ES2543568T3 - Célula genéticamente modificada y procedimiento de uso de dicha célula - Google Patents

Célula genéticamente modificada y procedimiento de uso de dicha célula Download PDF

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Tom Daniël ELINK SCHUURMAN
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Abstract

Célula modificada genéticamente que comprende: (i) una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que tiene capacidades de transporte de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF), que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4; e (ii) una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido HMF; caracterizado porque dicha célula es modificada genéticamente mediante la introducción funcional de al menos la primera secuencia de polinucleótidos y, preferentemente, mediante la introducción funcional de la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Célula genéticamente modificada y procedimiento de uso de dicha célula
Campo de la invención
La presente invención en general se refiere al campo de la biotransformación de compuestos furánicos. Dichas
5 biotransformaciones encuentran utilidad en la producción de ácido furan-2,5-dicarboxílico (FDCA) y el procesamiento de material que contiene lignocelulosa para, por ejemplo, la producción de biocombustibles y productos bioquímicos. Más en particular, la presente invención se refiere a nuevas células modificadas genéticamente con mejores características para la transformación biocatalítica de compuestos furánicos. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un vector adecuado para la modificación genética de una célula huésped para mejorar sus características y
10 la biotransformación de compuestos furánicos. Otros aspectos de la invención se refieren a procesos para la biotransformación de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF) y sus precursores con el uso de la célula de acuerdo con la invención.
Antecedente de la invención
La biotransformación de compuestos furánicos está recibiendo una atención cada vez mayor. Esto es tanto en
15 cuanto a la bioproducción de ácido furan-2,5-dicarboxílico (FDCA), que es un prometedor producto químico de valor añadido de la biomasa (Werpy y col., (2004)) y en cuanto a su papel negativo en la producción fermentativa de biocombustibles y productos bioquímicos a partir de materiales que contienen lignocelulosa (Almeida y col., (2009)).
Recientemente se ha aislado un compuesto furánico utilizando un organismo, Cupriavidus basilensis HMF14, (Koopman y col., (2010a). Este organismo es capaz de metabolizar furfural y 5-(hidroximetil)furan-2-carbaldehído
20 (HMF). La ruta de degradación de furfural y HMF de Cupriavidus basilensis HMF14 se ha divulgado en Koopman y col., (2010a) junto con los genes implicados.
La introducción funcional del gen hmfH de Cupriavidus basilensis HMF 14 en Pseudomonas putida S12 se divulga en Koopman y col., (2010b). La cepa resultante tiene buenas capacidades de producción de FDCA usando HMF como sustrato. No obstante, la acumulación observada de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido-HMF)
25 requeriría tiempos de procesamiento prolongados o medidas alternativas para eliminar este subproducto. La eliminación suficiente del subproducto de ácido-HMF es deseable para muchas de las aplicaciones para las cuales el FDCA puede producirse y, en ocasiones, es incluso esencial.
En búsqueda de una solución al problema de la acumulación de ácido HMF, los inventores de la presente invención han encontrado ahora sorprendentemente que la expresión de ciertos polipéptidos en el sistema de producción de
30 Pseudomonas putida S12 FDCA reduce eficazmente la acumulación de ácido HMF.
Sumario de la invención
Los presentes hallazgos de los inventores han dado como resultado el concepto generalizado de que la expresión en un huésped de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 1 o 2 o sus análogos/homólogos (tales como las SEC ID Nº 3 o 4) junto con uno o más polipéptidos capaces de la conversión de 35 ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF), tiene como resultado la bioconversión eficaz del ácido HMF. La mejora de la bioconversión de ácido HMF es beneficiosa para la eliminación de ácido HMF y sus precursores furánicos a partir de materias primas, en las que los compuestos furánicos se consideran perjudiciales, tales como materias primas para fermentaciones etanologénicas para la producción de, por ejemplo, biocombustibles o para fermentaciones para la producción biológica de productos químicos. En otras aplicaciones, la mejora de la
40 bioconversión de ácido HMF mejorará la bioproducción de una sustancia química en la que el ácido HMF es un material de partida o un intermedio, tal como en la bioproducción de FDCA.
En consecuencia, un primer objeto de la invención es una célula modificada genéticamente que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4 o sus análogos / homólogos y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un 45 segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido HMF. El polipéptido convertidor de ácido HMF puede ser la oxidorreductasa codificada por el gen hmfH de Cupriavidus Basilensis HMF14 descrito previamente (Koopman y col., 2010a y Koopman y col., (2010b). De acuerdo con determinadas realizaciones se prefiere que la célula modificada genéticamente comprenda una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica un tercer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o sus análogos / homólogos. La
50 expresión funcional de las terceras secuencias de aminoácidos tiene como resultado actividad aldehído deshidrogenasa capaz de convertir aldehídos furánicos.
Si el segundo polipéptido es una oxidorreductasa, la coexpresión del primer polipéptido simultáneamente con la oxidorreductasa también puede mejorar la calidad de un biocatalizador de célula completa que comprende la oxidorreductasa con respecto a la producción biocatalítica FDCA.
imagen2
La célula de acuerdo con la invención es modificada genéticamente mediante la introducción funcional de, al menos, la primera secuencia de polinucleótidos. Preferentemente, la célula se modifica genéticamente mediante la introducción funcional tanto de la primera como la segunda secuencia de polinucleótidos. Como alternativa, la célula se modifica genéticamente mediante la introducción funcional de la primera y la segunda secuencia de
5 polinucleótidos. La introducción funcional de los tres del primero, el segundo y el tercer polinucleótido es una alternativa adicional.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un vector adecuado para la modificación genética de una célula huésped. El vector comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4 o sus análogos / homólogos y una segunda secuencia de
10 polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido 5-(hidroximetil)furan-2carboxílico (ácido HMF). Opcionalmente, el vector puede comprender una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica un tercer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o sus análogos / homólogos. Tal vector es adecuado para obtener una célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención.
15 Otros aspectos de la invención se refieren a un proceso de conversión de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF). Este proceso hace uso de la célula de acuerdo con la invención. De acuerdo con realizaciones preferidas, este proceso es adecuado para la producción de FDCA.
Un aspecto adicional de la presente invención está dirigido al uso de una célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención, para la biotransformación de precursores furánicos a FDCA.
20 Breve descripción de las figuras
La Figura 1 divulga una representación esquemática de las reacciones oxidativas de compuestos furánicos a ácido 2,5-furandicarboxílico. Se presentan los siguientes compuestos furánicos: 1, alcohol HMF; 2, HMF; 3, ácido HMF; 4, FFA; 5, FDCA.
La Figura 2 divulga la producción de FDCA y la acumulación de ácido HMF en cultivos de alimentación de HMF
25 de P. putida S12_2642 (figura 2a) y B38 (figura 2b) (♦, FDCA (mM); , ácido HMF (mM); O, peso seco de la célula (PSC; g/l); línea discontinua: Velocidad de alimentación de HMF (ml de solución 4 M/h))
La Figura 3 divulga la productividad específica de FDCA en diversos puntos temporales durante los procesos de alimentación discontinua presentados en la figura 2 (Oscuro: P. putida S12_2642; claro: P. putida S12_B38).
La Figura 4 divulga la producción de FDCA y la acumulación de ácido HMF en experimentos en matraz de
30 agitación con P. putida S12_B38 (figura 4a) y B51 (figura 4b) (A, HMF (mM); ♦, FDCA (mM); , ácido HMF (mM); O, peso seco de la célula (PSC; g/l));
La Figura 5 divulga la producción de FDCA y la acumulación de ácido HMF en cultivo de alta densidad celular de alimentación de HMF de P. putida S12_B38 que comienza con densidad celular alta (, HMF; ♦, FDCA (mM); , ácido HMF (mM); O, peso seco de la célula (PSC g/l); línea discontinua: Velocidad de alimentación de
35 HMF (ml de solución 4 M/h))
La Figura 6 divulga la acumulación de FDCA, FFA y ácido HMF en cultivos en matraces de agitación que contienen HMF de P. putida S12_B38 (HmfH y HmfT1 co-expresados; A); S12_B97 (HmfH, HmfT1 y aldehído deshidrogenasa co-expresados; B); y S12_B101 (HmfH y aldehído deshidrogenasa co-expresados; C). , HMF (mM); ♦, FDCA (mM); , ácido HMF (mM); , FFA (mM); O, peso seco de la célula (PSC; g/l).
40 Breve descripción de las secuencias
La SEC ID Nº 1 establece la secuencia de aminoácidos de HmfT1 de Cupriavidus basilensis HMF1. La secuencia tiene un número de acceso en GenBank ADE20411.1.
La SEC ID Nº 2 establece la secuencia de aminoácidos de HmfT2 de Cupriavidus basilensis HMF14. La secuencia tiene un número de acceso en GenBank ADE20404.1.
45 La SEC ID Nº 3 establece la secuencia de aminoácidos del producto proteico del gen con el locus mrad2831_4728 de Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (= ATCC 27329 = DSM 1819). La secuencia tiene un número de acceso en GenBank ACB26689.1.
La SEC ID Nº 4 establece la secuencia de aminoácidos del producto proteico del gen saci_2058 de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639. La secuencia tiene un número de acceso en GenBank AAY81352.1.
50 La SEC ID Nº 5 establece la secuencia de aminoácidos de HmfH de Cupriavidus basilensis HMF14. La secuencia tiene un número de acceso en GenBank ADE20408.1.
imagen3
La SEC ID Nº 6 establece la secuencia de aminoácidos del producto proteico del gen blr0367 de Bradyrhizobium japonicum USDA 110. La secuencia tiene un número de acceso en GenBank BAC45632.1. La SEC ID Nº 7 establece la secuencia de codificación de hmfT1 de Cupriavidus basilensis HMF14. La SEC ID Nº 8 establece la secuencia de codificación de hmfT2 de Cupriavidus basilensis HMF14. 5 La SEC ID Nº 9 establece la secuencia de codificación del gen con el locus mrad2831_4728 de Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (= ATCC 27329 = DSM 1819). La SEC ID Nº 10 establece la secuencia de codificación del gen saci_2058 de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639. La SEC ID Nº 11 establece la secuencia de codificación de hmfH de Cupriavidus basilensis HMF14. La SEC ID Nº 12 establece la secuencia de codificación del genblr0367 de Bradyrhizobium japonicum USDA 110.
10 La SEC ID Nº 13-18 establecen las secuencias de varios cebadores sintéticos. Se indican los lugares de restricción (subrayados), los codones de iniciación y terminación (complemento inverso) (en cursiva) y los supuestos sitios de unión al ribosoma (en minúscula). El cebador FN23 se diseñó justo aguas arriba del codón de iniciación de hmfH.
La SEC ID Nº 13 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético hmfT1 (f) 5’-ACGAATTCAAaggagACAACAATGGAAG-3’
15 La SEC ID Nº 14 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético hmfT1 (r) 5’-AAGCTAGCTGAGCAGTCACCCTCACTC-3’ La SEC ID Nº 15 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético FN23. 5’-CGGAATTCCACATGACAagggagACCG-3’ La SEC ID Nº 16 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético FN24.
20 5’-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3’ La SEC ID Nº 17 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético mrad (f) 5’-ACGAATTCggaggAAATCTATGCAGACC -3’ La SEC ID Nº 18 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético mrad (r). 5’-AAGCTAGCGCAGAACCGTATCGTCAG -3’
25 La SEC ID Nº 19 establece la secuencia de aminoácidos de la aldehído deshidrogenasa Adh de Cupriavidus
basilensis HMF14. La SEC ID Nº 20 establece la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_003609156.1.
La SEC ID Nº 21 establece la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank:
30 ZP_02881557.1. La SEC ID Nº 22 establece la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_003451184.1.
La SEC ID Nº 23 establece la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: ACA09737.1. La SEC ID Nº 24 establece la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_530742.1.
35 La SEC ID Nº 25 establece la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_001541929.1. La SEC ID Nº 26 establece la secuencia de polinucleótidos de adh que codifica la aldehído deshidrogenasa Adh de
Cupriavidus basilensis HMF14. La SEC ID Nº 27 establece la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene el 40 número de acceso de Genbank: YP_003609156.1. La SEC ID Nº 28 establece la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: ZP_02881557.1.
imagen4
La SEC ID Nº 29 establece la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_003451184.1.
La SEC ID Nº 30 establece la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: ACA09737.1.
5 La SEC ID Nº 31 establece la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_530742.1.
La SEC ID Nº 32 establece la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de Genbank: YP_001541929.1.
La SEC ID Nº 33 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético FN13. 5’
10 ATGCGGCCGCAACAaggagAAGATGGAATGAACG-3’ (secuencia subrayada: sitio de restricción NotI; codón de iniciación (ATG) del gen que codifica la aldehído deshidrogenasa en cursiva; el supuesto sitio de unión al ribosoma (RBS) en minúsculas)
La SEC ID Nº 34 establece la secuencia de nucleótidos del cebador de ADN sintético FN14: 5’-ATGCGGCCGCGCGTCGGGGTCGGTGCTA-3’ (secuencia subrayada: sitio de restricción NotI; codón de
15 terminación (hebra complementaria inversa) en cursiva).
Descripción detallada de la invención
Definiciones generales
A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprenden" e "incluyen" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" deben interpretarse de forma
20 incluyente. Es decir, estas palabras tienen como objetivo transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, cuando el contexto lo permita.
Los artículos "un/uno" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a uno o a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” puede significar un elemento o más de un elemento.
25 El término "una serie de" debe entenderse que tiene el significado de uno o más.
En el presente documento se entiende que los compuestos furánicos son cualquier compuesto que tiene un anillo de furano. Preferentemente, el compuesto furánico es un compuesto que puede oxidarse a ácido 2,5-furandicarboxílico. Los compuestos furánicos relevantes en el contexto de la presente invención incluyen [5(hidroximetil)furan-2-il]metanol ("alcohol HMF"), 5-(hidroximetil) furan-2-carbaldehído ("HMF"), ácido 5
30 (hidroximetil)furan-2-carboxílico ("ácido HMF"), ácido 5-formilfurano-2-carboxílico ("FFA"), furano-2,5-dicarbaldehído (DFF) y ácido furano-2,5-dicarboxílico ("FDCA"). El anillo de furano o cualquiera de sus grupos laterales sustituibles pueden estar sustituidos, por ejemplo, con OH, alquilo C1-C10, alquilo, alilo, arilo o RO-resto éter, incluyendo grupos cíclicos, en cualquier posición disponible en el anillo furano. Las estructuras químicas de un número de compuestos furánicos relevantes se presentan a continuación.
imagen5
El término "polinucleótido" incluye ácidos polidesoxirribonucleicos (ADN) y ácidos polirribonucleicos (ARN) y el término puede referirse a ADN o ARN. El experto será consciente de las diferencias en la estabilidad de las
imagen6
moléculas de ADN y ARN. Así, el experto en la técnica será capaz de entender a partir del contexto del uso del término "polinucleótido", cuál de las formas de polinucleótido (ADN y / o ARN) es adecuada.
El término "similitud" secuencia tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la medida en que las secuencias de polinucleótidos o de proteínas individuales son iguales. El grado de similitud entre dos secuencias se
5 basa en la medida de la identidad combinada con la medida de los cambios conservadores. El porcentaje de "similitud de secuencia" es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que es o bien idéntico o con cambios conservadores a saber "similitud de secuencia" = (% de identidad de secuencia) + (% cambios conservadores).
Para el propósito de la presente invención "cambios conservadores" e "identidad" se consideran especies del término más amplio "similitud". De esta manera, cada vez que se utiliza el término "similitud" de secuencia, abarca la
10 "identidad" de secuencia y los "cambios conservadores".
La expresión "identidad de secuencia" es conocida para el experto en la técnica. Con el fin de determinar el grado de identidad de secuencia compartida por dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias para fines comparativos óptimos (p. ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de
15 aminoácidos o de ácido nucleico). Dicha alineación puede llevarse a cabo sobre las longitudes completas de las secuencias que se están comparando. Como alternativa, la alineación puede llevarse a cabo sobre una longitud más corta de comparación, por ejemplo por encima de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos / bases o aminoácidos.
Después se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de
20 aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótido en la correspondiente posición en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en dicha posición. El grado de identidad compartida entre las secuencias normalmente se expresa en términos del porcentaje de identidad entre las dos secuencias y es función del número de posiciones idénticas compartidas por residuos idénticos en las secuencias (es decir, % de identidad= número de residuos idénticos en las
25 posiciones correspondientes/número total de posiciones x 100). Preferentemente, las dos secuencias que se están comparando son de la misma o sustancialmente la misma longitud.
El porcentaje de "cambios conservadores" se puede determinar de forma similar al porcentaje de identidad de secuencia. Sin embargo, en este caso, los cambios en un lugar específico de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que son propensos a conservar las propiedades funcionales de los residuos originales se puntúan como
30 si se hubiera producido ningún cambio.
Para las secuencias de aminoácidos, las propiedades funcionales relevantes son las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos. Una sustitución conservadora para un aminoácido en un polipéptido de la invención se puede seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica de la bioquímica de las proteínas que un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen 35 un tamaño o característica particular (tales como carga, hidrofobicidad e hidrofilicidad) puede ser sustituido por otro aminoácido sin alterar la actividad de una proteína, particularmente en regiones de la proteína que no están directamente asociadas con la actividad biológica. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva
40 (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones conservadoras incluyen, por ejemplo, Lys por Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu por Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser por Thr de manera que se mantenga un -OH libre; y Gln por Asn para mantener un -NH2.libre.
Para las secuencias de nucleótidos, las propiedades funcionales pertinentes es principalmente la información
45 biológica que un determinado nucleótido lleva dentro del marco de lectura abierto de la secuencia en relación con la transcripción y / o maquinaria de traducción. Es de conocimiento común que el código genético tiene degeneración (o redundancia) y que múltiples codones pueden llevar a la misma información con respecto al aminoácido que codifican. Por ejemplo, en ciertas especies del aminoácido leucina está codificado por los codones UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, los CUG (o TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG para el ADN)y el aminoácido serina está especificado por
50 UCA , UCG, UCC, UCU, AGU, AGC (o TCA, TCG, TCC, TCT, AGT, AGC para el ADN). Los cambios de nucleótidos que no alteran la información traducida se consideran cambios conservadores.
El experto en la técnica conocerá el hecho de que varios programas de ordenador diferentes, utilizando diferentes algoritmos matemáticos, están disponibles para determinar la identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede hacer uso de un programa de ordenador que emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y col., 55 (1970)). De acuerdo con una forma de realización, el programa de ordenador es el programa GAP en el paquete de software GCG Accelerys (Accelerys Inc., San Diego EE.UU.). Las matrices de sustitución que se pueden usar son, por ejemplo una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250, con un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la técnica apreciará que todos estos parámetros diferentes
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producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.
De acuerdo con una realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG Accelrys (Accelerys Inc., San Diego EE.UU.). Se usa una 5 matriz NWSgapdna CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En otra realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Meyers y col., (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en la consulta ALIGN utilizando datos de la secuencia del servidor Genestream IGH Montpellier Francia http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de residuos del peso de PAM120,
10 una penalización de la longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
Para la presente invención se prefiere más utilizar BLAST (Herramienta de Alineamiento Local Básico) para determinar el porcentaje de identidad y / o similitud entre secuencias de nucleótidos o de aminoácidos.
Las consultas que utilizan los programas de BLASTn, BLASTp, BLASTX, tBLASTn y tBLASTx Altschul y col., (1990) se pueden enviar a través de las versiones online de BLAST accesible a través de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. 15 Como alternativa se puede usar una versión independiente de BLAST (por ejemplo, la versión 2.2.24 (publicada el 23 de agosto 2010)) descargable también a través de la página web del NCBI. Preferentemente, las consultas BLAST se realizan con los siguientes parámetros. Para determinar el porcentaje de identidad y / o similitud entre secuencias de aminoácidos: algoritmo: blastp; tamaño de la palabra: 3; matriz de puntuación: BLOSUM62; costes del hueco: Existencia: 11, Extensión: 1; ajustes de composición: ajuste de matriz de puntuación de composición
20 condicional; filtro: desactivado; máscara: desactivado. Para determinar el porcentaje de identidad y / o similitud entre secuencias de nucleótidos: algoritmo: blastp; tamaño de la palabra: 11; coincidencias máximas en el intervalo de consultas: 0; puntuaciones por apareamientos/apareamientos erróneos: 2, -3; costes del hueco: Existencia: 5, Extensión: 2; filtro: regiones de baja complejidad; máscara: máscara para la tabla de búsqueda solamente.
El porcentaje de "cambios conservadores" puede determinarse que es similar al porcentaje de identidad de
25 secuencia con la ayuda de los algoritmos indicados y programas de ordenador. Algunos programas de ordenador, por ejemplo, BLASTp, presentan el número / porcentaje de positivos (= similitud) y el número / porcentaje de identidad. El porcentaje de cambios conservadores se puede derivar de la misma restando el porcentaje de identidad del porcentaje de positivos / similitud (porcentaje de cambios conservadores = porcentaje de similitud porcentaje de identidad).
30 Las técnicas de biología molecular generales, tales como experimentos de hibridación, experimentos de PCR, digestiones con enzimas de restricción, transformación de los huéspedes etcétera pueden realizarse de acuerdo con la práctica estándar conocida para el experto como se divulga en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y col., (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).
35 Primer polinucleótido y polipéptido
La célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención comprende un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido. El primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, 2,
40 3 o 4.
Como alternativa, la similitud de secuencia se puede expresar como al menos 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de similitud. De acuerdo con una realización, los porcentajes de similitud indicados pueden ser porcentajes de identidad. En una realización concreta, el primer polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos tal como se expone en
45 cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4.
Tal polipéptido es capaz de proporcionar una mejora con respecto a la bioconversión en ácido HMF.
Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se cree que dicho polipéptido tiene capacidades de transporte de ácido HMF. Mediante el transporte de ácido HMF al interior de la célula por el primer polipéptido, mejora su disponibilidad para la conversión intracelular. Por lo tanto, la bioconversión en ácido HMF puede mejorar.
50 Tal mejora en la bioconversión en ácido HMF se ha demostrado en los ejemplos para HmfT1 (SEC ID Nº 1) y el producto proteico del gen con el locus mrad2831_4728 de Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (= ATCC 27329 = DSM 1819) (SEC ID Nº 3). Sobre la base del nivel de similitud / identidad de secuencia con estas secuencias está justificado esperar que HmfT2 (SEC ID Nº 2) y el producto proteico del gen Saci_2058 de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 tendrá efectos similares.
55 HmfT2 (SEC ID Nº 2) tiene más de 90 % de similitud con HmfT1 (SEC ID Nº 1). El nivel de identidad es 87 %.
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Una funcionalidad similar para el producto proteico del gen saci_2058d e S DSM 639 (SEC ID Nº 4) se puede esperar en base a una alineación de múltiples secuencias CLUSTALW2 con los transportistas de diferentes familias funcionales. El transportador Sulfolobus forma un clúster con HmfT1 (SEC ID Nº 1) y Mrad2831_4728 (SEC ID Nº 3). Además, el análisis del genoma de S. acidocaldarius ha demostrado que el gen transportador saci_2058 está
5 flanqueado por genes que codifican funcionalidades similares a las de los grupos de genes hmf, respectivamente, el tipo de actividades que se espera en la degradación de compuestos similares a HMF. Ejemplos: Saci_2057, alcohol deshidrogenasa; Saci_2059/2060, anillo aromático dioxigenasa; Saci_2062, acil-CoA sintetasa (funcionalmente comparable a hmfD); Saci_2063, enoil-CoA hidratasa (funcionalmente comparable con hmfE); Saci_2064, aldehído oxidasa / xantina deshidrogenasa (funcionalmente comparable con hmfABC). Sobre la base de este análisis está justificado esperar que el producto proteico del gen Saci_2058 de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 (SEC ID Nº 4) tenga efectos similares a los de HmfT1 (SEC ID Nº 1) y el producto proteico del gen con el locus mrad2831_4728 de Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (= ATCC 27329 = DSM 1819) (SEC ID Nº 3).
El primer polipéptido puede estar codificado por una primera secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más
15 preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de polinucleótidos expuesta an la SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10. Niveles alternativos adecuados de similitud del primer polinucleótido con una secuencia expuesta en la SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10 pueden ser al menos 66%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de similitud. De acuerdo con una realización, los porcentajes de similitud indicados pueden ser porcentajes de identidad. En una realización concreta, el primer polipéptido puede estar codificado por una secuencia de polinucleótidos tal como se expone en las SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10.
El primer polipéptido o el polinucleótido que codifica el primer polipéptido se pueden aislar de un organismo, preferentemente un microorganismo que exprese el primer polipéptido en ciertas condiciones de crecimiento. El microorganismo puede ser capaz de utilizar ácido HMF o sustancias furánicas relacionadas, tales como HMF o alcohol HMF, como fuente de carbono, pero esto no es necesario.
25 En un enfoque típico, se pueden cribar las bibliotecas de genes para aislar polinucleótidos alternativos que son adecuados. Las bibliotecas se pueden construir a partir de microorganismos del superreino de bacterias. Estos microorganismos pueden pertenecer al filo de las proteobacterias, más específicamente a la clase de Alfaproteobacterias o Betaproteobacterias. Las alfaproteobacterias pueden pertenecer al orden de Rhizobiales, a las familias de Bradyrhizobiaceae o Methylobacteriaceae. Bradyrhizobiaceae puede pertenecer al genio de Bradyrhizobium, por ejemplo Bradyrhizobium japonicum o al género de Afipia. La familia Methylobacteriaceae puede pertenecer al género de Methylobacterium, por ejemplo Methylobacterium nodulans o Methylobacterium radiotolerans. Las Betaproteobacterias pueden pertenecer al orden de Burkholderiales, más específicamente, la familia de Burkholderiaceae. Pueden pertenecer al género Cupriavidus, por ejemplo Cupriavidus basilensis; o al género Ralstonia, por ejemplo Ralstonia eutropha; o al género Burkholderia, por ejemplo Burkholderia phymatum,
35 Burkholderia phytofirmans, Burkholderia xenovorans o Burkholderia graminis. Las bacterias también pueden pertenecer al filo de Firmicutes, más concretamente a la clase de Bacilos, más específicamente el orden de Bacillales. El orden Bacillales puede pertenecer a la familia de Bacillaceae, más específicamente al género Geobacillus, por ejemplo, Geobacillus kaustophilus. Como alternativa, los microorganismos pueden pertenecer al superreino de Archaea, más concretamente al filo de Euryarchaeota o al filo de Crenarchaeota. El filo Euryarchaeota puede pertenecer a un género sin clasificar, por ejemplo Cand. Parvarchaeum acidiphilum o a la clase de Thermoplasmata, más específicamente al orden de Thermoplasmatales. El orden Thermoplasmatales puede pertenecer a la familia de Thermoplasmataceae, más específicamente al género Thermoplasma, por ejemplo Thermoplasma acidophilum o Thermoplasma volcanium. Las Crenarchaeota pueden pertenecer a la clase de Thermoprotei, más específicamente al orden de Sulfolobales. Los Sulfolobales pueden pertenecer a la familia de
45 Sulfolobaceae, más específicamente al género Sulfolobus, por ejemplo, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus islandicus, solfataricus Sulfolobus o Sulfolobus tokodaii; o al género de Metallosphaera, por ejemplo, Metallosphaera sedula. Los Thermoprotei también pueden pertenecer al orden de Thermoproteales, familia de Thermoproteaceae. La familia Thermoproteaceae puede pertenecer al género Vulcanisaeta, por ejemplo Vulcanisaeta distributa; o al género Caldivirga, por ejemplo Caldivirga maquilingensis.
Preferentemente, el primer polipéptido y / o el primer polinucleótido que codifica el primer polipéptido se aísla de Cupriavidus Basilensis HMF14 (Wierckx y col., 2010). De acuerdo con una realización alternativa, el primer polipéptido y / o el primer polinucleótido que codifica el primer polipéptido se pueden aislar de Methylobacterium radiotolerans.
En base a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4 y/o las secuencias de 55 nucleótidos proporcionadas en las SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10, el experto en la técnica será capaz de construir sondas y /
o cebadores adecuados para aislar una secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido.
Como alternativa, en base a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4 y/o las secuencias de nucleótidos proporcionadas en las SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10, el experto en la técnica puede obtener secuencias sintetizadas que codifican el primer polipéptido a partir de fuentes comerciales, ya que la síntesis de genes está cada vez más disponible. Las secuencias sintéticas se pueden adquirir de, por ejemplo, Geneart A.G. (Regensburg, Alemania) o de Genscript USA Inc. (Piscataway, NJ,EE.UU.) por citar algunos.
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La célula de acuerdo con la invención se modifica genéticamente mediante la introducción funcional del primer polinucleótido. Con la introducción funcional de un polinucleótido se entiende una introducción de dicho polinucleótido en una célula, de tal manera que dicha célula adquiere la posibilidad de expresar un producto polipeptídico funcional del polinucleótido. Los procedimientos y técnicas para la introducción funcional de
5 polinucleótidos en células huésped están dentro del conocimiento general del experto en la técnica.
Polipéptido convertidor de ácido HMF
La célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención comprende un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido. El segundo polipéptido tiene la actividad de conversión de ácido HMF y se puede seleccionar de cualquier polipéptido capaz de convertir ácido HMF en un producto. Los inventores han observado
10 que la bioconversión de ácido HMF por el segundo polipéptido convertidor de ácido HMF mejora de manera efectiva mediante la expresión del primer polipéptido en una célula.
El segundo polinucleótido que codifica el segundo polipéptido puede ser un componente natural de la célula de acuerdo con la invención, es decir la célula no necesita ser modificada genéticamente en relación con el segundo polinucleótido. Sin embargo, de acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, la célula de acuerdo con la
15 invención se modifica genéticamente en relación con el segundo polinucleótido, mediante la introducción funcional del segundo polinucleótido. la expresión "introducción funcional" ya se ha explicado anteriormente en conexión con el primer polipéptido y el primer polinucleótido.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el segundo polipéptido es una oxidorreductasa convertidora de ácido HMF. Esta oxidorreductasa convertidora de ácido HMF puede comprender una secuencia de
20 aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 5 o 6 o un polipéptido variante de la misma que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 5 o 6.
Como alternativa, la similitud de secuencia se puede expresar como al menos 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %,
25 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o al menos 99 % de similitud. De acuerdo con una realización, los porcentajes de similitud indicados pueden ser porcentajes de identidad. En una realización concreta, el segundo polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos tal como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº 5 o 6.
La oxidorreductasa convertidora de ácido HMF de la SEC ID Nº 5 se divulgó previamente en Koopman y col.,
30 (2010a) y Koopman y col., (2010b) y se designó HmfH. La oxidorreductasa convertidora de ácido HMF de la SEC ID Nº 6 se puede aislar de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 y corresponde al producto proteico traducido del gen blr0367. B. japonicum USDA 110 contiene homólogos para todos los genes de utilización de HMF/furfural de C. basilensis HMF14 en su genoma (Koopman y col., 2010a). El producto traducido del gen blr0367 es la proteína de B. japonicum USDA 110 que mostró la homología más alta con HmfH, de C. basilensis HMF14. En vista del hecho de
35 que se ha demostrado que B. japonicum USDA 110 utiliza HMF como la única fuente de carbono (Koopman y col., 2010a) debe albergar un homólogo funcional de HmfH. Por tanto, está justificado esperar que una actividad de HmfH similar surja de blr0367.
Aunque la invención se ejemplifica con referencia a un número de oxidorreductasas convertidoras de ácido HMF, cabe señalar que dentro de la invención está permitido expresamente que el segundo polipéptido es una
40 oxidorreductasa convertidora de ácido HMF diferente o aún un polipéptido convertidor de ácido HMF diferente no que tiene actividad de oxidorreductasa.
El segundo polipéptido puede estar codificado por una segunda secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de polinucleótidos expuesta an la
45 SEC ID Nº 11 o 12. Niveles alternativos adecuados de similitud del primer polinucleótido con una secuencia expuesta en la SEC ID Nº 7, 8, 11 o 12 pueden ser al menos 66 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de similitud. En una realización, los porcentajes de similitud indicados pueden ser porcentajes de identidad. En una realización concreta, el segundo polipéptido puede estar codificado por una secuencia de polinucleótidos tal como se expone en las SEC ID Nº 7, 8, 11 o 12.
50 El aislamiento de un polinucleótido adecuado que codifica el segundo polipéptido que tiene actividad oxidorreductasa de Cupriavidus Basilensis se ha divulgado en Koopman y col., (2010a). Este gen se designa hmfH.
En un enfoque para el aislamiento del segundo polinucleótido, se pueden cribar bibliotecas génicas para aislar polinucleótidos que son adecuados. Las bibliotecas se pueden construir a partir de microorganismos del superreino de bacterias. Estos microorganismos pueden pertenecer al filo de las proteobacterias, más específicamente a la 55 clase de Alfaproteobacterias, Betaproteobacterias o Gammaproteobacterias. Las alfaproteobacterias pueden pertenecer al orden de Rhizobiales o al orden Sphingomonadales. El orden Rhizobiales puede pertenecer a la familia de Methylobacteriaceae, por ejemplo, un organismo del género Methylobacterium como M. nodulans o M. radiotolerans o un organismo de la familia de Rhizobiaceae. La familia Rhizobiaceae puede pertenecer al grupo de Rhizobium/Agrobacterium, más específicamente al género Rhizobium, tal como R. leguminosarum o R. leguminosarum bv. trifolii. También pueden pertenecer al géneroAgrobacterium, tal como A. radiobacter. Rhizobiaceae también puede pertenecer a la familia de Bradyrhizobiaceae, más específicamente al género de Bradyrhizobium, tal como B. japonicum. Sphingomonedales puede pertenecer a la familia de Sphingomonadaceae, 5 más específicamente al género de Sphingomonas, tales como S. wittichii o S. chlorophenolicum. Las betaproteobacterias pueden pertenecer al orden de Methylophilales o al orden Burkholderiales. El orden Methylophilales puede pertenecer a la familia de Methylophilaceae, por ejemplo, un organismo del género Methylovorus. Burkholderiales puede pertenecer a la familia de Burkholderiaceae, por ejemplo, un organismo del género Cupriavidus, tal comoCupriavidus basilensis. También pueden pertenecer al géneroBurkholderia, tal como Burkholderia phytofirmans. B. phymatum, B. graminis, B. xenovorans o B. cenocepacia o a la familia de Oxalobacteraceae, género de Janthinobacterium. Las Gammaproteobacterias pueden pertenecer al orden de Enterobacteriales, familia de Enterobacteriaceae, género de Yersinia tal como Yersinia ruckeri. Los microorganismos pueden además ser bacterias del filo de Actinobacteria, clase de Actinobacteria, subclase de Actinobacteridae orden de Actinomycetales. El orden Actinomycetales puede pertenecer al suborden de Streptomycineae,
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15 Pseudonocardineae o Micromonosporineae. El suborden de Sphingomonedales puede pertenecer a la familia de Streptomycetaceae, más específicamente al género de Streptomyces, tales como S. violaceusniger, S. hygroscopicus o S. clavuligerus. Pseudonocardineae puede pertenecer a la familia de Pseudonocardiaceae, más específicamente al género de Saccharopolyspora tales como S. erythraea; o a la familia de Actinosynnemataceae, más específicamente al género de Saccharothrix tales como S. mutabilis o S. mutabilis subsp. capreolus o al género Actinosynnema, tal como A. Mirum. Las Micromonosporineae pueden pertenecer a la familia de Micromonosporaceae, más específicamente al género de Micromonospora.
En base a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEC ID Nº 5 o 6 y/o las secuencias de nucleótidos proporcionadas en las SEC ID Nº 11 o 12, el experto en la técnica será capaz de construir sondas y / o cebadores adecuados para aislar una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido.
25 Como alternativa, en base a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEC ID Nº 5 o 6 y/o las secuencias de nucleótidos proporcionadas en las SEC ID Nº 7, 8, 11 o 12, el experto en la técnica puede obtener secuencias sintetizadas que codifican el segundo polipéptido a partir de fuentes comerciales como ya se ha indicado en la sección que trata del primer polipéptido.
Tercer polinucleótido y polipéptido
De acuerdo con una realización alternativa, la célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención comprende un tercer polinucleótido que codifica un tercer polipéptido. El tercer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25.
35 Como alternativa, la similitud de secuencia se puede expresar como al menos 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de similitud. De acuerdo con una realización, los porcentajes de similitud indicados pueden ser porcentajes de identidad. En una realización concreta, el primer polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos tal como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25. La secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 19 es una selección preferida del tercer polipéptido. Esta secuencia de aminoácidos se publicó recientemente en el documento WO2011 / 02690 (SEC ID Nº 15).
La expresión funcional de dicho tercer polipéptido tiene como resultado una actividad de aldehído deshidrogenasa (Adh) capaz de convertir aldehídos furánicos y proporciona una mejora adicional con respecto a la bioconversión de ácido HMF y / o la producción de FDCA.
45 Los efectos asociados con la expresión del tercer polipéptido se han demostrado en los ejemplos para la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 19. Sobre la base del nivel de similitud / identidad de secuencia está justificado esperar que los polipéptidos de las SEC ID 20-25 y sus análogos / homólogos tendrán efectos similares.
El tercer polipéptido puede estar codificado por una tercera secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de polinucleótidos expuesta an la SEC ID Nº 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32. Preferentemente, el tercer polipéptido está codificado por una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26 o un homólogo que tiene la similitud de secuencia indicada con la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26. La secuencias de polinucleótidos de SEC ID Nº 26 se publicó recientemente en el documento WO2011 / 026906 (SEC ID Nº 16). Niveles alternativos adecuados de
55 similitud del tercer polinucleótido con una secuencia expuesta en la SEC ID Nº 27, 28, 29 o 32 pueden ser al menos 66 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de similitud. De acuerdo con una realización, los porcentajes de similitud indicados pueden ser porcentajes de identidad. En una realización concreta, el tercer polipéptido puede estar codificado por una secuencia de polinucleótidos tal como se expone en las SEC ID Nº 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32.
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El aislamiento y manipulación adicional del la tercer polipéptido y el correspondiente tercero polinucleótido se pueden realizar, en general, como se ha expuesto anteriormente y de aquí en adelante para el primer polipéptido y el primer polipéptido correspondiente.
Vectores
5 Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, incluyendo vectores de clonación y de expresión, que comprenden el primero y segundo polinucleótido o un equivalente funcional de los mismos y procedimientos de crecimiento, que transforman o transfectan tales vectores en una célula huésped adecuada, por ejemplo en condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido de la invención. Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico
10 al que se ha unido.
El primero y segundo polinucleótido y opcionalmente, el tercer polinucleótido, se pueden incorporar en un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento de fabricación de polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en
15 un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que produzcan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Las células huésped adecuadas se describen a continuación.
El vector en el que se inserta el casete de expresión o polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que pueda someterse de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector a menudo
20 dependerá de la célula huésped en la que tiene que introducirse.
Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en que se ha integrado.
25 Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN circular bicatenario en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, En el que se pueden ligar en el genoma viral segmentos adicionales de ADN. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el
30 genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. Eh general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante suelen estar en forma de plásmidos. Los términos “plásmido” y “vector” se pueden usar de forma intercambiable en el presente documento, ya que el
35 plásmido es la forma de vector usada con más frecuencia. No obstante, la invención está destinada a incluir esas otras formas de vectores de expresión, tales como cósmidos, vectores virales (p. ej., retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), vectores fagos y transposones y plasposones que sirven funciones equivalentes.
El experto será capaz de construir los vectores de acuerdo con la invención basándose en las secuencias de
40 aminoácidos y polinucleótidos proporcionadas, su conocimiento de la técnica y los medios disponibles comercialmente.
De acuerdo con una realización preferida, la primera y segunda secuencia de polinucleótidos se localizan en un único vector. Este vector comprende opcionalmente además la tercera secuencia de polinucleótidos. Como el experto en la técnica comprenderá, el uso de un vector que comprende la primera y segunda secuencia de 45 polinucleótidos (y que opcionalmente comprende además la tercera secuencia de polinucleótidos) simplifica en gran medida la construcción de células genéticamente modificadas que expresan funcionalmente el primero y segundo polipéptido (opcionalmente junto con el tercer polipéptido). Sin embargo, como el experto en la materia también entenderá, las células modificadas genéticamente que expresan funcionalmente el primero y segundo polipéptido se pueden obtener a través de varios otros esquemas de transformación que implican vectores alternativos. A este
50 respecto, hay que señalar que de acuerdo con ciertas realizaciones, la introducción funcional de la segunda secuencia de polinucleótidos no es un requisito. También de acuerdo con ciertas formas de realización alternativas adicionales, la introducción funcional de la tercera secuencia de polinucleótidos no es un requisito.
Célula huésped
La célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención se puede construir a partir de cualquier célula
55 huésped adecuada. La célula huésped puede ser una célula no modificada o puede estar ya modificada genéticamente. La célula puede ser una célula procariota, una célula eucariota, una célula vegetal o una célula animal. En una célula de este tipo, uno o más genes pueden delecionarse, inactivarse o romperse en su totalidad o en parte, en la que opcionalmente uno o más genes codifican la proteasa. De acuerdo con una realización, la célula huésped de acuerdo con la invención es una célula huésped eucariota. Preferentemente, la célula eucariota es una célula de mamífero, insecto, vegetal, fúngica o de alga. Las células de mamífero preferidas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células 293, células PerC6, e hibridomas. Las células de insecto preferidas incluyen, por ejemplo, células Sf9 y Sf21 y derivadas de las mismas. Más preferentemente, la
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5 célula eucariota es una célula fúngica, es decir, una célula de levadura, tal como cepas de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. Más preferentemente, la célula eucariota esKluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Pichia stipitis y Pichia pastoris o una célula fúngica filamentosa. En ciertas formas de realización, la célula eucariota huésped es una célula fúngica filamentosa.
10 Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como definen Hawksworth y col., (1995)). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante alargamiento de la hifa y el catabolismo del carbono es estrictamente aeróbico. Las cepas de hongos filamentosos incluyen, pero no se limitan a, las cepas of Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium,
15 Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladiumy Trichoderma.
Las células de hongos filamentosos preferidas pertenecen a una especie de un género Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Talaromyces o Trichoderma y, lo más preferentemente, una especie seleccionada de Aspergillus niger,
20 Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei o Penicillium chrysogenum.
De acuerdo con otra realización, la célula huésped de acuerdo con la invención es una célula huésped procariota. Preferentemente, la célula huésped procariota es una célula bacteriana. El término "célula bacteriana" incluye microorganismos tanto gramnegativos como grampositivos. Las bacterias adecuadas pueden seleccionarse de, por 25 ejemplo, los géneros Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Bradyrhizobium, Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Zymomonas, Acetobacter, Streptococcus, Bacteroides, Selenomonas, Megasphaera, Burkholderia, Cupriavidus, Ralstonia, Methylobacterium, Methylovorus, Rhodopseudomonas, Acidiphilium, Dinoroseobacter, 30 Agrobacterium, Sulfolobus o Sphingomonas. Preferentemente, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus puntis, Bacillus megaterium, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium nodulans, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida S12, Paracoccus denitrificans, Escherichia coli, 35 Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium meliloti, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium radiobacter, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Agrobacterium radiobacter, Cupriavidus basilensis, Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha), Ralstonia pickettii, Burkholderia phytofirmans, Burkholderia phymatum, Burkholderia xenovorans, Burkholderia graminis, Rhodopseudomonas palustris, Acidiphilium cryptum, Dinoroseobacter shibae, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus
40 islandicus, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii.
Una célula huésped altamente preferida es Pseudomonas putida S12. En esta cepa, se ha demostrado que la expresión funcional del genhmfH de Cupriavidus basilensis HMF14 es eficaz para introducir capacidad oxidativa de HMF, lo que tiene como resultado la producción de FDCA a partir de este sustrato.
Para usos específicos de la célula de acuerdo con la invención, la selección de la célula huésped puede hacerse de
45 acuerdo con dicho uso. Son particularmente preferidos los huéspedes que son adecuados para la conversión de materias primas lignocelulósicas y las que son resistentes a las condiciones preferidas para la producción de compuestos furánicos, tales como FDCA. El experto en la técnica tendrá que, según sus medios y procedimientos adecuados de disponibilidad, introducir funcionalmente el primero y opcionalmente el segundo polinucleótido en cualquiera de las células huésped mencionadas.
50 Biotransformación de HMF ácido
La célula manipulada genéticamente de acuerdo con la invención tiene una biotransformación de ácido HMF mejorada. La mejora de la bioconversión de ácido HMF es beneficiosa para la eliminación de ácido HMF y sus precursores furánicos a partir de materias primas, en las que los compuestos furánicos se consideran perjudiciales, tales como materias primas para fermentaciones etanologénicas para la producción de biocombustibles y productos
55 bioquímicos. En otras aplicaciones, la mejora de la bioconversión de ácido HMF mejorará la bioproducción de una sustancia química en la que el ácido HMF es un material de partida o un intermedio, tal como en la bioproducción de FDCA.
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Si la enzima convertidora de ácido HMF es oxidorreductasa convertidora de ácido HMF, la célula de acuerdo con la invención será capaz de realizar una reacción de oxidación biológica. La reacción de oxidación es, en el presente documento, una o más reacciones de un oxidante con ácido HMF en presencia de la oxidorreductasa.
Una reacción de oxidación preferida es la producción de FDCA, en la que el ácido HMF se convierte en FDCA, mediante la reacción con un oxidante en presencia de una oxidorreductasa convertidora de ácido HMF. Las bioconversiones de compuestos furánicos a FDCA, en las que el ácido HMF es un compuesto intermedio, se han divulgado en la técnica anterior, por ejemplo usando HMF como material de partida (véase Koopman y col., 2010a y Koopman y col., (2010b). Tales bioconversiones se mejorarán si las realizan una célula de acuerdo con la invención.
El ácido HMF se puede generar in situ a partir de uno o más precursores furánicos por la célula de la invención o cualquier otra célula presente. Con la generación in situ se entiende que el ácido HMF no se añade desde fuera del sistema. En su lugar, se genera ácido HMF dentro del sistema a través de una o más bioconversiones que convierten los precursores furánicos en ácido HMF.
El precursor furánico de ácido HMF puede seleccionarse del grupo que consiste en 5-(hidroximetil)furan-2carbaldehído (HMF), furan-2,5-dicarbaldehído (DFF) y [5-(hidroximetil)furan-2-il]metanol (alcohol HMF) y preferentemente el precursor furánico es HMF,
HMF se puede obtener a partir de uno o más azúcares hexosa mediante deshidratación catalizada por ácido, como se conoce en la técnica. Los azúcares hexosa pueden obtenerse a partir de biomasa, preferentemente biomasa lignocelulósica.
La reacción de oxidación puede comprender un número de etapas consecutivas de reacción de oxidación que tienen como resultado un producto, por ejemplo la oxidación de ácido HM en FFA y la posterior oxidación de FFA en FDCA. Ejemplos de las reacciones de oxidación se proporcionan en la Fig. 1.
Las reacciones de oxidación se llevan a cabo preferentemente a temperatura relativamente suave, es decir, a 10-80 °C, más preferentemente 20-45 °C, lo más preferentemente a aproximadamente 25-40 °C. Se prefiere llevar a cabo la reacción a un pH en el que FDCA está en una forma neutra o en una forma completamente disociada, de manera que la formación de sales puede controlarse. En vista de la presencia de dos restos de ácido en FDCA, hay dos intervalos de pH preferidos separados. El pH durante la reacción puede ser desde un pH de 1 hasta 6, preferentemente desde un pH de 1 a 4, lo más preferentemente desde un pH de 1 a 3. Como alternativa, el pH durante la reacción puede ser desde un pH de 5 hasta 9, preferentemente desde un pH de 1 a 8, lo más preferentemente desde un pH de 1 a 7. El experto en la técnica entenderá que los requisitos de la célula huésped también influirán en la selección de un valor de pH adecuado para el proceso. La selección de valores de pH que son adecuados para las diversas células huésped que son adecuadas dentro de la presente invención está dentro del ámbito del experto en la técnica y se puede derivar de libros de texto estándar. Para Pseudomonas putida, incluida Pseudomonas putida S12, el intervalo de pH preferido es de pH 5 a 7.
El tiempo de reacción puede ser de 6 a 150 horas, con la adición de oxígeno a partir de una fuente de oxígeno, tal como oxígeno molecular o agua o una fuente diferente de oxígeno en función de los requisitos de la enzima oxidante de furánico. Se puede usar aire convenientemente como una fuente de oxígeno molecular.
El reactor puede ser cualquier biorreactor (aireado) adecuado. Se puede funcionar en operación por lotes, de forma continua o discontinua.
Después de la biotransformación, las células pueden separarse del caldo por procedimientos establecidos y reutilizarse. Los productos de oxidación tales como FDCA, ácido HMF, etc., pueden recuperarse de la mezcla de reacción mediante precipitación (en ácido) y la posterior cristalización por enfriamiento y separación del producto de oxidación cristalizado, por ejemplo, FDCA cristalizado. Sin embargo otros métodos de recuperación son adecuados, tales como, pero sin limitaciones, precipitación ácida y extracción con disolvente, como se conoce en la técnica.
Para muchas aplicaciones, tales como la eliminación de ácido HMF partir de materias primas lignocelulósicas, la forma exacta de conversión de HMF es irrelevante. Lo que es importante es que el ácido HMF se convierte de forma eficaz a fin de eliminarlo como tal o para prevenir su acumulación si se forma a partir de precursores furánicos. Para este tipo de aplicaciones, el polipéptido convertidor de ácido HMF puede ser cualquier polipéptido que tenga actividad convertidora de ácido HMF actualmente conocido o aún por descubrir.
Un aspecto adicional de la presente invención está dirigido al uso de una célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención, para la biotransformación de precursores furánicos a FDCA. Los precursores furánicos pueden seleccionarse en particular de 5-(hidroximetil)furan-2-carbaldehído (HMF), [5-(hidroximetil)furan-2-il]metanol (alcohol HMF), furan-2,5-dicarbaldehído (DFF), ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF) o ácido 5formilfurano-2-carboxílico (FFA). Preferentemente, HMF es un precursor furánico seleccionado. El ácido HMF puede ser un intermedio en la bioconversión de HMF a FDCA.
La invención se ilustrará adicionalmente con referencia a los ejemplos siguientes.
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Ejemplos
Metodología general
Cepas y plásmidos Pseudomonas putida S12 (ATCC 700801) se utilizó como huésped para la expresión de genes de Cupriavidus basilensis HMF14 (Wierckx y col., 2010; Koopman y col., 2010a) y Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (= ATCC 27329 = DSM 1819; secuencia del genoma disponible en http://genome.jgi-psf.org/metra/metra. home.html). Las cepas DH5α o TOP10 (Invitrogen) de Escherichia coli se usaron para fines de clonación generales.
Para la expresión episómica de los genes de C. basilensis o M. radiotolerans se usaron pJT’mcs derivado de pUCP22 (Koopman y col., 2010a) o pJNNmcs(t) (Wierckx y col., 2008) o pBT’mcs derivado de pBBRIMCS (Koopman y col., 2010a). En pJT’mcs y pBT’mcs, la expresión del gen diana está dirigida por al promotor tac constitutivo. En pJNNmcs(t), la expresión está dirigida por el casete de expresión NagR/PnagAa inducible por salicilato.
Medios y condiciones de cultivo Se usó medio con sales minerales (MM) como medio definido. El MM contenía lo siguiente (por litro de agua desmineralizada): 3,88 g de K2HPO4, 1,63 g de NaH2PO4, 2,0 g de (NH4)2SO4, 0,1 g de MgCl2·6H20, 10 mg de EDTA, 2 mg de ZnSO4·7H20, 1 mg de CaCl2·2H20, 5 mg de FeSO4·7H20, 0,2 mg de Na2MoO4·2H20, 0,2 mg de CuSO4·5H20, 0,4 mg de CoCl2·6H20y 1 mg de MnCl2·2H20, suplementado con una fuente de carbono como se ha especificado. caldo Luria (caldo L: 10 g/l de Bacto trypton (Difco), 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 5 g/l de NaCl) se usaron como medio completo para la propagación de P. putida S12 y cepas derivadas, C. basilensis, M. radiotolerans y E. coli DH5α y derivados. Para el cultivo de placas, el caldo L se solidificó con 1,5 % (p/v) de agar (Difco). Se añadió ampicilina (Amp) al medio hasta 100 µg/ml para la selección de transformantes de E. coli portadores de plásmidos derivados de pJT’mcs o pJNNmcs(t). Se añadió gentamicina (Gm) a 30 µg/ml en caldo Luria y10 µg/ml en medio con sales minerales para la selección de transformantes de P. putida S12 portadores de plásmidos derivados de pJT’mcs o pJNNmcs(t). Para la selección de transformantes de E. coli o
P. putida S12 portadores de plásmidos derivados de pBT’mcs se añadió al medio 50 µg/ml de kanamicina (Km). Los antibióticos se adquirieron en Sigma-Aldrich. P. putida, C. basilensis y M. radiotolerans se cultivaron a 30 °C; E. coli se cultivó a 37 °C
Los experimentos de alimentación discontinua con cepas derivadas de P. putida S12 -se realizaron en vasos de 2 l controlados por un sistema de biorreactor de Labfors 4 (Infors Benelux BV) o un controlador BioFlo110 (New Brunswick Scientific). Se suministró aire presurizado u oxígeno puro en el espacio aéreo o se roció a través del caldo. La temperatura se controló a 30 °C y el pH se mantuvo a 7,0 mediante la adición automática de NH4OH, NaOH o KOH. La fase discontinua se realizó en medio 2x MM suplementado con antibióticos específicos de la cepa y 40 g/l de glicerol. Para los cultivos de de alta densidad, el medio de la fase discontinua se suplementó adicionalmente con 10 g / l de extracto de levadura (YE). Después del agotamiento del glicerol inicial, la alimentación (4 o 8 M de glicerol en MgCl2 100 , suplementado con 1 mM de salicilato sódico cuando se requiera) se inició y controló para permitir el crecimiento al tiempo que mantenía el glicerol como el sustrato limitante en el cultivo. La alimentación de HMF (4 M en agua desmineralizada) se introdujo a través de una bomba de alimentación separada; la velocidad de alimentación se ajustó dependiendo de la cepa empleada y de la afección estudiada. La tensión de oxígeno disuelto (DO) se monitorizó continuamente y la velocidad de agitación se ajustó para mantener suficiente aireación.
Ensayos y procedimientos analíticos Medición del peso seco de la célula (PSC) El contenido de PSC de cultivos de bacterias se determinó midiendo la densidad óptica a 600 nm (DO600) utilizando un medidor de la densidad celular Biowave (WPA Ltd) o un espectrofotómetro de microplaca universal μ Quant MQX200 (Biotek), utilizando microplacas de 96 pocillos de fondo plano (Greiner). Una DO600 de 1,0 corresponde a 0,56 g de PSC/ l (Biowave) o 1,4 g PSC/ l (µQuant) para P. putida.
Análisis por HPLC: Los compuestos de furano (FDCA, HMF, alcohol HMF, ácido HMF y FFA) se analizaron por RPHPLC según lo descrito por Koopman y col., (2010a). Azúcares, alcoholes y ácidos orgánicos también se analizaron mediante HPLC (sistema Agilent 1100) utilizando un detector del índice de refracción (RI). La columna usada fue Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm, forma de hidrógeno, tamaño de partícula 9 µm, 8 % de reticulación, intervalo de pH 1-3) con 5 mM H2SO4 5 mM como eluyente a un caudal de 0,6 ml / min.
Productos químicos
HMF se adquirió en Sigma, Eurolabs Ltd (Poynton, Reino Unido) o Yore Chemipharm Co. Ltd. (Ningbo, China). Los patrones analíticos de FDCA y ácido 5-hidroximetil-furoico (ácido HMF) se adquirieron en Immunosource B.V. (Halle-Zoersel, Bélgica), respectivamente, Matrix Scientific (Columbia SC, EE.UU.). Todos los otros productos químicos se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemie B.V. (Zwijndrecht, Países Bajos).
Técnicas moleculares y genéticas: El ADN genómico se aisló de C. basilensis HMF14 y M. radiotolerans JCM 2831 usando el kit tisular DNeasy (QIAGEN). El ADN del plásmido se aisló con el kit de minipreparación QIAprep spin (QIAGEN). Se aislaron fragmentos de ADN atrapados en agarosa con el kit de extracción en gel de QIAEXII (QIAGEN).
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Las reacciones de PCR se realizaron con la polimerasa AccuPrime Pfx (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los cebadores de oligonucleótidos (especificados en los ejemplos) fueron sintetizados por MWG Biotech AG (Alemania). El ADN del plásmido se introdujo en células electrocompetentes utilizando un dispositivo de electroporación Gene Pulser (BioRad). Otras técnicas de biología molecular estándar se realizaron de acuerdo con
5 Sambrook y Russell (2001).
Ejemplo I: La coexpresión de HmfH y HmfT1 mejora la producción de FDCA en P. putida S12
El gen hmfT1 (antes llamado mfs1 (Koopman y col., 2010a); SEC ID Nº 7) se amplificó a partir de ADN genómico deCupriavidus basilensis HMF14 mediante PCR usando cebadores hmfT1(f) (SEC ID Nº 13) y hmfT1(r) (SEC ID Nº: 14). El producto de PCR se introdujo como un fragmento de 1359 pb EcoRI-NheI en pJNNmcs(t), dando
10 pJNNhmfT1(t). El gen hmfH (SEC ID Nº 11) incluyendo su sitio de unión al ribosoma nativo (RBS) se amplificó mediante PCR del ADN genómico de C. basilensis HMF14 usando los cebadores FN23 (SEC ID Nº 15) y FN24 (SEC ID Nº 16). El producto de PCR se clonó como un fragmento de 1777 pb de EcoRI-NheI, dando el plásmido pJNNhmfT. Los plásmidos pBT’hmfH y pJNNhmfT1(t) se introdujeron sucesivamente en P. putida S12, dando P. putida S12_B38.
15 P. putida S12_B38 se cultivó en lotes de alimentación como se describe en la sección de metodología general. En la fase discontinua, se alcanzó una densidad celular de aproximadamente 3 g CDW / 1, tras lo cual se inició la alimentación con glicerol y la alimentación con HMF. Se realizó un cultivo de alimentación discontinua control con P. putida S12_2642 (similar a P. putida S12_hmfH (Koopman y col., 2010b)) que no expresa HmfT1.
La Fig. 2 muestra las concentraciones de FDCA y ácido HMF en los cultivos alimentados con HMF de las cepas de
20 P. putida S12_2642 y S12_B38. La acumulación extensa de ácido HFM es evidente para P. putida S12_2642. Por el contrario, la acumulación de ácido HMF fue insignificante en el cultivo de P. putida S12_B38. La reducida acumulación de ácido HMF permitió adicionalmente incrementos de las velocidades de alimentación de HMF, lo que tuvo como resultado títulos de FDCA más altos en un tiempo de proceso considerablemente más corto. Esto también se reflejó claramente en la productividad de FDCA específica para las cepas analizadas (Fig. 3).
25 Ejemplo II La coexpresión de HmfH y un polipéptido de Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 mejora la producción de FDCA en P. putida S12
El gen con el locus tag mrad2831_4728 (SEC ID: 9) se amplificó a partir de ADN genómico de Methylobacterium radiotolerans JCM2831 mediante PCR usando los cebadores Mrad(f) (SEC ID Nº 17) y Mrad(r) (SEC ID Nº 18). El producto de PCR se introdujo como un fragmento de 1381 pb EcoRI-NheI en pJNNmcs(t), dando pJNN_Mrad(t). Los
30 plásmidos pBT’hmfH (véase el Ejemplo I) y pJNN_Mrad(t) se introdujeron sucesivamente en P. putida S12, dando P. putida S12_B51.
P. putida_B51 se cultivó en matraces de agitación en medio con sales minerales (4 x concentración del tampón) suplementado con 1 g/l de extracto de levadura, glicerol 80 mM, glucosa 2 mM, salicilato sódico 100 µM, 50 µg/ml de kanamicina y 10 µg/ml de gentamicina.
35 Como cepa control se usó P. putida S12_B38 (véase el Ejemplo I). Después de cultivar durante la noche, los cultivos se suplementaron con glicerol 80 mM y salicilato sódico 100 µM. Después se añadió HMF a aproximadamente 10 mM y se evaluó la producción de FDCA.
La Fig. 4 muestra que la acumulación de ácido HMF durante la producción de FDCA fue insignificante para ambas cepas, lo que confirma que HmfT1 y el polipéptido Mrad2831_4728 exhibían una funcionalidad similar. Para P.
40 putida S12_B38, la producción de FDCA mostró una fase log más prolongada y una velocidad algo más lenta, lo que se pudo atribuir a la menor densidad inicial de biomasa (Fig. 4A). No obstante, la productividad máxima específica de FDCA fue idéntica en ambas cepas, es decir 2,36 mmol de FDCA/(g PSC, h), lo que indica que los polipéptidos Mrad2831_4728 y HmfT1 eran igualmente eficaces en la minimización de la acumulación de ácido HMF y maximización de la producción de FDCA.
45 Ejemplo III: Capacidad de conversión de ácido HMF de niveles altos por P. putida S12 que coexpresa HmfH y HmfT1
Como se demuestra en el Ejemplo I, la coexpresión de HmfH y HmfT1 en P. putida S12 mejoró considerablemente la capacidad específica para oxidar HMF en FDCA. Para realizar un uso óptimo de esta capacidad mejorada se realizó un experimento de alimentación discontinua con P. putida S12_B38 comenzando a una densidad de biomasa
50 elevada.
La alimentación de HMF se inició a una velocidad alta (20 ml/h; solución de alimentación 4 M de HMF) con el fin de saturar la capacidad de oxidación de P. putida S12_B38 y provocar la acumulación de HMF y ácido HMF (Fig. 5). Cuando se hubo acumulado ácido HMF hasta aproximadamente 20 mM, la velocidad de alimentación de HMF se redujo hasta 5 ml/h y se vigilaron las concentraciones de compuestos furánicos. Inicialmente, la concentración de
55 ácido HMF aumentó hasta aproximadamente 37 mM debido a la oxidación de HMF acumulado residual, tras lo cual disminuyó hasta menos de 2 mM en 5 horas, a una velocidad de alimentación de 0,72 mmol/(g PSC.h).
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Estos resultados demuestran claramente que la capacidad de oxidación de ácido HMF se había mejorado por la coexpresión de HmfH y HmfT1. Los resultados de Koopman y col., (2010b), mostraron que P. putida S12_hmfH (que carece de HmfT1) requerían más de 50 horas para reducir la concentración de HMF ácido desde aproximadamente 50 mM a menos de 5 mM, a una velocidad de alimentación de HMF mucho menor (0,09 mmol/(g PSC.h)). La capacidad de oxidación de HMF ácido mejorada tuvo como resultado un título de FDCA final mucho más alto (152 g/l frente a 30,1 g/l por Koopman y col., (2010b)) que también se alcanzó en un tiempo de proceso más corto (94 h frente a 115 h por Koopman y col., (2010b)).
Ejemplo IV: La coexpresión de HmfH, HmfT1 y una aldehído deshidrogenasa de C. basilensis mejora la producción de FDCA en P. putida S12
El gen que codifica una aldehído deshidrogenasa (SEC ID 26; secuencia de aminoácidos traducida: SEC ID 19) asociada con el operón de degradación de HMF en Cupriavidus basilensis HMF14 (Wierckx y col., 2011) se amplificó mediante PCR usando los cebadores FN13 (SEC ID 33) y FN14 (SEC ID 34). El producto de la PCR se introdujo como un fragmento NotI de 153 pb en pBT’hmfH digerido con Bsp120I (compatible con NotI)(véase el ejemplo I), dando pBT’hmfH-adh. La variante del plásmido en la que el gen codificante de la aldehído deshidrogenasa estaba presente en orientación directa (f) (pBT’hmfH-adh(f)) y pJNNhmfT1(t) (véase el Ejemplo I) se introdujeron sucesivamente en P. putida S12. La cepa resultante P. putida S12_B97, coexpresó HmfH, HmfT1y la aldehído deshidrogenasa. Como cepa control para la coexpresión de la HmfH oxidorreductasa y la aldehído deshidrogenasa (es decir, sin el transportador de HMF ácido HmfT1), se construyó P. putida S12_B101 que solo contenía pBT’hmfHadh(f). P. putida S12-B38 (véase el Ejemplo I) se usó como cepa control para la coexpresión de HmfT1 y HmfH sin la aldehído deshidrogenasa.
Las cepas de P. putida S12_B38, S12_B97 y S12_B101 se cultivaron en matraces de agitación en medio con sales minerales (4x la concentración del tampón) suplementado con 1 g/l de extracto de levadura, glicerol 80 mM, glucosa 2 mM, kanamicina 50 µg/ml y 10 µg/µl de gentamicina (nota: para la cepa B101 solo se añadió kanamicina). Se añadió salicilato sódico (1 µM) para la inducción de hmfT1 solo en los precultivos. Tras la adición de HMF aproximadamente 10 mM se evaluó la acumulación de FDCA y ácido HMF.
En la cepa que coexpresó HmfH (oxidorreductasa) y HmfT1 (transportador de ácido HMF) (cepa S12_B38; Fig. 6A), la producción de FDCA solo comenzó después de haber acumulado FFA hasta un nivel sustancial. El ácido HMF se acumuló de forma transitoria a cantidades bajas, como se ha observado anteriormente (véase el Ejemplo II). Cuando la aldehído deshidrogenasa se coexpresó con HmfH y HmfT1 (cepa S12_B97; Fig. 6B), la formación de FDCA comenzó sin retraso y se observaron tanto FFA como ácido HMF únicamente en cantidades de restos. La coexpresión de la aldehído deshidrogenasa y HmfH sin HmfT1 (cepa S12_B101; Fig. 6C), tuvo como resultado una amplia acumulación de ácido HMF, mientras que solo se produjeron cantidades pequeñas de FFA y FDCA.
Los resultados demostraron que la oxidación de HMF en ácido HMF se ve significativamente potenciada por la expresión de la aldehído deshidrogenasa. No obstante, HmfT1 debe coexpresarse para permitir una biotransformación eficiente del ácido HFM producido. La aldehído deshidrogenasa mejoró aún más la oxidación del producto intermedio FFA en FDCA. Por tanto, la expresión simultánea de la aldehído deshidrogenasa y HmfT1 mejora considerablemente el potencial global y la velocidad de, la oxidación de HMF a través de ácido HMF hasta el producto final.
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Claims (22)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Célula modificada genéticamente que comprende:
    (i)
    una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que tiene capacidades de transporte de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF), que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4; e
    (ii)
    una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido HMF;
    caracterizado porque dicha célula es modificada genéticamente mediante la introducción funcional de al menos la primera secuencia de polinucleótidos y, preferentemente, mediante la introducción funcional de la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos.
  2. 2.
    La célula modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el segundo polipéptido es una ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico oxidorreductasa, preferentemente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 5 o 6.
  3. 3.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la primera secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10.
  4. 4.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la segunda secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID Nº 11 o 12.
  5. 5.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica un tercer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 % más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25.
  6. 6.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la tercera secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID Nº 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32.
  7. 7.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la célula es una célula procariota tal como una célula bacteriana o una célula eucariota, tal como una célula de levadura, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula animal.
  8. 8.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la célula es una célula procariota, preferentemente una célula bacteriana seleccionada de los géneros Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Bradyrhizobium, Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Zymomonas, Acetobacter, Streptococcus, Bacteroides, Selenomonas, Megasphaera, Burkholderia, Cupriavidus, Ralstonia, Methylobacterium, Methylovorus, Rhodopseudomonas, Acidiphilium, Dinoroseobacter, Agrobacterium, Sulfolobus o Sphingomonas, más preferentemente seleccionada del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus puntis, Bacillus megaterium, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium nodulans, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida S12, Paracoccus denitrificans, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium meliloti, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium radiobacter, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Agrobacterium radiobacter, Cupriavidus basilensis, Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha), Ralstonia pickettii, Burkholderia phytofirmans, Burkholderia phymatum, Burkholderia xenovorans, Burkholderia graminis,
    66
    imagen2
    Rhodopseudomonas palustris, Acidiphilium cryptum, Dinoroseobacter shibae, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus islandicus, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii.
  9. 9.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la célula es una célula huésped eucariota, por ejemplo una célula de mamífero, de insecto, vegetal, fúngica o de alga, tal como una célula de mamífero seleccionada de células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células 293, células PerC6 o hibridomas, una célula de insecto seleccionada de células Sf9 o Sf21 y derivadas de los mismos, preferentemente una célula eucariota seleccionada de células fúngicas o de levadura, tales como especies de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, con mayor preferencia una célula eucariota seleccionada de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Harzsenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Pichia stipitis o Pichia pastoris o una célula de hongo filamentoso de una especie seleccionada de la subdivisión Eumycota y Oomycota o, como alternativa, una especie del género Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma tal como Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei o Penicillium chrysogenum.
  10. 10.
    Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos se localizan en un único vector opcionalmente un vector que además comprende la tercera secuencia de polinucleótidos.
  11. 11.
    Un vector que comprende:
    (i)
    una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 1 , 2, 3 o 4; y
    (ii)
    una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF).
  12. 12.
    Un vector de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el segundo polipéptido es una ácido 5hidroximetilfuroico oxidorreductasa, preferentemente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº 5 o 6.
  13. 13.
    Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la que la primera secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID Nº 7, 8, 9 o 10.
  14. 14.
    Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en la que la segunda secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID Nº 11 o 12.
  15. 15.
    Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, que comprende una tercera segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un tercer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25.
  16. 16.
    Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en la que la tercera secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32.
  17. 17.
    Procedimientos para convertir el ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF) que comprenden incubar una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en presencia de ácido HMF en condiciones adecuadas para la conversión por dicha célula del ácido HMF.
  18. 18.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el ácido HMF es formado in situ a partir de uno o más precursores furánicos de ácido HMF en condiciones adecuadas para la conversión por dicha célula del uno
    o más precursores furánicos en ácido HMF.
    67
    imagen3
  19. 19.
    Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-18, en el que el segundo polipéptido de la célula es una ácido HMF oxidorreductasa y que además comprende someter la célula a condiciones adecuadas para la conversión de ácido HMF en FDCA.
  20. 20.
    El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que un precursor furánico es
    5 seleccionado del grupo que comprende ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carbaldehído (HMF), furan-2,5dicarbaldehído (DFF), [5-(hidroximetil)furan-2-il]metanol (alcohol HMF) y es, preferentemente, HMF.
  21. 21. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que un precursor furánico es obtenido a partir de uno o más azúcares hexosa, preferentemente uno o más azúcares hexosa obtenidos de biomasa lignocelulósica, por ejemplo mediante deshidratación catalizada por ácido.
    10 22. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-21, en el que el FDCA es recuperado de la mezcla de reacción mediante un procedimiento que comprende precipitación en ácido, seguido de cristalización por enfriamiento o, como alternativa, seguido de extracción en disolvente.
  22. 23. Uso de una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para la biotransformación de una serie de precursores furánicos en FDCA.
    15 24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el número de precursores furánicos es seleccionado del grupo que comprende 5-(hidroximetil) furan-2-carbaldehído (HMF), [5-(hidroximetil)furan-2-il]metanol (alcohol HMF), ácido 5-(hidroximetil) furan-2-carboxílico (ácido HMF) furan-2,5-dicarbaldehído (DFF) o ácido 5formilfuran-2-carboxílico (FFA).
    68
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