CN102597227A - 增强的肌醇六磷酸酶变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增强蛋白质的领域，特别涉及通过分子改变增强的蛋白质领域。本发明涉及所谓的增强的肌醇六磷酸酶变体，其特征在于所述肌醇六磷酸酶变体具有比原肌醇六磷酸酶好的热稳定性和/或活性。本发明还涉及编码所述变体的核酸、含有所述变体的表达盒或表达载体、表达所述变体的宿主细胞、包含所述变体的组合物以及其主要在制备食品添加剂和动物饲料中的用途。

Description

增强的肌醇六磷酸酶变体

本发明涉及增强蛋白质领域，特别是通过分子改变而增强的蛋白质领域。它涉及称作增强的肌醇六磷酸酶的变体，因为与原肌醇六磷酸酶相比它具有较好的热稳定性和/或活性。本发明还涉及编码所述变体的核酸，含有所述变体的表达盒或表达载体，表达所述变体的宿主细胞，包括所述变体的组合物，以及还涉及其主要在食品添加剂和动物饲料制备中的用途。

肌醇六磷酸酯(phytate)是植物中主要的磷储存化合物。该分子，也被称作肌醇六磷酸(phytic acid)或六磷酸肌醇酯(inositol-hexa-phosphate)(InsP6或肌醇六磷酸酯(myo-inositol hexakisphosphate))，由环己烷组成，六个磷酸酯基团结合到该环己烷。肌醇六磷酸酯代表大约70％的植物磷酸酯，剩下30％以游离形式存在。另外，肌醇六磷酸酯的磷酸酯残基螯合二价和三价阳离子，如钙、铁、锌、镁、铜、锰和钼，这些阳离子是营养所必需的。

肌醇六磷酸酶是水解肌醇六磷酸酯的酶：这种酶自然地释放一种或两种磷酸酯，很少是三种，该磷酸酯然后被吸收进入消化系统；其它的反应产物很少是肌醇三磷酸酯，主要是肌醇四磷酸酯和肌醇五磷酸酯(图1)。肌醇六磷酸酶构成酶家族，其在自然界中被广泛代表：许多生物体——从细菌到借助真菌的植物和某些动物——表达它们中的一种或多种。然而，哺乳动物不表达任意一种，反刍动物或多胃动物如牛和马在它们的胃肠道中具有降解肌醇六磷酸酯的内源微生物，但是这并不适用于单胃动物，例如，主要是猪和家禽，所以源自摄食的植物的肌醇六磷酸酯不代表有用的磷来源。因此，必需向它们的饲料中加入游离的磷酸酯。然而，那些加入的游离磷酸酯的部分和动物摄食的几乎所有肌醇六磷酸酯被排入到环境中。肌醇六磷酸酯然后在土壤中被细菌降解并且以游离磷酸酯的形式最后处于地下水和河流中。在畜牧业高度集中的地区，这种农业-工业磷酸酯废物——呈游离形式或呈肌醇六磷酸酯形式——代表主要的污染来源，这特别地导致河流和河道中的绿藻类增殖。除了美观方面外，这种藻类具有重要的生态影响，因为它们与当地的植物种类竞争，特别是在溶解氧的消耗方面。

哺乳动物能利用以肌醇六磷酸酯形式储存的磷酸酯作为磷酸酯来源的一个方法是将外源肌醇六磷酸酶引入到食物中。因此加入所述酶代表利用无机磷酸酯作为食品补充剂的替代方案。另外，通过使肌醇六磷酸酯的磷酸酯可及，它们还能对螯合到肌醇六磷酸酯的磷酸酯上的金属离子以及对结合到肌醇六磷酸酯的蛋白质提供较好的可及性，使它们在营养上可用。肌醇六磷酸酶目前在动物饲料中被相对系统地使用。它们被用作磷酸酯的部分替代品，它们还使蛋白质、氨基酸和钙更加可及。

然而，在动物饲料中使用肌醇六磷酸酶存在几个限制：

-肌醇六磷酸酶释放磷酸酯不够有效构成第一个限制。即使在外源肌醇六磷酸酶存在的情况下，仍然将磷酸酯添加到动物饲料中。然而，如果所有肌醇六磷酸酯被转化成游离的磷酸酯，那么将不再需要补充物。因此，对提出更有活性的肌醇六磷酸酶存在真正的需求。

-目前使用的大多数酶不能被直接加入到饲料中，因为它们不能经受住制粒工艺，该工艺包括将饲料加热到95℃持续90秒。因此在制粒阶段之后将酶喷雾到饲料上，这代表额外的成本并构成第二个限制；因此，对于获得更加热稳定的肌醇六磷酸酶存在极大需求。

本发明的目的是通过产生这样的肌醇六磷酸酶而克服目前的限制，所述肌醇六磷酸酶有足够的活性以对补充磷酸酯的需要具有实质影响，并且是足够热稳定的以便能够被直接加入到动物的饲料中，而不必使用喷雾技术。

许多肌醇六磷酸酶已在出版物和专利申请中被表征，或甚至已在农业-工业应用中使用。然而，它们都没有能够免除用磷酸酯补充畜牧场动物饲料的需要，并且它们都不是足够热稳定的以便直接加入到动物饲料中而不必使用喷雾技术。

大多数出版物涉及来自黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌(Escherichia coli)的肌醇六磷酸酶。微生物来源或源自植物的其它肌醇六磷酸酶也已被研究，问题是获得具有大于黑曲霉比活性(250U/mg)的热稳定肌醇六磷酸酶。文献和专利申请中描述的肌醇六磷酸酶涉及真菌(担子菌和子囊菌)、酵母和细菌。

许多肌醇六磷酸酶已被从真菌中分离并且主要源自曲霉属(Aspergillus)家族，但也源自犁头霉属(Absidia)、端梗霉属(Acrophialophora)、田头菇属(Agrocybe)、Calcarisporiella、毛壳菌属(Cheatomium)、棒囊壳属(Corynascus)、毛霉菌(Mucor)、菌丝体(Mycelia)、Myriococcum、青霉属(Penicillium)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)或甚至源自松庆病菌属(Trametes)、孢子菌丝属(Sporotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)、枝孢属(Cladosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Taleromyces、梭孢壳属(Thielavia)、腐质霉属(Humicola)、桩菇菌属(Paxillus)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。

可获得大量关于这样的酶的比活性和Km的信息，如Wyss等1999(Appl.Environ.Microbiol.65(2)367-373)中的信息。总体上，曲霉属肌醇六磷酸酶被表征为5μM至20μM的高Km值、57℃的最适温度和5.5的最适pH——除了烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(最适pH.＝6)，但具有范围从100至250U/mg非常低的比活性。

某些源自其它真菌的肌醇六磷酸酶已显示令人感兴趣的性质，特别是高比活性，如源自绒毛栓菌(Trametes pubescens)的肌醇六磷酸酶或源自隔孢伏革菌(Peniophoralycii)的肌醇六磷酸酶(在WO 98/28408中分别是1200U/mg和1080U/mg)。枝孢菌属某种(Cladosporium sp.)具有令人感兴趣的肌醇六磷酸酶，其具有900U/mg的比活性和15.2μM的Km，但具有40℃的低最适温度。另外，来自蜡质菌属某种(Cereporiasp.)的6-肌醇六磷酸酶具有11040U/mg的比活性。Lassen等，2001(Appl.Environ.Microbiol.67(10)4701-4707发表了一些互补的信息，比较了来自担子菌，特别是隔孢伏革菌、蜡质菌某种、绒毛栓菌和黑曲霉的肌醇六磷酸酶的热稳定性；似乎所述酶具有从55℃(绒毛栓菌)到60℃(隔孢伏革菌)非常接近的Tms(酶具有50％活性时的温度)，但具有从15％(绒毛栓菌)到62％(隔孢伏革菌)变化大的残余活性(在醋酸钠[0.1M]，pH 5.5中于80℃预温育60分钟而产生的活性百分比)。

许多机构已提交了关于所述酶的专利申请，特别是Danisco/Genencor(WO 2001/012792，Penicillium subtilis；WO 2003/038035，里氏木霉(Trichodermareesei)；WO 2003/038111，青霉属，Mumicola，翘孢霉属(Emericella)，镰孢霉属(Fusarium))、ABEnzymes/ROAL (EP 0 659 215，由里氏木霉生产的曲霉属肌醇六磷酸酶)、DSM/Roche(EP 0 684 313，土曲霉(Apergillus terreus)，烟曲霉，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，Talaromaces thermophilus)、BASF(WO 2003/102174，曲霉属)、Adisseo(WO 2003/054199，青霉属)和Choongang Biotech Ltd.(WO 2005/056835，草酸青霉菌(Penicillium oxalicum))。

几种细菌肌醇六磷酸酶已被描述，其源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 151：1102-1108)、假单胞菌属(Pseudomonas)(Cosgrove，1970，Australian Journal of Biological Sciences23：1207-1220)和Klebsiella。文献中已报导了几种源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶。Greiner等在Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113，1993中纯化和表征了大肠杆菌的新型肌醇六磷酸酶；其它的已被Lim等，2000，Nat.Struct.Biol.7：108-113，Oshima等，1996，DNA Research，3：137-155，Touati和Danchin，1987，Biochimie，69：215-221，Rodriguez等，2000，Arch.Biochem.Biophys.，382：105-112，Kretz，涉及大肠杆菌B的美国专利5 876 997和涉及appA的Dassa等，1990，J.Bacteriol.172：5497-5500报导。

来自大肠杆菌肌醇六磷酸酶的突变体已通过基因工程获得，导致增强的热稳定性和比活性(Rodriguez等，2000，Arch.Biochem.Biophys.，382：105-112，Lanahan等，2003，美国专利申请20030157646)。然而，那些突变体都没能用于在真核生产生物体中生产足够的原核来源的那些酶。

本发明的目的是提供重组酶，所述重组酶适于工业过程以使其用作食品添加剂，主要是用于动物饲料中。

在申请WO 2002/048332中，利用在发明日获得的细菌基因组的BLAST分析和利用来自大肠杆菌的appA基因，Diversa鉴定了具有肌醇六磷酸酶活性的来自鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的新型蛋白。该蛋白具有显著的特征，即它具有4400U/mg的比活性。在该申请中没有说明该蛋白的其它生物化学特征。该申请似乎证实源自来自耶尔森菌家族细菌的肌醇六磷酸酶的高潜在活性。

在2005年10月20日，具有编号ZP_00832361的蛋白序列被加入到NCBI数据库中。所述序列是中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)ATCC 29909的假定蛋白，其相应的核苷酸顺序存在于编号NZ_AALF01000052，区域：1889…3214下。该蛋白序列通过源自菌株中间耶尔森菌ATCC 29909基因组全序列的相应核苷酸序列的翻译而获得。尽管PRK10172结构域似乎预测肌醇六磷酸酶活性，但是没有实验成分伴随该预测。

这似乎已通过从源自冰川污物样品的新型菌株中间耶尔森菌分离非常相似的肌醇六磷酸酶而被证实，该菌株被称为H-27并存在于申请WO 2007/128160中。源自H-27菌株的肌醇六磷酸酶在NCBI数据库中被指定核苷酸序列登录号AB195370.1和蛋白序列登录号DQ986462；它具有98％的氨基酸同一性并且与编码中间耶尔森菌ATCC 29909的假定肌醇六磷酸酶的核苷酸序列具有97％的同一性。

申请WO 2007/128160的肌醇六磷酸酶具有超过3000U/mg的高比活性，与WO 2002/048332中记载的鼠疫耶尔森菌的比活性具有相同的等级。在该申请WO 2007/128160中，要求保护蛋白的固有生物化学特征，即45.5kDa的分子量、在4.0至5.0范围的最适pH、50至60℃的最适温度、7.7的理论pI、超过3000U/mg的比活性和对胃蛋白酶和胰蛋白酶的高抗性。

本发明意指通过分子上改变来自中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶而提出增强的变体，可以超越目前的限制。术语″增强的变体″指热稳定性和/或活性比来自中间耶尔森菌的原肌醇六磷酸酶高的变体，指它可用于工业过程和特别是用作食品添加剂。

如在本文的其余部分和借助附图所描述的，本申请描述了序列是SEQ ID No.1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代：P3、V4、A5、P8、T9、G10、V16、V17、L19、S20、R21、H22、G23、V24、R25、S26、P27、T28、K29、Q30、T31、Q32、L33、M34、D36、P39、K41、W45、A49、G50、Y51、L52、T53、G56、A57、V60、Y67、G75、A78、C81、D92、V93、D94、Q95、R96、T97、R98、L99、T100、G101、A103、V116、V125、D126、F129、H130、P131、V132、D133、D140、T142、Q143+H145、A147、L152、P155、L156、E158、E158+S160、F167、A177、C182、G189、D193、N196、F197、K201、K206、P207、T209、K210、V211、S212、L213、L217、A218、L219、S220、S221、T222、L223、G224、E225、I226、F227、L228、L229、Q230、N231、Q233、A234、P236、R242、I250、S251、L252、L253、L255、H256、N257、Q259、F260、D261、M263、A264、Y268、K273、G274、P276、L277、Q292、G293、P297、P300、Q301、G308、G309、H310、D311、T312、N313、I314、A315、N316、G322、A323、Q326、P331、D332、N333、T334、P335、P336、G337、G338、G339、V341、E343、D349、Q352、R353、Y354、I355、A370、E371、K376、P379、A380、G381、D388、E391、S393、G394和P414，所述位置表示在SEQ ID No.1中。优选地，序列是SEQID No.1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物包括至少一个选自以下的取代：P3L、P3V、V4G、A5P、P8N、P8V、T9I、T9Q、T9S、T9Y、G10A、G10P、V16M、V17W、L19G、S20C、R21F、H22A、H22S、H22Y、G23S、V24C、R25C、S26C、P27F、T28N、T28S、T28V、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、Y67W、G75R、A78P、C81N、D92R、V93G、D94G、D94S、Q95N、Q95V、R96A、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、V116C、V125N、D126Q、F129W、H130N、H130Q、H130R、H130W、H130Y、P131S、V132W、D133G、D133P、D133R、D133V、D133W、D140E、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、T209C、K210C、K210E、K210N、K210S、K210T、K210V、K210Y、V211C、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、E225D、F227S、L229H、Q230N、Q230T、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、H256A、H256E、H256P、N257I、Q259K、Q259S、Q259T、Q259Y、D261F、M263L、A264N、A264P、Y268C、Y268E、Y268N、K273N、G274C、G274S、P276L、Q292P、G293N、P297N、P297S、P300N、Q301L、G308S、H310N、H310R、D311A、D311E、D311G、T312D、T312N、T312P、T312V、N313F、N313R、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、N333V、P335C、P335G、P335R、P335S、P335T、G339C、V341A、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、R353C、Y354N、I355W、A370D、A370T、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T和P414Q，所述位置表示在SEQ ID No.1中。优选地，序列是SEQ IDNo.1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物包括至少一个选自前述组的取代的取代组合。

SEQ ID No.1是2005年10月20日提交的出现在NCBI数据库中的序列，登录号是ZP_00832361，然而，在该蛋白质的5′端不含有23个氨基酸信号序列。SEQ ID No.1因此对应于在上述登录号下出现的残基24-441。SEQ ID No.1还含有编码NCBI数据库(base)中前述蛋白序列的核酸序列，编号是NZ_AALF01000052。在该序列的基础上利用技术人员熟知的技术，例如通过待被修饰密码子的定向诱变，可容易地制备编码本发明变体的核酸，以获得期望的氨基酸取代。因此，本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的序列对应于包含所选一个或多个取代的SEQ ID No.1。

SEQ ID No.2只复制SEQ ID No.1的蛋白序列。

在具体的实施方式中，本发明增强的变体包括单个取代。

在优选的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代：K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349和E391，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在另一个优选的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括在选自以下氨基酸之一上的取代：K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349和E391，所述位置表示在SEQ ID No.1中。优选地，在氨基酸K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349和E391上的取代选自K29N、Q30D、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52G、G75R、C81N、V93G、Q95N、R98T、L99C、F129W、H130Y、D140F、D140N、T142N、P155N、P155T、F167N、A177N、A177S、A177T、G189N、K201N、K210N、K210S、L219V、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、M263L、Y268N、G274C、Q292P、G293N、P297N、G308S、N316C、Q326S、Q326T、D349S、D349T和E391N，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

在又一个优选的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括在选自以下氨基酸之一上的取代：K29、Q30、Y51、L52、G75、V93、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、K201、K210、L219、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、G308、N316、Q326和E391，所述位置表示在SEQ ID No.1中。优选地，在上述氨基酸上的取代选自K29N、Q30D、Y51G、Y51Q、Y51W、L52G、G75R、V93G、R98T、L99C、F129W、H130Y、D140F、T142N、P155T、F167N、A177N、A177S、A177T、K201N、K210S、L219V、S251N、L252M、L255T、M263L、Y268N、G274C、Q292P、G293N、G308S、N316C、Q326S、Q326T和E391N，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

在另一个具体的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括选自以下的取代组合：G274C+N316C、T142N+A177T+Q326T、K210S+Y268E+Q292P、D140F+Y268E+Q292P、F167N+Y268E+Q292P、T142N+A177T+K210S+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T+G274C+N316C、L52C+L99C+T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在该具体实施方式的优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ IDNo.1中。在该实施方式的另一个特别优选的方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+K210S+Y268E+G274C+Q292P+N316C+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在该具体实施方式的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+K210S+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在该具体实施方式的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由G274C+N316C组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在该具体实施方式的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在该具体实施方式的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由K210S+Y268E+Q292P组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。在该具体实施方式的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由D140F+Y268E+Q292P组成的取代组合。在该具体实施方式的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由F167N+Y268E+Q292P组成的取代组合。

本发明提供序列是SEQ ID No.1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其包括所选的一个或多个取代。

本发明还提供编码根据本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的核酸、包括本发明核酸的表达盒和包括本发明核酸或表达盒的载体。所述载体可以优选地选自质粒、噬菌体、噬菌粒和病毒载体。

本发明还提供组合物，所述组合物包括序列是SEQ ID No.1的至少一个增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物——其具有根据本发明的所选的一个或多个取代。它还提供包含一定百分比的至少一个本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的任意固体、液体或气体混合物。它还提供优选含有一个、两个、三个、四个、五个或十个根据本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的混合物。本发明还提供肌醇六磷酸酶制剂或组合物，其含有一定百分比的至少一个本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物和一个或多个具有有利特性的其它酶。

本发明提供本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物在制备食品添加剂中的用途。利用本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物是工业过程所关注的，该工业过程可用于释放矿物质，特别是来自植物的磷酸酯，当在摄食之前利用本发明增强的肌醇六磷酸酶变体处理食物时体外释放，或通过在进食之前或进食时将所述变体直接给予动物而体内释放。

本发明提供含有序列是SEQ ID No.1的至少一个增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物——其具有本发明所选的一个或多个取代——的核酸、表达盒或编码载体转化或转染宿主细胞的用途。它还提供宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的核酸、表达盒或载体。本发明还提供所述核酸、所述表达盒、所述载体或所述宿主细胞生产本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的用途。它还提供本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的生产方法，包括用本发明的核酸、表达盒或载体转化或转染宿主细胞，培养转化或转染的宿主细胞和收获由宿主细胞产生的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物。宿主细胞可以是原核或真核的。因此，宿主细胞可以是微生物，优选细菌、酵母或真菌。宿主细胞还可以是哺乳动物细胞，如COS7或CHO细胞。

术语″功能衍生物″指源自本发明肌醇六磷酸酶变体的任何酶，其包含结构修饰同时保持肌醇六磷酸酶活性。这样的修饰可以例如包括通过加入新结构域而延伸所述酶，或结构域的部分或全部取代，如用来自可以提供其他功能/特性的其它酶的氨基酸替换氨基酸片段(stretch)。术语″功能衍生物″还包括本发明酶的变体的二聚化形式，其可以是同源或异源二聚体，或甚至多聚体，例如由于结构域倍增而具有增强的特性，如热稳定性。术语″功能衍生物″还包括本发明肌醇六磷酸酶变体的嵌合形式，其与感兴趣的另一蛋白/酶融合或与所述感兴趣的酶的一个或多个结构域融合。术语″功能衍生物″还包括本发明肌醇六磷酸酶变体的功能片段，其保留肌醇六磷酸酶活性。所述活性可以利用实施例4和5中描述的方案之一进行测量。该片段可以包括本发明肌醇六磷酸酶的250、275、300、325、350、375、380、385、390、395、400、405、410或415个连续氨基酸。所述功能片段还可以被二聚化或多聚化和/或与感兴趣的另一蛋白/酶融合或与其一个或多个结构域融合。

术语″变体″或″突变体″指与参考核苷酸序列相比具有突变的核苷酸序列。由于遗传密码的简并性，所述突变可以是沉默的；那么由该变体编码的蛋白与由参考核苷酸序列编码的蛋白具有同一性。所述突变还可以引起与参考核苷酸序列编码的蛋白相比变体编码的蛋白质中氨基酸的取代。术语″变体″包括含有通过定向诱变而获得的突变的序列。表达″变体″涉及呈现所述突变的核苷酸序列以及由所述核苷酸序列编码的蛋白序列。

本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物可以包含在选自以下氨基酸之一上的取代：P3、V4、A5、P8、T9、G10、V16、V17、L19、S20、R21、H22、G23、V24、R25、S26、P27、T28、K29、Q30、T31、Q32、L33、M34、D36、P39、K41、W45、A49、G50、Y51、L52、T53、G56、A57、V60、Y67、G75、A78、C81、D92、V93、D94、Q95、R96、T97、R98、L99、T100、G101、A103、V116、V125、D126、F129、H130、P131、V132、D133、D140、T142、Q143+H145、A147、L152、P155、L156、E158、E158+S160、F167、A177、C182、G189、D193、N196、F197、K201、K206、P207、T209、K210、V211、S212、L213、L217、A218、L219、S220、S221、T222、L223、G224、E225、I226、F227、L228、L229、Q230、N231、Q233、A234、P236、R242、I250、S251、L252、L253、L255、H256、N257、Q259、F260、D261、M263、A264、Y268、K273、G274、P276、L277、Q292、G293、P297、P300、Q301、G308、G309、H310、D311、T312、N313、I314、A315、N316、G322、A323、Q326、P331、D332、N333、T334、P335、P336、G337、G338、G339、V341、E343、D349、Q352、R353、Y354、I355、A370、E371、K376、P379、A380、G381、D388、E391、S393、G394和P414，其未在P3L、P3V、V4G、A5P、P8N、P8V、T9I、T9Q、T9S、T9Y、G10A、G10P、V16M、V17W、L19G、S20C、R21F、H22A、H22S、H22Y、G23S、V24C、R25C、S26C、P27F、T28N、T28S、T28V、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、Y67W、G75R、A78P、C81N、D92R、V93G、D94G、D94S、Q95N、Q95V、R96A、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、V116C、V125N、D126Q、F129W、H130N、H130Q、H130R、H130W、H130Y、P131S、V132W、D133G、D133P、D133R、D133V、D133W、D140E、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、T209C、K210C、K210E、K210N、K210S、K210T、K210V、K210Y、V211C、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、E225D、F227S、L229H、Q230N、Q230T、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、H256A、H256E、H256P、N257I、Q259K、Q259S、Q259T、Q259Y、D261F、M263L、A264N、A264P、Y268C、Y268E、Y268N、K273N、G274C、G274S、P276L、Q292P、G293N、P297N、P297S、P300N、Q301L、G308S、H310N、H310R、D311A、D311E、D311G、T312D、T312N、T312P、T312V、N313F、N313R、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、N333V、P335C、P335G、P335R、P335S、P335T、G339C、V341A、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、R353C、Y354N、I355W、A370D、A370T、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T和P414Q中被描述，所述位置表示在SEQ ID No.1中，或如上所述源自所述组的取代组合。作为例子，所述取代可以是称作″保守的″取代，即在具有相似或相当特性的氨基酸组，如根据下面表具有低空间位阻的氨基酸，或酸性、碱性、极性、疏水性和芳香氨基酸内的取代：

低空间位阻	Ala(A)	Gly(G)	Ser(S)	Thr(T)
					酸性的	Asp(D)	Glu(E)
碱性的	Arg(R)	His(H)	Lys(K)

极性的	Asn(N)	Gln(Q)
					疏水性的	Ile(I)	Leu(L)	Met(M)	Val(V)
芳香的	Phe(F)	Tyr(Y)	Trp(W)

因此，例如，利用上表中的分类，本发明增强的变体或其功能衍生物可以包含与前面组中描述的取代P276L相当的取代，如取代P276I、P276M或P276V。以上解释也适用于取代组合，另外，本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物可以包含在该组中未描述的其它突变，优选取代，特别是本领域中已知的一些取代。在具体实施方式中，增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物相对于野生型肌醇六磷酸酶，特别是相对于SEQ ID No.1包含最多40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个取代或1个取代。

术语″增强的变体″指相对于母体肌醇六磷酸酶具有增强的性质，特别是热稳定性和/或比活性和/或增强的表达的变体。另外，本发明增强的变体对蛋白酶或其它酶的蛋白水解可以具有较大的抗性。本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的一个或多个性质的增强是与在相同实验条件下测量的与母体肌醇六磷酸酶的性质相比至少5％，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或翻2、5、10或100倍。在优选的实施方式中，所述增强总计至少20％。肌醇六磷酸酶的热稳定性可以利用实施例5中详述的程序进行测量。肌醇六磷酸酶的比活性可以利用实施例4中详述的程序进行测量。肌醇六磷酸酶表达可以利用实施例2和3中详述的程序进行测量。

利用软件如swiss-model(http://www.expasy.ch/)和spdbv v4.01(GlaxoSmithKline)的3D可视化模型结构通常指假定的解释可以通过与酶的结构修饰比较而构建，该修饰引起活性和/或性质的改变，特别是邻近氨基酸之间可能的键。当采取预测的方法时，这种可视化还指某些残基可以被靶向用于诱变实验。作为例子，当期望增强的热稳定性时，靶向的残基可以是能够使二级结构变硬的那些残基。所述变硬可以不同的方式实现；作为例子，靶向的残基可被脯氨酸残基取代，常规地产生较少的旋转异构体并且因此使其所属的二级结构变硬。另外，二级结构的变硬可以通过产生新的氢键和新的盐桥而实现；3D可视化模型结构指可以与结构上接近的残基建立这种键的残基可以被靶向。当期望增强的热稳定性和/或活性时，除3D模型可视化外的方法是改变残基携带的电荷和随之发生的立体应力。已知在一些情况中酶的底物/产物参与稳定酶的3D构象并可提供增加的热稳定性。显然可视化这种3D模型结构指残基可被集中用于增强工业兴趣的酶的其它参数如，例如，活性、表达或抗蛋白水解性。也显然，这种通过可视化3D模型结构的方法是预测工具，允许构建诱变策略，而不以任何方式保证酶性质的任何增强。

术语″表达载体″指表达载体可以是任何类型的重组载体(特别是质粒、病毒等)，能够表达本发明增强的变体的核苷酸序列。该表达载体的选择取决于其与转化或转染的靶向表达宿主的相容性。所述载体可以是线性的或封闭环。它可自主地复制，即它可以是染色体外的实体——其复制独立于含有其的宿主的染色体、质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。相反，当被引入到宿主细胞时，所述载体可以整合到宿主的基因组中，与其同时进行复制。相等地，几种载体以及转座子可以是本发明增强的变体的表达所必需的并可以同时使用。

允许本发明增强的变体表达的载体可以含有一个或多个允许转化或转染的宿主细胞容易选择的标记物。所述选择标记物通常是基因，其产物给它们的宿主提供益处，例如，产生对抗生素的细菌抗性、营养缺陷型的原养型、对重金属的抗性等。细菌选择标记物的例子是提供抗生素特别是如氨苄西林、卡那霉素、四环素和氯霉素抗性的基因。适于在酵母中选择的标记物的具体例子是基因ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在丝状真菌中使用的标记物的具体例子是amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase))、hph(潮霉素磷酸酯转移酶)、niaD(硝酸酯还原酶)、pyrG(乳清苷(orotidin)-5′-磷酸酯脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)。允许本发明增强的变体表达的载体不一定含有选择标记物。

对于自主复制，载体必须含有适合宿主细胞的复制起点。细菌复制起点的具体例子是用于在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184以及用于在杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAM[β]的复制起点。酵母中复制起点的非穷尽性例子是2-微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。复制起点还可以含有导致它可以对温度敏感的突变。用于丝状真菌的复制起点的例子是来自构巢曲霉菌的AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-75；WO 00/24883)。

对于整合到宿主细胞的基因组中，载体必须通过同源或非同源重组利用本发明增强的变体的编码序列或载体中任何其它合适的序列使其进行整合。它还可以含有另外的核酸序列以指导其整合到宿主细胞的基因组中。为了最大化整合到宿主基因组中的机会，整合序列必须具有足够的长度，如100至10000个碱基对，优选400至10000个，更优选800至10000个碱基对。整合序列可以是编码的或非编码的。

存在于中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶基因(在NCBI中由编号NZ_AALF01000052和ZP_00832361表示)的5′端并且以成熟形式分裂的23密码子″信号″核苷酸序列促进所述酶在其来源的宿主中分泌。这一序列的存在是常规的并且是技术人员所熟知的。当在另一生物体中或在另一细胞区室中期望通过被选择来使期望生物体适合表达的质粒载体或其它载体表达考虑的基因时，改变该序列和用合适的序列替换它也是技术人员所熟知的策略。因此，所述序列可被其它基因的信号序列如特别是PelB、PhoA、OmpA或β-内酰胺酶的信号序列替换，用于它在原核宿主中的表达。在酵母如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达时，存在于中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶基因5′端的信号序列可以是分别来自该生物体磷酸酯酶和α因子基因的信号序列PHO1和α因子。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达时，可以使用相同的α因子信号序列。在解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lypolytica)中表达时，存在于中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶基因5′端的信号序列可以是XPR2信号序列，其来自所述生物体蛋白酶相同的XPR2基因。

术语″宿主细胞″指该细胞可以是原核或真核的；它可以是革兰阳性菌，如特别是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽胞杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、藓样芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)或Streptomyces murinusque，或革兰氏阴性菌如，例如大肠杆菌或假单胞菌属某种；该列举不是限制性的。本发明还提供在细菌优选大肠杆菌中生产可溶和有活性的肌醇六磷酸酶或其变体的方法，包括在细菌优选大肠杆菌中表达编码肌醇六磷酸酶或其变体的核酸，和任选地回收这样表达的肌醇六磷酸酶。

宿主细胞可以是来自特别是假丝酵母菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或子囊菌酵母属(Yarrowia)的酵母。宿主细胞可以优选是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母菌(Saccharomyceskluyveri)、Saccharomyces norbensis、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母或解脂耶氏酵母菌。

宿主细胞可以是来自以下属的丝状真菌：支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、鬼伞属(Coprinus)、云芝属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌(Neocallimastix)、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、白腐真菌(Phanerochaete)、射脉菌(Phlebia)、单鞭毛菌(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂折菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)。宿主细胞可以优选是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、海洋真菌(Caldariomyces fumago)、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、Fusarium negundi、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、Fusarium reticulatum、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、Fusarium sarcochroum、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulfureum、Fusarium torulosum、类拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、Fusarium venenatum、黑管菌(Bjerkandera adusta)、角孔拟蜡孔菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、绵毛状腐质菌(Humicola lanuginosa)、梅褐毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。

宿主细胞可以是哺乳动物细胞如COS7或CHO(US 4 889 803；US 5 047 335)。

术语″核酸″指DNA(cDNA或gDNA)、RNA或二者的混合物。核酸可以包括修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸包含例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的糖。它可以利用技术人员已知的任何方法，包括化学合成、重组、诱变等进行制备。

编码本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的核酸可以根据组成它的密码子进行优化以最大化其在不同于其来源生物体的特定宿主中表达。由于通用遗传密码是简并的，存在编码给定氨基酸的若干密码子(密码子＝核苷酸三联体)。这些同名密码子不被随机地使用，因为相应的tRNAs(转移RNA)不以相同的浓度存在于所有细胞中。这意味着某些密码子在相应tRNA稀少的组织中具有较少的机会被表达。技术人员熟知的这一事实当在不同于特定转基因来源生物体的给定宿主中实施表达时是要考虑的重要参数。在特定生物体中密码子的使用频率表已被公开并为技术人员所熟知。因此，编码本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的核酸可能必须被优化以促进它们在选定生产宿主中的表达。

本发明的语境中，两个核酸或氨基酸序列之间的术语″同一性百分比(percentageidentity)″或″同一性(identity)″指在最佳比对后获得的要比较的两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，所述百分比是纯统计的，并且两个序列之间的差异在它们的整个长度上随机分布。最佳比对或最优比对是如下面计算的要比较的两个序列之间同一性百分比最高的比对。两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较通常在以最优方式已对它们比对之后通过比较这些序列而进行，所述比较在比较区段或窗中进行，以鉴别和比较具有序列相似性的局部区域。除了手动对其进行实施外，可以利用Smith和Waterman(1981)局部同源性算法(Ad.App.Math.2：482)、利用Neddleman和Wunsch局部同源性算法(1970)(J.Mol.Biol.48：443)、利用Pearson和Lipman相似性查找方法(1988)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)或采用利用那些算法的软件程序(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，对序列进行最佳比对用于比较。两个核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比通过比较窗以最优方式比较这两个比对的序列而确定，在该比较窗中要比较的核酸或氨基酸序列区域与参考序列相比可以包括添加或缺失，用于那两个序列之间的最优比对。同一性百分比是通过测定两个序列的核苷酸或氨基酸残基相同的相同位置的数目，通过将该相同位置的数目除以比较窗中位置的总数以及通过将所获得的结果乘以100来进行计算，以获得那两个序列之间的同一性百分比。因此，保守氨基酸或与存在于本发明增强的肌醇六磷酸酶变体中的氨基酸相当的氨基酸可以在其它生物体的肌醇六磷酸酶中被识别。因此，由本发明增强的肌醇六磷酸酶变体中所选取代提供的增强可以通过在除本发明肌醇六磷酸酶来源的生物体外的生物体的肌醇六磷酸酶中实施相当的取代而被识别。显然，这种相当的取代落入本发明的范围。

本发明增强的肌醇六磷酸酶变体可以以纯化或部分纯化的形式在上述反应和方法中使用。本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的纯化可以是基本的，并且具体通过烧瓶或生产容器内含物的溶解和过滤和/或通过离心步骤，和/或通过使用硫酸铵的连续选择性沉淀和/或通过蒸发来实施。所述基本的程序可用于获得显示比活性大量增加的本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的部分。本发明增强的变体的纯化可以是完全的并需要技术人员熟知的多个步骤，特别是层析(离子交换、亲和性、疏水性、大小排阻)或电泳(制备型，利用等电浓缩)[Protein Purification，J.C.Janson and Lars Ryden，VCHPublishers，New York，1989]。

本发明增强的肌醇六磷酸酶变体纯化或部分纯化的部分可以以固定或非固定的形式在上述反应和方法中使用。在有机或无机支持体上固定本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的方法是技术人员所熟知的。这些支持体具体可以是聚丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素、葡聚糖凝胶或葡聚糖、多孔玻璃珠或氢氧化铝或钛。

术语″组合物″通常指包括至少一种增强的肌醇六磷酸酶变体的组合物，该变体的序列是SEQ ID No.1，具有本发明选定的一个或多个取代。它还提供包含一定百分比的至少一种本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的任何固体、液体或气体混合物。它还提供含有一、二、三、四、五或十种本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的混合物。

一般而言，含有肌醇六磷酸酶的组合物是液体或所谓的“干燥”组合物。

液体组合物不必含有除高度纯化的肌醇六磷酸酶外的任何物质。然而，可加入稳定剂如甘油、山梨醇或丙二醇。所述组合物还可以含有其它添加剂，如盐、糖、防腐剂、pH缓冲剂、蛋白质和肌醇六磷酸酯。通常，液体组合物是含水性组合物或油基悬浮液。在任选的制粒步骤之前或之后可以向食物中加入液体组合物。

所谓的″干燥″组合物可以是通过冷冻、喷雾而干燥的组合物，或者它们可以是挤压的干燥组合物；在这种情况下，所述组合物不必含有除干燥形式的酶之外的任何物质。干燥组合物还可以是颗粒，所述颗粒能够与食物组分混合或即将与食物组分混合，或即将形成预混合组分。酶颗粒的大小优选与混合物其它组分的大小一致。这代表向食物中掺入一种或多种酶的安全和实用方法。

作为例子，稳定的酶制剂可以通过将液体肌醇六磷酸酶混合物喷雾到组分如大豆粉上，然后干燥该组合物进行制备。含水量的减少和肌醇六磷酸酶与所述组分的结合作用保护所述酶免受外部环境因素如食物组分生产过程中使用的极端温度的影响。另外，以干燥形式提供肌醇六磷酸酶制剂可以通过降低潜在的蛋白水解酶的活性而改善其稳定性，所述蛋白水解酶在生产方法中的液体发酵步骤结束时以痕量存在。干燥肌醇六磷酸酶制剂可以例如在家禽和猪生产工业中用作食品补充剂。

从干燥酶制剂开始，利用技术人员熟知的附聚技术在混合器中制备颗粒，在该混合器中填料物质和所述酶被共附聚以形成颗粒。由可以其上吸附所述酶的基质或可以其上涂布一层酶的基质制备颗粒。可充当基质的典型物质是盐，如硫酸二钠(disodiumsulfate)。其它可能的基质可以基于滑石、粘土、硅酸镁、硅酸铝或纤维素纤维。任选地，结合剂如糊精可以包括在颗粒中。

可以包括下列组分的任何形式的夹带剂(entraining agent)：淀粉、木薯、马铃薯、大米、小麦、玉米等。还可加入盐。

任选地，颗粒可以涂有特别专用的混合物，特别是疏水性混合物，其基于棕榈坚果油、牛油以及如果必要的话其它添加剂如碳酸钙或粘土。

另外，肌醇六磷酸酶制剂可以含有其它试剂，如着色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质以及具有有利性质的其它酶或酶的混合物。这对于预混合物特别适合。

术语″食品添加剂″指实际上纯的组分或含有几种意欲加入到食品中的组分的组合物。具体地，所述添加剂意欲成为所述食品的完全意义上(fully-fledged)的组分并意欲影响、改变或提高所述食品的一种或多种性质。因此，用作食品添加剂的肌醇六磷酸酶制剂指这样的肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶不是添加的食品的天然组分或不以其天然浓度存在于该食品中，或与该食品的其它组分分开添加、单独或与其它食品添加剂一起添加。通常，食品添加剂含有几种组分，如维生素、矿物质、夹带剂、赋形剂、具有有利性质的其它酶或酶的混合物。

术语″作为准备使用的食品添加剂的肌醇六磷酸酶制剂(phytase preparation as afood additive ready for use)″或″作为准备使用食品添加剂的肌醇六磷酸酶(phytase asa ready to use food additive)″指不在食品或动物饲料中原位生产的食品添加剂。这样的肌醇六磷酸酶或制剂可以作为食品直接给予人类或动物，优选与所述食品的其它成分混合之后直接给予。作为例子，根据本发明该方面的食品添加剂与其它化合物组合以生产食品。这些其它化合物包括一种或多种其它的酶，优选热稳定的、含维生素的食品添加剂、矿物质食品添加剂或作为食品添加剂的氨基酸。该混合物或该化合物的组合的结果可以以适当的比例与其它组分如蛋白质或谷类补充物混合以形成最终食品。生产所述食品的方法可以利用技术人员熟知的任何设备如双重制粒机(doublegranulation machine)、蒸气制粒机、膨化器(expander)或挤压机进行。

本发明使用的术语″肌醇六磷酸酶制剂″或″肌醇六磷酸酶组合物″指含有显著量的至少一种本发明增强的肌醇六磷酸酶变体和一种或多种具有用于食品制备的有利性质的其它酶的组合物的制剂。这样的酶可以出现在以下非穷尽性的列举中：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，特别是乳糖酶、其它肌醇六磷酸酶、β-葡聚糖酶，特别是内切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖-内切1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-内切1，3-β-半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶，特别是内切-1，2-β-葡聚糖酶、内切-1，3-α-葡聚糖酶和内切-1，3-β-葡聚糖酶、降解果胶的酶，特别是果胶酶、果胶酯酶、胶质裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonases)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-乙酰基-酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果胶裂合酶、alpha-galacturonisidases、甘露聚糖酶、β甘露糖苷酶、甘露聚糖-乙酰基-酯酶、木聚糖-乙酰基-酯酶、朊酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶和脂解酶如脂肪酶、磷脂酶和角质酶。

根据本发明的动物饲料添加剂的补充可以在进餐前或与进餐同时进行。优选地，补充与进餐同时进行。

可以加入到食品中的肌醇六磷酸酶的有效量是大约10PPU/kg至20000PPU/kg食品；优选在10PPU/kg至15000PPU/kg的范围内；更优选在10PPU/kg至10000PPU/kg的范围内，特别是100PPU/kg至5000PPU/kg，尤其是100PPU/kg至2000PPU/kg食品。

本发明的范围还包括本发明增强的肌醇六磷酸酶变体在制备预期用于人类或动物消耗的食品中的用途。预期用于人类食品的谷物或面粉可以用肌醇六磷酸酶处理以降低它们的肌醇六磷酸酯含量，通过增加必要的矿物质如，例如铁、钙和锌的利用而使所述产品的营养价值增加。除了营养价值，用肌醇六磷酸酶的这种处理可以提高该食品的生产效率。作为例子，在大豆蛋白质提取过程中向白色大豆絮片中加入肌醇六磷酸酶可以提高提取的蛋白质的产量和质量。肌醇六磷酸酶在食品制备过程中有活性，但是在最终产品中没有活性。对于烘焙的物品，这在生产和烘焙面团时尤其如此。相似地，在动物饲料的生产中，在最终制备和/或调节之前，可以用肌醇六磷酸酶预处理大豆或油菜籽谷物。这样的预处理指降解抗营养成分如肌醇六磷酸酯和增加正在讨论的食品的营养价值。然后肌醇六磷酸酶可以任选地在摄入食物之后在动物的消化道中仍然有活性。

本发明的范围还包括本发明增强的肌醇六磷酸酶变体作为促进食物转化的试剂的用途。特别是，本发明肌醇六磷酸酶可以用作人类食品中的补充物以促进消化。作为例子，在进食之前个体可以摄入含有适量肌醇六磷酸酶的一个或多个片剂以使该个体的消化道有活性酶。当进食制备过程中无法用肌醇六磷酸酶处理的食物时，摄入肌醇六磷酸酶的益处是特别显著的。

本发明的肌醇六磷酸酶可以有利地用于单胃或多胃动物，特别是幼小的家畜。预期用于鱼和甲壳动物的饮食也可以用肌醇六磷酸酶处理以提高食物供应和动物生长之间的转化收率，也减少集约生产系统中排泄的磷酸酯的量。根据本发明处理的食物可以提供给家禽(火鸡、鸭、鹅、鹧鸪、母鸡、肉鸡(broiler))，提供给猪、马、牛、绵羊和山羊、狗或猫。特别应用于家禽和猪，包括但不限于母鸡、肉鸡、火鸡、鸭和鹅。

本发明的肌醇六磷酸酶用于生产具有有利性质的食物成分或食物的新型组合。作为例子，它可以用于生产无机磷酸酯含量降低的食物。该量作为添加的肌醇六磷酸酶的量和活性的函数进行调整，所述肌醇六磷酸酶存在于最终食物中或在形成最终食物组合物的部分的食物成分之一中有活性。优选地，这样的食物可以含有诸如微量营养物、维生素、氨基酸和有效和最佳量的肌醇六磷酸酶和无机磷酸酯的成分，以便肌醇六磷酸酶的量在每千克食物50至20000单位肌醇六磷酸酶范围内，以及无机磷酸酯的量小于0.45％。优选地，这两个量为每千克食物100至10000单位肌醇六磷酸酶范围和小于0.225％的无机磷酸酯；更优选为每千克食物150至10000单位肌醇六磷酸酶范围和小于0.15％的无机磷酸酯；仍然更优选为每千克食物250至20000单位肌醇六磷酸酶范围和不添加磷酸酯。这些新型组合具有很大的重要性，如减少磷酸酯排出到环境中和优化食物供应和动物生长之间的转化收率，这在集约型畜牧业中是广受欢迎的。

借助于附图和表，在以下的实施例中对本发明进行更详细的描述，所述实施例本质上绝不是限制性的：

·表1：利用THR^TM方法分离的突变体；

·表2：具有额外糖基化位点的突变体列表，作为它们各自的溶剂可及性百分比的函数进行分类；

·表3：允许额外二硫键加入的突变对的列表；

·表4：各个突变体的80％-20％活性消光系数(activity extinction coefficient)；

·表4A：突变体K210S、Y268E和Q292P的80％-20％活性消光系数；

·表4B：用于计算突变体K210S的80％-20％活性消光系数的数据细节；

·表4C：突变体T142N、A177T和Q326T的80％-20％活性消光系数；

·表4D：G274C/N316C突变体的80％-20％活性消光系数；

·表5：靶向增强的活性的突变体列表：

·表5A：靶向催化酶位点周围10埃或更小距离的位置列表；

·表5B：靶向在第一组实验中表征的活性增强的取代列表；

·图1：肌醇六磷酸酶对肌醇六磷酸酯的降解；

·图2：THR^TM技术的原理；

·图3：于80℃预加热0至2分钟之后，酿酒酵母产生的突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的残余活性的测量结果；

·图4：于45℃至65℃预加热15分钟之后，酿酒酵母产生的突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的残余活性的测量结果；

·图5：于60℃至80℃预加热1分钟之后，酿酒酵母产生的突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的残余活性的测量结果；

·图6A：于80℃预加热0至30分钟之后，毕赤酵母产生的突变体PHY-98-6X和PHY-98-6X-ss11的残余活性的测量结果；

·图6B：于80℃预加热0至5分钟之后，毕赤酵母产生的突变体PHY-98-6X和PHY-98-6X-ss11的残余活性的测量结果；

·图7：与酿酒酵母产生的来源酶PHY-98相比，突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的相对活性作为时间的函数的测量结果；

·图8：巴斯德毕赤酵母表达的各个突变体的生产上清液的12％SDS-PAGE凝胶，该突变体由内切糖苷酶Hf消化或不消化。

实施例：

实施例1：从中间耶尔森菌获得增强的肌醇六磷酸酶变体

质粒构建物：

生产本发明增强的肌醇六磷酸酶变体需要构建多种质粒载体，所述质粒载体能进行为获得变体或突变体文库以及所述突变体在各种筛选或生产宿主中表达所需的定向诱变实验。

pET25b中的构建物：

·利用技术人员熟知的分子生物学技术，将对应于序列NCBI ATCC 29909和对应于相应核苷酸序列NZ_AALF01000052，区域：1889…3214的ORF(开放阅读框)ZP_00832361克隆到质粒载体pET25b中。在克隆之前，原信号序列(前23个氨基酸)被从ORF删除并由大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列替换。该大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列已被克隆进载体pET25b以优化来自中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶在大肠杆菌中的表达。载体pET25b也可用来表达具有″6His标签″的融合蛋白形式的目标蛋白，促进利用技术人员熟知的方法对目标蛋白的分离和/或纯化。将含有与大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列融合的中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶的该载体在编码大肠杆菌内源性肌醇六磷酸酶的AppA基因已删除的BL21(DE3)大肠杆菌菌株中进行转化。

pNCK中的构建物：

·利用技术人员熟知的分子生物学技术将ZP_00832361的ORF克隆进载体pNCK。利用专利申请WO 2006/134240中描述的方法并对应于Biométhodes′THR^TM技术，该载体可用来在嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)中表达目标蛋白和热稳定卡那霉素抗性基因之间的融合蛋白。

pYES2中的构建物：

·利用技术人员熟知的分子生物学技术将ZP_00832361的ORF克隆进载体pYES2。在ORF ZP_00832361的5′位含有黑曲霉肌醇六磷酸酶信号肽的该载体允许酿酒酵母表达来自中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶。

pPIC9中的构建物：

·利用技术人员熟知的分子生物学技术将ZP_00832361的ORF克隆进载体pPIC9。在ORF ZP_00832361的5′位含有巴斯德毕赤酵母α因子信号肽(Invitrogen)的该载体允许巴斯德毕赤酵母表达来自中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶。

pNCK中突变体文库的构建、筛选和获得增强的变体：

利用US 7 202 086中或Saboulard等(Biotechniques，2005 Sep 39(3)：363-8)中描述的Biométhodes′Massive Mutagenesis

技术产生中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶突变体的几个文库。简言之，合成诱变寡核苷酸以在组成酶的每个氨基酸上产生肌醇六磷酸酶突变体。利用US 7 202 086中或Saboulard等(Biotechniques，2005 Sep 39(3)：363-8)中描述的Massive Mutagenesis

方案由含有肌醇六磷酸酶基因的载体pNCK构建突变体文库，然后在大肠杆菌菌株DH10B中进行转化和扩增。然后利用专利申请WO 2006/134240中描述的THR^TM技术筛选这些文库中含有的肌醇六磷酸酶突变体，其原理概括在图2中。在单个步骤中选择非常大量的突变体分子的系统所提供的概率意指能够进行高度多样的文库。利用Massive Mutagenesis

构建靶向蛋白质所有残基的这样的文库，大约10⁸个克隆。

简言之，将突变体文库在已呈现感受态的嗜热栖热菌的培养物中进行转化。使转化体于70℃在液体培养基中生长以产生预培养物，然后将该预培养物涂布到含有25μG/mL级严格浓度的卡那霉素的固体培养基上。于70℃温育48小时之后，只有具有抵抗选择温度并正确折叠的蛋白结构的突变体才允许热稳定性卡那霉素抗性基因的功能折叠，因此可以在卡那霉素存在的情况下生长。利用该方法，分离各种突变体，并分离和测序它们的质粒DNA。各种突变体揭示在表1中显示的89个位置共计138个取代。将各种取代物各自导入克隆进质粒载体pET25b的肌醇六磷酸酶，以便在大肠杆菌中表达和更详细地表征它们的活性和它们的热稳定性。实施例4详述了所使用的测量活性的方案，实施例5详述了将突变体残余活性作为温度的函数进行表征的方案。第一组实验能鉴定至少5个突变体，其相对于野生型酶具有增强的热稳定性。其中，3个突变体分别含有氨基酸K210、Y268和Q292上的取代，具体为取代K210S、Y268E和Q292P。这些突变体如表4A中所见具有分别为1.75、1.98和2.30的80％-20％残余活性消光系数。这些指数是通过使与野生型酶相比各种变体首先保留80％残余活性和其次保持20％残余活性的温度差异之间的比率而计算的。突变体K210S的该指数的计算细节显示在表4B中。

利用软件如swiss-model(http://www.expasy.ch/)和spdbv v4.01(GlaxoSmithKline)可视化3D模型结构使得关于上述3个突变体获得的热稳定性增加的某些解释能够被提出。K210可能是位于二级″片层″样结构中的溶剂可及的残基，这可能与键合和/或与底物(肌醇六磷酸酯)或源自反应的产物的相互作用相关。K210因此似乎是重要的残基，特别是由于其正电荷和其大的体积，这能产生关于底物接近活性位点或产物离开活性部点的立体和静电限制。K210S取代中该正电荷的丧失和相关空间限制的改变因此可以总体上干扰反应(底物接近+产物离开+活性位点腔的溶剂化(solvation))和改变其动力学常数，更具体地是反应期间产生的各种底物的表观Km。在一些情况下，已知底物/产物可以参与稳定蛋白质的3D结构和提供增加的热稳定性。可以想到，该取代可以例如通过增加活性位点中耐受的构象异构体的数目而促进底物的定位和/或也可以促进反应期间释放的磷酸酯排出，防止它们在活性位点腔中存在过多，该存在明显可以干扰酶-底物复合体和使整个结构不稳定。Y268可能是位于二级″环″型结构中的溶剂可及的残基。通过利用上述软件将Y268E取代建模，可以确定具有在结构上靠近残基(例如具有Q143残基的CO肽功能)的潜在氢键数目增加，也可以确定该取代可以产生额外的盐桥，特别是与K146。总体上，正在讨论的区域变得更硬，这可以解释观察到的热稳定性的增加。Q292也可能是位于二级″环″型结构中的溶剂可及的残基。脯氨酸残基的取代是在这种具有弱保守性二级结构中相对常规的工程化方法。这种残基产生很少的旋转异构体，因此使其所处的二级结构变硬，因而有时能够导致热稳定性增加，所述热稳定性增加因此可以引起取代Q292P。

具有额外糖基化位点的突变体的构建

某些翻译后修饰如糖基化已被描述为是蛋白质稳定剂。蛋白序列中的N-糖基化信号是NxT或NxS。利用上述受保护的Biométhodes Massive Mutagenesis

技术或利用技术人员熟知的诱变技术如重叠PCR，通过在相对于存在于中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶中的残基N的+2位置引入T残基或通过在相对于S或T残基的-2位置引入残基N，将这样的位点引入到克隆进载体pYES2的中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶中。利用在http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py？from＝ASA(T.J.Richmond，Solvent accessible surface area and excluded volume in proteins.J.Mol.Biol，178，63-89(1984)可获得的软件，将引入糖基化位点的位置作为它们的溶剂可及性百分比的函数(％ASA)进行分类。优选地，选择溶剂可及性百分比＞35％的22个残基取代。更优选地，选择溶剂可及性百分比＞70％的10个残基取代。将这些允许加入糖基化位点的不同变体构建物作为它们各自的溶剂可及性百分比的函数概括在表2中。

将突变体构建物在酿酒酵母中进行转化并且针对它们的活性和热稳定性对其进行更详细地表征。实施例5详述了将突变体的残余活性作为温度的函数进行表征的方案。第一组实验能鉴定几个具有额外糖基化位点的突变体，其与野生型酶相比具有增强的热稳定性。这些突变体含有溶剂可及性百分比＞70％所表征的氨基酸T142、A177和Q326上的取代。更具体地，所述氨基酸上的取代是T142N、A177T和Q326T。如表4C所示，这些突变体各自的80％-20％残余活性消光系数为1.62、1.62和1.52。这些指数是由使与野生型酶相比各种变体首先保留80％残余活性和其次保持20％残余活性的温度差异之间的比率而计算的。突变体K210S的该指数的计算细节显示在表4B中。

具有额外二硫键的突变体的构建

鉴定几个残基对与二硫键的形成匹配的距离和取向并用半胱氨酸残基进行替换。利用Swisspdb Viewer(GlaxoSmithKline)型程序通过pdb形式的肌醇六磷酸酶的可视化模型或同源结构来鉴定这些对，其考虑了残基之间的最优距离和其侧链的取向。利用该方法，选择位于大约2埃的12个残基对并将其列在表3中。

利用上述受保护的Biométhodes Massive Mutagenesis

技术或利用技术人员熟知的诱变技术如重叠PCR，将以上残基引入到克隆进载体pYES2的中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶。将突变体构建物在酿酒酵母中进行转化并且针对它们的活性和热稳定性对其进行更详细地表征。实施例5详述了将突变体的残余活性作为温度的函数进行表征的方案。第一组实验能够鉴定了一个具有额外二硫键位点且热稳定性提高的突变体。该突变体含有两个残基G274和N316上的取代，更具体地是取代G274C和N316C。如表4D所示，该突变体的80％-20％残余活性消光系数为2.33。该指数是通过使与野生型酶相比变体SS11首先保留80％残余活性和其次保持20％残余活性的温度差异之间的比率而计算的。突变体K210S的该指数的计算细节显示在表4B中。

靶向增强的活性的突变体的构建：

几个残基被靶向以鉴定具有增强的活性的突变体。利用Swisspdb Viewer(GlaxoSmithKline)型程序通过pdb形式的肌醇六磷酸酶的可视化模型或同源结构来鉴定这些残基。被选择的选择标准是：位于所述酶催化位点周围10埃或更小距离的残基。利用该方法，选择了76个位置并将其列在表5A中。利用上述受保护的Biométhodes Massive Mutagenesis技术或利用技术人员熟知的诱变技术如重叠PCR，将因使用寡核苷酸NNS的完全多样性在这些位置引入到克隆进pYES2载体的中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶。因此，对于表5A中列出的每个位置，构建分别包含来自20个现有氨基酸列表的19个可能取代之一的突变体；使用标准的的单字母代码，这20个氨基酸是：A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。将突变体构建物在酿酒酵母中进行转化并且针对它们的活性和热稳定性对其进行更详细地表征。实施例5详述了将突变体的残余活性作为温度的函数进行表征的方案。第一组实验使含有表5B中列出的取代的14个突变体得以表征。

增强的组合：

所采用的各种方法使得热稳定性和/或活性和/或蛋白水解抗性增加可以通过在以下每个方法中筛选和表征各个突变体而进行积累：THR^TM、加入糖基化位点、加入二硫键和靶向活性。第一组实验用于构建几个组合了热稳定性增强的突变体，所述热稳定性增强通过利用THR^TM、加入新糖基化位点和加入二硫键筛选文库而获得。利用上述受保护的Biométhodes Massive Mutagenesis

技术构建这些突变体。构建了几个突变体，其包含以下的取代组合：G274C+N316C、T142N+A177T+Q326T、K210S+Y268E+Q292P、D140F+Y268E+Q292P、F167N+Y268E+Q292P、T142N+A177T+K210S+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T+G274C+N316C。将突变体构建物在酿酒酵母中进行转化并且针对它们的活性和热稳定性对其进行更详细地表征。实施例5详述了将突变体的残余活性作为温度的函数进行表征的方案。图3至7显示了这些突变体其中一些的表征结果，具体是分别含有突变组合T142N+A177T+K210S+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T和T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T+G274C+N316C的突变体PHY-98-4X、PHY-98-6X和PHY-98-6X-SS 11，所述位置表示在SEQ ID No.1中。三个分别含有来源酶PHY-98和上述突变体PHY-98-6X和PHY-98-6X-SS11——如上所述克隆进质粒载体pYES2——的菌株，构成了在2009年6月24日各自编号CNCM I-4172、CNCM I-4173和CNCMI-4174下的生物材料保藏主题。这些各种突变体可以充当添加一个或多个源自各种选择方法的额外取代的基础并且显示一个/多个活性/热稳定性增强，以便产生新型突变组合，积累所述增强或证明由于这些新型突变组合而引起所述增强的协同效应。

实施例2：来自中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶的增强变体在酿酒酵母中的表达

将如上所述含有来自中间耶尔森菌的增强肌醇六磷酸酶变体的质粒pYES2通过电穿孔在酵母菌株酿酒酵母ΔPho4中转化并在SD-U固体培养基上选择转化体。将几个克隆在液体SD-U培养基中于30℃在振摇下预培养过夜。所述预培养物使更多培养物接种在2％YP半乳糖生产培养基中。将它们于30℃在振摇下生产过夜。

实施例3：来自中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶增强变体在巴斯德毕赤酵母中的表达

将如上所述含有来自中间耶尔森菌的增强肌醇六磷酸酶变体的质粒pPIC9在已呈现感受态的巴斯德毕赤酵母细胞中转化。在选择含有所述质粒的集落之后，将一个集落在50mL BMG培养基中于28℃振摇生长16小时以形成预培养物。通过利用在0.5％甲醇中不同的诱导时间来控制变体的生产，这取决于期望的所述变体的量。在诱导之前，在600nm处测量预培养物的光密度(OD)；对于诱导，需要2至6个OD单位的最优OD。然后将预培养物离心并且在1至30ODu/mL范围的初始OD下重悬浮于含有0.5％甲醇的BMM培养基中，所述初始OD取决于预想的诱导时间：对于96小时的诱导1ODu/mL，对于72小时的诱导6ODu/mL以及对于48小时的诱导30ODu/mL。每24小时添加100％甲醇，以得到0.5％的终浓度。这些生产程序被用于适合10mL至200mL体积的锥形瓶生产程序。

对于更大的体积，在适于2L至20L生产体积的5L至50L生物反应器中进行生产。使用的这种生物反应器(Applikon)可以通过规律地测量600nm处的光密度和氧气压力(pO₂)而自动监测酵母生长，优化具有甲醇的诱导条件的维持。根据在来自Invitrogen的巴斯德毕赤酵母中的发酵方案(″Pichia expression kit；a manual of methodsof expression of recombinant proteins in Pichia pastoris″·Version M dated 11 January2002)调整所使用的程序。图8显示了由内切糖苷酶Hf(New England Biolabs P0703)消化或不消化的巴斯德毕赤酵母表达的各种突变体生产上清液的12％SDS-PAGE凝胶。凝胶泳道指示Phy 98、PHY-98-6X和PHY-98-6X SS11对应于实施例1中描述的分子PHY-98、PHY-98-6X和PHY-98-6X-SS11的10μG生产上清液。突变体Phy98-6X-SS5是含有取代L52C+L99C+T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T的突变体。Phy98泳道显示了中间耶尔森菌野生型肌醇六磷酸酶的迁移分布，该酶未被糖基化，因为它不具有潜在的N-糖基化位点NxS/T；这通过用内切糖苷酶Hf消化后不存在迁移差异来说明。不存在内切糖苷酶Hf消化的泳道PHY-98-6X、PHY-98-6X SS5和PHY-98-6X SS11由于突变体的各自糖基化而显示具有高分子量的突变肌醇六磷酸酶的迁移分布。用内切糖苷酶Hf消化之后(″Endo Hf消化的″指示的泳道)，通过各种突变体的迁移分布恢复到野生型肌醇六磷酸酶的迁移分布而显示该糖基化，即使内切糖苷酶的消化在一些情况下可以是不完全的。

实施例4：来自中间耶尔森菌的增强肌醇六磷酸酶变体的活性测量

在用作底物的肌醇六磷酸酯溶液存在的情况下，利用测量所释放的磷酸酯的比色试验来测量中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶变体的活性以及用作对照的来源蛋白的活性。简言之，将40μL测试样品上清液(在醋酸钠缓冲液中稀释或未稀释)或40μL磷酸酯校准溶液与40μL肌醇六磷酸酯(20g/L)混合。将反应在37℃常规温育15分钟。用80μL 0.5M NaOH或20％TCA终止反应。转移160μL反应总体积中的60μL以用60μL Fe-Mo溶液显示。在用分光光度计于620nm处读数之前将显示反应(revealingreaction)置于黑暗处15分钟。利用WFI无磷酸酯水产生所有反应溶液。反应缓冲液是0.25M pH 4.5的醋酸钠缓冲液。使用的底物是在上面的反应缓冲液中由200g/L储备溶液(stock solution)产生的肌醇六磷酸酯溶液。利用与1体积Fe溶液混合的4体积Mo溶液即时形成显示溶液。Mo溶液是0.012M钼酸酯溶液，Fe溶液是0.38M铁II溶液。

为了计算活性，用范围0至10μmol/mL的KH₂PO₄产生磷酸酯校准曲线。通过利用上面描述的反应条件，应用以下公式计算测试样品的肌醇六磷酸酶活性：以U/mL计的肌醇六磷酸酶活性＝[(OD 620nm)×(稀释因子)]/[(校准曲线的斜率)×(以分钟计的反应时间)]。

利用技术人员熟悉的常规Bradford方法计算蛋白浓度。

图7显示了与酿酒酵母中起源酶PHY-98相比，突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的作为时间(0至15分钟)函数的相对活性更高。

实施例5：中间耶尔森菌的增强的肌醇六磷酸酶变体的热稳定性的鉴定

从中间耶尔森菌肌醇六磷酸酶分离的变体的热稳定性通过在预加热到恒定温度不同时间之后或在不同温度下固定的预加热时间之后测量生产变体的各种上清液的残余活性而测定。在第一个选择方案中，将变体预加热到80℃，持续0至30分钟时间。在第二个选择方案中，在预加热到45℃至65℃的温度15分钟之后，或在预加热到60℃至80℃的温度1分钟之后，测量两种类型的残余变体活性。在第一个选择方案中残余活性被测定为没有预加热的相同样品的％活性，或在第二个选择方案中残余活性被测定为预加热到第一测量温度的相同样品的％活性，这两个参考活性被认为100％点。在图4中，残余活性被显示为预加热15分钟之后在600nm处光密度的原始值。

图3、4和5显示了与来源酶PHY-98相比酿酒酵母表达的变体PHY-98-4X和PHY-98-6X获得的结果。图3显示了与来源酶PHY-98相比在80℃预加热0至2分钟之后两个突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的较高残余活性。图4显示了在从45℃至65℃变化的温度预加热15分钟之后两个突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的高残余活性。图5显示了在60℃以上利用1分钟的预加热，两个突变体PHY-98-4X和PHY-98-6X的高残余活性。

图6a)和6b)显示了在80℃分别预加热0至30分钟和0至5分钟的时间之后巴斯德毕赤酵母表达的突变体PHY-98-6X和PHY-98-6X-SS11的高残余活性。

实施例6：突变体在制粒试验中的热稳定性

可以进行制粒试验以测定各种突变体相对于野生型和现有和/或商业可获得的酶的热稳定性。各种肌醇六磷酸酶可被掺入到形成和配制欲加入到例如动物饲料中的颗粒的方法中。

这些颗粒可以通过在相同条件下混合/捏和必须比较的突变体和参考酶的生产上清液——例如由玉米淀粉和水组成的基质——而形成，。制粒基质可以含有不同的相对肌醇六磷酸酶/玉米/水百分比。常规地，在捏和之后，可以用与NICA^TM E-220型相似的挤压机将基质挤出并且利用NICA^TM或Fuji Paudal^TM QJ-400G型滚圆机(spheronizer)将基质直接滚圆。然后将获得的颗粒在Glatt GPCG 1.1型流化床干燥器中干燥。颗粒中的肌醇六磷酸酶活性一般在2500至3000FTU/g范围内。

可以将形成的颗粒与食物混合。取决于试验的体积，形成的食物的量可以变化。作为例子，可以将250g颗粒与25kg食物混合以形成预混合物。就在试验之前，可以将该预混合物掺入到225kg例如具有相同组成的食物中。在非限制性方式中，通常的家禽饲料可以由45％至50％玉米、0至5％豌豆、0至4.5％油菜粉、0至4.5％向日葵籽粉、0至2.5％玉米粉麸质、6％至10％全大豆、大约25％豆渣、大约4％木薯粉、1％至3.5％豆油、0至4％动物脂肪、0.5％至1％维生素混合物(Mervit 100)、大约1％粉状白垩、0.2％至1.3％磷酸二氢钙、0.1％至0.4％盐、0至0.3％碳酸氢钠(NaHCO₃)、0.05％至0.3％L-赖氨酸、0.15％至0.25％DL-甲硫氨酸和0至0.05％L-苏氨酸组成。通常可以将大约25kg预混合物在Collete MP90型行星式混合器中混合10分钟。可以将225kg级的混合物在Nauta型1200升混合器中混合。在该阶段获取该混合物的样品，以在形成最终颗粒之前测定突变体和参考肌醇六磷酸酶的活性和稳定性。通常利用定量给料螺杆(dosing screw)以大约600kg/小时的速度将250kg级的混合物定量给料到混合器/调节器中，其中通过注入大约95℃的蒸气对其进行加热。总停留时间是大约10至30秒，在这之后将热混合物引入到制粒压力机(granulating press)。为了测试，可以生产的颗粒大小是型号5/45mm(宽度/长度)或3/65mm。对于第一种类型的颗粒，在压力机出口的颗粒温度通常是82℃至83℃，而对于第二种类型的颗粒是91℃至93℃。在该步骤之后，将颗粒在冷却垫上冷却，从其中获取样品以测定最终颗粒形成后突变体和参考肌醇六磷酸酶的活性和稳定性。因此，通过产生在制粒步骤之后和之前的活性报告，可以获得与参考酶相比每个突变体在活性方面的制粒收率。实施例4中给出了测量肌醇六磷酸酶活性的方案。另外，适于这些方法的测量肌醇六磷酸酶活性的标准方案已被以下参考文献公开：van.Engelen等，Journal of AOACInternational 1994，77：760-764。

实施例7：在动物饲料试验中的测试

几种方法可以用来测量与参考肌醇六磷酸酶相比本发明突变体在体内从肌醇六磷酸酯释放磷酸酯以便促进动物生长的有效性。

多种动物如猪可被整合到充分确立的方案中。它们可以自由获取水和例如由67％玉米、28％大豆粉、1％粉状白垩、0.1％L-赖氨酸、1％玉米油、0.25％常规维生素混合物、0.5％盐、0.5％抗生素组成的典型饮食。每天收集饲料废物。每周测量动物的体重增长以计算每天的平均增长、平均每天食物摄取和增长/摄取比率。具有特别优势和最佳性能的突变体通常是增长/摄取比率增加的那些突变体。

另外，存在可以模拟单胃动物消化道中消化的体外模型。作为例子，向由30％大豆粉和70％玉米粉组成的饲料样品添加每千克饲料5g量的磷酸钙，并于40℃、pH 3下预温育30分钟，然后加入每克饲料3000U量的胃蛋白酶和每克饲料0(空白对照)至1U肌醇六磷酸酶范围的多种剂量的肌醇六磷酸酶。可以测试各种肌醇六磷酸酶突变体并与参考肌醇六磷酸酶进行比较。将各种样品在40℃，最初在pH 3下温育60分钟，然后在pH 4下温育30分钟。然后终止反应并通过如下提取肌醇六磷酸酯和肌醇磷酸酯：加入最终浓度0.5M的盐酸，于40℃温育2小时，然后冻融循环和在40℃温育1小时。

通过如Q.C.Chen和B.W.Li(2003)，Journal of Chromatography A 1018，41-52以及E.Skoglund，N.G.Carlson和A.S.Sandberg(1997)，J.Agric.Food Chem.45，431-436所述的高效离子交换层析分离肌醇六磷酸酯和肌醇磷酸酯。由结合到用肌醇六磷酸酶处理的样品与没用肌醇六磷酸酶处理的样品中肌醇磷酸酯的磷酸酯之间的差异来计算释放的磷酸酯。目标突变体释放较大量的磷酸酯。

生物材料保藏：

根据布达佩斯条约，将以上实施例中使用的三个含有构建物PHY-98、PHY-98-6X和PHY-98-6X-SS11的菌株保藏于the Institut Pasteur，25，Rue du Docteur Roux，75724的法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM))：

保藏菌株的鉴定编号	保藏日期	接收的生物材料的登录号
			PHY-98	2009年6月24日	CNCM I-4172
PHY-98-6X	2009年6月24日	CNCM I-4173
			PHY-98-6X-SS11	2009年6月24日	CNCM I-4174

引用的文献

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表1

P3L	P3V	V4G	A5P	P8N	P8V
						T9I	T9Q	T9S	T9Y	G10A	G10P
V16M	V17W	L19G	S20C	R21F	H22A
						H22S	H22Y	G23S	R25C	P27F	T28N
T28S	T28V	Q30R	Q32R	L33R	T41G
						G50D	G50E	V60I	Y67F	Y67W	G75R
A78P	D92R	D94G	D94S	Q95V	R96A
						T97N	V125N	D126Q	H130N	H130Q	H130R
H130W	P131S	V132W	D133G	D133P	D133R
						D133V	D133W	D140E	D140F	L152N	L152P
L156N	F167N	C182N	F197V	K206A	T209C
						K210C	K210E	K210S	K210T	K210V	K210Y
V211C	V211G	L217N	L223S	E225D	F227S
						L229H	Q230T	N231K	A234K	P236N	S251N
L252M	H256A	H256E	H256P	N257I	Q259K
						Q259Y	D261F	A264P	Y268N	Y268E	K273N
G274S	P276L	Q292P	P297S	Q301L	H310R
						D311A	D311E	D311G	T312D	T312N	T312P
T312V	N313F	N313R	I314E	I314M	A323E
						P331R	D332A	D332L	D332Q	N333V	P335C
P335G	P335R	P335S	V341A	V341E	E343A
						E343G	D349N	R353C	Y354N	V355W	A370D
A370T	K376S	P379L	G381S	S393G	P414Q

表2

表3

SER20-GLY339
	VAL24-GLY56
SER26-TRP45
	GLN30-MET34
LEU52-LEU99
	THR53-GLY56
ALA57-ALA103
	GLY101-VAL116
ALA147-TYR268
	ASP193-ASN196
GLY274-ASN316
	GLY322-ASP388

表4

表4A

突变体	K210S	Y268E	Q292P
				80％-20％活性消光系数	1.75	1.98	2.3

表4B

	野生型	K210S
			T，℃80％	50.77	50.51
T，℃20％	53.44	55.17
			Δ80％-20％	2.67	4.66
R(K210S/WT)		1.74531835

表4C

突变体	T142N	A177T	Q326T
				80％-20％活性消光系数	1.62	1.62	1.52

表4D

突变体	G274C/N316C(SS11)
		80％-20％活性消光系数	2.33

表5

表5A

表5B

Claims (15)

1.具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代：P3、V4、A5、P8、T9、G10、V16、V17、L19、S20、R21、H22、G23、V24、R25、S26、P27、T28、K29、Q30、T31、Q32、L33、M34、D36、P39、K41、W45、A49、G50、Y51、L52、T53、G56、A57、V60、Y67、G75、A78、C81、D92、V93、D94、Q95、R96、T97、R98、L99、T100、G101、A103、V116、V125、D126、F129、H130、P131、V132、D133、D140、T142、Q143+H145、A147、L152、P155、L156、E158、E158+S160、F167、A177、C182、G189、D193、N196、F197、K201、K206、P207、T209、K210、V211、S212、L213、L217、A218、L219、S220、S221、T222、L223、G224、E225、I226、F227、L228、L229、Q230、N231、Q233、A234、P236、R242、I250、S251、L252、L253、L255、H256、N257、Q259、F260、D261、M263、A264、Y268、K273、G274、P276、L277、Q292、G293、P297、P300、Q301、G308、G309、H310、D311、T312、N313、I314、A315、N316、G322、A323、Q326、P331、D332、N333、T334、P335、P336、G337、G338、G339、V341、E343、D349、Q352、R353、Y354、I355、A370、E371、K376、P379、A380、G381、D388、E391、S393、G394和P414，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

2.根据权利要求1的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括至少一个选自以下的取代：P3L、P3V、V4G、A5P、P8N、P8V、T9I、T9Q、T9S、T9Y、G10A、G10P、V16M、V17W、L19G、S20C、R21F、H22A、H22S、H22Y、G23S、V24C、R25C、S26C、P27F、T28N、T28S、T28V、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、Y67W、G75R、A78P、C81N、D92R、V93G、D94G、D94S、Q95N、Q95V、R96A、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、V116C、V125N、D126Q、F129W、H130N、H130Q、H130R、H130W、H130Y、P131S、V132W、D133G、D133P、D133R、D133V、D133W、D140E、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、T209C、K210C、K210E、K210N、K210S、K210T、K210V、K210Y、V211C、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、E225D、F227S、L229H、Q230N、Q230T、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、H256A、H256E、H256P、N257I、Q259K、Q259S、Q259T、Q259Y、D261F、M263L、A264N、A264P、Y268C、Y268E、Y268N、K273N、G274C、G274S、P276L、Q292P、G293N、P297N、P297S、P300N、Q301L、G308S、H310N、H310R、D311A、D311E、D311G、T312D、T312N、T312P、T312V、N313F、N313R、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、N333V、P335C、P335G、P335R、P335S、P335T、G339C、V341A、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、R353C、Y354N、I355W、A370D、A370T、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T和P414Q，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

3.根据权利要求2的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括至少一个选自以下的取代：P8N、P8V、T9I、T9S、G10A、G10P、V16M、V17W、S20C、G23S、V24C、S26C、P27F、T28N、T28S、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、G75R、A78P、C81N、V93G、Q95N、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、V116C、F129W、H130N、H130Q、H130R、H130Y、P131S、V132W、D133G、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177S+Q326S、A177S+Q326T、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、K210N、K210S、K210T、K210Y、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、L229H、Q230N、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、H256E、N257I、Q259S、Q259T、M263L、A264N、A264P、Y268C、Y268E、Y268N、G274C、Q292P、G293N、P297N、P297S、P300N、Q301L、G308S、H310N、T312D、T312N、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、P335C、P335S、P335T、G339C、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、A370D、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T和P414Q，所述位置表示在SEQ IDNo.1中。

4.根据权利要求1的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代：K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349和E391，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

5.根据权利要求4的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于在氨基酸K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、D140N、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349和E391上的取代选自K29N、Q30D、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、G75R、C81N、V93G、Q95N、R98T、L99C、F129W、H130Y、D140F、D140N、T142N、P155N、P155T、F167N、A177N、A177S、A177T、G189N、K201N、K210N、K210S、L219V、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、M263L、Y268E、Y268N、G274C、Q292P、G293N、P297N、G308S、N316C、Q326S、Q326T、D349S、D349T和E391N，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

6.根据权利要求1至5中任一项的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括选自以下的取代组合：G274C+N316C、T142N+A177T+Q326T、K210S+Y268E+Q292P、D140F+Y268E+Q292P、F167N+Y268E+Q292P、T142N+A177T+K210S+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T+G274C+N316C和L52C+L99C+T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

7.根据权利要求1至6中任一项的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括由T142N+A177T+K210S+Y268E+G274C+Q292P+N316C+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

8.根据权利要求1至7中任一项的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括由T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No.1中。

9.根据权利要求1至8中任一项的具有序列SEQ ID No.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它的序列是具有所选一个或多个取代的SEQ ID No.1。

10.编码根据权利要求1至9中任一项的增强肌醇六磷酸酶变体的核酸。

11.根据权利要求10的核酸的表达盒或表达载体。

12.宿主细胞，其包含根据权利要求10的核酸或根据权利要求11的表达载体。

13.组合物，其包含具有所选一个或多个取代的根据权利要求1至9中任一项具有序列SEQ ID No.1的至少一个增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物。

14.具有所选一个或多个取代的根据权利要求1至9中任一项具有序列SEQ IDNo.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物用于制备食品添加剂的用途。

15.根据权利要求10的核酸、根据权利要求11的表达盒或根据权利要求12的细胞生产具有所选一个或多个取代的根据权利要求1至9中任一项具有序列SEQ IDNo.1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的用途。

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