ES2817001T3 - Producción de FDCA catalizada por deshidrogenasa - Google Patents

Abstract

Proceso para oxidar ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (HMFCA) a ácido 5-formil-2-furoico (FFA), donde el proceso comprende la etapa de incubar una célula en presencia de HMFCA, preferiblemente en condiciones propicias para la oxidación de HMFCA por la célula, donde la célula comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la SEC ID N.º: 11, y donde el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de FDCA catalizada por deshidrogenasa

Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a los campos de la enzimología, genética molecular, biotransformación y tecnología de fermentación. En particular, la invención se refiere a deshidrogenasas que oxidan el ácido 5-(hidroximetil)-2-furoico en ácido 5-formil-2-furoico, y a polinucleótidos que codifican dichas deshidrogenasas y su uso en la biotransformación de hidroximetilfurfural en ácido 2,5-furandicarboxílico.

Antecedentes de la invención

[0002] El ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA) es un compuesto monomérico que se puede aplicar en la producción de poliésteres que tienen un tremendo impacto económico. Un compuesto muy importante en el campo es el polietilentereftalato (PET) que se produce a partir de ácido tereftálico (PTA) y etilenglicol. El FDCA puede sustituir al PTA en el poliéster PET, en cuyo caso da lugar a polietilenfurandicarboxilato (PEF). El PEF tiene un buen potencial para reemplazar al PET en el gran mercado del poliéster. No solo porque tiene propiedades superiores en comparación con el PET, sino también porque puede obtenerse a partir de materias primas renovables. El FDCA se puede producir a partir de azúcares, ya sea químicamente (De Jong et al. 2012. En: Biobased Monomers, Polymers, and Materials; Smith, P. et al.; Serie de simposios ACS; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC) o en una ruta química-biológica combinada (Wiercks et al 2011. Appl Microbiol Biotechnol 92: 1095-1105). En el último caso, un azúcar monomérico como glucosa o fructosa se transforma químicamente en 5-(hidroximetil)-2-furaldehído (HMF) que posteriormente puede ser oxidado por enzimas en FDCA.

[0003] Se ha desarrollado una ruta biológica para producir FDCA a partir de HMF basándose en el aislamiento de la cepa de degradación del HMF de Cupriavidus basilensis HMF14 (Wierckx et al 2010. Microbial Technology 3: 336-343). Se identificó un grupo de genes que codifican enzimas involucradas en la ruta de degradación de1HMF en C. basilensis HMF14 y los genes relevantes se expresaron de manera heteróloga en una cepa de Pseudomonas putida (Koopman et al 2010 PNAS 107: 4919-4924) que de ese modo adquirió la capacidad de metabolizar el HMF. El primer paso oxidativo en la ruta de degradación implicó la formación de ácido 5-(hidroximetil)-2-furoico (HMFCA) que a su vez se oxidó en ácido 5-formil-2-furoico (FFA) y luego en FDCA. En trabajos posteriores (Koopman et al 2010. Bioresource Technology 101: 6291-6296; y w O 2011/026913), solo el gen hmfH de C. basilensis HMF14 que codifica la enzima HMF oxidorreductasa se introdujo en P. putida. La oxidorreductasa actúa como oxidasa principalmente en HMFCA, pero también puede oxidar HMF o FFA. Solo la expresión heteróloga del gen hmfH permite a P. putida producir FDCA a partir de HMF. En un trabajo de optimización adicional (Wierckx et al 2011, supra; y WO 2012/064195), dos genes adicionales se expresaron en P. putida y codificaron un transportador HMFCA y una aldehído deshidrogenasa con especificidad desconocida, respectivamente.

[0004] Sin embargo, la ruta catalizada por oxidasa para la producción de FDCA a partir de HMF tiene varias desventajas inherentes en comparación con una ruta catalizada por deshidrogenasa, que incluyen al menos la producción de H2O2 tóxico, la falta de ganancia de energía del paso oxidativo y la escasa afinidad por el O2 y la alta demanda de oxígeno asociada del sistema. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es abordar estas desventajas proporcionando medios y métodos para una nueva ruta catalizada por deshidrogenasa para la producción de FDC^a a partir de precursores furánicos como el HMF, así como proporcionar medios y métodos para usar un nuevo transportador de HMFCA en tales procesos.

Resumen de la invención

[0005] En un primer aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 81.65 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1, en la que el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar el ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (HMFCA) a ácido 5-formil-2-furoico (FFA), en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión. Preferiblemente, la célula tiene además: a) una actividad de aldehído deshidrogenasa que oxida los aldehídos furánicos a los correspondientes ácidos carboxílicos furánicos, donde preferiblemente la célula comprende una segundo constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una aldehído deshidrogenasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID N.°: 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, donde el segundo constructo de expresión es expresable en la célula y la expresión de la aldehído deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula al menos una de las capacidades de i) oxidar 5-hidroximetilfurfural (HMF) a HMFCA, ii) oxidar DFF a FFA y iii) oxidar FFA a FDCA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del segundo constructo de expresión; y b) la capacidad de transportar compuestos furánicos hacia dentro y/o hacia fuera de la célula, donde preferiblemente, la célula comprende un tercer constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID N.°: 17, 31, 32, 33 y 34, donde el tercer constructo de expresión es expresable en la célula y la expresión del polipéptido confiere o aumenta en la célula la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del tercer constructo de expresión.

[0006] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula que comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86.5 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 17, en la que el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión del polipéptido confiere o aumenta en la célula al menos la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, en comparación con la correspondiente célula de tipo salvaje que carece del constructo de expresión, y donde la célula comprende además enzimas para convertir HMF en FDCA, donde las enzimas para convertir HMF en FDCA incluyen preferiblemente al menos una de: a) alcohol deshidrogenasa que oxida HMFCA a FFA y una actividad de aldehido deshidrogenasa que oxida los aldehidos furánicos a los correspondientes ácidos carboxílicos furánicos; y b) una oxidorreductasa que oxida a FDCA uno o más compuestos entre HMF, 2,5-dihidroximetil furano, HMFCA, FFA y 2,5-diformil furano y opcionalmente una actividad de aldehido deshidrogenasa que oxida los aldehidos furánicos a los correspondientes ácidos carboxílicos furánicos.

[0007] Una célula según la invención preferiblemente es una célula microbiana, por ejemplo, una célula bacteriana, de levadura o fúngica filamentosa. Una levadura o una célula fúngica filamentosa de la invención se seleccionan preferiblemente de un género del grupo que consta de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Myceliophthora, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Mupocoricola, Necallicola, Magdalena Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma, más preferiblemente una levadura o una célula fúngica filamentosa seleccionada de una especie del grupo que consta de Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Myceliophthora thermophila, Trichoderma reesei y Penicillium chrysogenum. Una célula bacteriana de la invención se selecciona preferiblemente de un género del grupo que consta de Escherichia, Anabaena, Aeribacillus, Aneurinibacillus, Burkholderia, Bradyrhizobium, Caulobacter, Cupriavidus, Desulfotomaculum, Desulfurispora, Gluconobacter, Rhodobacter, Pelotomaculum, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Geobacillus, Brevibacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Ralstonia, Rhodopseudomonas, Staphylococcus y Streptomyces, más preferiblemente una célula bacteriana seleccionada de una especie del grupo que consta de A. pallidus, A. terranovensis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. kribbensis, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, B. thermoruber, B. panacihumi, C. basilensis, D. kuznetsovii, D. thermophila, G. kaustophilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pelotomaculum thermopropionicum, Pseudomonas zeaxanthinificans, Pseudomonas putida, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

[0008] En otros aspecto, la invención se refiere a un proceso para preparar un polipéptido que tiene una actividad de HMFCA deshidrogenasa tal como se define en los aspectos anteriores, y/o para preparar un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos tal como se define en los aspectos anteriores. El método comprende preferiblemente el paso de cultivar una célula tal como se define en los aspectos anteriores, en condiciones propicias para la expresión del polipéptido o polipéptidos y, opcionalmente, recuperar el polipéptido o polipéptidos.

[0009] En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para oxidar HMFCA a FFA, que comprende el paso de incubar una célula de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores en presencia de HMFCA, preferiblemente en condiciones propicias para la oxidación del HMFCA por parte la célula.

[0010] En otro aspecto más, la invención se refiere a un proceso para producir FDCA, que comprende el paso de incubar una célula de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, en un medio que comprende uno o más precursores furánicos de FDCA, preferiblemente en condiciones propicias para la oxidación de los precursores furánicos de FDCA por la célula a FDCA y, opcionalmente, la recuperación de FDCA, donde preferiblemente, al menos un precursor furánico de FDCA se selecciona del grupo que consiste en HMF, 2,5-dihidroximetil furano (DHF o h Mf-OH), HMFCA, FFA y 2,5-diformil furano (DFF), de los cuales HMF es el preferido, en el que los precursores furánicos de FDCA se obtienen a partir de uno o más azúcares hexosa, preferiblemente uno o más azúcares hexosa obtenidos de biomasa lignocelulósica, preferiblemente mediante deshidratación catalizada por ácido, donde preferiblemente el FDCA se recupera del medio por un proceso que comprende precipitación ácida o salina seguida de cristalización por enfriamiento y/o extracción con disolvente.

[0011] En un aspecto adicional, la invención se refiere a un proceso para producir un polímero a partir de uno o más monómeros de FDCA. Dicho proceso comprende los pasos de: a) preparar un monómero de FDCA en un proceso según el aspecto anterior; y producir un polímero a partir del monómero de FDCA obtenido en a).

[0012] La invención también se refiere al uso de una célula según cualquiera de los aspectos anteriores, para la biotransformación de uno o más precursores furánicos de FDCA a FDC^a , donde preferiblemente, al menos un precursor furánico de FDCA se selecciona del grupo que consiste en HMF, DHF, HMFCA, FFA y DFF, de los cuales el HMF es el preferido.

[0013] En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81.85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1. En este aspecto, esta invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos uno de los siguientes elementos: a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81.85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1; b) una secuencia de nucleótidos establecida en las SEC ID N.°: 12 o 13; c) una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una secuencia de nucleótidos de b) debido a la degeneración del código genético; y d) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se define en a) a c), donde, preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es un vector. En este aspecto, la invención se refiere además a una célula que comprende un polipéptido de este aspecto y/o una molécula de ácido nucleico de este aspecto, donde preferiblemente la célula es una célula cultivada.

[0014] En un aspecto final, la divulgación se refiere a un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86.5 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 17. En este aspecto, la divulgación también se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos uno de los siguientes elementos: a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86.5 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 17; b) una secuencia de nucleótidos establecida en las SEC ID N.°: 18; c) un fragmento de una secuencia de nucleótidos tal como se define en a) o b) que tiene 10, 15, 20, 30, 50 o 100 nucleótidos de longitud; d) una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una secuencia de nucleótidos de b) o c) debido a la degeneración del código genético; y e) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se define en a) a d), donde, preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es un vector. En este aspecto, la divulgación se refiere además a una célula que comprende un polipéptido de este aspecto y/o una molécula de ácido nucleico de este aspecto, donde preferiblemente la célula es una célula cultivada.

Descripción de la invención

Definiciones

[0015] Los términos "homología", "identidad de secuencia" y similares se usan indistintamente en el presente documento. La identidad de secuencia se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determine comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, de acuerdo con lo determinado mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos.

[0016] La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" se pueden determinar mediante la alineación de dos secuencias de péptidos o de dos nucleótidos usando algoritmos de alineación global o local, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineación global (por ejemplo, Needleman Wunsch) que alinea las secuencias de manera óptima en toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineación local (por ejemplo, Smith Waterman). Las secuencias pueden entonces denominarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" (cuando se alinean de manera óptima, por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT usando parámetros predeterminados) cuando comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define a continuación). GAP utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de gaps. Una alineación global se usa adecuadamente para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares. Generalmente, se utilizan los parámetros predeterminados de GAP, con una penalización por creación de gap = 50 (nucleótidos)/8 (proteínas) y una penalización por extensión de gap = 3 (nucleótidos)/2 (proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada utilizada es nwsgapdna y para las proteínas, la matriz de puntuación predeterminada es Blosum62 (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Las alineaciones de secuencia y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencia se pueden determinar utilizando programas informáticos, como el paquete Wisconsin de GCG, versión 10.3, disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EE. UU., o utilizando software de código abierto, como el programa "needle" (usando el algoritmo global de Needleman Wunsch) o "water" (usando el algoritmo local de Smith Waterman) en EmbossWIN versión 2.10.0, usando los mismos parámetros que para GAP anteriormente, o usando la configuración predeterminada (ambos para "needle" y para "water" y tanto para proteínas como para alineaciones de ADN, la penalización por abertura de gap predeterminada es 10.0 y la penalización por extensión de gap predeterminada es 0.5; las matrices de puntuación predeterminadas son Blossum62 para proteínas y DNAFull para ADN). Cuando las secuencias tienen longitudes generales sustancialmente diferentes, se prefieren las alineaciones locales, como las que utiliza el algoritmo de Smith Waterman.

[0017] Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad se puede determinar buscando en bases de datos públicas, usando algoritmos como FASTA, BLAST, etc. Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar búsquedas contra bases de datos públicas con el fin de, por ejemplo, identificar a otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar utilizando los programas BLASTn y BLASTx (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de oxidorreductasa de la invención. Las búsquedas de proteínas con BLAST se pueden realizar con el programa BLASTx, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas de la invención. Para obtener alineaciones con gaps para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTx y BLASTn). Consulte la página de inicio del National Center for Biotechnology Information en http: www.ncbi.nim.nih.gov/.

[0018] Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", como será evidente para el experto. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas se compone de glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales de hidroxilo alifático se compone de serina y treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen amidas se compone de asparaginas y glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas se compone de lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre se compone de cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo de las secuencias descritas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos de origen natural son las siguientes: ala por ser; arg por lys; asn por gln o his; asp por glu; cys por ser o ala; gln a asn; glu a asp; gly por pro; his por asn o gln; Ile por leu o val; leu por ile o val; lys por arg, gln o glu; met por leu o ile; phe por met, leu o tyr; ser por thr; thr por ser; trp por tyr; tyr por trp o phe; y val por ile o leu.

[0019] Tal como se usa en el presente documento, los términos "hibridación selectiva", "se hibrida selectivamente" y términos similares están destinados a describir condiciones de hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos que tienen una homología de al menos un 66 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, incluso más preferiblemente al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 % o más preferiblemente al menos un 99 % entre sí permanecen típicamente hibridadas entre sí. Es decir, dichas secuencias de hibridación pueden compartir al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, incluso más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 % o más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia.

[0020] Un ejemplo preferido, no limitante de tales condiciones de hibridación es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 1 X, SDS al 0.1 % a aproximadamente 50 °C, preferiblemente a aproximadamente 55 °C, preferiblemente a aproximadamente 60 °C e incluso más preferiblemente a aproximadamente 65 °C.

[0021] Las condiciones muy astringentes incluyen, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 68 °C en SSC 5x/solución de Denhardt 5x/SDS al 1.0 % y lavado en SSC 0.2x/SDS al 0.1 % a temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado se puede realizar a 42 °C.

[0022] El experto en la materia sabrá qué condiciones aplicar para condiciones de hibridación astringentes y muy astringentes. En la técnica se encuentra fácilmente disponible orientación adicional con respecto a dichas condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York.; y Ausubel et al. (eds.), Sambrook y Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

[0023] Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida solo con una secuencia poli (A) (como el tracto poli (A) del extremo 3' de ARNm), o con un tramo complementario de residuos de T (o U) no se incluiría en un polinucleótido de la invención utilizado para hibridarse específicamente con una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que dicho polinucleótido se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo de poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc de doble hebra).

[0024] Un "constructo de ácidos nucleicos" o "vector de ácidos nucleicos" se entiende en el presente documento como una molécula de ácido nucleico artificial resultante del uso de tecnología de ADN recombinante. El término "constructo de ácidos nucleicos", por lo tanto, no incluye moléculas de ácidos nucleicos de origen natural, aunque un constructo de ácidos nucleico puede comprender (partes de) moléculas de ácidos nucleicos de origen natural. Los términos "vector de expresión" o "constructo de expresión" se refieren a secuencias de nucleótidos que son capaces de efectuar la expresión de un gen en células huésped u organismos huésped compatibles con tales secuencias. Estos vectores de expresión típicamente incluyen al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción 3'. También pueden estar presentes factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, tales como elementos potenciadores de la expresión. El vector de expresión se introducirá en una célula huésped adecuada y podrá efectuar la expresión de la secuencia codificante en un cultivo celular in vitro de la célula huésped. El vector de expresión será adecuado para la replicación en la célula u organismo huésped de la invención.

[0025] Según se usa en el presente documento, los términos "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refieren a un fragmento de ácidos nucleicos que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificantes, y está ubicado corriente arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción de la secuencia codificante, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la a Rn polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, entre otros, los sitios de unión al factor de transcripción, los sitios de unión a las proteínas represora y activadora y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la técnica que actúe directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de los tejidos en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o en cuanto a desarrollo, p. ej., mediante la aplicación de un inductor químico.

[0026] El término "marcador seleccionable" es un término familiar para un experto en la técnica y se usa en el presente documento para describir cualquier entidad genética que, cuando se expresa, puede usarse para seleccionar una célula o células que contienen el marcador seleccionable. El término "reportero" puede usarse indistintamente con marcador, aunque se usa principalmente para referirse a marcadores visibles, como la proteína verde fluorescente (GFP). Los marcadores seleccionables pueden ser dominantes, recesivos o bidireccionales.

[0027] Tal como se usa en el presente documento, el término "operativamente enlazado" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está operativamente enlazada a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que se enlazan son típicamente contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y están en el marco de lectura.

[0028] Los términos "proteína" o "polipéptido" se usan indistintamente y se refieren a moléculas que constan de una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen específicos.

[0029] El término "gen" significa un fragmento de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, operativamente enlazada a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Un gen comprenderá habitualmente varios fragmentos operativamente enlazados, tales como un promotor, una secuencia líder 5', una región codificante y una secuencia no traducida 3' (extremo 3') que comprende un sitio de poliadenilación. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que una región de ADN que está operativamente enlazada a regiones reguladoras apropiadas, en particular un promotor, se transcribe en un ARN que es biológicamente activo, es decir, que puede traducirse en una proteína o péptido biológicamente activos. El término "homólogo", cuando se usa para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico o de polipéptido (recombinante) dada y un organismo o célula huésped dados, se entiende que significa que, en la naturaleza, la molécula de ácido nucleico o polipéptido es producida por una célula huésped u organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad o cepa. Si es homóloga a una célula huésped, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido estará de manera habitual (pero no necesariamente) operativamente enlazada a otra secuencia promotora (heteróloga) y, si corresponde, a otra secuencia señal secretora (heteróloga) y/o secuencia terminadora que en su entorno natural. Se entiende que las secuencias reguladoras, secuencias señal, secuencias terminadoras, etc. también pueden ser homólogas a la célula huésped. En este contexto, usar solo elementos de secuencia "homólogos" permite la construcción de organismos genéticamente modificados (OGM) "autoclonados" (la autoclonación se define en el presente documento como en la Directiva Europea 98/81/EC Anexo II). Cuando se usa para indicar la relación de dos secuencias de ácidos nucleicos, el término "homólogo" significa que una secuencia de ácido nucleico monocatenario puede hibridarse con una secuencia complementaria de ácido nucleico monocatenario. El grado de hibridación puede depender de una serie de factores, incluido el grado de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridación, tales como la temperatura y la concentración de sal, según se comenta más adelante.

[0030] Los términos "heterólogo" y "exógeno" cuando se usan con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína se refieren a un ácido nucleico o proteína que no se produce de modo natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en el que está presente, o que se encuentra en una célula o ubicación o ubicaciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que difieren de aquella en la que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos y exógenos no son endógenos a la célula en la que se introducen, sino que se han obtenido de otra célula o se han producido de forma sintética o recombinante. Generalmente, aunque no necesariamente, dichos ácidos nucleicos codifican proteínas, es decir, proteínas exógenas, que normalmente no son producidas por la célula en la que se transcribe o expresa el ADN. De manera similar, el ARN exógeno codifica proteínas que normalmente no se expresan en la célula en la que está presente el ARN exógeno. Los ácidos nucleicos y proteínas heterólogos/exógenos también pueden denominarse ácidos nucleicos o proteínas extranjeros. Los términos ácido nucleico o proteína heterólogos o exógenos abarcan en el presente documento cualquier ácido nucleico o proteína que un experto en la técnica reconocería como extranjeros a la célula en la que se expresa. Los términos heterólogo y exógeno también se aplican a combinaciones no naturales de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, es decir, combinaciones en las que al menos dos de las secuencias combinadas son extranjeras entre sí.

[0031] La "actividad específica" de una enzima se entiende en el presente documento como la cantidad de actividad de una enzima particular por cantidad de proteína total de la célula huésped, normalmente expresada en unidades de actividad enzimática por mg de proteína total de la célula huésped. En el contexto de la presente invención, la actividad específica de una enzima particular puede aumentarse o disminuirse en comparación con la actividad específica de esa enzima en una célula huésped de tipo salvaje (por lo demás idéntica).

[0032] "Compuestos furánicos" se entiende en el presente documento como ácido 2,5-furano-dicarboxílico (FDCA) así como cualquier compuesto que tenga un grupo furano que pueda oxidarse a FDCA, este último se denomina en este documento un "precursor de FDCA" o un "precursor furánico de FDCA". Los precursores de FDCA incluyen al menos: 5-hidroximetilfurfural (HMF), 2,5-dihidroximetil furano (DHF o ^h M^f-OH) o 2,5-bis(hidroximetil) furano (BHF), ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico o ácido 5-hidroximetil-2-furoico (HMFCA), ácido 5-formil-2-furoico (FFA) y 2,5-diformil furano (DFF). Se entiende además que en los "compuestos furánicos", el anillo de furano o cualquiera de sus grupos laterales sustituibles pueden estar sustituidos, p. ej., con fracciones de éter de OH, alquilo C1-C10, alquilo, alilo, arilo o RO-, incluyendo los grupos cíclicos, en el anillo de furano en cualquier posición disponible.

[0033] Cualquier referencia a secuencias de nucleótidos o aminoácidos accesibles en las bases de datos de secuencias públicas en este documento se hace a la versión de la entrada de la secuencia disponible en la fecha de presentación de este documento.

Descripción detallada de la invención

Células que expresan una HMFCA deshidrogenasa

[0034] En un primer aspecto, la invención se refiere a una célula que tiene la capacidad de oxidar el ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (HMFCA) a ácido 5-formilfuroico (FFA). La capacidad de oxidar HMFCA a FFA preferiblemente se confiere a la célula o aumenta en la célula mediante la transformación de la célula con un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una deshidrogenasa que tiene la capacidad de oxidar HMFCA a FFA. La deshidrogenasa es preferiblemente una alcohol deshidrogenasa (es decir, que tiene actividad EC 1.1). Por tanto, la célula es preferiblemente una célula que comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una deshidrogenasa que tiene la capacidad de oxidar HMFCA a FFA. En una célula preferida de la invención, el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la deshidrogenasa preferiblemente confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA, en comparación con una célula correspondiente que carece del constructo de expresión, p. ej., una célula de tipo salvaje. La actividad específica de la enzima que oxida el HMFCA a FFA se incrementa preferiblemente en la célula en al menos un factor 1.05, 1.1, 1.2, 1.5, 2.0, 5.0, 10, 20, 50 o 100 en comparación con una célula correspondiente que carece de constructo de expresión.

[0035] Una deshidrogenasa que tiene la capacidad de oxidar HMFCA a FFA es, por tanto, una alcohol deshidrogenasa que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa. Si un polipéptido tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa o no, se puede ensayar mediante la expresión del polipéptido en una célula huésped adecuada que sea incapaz de oxidar HMFCA a FFA y detectar si la expresión del polipéptido confiere a la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA. . Preferiblemente, la actividad de HMFCA deshidrogenasa se ensaya como se describe en el ejemplo IV en el presente documento, donde una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que se va a ensayar para determinar la actividad de HMFCA deshidrogenasa reemplaza el gen hmfH de C. basilensis en pBT'hmfH-adh (descrito en WO2012/064195), después de lo cual se introduce el plásmido que comprende la secuencia codificante del polipéptido que se va a ensayar para determinar la actividad de HMFCA deshidrogenasa en P. putida KT2440Agcd que contiene pJNNhmfTI(t) (descrito en WO2012064195). Los transformantes de P. putida que expresan el polipéptido que se va a ensayar para determinar la actividad de HMFCA deshidrogenasa se incuban con HMF y se extraen muestras a intervalos regulares para el análisis de FDCA. Un aumento de la producción de FDCA, en comparación con los transformantes de P. putida correspondientes que carecen del polipéptido que se va a ensayar para determinar la actividad de HMFCA deshidrogenasa (y el gen hmfH) se toma como una indicación de que el polipéptido tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa.

[0036] La HMFCA deshidrogenasa expresada en la célula de la invención es preferiblemente una deshidrogenasa que depende de un cofactor seleccionado entre un dinucleótido de adenina, por ejemplo NADH o NADPH, un dinucleótido de flavina y adenina (FAD), un mononucleótido de flavina (FMN) y pirroloquinolina quinolona (PQQ).

[0037] La HMFCA deshidrogenasa expresada en la célula de la invención es además preferiblemente una alcohol deshidrogenasa que (también) tiene la capacidad de oxidar otros alcoholes furánicos, preferiblemente alcoholes furánicos con un grupo hidroxi en la posición 2, a los aldehídos correspondientes. Por tanto, la HMFCA deshidrogenasa tiene preferiblemente la capacidad de oxidar 5-hidroximetilfurfural (HMF) a 2,5-diformil furano (DFF).

[0038] En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica la deshidrogenasa con la capacidad de oxidar HMFCA a FFA se selecciona del grupo que consta de:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de HMFCA deshidrogenasa, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,

53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,

81.65,81.7, 81.8, 81.85, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID N.°: 1 (Aeribacillus pallidus), SEC ID N.°: 2 (Bacilo kribbensis), SEC ID N.°: 3 (Geobacillus kaustophilus), S^eC ID N.°: 4 (Aneurinibacillus terranovensis), SEC ID N.°: 5 (Brevibacillus thermoruber), SEC ID N.°: 6 (Brevibacillus panacihumi), SEC ID N.°: 7 (Bacillus sp. FJAT-14578), SEC ID N.°: 8 (Desulfotomaculum kuznetsovii), SEC ID N.°: 9 (Desulfurispora thermophila), SEC ID N.°: 10 (Bacillus sp. L1 (2012)) y SEC ID N.°: 11 (Pelotomaculum thermopropionicum);

(b) una secuencia de nucleótidos cuya hebra complementaria se hibrida con una secuencia de nucleótidos de (a); y

(c) una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una secuencia de nucleótidos de (b) debido a la degeneración del código genético.

[0039] Por tanto, una secuencia de nucleótidos preferida de la invención codifica una HMFCA deshidrogenasa con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la de una HMFCA deshidrogenasa que se puede obtener de (o se encuentra de manera natural en) una bacteria de las órdenes de Bacillales o Clostridiales. En una realización preferida, la bacteria es de la familia Bacillaceae, más preferiblemente la bacteria es del género Aeribacillus, Geobacillus y Bacillus, de los cuales las especies Aeribacillus pallidus, Bacillus kribbensis, Geobacillus kaustophilus, Aneurinibacillus terranovensis, Bacillus sp. FJAT-14578 y Bacillus sp. L1 (2012) son las más preferidas. En otra realización preferida, la bacteria es de la familia Paenibacillaceae, más preferiblemente una bacteria de los géneros Aneurinibacillus y Brevibacillus, de los cuales las especies Aneurinibacillus terranovensis, Brevibacillus thermoruber y Brevibacillus panacihumi, son las más preferidas. En otra realización preferida, la bacteria es de la familia Peptococcaceae, más preferiblemente la bacteria es de los géneros Desulfotomaculum, Desulfurispora y Pelotomaculum, de los cuales las especies Desulfotomaculum kuznetsovii, Desulfurispora thermophila y Pelotomaculum thermopropionicum son las más preferidas.

[0040] En una realización, una secuencia de nucleótidos preferida de la invención codifica una HMFCA deshidrogenasa de una bacteria mesófila, es decir, una bacteria que crece mejor a temperatura moderada, típicamente entre 20 y 45 °C. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la invención codifica una HMFCA deshidrogenasa mesófila con una actividad y estabilidad óptimas en el intervalo entre 20 y 45 °C. Ejemplos de tales deshidrogenasas mesófilas son, p. ej., las deshidrogenasas de Bacillus kribbensis (30 °C), Aneurinibacillus terranovensis (40 °C), Brevibacillus thermoruber (45 °C), Brevibacillus panacihumi (30 °C), Bacillus sp. FJAT-14578 (30 °C) y Bacillus sp. L1 (2012) (30 - 50 °C) y deshidrogenasa relacionada con los mismos.

[0041] En una realización, una secuencia de nucleótidos preferida de la invención codifica una HMFCA deshidrogenasa de una bacteria termofílica, es decir, una bacteria que crece mejor a temperaturas relativamente altas, típicamente entre 45 y 122 °C. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la invención codifica así una HMFCA deshidrogenasa termófila con una actividad y estabilidad óptimas en el intervalo entre 45 y 122 °C. Ejemplos de tales deshidrogenasas termófilas son, p. ej., las deshidrogenasas de Aeribacillus pallidus (55 °C), Geobacillus kaustophilus (55 °C), Desulfotomaculum kuznetsovii (60 °C), Desulfurispora thermophila (50 °C), Pelotomaculum thermopropionicum(55 °C) y Bacillus sp. L1 (2012) (30 - 50 °C) y deshidrogenasa relacionada con los mismos.

[0042] En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad de HMFCA deshidrogenasa tal como ocurre en la naturaleza, p. ej., ya que puede aislarse de un organismo fuente de tipo salvaje. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede codificar formas diseñadas de cualquiera de las HMFCA deshidrogenasas definidas anteriormente y que comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con la correspondiente HMFCA deshidrogenasa de origen natural pero que están dentro de los rangos de identidad o similitud tal como se define en este documento. Por tanto, en una realización, la secuencia de nucleótidos de la invención codifica una HMFCA deshidrogenasa cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos en cada una de las posiciones invariables (que se indican en la tabla 2 con un "*") el aminoácido presente en una posición invariable. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos también comprende en las posiciones fuertemente conservadas (que se indican en la tabla 2 con un ":") uno de los aminoácidos presentes en una posición fuertemente conservada. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos comprende además en las posiciones menos fuertemente conservadas (que se indican en la tabla 2 con un ".") uno de los aminoácidos presentes en una posición menos fuertemente conservada. Es menos improbable que las sustituciones de aminoácidos fuera de estas posiciones invariables y conservadas afecten a la actividad deshidrogenasa de HMFCA.

[0043] Las secuencias de nucleótidos de la invención, que codifican polipéptidos con actividad de HMFCA deshidrogenasa, se pueden obtener a partir de ADN genómico y/o de ADNc de un hongo, levadura o bacteria, p. ej., uno que pertenece al mismo filo, clase o género que los organismos fuente descritos anteriormente, usando métodos para el aislamiento de secuencias de nucleótidos que son bien conocidos en la técnica per se (ver, p. ej., Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York). Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden obtener, p. ej., en un proceso en el que a) se usan cebadores de PCR degenerados (diseñados sobre la base de secuencias de aminoácidos conservadas) en ADNc y/o ADN genómico de un organismo adecuado para generar un fragmento de PCR que comprende parte de las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos con actividad de HMFCA deshidrogenasa; b) el fragmento de PCR obtenido en a) se usa como sonda para cribar una biblioteca de ADNc y/o genómica del organismo; y c) producir un ADNc o ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de HMFCA deshidrogenasa.

[0044] Para aumentar la probabilidad de que una HMFCA deshidrogenasa de la invención se exprese en niveles suficientes y en forma activa en las células transformadas de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica a estas enzimas, así como otras enzimas de la invención (ver más adelante), se adaptan preferiblemente para optimizar su uso de codones al de la célula huésped en cuestión. La adaptabilidad de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido para el uso de codones de una célula huésped puede expresarse como índice de adaptación de codones (CAI). El índice de adaptación de codones se define en el presente documento como una medida de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen al uso de codones de genes altamente expresados en una célula u organismo huésped particular. La adaptabilidad relativa (w) de cada codón es la relación entre el uso de cada codón y el del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice CAI se define como la media geométrica de estos valores de adaptabilidad relativa. Se excluyen los codones no sinónimos y los codones de terminación (que dependen del código genético). Los valores de CAI van de 0 a 1, y los valores más altos indican una mayor proporción de los codones más abundantes (ver Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; ver también: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8): 2242-51). Una secuencia de nucleótidos adaptada tiene preferiblemente un CAI de al menos 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 o 0.9. Las preferidas son las secuencias enumeradas en las SEC ID N.°: 13 o 14, que han sido optimizadas con respecto a codones para su expresión en células de P. putida.

[0045] La célula huésped que se va a transformar con un constructo de ácidos nucleicos para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa de la invención puede ser, en principio, cualquier célula huésped en la que la invención de HMFCA deshidrogenasa pueda expresarse adecuadamente, preferiblemente en forma funcional, es decir, activa. La célula huésped de la invención es preferiblemente un huésped capaz de transportar compuestos furánicos de forma activa o pasiva tanto dentro como fuera de la célula. Una célula huésped preferida de la invención no tiene o carece de actividades detectables que descarboxilen compuestos furánicos carboxilados, tales como, en particular, HMFCA, FFA y FDCa . Preferiblemente, dicha célula huésped carece naturalmente de la capacidad de descarboxilar compuestos furánicos carboxilados.

[0046] Preferiblemente, la célula huésped es una célula cultivada, p. ej., una célula que puede cultivarse en un proceso de fermentación, preferiblemente en fermentación sumergida.

[0047] Según una realización, la célula huésped según la invención es una célula huésped eucariótica. Preferiblemente, la célula eucariótica es una célula de mamífero, insecto, planta, hongo o alga. Las células de mamífero preferidas incluyen, p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células 293, células PerC6 e hibridomas. Las células de insecto preferidas incluyen, p. ej., células Sf9 y Sf21 y derivados de las mismas.

[0048] Sin embargo, preferiblemente, la célula huésped es una célula microbiana. La célula puede ser una célula microbiana eucariótica, preferiblemente una célula fúngica, como, p. ej., una levadura o una célula fúngica filamentosa. Las células huésped de levadura preferidas incluyen, p. ej., células de levaduras de géneros como Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces y Yarrowia. Más preferiblemente levaduras de especies como Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris. Las células fúngicas filamentosas preferidas incluyen, p. ej., células de hongos filamentosos de géneros como Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Myceliophthora, Chrysosprorium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma. Las células fúngicas filamentosas preferidas pertenecen a una especie de un género de Aspergillus, Myceliophthora, Penicillium, Myceliophthora, Talaromyces o Trichoderma, y más preferiblemente una especie seleccionada entre Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Myceliophthora thermophila, Trichoderma reesei y Penicillium chrysogenum.

[0049] La célula huésped microbiana también puede ser una célula procariótica, preferiblemente una célula bacteriana. El término "célula bacteriana" incluye microorganismos tanto gram negativos como gram positivos. Las bacterias adecuadas pueden seleccionarse del género Escherichia, Anabaena, Aeribacillus, Aneurinibacillus, Burkholderia, Bradyrhizobium, Caulobacter, Cupriavidus, Desulfotomaculum, Desulfurispora, Gluconobacter, Rhodobacter, Pelotomaculum, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Geobacillus, Brevibacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Ralstonia, Rhodopseudomonas, Staphylococcus y Streptomyces. Preferiblemente, la célula bacteriana se selecciona de una especie del grupo que consta de A. pallidus, A. terranovensis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. kribbensis, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, B. thermoruber, B. panacihumi, C. basilensis, D. kuznetsovii, D. thermophila, G. kaustophilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pelotomaculum thermopropionicum, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter. Dentro de la especie Pseudomonas putida, se prefieren las cepas de P. putida S12 y P. putida KT2440.

[0050] Para usos específicos de un compuesto producido en una célula huésped según la invención, la selección de la célula huésped puede realizarse según dicho uso. Donde, p. ej., el compuesto producido en una célula huésped según la invención se va a utilizar en aplicaciones alimentarias, una célula huésped puede seleccionarse de un organismo de calidad alimentaria como Saccharomyces cerevisiae. Los usos específicos incluyen, entre otros, alimentos, piensos (animales), farmacéuticos, agrícolas tales como protección de cultivos y/o aplicaciones de cuidado personal.

[0051] El constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa de la invención es preferiblemente un constructo de expresión que es heterólogo o exógeno a la célula huésped transformada con el constructo. En el presente documento se entiende que un constructo es heterólogo o exógeno a la célula huésped que comprende el constructo cuando el constructo comprende al menos una secuencia o elemento de secuencia que no se produce de forma natural en la célula huésped y/o cuando el constructo comprende al menos dos elementos de secuencia en una combinación y/u orden que no ocurre naturalmente en la célula huésped, incluso si los elementos mismos ocurren de manera natural en la célula huésped.

[0052] Los vectores y constructos de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa de la invención en células huésped apropiadas se describen con más detalle en el presente documento más adelante.

[0053] Una célula transformada que expresa una HMFCA deshidrogenasa de la invención, además, preferiblemente tiene actividad de aldehído deshidrogenasa (es decir, tiene actividad de EC 1.2). Preferiblemente, la actividad de la aldehído deshidrogenasa es capaz de convertir aldehídos furánicos. Más preferiblemente, la actividad de aldehído deshidrogenasa es capaz de oxidar los aldehídos furánicos a los correspondientes ácidos carboxílicos furánicos. Más específicamente, la actividad de aldehído deshidrogenasa es preferiblemente capaz de al menos una de las siguientes opciones: i) oxidar HMF a HMFCA, ii) oxidar 2,5-diformil furano (DFF) a ácido 5-formil-2-furoico (FFA) y iii) FFA en FDCA. Dicha actividad de aldehído deshidrogenasa furánica puede ser una actividad endógena de la célula o puede ser una actividad exógena conferida a la célula. Preferiblemente, la actividad de aldehído deshidrogenasa furánica se confiere o aumenta en la célula mediante la transformación de la célula con un segundo constructo de expresión. En una célula preferida de la invención, el segundo constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la aldehído deshidrogenasa furánica confiere o aumenta preferiblemente en la célula la capacidad de al menos una de las siguientes opciones: i) oxidar HMF a HMFCA, ii) oxidar DFF a FFA y iii) oxidar FFA a FDCA, en comparación con una célula correspondiente que carece del constructo de expresión, p. ej., una célula de tipo salvaje. La actividad específica de la aldehído deshidrogenasa furánica se incrementa preferiblemente en la célula en al menos un factor 1.05, 1.1, 1.2, 1.5, 2.0, 5.0, 10, 20, 50 o 100 en comparación con una célula correspondiente que carece de constructo de expresión. El segundo constructo de expresión comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido:

a) que tiene al menos una de las capacidades de i) oxidar HMF a HMFCA, ii) oxidar DFF a FFA y iii) oxidar FFA a FDCA; y

b) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID N.°: 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30.

[0054] La capacidad de un polipéptido para oxidar al menos una de las siguientes: i) HMF a HMFCA, ii) DFF a FFA y iii) FFA a FDCA, puede ensayarse mediante la coexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en una célula huésped de P. putida, preferiblemente una célula huésped de P. putida KT2440, junto con los genes HmfH y HmfT1 de C. basilensis HMF 14, incubando células de P. putida en HMF 10 mM y detectando un aumento en la acumulación de FDCA en comparación con las células correspondientes de P. putida que no expresan el polipéptido, p. ej. como se describe en el ejemplo IV de WO2012/064195. La capacidad de un polipéptido para oxidar HMF a HMFCA también puede ensayarse como describen Koopman et al. 2010, PNAS supra). Cepas que expresan el gen HmfT1 de C. basilensis HMF14 en el presente documento se entiende que expresa un producto génico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 31.

[0055] Una célula transformada que expresa una HMFCA deshidrogenasa de la invención, además, preferiblemente tiene la capacidad de transportar compuestos furánicos hacia y/o desde la célula. Preferiblemente, la célula tiene la capacidad de transportar compuestos furánicos que son precursores de FDCA al interior de la célula y preferiblemente la capacidad de transportar FDCA fuera de la célula. Dichas capacidades de transporte de compuestos furánicos pueden ser capacidades endógenas de la célula y/o pueden ser capacidades exógenas conferidas a la célula. Por tanto, una célula preferida de la invención expresa un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos. Más preferiblemente, la célula expresa un polipéptido que tiene capacidades de transporte de HMFCA. Se entiende que las capacidades de transporte de HMFCA incluyen al menos la capacidad de transportar HMFCA a la célula. La expresión de un polipéptido que tiene capacidades de transporte de HMFCA aumentará el transporte de HMFCA al interior de la célula, lo que aumenta su disponibilidad para la conversión intracelular a FDCA. Por tanto, se puede mejorar la bioconversión de HMFCA.

[0056] Preferiblemente, la capacidad para transportar compuestos furánicos hacia y/o desde de la célula se confiere o aumenta en la célula mediante la transformación de la célula con un tercer constructo de expresión. En una célula preferida de la invención, el tercer constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión del transportador del compuesto furánico preferiblemente confiere o aumenta en la célula la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, en comparación con una célula correspondiente que carece del constructo de expresión, p. ej., una célula de tipo salvaje. El tercer constructo de expresión comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido:

a) que tiene al menos capacidad de transporte de HMFCA; y

b) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID N.°: 17, 31, 32, 33 y 34.

[0057] La capacidad de un polipéptido para transportar compuestos furánicos, en particular HMFCA, al interior de la célula puede ensayarse mediante la coexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido transportador en una célula huésped de P. putida, preferiblemente una célula huésped de P. putida KT2440, junto con el gen HmfH de C. basilensis HMF 14 y un gen que codifica una aldehido deshidrogenasa furánica asociada con el operón de degradación de HMF de C. basilensis HMF 14 (que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 19 de WO2012/064195), incubando células de P. putida en HMF 10 mM y detectando un aumento en la acumulación de FDCA en comparación con las células correspondientes de P. putida que no expresan el polipéptido transportador, p. ej. como se describe en el ejemplo IV de WO2012/064195.

[0058] En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene capacidad de transporte de HMFCA tal como ocurre en la naturaleza, p. ej., ya que puede aislarse de un organismo fuente de tipo salvaje. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede codificar formas diseñadas de cualquiera de los polipéptidos que tienen capacidad de transporte de HMFCA tal como se definió anteriormente y que comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con el correspondiente polipéptido natural con capacidad de transporte de HMFCA pero que están dentro de los rangos de identidad o similitud tal como se define en el presente documento. Por tanto, en una realización, la secuencia de nucleótidos de la invención codifica un polipéptido que tiene capacidad de transporte de HMFCA, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos en cada una de las posiciones invariables (que se indican en la tabla 3 con un "*") el aminoácido presente en una posición invariable. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos también comprende en las posiciones fuertemente conservadas (que se indican en la tabla 3 con un ":") uno de los aminoácidos presentes en una posición fuertemente conservada. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos comprende además en las posiciones menos fuertemente conservadas (que se indican en la tabla 3 con un ".") uno de los aminoácidos presentes en una posición menos fuertemente conservada. Es menos probable que las sustituciones de aminoácidos fuera de estas posiciones invariables y conservadas afecten a la capacidad de transporte de HMFCA.

[0059] Las secuencias de nucleótidos de la invención, que codifican polipéptidos que tienen capacidad de transporte de HMFCA, se pueden obtener a partir de ADNc y/o ADN genómico de un hongo, levadura o bacteria, p. ej., uno que pertenece al mismo filo, clase o género que los organismos fuente descritos anteriormente, utilizando métodos para el aislamiento de secuencias de nucleótidos que son bien conocidos en la técnica per se, de una manera similar a la descrita anteriormente para las secuencias de nucleótidos que codifican las HMFCA deshidrogenasas de la invención.

Células que expresan un transportador de compuestos furánicos.

[0060] En un segundo aspecto, la divulgación se refiere a una célula que expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos. Preferiblemente, la célula se transforma con un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos. El polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos es preferiblemente un polipéptido que tiene capacidades de transporte de HMFCA, que al menos incluye la capacidad de transportar HMFCA al interior de la célula. Preferiblemente, la célula comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 86.5, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 17, donde, el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión del polipéptido confiere a o aumenta en la célula la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión. La capacidad de un polipéptido para transportar compuestos furánicos, en particular HMFCA, al interior de la célula puede ensayarse como se ha descrito anteriormente.

[0061] Preferiblemente, una célula transformada que expresa un transportador de compuestos furánicos de este aspecto de la divulgación comprende además actividades enzimáticas para convertir HMF en FDCA, donde las actividades para convertir HMF en FDCA incluyen preferiblemente al menos una de las siguientes opciones:

a) una alcohol deshidrogenasa que oxida el HMFCA a FFA y una actividad de aldehido deshidrogenasa que oxida los aldehidos furánicos a los correspondientes ácidos carboxilicos furánicos; y

b) una oxidorreductasa, preferiblemente una oxidasa, que oxida uno o más de los siguientes: HMF, 2,5-dihidroximetil furano, HMFCA, FFA y 2,5-diformil furano a FDCA y opcionalmente una actividad aldehido deshidrogenasa que oxida los aldehidos a los correspondientes ácidos carboxilicos furánicos.

[0062] La alcohol deshidrogenasa que oxida el HMFCA a FFA y la actividad de aldehido deshidrogenasa que oxida los aldehídos furánicos son preferiblemente como se han definido en el presente documento anteriormente. La oxidorreductasa que oxida uno o más de los compuestos HMF, 2,5-dihidroximetil furano, HMFCA, FFA y 2,5-diformil furano a FDCa es preferiblemente una oxidorreductasa que tiene actividades de EC 1.1 y EC 1.2, como se describe en WO2011/026913.

[0063] A menos que se especifique lo contrario, una célula transformada que expresa un transportador de compuestos furánicos de este aspecto de la divulgación puede tener además las características de una célula que expresa una HMFCA deshidrogenasa del primer aspecto de la invención tal como se ha definido anteriormente.

Vectores, constructos y método para la expresión de polipéptidos de la invención.

[0064] Otro aspecto de la invención se refiere a constructos de ácidos nucleicos, tales como vectores, que incluyen vectores de clonación y expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención, p. ej., una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa o un transportador de la invención o un equivalente funcional de los mismos y métodos para hacer crecer, transformar o transfectar dichos vectores en una célula huésped adecuada, por ejemplo en condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido de la invención. Según se usa en el presente documento, los términos "vector" y "constructo" se usan de manera intercambiable y se refieren a una molécula de ácidos nucleicos construida que comprende y es preferiblemente capaz de transportar un polinucleótido de la invención.

[0065] Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse a un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de clonación o expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para fabricar polinucleótidos de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, la introducción del vector en una célula huésped compatible y el crecimiento de la célula huésped en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Las células huésped adecuadas se han descrito anteriormente.

[0066] El vector en el que se inserta el casete de expresión o polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir.

[0067] Un vector según la invención puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser tal que, cuando se introduce en una célula huésped, está integrado en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado.

[0068] Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (p. ej., vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, por tanto, se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente enlazados. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles para las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente en este documento, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como cósmidos, vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados) y vectores de fagos que cumplen funciones equivalentes.

[0069] Se pueden utilizar in vitro vectores según la invención, por ejemplo, para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula huésped.

[0070] Un vector de la invención puede comprender dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sobreexpresión.

[0071] Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que se van a utilizar para la expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácidos nucleicos que se va a expresar. Una secuencia reguladora, por ejemplo, un promotor, un potenciador u otra señal de regulación de la expresión, "operativamente enlazada" a una secuencia codificante se coloca de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control o las secuencias se disponen de manera que funcionan conjuntamente para su propósito previsto, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y avanza a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. El término "secuencia reguladora" o "secuencia de control" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca (1990). El término secuencias reguladoras o de control incluye aquellas secuencias que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en una determinada célula huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido).

[0072] Un vector o constructo de expresión para una célula huésped determinada puede comprender, por tanto, los siguientes elementos operativamente enlazados entre sí en un orden consecutivo desde el extremo 5' hasta el extremo 3' en relación con la cadena codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en la célula huésped dada; (2) secuencias de iniciación de la traducción, como la secuencia de consenso de Kozak eucariótica o la secuencia del sitio de unión al ribosoma procariótica/Shine-Dalgarno, (3) opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido de la célula huésped dada a un medio de cultivo; (4) una secuencia de ADN de la invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptido de la invención; y preferiblemente también (5) una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción corriente abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

[0073] Corriente abajo de la secuencia de nucleótidos según la invención puede haber una región 3' sin traducir que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo, un terminador). El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente se usa un terminador de levadura en células huésped de levadura y un terminador fúngico filamentoso se usa en células huésped fúngicas filamentosas. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula huésped (en la que se va a expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido). En la región transcrita, puede estar presente un sitio de unión al ribosoma para traducción. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirá un AUG que iniciará la traducción al principio y un codón de terminación posicionado apropiadamente al final del polipéptido que se va a traducir.

[0074] La expresión mejorada del polinucleótido de la invención también se puede lograr mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, p. ej., regiones promotoras, líderes de secreción y/o terminadoras, que pueden servir para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés desde el huésped de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención. .

[0075] Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de la invención, tales como los vectores de expresión, pueden introducirse en células huésped para producir proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento (por ejemplo, HMFCA deshidrogenasa o un transportador de la invención, formas mutantes de la misma, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de la misma, proteínas de fusión, etc.).

[0076] Según se ha expuesto anteriormente, el término "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en el presenten documento para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o beneficioso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de ácidos nucleicos de la invención que codifica un polipéptido. Dichas secuencias de control pueden incluir, entre otras, un promotor, un líder, secuencias óptimas de iniciación de traducción (tal como se describe en Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870) o las secuencias procarióticas Shine-Delgarno, una secuencia señal de secreción, una secuencia propéptido, una secuencia de poliadenilación y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen típicamente un promotor y señales de inicio y parada traduccional.

[0077] Un microorganismo transformado de forma estable es aquel al que se le han introducido uno o más fragmentos de ADN de manera que las moléculas introducidas se mantienen, replican y segregan en un cultivo en crecimiento. La transformación estable puede deberse a integraciones cromosómicas múltiples o únicas o a un elemento o elementos extracromosómicos como un vector plasmídico. Un vector plasmídico es capaz de dirigir la expresión de polipéptidos codificados por fragmentos de ADN particulares.

[0078] La expresión puede ser constitutiva o regulada por promotores inducibles (o reprimibles) que permiten altos niveles de transcripción de fragmentos de ADN funcionalmente asociados que codifican polipéptidos específicos.

[0079] Independientemente del mecanismo exacto utilizado para la expresión de polipéptidos de la invención, se contempla que dicha expresión sea transferible mediante la introducción de genes que codifican estos polipéptidos en otra célula huésped mediante métodos conocidos en la técnica. Los elementos genéticos tal como se definen en el presente documento incluyen ácidos nucleicos (generalmente ADN o ARN) que tienen secuencias codificantes expresables para productos tales como proteínas, específicamente enzimas, apoproteínas o ARN antisentido, que expresan o regulan la expresión de polipéptidos relevantes. Las proteínas expresadas pueden funcionar como enzimas, reprimir o desreprimir la actividad enzimática o controlar la expresión de enzimas o funcionar como transportadores de compuestos, p. ej., metabolitos. El ADN recombinante que codifica estas secuencias expresables puede ser cromosómico (integrado en el cromosoma de la célula huésped mediante, por ejemplo, recombinación homóloga) o extracromosómico (por ejemplo, transportado por uno o más plásmidos, cósmidos y otros vectores capaces de autorreplicarse). Se entiende que el ADN recombinante utilizado para transformar la célula huésped según esta invención puede incluir, además de genes estructurales y factores de transcripción, secuencias de control de expresión, incluyendo promotores, represores y potenciadores, que actúan para controlar la expresión o desrepresión de secuencias codificantes de proteínas, apoproteínas o ARN antisentido. Por ejemplo, dichas secuencias de control pueden insertarse en células huésped de tipo salvaje para promover la sobreexpresión de polipéptidos seleccionados ya codificados en el genoma de la célula huésped, o alternativamente pueden usarse para controlar la síntesis de polipéptidos codificados extracromosómicamente.

[0080] El ADN recombinante puede introducirse en la célula huésped por cualquier medio, incluyendo, entre otros, plásmidos, cósmidos, fagos, cromosomas artificiales de levadura u otros vectores que median la transferencia de elementos genéticos a una célula huésped. Estos vectores pueden incluir un origen de replicación, junto con elementos de control que actúan en cis que controlan la replicación del vector y los elementos genéticos transportados por el vector. Pueden estar presentes marcadores seleccionables en el vector para ayudar en la identificación de células huésped en las que se han introducido elementos genéticos.

[0081] Los medios para introducir elementos genéticos en una célula huésped (por ejemplo, clonación) son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede utilizar un vector plasmídico extracromosómico de múltiples copias para insertar los elementos genéticos según la presente invención. La introducción del elemento genético a través del plásmido en las células huésped implica una escisión inicial de un vector plasmídico con una enzima de restricción, seguida de la ligación del plásmido y los elementos genéticos que codifican la especie enzimática diana de acuerdo con la invención. Tras la recircularización del plásmido recombinante ligado, se utiliza una infección (por ejemplo, empaquetamiento en fago lambda) u otro mecanismo de transferencia de plásmido (por ejemplo, electroporación, microinyección, etc.) para transferir el plásmido a la célula huésped. Los plásmidos adecuados para la inserción de elementos genéticos en la célula huésped son bien conocidos por los expertos en la materia.

[0082] Otros métodos de clonación de genes incluyen, entre otros, la integración directa del material genético en el cromosoma. Esto puede ocurrir por una variedad de medios, incluida la clonación de los elementos genéticos descritos en el presente documento en plásmidos no replicantes flanqueados por secuencias de ADN homólogas del cromosoma huésped; tras transformar dicho plásmido recombinante en un huésped, los elementos genéticos pueden introducirse en el cromosoma mediante recombinación de ADN. Estas cepas recombinantes se pueden recuperar si los fragmentos de ADN que se integran contienen un marcador seleccionable, como la resistencia a los antibióticos. Alternativamente, los elementos genéticos se pueden introducir directamente en el cromosoma de una célula huésped sin el uso de un plásmido no replicante. Esto puede realizarse produciendo de manera sintética fragmentos de ADN de los elementos genéticos de acuerdo con la presente invención que también contienen secuencias de ADN homólogas del cromosoma huésped. De nuevo, si estos fragmentos de ADN sintéticos también contienen un marcador seleccionable, los elementos genéticos pueden insertarse en el cromosoma del huésped.

[0083] La invención se refiere además a un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa de la invención y/o un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos de la invención, el cual comprende cultivar una célula de acuerdo con la invención en condiciones propicias para la expresión del polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado, así como a un polipéptido obtenible mediante dicho método.

Procesos de oxidación de compuestos furánicos

[0084] En un aspecto adicional, la invención se refiere a procesos para oxidar compuestos furánicos. En particular, la invención se refiere a un proceso en el que se oxidan precursores furánicos de FDCA. Un proceso de la invención puede comprender una única etapa de reacción de oxidación que da como resultado un producto (por ejemplo, la oxidación de HMFCA a FFA). Alternativamente, un proceso de la invención puede comprender más de una etapa de reacción de oxidación, donde cada etapa da como resultado un intermedio y el último intermedio es el producto final. Los ejemplos de dicha serie de pasos, en los que e1HMF se oxida a FDCA a través pasos de oxidación secuenciales incluyen, por ejemplo: 1) El HMF se oxida primero a HMFCA, que en un segundo paso se oxida a FFA, que luego finalmente se oxida a FDCA, o alternativamente, como lo describen Dijkman et al. (2014, Angew. Chem. 53 (2014) 6515-8.) 2) El HMF se oxida primero a DFF, que en un segundo paso se oxida a FFA, que finalmente se oxida a FDCA. Por tanto, en un proceso preferido de la invención, uno o más precursores furánicos de FDCA se oxidan en una serie de pasos hasta llegar finalmente a FDCA.

[0085] En una realización, la invención se refiere a procesos que comprenden al menos la oxidación de HMFCA a FFA. Preferiblemente, el proceso es un proceso para oxidar HMFCA a FFA, donde el proceso comprende el paso de incubar una célula en presencia de HMFCA, donde la célula es una célula que expresa una HMFCA deshidrogenasa tal como se ha definido en el presente documento anteriormente, o una célula que expresa un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos y que además comprende actividades de HMFCA deshidrogenasa u oxidasa tal como se ha definido en el presente documento anteriormente. Preferiblemente, la célula se incuba en presencia de HMFCA en condiciones que conducen a la oxidación del HMFCA por la célula, como, p. ej., se especifica a continuación.

[0086] En otra realización, la invención se refiere a procesos para producir FDCA. Un proceso para producir FDCA comprende preferiblemente el paso de incubar una célula en un medio que comprende uno o más precursores furánicos de FDCA, en el que la célula es una célula que expresa una HMFCA deshidrogenasa tal como se ha definido en el presente documento anteriormente, o una célula que expresa un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos y que comprende además una actividad de HMFCA deshidrogenasa u oxidasa tal como se ha definido en el presente documento anteriormente. Preferiblemente, la célula se incuba en presencia de HMFCA en condiciones propicias para la oxidación a FDCA de los precursores furánicos de FDCA por parte la célula, como, p. ej., se especifica a continuación.

[0087] Preferiblemente, en el proceso, al menos un precursor furánico de FDCA se selecciona del grupo que consta de HMF, DHF, HMFCA, FFA y DFF, de los cuales HMF es el preferido. Los precursores furánicos del FDCA se obtienen preferiblemente a partir de uno o más azúcares de hexosa, preferiblemente mediante deshidratación catalizada por ácido, p. ej., mediante calentamiento en presencia de ácido, de manera convencional. La tecnología para generar ^h M^f a partir de fructosa está bien establecida y es robusta (ver p. ej., van Putten et al., 2013, Chem. Rev. 113, 1499-1597). También se puede utilizar materia prima rica en glucosa, pero la formación termoquímica de HMF procede de forma más eficaz a partir de la fructosa. Por lo tanto, se puede incluir un paso enzimático adicional para convertir la glucosa en fructosa, utilizando glucosa isomerasa. Este último proceso está bien establecido en la industria alimentaria, p. ej., para producir jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (JMAF) a partir de almidón hidrolizado. La glucosa también se puede isomerizar químicamente a fructosa usando combinaciones de catalizadores y disolventes como se describe, p. ej., en van Putten et al. (2013, supra).

[0088] Los azúcares hexosa normalmente se obtendrán a partir de biomasa. El término "biomasa" se entiende como la fracción biodegradable de productos, desechos y residuos de origen biológico de la agricultura (incluyendo sustancias vegetales, tales como residuos de cultivos, y animales), la silvicultura (por ejemplo, recursos madereros) e industrias relacionadas, incluidas la pesca y la acuicultura, así como la fracción biodegradable de residuos industriales y municipales, tales como residuos sólidos urbanos o papel de desecho. En una realización preferida, la biomasa es biomasa vegetal, más preferiblemente una biomasa (fermentable) rica en hexosa/glucosa/azúcar, como p. ej., caña de azúcar, una biomasa que contiene almidón, por ejemplo, grano de trigo o paja de maíz, o incluso granos de cereales, como maíz, trigo, cebada o mezclas de los mismos. Se prefieren los cultivos agrícolas naturalmente ricos en fructanos (por ejemplo, raíces de topinambur o achicoria).

[0089] Los azúcares de hexosa se pueden obtener por hidrólisis de dicha biomasa. Los métodos para la hidrólisis de biomasa son conocidos en la técnica per se e incluyen el uso de, p. ej., vapor y/o carbohidrasas tales como glucoamilasas.

[0090] Otro tipo preferido de biomasa para usar en el proceso de la invención es la denominada materia prima lignocelulósica de "segunda generación", que se prefiere si se van a producir grandes volúmenes de FDCa de una manera más sostenible. Las materias primas lignocelulósicas pueden obtenerse de cultivos energéticos dedicados, p. ej., cultivados en terrenos marginales, por lo que no compite directamente con los cultivos alimentarios. O pueden obtenerse materias primas lignocelulósicas como subproductos, p. ej., se pueden considerar los desechos sólidos municipales, el papel de desecho, los residuos de madera (incluidos los desechos de aserraderos y fábricas de papel) y los residuos de cultivos. Ejemplos de residuos de cultivos incluyen el bagazo de caña de azúcar y también varios desechos de maíz y trigo. En el caso de los subproductos del maíz, tres residuos son fibra, mazorcas y rastrojo. Además, la biomasa forestal se puede utilizar como materia prima. Para convertir las materias primas de segunda generación en productos de fermentación de la invención, es necesario liberar la celulosa y la hemicelulosa como monosacáridos. Para ello, se aplican enfoques termoquímicos (normalmente denominados pretratamientos), enfoques enzimáticos o una combinación de las dos metodologías. Un pretratamiento puede servir para liberar completamente los azúcares o para hacer que los compuestos poliméricos sean más accesibles al ataque enzimático posterior. Los diferentes tipos de pretratamiento incluyen agua caliente líquida, explosión de vapor, pretratamiento con ácido, pretratamiento con bases y pretratamientos con líquidos iónicos. Las cantidades relativas de los diversos compuestos dependerán tanto de la materia prima utilizada como del pretratamiento empleado. Para la liberación de azúcares monosacáridos de dicha materia prima lignocelulósica, se emplean carbohidrasas apropiadas, incluyendo p. ej., arabinasas, xilanasas, glucanasas, amilasas, celulasas, glucanasas y similares.

[0091] El proceso de la invención comprende además preferiblemente la etapa de recuperación del producto o productos de oxidación producidos en el proceso, tales como FDCA o HMFCA. Preferiblemente, el producto de oxidación se recupera del medio en el que se incuba la célula que lleva a cabo las etapas de oxidación. Los productos de oxidación tales como FDCA, HMFCA, etc. pueden recuperarse de la mezcla o medio de reacción, p. ej., precipitación (ácida o salina), posterior cristalización por enfriamiento y separación del producto de oxidación cristalizado, por ejemplo, FDCA cristalizado. Sin embargo, son adecuados otros métodos de recuperación, como p. ej., precipitación ácida o salina y extracción con disolvente, como se conoce en la técnica. La precipitación salina para la recuperación del FDCA puede, por ejemplo, realizarse usando cationes divalentes (metálicos), como p. ej., Mg2+.

[0092] Las reacciones de oxidación se llevan a cabo preferiblemente a la temperatura óptima para la célula y las enzimas oxidorreductasa contenidas en la célula. Por tanto, en el caso de células y enzimas termofílicas, la temperatura preferiblemente es de 45 °C o superior, p. ej., en el rango entre 45 y 122 °C, p. ej., superior a 50, 55, 60 o 65 °C. Sin embargo, en el caso de una célula mesófila que contiene enzimas de mesófilos, las reacciones de oxidación se llevan a cabo preferiblemente a una temperatura relativamente suave, p. ej., 10 - 80 °C, más preferiblemente 20 - 45 °C, lo más preferible aproximadamente de 25 - 40 °C.

[0093] Las reacciones de oxidación se llevan a cabo preferiblemente a un pH en el que el FDCA está en una forma neutra o en una forma completamente disociada, de modo que se pueda controlar la formación de sal. En vista de la presencia de dos fracciones ácidas en FDCA, hay dos intervalos de pH preferidos separados. El pH durante la reacción puede ser de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 1 a 3. Alternativamente, el pH durante la reacción puede ser de 5 a 9, preferiblemente de 5 a 8, más preferiblemente de 5 a 7. La persona experta comprenderá que los requisitos de la célula huésped también influirán en la selección de un valor de pH adecuado para el proceso. La selección de los valores de pH que son apropiados para una célula huésped particular está dentro del ámbito de la persona experta y puede obtenerse de libros de texto estándar. Para Pseudomonas putida, incluyendo, p. ej., las cepas de Pseudomonas putida S12 o KT2440, el rango de pH preferido es de 5 a 7.

[0094] El tiempo de la reacción puede ser de 6 a 150 horas, más preferiblemente de 6 a 18 horas. Preferiblemente, se suministra oxígeno a las células en el medio de reacción desde una fuente de oxígeno, tal como oxígeno molecular, p. ej., como oxígeno puro o en el aire, o agua, o una fuente diferente de oxígeno dependiendo de los requisitos de la enzima oxidante furánica. El aire puede usarse convenientemente como fuente de oxígeno molecular.

[0095] El reactor puede ser cualquier biorreactor adecuado (aireado). Puede operarse en lotes, en continuo o preferiblemente en lotes alimentados.

[0096] Los procesos de la invención para oxidar compuestos furánicos pueden aplicarse de manera ventajosa para la eliminación de compuestos furánicos de materias primas en las que los compuestos furánicos se consideran perjudiciales, tales como materias primas para fermentaciones para la producción de biocombustibles y productos bioquímicos. Más preferiblemente, los procesos para oxidar compuestos furánicos se aplican en la bioproducción de FDCA como un precursor monomérico para la producción de poliésteres (plásticos), donde el FDCA puede sustituir al PTA en el poliéster PET en cuyo caso se produce el polietilenfurandicarboxilato (PEF) de base biológica. El FDCA también puede usarse como sustrato para una gran variedad de compuestos valiosos, que incluyen p. ej., como sustrato para la producción de ácido succínico, 2,5-bis (aminometil)-tetrahidrofurano, 2,5-dihidroximetil-tetrahidrofurano, 2,5-dihidroximetilfurano y 2,5-furandicarbaldehído. El FDCA puede usarse en la producción de revestimientos, p. ej., en resinas alquídicas y revestimientos termoplásticos. También se puede utilizar como equivalente de xileno en biocombustibles y como disolvente. El FDCa puede esterificarse y los ésteres pueden usarse como plastificantes. El FDCA puede convertirse en su diol, que puede usarse en poliésteres y poliuretanos similares al PET. Además, el FDCA se puede convertir en su diamina, la diamina se puede usar como extensor de cadena y se puede convertir en diisocianato, que se puede usar en la producción de poliuretanos.

[0097] Por tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un proceso para producir un polímero a partir de uno o más monómeros de FDCA, donde el proceso comprende las etapas de: a) preparar un monómero FDCA en un proceso de oxidación de la invención tal como se ha descrito anteriormente; y b) producir un polímero a partir del monómero de FDCA obtenido en a). Preferiblemente, el polímero es polietilenfurandicarboxilato (PEF).

[0098] En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una célula de la invención, para la biotransformación de uno o más precursores furánicos a FDCA, donde la célula es una célula que expresa una HMFCA deshidrogenasa tal como se ha definido en el presente documento anteriormente o una célula que expresa el polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos y que comprende además una actividad de HMFCA deshidrogenasa u oxidasa tal como se ha definido en el presente documento anteriormente. Preferiblemente, al menos un precursor furánico del FDCA que se biotransforma en FDCA se selecciona del grupo que consta de HMF, DHF, HMFCA, FFA y DFF, de los cuales HMF es el preferido.

Polipéptidos de HMFCA deshidrogenasa y ácidos nucleicos que codifican HMFCA deshidrogenasas

[0099] En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa. El polipéptido con actividad de HMFCA deshidrogenasa comprende o consta de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81.65, 81.7, 81.8, 81.85, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1 (Aeribacillus pallidus) pero por lo demás es tal como se ha definido en el presente documento anteriormente. Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido aislado.

[0100] La invención se refiere además a una molécula de ácidos nucleicos que comprende al menos una de las siguientes:

a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa, cuyo polipéptido comprende o consta de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81.65, 81.7, 81.8, 81.85, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1;

b) una secuencia de nucleótidos establecida en las SEC ID N.°: 12 o 13;

c) una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una secuencia de nucleótidos de b) debido a la degeneración del código genético; y

d) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a c).

[0101] Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, incluyendo los vectores de clonación y expresión, que comprenden una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a d) anteriormente en esta sección, donde dichos vectores son por lo demás tal como se han descrito en el presente documento anteriormente.

[0102] En otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende al menos uno de los siguientes: i) un polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa tal como se ha definido anteriormente en esta sección, y ii) una molécula de ácidos nucleicos tal como se ha definido anteriormente en esta sección. Preferiblemente, la célula es una célula que comprende o se transforma con una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a d) anteriormente en esta sección, o un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos. La célula es preferiblemente una célula aislada o una célula cultivada, la célula preferiblemente es por lo demás como se ha descrito en el presente documento anteriormente y preferiblemente la célula comprende una o más de las modificaciones genéticas descritas en el presente documento anteriormente. La célula se puede aplicar en cualquiera de los métodos, procesos y usos descritos anteriormente.

Polipéptidos transportadores de compuestos furánicos y ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos transportadores

[0103] En otro aspecto adicional, la divulgación se refiere a un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos. El polipéptido preferiblemente tiene al menos la capacidad de transportar HMFCA al interior de la célula. Preferiblemente, el polipéptido comprende o consta de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86.5, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 17 (Aeribacillus pallidus) pero por lo demás es tal como se ha definido en el presente documento anteriormente. Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido aislado.

[0104] La divulgación se refiere además a una molécula de ácidos nucleicos que comprende al menos una de las siguientes:

a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 86.5, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 17;

b) una secuencia de nucleótidos establecida en las SEC ID N.°: 18;

c) un fragmento de una secuencia de nucleótidos tal como se define en (a) o (b) que tiene 10, 15, 20, 30, 50 o 100 nucleótidos de longitud;

d) una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una secuencia de nucleótidos de b) o c) debido a la degeneración del código genético; y

e) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a d).

[0105] Otro aspecto de la divulgación se refiere a vectores, incluyendo los vectores de clonación y expresión, que comprenden una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a e) anteriormente en esta sección, donde dichos vectores son por lo demás tal como se han descrito en el presente documento anteriormente.

[0106] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula que comprende al menos uno de los siguientes: i) un polipéptido que tiene capacidades de transporte de compuestos furánicos tal como se ha definido anteriormente en esta sección, y ii) una molécula de ácidos nucleicos tal como se ha definido anteriormente en esta sección. Preferiblemente, la célula es una célula que comprende o se transforma con una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a e) anteriormente en esta sección, o un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos. La célula es preferiblemente una célula aislada o una célula cultivada, la célula preferiblemente es por lo demás como se ha descrito en el presente documento anteriormente y preferiblemente la célula comprende una o más de las modificaciones genéticas descritas en el presente documento anteriormente. La célula se puede aplicar en cualquiera de los métodos, procesos y usos descritos anteriormente.

[0107] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitante para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento por los artículos indefinidos "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y sólo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno".

[0108] Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Descripción de las figuras

[0109]

Figura 1A: Biotransformación de HMF por P. putida CA2046 (P. putida; círculo abierto: HMF (5-hidroximetilfurfural); cuadrado abierto: HMFCA (ácido 5-hidroximetilfuroico); rombo relleno: FDCA (ácido 2,5-furano dicarboxílico); círculo gris relleno: OD600.

Figura 1B: Biotransformación de HMF por P. putida CA2101; círculo abierto: HMF (5-hidroximetilfurfural); cuadrado abierto: HMFCA (ácido 5-hidroximetilfuroico); rombo relleno: FDCA (ácido 2,5-furano dicarboxílico); círculo gris relleno: OD600.

Figura 2: Biotransformación de HMF por P. putida CA2111, coexpresando YiaY con Aldh y HmfT1 de C. basilensis HMF14; círculo abierto: HMF (5-hidroximetilfurfural); cuadrado abierto: HMFCA (ácido 5-hidroximetilfuroico); rombo relleno: FDCA (ácido 2,5-furano dicarboxílico); círculo gris relleno: OD600. Se muestran los promedios de cultivos duplicados.

Figura 3: Biotransformación de HMF por P. putida CA2112, coexpresando YiaY con Aldh y HmfT1 de C. basilensis HMF14; círculo abierto: HMF (5-hidroximetilfurfural); cuadrado abierto: HMFCA (ácido 5-hidroximetilfuroico); rombo relleno: FDCA (ácido 2,5-furano dicarboxílico); círculo gris relleno: OD600. Se muestran los promedios de cultivos duplicados.

Figura 4. Biotransformación de HMF por P. putida CA21780, coexpresando YiaY de Bacillus kribbensis DSM17871 y Aldh y HmfT1 de C. basilensis. h Mf-OH es dihidroximetilfurano, también denominado "DHF" en el presente documento.

Figura 5. Biotransformación de HMF por P. putida CA21781, coexpresando YiaY de Aneurinibacillus terranovensis DSM18919 y Aldh y HmfT1 de C. basilensis. HMF-OH es dihidroximetilfurano, también denominado "DHF" en el presente documento.

Figura 6. Biotransformación de HMF por P. putida CA21783, coexpresando YiaY de Brevibacillus panacihumi W25 y Aldh y HmfT1 de C. basilensis. HMF-OH es dihidroximetilfurano, también denominado "DHF" en el presente documento.

Ejemplos

Metodología general

Cepas y plásmidos

[0110] Pseudomonas putida S12Agcd o P. putida KT2440Agcd (mutantes deficientes en glucosa deshidrogenasa de P. putida S12 (ATCC 700801), resp., P. putida KT2440 (DSM6125)) o P. putida S12 de tipo salvaje, se utilizaron como huésped para la expresión del gen yiaY de Aeribacillus pallidus cepa CA1828 (ver más adelante). La cepa TG90 de Escherichia coli se utilizó para fines generales de clonación.

[0111] Para la expresión episomal del gen de A. pallidus se usó el pBT'mcs derivado de pBBR1MCS (Koopman et al., 2010a, Biores Technol 101: 6291-6196). En el pBT'mcs, la expresión del gen diana es impulsada por el promotor constitutivo tac.

Medios y condiciones de cultivo

[0112] El medio de sales minerales mesófilas (MMM) contenía lo siguiente (por litro de agua desmineralizada): 15.52 g de K2HPO4, 6.52 g de NaH²PÜ⁴ , 2.0 g de (NH⁴)²SÜ⁴ , 0.1 g de MgCb ^ hhO, 10 mg de EDTA, 2 mg de ZnSÜ⁴ -7H²O, 1 mg de CaCb -2H²O, 5 mg de FeSO⁴ -7H²O, 0.2 mg de Na²MoO⁴ -2H²O, 0.2 mg de CuSO⁴ -5H²O, 0.4 mg de CoCb -6H2O y 1 mg de MnCb -2H²O, suplementado con una fuente de carbono según se especifica.

[0113] El medio de sales minerales termófilas (TMM) contenía lo siguiente (por litro de agua desmineralizada): 10 g de Bis-Tris, FeSO47H2O 10 pM, tricina 4 mM, K2HPO4 1.32 mM, n H4CI 9.53 mM, 0.2 g de extracto de levadura, 5 g de NaCI, 1.47 g de Na2SO4, 0.08 g de NaHCO3, 0.25 g de KCl, 1.87 g de MgCl2.6H2O, 0.41 g de CaCl2.2H2O, 0.008 g de SrCl2.6H2O, 0.008 g de H3BO3, 0.90 g de NaNO3 y 1 ml de solución vitamínica (tiamina, 0.1 g/l; riboflavina, 0.1 g/l; ácido nicotínico, 0.5 g/l, ácido pantoténico, 0.1 g/l; piridoxamina- HCl, 0.5 g/l; piridoxal-HCl, 0.5 g/l; D-biotina, 0.1 g/l; ácido fólico, 0.1 g/l; ácido p-aminobenzoico, 0.1 g/l; cobalamina, 0.1 g/l). Las fuentes de carbono se suplementaron según lo especificado.

[0114] Como medio completo para la propagación de mesófilos se utilizó caldo Luria-Bertani (LB): 10 g/l de Bacto triptona (Difco), 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 10 g/l de NaCl. Para el cultivo en placas, LB se solidificó con un 1.5 % (p/v) de agar (Difco). Para la selección de los transformantes de E. coli, P. putida S12 o P. putida KT2440 que portaban los plásmidos derivados de pBT'mcs, se añadieron al medio 50 pg/ml de kanamicina (Km). Los antibióticos se adquirieron de Sigma-Aldrich. P. putida se cultivó a 30 °C; E. coli se cultivó a 37 °C.

[0115] Como medio completo para la propagación de termófilos se utilizó caldo TGP: 17 g/l de triptona, 3 g/l de peptona de soja, 5 g/l de NaCl, 2.5 g/l de K2HPO4, 4 g/l de glicerol y 4 g/l de Na-piruvato (pH 7). Para el cultivo en placas, se solidificó TGP con 1.5 % (p/v) de agar (Difco). Aeribacillus pallidus se cultivó a 60 °C.

Ensayos y métodos analíticos

Medición del peso seco de la célula (CDW):

[0116] El contenido de CDW de cultivos bacterianos se determinó midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un medidor de densidad celular Biowave (WPA Ltd) o un espectrofotómetro de microplacas universal pQuant MQX200 (Biotek), utilizando microplacas de fondo plano de 96 pocilios (Greiner). Una OD600 de 1.0 corresponde a 0.56 g CDW/l (Biowave) o 1.4 g CDW/l (pQuant) para P. putida.

Análisis HPLC:

[0117] Los compuestos de furano (FDCA, HMF, HMF-alcohol, HMFCA y FFA) se analizaron mediante RP-HPLC como describen Koopman et. (2010a, Biores Technol 101: 6291-6196).

Sustancias químicas

[0118] El 5-Hidroximetilfurfural (HMF) se adquirió en Eurolabs Ltd (Poynton, Reino Unido). Los estándares analíticos del FDCA y el ácido 5-hidroximetilfuroico (HMFCA) se adquirieron de Immunosource B.V. (Halle-Zoersel, Bélgica), respectivamente, Matrix Scientific (Columbia SC, EE. UU.). Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemie B.V. (Zwijndrecht, Países Bajos).

Técnicas moleculares y genéticas:

[0119] Se aisló ADN genómico de A. pallidus CA1828 utilizando el kit de purificación de ADN gram positivo MasterPure™ (Epicenter). El ADN plasmídico se aisló con el kit de purificación de plásmidos JETSTAR Maxi (GENOMED, ITK diagnostics). Los fragmentos de ADN atrapados en agarosa se aislaron con el

[0120] DNA Clean & Concentrator™ (Zymo research). Las reacciones de PCR se realizaron con Phusion Flash PCR Master Mix (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de oligonucleótidos (especificados en los ejemplos) fueron sintetizados por Sigma-Aldrich. El ADN plasmídico se introdujo en células electrocompetentes utilizando un dispositivo de electroporación Gene Pulser (BioRad). Se llevaron a cabo otras técnicas estándar de biología molecular de acuerdo con Sambrook y Russell (2001, supra).

Ejemplo I: Aislamiento de cepas de Aeribacilluspallidus que metabolizan HMF

[0121] Se mezcló abono (15 g) con 15 ml de solución de NaCl al 0.9 % (p/v) y se incubó durante 40 min a 750 rpm y 80 °C. La suspensión de abono resultante se incubó en TMM suplementado con 0.65 g/l de HMF en matraces de agitación a 60 °C y 180 rpm durante 3 días. El cultivo se transfirió en intervalos regulares a TMM-HMF reciente y se colocó en placas sobre TMM-HMF sólido. Se volvieron a sembrar colonias individuales en placas de TMM-HMF y TGP, y se volvió a evaluar su capacidad para metabolizar HMF y también FDCA. Dos cepas que metabolizaron tanto HMF como FDCA (cepas CA1809 y CA1828) se identificaron como Aeribacillus pallidus mediante secuenciación de ADNr 16S y se seleccionaron para estudios adicionales.

Ejemplo II: Identificación de una nueva ruta catabólica de HMF catalizada por deshidrogenasa en HMF degradando aislados de A. pallidus

[0122] Los genomas de las cepas CA1809 y CA1828 de A. pallidus se secuenciaron mediante secuenciación PacBio, y se realizaron llamadas y anotaciones ORF automatizadas. En los genomas anotados, se identificaron homólogos de los genes hmfABCDE de Cupriavidus basilensis HMF14 que constituyen el clúster de degradación del ácido furoico (Koopman et al., 2010, Proc Nat Acad Sci USA 107: 4919-4924).

[0123] Considerando la capacidad de las cepas CA1809 y CA1828 para metabolizar FDCA además de HMF se sugirió firmemente que HMF se metaboliza a través de FDCA como en C. basilensis HMF14. Sin embargo, inesperadamente no se encontró ningún homólogo del clúster hmfFGH de C. basilensis HMF14 que constituya la ruta de degradación de HMF a ácido furoico a través de FDCA. Este resultado sugirió que existía una vía alternativa para la oxidación de HMF a FDCA, y posiblemente la descarboxilación posterior a ácido furoico, en los aislados de A. pallidus. La extracción de genomas en busca de clústers de genes que comprenden genes que codifican actividades oxidantes y descarboxilantes dio como resultado la identificación de un clúster de degradación putativo de HMF, que comprende genes que codifican una alcohol deshidrogenasa, una aldehído deshidrogenasa y dos descarboxilasas (Tablas 1 A y B). Juntos, estos genes codifican una vía putativa para la oxidación de HMF a FDCA, a través del ácido hidroximetilfuroico (HMFCA), como en C. basilensis HMF14 pero que implica una actividad de alcohol deshidrogenasa para la oxidación de HMFCA a ácido formilfuroico (FFA) en lugar de una actividad de oxidasa.

Tabla 1 A: Clúster de degradación putativo de HMF de A. pallidus CA1809

T l 1 B: l r r i n iv HMF A. lli A1 2

Ejemplo III: La expresión de YiaY de A. pallidus en P. putida S12 confiere la capacidad de oxidar HMF a FDCA

[0124] El gen yiaY se clonó como un fragmento Xbal-SalI sintético de 1988 pb (SEC ID N.°: 15), incluyendo la región promotora PldhL1 de B. coagulans DSM1, en pBT'mcs produciendo el plásmido pKW007. El plásmido pKW007 se introdujo en P. putida KT2440Agcd (CA1877), produciendo P. putida CA2101. Se ensayó P. putida KT2440Agcd que portaba pBT'mcs (cepa CA2046) como control de vector vacío.

[0125] Las cepas CA2101 y CA2046 de P. putida se cultivaron en matraces de agitación de 100 ml que contenían 10 ml de MM glicerol 80 mM y glucosa 2 mM suplementada con 50 mg/l de kanamicina. Las células se recolectaron al final de la fase logarítmica (DO600 ~ 4), se lavaron y se volvieron a suspender en MM suplementado con 19.4 g/l de K2HP04, 8.15 g/l de NaH2PO4, glicerol 80 mM y 50 mg/l de kanamicina. Se incubaron alícuotas (10 ml) de suspensiones de células lavadas (a una DO600 de 1-2) con HMF en matraces Erlenmeyer de 100 ml y se extrajeron muestras a intervalos regulares para el análisis de FDCA. La figura 1A muestra que el HMF se oxida rápidamente a ácido hidroximetilfuroico (HMFCA) en el control de vector vacío, mientras que la formación del FDCA estuvo totalmente ausente. Cuando se expresó YiaY (Fig. 1B), e1HMFCA acumulado se oxidó lentamente a FDCA, lo que demostró la funcionalidad de YiaY como deshidrogenasa oxidante de HMFCA.

Ejemplo IV: Oxidación optimizada de HMF a FDCA mediante la coexpresión de YiaY de A. pallidus y Aldh y HmfT1 de C. basilensis HMF14

[0126] Se sintetizó el gen yiaY de A. pallidus CA1828 incluyendo el sitio de unión al ribosoma TAGGAAAGGAAGATTAACCC (SEC ID N.°: 21). El fragmento de yiaY (SEC ID N.°: 16) se digirió con Kpnl y Xbal para reemplazar el gen hmfH en pBT'hmfH-adh (WO2012064195) lo que produjo el plásmido pKW010. El plásmido pKW010 se introdujo en P. putida S12Agcd que albergaba pJNNhmlTI(t) (WO2012064195) lo que produjo P. putida CA2111, y en P. putida KT2440Agcd (que también albergaba pJNNhmfTI(t)) lo que produjo P. putida CA2112. Por tanto, la alcohol deshidrogenasa oxidante HMFCA codificada por yiaY podría coexpresarse con la HMF deshidrogenasa y el transportador de HMFCA de C. basilensis HMF14 para eliminar los cuellos de botella de la oxidación de HMF a HMfCa y la absorción de HMFCA.

[0127] Se cultivaron CA2111 y CA2112 de P. putida en matraces de agitación de 100 ml que contenían 10 ml de MM glicerol 80 mM y glucosa 2 mM suplementada con 50 mg/l de kanamicina, 30 mg/l de gentamicina y 100 pM de ácido salicílico. Las células se recolectaron al final de la fase logarítmica (DO600 ~ 4), se lavaron y se resuspendieron en MM 50 mg/l de kanamicina, 30 mg/l de gentamicina y 10 pM de ácido salicílico. Se incubaron alícuotas (10 ml) de suspensiones de células lavadas (a una DO600 de 1-2) con HMF en matraces Erlenmeyer de 100 ml y se extrajeron muestras a intervalos regulares para el análisis de FDCA. Las figuras 2 y 3 muestran que el HMF se oxida rápidamente a HMFCA, que se oxida además a FDCA. Está claro que la coexpresión de YiaY con Aldh y HmfT1 acelera considerablemente la oxidación de HMF a FDCA.

Ejemplo V: Construcción de cepas optimizadas para la oxidación de HMF a FDCA a través de la coexpresión de alcohol deshidrogenasas de HMFCA mesófilas y Aldh y HmfT1 de C. basilensis HMF14

[0128] Los homólogos de yiaY de Bacillus kribbensis DSM17871, Brevibacillus thermoruber 423, Bacillus sp. FJAT-14578 y Bacillus sp. L1 (2012) se sintetizaron incluyendo un sitio de unión a ribosomas que contenía el espaciador ^tA^g GAAA^g G^a A^gA^tTAACCC (SEC ID N.°: 21) así como sitios de reconocimiento para enzimas de restricción (Kpnl, resp., NheI; compatible con Xbal)) para la clonación (SEC ID N.°: 19, 36, 38 y 39).

[0129] Los homólogos de yiaY de Aneurinibacillus terranovensis DSM18919 y Brevibacillus panacihumi se sintetizaron W25 incluyendo un sitio de unión a ribosomas que contenía el espaciador GAATTCCACATGACAAGGGGAGACCGC (SEC ID N.°: 40) así como sitios de reconocimiento para enzimas de restricción (KpnI, resp., Xbal) para la clonación (SEC ID N.°: 35 y 37). La secuencia de nucleótidos codificante de la enzima de B. kribbensis (SEC ID N.°: 19), la enzima de B. thermoruber (SEC ID N.°: 36) y las dos enzimas de Bacillus sp. (SEC ID N.°: 38 y 39) se obtuvieron mediante la traducción inversa de las secuencias de aminoácidos (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html) utilizando la tabla de uso de codones de P. putida de http://www.kazusa.or.jp/codon/. La secuencia de nucleótidos codificante de la enzima de A. terranova y B. panacihumi se obtuvo mediante la traducción inversa de las secuencias de aminoácidos utilizando la herramienta de optimización de secuencia de E. coli de GeneArt (https://www.thermofisher.com/nl/en/home/lifescience/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html).

[0130] Los fragmentos de homólogos de yiaY de B. kribbensis, B. thermoruber, Bacillus sp. FJAT-14578 y Bacillus sp. L1 (2012) fueron digeridos con KpnI y NheI (compatible con XbaI en pBT'hmfH-adh) para reemplazar el gen hmfH en pBT'hmfH-adh (WO2012064195) lo que produjo los plásmidos pKW2210, pKW2212, pKW2214 y pKW2215. Los fragmentos de homólogos de yiaY de A. terranovensis y B. panacihumi fueron digeridos con KpnI y Xbal para reemplazar el gen hmfH en pBT'hmfH-adh (WO2012064195) lo que produjo los plásmidos pKW2211 y pKW2213.

[0131] Los plásmidos pKW2210, pKW2211, pKW2212, pKW2213, pKW2214 y pKW2215 se introdujeron en P. putida KT2440Agcd_pJNNhmfT1 (CA1965), lo que produjo respectivamente, P. putida CA21780, CA21781, CA21782, CA21783, CA21784 y CA21785 para la expresión de los homólogos de YiaY en un entorno huésped optimizado que incluía aldh y hmfTI. Para la evaluación del rendimiento, las cepas de P. putida CA21780, CA21781, CA21782, CA21783, CA21784 y CA21785 se cultivaron en matraces de agitación de 100 ml que contenían 10 ml de MM glicerol 80 mM y glucosa 2 mM suplementada con 50 mg/l de kanamicina, 30 mg/l de gentamicina y 100 pM de ácido salicílico. Las células se recolectaron al final de la fase logarítmica (DO600 ~ 4), se lavaron y se resuspendieron en MM 50 mg/l de kanamicina, 30 mg/l de gentamicina y 10 pM de ácido salicílico. Se incubaron alícuotas (10 ml) de suspensiones de células lavadas (DO600 de 1-2) con HMF en matraces Erlenmeyer de 100 ml y se extrajeron muestras a intervalos regulares para el análisis de FDCA. Los resultados para P. putida CA21780, CA21781 y CA21783 se muestran en las figuras 4, 5 y 6, respectivamente. Las tres cepas transformadas produjeron FDCA a partir de HMF. Sin embargo, las diferentes cepas mostraron marcadas diferencias en la acumulación transitoria de HMFCA y la reducción parcial de HMF a dihidroximetil furano (HMF-OH o DHF). También se encontró que las cepas de P. putida CA21782, CA21784 y CA21785 producen FDCA a partir de HMF, lo que demuestra la funcionalidad de las seis alcohol deshidrogenasas como enzimas oxidantes de HMFCA.

Ejemplo VI: Construcción de una cepa de P. putida que exprese el transportador HMFCA codificado por proP de Aeribacillus pallidus

[0132] El gen proP (SEC ID N.°: 18) se amplificó a partir de ADN genómico de Aeribacillus pallidus CA1828 por PCR usando los cebadores proP(f) (gccgaattcATGAAGAATATCGCTAATACG; SEC ID N.°: 22) y proP(r) (gccgctagcTTATTTGAGGTTTCCTTTTGTTTCC; SEC ID N.°: 23). El producto de PCR se introdujo como un fragmento de EcoRI-Nhel de 1350 bp (SEC ID N.°: 20) en pJNNmcs(t) lo que produjo pJNNproP(t). Los plásmidos pBT'hmfH_aldh y pJNNproP(t) se introdujeron sucesivamente en P. putida KT2440Agcd (CA1877), lo que produjo P. putida CA21783. Se cultivó P. putida CA2111 y CA2112 en matraces de agitación de 100 ml que contenían 10 ml de MM glicerol 80 mM y glucosa 2 mM suplementada con 50 mg/l de kanamicina, 30 mg/l de gentamicina y 100 pM de ácido salicílico. Las células se recolectaron al final de la fase logarítmica (DO600 ~ 4), se lavaron y se resuspendieron en MM 50 mg/l de kanamicina, 30 mg/l de gentamicina y 10 pM de ácido salicílico. Se incubaron alícuotas (10 ml) de suspensiones de células lavadas (DO600 de 1-2) con HMF en matraces Erlenmeyer de 100 ml y se extrajeron muestras a intervalos regulares para el análisis de FDCA. Es evidente que la expresión del transportador de HMFCA codificado por proP acelera considerablemente la oxidación de HMF a FDCA en comparación con una cepa de control correspondiente que no expresa proP.

Tabla 2: Alineación de secuencias de aminoácidos YiaY

Adh_Bp ---------MESPFSFHLPTNVQFGVGSASRLGEMLLSMGVRRVFLVTDQGVRQAGLLDE Adh_Bk ---------MDVEFSFHLPTLIEFGFGKASLLGERLLKIjGVGNVFLVSDKGVASAGLLqK Adh_Bt — MSQTVQGTDFAFSFHLPTLIEFGYGRASRLGERLQHLGVTNVFWTDKGVEAAGLLNG Adh_At — MSPAVKAINFEFSFNLPTLIEFGYGKMEKFGQQLISIGVKRIFMVTDKGVESAGLLAA YiaY MIGNYAKKAIDFEFTFYLPTLIEFGYGKASRMGEMLEQMGIKNVFLVTDKGVEAAGLLAG Adh_G k MVGHYIQKEVEFEFSFHLPTSIQFGYGKASQLGNQLVDMGIKSAFLVTDRGVEATGLLAG Adh_B sp -------- MYPSFEFHLPTKIHFGYNTIKQLDH— LPFEIKRAFIVTDQGVLNSGLVEN Adh_BspLl

Adh_Pt

Adh_Dk

Adh Dt MKTTVCFGANIVSSIDDRCRDYNARHVLIVTDQGVEKAGILEK

Adh_Bp VIH5LEEKGLHFQIYADVEPDPSLETIQAGAAMFQQQSFDCMVAJGGGSPIDTAKGIRVL Adh_Bk LEQSLQTSDIHFKTYLEVEPDPSLETIDLGAEAFNSGKYDCIVAVGGGSAIDTAKGIRVV Adh_Bt LVGSLQSAGIAFDLYTEVEPDPGLETIDRGAAVFRAKPYDCLVAVGGGSPIDAAKGMRVV Adh_At LTDSLQAAAIQFDI YTDVESDPSLETIDRGVEVFQQKPY'DCIVAVGGGSPIDTAK.GIRVV YiaY IVQSLESSNIRYVIYSDVEPDPSLETIDRGASVFKEQSFDCILAVGGGSPIDTAKGIRVV AdhGk IIQSLESSNIQYCVYADVEPDPSLETIDQGAAAFKEQPFDCIVAIGGGSPIDTAKGIRVV AdhBsp VTNILKDHQISYVIY3EVEPDPSVETVDKAAQMFQREEADALIAIGGGSPIDTAKGVRVI AdhBspLl ---------------------PSVE TVDKAAKA FAEAECDLLIAVGGGSPIDTAKGVRVV AdhPt -----------------VEPDPGLE TVHKAAAFLGRT RPDCLVALGGGS3IDVAKGARVI Adh_Dk --------------------DPGLET1HRCASCFRENKCDLILAVGGGSPIDTAKGARVI Adh Dt VEKVLSDAGIENWFDDVEPDPGLETIHRCASCFRENKCDLFLAIGGGSPIDTAKGARII * r k k w * i r * * k * k k k k k k k k k k * w

Adh_Bp AANGGGIGQYAGVNRVPAASAIPLIAIPTTSGTGSEVTIFGVYSDWENHVKITVTSPHMA Adh_Bk AGNGGSIGDFAGVDKIGKAPQIPLIAVPTTSGTGSEVTIFGVYSDWVKNVKVTVTSQYMA Adh_Bt TSCGGSIADYAGVNRVPMAPAVPLVAVPTTSGTGSEVTMFGVYSDWHNHVKVTVTSPHMA Adh_At AANGGNIGHYAGVNQIPVAPTIPLLAIPTTSGTGSEVTNFGVYSDWQNNVKVTVTSQYMA YiaY VTNGGNIGDYAGVNRVAKKSEIPLVAVPTTSGTGSEVTTFGVYSDWENQVKVTVTSPYMA Adh_Gk ATNGGSIGDYAGVKRIKKKSEIPLIñLPTTSGTGSEVTIFGVYSDWKNNVKVTVTSPYMA Adh_Bsp AGNGGSIRDYAGVNLIKQKSNIPLIAIPTTSGTGSEVTIFAVFSDWEENRKVTVTSPFLA Adh_BspLl ASNGGSIRNYSGVNLVKEAPSVPLVAIPTTAGTGSEVTIFAVFSDDKENRKVTVTSSHLS Adh_Pt YDNGGKISDYAGVNKVKVKPSLPLMAVPTTAGTGSEVTVFAVLSDWEQNIKITVTSEYLA Adh_Dk VENGGHIRDYAGVNKVPRAPVTPLIAIPTTSGTGSEVTTFAVLSDWENRMKITISSPFLA Adh Dt VDNGGHIRDYAGVNKVPRAPRTPLLAIPTTSGTGSEVTTFAVLSDWENRMKITISSPFLA kk * •*kk m m kk*kmkkk*kkkkkkk k k kk ■ k •k •*k • • Adh Bp PSTALIDPALTLSLPAKMTAATGIDALAHGIETFFSLRSSPASDALAIHAMKMIAPHLRR Adh Bk PTIALVDPELTMRLPRKMTAASGIDALAHGIESYFSLRSTSASRALSLEAINIVGNHLRQ Adh Bt PTIALVDPALTVSLPAKMTAASGIDALAHGIETFFSVRSRPASDALAMEAIAAVNAHLRR Adh At PTIAWVDPALTMSLPAKMTAASGI DALAHGIETFFSLGSSPASDALAIEAIHTVNRYLSR YiaY PEIALVDPELTMSLPQKMTAASGIDALAHGIETFFSLRSRPASDALAVEAMATVSAYLRR Adh Gk PEIALVDPKLTMSLPKKITAASGIDALAHGIETFFSLRSQPISDVLAIEAMTTVNRYLRR Adh Bsp PDISIVDPKMTMTAPPAITAASGFDAFAHGAETFVSRASQPASDVLAFSAMSTVSKYLRR Adh BspLl PDVSIIDPKLTLTAPPSITAAAGFDAFAHAAEAFVSRISQPPSDALALSAMKTVHTYLRR Adh_Pt PEAAFVDPLAMVSAPPGITAASGIDALSHAVEAYVSRAASPVSDNLALGAVELIGGHLRQ Adh Dk PEVAWDPLLTMTAPPSVTAASGIDALSHAIETYVSLKAQPPAEALALKAIELIGESLRT Adh Dt PEVAWDPILTLTAPPSVTAASGIDALSHAIETYVSLKAQPPAEALALKAIELIGESLRA ^{i r} » • ^-k • ^{-k i r i r} • ^{i r} • ^{i r i r} • ^{.•Jr i r} •• ^{i r -} • ^{i r} • ^~k • • ^{i r}

Adh Bp AVRDGADMEARIGMSQGSVLAGMAFNNGFLGLAHAIGSALSGHCHVPHGVAIGLLLPHW Adh Bk SVANGEDKEARCGMSHGSLLAGMAFNNGFLGLAHAIGSALSGHCHVPHGVAIGLLLPHW Adh Bt AVHDGSDVEARIGMSHGSLLAGMAFTNGFLGLAHAIGSALSGHCHVPHGIAIGLLLPHW Adh At AVHNGSDMEARIGMSHGSLLAGMAFNNGFLGLAHAIGSALSGHCHVPHGVAIGLLLPKW YiaY AVEDGTDKEARIGMSQGSLLAGMAFNNGFLGLAHAIGSALSGHCHVSHGVAIGLLLPKW Adh Gk AVEDGTNKEARIGMSYGSLLAGMAFNNGFLGLAHAIGSALSGHCHVSHGVAIGLLLPKW Adh Bsp AVYNGEDVEARIKMAEASLLAGMAFNQSYLGLTHAIGSALSGHAHVSHGVAIGLLLPGVI Adh BspLl AVYNGDDIEARMKMAEASLLAGMAFNQSYLGLAHAIGSAISVHAHVSHGWIGLLLPKVI Adh_Pt AVANGGDLAARTGAALGSLLAGMAFNNAFLGLTHSIGAALSGHVHVSHGVAVGLLLPYVM Adh Dk AVADGSDKEARTRMSLGSLLAGMAFNNSLLGLTHSIGAALSGHAHVSHGMAIGLLLPYVM Adh Dt AVADGSNKEARTKMSLGSLLAGMAFNNSLLGLTHSIGAALSGHAHVSHGMAVGLLLPYVM ^{• k} • ^{i r -} ★ ^{i r « k - i r i r i r i r ' k ' k} • ^{- k ' k i r m ' k * i r i r » i r » ' k i r i r i r i r i r} • • ^{-k i r i r k ~k k} •

Adh Bp AFNTPVRPEKAELIADVLGSV--QKET--- GTAAELVGQLVQDIGLPQRLQEVGVPEAK Adh Bk EFNSSECPDQAAEIAKILGVK--AE DERQLAEQASHAVGDLVKDIGLPTRLRDMNVPEEK Adh Bt AFNAPARPDKAAQLARLLGVE— ANPREERGEETSAAVARMVADIGLPTRLRDVGVPEEK Adh At EFNATVRPDKAAKIAGLMGMK--GEHSEELALQASPAVARLVEDIGLPTRLREVDVTEKK YiaY EFNARVRPEKAAKIAE LLGVK--GDREEVLAEQAAPAVASLVKEIGLPT RLRDVDVS EEK Adh Gk EFNSWQPEKAAKI AELLGRK--GNQNT-LVQQAALAVASLVKEIGLPT RLRDVDVPKEK Adh Bsp RYNSISRMDKHIEMAGAFREIDRSLSDWEIIDQLIEDVSRLRDDIGLPQRLQQVGVKEDQ Adh BspLl EYNLVAKIDKYAEAGKYIEQSSHGLSNYEAAALFSETVTQLRNDIGLPKQLREVNVKEAQ Adh_Pt EYNLMAKPDKFARLARAMGEVTEGKSLYRAASLAPRAVKAMVKSIGLPVRLKEIGVPEGA Adh Dk EFNAMARMEKFSKIAVALGEDVKGLSLREAALRSVKAVRELVEDISLPRRLGDVGVTGDM Adh Dt EFNAMARLEKYGKIAIALGEDVKGLSLREAALRSVKAVRELVEDISLPRRLGEVGVTGDM Adh_Bp LVDIAKDSFKSGMMKWNPRLPTEQEVLELLQKAF

Adh_Bk LADIARDSFQSGMMKFNPRRASESEVLELLHRVY

Adh_Bt LPAIAKDAFKSGMMTCNPRQPTEQEVRELLRRAF

Adh_At LFEIAKDSFKSGMMKFNPRQPSESEVLQLLKEIF

YiaY LPDIARDAFKSGMMKFNPRQPSLSEVLTLLQQIY

Adh_Gk LPDIAKDSFKSGMMRFNPRQPSEAEVMTLLQQIY

Adh_Bsp LKMIAADSVKSGMWKFNPRQASEEEILELLKELY

Adh_BspLl LEAISKDSIKSGMWQFNPRRASEQDVYQMLREML

Adh_Pt LAAIAETALKHGMIKFNPRVPSREDILDIVKKAY

Adh_Dk IEGMAKDAMGHGMLKFNPRAVTEKDIIAILRKAL

Adh Dt IEGMAKDAMGHGMLKFNPRWTEKDIMAILQKAL

[0133] Adh_Bp = SEC ID N.°: 6 (Brevibacillus panacihumi), Adh_Bk = SEC ID N.°: 2 (Bacilo kribbensis); Adh_Bt = SEC ID N.°: 5 (Brevibacillus thermoruber); Adh_At = SEC ID N.°: 4 (Aneurinibacillus terranovensis); YiaY = SEC ID N.°: 1 (Aeribacillus pallidus); Adh_Gk = SEC ID N.°: 3 (Geobacillus kaustophilus); Adh_Bsp = SEC ID N.°: 7 (Bacillus sp. FJAT-14578); Adh_BspL1 = SEC ID N.°: 10 (Bacillus sp. L1 (2012)); Adh_Pt = SEC ID N.°: 11 (Pelotomaculum thermopropionicum); Adh_Dk = SEC ID N.°: 8 (Desulfotomaculum kuznetsovii); y Adh_Dt = SEC ID N.°: 9 (Desulfurispora thermophila). Los símbolos debajo de la alineación indican: * = posiciones invariantes; :

= posiciones fuertemente conservadas; . = posiciones menos conservadas; ningún símbolo indicaba posiciones no conservadas.

Tabla 3: Alineación de secuencia de aminoácidos (Clustal Omega) del transportador MFS de A. Pallidus (transportador HMFCA) con los 10 mejores resultados de BLAST

Transportador de Aeribacillus

MKNIANTSTERPVt-IDASVKNRQMVRATIASLIGWSLDLYDLFLLLFVATTIGHLFFPASN

gi|499548718|refIWP_011229501.1|:1-445 MDNITKTKIERPVE-VSIKISQMVFATIASLIGWAIDLYDLFLLLYVATTIGNLFFPASN

gil6519772331ref|WP_026691821.11:7-435 -----------------NNRQLVSATMASLLGWSFDLYDLFILLYVrPTIGSLFFPSSN

gil6549451261ref|WP_028395291.11:1-445 MSNWAT--HSKQESVTVSKREVRSAMVASLLGWSFDLYDLFLLLFVAPTISVLFFPTTN

gil7373339631ref|WP_035316274.11¡3-438 -------SSNQPPKVEISRRQMVIIASIASLLGWALDLFDLFVLLYVAPVIGKLFFPTEL

gil5586171991gblEST53422.11:ll-446 -------SSNQPPKVEISRRQMVNASIASLLGWALDLFDLFVLLYVAPVIGKLFFPTEL

gi|737314460|ref|WP_035297308.1|:18-449 -----------RPPAAVGRKQMITAVLASLLGWSLDLYDLFILLYVTPVLGKLFFPADN

gi|656061131iref|WP_029098927.11¡18-449 -----------RPPAAVGRKQMITAVLASLLGWSLDLYDLFILLYVTPVLGKLFFPADN

gil5031664691ref|WP_013401130.11¡2-445

SANMETPVQQASALAAAISRKQMIIAVMASLLGWSLDLYDLFILLYVAPELGKLFFFTDK

giI505187461IrefIWP_015374563.1|¡8—445 -----NVQQTSSLTVSISKKQMITAVTASLLGWSLDLYDLFILLYVAPELGKLFFPADK

gil6121202561gb|EZP78263.il¡2-445

SVNTETTVQQASPLTVSISRKQMIIAVMSSLLGWSLDLYDLFILLYVAPELGKLFFPTDK

Transportador de Aeribacillus

QTLSLAAVYASFAVTLLMRPLGSAIFGIYADKNGRKKAMTVA11GAGLCTAAFGLLPT1H gil4995487181ref|WP_011229501.1 |:1-445 QTLSLAAVYASFAVTLLMRPLGSAIFGVYADKNGRKKAMTVAIIGAGLSTTAFGLLPT1H gi|6519772331ref|WP_026691821.1I:7-435 PTLSLAAVYASFAVTLLMRPLGSAIFGSYADKMGRKKAMTVAIVGVGVSTAVFGLLPTVP

gi|6549451261ref|T/JP_028395291.11:l-445

PTLSLAAVYASFAVTLLMRPLGSAIFGSYADK1IGRKKAMIVSWGVGVSTAAFGLLPTVP gi|7373339631ref|WP_035316274.1|:3-438 PTL5LAAVYASFAVTLLMRPIGSALFGSYADRKGRKKAMIVAVIGVGVATALFGALPTVH gil558617199|gb|EST53422.1|:11-446 PTLSLAAVYASFAVTLLMRPIGSALFGSYADRKGRKKAMIVAVIGVGVATALFGALPTVH

gi|737314460Jref|WP_035297308.11:18-449

PTLSLAAVYASFAVTLLLRPFGSALFGSYADRMGRKRAMWAVSGVGISTALFGVLPTVA

gil6560611311ref|T/JP_029098927.11:18-449 PTLSLAAVYASFAVTLLLRPFGSALFGSYADRMGRKRAMWAVSGVGISTALFGVLPTVA

gi|5031664691ref|WP_013401130.11:2-445

PTLSLAAVYASFAVTLFMRPLGSALFGAYADRNGRKRAMWAV5GVGISTALFGALPTVA gil5051874611ref|WP_015374563.11:8-445 PTLSLAAVYASFAVTLFMRPLGSALFG3YADRNGRKRAMWAV3GVGISTALFGALPTVE gil612120256|gb|EZP78263.11:2-445 PTLSLAAVYASFAVTLFMRPLGSALFGTYADRNGRKRAMWAVSGVGISTALFGALPTVA

Transportador de Aeribacillus

QVGWAAIAFLILRLVQGVFVGGWASTHTIGTE5ASPKYRGFMSGLIGGGGAGLGALFA gil4995487181ref|WP_011229501.11:1-445 QVGVAASIAFLILRLVQGIFVGGWASTHTIGTESASPKYRGLMSGLIGGGGAGLGALFA

gil6519772331ref|WP_026691821.11:7-435 QIGVFATIIFLVLRLCQGIFVGGWASSHTIGTESAPPKLRGU4SGLIGGGGAGLGALFA gi1654945126|ref|WP_028395291.1| :1-445 QIGFMASIIFLVLRLVQGIFVGGWASTHTIGTESAPPKWRGLMSGLIGGGGAGLGALFA

gil7373339631ref|WP_035316274.11:3-438 QIGVGASIIFLILRLVQGIFVGGWASTHTIGTESVPPKWRGFttSGFVGGGGAGLGALLA gi|558617199|gb|EST53422.1|:11-446 QIGVGASIIFLILRLVQGIFVGGWA5THTIGTESVPPKVJRGFMSGFVGGGGAGLGALLA gil7373144601refIWP_035297308.11:18-449

HIGAAATILFIILRLIQGVFVGGWASTHTIGTESVPEKWRGLMSGLVGGGGAGLGALLA

gil6560611311ref|WP_029098927.11:18-449 HIGAAATILFITLRLIQGVFVGGWA5THTIGTESVPEKWRGLMSGLVGGGGAGLGALLA giI5031664691ref|WP__013401130.1| :2-445

QIGAAAAIIFIILRLVQGVFVGGWASTHTIGTESVPEKWRGLMSGLVGGGGAALGALLA

gi15051874611ref|WP_015374563.1|:8-445

QIGAAAAIIFIILRLIQGVFVGGWASTHTIGTESVPEKWRGLMSGLVGGGGAALGALLA

gil6121202561gbIEZP78263.il:2-445 QIGAAAAIIFIVLRLIQGVFVGGWASTHTIGTESVPEKWRGLMSGLVGGGGAALGALLA

..* *.* ..***

**.-***-*-***-*.*-***-*-*■*- * ★*.*★★..*■*■+*•■* **+■*.•*

Transportador de Aeribacillus

SISYSWTAIFPGEAFDVWGWRVMFFTGIIGSLFGLFIFRSLEESPLWKQLKEENSKGEV

giI499548718|refIWP_011229501.1I:1-445 SIAYSIVSAIFPGDAFDTLGWRIMFFTGIIGALFGLFIFRSLDESPLWKQLKEKQSKDKM

gi16519772331ref|WP_026691821.1|:7-435 SIAFTWS5FFPGEAFSEWGWRVHFFTGILGAIAGLFVFRTLDE5PLWKGLQEEKKGKAV

gij6549451261ref|WP_028395291.11:1-445 SIAFAII$ALFPGEAF!IEWGWRVLFFTGLLGAGAGLIVFRSLNESPLV?AQLHEEKKKTME gi|7373339631ref|WP_035316274.1|:3-438 3IVYFIVSEAFPGEAFDAT/7GWRFMFFAGILSAVLGVFVFK5LEESPLWLQAQQKKE--A

gil5586171991gb|EST53422.11:11-446 SIVYFIVSEAFPGEAFDAWGV7RFMFFAGILSAVLGVFVFKSLEESPLWLQAQQKKE--A gi|737314460|ref!WP_035297308.1|:18-449 SIVYFVLSSLFPGEAFSEWGWRFMFFTGILCSVLGLFVFRMLEE3PLWV0HKNEQA--A gi|6560611311ref|WP_029098927.1|:18-449 SIVYFVLSSLFPGEAFSEWGWRFMFFTGILCSVLGLFVFRMLEESPLWVQHKNEQA--A

gil503166469|ref|WP_013401130.11:2-445 3IVYFVLSSVFSGPEF3EWGWRFMFFTGILS5VLGLFVFKKLEESPLWMQHKKKQE--T

gil5051874611ref|WPJH5374563.11:8-445 SIVYFVLSSIFPGPEFSEWGWRFMFFTGILSSVLGLFVFKKLEESPFWVQHKKVQE--T

gi|612120256|gb|EZP78263.1|:2-445 SIVYFVLSHIFSGSEFSEWGWRFMFFTGILCSVLGLFIFKKLEESPLV7VQHKKDQE-- M

• * * • h • - * - * . - *

Transportador de Aeribacillus

5EFQKAPLKTFFTKYYKVLLVNLMIVIGGGSGYYLT5GFIPTFLKWNKV5ASV35GVL

gi| 499548718 Iref|WP__011229501.11:1-445 VEQQKSPFKMFLTKYYKVLFVHLMIVIGGGSGYYLTAGFIPTFLKWNKVPAAVSSGVL

gi|651977233|ref|WP_026691821.1 |:7-435 SHTIEQKPVKTLFTTYSKVLLVNLMIVIGGGTGYYLTAGFIPTFLT11HDVSPGTK5GIL gi|6549451261ref|WP_028395291.1I:1 - 445 EDAVPQSPIKMLFKQYPGVLLVNVMIVMGGGSAYYLTSGFVPTFLKWHEAPP1JVISGVL gi|7373339631ref|WP_035316274.1 |:3-438 AKKPEGSPVKMIFTQYRIIVLLVNLMLVTGGGTAYYLTSGYLPTFLNVINKVSSGTASLIL

gi|558617199IgbIEST53422.il:11-446 AKKPEGSPVKMIFTQYRNVLLVNLMLVTGGGTAYYLTSGYLPTFLHVINKVSSGTASLIL

gi|7373144601ref|WP_035297308.1 |:18 -449 KPAGQQSPVKMVTTKYLPVLLVNLLIVIGGGSAYYLTSGYLPTFLNV1HHVPQTTASMIL gi|656061131Iref|WP_029098927.1|:18-449 KPAGQQSPVKMVFTKYLPVLLVNLLIVIGGGSAYYLTSGYLPTFLNVINHVPQTTSSMIL

gi| 5031664691 ref|V7P_ 013401130.11:2-445 KPEYQQSPVKMVFTKYLSVLLVNLMIVIGGGSAYYLTCGYLPTFLKVINNIPQTVSSIIL

gi| 5051874611ref|V7P__015374563.11:8-445 KPEÍÍEQSPVKIVFTKYLSVLLINLMIVIGGGSAYYLTCGYLPTFLKVINNIPOTVSSMIL

gil 612120256|gbIEZP78263.il:2-445

KPENQQSPVKMVFSKYLSVLLINLMIVIGGGSAYYLTCGYLPTFLKVIUNIPQTVSSMIL

Transportador de Aeribacillus

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Transportador de Aeribacillus

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para oxidar ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (HMFCA) a ácido 5-formil-2-furoico (FFA), donde el proceso comprende la etapa de incubar una célula en presencia de HMFCA, preferiblemente en condiciones propicias para la oxidación de HMFCA por la célula, donde la célula comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la SEC ID N.°: 11, y donde el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión.

2. Proceso para producir FDCA, que comprende el paso de incubar una célula en un medio que comprende uno o más precursores furánicos de FDCA, preferiblemente en condiciones propicias para la oxidación de los precursores furánicos de FDCA por la célula a FDCA y, opcionalmente, recuperar el FDCA, donde la célula comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID N.°: 1 a 11, donde el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la HMFCA deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión,

donde preferiblemente, al menos un precursor furánico de FDCA se selecciona del grupo que consta de HMF, 2,5-dihidroximetil furano (DHF), HMFCA, FFA y 2,5-diformil furano (DFF), de los cuales HMF es el preferido, y donde preferiblemente los precursores furánicos de FDCA se obtienen a partir de uno o más azúcares de hexosa, preferiblemente uno o más azúcares de hexosa obtenidos de biomasa lignocelulósica, preferiblemente por deshidratación catalizada por ácido.

3. Proceso para producir FDCA según la reivindicación 2, en el que el FDCA se recupera del medio mediante un proceso que comprende precipitación ácida o salina seguida de cristalización por enfriamiento y/o extracción con disolvente.

4. Proceso para producir un polímero a partir de uno o más monómeros de FDCA, que comprende las etapas de:

a) preparar un monómero de FDCA en un proceso según las reivindicaciones 2 o 3; y

b) producir un polímero a partir del monómero de FDCA obtenido en a).

5. Uso de una célula para la biotransformación a FDCA de uno o más precursores furánicos, donde preferiblemente, al menos un precursor furánico de FDCA se selecciona del grupo que consta de HMF, DHF, HMFCA, FFA y DFF, de los cuales HMF es el preferido, donde la célula comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID N.°: 1 a 11, y donde el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la HMFCA deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión.

6. Célula que comprende un constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una HMFCA deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 81.65 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1, donde el constructo de expresión se puede expresar en la célula y la expresión de la HMFCA deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar HMFCA a FFA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del constructo de expresión.

7. Célula según la reivindicación 6, donde la célula tiene además al menos uno de los siguientes:

a) una actividad de aldehido deshidrogenasa que oxida los aldehidos furánicos a los ácidos carboxílicos furánicos correspondientes, donde preferiblemente la célula comprende una segundo constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una aldehído deshidrogenasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID N.°: 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, donde el segundo constructo de expresión es expresable en la célula y la expresión de la aldehído deshidrogenasa confiere o aumenta en la célula al menos una de las capacidades siguientes: i) oxidar 5-hidroximetilfurfural (HMF) a HMFCA, ii) oxidar DFF a FFA y iii) oxidar FFA a FDCA, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del segundo constructo de expresión; y

b) la capacidad de transportar compuestos furánicos hacia dentro y/o hacia fuera de la célula, donde preferiblemente la célula comprende un tercer constructo de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID N.°: 17, 31, 32, 33 y 34, donde el tercer constructo de expresión es expresable en la célula y la expresión del polipéptido confiere o aumenta en la célula la capacidad de transportar al menos HMFCA al interior de la célula, en comparación con una célula de tipo salvaje correspondiente que carece del tercer constructo de expresión.

8. Célula según la reivindicación 7, donde la célula es una célula microbiana, preferiblemente la célula es una levadura o una célula fúngica filamentosa seleccionada de un género del grupo que consta de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Myceliophthora, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma, más preferiblemente una levadura o una célula fúngica filamentosa seleccionada de una especie del grupo que consta de Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Myceliophthora thermophila, Trichoderma reesei y Penicillium chrysogenum; o, preferiblemente la célula es una célula bacteriana seleccionada de un género del grupo que consta de Escherichia, Anabaena, Aeribacillus, Aneurinibacillus, Burkholderia, Bradyrhizobium, Caulobacter, Cupriavidus, Desulfotomaculum, Desulfurispora, Gluconobacter, Rhodobacter, Pelotomaculum, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Geobacillus, Brevibacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Ralstonia, Rhodopseudomonas, Staphylococcus y Streptomyces, más preferiblemente una célula bacteriana seleccionada de una especie del grupo que consta de A. pallidus, A. terranovensis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. kribbensis, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, B. thermoruber, B. panacihumi, C. basilensis, D. kuznetsovii, D. thermophila, G. kaustophilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pelotomaculum thermopropionicum, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

9. Polipéptido que tiene actividad de HMFCA deshidrogenasa, cuyo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81.65 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1.

10. Molécula de ácidos nucleicos que comprende al menos una de las siguientes:

a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido como se define en la reivindicación 9;

b) una secuencia de nucleótidos como la establecida en la SEC ID N.°: 12 o 13;

c) una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una secuencia de nucleótidos de b) debido a la degeneración del código genético; y

d) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los puntos a) a c),

donde, preferiblemente, la molécula de ácidos nucleicos es un vector.