CN109750015B - 一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

发明属于生物工程技术领域，公开了一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，木聚糖酶突变体由编码木聚糖酶氨基酸序列SEQ ID NO.2中的88位天冬酰胺变为甘氨酸(N88G)而获得。该突变体具有较理想耐热特性，因此特别适合工业化大规模生产。

Description

一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种木聚糖酶突变体，尤其为一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase,EC.3.2.1.8)是一类木聚糖降解酶系,属于水解酶类，主要包括:内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。木聚糖酶是饲料主要用酶之一,其主要作用是分解由五碳糖聚合而成的半纤维素和木聚糖,主要分解产物有木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖。加木聚糖酶到饲料中，可以有效的将肠道内的木聚糖降解，改善食糜的粘度，提升饲料的利用率。

作为发展中国家，我国对饲料产量需要很大。饲料添加剂在实际应用过程中需要耐受饲料高温制粒过程，而天然木聚糖酶耐热性普遍较差，生产过程损失率高达70％-80％。那么提高他的热稳定性和催化能力就非常关键，因此，对木聚糖酶作用机理的研究以及优良性质的改造潜力巨大。本发明通过对真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因上的改造使其成为一种耐热性比较高的木聚糖酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种木聚糖酶突变体及其应用，旨在解决真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶的耐热性较差和在工业生产上不理想的问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种热稳性提高的木聚糖酶突变体，该突变体由真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶的氨基酸序列经取代得到，所述的真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

具体的，所述的木聚糖酶突变体由真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶氨基酸序列SEQ IDNO.3中第88位天冬酰胺变为甘氨酸而获得。

本发明所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的木聚糖酶突变体的酶促反应最适pH值为5.5；最适温度为60℃；在55℃、60℃、65℃时耐受60min残活都在50％以上。

在本发明另一方面，所述的氨基酸序列SEQ ID NO.1经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

所述的木聚糖酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明另一方面，与所述的编码基因SEQ ID NO.2编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。

在本发明另一方面，本发明还包括携带有编码基因序列为SEQ ID NO.2的木聚糖酶突变体的质粒。

本发明一并提供上述木聚糖酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)以真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因连接到载体pET-28a(+)上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增；

2)添加lμLDMT消化酶于PCR产物中，混匀，孵育70min；

3)加入l0μL消化产物于DMT感受态细胞中，经冰浴冷却、热激、冷却后，加500μL LB培养基，37℃180转培养1h，离心保留部分上清液，悬浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；

4)进行阳性克隆子筛选验证，挑取单菌落于相应抗性的LB培养基中，培养2-3h后PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆子测序，测序结果与原序列比对。

在本发明另一方面，本发明还提供了一种木聚糖酶突变体的基因的工程菌，所述的工程菌含有具有SEQ ID NO.2所示基因的载体。

所述的工程菌通过将SEQ ID NO.2所示的基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。

本发明所述的编码基因SEQ ID NO.2的表达载体选自pET-28a(+)、pET-28b/c(+)或pEasy-E2。

在本发明另一方面，本发明提供的木聚糖酶突变体在饲料添加剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种木聚糖酶突变体，该突变后的基因除与pET-28a(+)构建重组质粒外，还可以与pET-28b/c(+)、pEASY-Blunt E1、pEASY-E2等表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌中，通过在平板中加入Kanamycin、Ampicillin等抗生素，筛选获得木聚糖酶突变体基因工程菌，然后通过发酵获得新的木聚糖酶突变体。使其成为耐热性高的木聚糖酶，该木聚糖酶的突变体与木聚糖酶在高温下耐受经实验证明，无论在任何温度和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在55℃耐受60min木聚糖酶突变后相对酶活大约还有88.33％，而突变之前木聚糖酶仅仅剩余14.2％。在60℃时耐受60min木聚糖酶突变后相对酶活还有64.22％，而突变之前木聚糖酶仅仅剩余5.92％。在65℃时耐受60min木聚糖酶突变后相对酶活还有57.4％，而突变之前木聚糖酶仅仅在30min就只剩余1.12％。该突变体的耐热性有了明显的提高，工业化生产中损失率有一定的降低。

附图说明

图1是本发明实施例提供的木聚糖酶突变体的构建方法流程图；

图2是本发明实施例提供的最适pH的测定曲线图；

图3是本发明实施例提供的最适温度曲线图；

图4是本发明实施例提供的55℃耐受曲线图；

图5是本发明实施例提供的60℃耐受曲线图；

图6是本发明实施例提供的65℃耐受曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

通过对真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶的蛋白质空间结构进行模拟分析，确定其突变位点为第88位天冬酰胺变为甘氨酸。具体实施方案为以真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因为模板，通过基因的定点突变方法，使真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因发生突变，获得了新的木聚糖酶基因，将该突变基因与pET-28a(+)、pET-28b/c(+)、pEASY-Blunt E1、pEASY-E2等载体相连构建重组质粒，转入相应宿主菌BL21(DE3)中进行异源表达，发酵可以获得该木聚糖酶突变体。该突变体能在酸性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此适合工业上生产。

本发明实施例的木聚糖酶突变后的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

1、实验材料和试剂：

基因来源菌株：由本实验室筛选并保存的华根霉Rhizopus chinensis CCTCCM201021；表达宿主菌及载体：BL21和pET-28a(+)均购于Novagen公司；木聚糖酶重组质粒由实验室构建；宿主菌：DMT感受态细胞购于北京全式金公司。

主要试剂：DNAMarker、蛋白Marker(TaKaRa公司)；定点突变试剂盒(北京全式金公司)，PlasmidMini Kit I(Omega公司)。

实验仪器：离心机(Eppendorf)；PCR扩增仪(Bio-Rad)；核酸电泳仪(Bio-Rad)；蛋白电泳仪(Amersham Bioscience)；凝胶成像仪(Bio-Rad)。

主要培养基:LB，按照“Invitrogen公司操作手册”的推荐方法来配制。

2、木聚糖酶酶活力的测定

在一定温度为50℃、pH＝6.0条件下，每分钟从浓度为5.0mg/ml木聚糖溶液中释放1μmoL还原糖所需要的酶量，即一个酶活单位，以U表示(QB/T 4483-2013)。

2.1实验仪器：恒温水浴锅；pH仪器；酶标仪(Bio-Rad)等。

2.2实验材料：

2.2.1酶液：突变木聚糖酶菌株发酵酶液(突变)、原模版木聚糖酶菌株发酵液(真菌类新丽鞭毛菌)

2.2.2溶液配制：

pH缓冲液：0.1mol/L一水合柠檬酸缓冲液和0.1mol/L磷酸缓冲液(pH3-7)；

0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7-9)；

0.1mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9-12)。

底物溶液：10mg/mL玉米芯溶液。

DNS终止液配制：取80gNaOH加入3.5L双蒸水中，待全部溶解并冷却至室温后，称取50.0g的3，5-二硝基水杨酸加入上述溶液，使之完全溶解，之后缓慢加入少量酒石酸钾钠，共计1500.0g，小心加热溶解，温度不超过45℃，冷却至室温后用双蒸水定容至5.0L，室温放置储存于棕色瓶中，静置7天后即可使用。

3.酶活测定方法

采用DNS法：取10ml试管，加入450μL缓冲液，底物450μL混合后预热5min，加入稀释的酶液100μL混匀，加入的酶液时间间隔一致，混合反应10min之后依次加入DNS终止液终止反应，加入时间间隔和加入酶液的时间间隔一致；混合后，于沸水中煮沸5min，冷却后在波长为540nm下测定其OD值。对照组为先加入终止液后再加入酶液。实验为一个对照组和三个平行实验。

实施例1木聚糖酶突变体的制备

如图1所示，本发明实施例的木聚糖酶突变体的获得方法包括以下步骤：

(1)定点突变：真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制50μL突变体系。

(2)突变PCR验证：取10μL突变产物，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加1μLDMT消化酶于突变产物中，轻弹混匀，37℃孵育70min。

(3)转化：加入5μL突变后的产物于50μL DMT感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；42℃准确热激45s后立即置于冰上冷却l0min；加500μL LB培养基，180转，37℃培养lh；7000rpm离心3min，弃上部分清液，保留100-150μL上清轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃过夜培养。

(4)阳性克隆子验证：挑取单菌落于500μL相应抗性的LB培养基中，200rpm培养2-3h后PCR鉴定；将筛选出的阳性克隆子送出测序，测序结果与原序列比对。

(5)找出突变正确的重组质粒；将突变质粒转入大肠杆菌BL21中进行表达，发酵并进行对比测酶活，研究酶学及应用特性。

步骤(1)中定点突变引物为：

Forward：5’-AAACTTGTCAAACAAGGTAGTTCCAATGTT-3′；

Reverse：5’-CCTTGTTTGACAAGTTTGAAATCAGCCTTCA-3’。

真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因突变，按上实验方法进行突变后送华大基因公司测序，结果如序列SEQ ID NO.2，转化的大肠杆菌菌株具有木聚糖酶活性，选取一株发酵酶活性单位高的菌株进行发酵获得酶液进行酶学性质测定。

实施例2木聚糖酶最适pH测定

将缓冲液pH调成3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，将酶液稀释到适应的倍数，依照木聚糖酶活测定方法在37℃测出最适pH之后在最大值两侧补半点继续检测最适值(例如最适pH为6，则再取pH5、5.5、6、6.5和7按照木聚糖酶活测定方法进行测定)。

木聚糖酶酶促反应最适pH值结果如图2所示。突变体与木聚糖酶最适均为5.5。无明显变化。

实施例3木聚糖酶最适温度测定

依照木聚糖酶活测定方法测定，在上述最适pH的条件下，将反应物放在不同温度下反应30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，测出最适温度后，在最大值两侧补半点(例如最适温度是60℃，则补充50℃、55℃、60℃、65℃按照木聚糖酶活测定方法测定)。

木聚糖酶酶促反应最适温度值如图3所示，突变体与木聚糖酶最适温度均为60℃；两者无明显变化。

实施例4木聚糖酶温度耐受测定

将酶液稀释到相应倍数，然后放入不同温度：55℃下耐受3min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、45min、60min；60℃下耐受3min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、45min、60min；65℃下耐受3min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、45min、60min之后按照木聚糖酶活测定方法在最适温度下反应。对照实验组酶液是未耐受过的酶液。

高温下木聚糖酶的温度耐受情况如图4、图5、图6所示，随着温度的升高，相对酶活不断降低，随着时间的增加，相对酶活也逐渐降低。无论在任何温度和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在55℃耐受60min木聚糖酶突变后相对酶活大约还有88.33％，而突变之前木聚糖酶仅仅剩余14.2％。在60℃时耐受60min木聚糖酶突变后相对酶活还有64.22％，而突变之前木聚糖酶仅仅剩余5.92％。在65℃时耐受60min木聚糖酶突变后相对酶活还有57.4％，而突变之前木聚糖酶仅仅在30min就只剩余1.12％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 224

<212> PRT

<213> 木聚糖酶突变体(Xylanase mutant)

<400> 1

Gln Ser Phe Cys Ser Ser Ala Ser His Ser Gly Gln Ser Val Lys Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp

20 25 30

Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Asp Gly Ser Phe

35 40 45

Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu

50 55 60

Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala

65 70 75 80

Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Gly Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr

85 90 95

Val Gly Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile

100 105 110

Val Asp Asn Trp Leu Ser Pro Phe Pro Pro Gly Asp Trp Val Gly Asn

115 120 125

Lys Lys His Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr

130 135 140

Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp

165 170 175

Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly

180 185 190

Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly

195 200 205

Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly

210 215 220

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 编码基因(Coding gene)

<400> 2

caaagtttct gtagttcagc ttctcactct ggacaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60

gttggaacta ttggtggtgt tggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120

actttctatt ctgatggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga ttacttatgt 180

cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240

gatttcaaac ttgtcaaaca aggtagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300

ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360

ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420

tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480

caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540

tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600

ggtgaagccg gtaacgttaa cggtggtgcc agtggtaccg ctgatttccc atacgcaaag 660

gtttacattg gt 672

<210> 3

<211> 224

<212> PRT

<213> 木聚糖酶(Xylanase)

<400> 3

Gln Ser Phe Cys Ser Ser Ala Ser His Ser Gly Gln Ser Val Lys Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp

20 25 30

Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Asp Gly Ser Phe

35 40 45

Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu

50 55 60

Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala

65 70 75 80

Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr

85 90 95

Val Gly Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile

100 105 110

Val Asp Asn Trp Leu Ser Pro Phe Pro Pro Gly Asp Trp Val Gly Asn

115 120 125

Lys Lys His Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr

130 135 140

Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp

165 170 175

Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly

180 185 190

Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly

195 200 205

Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly

210 215 220

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacttgtca aacaaggtag ttccaatgtt 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccttgtttga caagtttgaa atcagccttc a 31

Claims (7)

1.一种热稳性提高的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体由氨基酸序列SEQ ID NO.3中第88位取代获得，所述的取代具体为天冬酰胺变为甘氨酸。

2.编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子与SEQ ID NO.2编码相同蛋白质，但其核苷酸序列为因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列。

5.一种工程菌，其特征在于，包含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的载体。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述的载体为pET-28a(+)、pET-28b/c(+)、 pEASY-Blunt E1或pEASY-E2。

7.权利要求1所述的木聚糖酶突变体在作为饲料添加剂中的应用。

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