胞系或微生物株，其他参数可能对培养物生长和/或产物形成至关重要，例如培养基pH、代谢物浓度、氧化还原电位和机械力。生物反应器是优化培养条件的宝贵工具。

本公开教导在受控制的生物处理系统中的生物反应器可以增加再现性。在生物反应器中，可以使用传感器不断地测量工艺参数，诸如pH、温度和溶解氧。传感器将信息传输到生物过程控制软件，该软件调节执行器(如泵、调温装置和充气装置)的动作，以将参数保持在设定值。监测、控制和记录过程值有助于增加培养物生长、产物形成、产物特征等的再现性。在一些实施方案中，在受控制的生物处理系统中的生物反应器可以增加由亲本细菌细胞生产的微细胞的再现性。

包括温度、培养基pH、DO、代谢物浓度、机械力和培养基组分在内的生物过程参数可能会影响培养物生长和产物产率(即微细胞产率)。工艺参数影响细胞活力、细胞行为和分化。在生物过程中，常规监测和控制温度、pH和DO。参见Ulrike Rasche.InternationalBioPharm:bioprocessing basics,2020年6月。

本公开教导了一种用于微细胞生产的生物处理系统，所述生物处理系统包括：(a)至少一个生物反应器；(b)用于微细胞生产的基本培养基；和(c)至少一种能够产生无染色体微细胞群的细菌细胞株。

在实施方案中，与富含营养的复合培养基(诸如LB或TB)相比，通过使用具有成本效益的碳源和氮源以及最少量的其他成分(诸如痕量金属和维生素)，基本培养基在商业上是可扩展的。基本培养基用于使用生物反应器或发酵罐的受控制的生物处理系统，并且复合培养基用于使用摇床或培养箱的不受控制的生物处理系统。

如本文所用，“生产微细胞的细胞”是指能够生产无染色体微细胞(即微细胞)群的细胞株。在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞是指能够生产无染色体微细胞(即微细胞)群的细菌细胞。

在生物处理系统的一些实施方案中，所述生物反应器被布置用于维持被配置成提供所述无染色体微细胞群的连续生物过程。

在生物处理系统的另外的实施方案中，所述生物处理系统中的微细胞生产产率是在不受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或至少20倍。

在一些实施方案中，所述不受控制的生物处理系统是培养箱系统或摇瓶系统。

在一些实施方案中，所述微细胞的尺寸范围为约100至约900nm、约150至约800nm、约200至约700nm、或约250至约650nm。

在一些实施方案中，所述生物处理之后的微细胞比率为生物反应器中的总细胞的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％。

微细胞生产的细胞培养或发酵参数

在生物反应器中独特控制的生长速率、营养素供应、生物量密度和一般原理与赋予这种高生产产率的微细胞生产株一起可以与其同时公开。

与细胞生长相比，微细胞生产更类似于生物分子(诸如蛋白质)生产，因为在限定的参数内观察到微细胞产生，然而如果不在如表1所呈现的适当参数(温度、溶解氧、搅拌、气流速率等)内，则在组成型微细胞生产细胞系中发生细胞生长而没有微细胞产生。

表1.微细胞生产的发酵参数

本公开教导了一种用于微细胞生产的生物处理系统，所述生物处理系统包括：(a)至少一个生物反应器；(b)用于微细胞生产的基本培养基；和(c)至少一种能够产生无染色体微细胞群的细菌细胞株。

在生物处理系统的一些实施方案中，所述生物反应器设置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长。

在实施方案中，所述进料速率为0至约10mL/min/L。在实施方案中，所述温度为约10℃至约70℃。在实施方案中，所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。在实施方案中，所述溶解氧为0至100％。在实施方案中，所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。在实施方案中，所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。在实施方案中，所述氧气为0至100％。在实施方案中，所述pH为约3至约10。在实施方案中，所述接种物为约0.1％至约20％。在实施方案中，所述发酵时长为约12小时至约200小时。在一些实施方案中，所述碳源是甘油或葡萄糖。

通过评估营养缺陷型和原养型微细胞生产株来分析微细胞生产。一旦在基于表1中所述的参数的生物反应器中生长，两种类型的微细胞生产株都显示出意外的微细胞生产增加。原养型株在生物反应器环境中生产更多的微细胞。

本公开教导营养缺陷型株可以被校正、修饰、突变或基因工程化。当在生物反应器条件下生长时，营养缺陷型被校正的株会发生反应。在一些实施方案中，营养缺陷型被校正的株能够在发酵参数下生长。本公开提供了在给定条件下不仅从原养型株而且还从营养缺陷型被校正、修饰、突变或基因工程化的株观察到微细胞生产的显著增加。

营养缺陷型和原养型是替代表型。营养缺陷型生物是无法产生其生长所必需的特定有机化合物的生物体，而原养型生物是可以从无机化合物合成其生长所必需的全部有机化合物的生物体。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株可以是营养缺陷型株。在其他实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株可以是其营养缺陷型被校正的营养缺陷型株。校正或减轻的营养缺陷性状可以通过对与营养缺陷性状相关的基因进行遗传修饰、突变或基因/基因组编辑技术来获得。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株可以是原养型株。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠埃希氏菌、沙门氏菌属(Salmonella)物种(包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、志贺氏菌属(Shigella)物种(包括福氏志贺氏菌(Shigella flexneri))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、农杆菌属(Agrobacterium)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)和嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。在一些实施方案中，生产微细胞的革兰氏阴性细菌可以生产由与细胞分裂和/或染色体分配相关的内源性或外源性突变自然地引起的微细胞。在一些实施方案中，生产微细胞的细菌包含参与细胞分裂和/或染色体分配的内源性或外源性基因，其中与对应的野生型基因相比，所述基因诸如通过同源重组被遗传修饰。在一些实施方案中，生产微细胞的革兰氏阴性细菌自然地和/或通过基因工程技术缺乏蛋白酶和/或其活性。在一些实施方案中，生产蛋白酶缺乏的微细胞的革兰氏阴性细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含参与本公开中公开的感兴趣的蛋白质的一个或多个基因。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株来源于选自由以下组成的组的细菌属：埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)和农杆菌属。在另外的实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株来源于选自由以下组成的组的细菌物种：大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌和铜绿假单胞菌。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株(诸如R1、P8-T7和P826株)是衍生自可商购获得的株诸如BL21和P678-54的多种株。在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株(诸如R1、P8-T7和P826株)是通过对可商购获得的菌株(诸如BL21和P678-54)的遗传修饰、自然存在的或人工诱导的突变、基因工程或基因/基因组编辑技术产生的多种株。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌可以是革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium Glutamicum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、或链球菌属(Streptococcus)物种。在一些实施方案中，生产微细胞的革兰氏阳性细菌可以生产由与细胞分裂和/或染色体分配相关的内源性或外源性突变自然地引起的微细胞。在一些实施方案中，生产微细胞的革兰氏阳性细菌包含参与细胞分裂和/或染色体分配的内源性或外源性基因，其中与对应的野生型基因相比，所述基因诸如通过同源重组被遗传修饰。在一些实施方案中，生产微细胞的革兰氏阳性细菌自然地和/或通过基因工程技术缺乏蛋白酶和/或其活性。在一些实施方案中，生产蛋白酶缺乏的微细胞的革兰氏阳性细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含参与本公开中公开的感兴趣的蛋白质的一个或多个基因。

在一些实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株来源于选自由以下组成的组的细菌属：芽孢杆菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)和乳杆菌属。在另外的实施方案中，生产微细胞的细菌细胞株来源于选自由以下组成的组的细菌物种：枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和嗜酸乳杆菌。

本公开教导了一种用于微细胞生产的生物处理系统，所述生物处理系统包括：(a)至少一个生物反应器；(b)用于微细胞生产的基本培养基；和(c)至少一种能够产生无染色体微细胞群的细菌细胞株。

以受控制的方式进行生物处理的方法

本公开教导了生物处理方法，所述生物处理方法包括以下步骤：(a)将至少一种细菌细胞株引入包含基本培养基的生物反应器环境中；(b)在所述生物反应器环境中培养来自(a)的所述细菌细胞株以生产无染色体微细胞群。在所述方法的实施方案中，所述细菌细胞株是生产微细胞的细菌细胞株。在所述方法的实施方案中，所述无染色体微细胞群由步骤(b)生产。在所述方法的实施方案中，所述生物反应器环境被配置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长。在所述方法的实施方案中，在所述生物处理中的所述微细胞生产产率是在不受控制的生物处理中的微细胞生产产率的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或至少20倍。

在实施方案中，所述方法包括以下步骤：(c)从步骤(b)收获包含所述细菌细胞和新生产的微细胞群的一个批次的细胞；(d)纯化所述批次的细胞；(e)从所述批次的细胞中过滤或分选出所述无染色体微细胞群；和(f)浓缩所述微细胞。

在实施方案中，所述纯化是通过盘式叠层离心进行的。在实施方案中，所述浓缩的微细胞以液体形式或粉末形式储存。在实施方案中，所述粉末形式通过冷冻干燥、真空干燥或加热干燥所述浓缩的微细胞来制备。

在实施方案中，所述生物处理是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理。在实施方案中，部分地收获所述生产的微细胞并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。在实施方案中，从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

在所述方法的实施方案中，所述进料速率为0至约10mL/min/L。在所述方法的实施方案中，所述温度为约10℃至约70℃。在所述方法的实施方案中，所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。在所述方法的实施方案中，所述溶解氧为0至100％。在所述方法的实施方案中，所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。在所述方法的实施方案中，所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。在所述方法的实施方案中，所述氧气为0至100％。在所述方法的实施方案中，所述pH为约3至约10。在所述方法的实施方案中，所述接种物为约0.1％至约20％。在所述方法的实施方案中，所述发酵时长为约12小时至约200小时。在所述方法的实施方案中，所述微细胞的长度为约150nm至约950nm。在所述方法的实施方案中，所述碳源是甘油或葡萄糖。在所述方法的实施方案中，所述不受控制的生物处理是培养箱环境或摇瓶环境的。

在所述方法的实施方案中，所述微细胞能够包封农用药剂。在实施方案中，所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。在实施方案中，所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。在实施方案中，所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。在实施方案中，核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。在实施方案中，精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。在实施方案中，所述微细胞的尺寸范围为约100至约900nm、约150至约800nm、约200至约700nm、或约250至约650nm。

在实施方案中，所述生物处理之后的微细胞比率为生物反应器中的总细胞的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％。

本公开教导了一种通过此处所述的方法生产的微细胞。在一些实施方案中，在所述生物处理环境中生产的所述微细胞是在不受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。在一些实施方案中，发酵参数列于表1中。

实施例

以下实施例是为了说明本公开的各种实施方案的目的而给出的，并不意味着以任何方式限制本公开。本领域技术人员将会想到如权利要求的范围所定义的、在其中的变化和在本公开的精神内涵盖的其他用途。

实施例1-从株P678-54产生株P6*

根据发明人所进行的实验，大肠埃希氏菌株P678-54是营养缺陷型的。参见Adler等人,Genetic control of cell division in bacteria,154Science 417(1966)，以及Adler等人(Miniature Escherichia coli cells deficient in DNA,57Proc.Nat.Acad.Sci(Wash.)321(1967)，也得到Adler 1966的支持)。基于测序分析，观察到株P678-54基因组中相对于大肠埃希氏菌株MG1655的营养缺陷型突变。

对株P678-54的基因组进行修饰，以校正与营养缺陷性状相关的基因突变，从而减轻营养缺陷型。可以使用本领域熟知的自然定向进化或基因/基因组编辑技术同时校正靶基因。

通过DNA测序确认突变，并且通过在具有和没有亮氨酸和/或苏氨酸的基本培养基上铺板来测试营养缺陷型。

营养缺陷型被校正后，从P678-54产生了新的株(P6*)。与包括R1在内的其他生产微细胞的株一样，具有较小遗传修饰的P6*被用作生产微细胞的株。

P6*株可以产生高水平的微细胞，并且能够在限定的生物反应器培养基配方中生长。由于营养缺陷型固定在上文所述的P6*株中，因此实现了其可扩展的生长和高微细胞产率。基因工程化P6*株允许在限定的培养基上生长，使得能够实现具有成本效益的可扩展微细胞生产。

实施例2–不受控制的生物处理系统中的微细胞生产

为了理解不受控制的生物处理系统(即无法控制发酵/培养参数的摇瓶系统未精确控制)中的微细胞生产产率，将如实施例1中所述的能够生产微细胞的亲本细菌株P6*群体接种到摇瓶系统中未限定的LB、TB或类似的复合培养基中。将所述株孵育16小时，并且在接种后1小时、2小时、3小时和16小时观察微细胞生产产率。在摇瓶系统中将温度设定在37℃。在本实施例中，在一个时间进程中的微细胞生产产率为4次独立运行的平均值，并且在每个时间点取平均值。

图1A-1D示出了在第1小时(图1A)、第2小时(图1B)、第3小时(图1C)和第16小时(图1D)在不受控制生物过程(摇瓶系统)中在未限定的复合LB、TB或类似复合培养基中于37℃生长的微细胞生产的时间进程。在约0.5um的捕获微细胞的第一个峰处检测到新产生的微细胞群，并且在>1um的捕获亲本细菌细胞的第二个峰处检测到亲本细菌株P6*。数据来自n＝4次重复运行。通过从不同孵育时间(1小时；2小时；3小时；和16小时)的总微细胞/总对象(微细胞和亲本细菌细胞两者)的百分比来计算微细胞比率(％)。本实施例证明了如图1E所示，当利用使用摇床的不受控制的生物处理系统时平均微细胞比率为<40％。

实施例3–受控制的生物处理系统中的微细胞生产

为了测试在受控制的生物处理系统(即精确控制并且不断地维持发酵/培养参数的生物反应器/发酵罐系统)中增强的微细胞产率，将能够生产微细胞的亲本细菌株P6*接种到生物反应器/发酵罐系统中的限定的基本培养基中。生物反应器/发酵罐系统被设定为如表1所呈现的用于生产微细胞的发酵参数。在接种亲本细菌株后36小时观察到微细胞生产产率。在生物反应器/发酵罐系统中温度被设定为37℃。

从不同天数的四次独立受控制的生物过程运行中测量微细胞生产；运行1(图2A)、运行2(图2B)、运行3(图2C)和运行4(图2D)。图2A-2D示出了在受控制的生物过程(生物反应器/发酵罐系统)中从基本培养基中于37℃生长的P6*细菌株生产微细胞的四次单独运行。在图2A-2D中，在约0.5um处观察到捕获微细胞的第一个峰，并且在>1um处观察到捕获亲本细菌细胞的第二个峰。如图2A-2D所显示，数据来自n＝4次重复运行。通过在发酵时间点结束时(即在36小时时)总微细胞/总对象(微细胞和亲本细菌细胞两者)的百分比来计算微细胞比率(％)。如图2E所示，本实施例证明在不同时间点的平均微细胞比率>65％。

当与不受控制的生物过程运行中的微细胞生产(图1E)相比时，这些来自4次独立受控制的生物过程运行的数据点(图2E)显示增强的微细胞生产的一致性。受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率(图2A-2E)显示出为不受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率(图1A-1E)的至少1.5倍。

实施例4–受控制的生物处理系统中不同发酵参数的影响

测试了不同范围的发酵参数以了解各种参数如何影响微细胞生产。在受控制的生物处理系统中用诸如氧气传输(如通过OUR测量的)(图4A)、气流(VVM)(图4B)和氧气(O₂)供应(图4C)等发酵参数组合进行了12次单独的生物反应器运行(BR1-12)。OUR是摄氧速率，其是细胞生长有多快的指标。最大OD583是使用P6*株的最大生物量的量度。对于所有12次运行，基本培养基中的碳源都是甘油。

图3呈现了在受控制的生物过程中在受控制的生物处理系统的各种参数组合(诸如OUR、VVM和O₂中的增强的微细胞生产(约63％至约89％)。此外，在受控制的生物过程设置中在12次单独微细胞生产运行中观察到与生物量相关的其他输出(最大OD583和最大OD583时间点)。氧气“0”表示生物反应器中除正常空气外没有另外供应氧气，并且氧气“1”表示补充氧气以丰富正常空气中的O₂水平。图3中的数据表明在多种生物过程控制参数组合中微细胞生产效率＞63％。参数变量是高度相互关联的。

该实验表明在图3中限定的发酵参数中微细胞生产被增强。然而，增强的微细胞生产并不总是与增强的生物量产生(最大OD583)相关。因此，此处所描述的用于增强微细胞生产的受控制的生物过程与专门用于生物量产生的受控制的生物过程是有区别和不同的。

图4A-4C示出了各种参数对微细胞生产的影响。氧气传输/摄取(如通过OUR测量的)与微细胞生产产率的关系(图4A)、气流(VVM)与微细胞生产产率的关系(图4B)和氧气(O₂)供应与微细胞生产产率的关系(图4C)。这些数据表明增加的氧气传输(如通过OUR测量的)与增强的微细胞生产直接相关。然而，VVM与微细胞生产(％)的相关性不如OUR强。

实施例5–受控制的生物处理系统中温度的影响

为了测试温度是否影响受控制的生物处理系统中的微细胞生产，对株P826设定不同的温度设置(从15℃到45℃)以生产微细胞。

图5示出了微细胞比率随温度而变化，并且微细胞生产产率从约18℃增加到约30℃至37℃。

为了比较另一种生产微细胞的株(P826)的微细胞生产产率，将复合培养基中的P826株接种在不受控制的摇瓶系统中并且在25℃下孵育以进行微细胞生产(图6A)，而将基本培养基中的P826株接种在pH 6.7和约30％的DO的受控制的生物反应器系统中并且在25℃下培养以进行微细胞生产(图6B)。图6A表明微细胞(第1个峰)的生产比例小于亲本P826细胞(第2个峰)的1/3，而图6B显示微细胞(第1个峰)与亲本P826细胞(第2个峰)的比率为约1:1(或0.8:1)。此外，图6B中生产的微细胞的数量是图6A中生产的微细胞数量的至少8倍。图6A表明微细胞比率小于细胞总数(微细胞和亲本P826细胞)的25％，而图6B表明在受控制的生物过程系统中在限定的发酵参数范围内微细胞产生增强(至少45％微细胞比率)。

图6C-6D展示了除了温度设定为35℃外实验设置相同的类似微细胞产生模式。图6C表明微细胞(第1个峰)的生产比例为亲本P826细胞(第2个峰)的约一半，而图6D显示微细胞(第1个峰)与亲本P826细胞(第2个峰)的比率为约1:1(或0.9:1)。此外，图6D中生产的微细胞的数量是图6C中生产的微细胞数量的至少8倍。图6C表明微细胞比率小于细胞总数的33％，而图6D表明在受控制的生物过程系统中在限定的发酵参数范围内微细胞产生增强(至少45％微细胞比率)。

图6B和6D表明与图6A和6C相比在受控制的生物处理系统中通过使用表1中列出的控制参数增强了微细胞生产。

实施例6–用限定的发酵参数在受控制的生物处理系统中从表达生物分子的细菌株生产微细胞

在表1中的限定范围内，在受控制的生物处理系统中测试了生物分子(RNA/蛋白质/代谢物)表达株的微细胞生产。将还携带至少一种表达不同双链RNA的构建体的两种生产微细胞的细胞系(P8-T7和R1细菌株)用于测试在受控制的生物处理系统中生产微细胞的效率。图7A-7D示出了用表1中列出的限定的参数在受控制的生物处理系统中从携带不同构建体的四种单独的株获得的微细胞生产增强。微细胞生产为总细胞的至少50％(图7A)、总细胞的至少40％(图7B)、总细胞的至少65％(图7C)和总细胞的至少60％(图7D)。

作为对照，测试携带表达dsRNA以控制昆虫的构建体的R1株之一在受控制的生物处理系统中但在限定的参数(即pH在表1中列出的限定参数范围之外，并且不受控制)之外的微细胞生产的效率。图7E示出了来自所述株的微细胞生产明显更低(总细胞的约25％或更少)。

这些数据表明，即使在受控制的生物处理系统中，表1中的限定参数也提供更高的微细胞生产产率。

本公开的编号的实施方案

尽管有随附的权利要求，但是本公开提出了以下编号的实施方案：

1.一种用于微细胞生产的生物处理系统，所述生物处理系统包括：

(a)至少一个生物反应器；

(b)用于微细胞生产的基本培养基；和

(c)至少一种能够产生无染色体微细胞群的细菌细胞株；

其中所述生物反应器被布置用于维持被配置成提供所述无染色体微细胞群的连续生物过程，

其中所述生物反应器设置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长，并且

其中所述生物处理系统中的微细胞生产产率是不受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率的至少1.1倍。

2.如实施方案1所述的生物处理系统，其中所述进料速率为0至约10mL/min/L。

3.如实施方案1-2中任一项所述的生物处理系统，其中所述温度为约10℃至约70℃。

4.如实施方案1-3中任一项所述的生物处理系统，其中所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。

5.如实施方案1-4中任一项所述的生物处理系统，其中所述溶解氧为0至100％。

6.如实施方案1-5中任一项所述的生物处理系统，其中所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。

7.如实施方案1-6中任一项所述的生物处理系统，其中所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。

8.如实施方案1-7中任一项所述的生物处理系统，其中所述氧气为0至100％。

9.如实施方案1-8中任一项所述的生物处理系统，其中所述pH为约3至约10。

10.如实施方案1-9中任一项所述的生物处理系统，其中所述接种物为约0.1％至约20％。

11.如实施方案1-10中任一项所述的生物处理系统，其中所述发酵时长为约12至约200小时。

12.如实施方案1-11中任一项所述的生物处理系统，其中所述微细胞的长度为约150nm至约950nm。

13.如实施方案1-12中任一项所述的生物处理系统，其中所述碳源是甘油或葡萄糖。

14.如实施方案1-13中任一项所述的生物处理系统，其中所述不受控制的生物处理系统是培养箱系统或摇瓶系统。

15.如实施方案1-14中任一项所述的生物处理系统，其中所述微细胞能够包封农用药剂。

16.如实施方案15所述的生物处理系统，其中所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。

17.如实施方案16所述的生物处理系统，其中所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。

18.如实施方案16所述的生物处理系统，其中所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。

19.如实施方案18所述的生物处理系统，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。

20.如实施方案18所述的生物处理系统，其中所述精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

21.如实施方案1-20中任一项所述的生物处理系统，其中在所述生物处理之后的微细胞比率是生物反应器中总细胞的至少40％。

22.如实施方案1-21中任一项所述的生物处理系统，其中所述生物处理系统是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理系统。

23.如实施方案22所述的生物处理系统，其中部分地收获所述生产的微细胞并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。

24.如实施方案23所述的生物处理系统，其中从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

25.一种生物处理方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将至少一种细菌细胞株引入包含基本培养基的生物反应器环境中；

(b)在所述生物反应器环境中培养来自(a)的所述细菌细胞株以生产无染色体微细胞群，

其中所述细菌细胞株是生产微细胞的细菌细胞株，

其中所述无染色体微细胞群由步骤(b)生产，

其中所述生物反应器环境配置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长，并且

其中在所述生物处理中的所述生产的微细胞产率是在不受控制的生物处理中的微细胞生产产率的至少1.1倍。

26.如实施方案25所述的方法，其中所述进料速率为0至约10mL/min/L。

27.如实施方案25-26中任一项所述的方法，其中所述温度为约10℃至约70℃。

28.如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。

29.如实施方案25-28中任一项所述的方法，其中所述溶解氧为0至100％。

30.如实施方案25-29中任一项所述的方法，其中所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。

31.如实施方案25-30中任一项所述的方法，其中所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。

32.如实施方案25-31中任一项所述的方法，其中所述氧气为0至100％。

33.如实施方案25-32中任一项所述的方法，其中所述pH为约3至约10。

34.如实施方案25-33中任一项所述的方法，其中所述接种物为约0.1％至约20％。

35.如实施方案25-34中任一项所述的方法，其中所述发酵时长为约12至约200小时。

36.如实施方案25-35中任一项所述的方法，其中所述微细胞的长度为约150nm至约950nm。

37.如实施方案25-36中任一项所述的方法，其中所述碳源是甘油或葡萄糖。

38.如实施方案25-37中任一项所述的方法，其中所述不受控制的生物处理在培养箱环境或摇瓶环境中进行。

39.如实施方案25-38中任一项所述的方法，其中所述微细胞能够包封农用药剂。

40.如实施方案39所述的方法，其中所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。

41.如实施方案40所述的方法，其中所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。

42.如实施方案40所述的方法，其中所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。

43.如实施方案42所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。

44.如实施方案42所述的方法，其中所述精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

45.如实施方案25-44中任一项所述的方法，其中在所述生物处理之后的微细胞比率是生物反应器中总细胞的至少40％。

46.如实施方案25所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

(c)从步骤(b)收获包含所述细菌细胞和新生产的微细胞群的一个批次的细胞；

(d)纯化所述批次的细胞；

(e)从所述批次的细胞中过滤或分选出所述无染色体微细胞群；和

(f)浓缩所述微细胞。

47.如实施方案46所述的方法，其中所述纯化通过盘式叠层离心进行。

48.如实施方案46所述的方法，其中所述浓缩的微细胞以液体形式或粉末形式储存。

49.如实施方案48所述的方法，其中所述粉末形式通过冷冻干燥、真空干燥或加热干燥所述浓缩的微细胞来制备。

50.如实施方案25或46所述的方法，其中所述生物处理是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理。

51.如实施方案25或46所述的方法，其中部分地收获所述生产的微细胞并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。

52.如实施方案51所述的生物处理系统，其中从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

53.一种微细胞，其通过如实施方案25或46所述的方法生产。

54.如实施方案53所述的微细胞，其中在所述生物处理环境中生产的所述微细胞是在不受控制的生物处理环境中生产的微细胞的至少1.1倍。

55.如实施方案1、25或46所述的发酵参数，其中所述发酵参数列于表1中。

以引用的方式并入

出于所有目的，将所有本文引用的参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请都以全文引用的方式并入。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公布和专利申请的提及不被视为并且不应该被视为承认或以任何形式暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

*****

美国专利号3,467,604

美国专利申请号2012/0016022

美国专利申请号2012/0016022

美国专利申请号2016/0174571

国际专利申请号WO 09/013361

国际专利申请号WO2018/201160

国际专利申请号WO2018/201161

国际专利申请号WO2019/060903

国际专利申请号WO2021/133846

Claims (55)

1.一种用于微细胞生产的生物处理系统，所述生物处理系统包括：

(a)至少一个生物反应器；

(b)用于微细胞生产的基本培养基；和

(c)至少一种能够产生无染色体微细胞群的细菌细胞株；

其中所述生物反应器被布置用于维持被配置成提供所述无染色体微细胞群的连续生物过程，

其中所述生物反应器设置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长，并且

其中所述生物处理系统中的微细胞生产产率是不受控制的生物处理系统中的微细胞生产产率的至少1.1倍。

2.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述进料速率为0至约10mL/min/L。

3.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述温度为约10℃至约70℃。

4.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。

5.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述溶解氧为0至100％。

6.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。

7.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。

8.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述氧气为0至100％。

9.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述pH为约3至约10。

10.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述接种物为约0.1％至约20％。

11.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述发酵时长为约12至约200小时。

12.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述微细胞的长度为约150nm至约950nm。

13.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述碳源是甘油或葡萄糖。

14.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述不受控制的生物处理系统是培养箱系统或摇瓶系统。

15.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述微细胞能够包封农用药剂。

16.如权利要求15所述的生物处理系统，其中所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。

17.如权利要求16所述的生物处理系统，其中所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。

18.如权利要求16所述的生物处理系统，其中所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。

19.如权利要求18所述的生物处理系统，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。

20.如权利要求18所述的生物处理系统，其中所述精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

21.如权利要求1所述的生物处理系统，其中在所述生物处理之后的微细胞比率是生物反应器中总细胞的至少40％。

22.如权利要求1所述的生物处理系统，其中所述生物处理系统是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理系统。

23.如权利要求22所述的生物处理系统，其中部分地收获所述生产的微细胞并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。

24.如权利要求23所述的生物处理系统，其中从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

25.一种生物处理方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将至少一种细菌细胞株引入包含基本培养基的生物反应器环境中；

(b)在所述生物反应器环境中培养来自(a)的所述细菌细胞株以生产无染色体微细胞群，

其中所述细菌细胞株是生产微细胞的细菌细胞株，

其中所述无染色体微细胞群由步骤(b)生产，

其中所述生物反应器环境配置有选自下组的发酵参数：进料速率、温度、成分、溶解氧、搅拌速度、气流速率、氧气、pH、接种物和发酵时长，并且

其中在所述生物处理中的所述生产的微细胞产率是在不受控制的生物处理中的微细胞生产产率的至少1.1倍。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述进料速率为0至约10mL/min/L。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述温度为约10℃至约70℃。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述成分包括碳源、痕量金属、维生素、缓冲剂、氮源、消泡剂、另外的生长促进成分。

29.如权利要求25所述的方法，其中所述溶解氧为0至100％。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述搅拌速度为约50至约10,000rpm。

31.如权利要求25所述的方法，其中所述气流速率为约0.1至约20标准升/分钟(SLPM)。

32.如权利要求25所述的方法，其中所述氧气为0至100％。

33.如权利要求25所述的方法，其中所述pH为约3至约10。

34.如权利要求25所述的方法，其中所述接种物为约0.1％至约20％。

35.如权利要求25所述的方法，其中所述发酵时长为约12至约200小时。

36.如权利要求25所述的方法，其中所述微细胞的长度为约150nm至约950nm。

37.如权利要求25所述的方法，其中所述碳源是甘油或葡萄糖。

38.如权利要求25所述的方法，其中所述不受控制的生物处理在培养箱环境或摇瓶环境中进行。

39.如权利要求25所述的方法，其中所述微细胞能够包封农用药剂。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述农用药剂是农用化学化合物或生物活性化合物。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述农用化学化合物选自由以下组成的组：杀虫剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述生物活性化合物选自核酸、肽、蛋白质、精油及其组合。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义核酸、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、适体及其组合。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述精油包括香叶醇、丁香酚、染料木黄酮、香芹酚、百里酚、除虫菊或香芹酚。

45.如权利要求25所述的方法，其中在所述生物处理之后的微细胞比率是生物反应器中总细胞的至少40％。

46.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

(c)从步骤(b)收获包含所述细菌细胞和新生产的微细胞群的一个批次的细胞；

(d)纯化所述批次的细胞；

(e)从所述批次的细胞中过滤或分选出所述无染色体微细胞群；和

(f)浓缩所述微细胞。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述纯化通过盘式叠层离心进行。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述浓缩的微细胞以液体形式或粉末形式储存。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述粉末形式通过冷冻干燥、真空干燥或加热干燥所述浓缩的微细胞来制备。

50.如权利要求25或46所述的方法，其中所述生物处理是能够连续地生产无染色体微细胞群的受控制的连续生物处理。

51.如权利要求25或46所述的方法，其中部分地收获所述生产的微细胞并且所述生物处理系统连续地运行以生产另一个无染色体微细胞群。

52.如权利要求51所述的生物处理系统，其中从所述生物反应器中的总细胞的约5％至约90％部分地收获所述微细胞。

53.一种微细胞，其通过如权利要求25或46所述的方法生产。

54.如权利要求53所述的微细胞，其中在所述生物处理环境中生产的所述微细胞是在不受控制的生物处理环境中生产的微细胞的至少1.1倍。

55.如权利要求1、25或46所述的发酵参数，其中所述发酵参数列于表1中。