JP6327724B2 - 遺伝的に改変された細胞及び前記細胞の使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、フラン化合物の生体内転換(biotransformation)の分野に一般に関する。そのような生体内転換は、フラン−2,5−ジカルボン酸(FDCA)の産生及びリグノセルロース含有材料の処理(例えばバイオ燃料及び生化学物質の産生のため)において有用である。より詳細には本発明は、フラン化合物の生体触媒転換についての特徴が改善された、遺伝的に改変された新規細胞に関する。本発明のさらなる態様は、フラン化合物の生体内転換についての特徴を改善するための宿主細胞の遺伝的改変のために好適なベクターに関する。本発明の他の態様は、本発明による細胞を使用した5−(ヒドロキシメチル)フラン−2−カルボン酸(HMF酸)及びその前駆体の生体内転換のための方法に関する。
フラン化合物の生体内転換への注目が高まっている。これは、バイオマスからの付加価値のある化学物質として期待されるフラン−2,5−ジカルボン酸(FDCA)の生物的産生(Werpyら、(2004))の観点及びリグノセルロース含有材料からのバイオ燃料及び生化学物質の発酵性産生におけるフラン化合物の負の役割(Almeidaら、(2009))の観点の両方においてである。
本発明者らの本発見は、宿主において、配列番号1若しくは2のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその類似体/相同体(配列番号3若しくは4等)と共に、5−(ヒドロキシメチル)フラン−2−カルボン酸(HMF酸)の転換が可能である1つ又は複数のポリペプチドを発現させることが、HMF酸の効果的な生物変換(bioconversion)をもたらすという一般化概念をもたらした。改善されたHMF酸生物変換は、フラン化合物が有害であると考えられる供給原料(例えばバイオ燃料の産生のためのエタノール産生発酵用又は化学物質の生物学的産生のための発酵用の供給原料等)からのHMF酸及びそのフラン前駆体の除去のために有益である。他の応用において、改善されたHMF酸生物変換は、例えばFDCA生物的産生において、HMF酸が出発材料又は中間体である化学物質の生物的産生を改善する。
配列番号1は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のHmfT1のアミノ酸配列を記載する。配列はGenBank受託番号ADE20411.1を有する。
配列番号2は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のHmfT2のアミノ酸配列を記載する。配列はGenBank受託番号ADE20404.1を有する。
配列番号3は、メチロバクテリウム・ラジオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)JCM2831(=ATCC27329=DSM1819)由来の遺伝子座タグ(locus tag)mrad2831_4728を有する遺伝子由来のタンパク質産物のアミノ酸配列を記載する。配列はGenBank受託番号ACB26689.1を有する。
配列番号4は、スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)DSM639由来のsaci_2058遺伝子由来のタンパク質産物のアミノ酸配列を記載する。配列はGenBank受託番号AAY81352.1を有する。
配列番号5は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のHmfHのアミノ酸配列を記載する。配列はGenBank受託番号ADE20408.1を有する。
配列番号6は、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)USDA110由来のblr0367遺伝子由来のタンパク質産物のアミノ酸配列を記載する。配列はGenBank受託番号BAC45632.1を有する。
配列番号7は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のhmfT1のコード配列を記載する。
配列番号8は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のhmfT2のコード配列を記載する。
配列番号9は、メチロバクテリウム・ラジオトレランスJCM2831(=ATCC27329=DSM1819)由来の遺伝子座タグmrad2831_4728を有する遺伝子のコード配列を記載する。
配列番号10は、スルホロブス・アシドカルダリウスDSM639由来のsaci_2058遺伝子のコード配列を記載する。
配列番号11は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のhmfHのコード配列を記載する。
配列番号12は、ブラディリゾビウム・ジャポニクムUSDA110由来のblr0367遺伝子のコード配列を記載する。
配列番号13〜18は、種々の合成プライマーの配列を記載する。制限位置(下線)、開始及び終止(逆相補)コドン(斜体)並びに推定リボソーム結合位置(小文字)が示されている。FN23プライマーは、hmfHの開始コドンのすぐ上流に設計された。
配列番号13は、合成DNAプライマーhmfT1(f)のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号14は、合成DNAプライマーhmfT1(r)のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号15は、合成DNAプライマーFN23のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号16は、合成DNAプライマーFN24のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号17は、合成DNAプライマーmrad(f)のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号18は、合成DNAプライマーmrad(r)のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号19は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のアルデヒド脱水素酵素Adhのアミノ酸配列を記載する。
配列番号20は、GenBank受託番号YP_003609156.1を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号21は、GenBank受託番号ZP_02881557.1を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号22は、GenBank受託番号YP_003451184.1を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号23は、GenBank受託番号ACA09737.1を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号24は、GenBank受託番号YP_530742.1を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号25は、GenBank受託番号YP_001541929.1を有するアミノ酸配列を記載する。
配列番号26は、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のアルデヒド脱水素酵素Adhをコードしているadhのポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号27は、GenBank受託番号YP_003609156.1を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号28は、GenBank受託番号ZP_02881557.1を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号29は、GenBank受託番号YP_003451184.1を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号30は、GenBank受託番号ACA09737.1を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号31は、GenBank受託番号YP_530742.1を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号32は、GenBank受託番号YP_001541929.1を有するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号33は、合成DNAプライマーFN13:
(下線付き配列:NotI制限部位、アルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子の開始コドン(ATG)は斜体、推定リボソーム結合位置(RBS)は小文字)のヌクレオチド配列を記載する。
配列番号34は、合成DNAプライマーFN14:
(下線付き配列:NotI制限部位、終止コドン(逆相補鎖)を斜体)のヌクレオチド配列を記載する。
一般的定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通じて、単語「含む(comprise)」及び「含む(include)」並びに「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(includes)」及び「含んでいる(including)」等の変化形は、包含的に解釈される。つまりこれらの用語は(コンテクストが認める場合に)具体的に引用されていない他の要素又は成分の含有可能性を表すことが意図される。
本発明による遺伝的に改変された細胞は、第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチドを含む。第一のポリペプチドは、配列番号1、2、3又は4のアミノ酸配列と少なくとも45%、好ましくは少なくとも60%、例えば少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、例えば90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明による遺伝的に改変された細胞は、第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを含む。第二のポリペプチドはHMF酸転換活性を有し、HMF酸を産物に転換できる任意のポリペプチドから選択されうる。本発明者らは、HMF酸を転換する第二のポリペプチドによるHMF酸の生物変換が細胞中の第一のポリペプチドの発現によって効果的に改善されることを観察した。
酸化還元活性を有する第二のポリペプチドをコードしている好適なポリヌクレオチドのカプリアビダス・バシレンシスからの単離は、Koopmanら、(2010a)において開示されている。この遺伝子はhmfHと称される。
代替的実施形態により本発明による遺伝的に改変された細胞は、第三のポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチドを含む。第三のポリペプチドは、配列番号19、20、21、22、23、24又は25のアミノ酸配列と少なくとも45%、好ましくは少なくとも60%、例えば少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、例えば90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、第一及び第二のポリヌクレオチド又はその機能的等価物を含む(クローニングベクター及び発現ベクターを含む)ベクター並びにそのようなベクターを好適な宿主細胞で(例えば本発明のポリペプチドの発現が生じる条件下で)増殖させる、形質転換する又は形質移入する方法に関する。本明細書において用いる用語「ベクター」は、ベクターに結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。
本発明による遺伝的に改変された細胞は、任意の好適な宿主細胞から構築されうる。宿主細胞は、未改変細胞であってもよく、既に遺伝的に改変されていてもよい。細胞は、原核生物細胞、真核生物細胞、植物細胞又は動物細胞であってもよい。そのような細胞では、1つ又は複数の遺伝子が全長で又は部分で欠失、ノックアウト又は破壊されている場合があり、その場合任意選択で1つ又は複数の遺伝子はプロテアーゼをコードしている。実施形態により本発明による宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。好ましくは真核生物細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、真菌又は藻類の細胞である。好ましい哺乳動物細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、293細胞、PerC6細胞及び融合細胞を含む。好ましい昆虫細胞は、例えばSf9及びSf21細胞並びにそれらの派生物を含む。さらに好ましくは、真核生物細胞は真菌細胞(すなわちカンジダ(Candida)株、ハンセヌラ(Hansenula)株、クリベロマイセス(Kluyveromyces)株、ピキア(Pichia)株、サッカロマイセス(Saccharomyces)株、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)菌株又はヤロウイア(Yarrowia)菌株等の酵母細胞)である。より好ましくは、真核生物細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)又は糸状真菌細胞である。特定の実施形態では真核生物細胞は、糸状真菌細胞である。
本発明によって遺伝的に操作された細胞は、改善されたHMF酸生体内転換を有する。改善されたHMF酸生物変換は、(バイオ燃料及び生化学物質の産生のためのエタノール生産発酵のための供給原料等、フラン化合物が有害であると考えられている)供給原料からのHMF酸及びそのフラン前駆体の削減のために有益である。他の応用では改善されたHMF酸生物変換は、FDCA生物学的産生等において、HMF酸が出発材料又は中間体である化学物質の生物学的産生を改善する。
菌株及びプラスミド。シュードモナス・プチダS12(ATCC700801)をカプリアビダス・バシレンシスHMF14(Wierckxら、2010;Koopmanら、2010a)及びメチロバクテリウム・ラジオトレランスJCM2831(=ATCC27329=DSM1819;ゲノム配列はhttp://genome.jgi−psf.org/metra/metra.home.htmlで入手可能である)由来の遺伝子の発現のための宿主として用いた。エシェリキア・コリDH5α又はTOP10(Invitrogen)菌株を一般的クローニング目的で用いた。
HMFはSigma、Eurolabs Ltd(Poynton、UK)又はYore Chemipharm Co.Ltd.(Ningbo、China)のいずれかで購入した。FDCA及び5−ヒドロキシメチル−フロン酸(HMF酸)の分析標準は、それぞれImmunosource B.V.(Halle−Zoersel、Belgium)、Matrix Scientific(Columbia SC、USA)から購入した。他の全ての化学物質はSigma−Aldrich Chemie B.V.(Zwijndrecht、The Netherlands)から購入した。
hmfT1遺伝子(以前はmfs1と記載(Koopmanら、2010a);配列番号7)をカプリアビダス・バシレンシスHMF14のゲノムDNAからプライマーhmfT1(f)(配列番号13)及びhmfT1(r)(配列番号14)を用いたPCRによって増幅した。PCR産物を1359bp EcoRI−NheI断片としてpJNNmcs(t)に導入し、pJNNhmfT1(t)を得た。天然リボソーム結合部位(RBS)を含むhmfH遺伝子(配列番号11)をPCRによってC.バシレンシスHMF14のゲノムDNAから、プライマーFN23(配列番号15)及びFN24(配列番号16)を用いて増幅した。PCR産物を1777bp EcoRI断片としてpBT’mcs中にクローン化し、プラスミドpBT’hmfHを得た。プラスミドpBT’hmfH及びpJNNhmfT1(t)をP.プチダS12に連続的に導入し、P.プチダS12_B38を得た。
遺伝子座タグmrad2831_4728(配列番号9)を有する遺伝子を、メチロバクテリウム・ラジオトレランスJCM2831のゲノムDNAから、プライマーMrad(f)(配列番号17)及びMrad(r)(配列番号18)を用いたPCRによって増幅した。PCR産物を1381bp EcoRI−NheI断片としてpJNNmcs(t)に導入し、pJNN_Mrad(t)を得た。プラスミドpBT’hmfH(実施例I参照)及びpJNN_Mrad(t)をP.プチダS12に連続的に導入し、P.プチダS12_B51を得た。
実施例Iにおいて実証したとおり、P.プチダS12におけるHmfH及びHmfT1の共発現は、HMFをFDCAに酸化する特異的能力を著しく改善した。この改善された能力を最適に使用するために、流加実験をP.プチダS12_B38について高バイオマス密度で開始して実施した。
カプリアビダス・バシレンシスHMF14中のHMF分解オペロン(Wierckxら、2011)と関連するアルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子(配列番号26;翻訳されたアミノ酸配列:配列番号19)をプライマーFN13(配列番号33)及びFN14(配列番号34)を用いてPCRによって増幅した。PCR産物を1543bp NotI断片として、Bsp120I消化(NotIに適合する)pBT’hmfH(実施例I参照)に導入し、pBT’hmfH−adhを得た。アルデヒド脱水素酵素をコードしている遺伝子がフォワード(f)方向で存在したプラスミド変種(pBT’hmfH−adh(f))及びpJNNhmfT1(t)(実施例I参照)をP.プチダS12に連続的に導入した。得られた菌株P.プチダS12_B97は、HmfH、HmfT1及びアルデヒド脱水素酵素を共発現した。HmfH酸化還元酵素及びアルデヒド脱水素酵素の共発現(つまりHMF酸輸送体HmfT1を含まない)についての対照菌株として、pBT’hmfH−adh(f)だけを含有しているP.プチダS12_B101を構築した。P.プチダS12_B38(実施例I参照)をアルデヒド脱水素酵素を含まないHmfT1及びHmfHの共発現についての対照菌株として用いた。
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Claims (15)
- 5−(ヒドロキシメチル)フラン−2−カルボン酸(HMF酸)の輸送能力を有するポリペプチドをコードし、配列番号7に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも70%の配列同一性を有する第一のポリヌクレオチドの導入によって遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
- HMF酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドであって、HMF酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号5に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、第二のポリヌクレオチドを更に含む、請求項1に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
- フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチドを更に含み、
フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号19、20、21、22、23、24又は25に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1又は2に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。 - エシェリキア属、アナベナ属、カウロバクター属、グルコノバクター属、ロドバクター属、シュードモナス属、パラコッカス属、リゾビウム属、シノリゾビウム属、ブラディリゾビウム属、フラボバクテリウム属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、メチロバクテリウム属、ザイモモナス属、アセトバクター属、バクテロイデス属、セレノモナス属、メガスファエラ属、バークホルデリア属、カプリアビダス属、ラルストニア属、メチロボラス属、ロドシュードモナス属、アシディフィリウム属、ディノロセオバクター属、アグロバクテリウム属、スルホロブス属及びスフィンゴモナス属からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
- グルコノバクター・オキシダンス、カウロバクター・クレセンタス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、メチロバクテリウム・ラジオトレランス、メチロバクテリウム・ノデュランス、ロドバクター・スフェロイデス、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・プチダS12、パラコッカス・デニトリフィカンス、エシェリキア・コリ、シノリゾビウム・メリロティ、ブラディリゾビウム・ジャポニクム、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・レグミノサルム、リゾビウム・レグミノサルムbv.トリフォリー(Rhizobium leguminosarum bv.trifolii)、アグロバクテリウム・ラジオバクター、カプリアビダス・バシレンシス、カプリアビダス・ネカトール、ラルストニア・ユートロファ、ラルストニア・ピッケティー、バークホルデリア・フィトファーマンズ、バークホルデリア・フィマタム、バークホルデリア・ゼノボランス、バークホルデリア・グラミニス、ロドシュードモナス・パルストリス、アシディフィリウム・クリプタム、ディノロセオバクター・シバエ、スルホロブス・アシドカルダリウス、スルホロブス・イスランディカス、スルホロブス・ソルファタリカス及びスフホロブス・トコダイーからなる群から選択される、請求項4に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
- 第一及び第二のポリヌクレオチドが単一のベクターに位置する、請求項2〜5のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
- 第一、第二及び第三のポリヌクレオチドが単一のベクターに位置する、請求項3に記載の遺伝的に改変されたグラム陰性細菌細胞。
- (i)5−(ヒドロキシメチル)フラン−2−カルボン酸(HMF酸)輸送能力を有するポリペプチドをコードしており、配列番号7に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも70%の配列同一性を有する第一のポリヌクレオチド、及び
(ii)HMF酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド
を含むベクター。 - HMF酸酸化還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号5に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項8に記載のベクター。
- フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチドを更に含み、
フランアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号19、20、21、22、23、24又は25に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項8又は9に記載のベクター。 - 請求項2〜7のいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞をHMF酸の存在下で該グラム陰性細菌細胞によるHMF酸の酸化のために好適な条件下でインキュベートするステップを含む、HMF酸を酸化する方法。
- 請求項2〜7のいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞を、1つ又は複数のHMF酸のフラン前駆体の存在下で、該グラム陰性細菌細胞によって1つ又は複数のフラン前駆体を2,5−フランジカルボン酸(FDCA)に酸化するための好適な条件下でインキュベートするステップを含む、FDCAを産生する方法。
- フラン前駆体が5−(ヒドロキシメチル)フラン−2−カルボアルデヒド(HMF)、フラン−2,5−ジカルボアルデヒド(DFF)及び[5−(ヒドロキシメチル)フラン−2−イル]メタノール(HMFアルコール)を含む群から選択される、請求項12に記載の方法。
- フラン前駆体が1つ又は複数のヘキソース糖から得られる、請求項12又は13に記載の方法。
- FDCAが、酸沈殿の後に、冷却結晶化又は溶媒抽出を実施することを含む方法によって反応混合物から回収される、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
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