CN110819565B - 一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌bw9及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9及其应用。所述的耐盐芽孢杆菌BW9分类命名为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019379。该菌菌落不规则，呈白色，边缘不整齐，表面干燥，微皱，菌落平铺在培养基上易刮取，菌体呈杆状，菌体大小为0.70‑0.94×1.52‑4.75μm，该菌的适宜生长pH为6‑10，生长盐浓度为1‑10%。本发明的耐盐芽孢杆菌BW9性状稳定、培养简单，具有较强的拮抗活性、产铁载体活性和固氮作用，可以有效的抑制多种植物病原菌，进而能够减少多种植物的病害，可以提高植物品质和产量，具有很好的应用价值。

Description

一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9及其应用

技术领域

本发明主要涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9及其应用。

背景技术

植物病害是影响农业生产的主要因素之一，在植物种植的过程中，常常会遇到各种病害的侵扰，这些病害严重影响了植物的品质和产量，给农户带来巨大的经济损失。而化学农药与肥料一直是全世界各地长期以来防治植物病害与提高作物产量的主要手段，但由于化学药剂长期使用，不仅会对土壤造成一定的化学残留和污染，还会使植物病原菌产生抗药性、伤害非靶标生物甚至破坏生态平衡。随着大众对绿色无污染、无公害产品的高度呼吁，生物防治因其环境友好性、无毒无残留而成为国内外的研究热点。

而早在1921年，科学家Hartely就利用真菌防治猝倒病，从此开辟了一条利用有益微生物防治植物病害的的新型农药研究道路。而我们也将这些有益微生物称作“生防微生物”，其包含了细菌(狭义)、放线菌、真菌和病毒等，它们通过寄生作用、分泌拮抗物质，在土壤或植物体中定值，占据生态位，或增强植物抗逆性等来达到控制病害的效果。

植物根际土壤中存在着数量巨大、种类丰富的微生物，它们中绝大多数是有益的，在土壤的物质转化、结构形成、提高作物养分有效性以及抑制病原菌活性等方面发挥着不可替代的作用。有研究表明，在土壤中接种人工选育的促生菌和拮抗菌，或对植物施用这些菌株的发酵产物，可以有效降低土传病害的发生率。但大部分的有益微生物在高盐的土壤环境中无法发挥自身的活性以达到有效抑制植物病原菌的作用。因此，筛选能够在高盐环境下对植物病原菌有较强拮抗效果的微生物，可以对发现新型农用生防菌以及挖掘潜在新型杀菌剂候选化合物奠定基础。

发明内容

本发明提供了一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9及其应用，所述耐盐芽孢杆菌BW9具有很好的耐盐特性以及较强的拮抗活性，可以明显的抑制多种植物病原菌。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9，其分类命名为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019379。

进一步的，所述耐盐芽孢杆菌BW9的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述耐盐芽孢杆菌BW9菌落不规则，呈白色，边缘不整齐，表面干燥，微皱，菌落平铺在培养基上易刮取。

进一步的，所述耐盐芽孢杆菌BW9菌体呈杆状，菌体大小为0.70-0.94×1.52-4.75μm。

进一步的，所述耐盐芽孢杆菌BW9的适宜生长pH值范围为pH 6-10。

进一步的，所述耐盐芽孢杆菌BW9的适宜生长盐浓度为1-10％。

进一步的，所述耐盐芽孢杆菌BW9具有产铁载体活性和固氮作用。

本发明还提供了所述的耐盐芽孢杆菌BW9在用于制备抑制植物病原菌的制剂中的应用。

进一步的，所述植物病原菌为禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌、禾谷丝核菌、尖孢镰刀菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、灰霉病菌和禾顶囊壳菌中的至少一种。

进一步的，所述的植物为小麦、大麦、玉米、水稻、苹果、番茄、柑橘、黄瓜中的至少一种。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明所述的耐盐芽孢杆菌BW9是从小麦田的小麦根部地表10cm以下的土壤中筛选并经过分离和纯化得到的，其具有性状稳定、培养简单、效果明显、适用条件较广以及不会造成环境污染等优点。本发明的耐盐芽孢杆菌BW9还具有耐盐的特性，适宜在1-10％的浓度下生长，可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐、水解淀粉，利用多种糖类产酸，并且该耐盐芽孢杆菌BW9还具有产铁载体活性、固氮作用以及较强的拮抗活性，可以有效的抑制多种植物病原菌，尤其是抑制禾谷丝核菌、苹果腐烂病菌和灰霉病菌的效果最好，进而能够减少多种植物的病害，提高植物品质和产量，同时还不会给动植物带来致病性，有利于保障农作物的种植和农业生产，因此具有很好的应用价值。

附图说明

图1为耐盐芽孢杆菌BW9的菌落形态特征(左)与革兰氏染色结果(右)。

图2为耐盐芽孢杆菌BW9的16S rRNA基因扩增产物电泳结果。

图3为采用邻接法构建耐盐芽孢杆菌BW9的16S rRNA基因系统进化树。

图4为耐盐芽孢杆菌BW9的polC基因扩增产物电泳结果。

图5为耐盐芽孢杆菌BW9对植物病原真菌抑制作用结果，其中1为禾谷镰刀菌；2为燕麦镰刀菌；3为禾谷丝核菌；4为尖孢镰刀菌；5为苹果轮纹病菌；6为苹果腐烂病菌；7为灰霉病菌；8为禾顶囊壳菌。

图6为耐盐芽孢杆菌BW9产铁活性检测结果(左)与固氮作用检测结果(右)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

本发明所用培养基的配方和配置方法为：

1、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)：牛肉膏5g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂粉18g；水1000ml；pH：7.2-7.4。混合均匀，121℃高压灭菌20min。

2、牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)：牛肉膏5g；蛋白胨10g；氯化钠5g；水1000ml；pH：7.2-7.4。混合均匀，121℃高压灭菌20min。

3、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉15g。混合均匀，121℃高压灭菌20min。

4、CAS检测培养基：

(1)溶液a：称0.012g铬天青(CAS)完全溶于10ml ddH₂O中，然后加入2ml 1mmol/1的FeCL₃溶液，混和均匀；

(2)溶液b：称0.015g十六烷基三甲基嗅化铵(CTAB)完全溶于8ml ddH₂O中；

(3)染液c：将溶液a缓慢加入溶液b中，充分搅拌混匀；

(4)培养基d：将20ml 10×MM9盐溶液、6.04g呱嗪二乙醇磺酸(pipes)溶于150mlddH₂O中，混和均匀，再使用50％NaOH调pH至6.8，加入3.2g的琼脂粉得到培养基d；

(5)配置1mmol/l CaCL₂、1mmol/l MgSO·7H2O、20％葡萄糖、10％酪蛋白氨基酸溶液，然后将上述4种溶液与染液c和培养基d分开灭菌，115℃高压灭菌20min，待灭菌完成后将上述4种溶液置于50℃水浴锅中保温。分别取0.2ml的1mmol/l CaCL₂、4ml的1mmol/lMgSO·7H2O、2ml的20％葡萄糖、6ml的10％酪蛋白氨基酸溶液加入到培养基d中，再将染液c也缓慢加入，轻轻摇匀，即得到蓝色产铁载体检测培养基。

5、无氮固体培养基：蔗糖10g；K₂PO₄ 0.5g；CaCO₃ 1g；MgSO·7H2O 0.2g；NaCl0.2g；琼脂20g；ddH₂0 1000ml；pH：7.2。

实施例1：耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans BW9的筛选

1、菌株分离

采集了山东省潍坊市潍坊农科院试验基地小麦田的小麦根部地表10cm以下的土壤，将其装入无菌样袋并于-4℃保存备用。

菌株分离采用土壤稀释涂布平板法。将采集的土壤风干，称取30g土样，剔除植物残体等杂质，用研钵研成粉末状。加入270mL无菌水，于磁力搅拌器上搅拌30min，静置一会儿取上清液3mL加入27mL无菌水，即成为10^-2的土壤悬液，混匀后，再用无菌移液管吸取10^-2土壤悬液3mL加入27mL无菌水，如此重复制成10^-3、10^-4、10^-5及10^-6的稀释液。从每个浓度梯度的土壤稀释液中吸取0.1mL到NA培养基中，用涂布器均匀涂于培养基表面，每个浓度各3个重复，28℃恒温培养。

2、菌株纯化

待涂布平板培养3-4天后，开始挑取单菌落，一直培养10天。采用平板划线分离的方法进行菌种纯化与培养，将菌种接种到NA培养基上，将其培养1-2天，纯化2次后再进行保存。挑取纯化后的单菌落至NB培养基中，28℃，200r/min培养12-24h，制备灭菌的40％的甘油，按1∶1的比例将菌悬液与甘油混合，保存在2mL冻存管中，于-80℃保藏。

3、耐盐芽孢杆菌BW9的筛选

以禾谷镰孢菌、燕麦镰孢菌、尖孢镰孢菌、禾谷丝核菌以及禾顶囊壳菌小麦变种为小麦土传病害指示病原真菌，采用五点平板对峙的方法进行拮抗菌株的筛选。用PDA培养基活化上述病原真菌，用直径5mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，用灭菌牙签挑取菌饼放在琼脂板中间位置。在生长成熟的待测菌株平板上，同样用打孔器打孔，挑取新鲜待测菌株接种在距指示菌菌饼3cm的位置，有菌面朝上。每板接4个待测菌株，呈十字交叉形，封口膜封好后于28℃恒温倒置培养。接种禾谷镰孢菌与燕麦镰孢菌的平板，4天后观察试验结果；接种尖孢镰孢菌、禾谷丝核菌以及禾顶囊壳菌的平板，7天后观察试验结果。对初筛得到有效菌株再进行复筛，每个菌株3个重复。通过平板对峙筛选试验，筛选出具有较广谱拮抗能力以及较强拮抗活性的菌株，其中一株定名为BW9。

实施例2：耐盐芽孢杆菌BW9的鉴定

1、菌株BW9的形态学特征及生物学特性

(1)菌株BW9的菌落特征观察

取新鲜菌株BW9在NA培养基上划线，封口膜封好后，置于28℃培养箱中培养，1-2d后取出观察菌落形态、颜色、边缘形状、透明度、隆起度、干湿度等基本特征，并进行革兰氏染色实验。

菌株BW9在NA培养基上生长，菌落的形态如图1所示：菌落不规则，呈白色，边缘不整齐，表面干燥，微皱，菌落平铺在培养基上易刮取。在油镜下观察，菌体呈杆状，菌体大小为0.70-0.94×1.52-4.75μm，革兰氏染色为蓝紫色，为革兰氏阳性菌。

(2)菌株BW9的pH适应范围

取新鲜菌株BW9分别接种于pH值为4、6、7、8、9、10、11的NB培养液中，30℃200r/min摇培72h后观察各菌株在不同pH值下的生长情况，每个菌株3个重复。结果如表1所示，表明菌株BW9能够适应较广的pH范围，6到10区间内都可以正常生长，当pH为4和11时，生长受到抑制，因此菌株BW9的生长pH值范围为pH 6-10。

表1菌株BW9在不同pH值下的生长

注释：“+”生长，“-”不生长

(3)菌株BW9的耐盐特性

取新鲜菌株BW9分别接种于含1％、2％、5％、7％、10％、11％的NaCl的NB培养液中，30℃200r/min摇培72h后观察各菌株在不同盐浓度下的生长情况，每个菌株3个重复。结果如表2所示，菌株BW9具有相当强的耐盐特性，在盐浓度达到10％时，依然可以生长，而在11％的盐浓度下生长受到抑制，因此菌株BW9的适宜盐浓度为1-10％。

表2菌株BW9在不同NaCl浓度下的生长

注释：“+”生长，“-”不生长

(4)菌株BW9的生理生化指标

参考《常见细菌系统鉴定手册》的方法测定菌株BW9的各项生理生化指标。结果如表3所示，表明菌株BW9可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，能够水解淀粉，利用柠檬酸盐，不产生H₂S，可以利用葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、木糖、果糖、肌醇、甘露醇并产酸，但不产气。

表3菌株BW9生理生化鉴定结果

注释：“+”阳性，“-”阴性

2、菌株BW9的16S rDNA鉴定

取1.5mL离心管，加入20-50μL无菌水，用枪头挑取菌株BW9的单菌落加入水中，吸打混匀，置沸水浴中加热，2min后取出，12000rpm离心2min，以上清液作为PCR模板，对其16SrRNA基因序列进行扩增，其中所用的PCR扩增引物序列为：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQIDNo.1)；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.2)。PCR扩增体系为20μL体系：TaKaRaTaq 10.0μL，引物各1.0μL，DNA模板1μL，ddH₂O 7.0μL。PCR扩增程序为预变性94℃5min；变性94℃1min，退火53℃1min，延伸72℃90s，重复35个循环；再延伸72℃，10min；4℃保存。菌株BW9的16S rRNA基因PCR扩增产物电泳结果如图2所示。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小后送去测序，测序结果显示其大小为1433bp，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。利用NCBI数据库进行Blast同源性分析，结果显示菌株BW9为芽孢杆菌属。再将菌株BW9的16S rRNA基因序列上传到EzBiocloud数据库与模式菌株进行比对，结果表明其与多种芽孢杆菌属菌株相似度均较高，达到了99％以上，再利用MEGA 5软件对菌株BW9及其它同源性较高的模式菌株或者已发表菌株进行Clustal W多序列比对，并构建系统发育树。系统发育树如图3所示，结果表明，菌株BW9与Bacillus halotolerans处于同一分支。

为了进一步确定菌株BW9的分类地位，又对其polC基因进行PCR扩增，其PCR扩增引物为Position 278-310-F：ATTTCAGGCCTCAGCGCTTTGAAGA(SEQ ID No.4)；Position 1227-1204-R：CCGGAATTTGTTCACTTAGTTCCC(SEQ ID No.5)。PCR扩增体系为20μL体系：TaKaRa Taq10.0μL，引物各1.0μL，DNA模板1μL，ddH₂O 7.0μL。PCR扩增程序为预变性95℃3min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，重复35个循环；再延伸72℃，10min；4℃保存。电泳检测PCR扩增产物，得到一条大小约1000bp左右的条带(图4)，将扩增产物进行测序，测序结果进行BLAST同源性比对分析，结果显示菌株BW9与Bacillus halotolerans strain DSM8802相似度最高，达到99.60％，与其它Bacillus halotolerans菌株相似度也都在99％以上，而与其它芽孢杆菌属菌种相似度均在92％以下，因此判定菌株BW9为耐盐芽孢杆菌Bacillushalotolerans。

本发明将筛选到的菌株BW9进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019年5月21日；耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans的保藏编号为CCTCC No：M 2019379。

实施例3：耐盐芽孢杆菌BW9对植物病原菌的抑菌作用

用PDA培养基活化禾谷镰孢菌、燕麦镰孢菌、尖孢镰孢菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌及灰霉病菌，用直径5mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，用灭菌牙签挑取菌饼放在琼脂板中间位置。在生长成熟的待测菌株平板上，同样用打孔器打孔，挑取新鲜耐盐芽孢杆菌BW9接种在距指示菌菌饼3cm的位置，有菌面朝上，封口膜封好后于28℃恒温倒置培养。接种禾谷镰孢菌、燕麦镰孢菌与灰霉病菌的平板，4天后观察试验结果；接种尖孢镰孢菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌的平板，7天后观察试验结果。对初筛得到有效菌株再进行复筛，每个菌株3个重复。

结果如图5所示，耐盐芽孢杆菌BW9对上述8种植物病原菌均显示出较强的拮抗活性，且具有明显的抑制效果，尤其是对禾谷丝核菌、苹果腐烂病菌和灰霉病菌的抑制效果最好。而禾谷丝核菌容易引起小麦、大麦、玉米、水稻的纹枯病，苹果腐烂病菌易引起苹果的烂皮病，灰霉病菌容易引起番茄、柑橘、黄瓜等植物。

实验例4：耐盐芽孢杆菌BW9的室内活性检测

1、菌株BW9的产铁载体活性定性检测

制作通用的CAS检测平板。挑取5mm BW9菌饼接于检测平板，28℃暗培养5-7天。根据菌株周围能否产生橙黄色晕圈，判断菌株是否具有产铁载体活性。

2、菌株BW9的固氮作用检测

用点植法将BW9菌株接种于无氮培养基中(点植法：使用接种环蘸取BW9菌株后，在固体培养基表面接触几点)，28℃培养5-7天，观察菌株在该检测培养基上的生长情况，若菌株转接5次后还能生长，则判定该菌株具有固氮的潜在活性。

结果如图6所示，耐盐芽孢杆菌BW9周围产生橙黄色晕圈，且在无氮培养基培养5天后仍然生长，说明耐盐芽孢杆菌BW9具有产铁载体活性和潜在的固氮的作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1433

<212> DNA

<213> 耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)

<400> 3

gcagcctata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg 60

gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg 120

ggctaatacc ggatgcttgt ttgaaccgca tggttcaaac ataaaaggtg gcttcggcta 180

ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc 240

aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag 300

actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa 360

cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt 420

accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480

gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg 540

gctcgcaggc ggttccttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat 600

tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa 660

tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc 720

tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780

cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc 840

actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960

atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca 1020

tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080

tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200

caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc 1260

tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320

atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1380

gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc cga 1433

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atttcaggcc tcagcgcttt gaaga 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaatttg ttcacttagt tccc 24

Claims (3)

1.一株具有抑制植物病原菌作用的耐盐芽孢杆菌BW9，其特征在于，其分类命名为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019379。

2.权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌BW9在用于制备抑制植物病原菌的制剂中的应用，其特征在于，所述植物病原菌为禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌、禾谷丝核菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、灰霉病菌和禾顶囊壳菌中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物为小麦、大麦、玉米、水稻、苹果、柑橘、黄瓜中的至少一种。

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