CN102906254A - 热稳定性肌醇六磷酸酶变体 - Google Patents

热稳定性肌醇六磷酸酶变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，所述肌醇六磷酸酶变体与来源于布氏柠檬酸杆菌的肌醇六磷酸酶具有至少74%同一性并与该肌醇六磷酸酶相比包含至少两个其它的二硫键。这些肌醇六磷酸酶变体具有修饰的，优选改善的性质，如热稳定性、温度概貌、pH概貌、比活性、在动物饲料中的性能、减少的蛋白酶敏感性和/或修饰的糖基化样式。本发明亦涉及产生的变体，编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，其产生方法，及其例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。

Description

热稳定性肌醇六磷酸酶变体
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，其与来源于布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)ATCC 51113的肌醇六磷酸酶具有至少74%同一性，并与这个及紧密相关的肌醇六磷酸酶相比包含至少一个二硫桥联的建立(即，为其变体)，所述桥联不属于四个天然存在的二硫桥联。本发明还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，产生的变体，及其用途，例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶的成熟部分作为SEQ ID NO:2包括在序列表中。
发明背景
背景技术
肌醇六磷酸酶是公知的酶，将其添加至动物包括人类的食料中的优点也是公知的。已从多种来源，包括多种真菌和细菌菌株分离出肌醇六磷酸酶。
本发明的一个目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的替代性多肽(肌醇六磷酸酶)和编码所述多肽的多核苷酸。本发明的肌醇六磷酸酶变体与亲本肌醇六磷酸酶相比呈现修饰的或改变的，优选改善的性质。此类性质的非限定性实例为：稳定性(如酸稳定性，热稳定性，蒸汽稳定性，造粒稳定性和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)，温度概貌(profile)，pH概貌，比活性，底物特异性，在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)，对糖化作用(glycation)的易感性，和/或糖基化样式。
如本文中所述，采用编码肌醇六磷酸酶的亲本多核苷酸的诱变以制备编码相对于由亲本多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶具有改善的性质的肌醇六磷酸酶的变体(合成)DNA。
已知多种组氨酸磷酸(HAP)类型的肌醇六磷酸酶的三维结构(例如Lim等Nature struct.biol.7,108-113(2000))。由此发现，其均具有位于位置对77/108133/407178/187381/390(根据本文中使用的编号)的四个二硫桥联。通常这些桥联占用了分子中存在的所有半胱氨酸。
柠檬酸杆菌属(Citrobacter)
来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的菌株的phyA基因的序列已由Zinin等以登录号AY390262提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库。相应的肌醇六磷酸酶氨基酸序列以登录号Q676V7见于UniProt/TrEMBL数据库。Q676V7预期的成熟部分作为SEQ ID NO:4包括在本发明序列表中。弗氏柠檬酸杆菌Q676V7肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。
WO-2004/085638(Republic of National Fisheries Research and DevelopmentInstitute of Korea)以SEQ ID NO:7公开了来自作为KCCM 10427保藏的布氏柠檬酸杆菌YH-15的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。该氨基酸序列的成熟部分作为SEQ ID NO:3包括在本文中。该序列亦见于数据库Geneseqp，登录号为ADU50737。布氏柠檬酸杆菌YH-15肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。
WO 2006/037328(Novozymes A/S)公开了布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113的野生型肌醇六磷酸酶(即本文中的SEQ ID NO:2)以及其变体，该变体亦包括在本发明序列表中，即作为SEQ ID NO:6。布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。
WO 2006/038062和WO 2006/038128(Danisco A/S)均公开了以登录号NCIMB 41247保藏的弗氏柠檬酸杆菌P3-42的肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列，及其多种变体。该氨基酸序列作为SEQ ID NO:9包括在本文中。这些申请仅公开了一个在位置233用半胱氨酸的取代(S233C)，根据本文中使用的编号，这应为S211C。弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。WO 2006/038062和WO 2006/038128的文本看起来是相同的。
WO 2007/112739(Novozymes A/S)公开了多种肌醇六磷酸酶变体，其中示例使用布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶作为亲本。WO 2007/112739表明了二硫桥联的构建等。
附图和序列表简述
图1是SEQ ID NO:2和9的肌醇六磷酸酶的比对。
序列表中序列如下所示：
Figure GDA00002464555900031
实施例概述
在本说明书中提供了下述实施例：
实施例1：变体的制备和活性的确定
实施例2：比活性
实施例3：就温度稳定性进行筛选
实施例4：通过DSC测量热稳定性
实施例5：温度概貌
实施例6：pH概貌
实施例7：蒸汽稳定性
实施例8：造粒稳定性测试
实施例9：在烤用鸡体外模型中在动物饲料中的性能
实施例10：在猪体内试验中的性能
实施例11：计算同一性百分比和鉴定对应位置
发明内容
本发明涉及产生变体肌醇六磷酸酶的方法，所述变体肌醇六磷酸酶与SEQ ID NO:2具有至少74%同一性，并与SEQ ID NO:2相比包含至少两个二硫桥联的建立，其中所述两个二硫桥联不属于在如SEQ ID NO:2中规定的编号的位置77/108，133/407，178/187和381/390的四个天然存在的二硫桥联。
同一性百分比如段落“肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比”中所述确定。
位置编号指SEQ ID NO:2中的位置编号，如段落“位置编号”中所述。在其它肌醇六磷酸酶中，对应于这些SEQ ID NO:2位置编号的位置是通过如段落“鉴定相应的位置编号”中所述确定的。
所述至少两个二硫桥联在选自下组位置对的位置建立：A)52/99；B)31/177；C)46/91；D)141/199；E)31/176；F)59/100；和G)162/247。
优选第一二硫桥联在位置52和99的残基之间的位置对A建立，而第二二硫桥联在位置31和177的残基之间的位置B建立。
本发明的方法涉及肌醇六磷酸酶变体，其中建立的二硫桥联的数量是2，3，4，5，6，和/或7。
当建立的二硫桥联的数量是二时，可构建下述位置对的组合：A+B，A+C，A+D，A+E，A+F，A+G，B+C，B+D，B+E，B+F，B+G，C+D，C+E，C+F，C+G，D+E，D+F，D+G，E+F，E+G，和F+G，其中A意指52/99；B意指31/177；C意指46/91；D意指141/199；E意指31/176，F意指59/100；和G意指162/247。
若建立的二硫桥联的数量是三，可构建下述位置对的组合：A+B+C，A+B+D，A+B+E，A+B+F，A+B+G，A+C+D，A+C+E，A+C+F，A+C+G，A+D+E，A+D+F，A+D+G，A+E+F，A+E+G，A+F+G，B+C+D，B+C+E，B+C+F，B+C+G，B+D+E，B+D+F，B+D+G，B+E+F，B+E+G，B+F+G，C+D+E，C+D+F，C+D+G，C+E+F，C+E+G，C+F+G，D+E+F，D+E+G，D+F+G，和E+F+G。
亦可预见下述位置对的组合：A+B+C+D，A+B+C+E，A+B+C+F，A+B+C+G，A+B+D+E，A+B+D+F，A+B+D+G，A+B+E+F，A+B+E+G，A+B+F+G，A+C+D+E，A+C+D+F，A+C+D+G，A+C+E+F，A+C+E+G，A+C+E+H，A+C+F+G，A+D+E+F，A+D+E+G，A+D+F+G，A+E+F+G，B+C+D+E，B+C+D+F，B+C+D+G，B+C+E+F，B+C+E+G，B+C+F+G，B+D+E+F，B+D+E+G，B+D+F+G，B+E+F+G，C+D+E+F，C+D+E+G，C+D+F+G，C+E+F+G，C+E+F+H，和D+E+F+G用于建立四个二硫桥联。
当建立的二硫桥联的数量是五时，组合选自下列位置对：A+B+C+D+E，A+B+C+D+F，A+B+C+D+G，A+B+C+E+F，A+B+C+E+G，A+B+C+F+G，A+B+D+E+F，A+B+D+E+G，A+B+D+F+G，A+B+E+F+G，A+B+F+G+H，A+C+D+E+F，A+C+D+E+G，A+C+D+F+G，A+C+E+F+G，A+D+E+F+G，B+C+D+E+F，B+C+D+E+G，B+C+D+F+G，B+C+E+F+G，B+D+E+F+G，和C+D+E+F+G。
若建立的二硫桥联的数量是六，组合选自下列位置对：A+B+C+D+E+F，A+B+C+D+E+G，A+B+C+D+F+G，A+B+C+E+F+G，A+B+D+E+F+G，A+C+D+E+F+G，和B+C+D+E+F+G。
最后，对于建立七个二硫桥联，可使用下述组合：A+B+C+D+E+F+G。
在所有上述组合中，A意指52/99；B意指31/177；C意指46/91；D意指141/199；E意指31/176，F意指59/100；和G意指162/247
根据本发明的方法，肌醇六磷酸酶变体可进一步在选自下组的至少一个位置包含至少一个修饰：1，2，3，4，5，6，24，31，35，41，45，46，52，53，55，56，57，59，60，64，66，73，74，75，76，79，80，81，82，83，84，87，90，91，94，100，104，105，106，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，129，130，132，134，136，137，138，139，142，146，148，154，155，157，161，162，164，167，171，173，175，176，177，179，180，181，182，183，184，185，186，188，190，193，196，200，202，203，205，207，211，213，215，217，218，223，231，239，240，241，247，252，254，257，266，273，276，279，280，281，282，283，284，285，286，289，294，299，300，308，314，316，321，324，330，331，336，338，339，340，344，345，348，351，355，361，362，363，364，369，371，372，373，375，379，385，386，392，406，409，410，和411。
本发明进一步规定，上述修饰具体选自下组：1*，1H,K,R,Q，2D，2*，3*，4P，5P，6L，24R,E，31T,K,N，35Y，41P，45R，46D,E，52E,R 53V，Q,K，53V 55D,I，56T，57Y，V，60P，H,K,R，66Y，73D,P，74P，S,Y，A，75T，76G，P，79F，80L，81E，82E，83I，84Y，87T，90V，Y，91P，100Y，104I,A，105F,E，106A,G，107D,E,G，109A,G，111P，114H,N,T，115Q，116A,E,P，T，Q，117D,E,K，118V，I,L,M,T，119G，K,R,S，120K,S,T，Q,R 121A,D,M,P，T，V 121I，122D，123P，S，124L,T，V，N126D，K129G 129I,R,P，Q，130K,V，132I，134T 136P，137P，138F，139N，142D，146D，148T 154P，Q,V 155F，157F，161P，164D,E，167Q，171T，173P，T 175L，177I 179G，I,K,N,Q，180A,E,G，T，181D,G，I,K,L,S,W182G，N,R,V，H,K,S,Q，183RA,L,P，S,V，Q，184RT，184*，185A,S，185*，186*，188P，193F，196Q，200K,R，202N,H，203D,E,T,L，205P，207G，S，211C，213A，215M，218Q，223E，231P，239Q，240P，241Q，252H,L，254Y，257E，266M，273L,Q，276K,R，279S，280P，281H，282P，283P，284P，285G，N,R，E285Y，286D,T，K,Q，289P，294T，299L，300V，308A，314G，N，316D，321A，324N，330D，331K，336R，338N，339D，340A,I，343D，344S，345N，348H，351Y，355P，361V，362K,R，I362F，I362L，362M，363R，364Q，369N，371P，373T，375N，379K,R，385D 386I，392I，406A，409D,E，410D,E，和/或411R,K。
在进一步的实施方案中，此外，在位置179，180，181，182，183，184，185，和186的八个氨基酸由QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV，或KTDKL替代。
根据本发明，具有其它二硫桥联的变体可进一步包含至少一个选自下组的修饰：1*，1*/2*，1*/2*/3*，1K，4P，5P，46E，52E，53V，57Y，76G，82E，107D，107E，107G，109A，111P，119R，119K，121T，121D，137P，161P，164E，167Q，196Q，200K，202N，218Q，223E，241Q，273L，276R，276K，285G，285N，286Q，299L，314N，314G，362R，362K，379R，379K，385D，406A，410D，410E，411R，411K，或选自下组的组合：55D/331K，111P/241Q，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L，和114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L
在本发明的具体实施方案中，其它二硫桥联选自下组：G52C/A99C，N31C/T177C，W46C/Q91C，K141C/V199C，N31C/E176C，G59C/F100C，和/或S162C/S247C。
在本发明的方法进一步的具体实施方案中，进一步具体的修饰为E1K，E1Q，E2D，M6L，K24E，K24R，D31K，D31N，D35Y，G45R，G52R，E53K，E53V，V55I，S56T，E57V，Q60H，Q60K，Q60R，F66Y，N73D，N73P，N74P，N74S，N74Y，Q75T，T76G，T76P，S79F，P80L，G81E，V83I，A87T，D90V，D90Y，F100Y，L104I，Y114N，E118V，K120R，T121I，T121P，N126D，K129G，M130K，M130V，T132I，S134T，L138F，K139N，N142D，E146D，A148T，L154Q，L154V，Y155F，S173T，T177I，T181I，T181L，T181S，T181W，E182A，E182G，E182H，E182I，E182N，E182R，E182V，K183P，K183R，S184R，S184T，T185A，T185S，L193F，D202H，N203D，N203E，P207S，S211C，S213A，Q252H，Q252L，Q257E，R266M，L279S，E285Y，N286D，N286T，A300V，G321A，K336R，K338N，T340A，T340I，N343D，T344S，D345N，Q348H，D361V，I362F，I362L，I362M，Q363R，P364Q，K369N，A371P，K373T，D375N，S386I和L392I或选自下组的修饰的组合：K24E/Q60H；Q60K/V83I；N126D/T340I；K24E/L392I；F66Y/Y114N；T132I/P364Q；N73P/N74S；N73P/N74P；Q75T/T76G；D202H/N203E；Y155F/T177I；Q252L/Q348H；K24E/N74Y；N126D/L279S；E2D/R266M；E118V/A300V；K24E/S173T；E53K/N343D；T76P/S213A；L138F/L193F；Q252L/K373T；G45R/Q257E/N286T；K139N/P207S/R266M；D31N/D35Y/M130V；F100Y/S134T/P207S；T177I/S184R/T185S；E1K/K24E/Q60H；K24E/Q60H/Q363R；T181W/E182N/K183R；T181W/E182H/K183R；T181W/E182R/K183R；T181W/E182A/K183R；A0T/K129G/N286D；E1K/E53K/F66Y；M130K/N203D/L279S；S56T/Q252L/S386I；L154Q/T177I/T344S；K24E/V55I/T181S；K24R/T177I/D345N；G52R/E182G/R266M，A0T/T177I/S184T/T185A，Q60R/F66Y/L104I/I362L，K24E/Q60H/E146D/Q252L，Q60K/T132I/Q257E/N284T，Q60R/D90V/Q252H/T340A，E22D/E57V/N73D/K338N，E1K/M6L/A87T/T121P/I362L，D31N/D35Y/T177I/P207S/R266M，K24E/Q60H/N126D/T132I/T340I，D31N/D35Y//P207S/R266M/K336R，D31N/D35Y/T132I/P207S/R266M，Y114N/T177I/T181L/E182I/K183P，E1Q/S79F/Q252L/I362M/K369N，K24E/Q60H/N73D/D90V/K120R/D361V，D31N/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P，D31K/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/F66Y/M130V/P207S/Q257E/N286T，D31N/D35Y/M130V/E182V/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/M130V/T132I/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/Q60H/G81E/M130V/P207S/R266M/A371P，K24E/D31N/D35Y/T121I/M130V/L154V/P207S/R266M/A371P，Q60K/F66Y/N74P/Q75T/T76G/V83I/Q252H/Q257E/A371P，Q60K/F66Y/N73P/N74P/Q75T/Q257E/I362L/P364Q/A371P，D31N/D35Y/E53V/M130V/A148T/P207S/R266M/Q363R/A371P，Q60K/F66Y/N74P/T76G/Y114N/M130V/Y155F/T340I/I362F/A371P/D375N，D31N/D35Y/F66Y/N73P/N74P//V83I/D90V/Y114N/N126D/N142D/Q252H/T340I/I362L/A371P，D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N73P/P80L//V83I//Y117N/N126D/Y155F/Q252H/Q257E/T340I/A371P，和D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N74P/T76G//V83I/D90V/Y155F/Q252L/G321A/T340I/I362L/A371P。
本发明的方法的进一步具体的实施方案提供了选自下组的具体变体：A/B/K129P，A/B/K129Q，A/B/K129I，A/B/K129R，A/B/P207G，A/B/N203L/P207G，A/B/K129R/N203L，A/B/K129R/N203L/P207G，A/B/K24R，A/B/K24R/K129P，A/B/K24R/K129R/N203L/P207G，A/B/K24R/K129R/N203L，A/B/D，
A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/L64F/F66L/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252W，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252F，
A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y
A/B/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217A/K336V
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217A
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/T188S/P190T/T217A
B/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A
A/D/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/K179N/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/E182N/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R，
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/S213G/T217A/K336R,
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/E196R/S213G/T217A/K336R，
D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R/K393G/R397Q/K400A，
D/∑b/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，
D/∑c/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A，
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/N203L/S213G，
D/F66L/R94V/∑d/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/E1*/E2*/K116A/E119S/T217A，
D/E1*/E2*/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
其中A意指G52C/A99C，B意指N31C/T177C，C意指W46C/Q91C，D意指K141C/V199C，E意指N31C/E176C，F意指G59C/F100C，和G意指S162C/S247C；和其中∑a意指在位置114-121用片段TQADTSSR取代片段YQKDEEKN，∑b意指用片段TQADTSSP取代片段YQKDEEKN，∑c意指用片段TQADTSSN取代片段YQKDEEKN，∑d意指用片段TQADTSS取代片段YQKDEEKN。
本发明的方法可用于构建任何野生型或变体肌醇六磷酸酶的变体。在具体实施方案中，其产生SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9的成熟部分的变体，或与SEQ ID NO:9相关且列于表1的任何一个肌醇六磷酸酶变体的变体。
本发明的方法可进一步提供除了其它二硫桥联之外还包含选自下组的修饰(取代)或修饰(取代)的组合的变体：在图1的每一行中列出的修饰(取代)和修饰(取代)的组合。
本发明的方法可提供具有改善性质的肌醇六磷酸酶变体，所述性质如热稳定性(thermostability)，热活性稳定性(heat-stability)，蒸汽稳定性，温度概貌，造粒稳定性，酸稳定性，pH概貌，和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性，比活性，底物特异性，在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)，对糖化作用的易感性，和/或糖基化样式。由本发明提供的变体呈现特别改善的热性质，如热稳定性、热活性稳定性、蒸汽稳定性、温度概貌、造粒稳定性或在动物饲料中的改善的性能。
本发明的方法因此涉及具有改善的热性质的肌醇六磷酸酶变体，所述热性质如热稳定性，热活性稳定性，蒸汽稳定性，温度概貌，和/或造粒稳定性。
本发明的方法因此涉及具有改善的热稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的热活性稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的蒸汽稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的温度概貌的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的造粒稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的酸稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的pH概貌的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的比活性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的底物稳定性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的对糖化作用的易感性的肌醇六磷酸酶变体。
本发明的方法因此涉及具有改善的糖基化样式的肌醇六磷酸酶变体。
本发明进一步涉及包含编码由本方法产生的肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列的多核苷酸，包含所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导所述多肽在表达宿主中产生的调控序列的核酸构建体，包含此种核酸构建体的重组表达载体，和包含核酸构建体和/或表达载体的重组宿主细胞。
本发明进一步涉及产生如所提供的肌醇六磷酸酶变体的方法，包括：
(a)培养宿主细胞以产生包含所述肌醇六磷酸酶的上清；和
(b)回收所述肌醇六磷酸酶。
本发明还涉及由此具有如上所示的修饰的肌醇六磷酸酶变体。
本发明因此涉及肌醇六磷酸酶变体，其与SEQ ID NO:2具有至少74%同一性，并与SEQ ID NO:2相比包含至少两个二硫桥联，其中所述两个二硫桥联是SEQ ID NO:2中规定的编号的位置77/108，133/407，178/187和381/390的四个天然存在的二硫桥联之外其它的二硫桥联。
所述至少两个二硫桥联选自下组的位置对：A)52/99；B)31/177；C)46/91；D)141/199；E)31/176；F)59/100；和G)162/247。
本发明涉及肌醇六磷酸酶变体，其中二硫桥联的数量是6，7，8，9，10，和/或11。
当其它二硫桥联的数量是二时，可存在下述位置对的组合：A+B，A+C，A+D，A+E，A+F，A+G，B+C，B+D，B+E，B+F，B+G，C+D，C+E，C+F，C+G，D+E，D+F，D+G，E+F，E+G，和F+G，其中A意指52/99；B意指31/177；C意指46/91；D意指141/199；E意指31/176，F意指59/100；和G意指162/247。
若其它二硫桥联的数量是三，可存在下述位置对的组合：A+B+C，A+B+D，A+B+E，A+B+F，A+B+G，A+C+D，A+C+E，A+C+F，A+C+G，A+D+E，A+D+F，A+D+G，A+E+F，A+E+G，A+F+G，B+C+D，B+C+E，B+C+F，B+C+G，B+D+E，B+D+F，B+D+G，B+E+F，B+E+G，B+F+G，C+D+E，C+D+F，C+D+G，C+E+F，C+E+G，C+F+G，D+E+F，D+E+G，D+F+G，和E+F+G。
亦可预见下述位置对的组合：A+B+C+D，A+B+C+E，A+B+C+F，A+B+C+G，A+B+D+E，A+B+D+F，A+B+D+G，A+B+E+F，A+B+E+G，A+B+F+G，A+C+D+E，A+C+D+F，A+C+D+G，A+C+E+F，A+C+E+G，A+C+E+H，A+C+F+G，A+D+E+F，A+D+E+G，A+D+F+G，A+E+F+G，B+C+D+E，B+C+D+F，B+C+D+G，B+C+E+F，B+C+E+G，B+C+F+G，B+D+E+F，B+D+E+G，B+D+F+G，B+E+F+G，C+D+E+F，C+D+E+G，C+D+F+G，C+E+F+G，C+E+F+H，和D+E+F+G用于其它四个二硫桥联。
当其它二硫桥联的数量是五时，组合选自下列位置对：A+B+C+D+E，A+B+C+D+F，A+B+C+D+G，A+B+C+E+F，A+B+C+E+G，A+B+C+F+G，A+B+D+E+F，A+B+D+E+G，A+B+D+F+G，A+B+E+F+G，A+B+F+G+H，A+C+D+E+F，A+C+D+E+G，A+C+D+F+G，A+C+E+F+G，A+D+E+F+G，B+C+D+E+F，B+C+D+E+G，B+C+D+F+G，B+C+E+F+G，B+D+E+F+G，和C+D+E+F+G。
若其它二硫桥联的数量是六，组合选自下列位置对：A+B+C+D+E+F，A+B+C+D+E+G，A+B+C+D+F+G，A+B+C+E+F+G，A+B+D+E+F+G，A+C+D+E+F+G，和B+C+D+E+F+G。
最后，对于其它七个二硫桥联，可使用下述组合：A+B+C+D+E+F+G。
在所有上述组合中，A意指52/99；B意指31/177；C意指46/91；D意指141/199；E意指31/176，F意指59/100；和G意指162/247
根据本发明，肌醇六磷酸酶变体可进一步在选自下组的至少一个位置包含至少一个修饰：1，2，3，4，5，6，24，31，35，41，45，46，52，53，55，56，57，59，60，64，66，73，74，75，76，79，80，81，82，83，84，87，90，91，94，100，104，105，106，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，129，130，132，134，136，137，138，139，142，146，148，154，155，157，161，162，164，167，171，173，175，176，177，179，180，181，182，183，184，185，186，188，190，193，196，200，202，203，205，207，211，213，215，217，218，223，231，239，240，241，247，252，254，257，266，273，276，279，280，281，282，283，284，285，286，289，294，299，300，308，314，316，321，324，330，331，336，338，339，340，344，345，348，351，355，361，362，363，364，369，371，372，373，375，379，385，386，392，406，409，410，和411。
本发明进一步规定，上述修饰具体选自下组：1*，1H,K,R,Q，2D，2*，3*，4P，5P，6L，24R,E，31T,K,N，35Y，41P，45R，46D,E，52E,R 53V，Q,K，53V 55D,I，56T，57Y，V，60P，H,K,R，66Y，73D,P，74P，S,Y，A，75T，76G，P，79F，80L，81E，82E，83I，84Y，87T，90V，Y，91P，100Y，104I,A，105F,E，106A,G，107D,E,G，109A,G，111P，114H,N,T，115Q，116A,E,P，T,Q，117D,E,K，118V，I,L,M,T，119G，K,R,S，120K,S,T,Q,R 121A,D,M,P，T,V 121I，122D，123P，S，124L,T,V，N126D，K129G 129I,R,P，Q，130K,V，132I，134T 136P，137P，138F，139N，142D，146D，148T 154P，Q,V 155F，157F，161P，164D,E，167Q，171T，173P，T 175L，177I 179G，I,K,N,Q，180A,E,G，T，181D,G，I,K,L,S,W182G，N,R,V，H,K,S,Q，183RA,L,P，S,V，Q，184RT，184*，185A,S，185*，186*，188P，193F，196Q，200K,R，202N,H，203D,E,T,L，205P，207G，S，211C，213A，215M，218Q，223E，231P，239Q，240P，241Q，252H,L，254Y，257E，266M，273L,Q，276K,R，279S，280P，281H，282P，283P，284P，285G，N,R，E285Y，286D,T,K,Q，289P，294T，299L，300V，308A，314G，N，316D，321A，324N，330D，331K，336R，338N，339D，340A,I，343D，344S，345N，348H，351Y，355P，361V，362K,R，I362F，I362L，362M，363R，364Q，369N，371P，373T，375N，379K,R，385D 386I，392I，406A，409D,E，410D,E，和/或411R,K。
在进一步的实施方案中，此外，在位置179，180，181，182，183，184，185，和186的八个氨基酸由QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV，或KTDKL替代。
根据本发明，具有其它二硫桥联的变体可进一步包含至少一个选自下组的修饰：1*，1*/2*，1*/2*/3*，1K，4P，5P，46E，52E，53V，57Y，76G，82E，107D，107E，107G，109A，111P，119R，119K，121T，121D，137P，161P，164E，167Q，196Q，200K，202N，218Q，223E，241Q，273L，276R，276K，285G，285N，286Q，299L，314N，314G，362R，362K，379R，379K，385D，406A，410D，410E，411R，411K，或选自下组的组合：55D/331K，111P/241Q，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L，和114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L
在本发明的具体实施方案中，其它二硫桥联选自下组：G52C/A99C，N31C/T177C，W46C/Q91C，K141C/V199C，N31C/E176C，G59C/F100C，和/或S162C/S247C。
在本发明进一步的具体实施方案中，进一步具体的修饰为E1K，E1Q，E2D，M6L，K24E，K24R，D31K，D31N，D35Y，G45R，G52R，E53K，E53V，V55I，S56T，E57V，Q60H，Q60K，Q60R，F66Y，N73D，N73P，N74P，N74S，N74Y，Q75T，T76G，T76P，S79F，P80L，G81E，V83I，A87T，D90V，D90Y，F100Y，L104I，Y114N，E118V，K120R，T121I，T121P，N126D，K129G，M130K，M130V，T132I，S134T，L138F，K139N，N142D，E146D，A148T，L154Q，L154V，Y155F，S173T，T177I，T181I，T181L，T181S，T181W，E182A，E182G，E182H，E182I，E182N，E182R，E182V，K183P，K183R，S184R，S184T，T185A，T185S，L193F，D202H，N203D，N203E，P207S，S211C，S213A，Q252H，Q252L，Q257E，R266M，L279S，E285Y，N286D，N286T，A300V，G321A，K336R，K338N，T340A，T340I，N343D，T344S，D345N，Q348H，D361V，I362F，I362L，I362M，Q363R，P364Q，K369N，A371P，K373T，D375N，S386I和L392I或选自下组的修饰的组合：K24E/Q60H；Q60K/V83I；N126D/T340I；K24E/L392I；F66Y/Y114N；T132I/P364Q；N73P/N74S；N73P/N74P；Q75T/T76G；D202H/N203E；Y155F/T177I；Q252L/Q348H；K24E/N74Y；N126D/L279S；E2D/R266M；E118V/A300V；K24E/S173T；E53K/N343D；T76P/S213A；L138F/L193F；Q252L/K373T；G45R/Q257E/N286T；K139N/P207S/R266M；D31N/D35Y/M130V；F100Y/S134T/P207S；T177I/S184R/T185S；E1K/K24E/Q60H；K24E/Q60H/Q363R；T181W/E182N/K183R；T181W/E182H/K183R；T181W/E182R/K183R；T181W/E182A/K183R；A0T/K129G/N286D；E1K/E53K/F66Y；M130K/N203D/L279S；S56T/Q252L/S386I；L154Q/T177I/T344S；K24E/V55I/T181S；K24R/T177I/D345N；G52R/E182G/R266M，A0T/T177I/S184T/T185A，Q60R/F66Y/L104I/I362L，K24E/Q60H/E146D/Q252L，Q60K/T132I/Q257E/N284T，Q60R/D90V/Q252H/T340A，E22D/E57V/N73D/K338N，E1K/M6L/A87T/T121P/I362L，D31N/D35Y/T177I/P207S/R266M，K24E/Q60H/N126D/T132I/T340I，D31N/D35Y//P207S/R266M/K336R，D31N/D35Y/T132I/P207S/R266M，Y114N/T177I/T181L/E182I/K183P，E1Q/S79F/Q252L/I362M/K369N，K24E/Q60H/N73D/D90V/K120R/D361V，D31N/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P，D31K/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/F66Y/M130V/P207S/Q257E/N286T，D31N/D35Y/M130V/E182V/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/M130V/T132I/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/Q60H/G81E/M130V/P207S/R266M/A371P，K24E/D31N/D35Y/T121I/M130V/L154V/P207S/R266M/A371P，Q60K/F66Y/N74P/Q75T/T76G/V83I/Q252H/Q257E/A371P，Q60K/F66Y/N73P/N74P/Q75T/Q257E/I362L/P364Q/A371P，D31N/D35Y/E53V/M130V/A148T/P207S/R266M/Q363R/A371P，Q60K/F66Y/N74P/T76G/Y114N/M130V/Y155F/T340I/I362F/A371P/D375N，D31N/D35Y/F66Y/N73P/N74P//V83I/D90V/Y114N/N126D/N142D/Q252H/T340I/I362L/A371P，D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N73P/P80L//V83I//Y117N/N126D/Y155F/Q252H/Q257E/T340I/A371P，和D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N74P/T76G//V83I/D90V/Y155F/Q252L/G321A/T340I/I362L/A371P。
本发明的进一步具体的实施方案提供了选自下组的具体变体：A/B/K129P，A/B/K129Q，A/B/K129I，A/B/K129R，A/B/P207G，A/B/N203L/P207G，A/B/K129R/N203L，A/B/K129R/N203L/P207G，A/B/K24R，A/B/K24R/K129P，A/B/K24R/K129R/N203L/P207G，A/B/K24R/K129R/N203L，A/B/D，
A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/L64F/F66L/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252W，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252F，
A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y
A/B/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217A/K336V
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217A
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/T188S/P190T/T217A
B/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A
A/D/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/K179N/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/E182N/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R，
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/S213G/T217A/K336R,
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/E196R/S213G/T217A/K336R，
D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R/K393G/R397Q/K400A，
D/∑b/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，
D/∑c/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A，
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/N203L/S213G，
D/F66L/R94V/∑d/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/E1*/E2*/K116A/E119S/T217A，
D/E1*/E2*/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
其中A意指G52C/A99C，B意指N31C/T177C，C意指W46C/Q91C，D意指K141C/V199C，E意指N31C/E176C，F意指G59C/F100C，和G意指S162C/S247C；和其中∑a意指在位置114-121用片段TQADTSSR取代片段YQKDEEKN，∑b意指用片段TQADTSSP取代片段YQKDEEKN，∑c意指用片段TQADTSSN取代片段YQKDEEKN，∑d意指用片段TQADTSS取代片段YQKDEEKN。
本发明的肌醇六磷酸酶变体可为任何野生型或变体肌醇六磷酸酶的变体。在具体实施方案中，所述变体可来源于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9的成熟部分，或与SEQ ID NO:9相关且列于表1的任何一个肌醇六磷酸酶变体的变体。
本发明的变体可为除了其它二硫桥联之外还包含选自下组的修饰(取代)或修饰(取代)的组合的变体：在图1的每一行中列出的修饰(取代)和修饰(取代)的组合。
本发明进一步涉及能够表达所述肌醇六磷酸酶变体的转基因植物或植物部分，涉及包含至少一种肌醇六磷酸酶变体和如下的组合物：(a)至少一种脂溶性维生素；(b)至少一种水溶性维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。此类组合物可进一步包含至少一种选自下组酶的酶：淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，α-半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶，和/或β-葡聚糖酶。所述组合物可为动物饲料添加剂，其可具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并包含本发明的肌醇六磷酸酶变体。
本发明进一步涉及通过将本发明的肌醇六磷酸酶变体添加至饲料而改善动物饲料的营养价值的方法，通过用有效量的饲料饲养动物而减少动物粪便(animal manure)中植酸水平的工艺，处理植物蛋白的方法，其包括下述步骤：将肌醇六磷酸酶变体添加至至少一种植物蛋白，并涉及本发明的组合物的肌醇六磷酸酶变体的用途。
本发明亦提供了产生发酵产物如例如乙醇、啤酒、葡萄酒的方法，其包括在植酸变体的存在下发酵糖类材料，提供了产生乙醇的方法，其包括在肌醇六磷酸酶变体的存在下发酵糖类材料并产生乙醇。
制备变体的策略
布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶的结构是使用大肠杆菌(E.coli)AppA肌醇六磷酸酶(Protein Data Bank id.:1DKO;Lim等,Nat.Struct.Biol.(2000),vol.2,pp.108-113)的结构作为模板通过同源建模来构筑的。
对该结构进行分子动力学(MD)模拟，和静电计算。鉴定出推定的二硫桥联和脯氨酸的位置，以及其它对多种所需的酶性质具有潜在重要性的位置。最终，鉴定出推定的糖基化位点(NXT或NXS段)。
将所有这些提示在建模的结构和模拟结果的框架内，就热稳定性质(其中特别强调在高温端)进行评估。
相应的肌醇六磷酸酶变体通过本领域已知方法制备，并如实验部分中所述进行测试。
肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比
在本文中，肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，即催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解成(1)肌醇和/或(2)它的单、二、三、四和/或五磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。
在本文中，术语肌醇六磷酸酶底物包括，但不限于，植酸和任何植酸盐(植酸的盐)，以及上文(2)中所列的磷酸盐。
因特网上的ENZYME站点(http://www.expasy.ch/enzyme/)是与酶的命名法相关的信息的储藏库。其主要基于国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)(IUB-MB)的建议，并描述了各种类型的表征的酶，并为这些酶提供了EC(Enzyme Commission(酶学委员会))号(Bairoch A.TheENZYME数据库,2000,Nucleic Acids Res 28:304-305)。同样参见NC-IUBMB,1992的酶命名手册(handbook Enzyme Nomenclature)。
根据ENZYME网站，已知三种不同类型的肌醇六磷酸酶：所谓的3-肌醇六磷酸酶(或称1-肌醇六磷酸酶；肌醇六磷酸3-磷酸水解酶(myo-inositolhexaphosphate 3-phosphohydrolase))，所谓的4-肌醇六磷酸酶(或称6-肌醇六磷酸酶，基于1L编号系统而非1D编号命名，EC 3.1.3.26)，和所谓的5-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.72)。就本发明而言，全部三种类型均包括在肌醇六磷酸酶的定义中。
在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，该家族包括大肠杆菌(Escherichia coli)pH 2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌肌醇六磷酸酶例如泡盛曲霉(Aspergillus awamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC:3.1.3.8)(基因phyA和phyB)。多种组氨酸酸性磷酸酶共享两个具有序列相似性的区域，每个均以保守的组氨酸残基为中心围绕在其周围。这两个组氨酸似乎涉及酶的催化机制。第一组氨酸位于N-末端部分，并且形成磷-组氨酸中间物，而第二个位于C末端部分，并且可能充当质子供体。
在另一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性部位基序，即R-H-G-X-R-X-P，其中X表示任何氨基酸(参见SEQ ID NO:2、3、4和6的氨基酸16至22和SEQ ID NO:9的氨基酸38-44)。在一个优选实施方案中，所述保守的活性部位基序为R-H-G-V-R-A-P，即氨基酸16-22(参照SEQ ID NO:2)是RHGVRAP。
就本发明而言，肌醇六磷酸酶活性是以FYT单位测定的，一个FYT是在以下条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸根的酶量：pH5.5；温度37℃；底物：浓度为0.0050mol/l的植酸钠(C6H6O24P6Na12)。合适的肌醇六磷酸酶测定法是WO 00/20569的实施例1中描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混物(premix)中的肌醇六磷酸酶活性。肌醇六磷酸酶活性亦使用实施例1中的测定法来确定(“磷酸酶活性的确定”或“肌醇六磷酸酶活性的确定”)。
在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶是分离的。术语“分离的”如用于本文是指这样的多肽，如通过SDS-PAGE测定，所述多肽是至少20%纯的，优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少80%纯的，最优选至少90%纯的，并且甚至最优选至少95%纯的。具体而言，优选多肽是“基本上纯的形式(essentially pure form)”，即，所述多肽制备物基本上不含(essentially free of)其它与该多肽制备物天然结合的(natively associated)多肽物质。例如，这可以通过以公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽来实现。
两个氨基酸序列之间的相关性用参数“同一性”来描述。就本发明而言，两个氨基酸序列的比对是通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)的Needle程序版本2.8.0确定的。Needle程序执行在Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的全局比对算法(global alignmentalgorithm)。所用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开放罚分是10，并且缺口延伸罚分是0.5。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)和权利要求中涉及的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2)之间的同一性程度，是通过两个序列比对中精确匹配的数目，除以“发明序列”的长度或SEQ ID NO:2的长度中最短的一个来计算。结果以百分比同一性表示。
当“发明序列”和SEQ ID NO:2在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配(在下文的比对实例中用“|”代表这种情况)。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQ ID NO:2的氨基酸1-411的长度是411)。
实施例11是SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶和SEQ ID NO:9的肌醇六磷酸酶的比对的实例，且该实例阐述如何计算这两个骨架之间的同一性百分比。
在以下的另一个纯假设性比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，缺口用“-”表示。
假设性比对实例：
序列1：ACMSHTWGER-NL
           | |||  ||
序列2：HGWGEDANLAMNPS
在一个具体的实施方案中，多肽的氨基酸序列与或者相对于例如SEQ IDNO:2的同一性百分比是通过如下来确定的：i)使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10的缺口开放罚分和0.5的缺口延伸罚分来比对所述两个氨基酸序列；ii)计数比对中精确匹配数；iii)用精确匹配数除以两个氨基酸序列中最短的序列的长度，iv)将iii)除得的结果转换成百分比。
在上文的假设性实例中，精确匹配数是6，两个氨基酸序列中最短的序列的长度是12；因此同一性百分比是50%。
在本发明的肌醇六磷酸酶的具体实施方案中，与SEQ ID NO:2的同一性程度为至少75%，76%，77%，78%，79%，80%，81％，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%。在仍进一步的具体实施方案中，同一性程度为至少98.0%，98.2%，98.4%，98.6%，98.8%，99.0%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%。在其它实施方案中，同一性程度为至少70%，71％，72%，或至少73%。
在仍进一步的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有与SEQ IDNO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于1，2，3，4，5，6，7，8，9，或不多于10个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比不多于11，12，13，14，15，16，17，18，19，或不多于20个修饰；与SEQID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比不多于21，22，23，24，25，26，27，28，29，或不多于30个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于31，32，33，34，35，36，37，38，39，或不多于40个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于41，42，43，44，45，46，47，48，49，或不多于50个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于51，52，53，54，55，56，57，58，59，或不多于60个修饰；与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于61，62，63，64，65，66，67，68，69，或不多于70个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于71，72，73，74，75，76，77，78，79，或不多于80个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于81，82，83，84，85，86，87，88，89，或不多于90个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于91，92，93，94，95，96，97，98，99，或不多于100个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于101，102，103，104，105，106，107，108，109，或不多于110个修饰；与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于111，112，113，114，115，116，117，118，119，或不多于120个修饰；或与SEQ ID NO:2或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于121，122，123，或124个修饰。
位置编号
本文使用的用于限定氨基酸位置的命名法基于来源于布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，其成熟序列作为SEQ ID NO:2在序列表中给出(SEQ ID NO:2的氨基酸1-411)。因此，在本上下文中，用于位置编号的基础是SEQ ID NO:2，始于E1并且止于E411。
当用于本文中时，术语“成熟”部分(或序列)是指由细胞分泌的多肽的部分，所述细胞含有编码该多肽的多核苷酸作为其遗传部件(genetic equipment)的部分。换言之，成熟多肽部分指多肽在切割去信号肽部分以及前肽部分(如存在)之后残余的部分。信号肽部分可通过本领域已知的程序预测(例如SignalP)。SEQ ID NO:2的预期的信号肽部分作为SEQ ID NO:8包括在本发明序列表中，其由SEQ ID NO:7编码。SEQ ID NO:2是预期的成熟部分。一般而言，酶的成熟多肽的第一个氨基酸可通过纯化的酶的N端测序来确定。则信号肽部分和成熟部分之间的任何差异必然是由于前肽的存在。
修饰，如取代、缺失、插入
肌醇六磷酸酶变体，可以相对于模板(即参照或比较性氨基酸序列例如SEQ ID NO:2)包含多种类型的修饰：可以将一个氨基酸用另一个氨基酸取代；可以缺失氨基酸；可以插入氨基酸；以及任何数目的这些修饰的任意组合。在本上下文中，术语“插入”意欲还包括N末端和/或C末端延伸。
本文用于单修饰的通用命名法如下：XDcY，其中"X"和"Y"独立地表示单字母氨基酸代码，或"*"(一个氨基酸缺失)，"D"表示一个数字，且"c"表示按字母顺序计数(a、b、c等等)，其仅在插入中出现。参考下文表1，其中描述了将这种命名法应用于多种类型的修饰的纯假设性实例。
表1
Figure GDA00002464555900221
Figure GDA00002464555900231
如上文所解释的，位置号("D")从SEQ ID NO:2的第一氨基酸残基起计算。
在相同序列中的几个修饰用"/″(斜线)分隔，例如标识“1*/2*/3*”表示在位置号1、2和3的氨基酸全部缺失，标识“104A/105F”表示位置号104的氨基酸被A取代，并且位置号105的氨基酸被F取代。
可选择的修饰用“,”(逗号)分隔，例如，标识“119R,K”表示位置119上的氨基酸被R或K取代。
本文在各种其他不胜枚举的可能性中所用的逗号表示它们通常在语法上的作用，即通常是和/或。例如，列举“53V，Q,121D，和/或167Q”中第一个逗号表示二中选一(V或Q)，而后面的两个逗号应理解为和/或的选择：53V或Q，和/或121D，和/或167Q。
在本文中，“至少一个”(例如修饰)表示一个或多个，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个修饰；或12，14，15，16，18，20，22，24，25，28或30个修饰；等等，直至最多的修饰数目为125，130，140，150，160，170，180，190或200个。然而，本发明的肌醇六磷酸酶变体仍必须与SEQ ID NO:2具有至少70%同一性，该百分比如上所述确定。
对用什么取代或延伸没有进行任何指定的取代或延伸是指除了在模板中占据该位置的氨基酸以外，插入任何天然的，或非天然的氨基酸。
实施例11提供了如何应用该命名法的进一步说明。
鉴定相应的位置号
如上文所解释，使用布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113的成熟肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO:2)作为位置编号的标准，因此也是命名法的标准。
对于另外的肌醇六磷酸酶，特别是本发明的肌醇六磷酸酶变体，对应于SEQID NO:2中位置D的位置通过如标题为“肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比”一节中在前面详明的比对两个序列来查找到。从比对中，本发明序列中与SEQID NO:2的位置D相对应的位置可清楚而明白地鉴定出来(在比对中在彼此顶部的那两个位置(the two positions on top of each other in the alignment))。
实施例11是SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶和SEQ ID NO:9的肌醇六磷酸酶的比对的实例，且该实例阐述了如何鉴定这两个骨架中相应的位置。
下面给出一些从上文表1得到的其它的、纯假设性实例，其在第三栏中包括多个对两个序列的比对：
参照表1第一行第三格：上排序列是模板，下排是变体。位置号80是指模板中的氨基酸残基G。氨基酸A占据变体中相应的位置。因此，将这种取代命名为G80A。
再参照表1第二行第三格：上排序列还是模板且下排是变体。位置号80还是指模板中的氨基酸残基G。变体具有两个插入，即TY，在模板的G80之后V81之前。尽管T和Y在变体氨基酸序列中当然也将具有它们自己“真正的”位置号，但是就此处而言，我们总是指模板位置号，而因此T和Y分别称作位置号80a和80b。
最后，参照表1最后一行的第三格：位置号275是指模板中最后的氨基酸。将C末端延伸ST分别称作位置号275a和275b，尽管它们在变体氨基酸序列中当然也拥有它们自己“真实的”位置号。
修饰的性质，参照肌醇六磷酸酶
在一个具体实施方案中，本发明的产生肌醇六磷酸酶变体的方法提供具有修饰的，优选改善的性质的变体。
术语“修饰的”和“改善的”暗示与其它肌醇六磷酸酶的比较。此类其它的参照或比较性肌醇六磷酸酶的实例为：SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:6。参照肌醇六磷酸酶的仍进一步的实例可为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。参照肌醇六磷酸酶的仍进一步的实例可为SEQ ID NO:9，及其变体。
修饰的，优选改善的性质的非限定性实例如下所述：热稳定性，pH概貌，比活性，在动物饲料中的性能，造粒稳定性，蛋白酶敏感性，和/或糖基化样式。通过本发明的方法产生的肌醇六磷酸酶变体呈现改善的热稳定性，并亦可具有修饰的，优选改善的温度概貌，和/或其可并入潜在蛋白酶切割位点的变化。
热性能
温度稳定性
温度稳定性可如实施例3中所述在60℃或更高的温度在30分钟温育中确定活性，并与在37℃进行的参照实验相比较来确定。
热稳定性
热稳定性可如实施例4中所述确定，即，使用DSC测量以确定纯化的肌醇六磷酸酶蛋白的变性温度Td。Td指示蛋白质的热稳定性：Td越高，热稳定性越高。因此，在一个优选实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有高于参照肌醇六磷酸酶Td的Td，其中Td针对纯化的肌醇六磷酸酶样品确定(优选地，通过SDS-PAGE确定具有至少90%或95%的纯度)。
热活性稳定性
热活性稳定性可如实施例5中所述通过确定变体肌醇六磷酸酶的温度/活性概貌来确定。
蒸汽稳定性
蒸汽稳定性可如实施例7中所述通过确定肌醇六磷酸酶分子在85℃或90℃进行短时间的蒸汽处理之后的残余活性来确定。
造粒稳定性
造粒稳定性可如实施例8中所述通过使用与饲料预混的酶颗粒来确定。将该预混物与饲料混合。从混合器中，将饲料汽蒸至95℃进行调理。在调理之后，将饲料压为团粒，并确定残余活性。
在优选实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶的热性质，如热活性稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性和/或造粒稳定性，如根据残余活性、Td或其它参数提供的，与SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的相应值，如残余活性或Td相比更高，更优选地，为其至少101%，或其至少102%，103%，104%，105%，106%，107%，108%，109%，或其至少110%。甚至更优选地，本发明的肌醇六磷酸酶的参数如残余活性或Td的值是对于SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的值的至少120%，130%，140%，150%，160%，170%，180%，或至少190%。
在仍进一步的具体实施方案中，本发明的热稳定性肌醇六磷酸酶具有至少50℃的熔融温度Tm(或变性温度Td)，如使用实施例中所述(即在20mM乙酸钠pH 4.0中)的差示扫描量热法(DSC)确定。在仍进一步的具体实施方案中，所述Tm为至少51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，62.5，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或至少100℃。DSC测量亦可如实施例中所述进行。
温度概貌/温度稳定性
本发明的肌醇六磷酸酶是否与参照肌醇六磷酸酶相比具有修饰的温度概貌可如实施例5中所述确定。因此，在一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比，具有修饰的温度概貌，其中所述温度概貌以肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数针对植酸钠在pH 5.5在20-90℃的温度范围(10℃步移)确定。优选的缓冲液为0.25M乙酸钠缓冲液pH 5.5。在每个温度的活性优选表示为标准化至最适温度的值的相对活性(以%表示)。最适温度是在测试的温度内(即具有5-10℃跃变(jump)的那些温度)活性最高处的温度。
pH概貌
本发明的肌醇六磷酸酶是否与参照肌醇六磷酸酶相比具有改变的pH概貌可如实施例中所述确定。因此，在一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比，具有改变的pH概貌，其中所述pH概貌以肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数针对植酸钠在37℃在2.0至7.5的pH范围(0.5pH单位步移)确定。优选的缓冲液是50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mMBis-Tris的混合液。在每个pH的活性优选表示为标准化至最适pH的值的相对活性(以%表示)。
改变的pH概貌的实例是当pH曲线(相对活性作为pH的函数)移向较高或较低的pH时。与SEQ ID NO:2的参照肌醇六磷酸酶相比，优选的取代导致向更高pH迁移0.5pH单位。然而，对于某些目的，可优选导致与SEQ IDNO:2的参照肌醇六磷酸酶相比，向更低pH迁移0.5pH单位。
改变的pH概貌的另一个实例是当最适pH以向上或向下方向变化时。
在一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有改变的pH概貌。更具体而言，pH概貌在pH范围3.5-5.5中受修饰。仍更具体而言，在pH 4.0，4.5，5.0和/或5.5的活性处于最适pH的活性至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或至少95%的水平。
比活性
在一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶相对于参照肌醇六磷酸酶具有改善的比活性。更具体而言，本发明的肌醇六磷酸酶的比活性相对于用同样方法确定的参照肌醇六磷酸酶的比活性是至少105%。在仍进一步的具体实施方案中，相对比活性是至少110、115、120、125、130、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、350或甚至400%，仍是相对于用同样方法确定的参照肌醇六磷酸酶的比活性而言。
或者，术语高比活性指至少200FYT/mg酶蛋白(EP)的比活性。在具体实施方案中，比活性为至少300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900或3000FYT/mg EP。
比活性是对高度纯化的样品(SDS聚丙烯酰胺凝胶应该显示只有一个组分存在)测量的。酶蛋白浓度可以通过氨基酸分析来测定，并且肌醇六磷酸酶活性以FYT为单位，如实施例1中所述确定。比活性是所述的特定肌醇六磷酸酶的特征，并且计算为以每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白的FYT单位测量的肌醇六磷酸酶活性。具体细节参见实施例。
在动物饲料中的性能
在一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶的与参照肌醇六磷酸酶相比在动物饲料中具有改善的性能。动物饲料中的性能可通过实施例中所示的体外模型来确定。因此，在一个优选实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在动物饲料中具有改善的性能，其中所述性能在体外模型中确定，即制备由30%大豆粉和70%玉米粉构成、添加CaCl2至5g钙每kg饲料的浓度的饲料样品，将其在40℃和pH 3.0预温育30分钟，接着添加胃蛋白酶(3000U/g饲料)和肌醇六磷酸酶，将样品在40℃和pH 3.0温育60分钟，接着pH 4.0温育30分钟；终止反应；通过添加HCl至0.5M的终浓度并在40℃温育2小时提取植酸和肌醇磷酸，接着再进行一次冻结-熔融循环，并在40℃温育1小时；通过高效离子层析将植酸和肌醇磷酸分开；确定残余植酸磷(IP6-P)的量；计算经肌醇六磷酸酶处理的和未经肌醇六磷酸酶处理的空白样品之间残余IP6-P的差异(差异为降解的IP6-P)；并将本发明的肌醇六磷酸酶降解的IP6-P相对于参照肌醇六磷酸酶降解的IP6-P表示。
本发明的肌醇六磷酸酶和参照肌醇六磷酸酶当然地以相同量给药，优选基于肌醇六磷酸酶活性单位(FYT)。优选剂量为125FYT/kg饲料。另一个优选的剂量是250FYT/kg饲料。肌醇六磷酸酶可以以纯化的肌醇六磷酸酶的形式，或以发酵上清的形式给药。纯化的肌醇六磷酸酶优选具有至少95%的纯度，如通过SDS-PAGE确定。
在优选实施方案中，本发明的纯化的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相对于参照肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，为至少101%，或至少102%，103%，104%，105%，110%，115%，或至少120%。在仍进一步的优选实施方案中，本发明的纯化的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相对于参照肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，为至少125%，130%，140%，150%，160%，170%，180%，190%，或至少200%。优选地，本发明的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相对于SEQ ID NO:2肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，为至少105%，110%，113%，115%，120%，125%，或至少130%。
本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能亦可计算为由参照肌醇六磷酸酶释放的磷的百分比。
在仍进一步的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能可计算为由本发明的肌醇六磷酸酶释放的磷，相对于由参照肌醇六磷酸酶释放的磷的量的百分比。
在仍进一步的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能为至少105%，优选至少110，120，130，140，150，160，170，180，190，或至少200%。
蒸汽稳定性
热稳定性是重要的参数，但与之相关，蒸汽稳定性也是重要的。就此方面参见下文中的实施例8。
低变应原性变体
在一个具体实施方案中，由本发明的方法产生的肌醇六磷酸酶变体(也)是低变应原性变体，设计为当暴露于动物包括人时，引发减弱的免疫应答。术语免疫应答应理解为暴露于该肌醇六磷酸酶变体的动物的免疫系统的任何反应。一种类型的免疫应答是变态反应，其导致暴露的动物中IgE水平的提高。低变应原性变体可使用本领域已知技术制备。举例而言，所述肌醇六磷酸酶变体可与聚合物模块缀合，所述模块屏蔽涉及免疫应答的肌醇六磷酸酶变体的表位或部分。与聚合物缀合可涉及在体外将聚合物偶联于肌醇六磷酸酶变体，例如如WO 96/17929，WO 98/30682，WO 98/35026，和/或WO 99/00489中所述。缀合可额外或替代地涉及在体内将聚合物偶联于所述肌醇六磷酸酶变体。此种缀合可通过编码肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列的遗传工程来实现，即，将编码额外糖基化位点的共有序列插入该肌醇六磷酸酶变体，并在能够糖基化该肌醇六磷酸酶变体的宿主中表达该肌醇六磷酸酶变体，参见例如WO 00/26354。另一种提供低变应原性变体的方式是对编码该肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列进行遗传工程，从而导致该肌醇六磷酸酶变体自寡聚化，其作用是该肌醇六磷酸酶变体单体可屏蔽其它肌醇六磷酸酶变体单体的表位，并由此降低寡聚物的免疫原性。此类产物及其制备描述于例如WO 96/16177。涉及免疫应答的表位可通过多种方法鉴定，如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示方法，或EP 561907中描述的随机方法。一旦鉴定出表位，可通过已知的基因操纵技术如定位诱变(参见例如WO 00/26230，WO 00/26354和/或WO 00/22103)改变其氨基酸序列以产生改变的免疫性质的肌醇六磷酸酶变体，和/或可在聚合物足够接近该表位处进行聚合物的缀合以使得该聚合物屏蔽该表位。
核酸序列和构建体
本发明还涉及包含编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的核酸序列。
术语“分离的核酸序列”指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如，至少约20%纯，优选至少约40%纯，更优选至少约60%纯，甚至更优选至少约80%纯，并且最优选至少约90%纯，如通过琼脂糖电泳确定。举例而言，分离的核酸序列可通过遗传工程中使用的标准克隆步骤获得，在所述步骤中，将核酸序列从其天然位置重新置于不同位点，在此其会被复制。所述克隆步骤可涉及对包含编码所述多肽的核酸序列的所需核酸片段的切出和分离，将所述片段插入载体分子，并将所述重组载体并入宿主细胞，在此会复制所述核酸序列的多重拷贝或克隆。所述核酸序列可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或其任意组合。
本发明的核酸序列可通过将至少一个突变导入模板肌醇六磷酸酶编码序列或其亚序列来制备，其中所述突变体核酸序列编码变体肌醇六磷酸酶。将突变导入核酸序列以用一个核苷酸交换另一个核苷酸可通过任何本领域中已知的方法，例如通过定位诱变，通过随机诱变或通过掺杂的(doped)、混杂的(spiked)或局部化(localized)的随机诱变来完成。
随机诱变可作为局部化或区特异性随机诱变，在翻译至所述显示的氨基酸序列的基因的至少三个部分或在全基因内适当地进行。当通过使用寡核苷酸进行诱变时，可将所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的合成过程中在待改变的位置掺杂或混杂以三个非亲本核苷酸。可进行所述掺杂或混杂使得不欢迎的氨基酸的密码子得以避免。可通过任何技术，使用例如PCR、LCR或任何视为适当的DNA聚合酶和连接酶，将所述掺杂或混杂的寡核苷酸并入编码所述肌醇六磷酸酶的DNA。
优选地，掺杂(doping)是使用“恒定随机掺杂(constant random doping)”进行的，其中预先决定在每个位置野生型和突变的百分比。此外，可将掺杂导向于优选导入某些核苷酸，并由此优选导入一个或多个特定氨基酸残基。例如，可使得所述掺杂允许在每个位置导入90%野生型和10%突变。在选择掺杂方案的另一个考量基于遗传的以及蛋白结构的限制。
可将随机诱变有利地定位于所述亲本肌醇六磷酸酶的一部分。这可例如在当已鉴定出酶的某些区对于酶的给定性质特别重要时是有利的。用于提供本发明的变体的其他方法包括例如如WO 95/22625或WO 96/00343中描述的基因改组，和如EP 897985中描述的共有衍生过程(consensus derivation process)。
核酸构建体
核酸构建体包含可操作地连接的本发明的核酸序列和一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述编码序列在与所述调控序列相容的条件下在合适宿主细胞中表达。表达应理解为包括多肽产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“核酸构建体”用于本文中指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因分离，或经修饰以否则不会在自然界存在的方式含有核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒“同义。
术语“调控序列”用于本文中包括对于表达编码本发明多肽的多核苷酸必需或有利的所有成分。每个调控序列对于编码多肽的核苷酸序列可为天然或外源的。此类调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，调控序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。调控序列可与接头一同提供，以供导入特定限制性位点的目的，所述位点便于所述调控序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。
术语“可操作地连接”在本文中意指构型，其中调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适位置，从而使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。
当用于本文中，术语“编码序列”(CDS)意指核苷酸序列，其直接指定其蛋白产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般通过开读框确定，其通常以ATG起始密码子或其他起始密码子如GTG和TTG开始。所述编码序列可为DNA、cDNA或重组的核苷酸序列。
表达载体
术语“表达”包括多肽产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”在本文中定义为直链或环状的DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，且其可操作地连接于提供其表达的其他多核苷酸。
编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的核酸序列可使用表达载体表达，所述表达载体通常包括编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻抑物基因或多种激活子基因的调控序列。
携带编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的DNA序列的重组表达载体可为任何载体，可便利地对其进行重组DNA步骤，且载体的选择通常会取决于其要导入的宿主细胞。所述载体可为这样的载体，当其导入宿主细胞时，其整合入宿主细胞基因组，并与其整合入的染色体一同复制。
所述肌醇六磷酸酶变体亦可与至少一种其他在动物饲料中感兴趣的酶，如肌醇六磷酸酶、磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、淀粉酶和/或β-葡聚糖酶一同共表达。所述酶可从不同的载体，从同一载体，或使用两种技术的混合进行共表达。当使用不同载体时，所述载体可具有不同的选择性标记，和不同的复制起点。当仅使用一个载体时，基因可从一个或多个启动子表达。若在一个启动子的调节下克隆(双或多顺反性(di-ormulti-cistronic))，基因克隆的顺序可影响蛋白的表达水平。所述肌醇六磷酸酶变体亦可作为融合蛋白表达，即编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因与编码另一个蛋白的基因框内融合。该蛋白可为另一个酶或来自另一个酶的功能域。
宿主细胞
术语“宿主细胞”如用于本文中，包括任何对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体进行的转化、转染、转导等是易感的细胞类型。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞，其有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使得所述载体作为染色体整合体，或作为之前所述的自主复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变不同于亲本细胞。宿主细胞的选择在很大程度上会取决于编码所述多肽的基因及其来源。
所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
可用的单细胞微生物为细菌细胞，如革兰氏阳性细菌，其包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉属(Streptomyces)细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的方面，所述芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌。
将载体导入细菌宿主细胞可通过例如原生质体转化(参见，例如Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如Young和Spizizin,1961,Journal of Bacteriology 81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56:209-221)，电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower，1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278)来实现。
所述宿主细胞亦可为真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的方面，所述宿主细胞是真菌细胞。“真菌”如用于本文包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary ofThe Fungi,第八版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
在一个更优选的方面，所述真菌宿主细胞为酵母细胞。“酵母”如用于本文中包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，应将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在一个甚至更优选的方面，所述酵母宿主细胞为假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。
在一个最优选的方面，所述酵母宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)，卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cyptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa或虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、杂色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proeedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,182-187页,AcademicPress,Inc.,New York；Ito等,1983,Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920。
产生方法
本发明涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，包括(a)在有助于产生肌醇六磷酸酶的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden editors,VCHPublishers,New York,1989)。
转基因植物
本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其经本发明编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改饮食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
在一个具体实施方案中，所述多肽靶向种子中的胚乳储藏液泡。这可通过将其作为具有合适信号肽的前体合成来获得，参见Horvath等，PNAS,Feb.15,2000,vol.97,no.4,p.1914-1919。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或其经工程改造变体。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱、黑小麦(triticale)(小麦(Triticum)和黑麦(Secale)的稳定杂种)和玉蜀黍(maize)(玉米)。双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如向日葵(Helianthus)、棉花(Gossypium)、羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。低植酸植物，如例如美国专利号5,689,054和美国专利号6,111,168中描述的，是经工程改造的植物的实例。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列与在选择的植物或植物部分中表达该核酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的细胞区室、组织或植物部分例如种子或叶。调节序列为例如由Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。
对于组成型表达，可以使用下述启动子：35S-CaMV启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294)、玉米泛素1(Christensen AH,Sharrock RA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genes:structure,thermal perturbation of expression andtranscript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts byelectroporation)和稻肌动蛋白1启动子(Plant Mol.Biol.18,675-689.;Zhang W，McElroy D.和Wu R 1991,Analysis of rice Act1 5’region activity in transgenicrice plants.Plant Cell 3,1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sinktissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant and Cell Physiology 39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of Plant Physiology 152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant and CellPhysiology 39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，如在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Molecular Biology 26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and General Genetics 248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant MolecularBiology 22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度修饰，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)、赤霉酸(gibberellic acid)，和/或重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
此外，可对于所述植物物种优化密码子选择以改善表达(参见上述提到的Horvath等)。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19:15-38)，而且也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物更经常使用其它的转化方法。目前，补充土壤杆菌方法的产生转基因单子叶植物的优选方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,Plant Journal 2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinion Biotechnology 5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Molecular Biology 21:415-428所描述的。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择其中并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含核酸序列的转基因植物或植物细胞，所述核酸序列编码本发明具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。
组合物和用途
仍旧在进一步的方面，本发明涉及包含本发明多肽的组合物，以及使用这些的方法。
多肽组合物可依照本领域已知方法制备，且可为液体或干组合物的形式。举例而言，所述多肽组合物可为颗粒或微颗粒的形式。待包括在组合物中的多肽可依照本领域中已知的方法稳定化。
本发明是肌醇六磷酸酶可用于在任何产业背景下降解例如植酸盐，植酸，和/或肌醇一、二、三、四和/或五磷酸。公知这些化合物的磷酸模块螯合二价和三价阳离子如金属例子，即营养上必需的离子：钙、铁、锌和镁，以及痕量矿物质锰、铜和钼。此外，植酸亦一定程度上通过静电相互作用结合蛋白质。
因此，本发明的多肽的优选用途是用于动物饲料制备物(包括人类食物)或用于此类制备物的添加剂。
在一个具体实施方案中，本发明的多肽可用于改善动物饲料的营养价值。改善动物饲料(包括人类食物)的营养价值的非限定性实例为：改善食物可消化性；促进动物的生长；改善饲料利用；改善蛋白质的生物利用度；提高可消化的磷酸的水平；改善植酸释放和/或降解；改善痕量矿物质的生物利用度；改善常量矿物质的生物利用度；消除对于添加补充性磷酸、痕量矿物质和/或常量矿物质的需求；和/或改善蛋壳品质。因此增加了所述饲料的营养价值，且可改善动物的生长率和/或体重增加和/或饲料转化率(即，摄入的饲料的重量相对于重量增加)。
此外，本发明的多肽可用于减少粪便的植酸(盐)水平。
动物、动物饲料和动物饲料添加剂
术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括，例如下述动物：如绵羊、山羊和牛，例如母牛，如肉牛和乳牛。在一个具体实施方案中，所述动物是非反刍动物。非反刍动物的实例包括单胃动物，例如猪(pig或swine)(包括但不限于小猪，生长猪(growingpig)和母猪)；禽类如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于烤用鸡(broiler chick)，蛋鸡)；鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲇鱼和鲤鱼)；和甲壳类(包括但不限于虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物意指任何适于或旨在供动物摄入的化合物、制备物、混合物或组合物。
在根据本发明的用途中，所述多肽可在饮食之前、之后或同时饲喂给动物。优选后者。
在一个具体实施方案中，所述多肽在其添加至饲料的形式中，或当包括在饲料组合物中时，是基本上纯的。在一个具体实施方案中，其为“良好限定的(well-defined)”。术语“良好限定的”意指所述肌醇六磷酸酶制备物如通过大小排阻层析(参见WO 01/58275的实施例12)确定的为至少50%纯。在其它具体实施方案中，所述肌醇六磷酸酶制备物如通过该方法确定的为至少60，70，80，85，88，90，92，94，或至少95%纯。
基本上纯的，和/或良好限定的多肽制备物是有利的。举例而言，将基本上不含其它多肽干扰或污染的多肽准确地剂量添加于饲料要容易得多。术语准确地剂量添加具体指获得一致和恒定结果的目的，和基于所需作用优化剂量的能力。
然而，对于在动物饲料中的用途，本发明的肌醇六磷酸酶多肽无需那么纯；其可例如包含其它多肽，在此情况下，其可命名为肌醇六磷酸酶制备物。
所述肌醇六磷酸酶制备物可(a)直接添加至饲料(或直接用于蛋白质的处理工艺)，或(b)其可用于产生一种或多种中间组合物，如饲料添加剂或预混物，然后将其添加至饲料(或用于处理工艺)。上述的纯度程度指原始多肽制备物的纯度，无论是根据上述(a)或(b)使用的。
具有该数量级的纯度的多肽制备物具体而言是使用重组产生方法可获得的，而当所述多肽通过传统发酵方法产生时，它们不那么容易获得，并且亦受高得多的批次对批次差异的影响。
此种多肽制备物可当然地与其它多肽混合。
所述多肽可以以任何形式添加至饲料，无论其作为相对纯的多肽，或与旨在添加至动物饲料的其它组分的混合物，即，以动物饲料添加剂的形式，如所谓用于动物饲料的预混物。在一个进一步的方面，本发明涉及用于动物饲养的组合物，如动物饲料，和动物饲料添加剂，例如预混物。
除了本发明的多肽以外，本发明的动物饲料添加剂还含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质。所述饲料添加剂亦可含有至少一种常量矿物质。
此外，任选的饲料添加剂成分为着色剂，例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素，虾青素，和叶黄素；香味化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；反应性氧生成物种；和/或至少一种选自下组的其它多肽：肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；磷酸酶(EC 3.1.3.1；EC 3.1.3.2；EC 3.1.3.39)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.-.-)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶如例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在一个具体实施方案中，这些其它多肽是良好限定的(如上文对于肌醇六磷酸酶制备物所定义)。
本发明的肌醇六磷酸酶亦可与其它肌醇六磷酸酶组合，例如子囊菌肌醇六磷酸酶如曲霉属肌醇六磷酸酶，例如来源于无花果曲霉(Aspergillusficuum)，黑曲霉或泡盛曲霉，或担子菌肌醇六磷酸酶，例如来源于Peniophoralycii，Agrocybe pediades，绒毛栓菌(Trametes pubescens)，或卷边桩菇(Paxillusinvolutus)；或其具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物、片段或变体。
因此，在本发明的在动物饲料中的用途的优选实施方案中，和在本发明的动物饲料添加剂和动物饲料的优选实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与此类肌醇六磷酸酶组合。
抗微生物肽(AMP)的实例为CAP18，LeucocinA，Tritrpticin，Protegrin-1，Thanatin，防卫素(Defensin)，乳铁蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin，和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer,2000)，Plectasin，和抑制素(Statin)，包括WO03/044049和WO 03/048148中公开的化合物和多肽，以及上述的保留抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽，以及其保留抗真菌活性的变体和片段，如WO 94/01459和WO 02/090384中所公开的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18，C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸，二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
反应性氧生成物种的实例是化学品如过硼酸(盐)，过硫酸(盐)或过碳酸(盐)；和多肽如氧化酶、氧合酶或合成酶。
通常脂溶性和水溶性维生素，以及痕量矿物质形成旨在添加至饲料的所谓预混物的一部分，而常量矿物质通常单独地添加至饲料。这些组合物类型之一，当富含本发明的多肽时，是本发明的动物饲料添加剂。
在一个具体实施方案中，本发明的动物饲料添加剂旨在以0.01至10.0%，更具体而言0.05至5.0%；或0.2至1.0%(%意指g添加剂每100g饲料)的水平包括在(或规定为必须包括在)动物饮食或饲料中。对于预混物尤为如此。
下述为这些组分的实例的非排他性列表：
脂溶性维生素的实例是维生素A，维生素D3，维生素E，和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12，生物素和胆碱，维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酸，叶酸和泛酸，例如D-泛酸钙。
痕量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
常量矿物质的实例是钙，磷和钠。
这些组分的营养需求(以禽类和小猪/猪例示)列于WO 01/58275的表A。营养需求意指这些组分应在饮食中以所示的浓度提供。
或者，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种WO 01/58275的表A中指明的单独组分。至少一种意指任一，一种或多种，一种，或两种，或三种，或四种，余此类推至所有十三种，或高至所有十五种单独组分。更具体而言，该至少一种单独组分以下述量包含于本发明的添加剂中，其提供在表A的第四栏，或第五栏，或第六栏中所示的范围内的饲料内浓度。
本发明亦涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对较高含量的蛋白质。禽类和猪饮食可如WO 01/58275的表B，2-3栏中所示表征。鱼饮食可如该表B的4栏中所示表征。此外，此类鱼饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275对应于US 09/779334，其通过提述并入本文。
根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，且进一步包含至少一种如本文中要求保护的多肽。
此外，或或者(对于如上所示的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的可利用的磷的含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施方案中，可代谢的能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量处于WO 01/58275(R.2-5)的表B中范围2、3、4或5中任一内。
粗蛋白计算为氮(N)乘以因子6.25，即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25。该氮含量由凯氏定氮法(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis 14th ed.,Association of Official Analytical Chemists,Washington DC)确定。
可代谢的能量可基于NRC出版物Nutrient requirements in swine,ninthrevised edition 1988,subcommittee on swine nutrition,committee on animalnutrition,board of agriculture,national research council National Academy Press,Washington,D.C.,pp.2-6和the European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs,Spelderholt centre for poultry research and extension,7361 DABeekbergen,The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,Wageningen.ISBN 90-71463-12-5进行计算。
完整动物饮食中钙、可利用的磷和氨基酸的饮食含量基于饲料表如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid envoederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7进行计算。
在一个具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种蛋白质。所述蛋白质可为动物蛋白，如肉和骨粉，和/或鱼粉；或其可为植物蛋白。术语植物蛋白如用于本文中指包含衍生自或来源于植物的至少一种蛋白质的任何化合物、组合物、制备物或混合物，包括修饰的蛋白质和蛋白衍生物。在具体实施方案中，植物蛋白的蛋白含量为至少10，20，30，40，50，或60%(w/w)。
植物蛋白可来源于植物蛋白源，如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae(Legumino sae))，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，和禾本科(Poaceae)植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和菜籽粉。
在一个具体实施方案中，所述植物蛋白源是来自一种或多种豆科植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆(bean)的材料。
在另一个具体实施方案中，所述植物蛋白源是来自一种或多种藜科植物如甜菜，糖甜菜，菠菜或昆诺阿藜(quinoa)的材料。
植物蛋白源的其它实例是菜籽、葵花籽、棉籽和卷心菜。
大豆是优选的植物蛋白源。
植物蛋白源的其它实例为谷类如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米(corn)，稻，黑小麦(triticale)和高粱。
在仍进一步的具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麦；和/或0-70%大麦；和/或0-30%燕麦；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%鱼粉；和/或0-25%肉和骨粉；和/或0-20%乳清。
动物饮食可例如作为糊状饲料(未造粒)或粒状饲料制造。通常，将经磨制的食材混合并根据对于所述物种的规范添加足量的必需维生素和矿物质。多肽可作为固体或液体多肽制剂添加。举例而言，固体多肽制剂通常在混合步骤之前或过程中添加，且液体多肽制备物通常在造粒步骤之后添加。所述多肽亦可并入饲料添加剂或预混物。
饮食中的最终多肽浓度在每kg饮食0.01-200mg多肽蛋白质范围内，例如在每kg动物饮食5-30mg多肽蛋白质的范围内。
本发明的肌醇六磷酸酶应当然地以有效量，即以足以改善饲料溶解和/或改善其营养价值的量施用。目前认为多肽以一种或多种下述量(剂量范围)施用：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10——所有这些范围以每kg饲料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白质的mg数(ppm)表示。
为了确定每kg饲料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白质的mg数，从饲料组合物纯化肌醇六磷酸酶，并使用相关测定法确定纯化的肌醇六磷酸酶的比活性。亦使用相同测定法确定该饲料组合物的肌醇六磷酸酶活性，并基于这两个测量值，计算以每kg饲料的肌醇六磷酸酶蛋白质的mg数计的剂量。
相同原则适用于确定饲料添加剂中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白质的mg数。当然，若可获得用于制备所述饲料添加剂或饲料的肌醇六磷酸酶的样品，则从该样品确定比活性(无需从饲料组合物或添加剂纯化肌醇六磷酸酶)。
产生发酵产物的方法
本发明还有另一个方面涉及产生发酵产物如例如乙醇、啤酒、葡萄酒、蒸馏干酒糟(DDG)的方法，其中发酵在本发明产生的肌醇六磷酸酶的存在下进行。发酵工艺的实例包括，例如WO 01/62947中所述的工艺。发酵使用发酵微生物如酵母进行。
在一个具体实施方案中，本发明提供了产生发酵产物的方法，其包括：(a)在本发明的肌醇六磷酸酶存在下(使用发酵微生物如酵母)发酵含糖材料(例如淀粉)，和(b)从经发酵的含糖材料产生发酵产物。
在一个具体实施方案中，本发明提供了产生乙醇的方法，其包括在本发明的肌醇六磷酸酶的存在下(使用发酵微生物如酵母)发酵含糖材料(例如淀粉)，并从经发酵的含糖材料产生或回收乙醇。
在另一个实施方案中，本发明提供产生乙醇的方法，其包括a)例如通过液化和/或糖化工艺，生淀粉水解工艺来水解淀粉，b)在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵所得的淀粉，和c)产生乙醇。
肌醇六磷酸酶可在任何合适的阶段和以任何合适的组合物添加至发酵过程，包括单独添加或与其它酶如一种或多种α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，蛋白酶和/或纤维素酶组合添加。
在另一个实施方案中，本发明提供产生乙醇的方法，包括水解生物质，并在本发明的肌醇六磷酸酶存在下(使用发酵微生物如酵母)发酵所得的生物质。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案旨在作为对于本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的实施方案包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
在本文中引用了多个文献，其公开内容通过提述以其整体并入。
实施例
使用的化学品为至少试剂级的商品。
实施例1：变体的制备，和活性的确定
肌醇六磷酸酶变体的制备
在米曲霉中表达肌醇六磷酸酶变体
使用包含实施例中的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶变体基因的构建体以构建供曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体组成为基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子融合于构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)的表达盒。质粒上亦存在使作为pyrG-的曲霉能够在基本培养基上生长的来自构巢曲霉的曲霉属选择性标志物pyrG。将曲霉属变体的表达载体如Lassen等(2001),Applied and Environmental Micorbiology，67,4701-4707中所述转化入曲霉。对于每个构建体，分离出4-6个菌株，将其纯化并在微滴定板中培养。表达使用对硝基苯基磷酸底物确定。将最佳生产株在摇瓶中发酵。
布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶变体的纯化
将肌醇六磷酸酶变体的发酵上清通过具有0.22μm截留值的Fast PESBottle顶部滤器进行过滤。将所得的溶液用水稀释至双倍体积，并用乙酸将pH调整至4.5。有时，溶液可变得有些浑浊，这通过经由具有0.22μm截留值的Fast PES Bottle顶部滤器过滤来去除。
在预处理之后，肌醇六磷酸酶变体通过层析在大约30ml于XK26柱中的S Sepharose上，使用50mM乙酸钠pH 4.5作为缓冲液A和50mM乙酸钠+1M NaCl pH 4.5作为缓冲液B来纯化。对于来自柱的级分使用磷酸酶测定法(见下文)分析活性，并汇集具有活性的级分。
在一些情况下，使用具有30kDa截留值的膜的Amicon ultra-15过滤装置浓缩含有纯化的肌醇六磷酸酶变体的溶液。
分子量如根据SDS-PAGE估计，为大约45-50kDa，而纯度为>95%。
表2：变体的设计
Figure GDA00002464555900471
Figure GDA00002464555900491
其中A意指G52C/A99C，B意指N31C/T177C，C意指W46C/Q91C，D意指K141C/V199C，E意指G52C/S162C，F意指N31C/E176C，G意指G59C/F100C，和H意指S162C/S247C；且其中∑a意指在位置114-121用片段TQADTSSR取代片段YQKDEEKN，∑b意指用片段TQADTSSP取代片段YQKDEEKN，∑c意指用片段TQADTSSN取代片段YQKDEEKN，∑d意指用片段TQADTSS取代片段YQKDEEKN；且其中∑KJ意指∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R，∑KU意指∑d/F66L/R94V/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，和∑KK意指∑a/F66L/R94V/T188S/P190T/P207G//S213G/T217A/K336V。
磷酸酶活性的确定
将75微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配于微滴定板例如NUNC 269620的孔中，并添加75微升底物(为了制备底物，将两片5mg对硝基苯基磷酸片(Sigma,Cat.No.N-9389)溶解于10ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.5)。将平板密封，并在37℃以750rpm振荡温育15分钟。在温育时间之后，添加75微升终止试剂(终止试剂为水中的0.1M四硼酸二钠(di-sodiumtetraborate))，并在微滴定板分光光度计中测量在405nm的吸光度。一个磷酸酶单位定义为在给定试样条件下释放1微摩尔磷酸(盐)/分钟(减去缓冲液盲样(blind))的酶活性。1微摩对硝基苯酚的吸光度在测定条件下确定为56AU(AU=吸光度单位)。
肌醇六磷酸酶活性的确定
将75微升适当地稀释于0.25M乙酸钠，0.005%(w/v)Tween-20，pH 5.5的含肌醇六磷酸酶酶溶液分配于微滴定板例如NUC269620的孔中，并添加75微升底物(通过将来自稻米的100mg植酸钠(Aldrich Cat.No.274321)溶解于10ml 0.25M乙酸钠缓冲液pH 5.5来制备)。将平板密封，并在37℃以750rpm振荡温育15分钟。在温育之后，添加75微升终止试剂(终止试剂是通过混合10ml钼酸盐溶液(0.25%(w/v)氨溶液中的10%(w/v)七钼酸铵)、10ml钒酸铵(0.24%来自Bie&Berntsen,Cat.No.LAB17650的商品)，和20ml 21.7%(w/v)硝酸而制备的)，并在微滴定板分光光度计中测量在405nm的吸光度。肌醇六磷酸酶活性以FYT的单位表示，一个FYT为在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸的酶量。测量的肌醇六磷酸酶活性的绝对值可通过参照从无机磷酸的适当稀释准备的标准曲线，或通过参照从具有已知活性的肌醇六磷酸酶制备物(此种具有已知活性的标准酶制备物可应要求从Novozymes A/S,Krogshoejvej 36,DK-2880 Bagsvaerd获得)的稀释制成的标准曲线来获得。
实施例2：比活性
肌醇六磷酸酶变体的比活性根据针对250mM乙酸钠pH 5.5透析的高度纯化的样品确定。事先在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检查纯度，显示仅存在一个组分。
蛋白浓度通过如下所述的氨基酸分析确定：将样品的等分试样在排空的玻璃试管中在110℃在6N HCl，0.1%苯酚中水解16小时。所得的氨基酸使用根据生产商的指示操作的Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统进行定量。从氨基酸的量可计算出水解的等分试样中蛋白质的总质量，由此亦可计算出浓度。
肌醇六磷酸酶活性以如实施例1(“肌醇六磷酸酶活性的确定”)中所述的FYT的单位数确定，而比活性作为以每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白的FYT单位数测量的肌醇六磷酸酶活性进行计算。
实施例3：就温度稳定性进行筛选
菌株和质粒
大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒拯救。
pJCP000是在TPI启动子调控之下的酿酒酵母(S.cerevisiae)和大肠杆菌穿梭载体，从WO 01/92502中所述的pJC039构建，其中已插入了布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶基因。
酿酒酵母YNG318：MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his 4-539用于肌醇六磷酸酶变体表达。其描述于J.Biol.Chem.272(15),pp 9720-9727,1997。
培养基和底物
10X基础溶液：不含氨基酸的Yeast氮基(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH 60g/l。
SC-葡萄糖：20%葡萄糖(即，终浓度2%=2g/100ml))100ml/l，5%苏氨酸4ml/l，1%色氨酸10ml/l，20%酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。将溶液使用孔径0.20微米的滤器灭菌。琼脂和H2O(大约761ml)一同高压灭菌，并将单独灭菌的SC-葡萄糖溶液添加至琼脂溶液。
YPD：Bacto蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20%葡萄糖100ml/l。
PEG/LiAc溶液：40%PEG400050ml，5M乙酸锂1ml。
DNA操纵
除非另行声明，DNA操纵和转化使用如Sambrook等(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor，NY；Ausubel,F.M.等(编)"Current protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编)中所述的分子生物学标准方法进行。
酵母转化
酵母转化通过乙酸锂方法进行。将0.5微升载体(通过限制性内切核酸酶消化)和1微升PCR片段混合。在冰上熔融YNG318感受态细胞。将100微升细胞，DNA混合物和10微升载体DNA(Clontech)在12ml聚丙烯管(Falcon2059)中混合。添加0.6ml PEG/LiAc溶液，并轻柔地混合。在30℃和200rpm温育30分钟。在42℃温育30分钟(热激)。转移至Eppendorf管并离心5秒。去除上清，并溶解于3ml的YPD。将细胞悬液在30℃在200rpm温育45分钟。将悬液倾至SC葡萄糖平板并在30℃温育3日以制成菌落。酵母总DNA通过Nucleic acids research vol.20,No.14(1992)3790中所述的Robzyk和Kassir的方法来提取。
DNA测序
用于DNA测序的大肠杆菌转化通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser)进行。DNA质粒通过碱性方法(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor)或用
Figure GDA00002464555900511
Plasmid Kit制备。将DNA片段从琼脂糖凝胶通过Qiagen gel extraction Kit回收。PCR使用PTC-200 DNA Engine进行。使用ABI PRISMTM 310 GeneticAnalyzer确定所有DNA序列。
肌醇六磷酸酶表达载体的构建
用引物对(CbPhyF和CbPhyR)扩增柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶基因。将所得的PCR片段与用限制性酶消化以去除特异腐质霉角质酶基因的成熟部分的pJC039载体一同导入酿酒酵母YNG318。
CbPhyF(40聚物)
CTCCTGAACTTGTTGCCCGGGAAGAGCAGAACGGAATG
CbPhyR(42聚物)
ATTACATGATGCGGCCCGCGGCCGCCTACTCTGTGACGGCAC
将来自SC-葡萄糖平板上的酵母转化体的质粒(命名为pJCP000)回收，并确定其内部序列以确证肌醇六磷酸酶基因。
构建酵母文库和定位变体
在酵母中的文库和定位变体通过SOE PCR方法(通过重叠延伸的剪接(Splicing by Overlap Extension)，参见“PCR:A practical approach”,p.207-209,Oxford University press,eds.McPherson,Quirke,Taylor)来构建，然后是酵母体内重组。
用于扩增和测序的一般性引物
下述引物用于与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一同通过SOE方法制备含有任何突变的片段的DNA片段，或仅用于扩增完整天冬酰胺酶基因(AM34+AM35)。
AM34    TAGGAGTTTAGTGAACTTGC
AM35    TTCGAGCGTCCCAAAACC
Figure GDA00002464555900521
DNA片段通过Qiagen gel extraction Kit从琼脂糖凝胶回收。将所得的纯化的片段与载体消化物混合。将混合的溶液导入酿酒酵母以构建文库或通过体内重组构建定位变体。
文库筛选(初级膜测定)
将酵母文库用醋酸纤维素膜(上部)和Biodyne C(来自Pall gelman)膜(下部)在SC-葡萄糖平板上在30℃培养至少3天。将BiodyneC膜转移至含有20mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0的预温育的平板，并在一定温度(在WT作为骨架的情况下，50℃)温育1-2小时。
然后，移除膜，并将其浸泡于新鲜底物溶液(10ml 20mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0；0.01gα-萘基磷酸(sigma)；0.02g Fast Garnet GBC(sigma))。从醋酸纤维素膜分离对应于在Biodyne C膜上显出红色的位置的酵母克隆。
文库筛选(次级相对活性选择)
将醋酸纤维素膜上的酵母克隆接种于96孔微滴定板的孔，并在28℃培养3日。将肌醇六磷酸酶活性在37℃和更高温度(60、64、65、70、72℃等)进行测量以确定在一定温度的相对活性。然后选择具有较高相对活性的克隆，并确认其序列。
将标样、水平对照和样品移入MTP或8条管(strip tube) 10μl
添加经预热(50℃)的底物 200μl
将8-条管或MTP置于37、60和64℃(或更高)的MTP培养箱 30min.
取35μl，将其加入100μl终止-络合试剂，并混合5-20秒 35+100μl
在测量之前放置样品 5-30min
OD测量位置 750nm
底物、植酸钠溶液2.0mM (每次)
制备100ml的示例：
植酸钠0.1847g
0.1M乙酸(盐)缓冲液pH4.0至100ml
络合试剂
制备200ml的示例：
FeSO4·7H2O 14.64g
七钼酸铵溶液至200ml
终止-络合试剂
制备600ml终止-络合试剂的示例：
0.5M H2SO4 200ml
络合试剂400ml
七钼酸铵溶液
制备1000ml的示例：
(NH4)6Mo7O24·4H2O 10.0g
硫酸32ml
去离子水至1000ml
结果提供于下。表示相对活性的竖栏提供变体的相对活性，其后为确定使用的参照肌醇六磷酸酶的相对活性。参照为野生型肌醇六磷酸酶。
结果
变体编号 修饰(取代、插入或缺失) 相对活性(100%，在37℃)
65 D/∑KJ 113%，在72℃(WT19%)
变体编号 修饰(取代、插入或缺失) 相对活性(100%，在37℃)
70 D/∑KJ/F66L/T188S/P190T 188%，在72℃(WT19%)
92 D/∑KU/T188S/P190T/P207G 231%，在72℃(WT19%)
99 A/D/∑KK/E182K/K183Q/T185G/K186L 277%，在72℃(WT19%)
100 A/D/∑KK 320%，在72℃(WT19%)
213 A/B/D/∑KK 147%，在72℃(WT19%)
实施例4：通过DSC测量的热稳定性
将布氏柠檬酸杆菌(如实施例1中所述纯化)的蛋白样品的等分试样使用预填充的PD-10柱脱盐并缓冲液交换至20mM乙酸钠pH 4.0，或在4℃在2-3小时步骤中针对2x500ml 20mM乙酸钠pH 4.0透析继以过夜步骤。对样品进行0.45μm过滤，并用缓冲液稀释至大约2A280单位。使用透析缓冲液作为差示扫描量热法(DSC)中的参照。样品使用真空抽吸脱气，并搅拌大约10分钟。
DSC扫描在MicroCal VP-DSC上以1.5℃/分钟的恒定扫描速率从20至90℃进行。数据处理使用MicroCal Origin软件(版本4.10)进行，且变性温度，Td(亦称作熔解温度，Tm)定义为热分析图中峰顶部的温度。
对于布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶变体的DSC结果总结于下表3。
表3：布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的比较性热稳定性
变体 S-S数 Td第一扫描(℃)
布氏柠檬酸杆菌野生型 0 62.0
10=D 1 63.8
36=C 1 65.4
38=B 1 66.8
43=A 1 69.6
115=B/N203S 1 66.6
118=B/N203V 1 64.6
120=A/B 2 72.2
139=A/B/D 3 74.0
65=D/∑KJ 1 68.3
70=D/∑KJ/F66L/T188S/P190T 1 69.8
92=D/∑KU/T188S/P190T/P207G 1 68.0
97=D/∑KK 1 68.8
99=A/D/∑KK/E182K/K183Q/T185G/K186L 2 76.4
变体 S-S数 Td第一扫描(℃)
100=A/D/∑KK 2 76.3
200=D/∑KK/K179N/E182K/K183Q/T185G/K186L 1 67.7
201=D/∑KK/E182K/K183Q/T185G/K186L 1 68.4
212=A/D/6个修饰参见表2 2 68.7
213=A/B/D/∑KK 3 79.4
实施例5：温度概貌
对于布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶和变体在20-90℃的温度范围基本上如上所述(“肌醇六磷酸酶活性的确定”)来确定温度概貌(肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数)。然而，酶反应(100微升含肌醇六磷酸酶酶溶液+100微升底物)在PCR管中而非微滴定板中进行。在所需温度15分钟反应期之后，将管冷却至20℃进行20秒，并将150微升的每种反应混合物转移至微滴定板。添加75微升终止试剂，并在微滴定板分光光度计中测量在405nm的吸光度。结果总结于表4。对于每个温度给出的数值是标准化至最适处的值的相对活性(以%计)。
表4：相对温度概貌
Figure GDA00002464555900551
实施例6：pH概貌
pH概貌如上文段落“肌醇六磷酸酶活性的确定”中所述在2.0至7.5的pH范围为(0.5pH单位步移)中在37℃确定，但是使用缓冲混合液(50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mM Bis-Tris)代替0.25M乙酸钠pH 5.5缓冲液。结果总结于下表5。对于范围2.0-7.5中的每个pH给出的值是标准化至最适处的值的以%计的相对活性。
表5：在37℃的相对pH概貌
Figure GDA00002464555900562
Figure GDA00002464555900571
实施例7：蒸汽稳定性
模型1
在蒸汽处理之后的肌醇六磷酸酶分子的残余活性使用下述测定法评估：
将20μL的每种纯化的酶样品分配于
Figure GDA00002464555900572
96Well(1x 8 StripwellTM)平板(Corning,Lowell,MA,USA)的单个孔中，然后在真空离心机(GenevacEZ-1 Plus,Genevac Ltd,Suffolk,UK)中蒸发至干燥。蒸汽温育在封闭的、具有内部维度27x18x20cm的styropor容器中进行。将在开放条中的样品置于容器底部之上大约10cm的金属架上以免与水接触。
将一升沸水倾入容器，封闭盖子，并使用安装在容器盖子中的温度计监视产生的蒸汽的温度。温育从水倾入容器开始进行90秒。在此期间温度增加至约85℃。紧接着温育之后将样品在冰上冷却，重悬，并使用色度法对硝基苯基磷酸(pNPP)测定法(Sigma,Broendby,DK)对于肌醇六磷酸酶活性进行评估。将每个酶样品与类似的、未经蒸汽处理的样品相比较以计算残余活性。
结果示于下表6和7。
表6：通过方法1确定的蒸汽稳定性。两个或三个数值代表来自两个或三个不同孔的数据。
变体 S-S数 残余活性[%]
布氏柠檬酸杆菌野生型 0 6;11
10=D 1 9
38=B 1 13
43=A 1 26;64
120=A/B 2 57;70;66
139=A/B/D 3 66
100=A/D/∑KK 2 88;77
212=A/D/6个修饰 2 59
213=AB/D/∑KK 3 107;66
方法2
在这些实验中使用修改的设定，其中蒸汽从蒸汽发生器提供并引入盒中。当温度达到时，将置于平板上的样品通过抽屉插入盒中。插入样品时温度立即下降4℃。温育进行60秒，而温度大约保持恒定在90℃。此后将平板从盒迅速取出，并将样品置于冰上。样品如方法1中进行分析。
表7：通过方法2确定的蒸汽稳定性。两个或三个数值代表来自两个或三个不同孔的数据。
变体 S-S数 残余活性[%]
布氏柠檬酸杆菌野生型 0 4;5
10=D 1 10
38=B 1 13
43=A 1 18;16
120=A/B 2 25;50;28
139=A/B/D 3 35
100=A/D/∑KK 2 79;56
212=A/D/6个修饰 2 31
213=A/B/D/∑KK 3 38;45
在上表中，变体如表2中提供的。
实施例8：造粒稳定性测试
造粒稳定性的测量
将大约50g酶颗粒与10kg饲料在小型水平混合器中预混合10分钟。该将该预混物与90kg饲料在较大水平混合器中混合10分钟。将饲料从混合物以大约300kg/小时的速率移至调节器(具有蒸汽注入的级联混合器)。调节器通过注入蒸汽将饲料加热至95℃(在出口测量)。在调节器中的停留时间为30秒。将饲料从调节器移至配有3.0x35mm的水平模具的Simon Heesen的挤压机(press)，并压制成大约15mm长度的团粒。在压制之后，将团粒置于空气冷却器中，并冷却15分钟。
饲料制剂：
Figure GDA00002464555900591
测试1
粉末，其组成为
1.50kg纤维状纤维素，Arbocel BC200
0.75kg糖粘合剂，Avedex W80
11.50kg精细磨碎的硫酸钠
将其在
Figure GDA00002464555900592
混合器FM 50中与组成为下述制粒液一同制粒：
0.75kg糖粘合剂，Avedex W80
2.60kg布氏柠檬酸杆菌野生型肌醇六磷酸酶浓缩物
0.45kg水
制粒是如美国专利号4,106,991，实施例1中所述的方式进行。将获得的颗粒在流化床中干燥至低于1%的水分含量，并筛至获得具有250μm至850μm的颗粒范围的产品。最终，将产物以如美国专利号4,106,991，实施例22中所述的方式用9.5%棕榈油和23.5%碳酸钙涂覆。
测试2
粉末，其组成为：
1.6kg纤维状纤维素，Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂，Avedex W80
12.16kg精细磨碎的硫酸钠
在
Figure GDA00002464555900601
混合器FM 50中与组成为下述的制粒液一同制粒：
0.80kg糖粘合剂，Avedex W80
2.71kg肌醇六磷酸酶变体100浓缩物
0.8kg水
制粒是如美国专利号4,106,991，实施例1中所述的方式进行。将获得的颗粒在流化床中干燥至低于1%的水分含量，并筛至获得具有250μm至850μm的颗粒范围的产品。最终，将产物以如美国专利号4,106,991，实施例22中所述的方式用8.5%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试3
粉末，其组成为：
1.6kg纤维状纤维素，Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂，Avedex W80
12.01kg精细磨碎的硫酸钠
在
Figure GDA00002464555900602
混合器FM 50中与组成为下述的制粒液一同制粒：
0.80kg糖粘合剂，Avedex W80
3.50kg肌醇六磷酸酶变体213浓缩物
0.05kg水
制粒是如美国专利号4,106,991，实施例1中所述的方式进行。将获得的颗粒在流化床中干燥至低于1%的水分含量，并筛至获得具有250μm至850μm的颗粒范围的产品。最终，将产物以如美国专利号4,106,991，实施例22中所述的方式用8%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
将在测试1至测试3中产生的样品在95℃(调节器的出口)的造粒试验中进行测试。在造粒之前和在造粒之后的饲料团粒中使用分析方法EB-SM0559.02版本01(可从Novozymes应要求获得)测量肌醇六磷酸酶含量。发现了下述肌醇六磷酸酶的残余活性：
表8：造粒稳定性
测试 变体 S-S数 肌醇六磷酸酶的残余活性[%]
1 C.B.野生型 0 14
2 100=A/D/∑KK 2 58
3 213=A/B/D/∑KK 3 57
结论是变体与参照测试1相比改善了造粒稳定性。
在上表中，所述变体为如表2中提供的。
实施例9：在动物饲料中的性能和体外模型
将本发明的多种肌醇六磷酸酶变体在动物饲料中的性能在体外模型中与参照蛋白如SEQ ID NO:2的性能相比较。体外模型模拟单胃动物中的胃肠条件，并与在体内动物试验中获得的结果关联良好。本实施例中使用的型式模拟谷物和烤用鸡的胃。比较如下所述进行：
变体样品中的肌醇六磷酸酶活性如实施例1的“肌醇六磷酸酶活性的确定”中所述确定。
将来自烤用鸡饲养试验的饲料团粒(具有玉米、大豆粉和大豆油作为主要成分)在40℃和pH 4.6预温育5分钟，然后加入合适剂量的肌醇六磷酸酶(对于所有待测试的肌醇六磷酸酶使用相同的剂量以允许比较)，例如125至1000肌醇六磷酸酶单位FYT/kg饲料，而在对照样品中加入缓冲液。在温育5分钟之后，添加HCl溶液中的胃蛋白酶(3000U/g饲料)，并以此方式将pH降低至3。然后将样品在40℃再温育5分钟。
终止反应，并提取植酸和肌醇磷酸，即添加HCl至0.5M的终浓度并在40℃温育2小时，然后是一个冻结熔融循环，并在40℃温育1小时。
通过高效离子层析如Chen等于Journal of Chromatography A(2003)vol.1018,pp.41-52中所述分离植酸和肌醇磷酸，并如Skoglund等于J.Agric.FoodChem.(1997),vol.45,pp.431-436中所述对其进行定量。
接着，植酸的降解计算为经肌醇六磷酸酶处理和未经肌醇六磷酸酶处理的样品之间的肌醇-6-磷酸结合的磷(IP6-P)的差异。变体的相对性能计算为由野生型肌醇六磷酸酶降解的植酸的百分比。
肌醇六磷酸酶变体的相对降解(表9)显示所有变体均能够在应用的体外系统中降解肌醇-6-磷酸。某些候选物与野生型相比性能更好(例如变体：38，变体：99，变体：100和变体：213)，而其它在体外并不像野生型那样有效(例如变体：120)。
表11：来自基于大豆/玉米饮食的IP6-P的体外降解。变体的植酸(盐)降解计算为野生型肌醇六磷酸酶的植酸(盐)降解的百分比
Figure GDA00002464555900621
在上表中，变体为如表2中提供的。
实施例10：在猪体内试验中的性能
不同量的布氏柠檬酸杆菌野生型肌醇六磷酸酶和变体对生长中的猪中粪便消化性和磷及钙的排泄的比较评价。
使用六十四头具有43.55±4.35kg起始体重的Large White×Landrace猪。
将动物圈养于环境控制的房间中的地面围栏笼(floor-pen cage)中。每个围栏(pen)具有塑料包裹的焊网底(welded wire floor)，并配制有两个水龙头(waternipple)和四个不锈钢个体化喂食器(individualized feeder)。室内温度为21-22℃，而湿度百分比为50%。
在14日的适应期中，向猪饲喂配制用于排他地从植物来源提供磷(P)的基础饮食。在该期间之后，将其分配至16个相同的组，每组4头动物。
向其饲喂该基础饮食或补充1000或2000U/kg布氏柠檬酸杆菌野生型肌醇六磷酸酶或500、1000或2000U/kg的变体(命名为100，具有两个其它二硫键)的该饮食12日。
将不可消化的示踪剂(氧化铬)以0.4%的浓度添加至所有饮食，使得可以计算P和钙(Ca)的消化性。饲料在围栏饲料消耗控制(pen feed consumptioncontrol)下以糊状(mash)形式任意分配，且动物可自由饮用水。Ca的消化性并未对饮用水造成的Ca摄入进行校正。
在第二期第12日测量粪便中P、Ca和Cr的浓度。粪便取样是在该日期之前最后3日中，在每日相同时间以大约相同量单独进行。因此，对于每种饮食处理和对于每种标准，进行了总共12个个体的确定。所有矿物质根据标准的Association of Official Analytical Chemists (1990)方法使用Vista-MPX ICP-OES分光光度计确定。对于提及的3日期间计算矿物质的表观消化性(摄入的%)。
酶补充动物的平均P粪便浓度与对于摄入对照饮食的动物观察到的相比非常显著地更低(a)。
P消化性具剂量依存性，并在所有补充的组中用两个肌醇六磷酸酶非常显著地改善。最高P消化性在变体100的2000U/kg补充组中观察到(b)。
P的粪便排泄在所有肌醇六磷酸酶补充动物中和对于所有测试的包括水平都显著减少(c)。
最高表观吸收的P在变体100的2000U/kg补充组中观察到(d)。
P当量，其视作消化的补充P与非补充对照相比较，在所有肌醇六磷酸酶补充饮食中与对照相比非常显著地更高(e)。
Ca消化性在所有的测试酶和所有包括水平都改善(f)。
结果示于下表12
表12：对于消化性的参数的残余水平
Figure GDA00002464555900631
Figure GDA00002464555900641
实施例11：计算同一性程度和鉴定相应位置
将SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:2使用来自EMBOSS包版本2.8.0的Needle程序进行比对。使用的取代矩阵为BLOSUM62，缺口开放罚分是10.0，而缺口延伸罚分为0.5。
所得的比对示于图1。
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:2之间的同一性程度如上述计算：准确匹配(所有那些具有垂直线的)的数量是406。最短序列的长度是411(SEQ ID NO:2)。同一性的程度是406/411x100%=98.8%。
图1的比对亦用于如下所述得出相应位置：在该比对中在彼此之上的氨基酸为在相应位置。例如SEQ ID NO:2的位置3的氨基酸Q对应于SEQ ID NO:9的位置编号25的氨基酸P。就本发明的目的而言，我们参照SEQ ID NO:2的位置编号。因此，SEQ ID NO:9可视作SEQ ID NO:2包含取代Q3P的变体。
以比对重叠内的取代形式存在的其它差异见于位置31，121，132和139，参见N31D，N121T，K132T，和Q139K。
其它差异见于N端，其中SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:2相比具有22个氨基酸的延伸。
总体而言，SEQ ID NO:9因此可视作SEQ ID NO:2的下述变体：
*0aM/*0bS/*0cT/*0dF/*0eI/*0fI/*0gR/*0hL/*0iL/*0jF/*0kF/*0mS/*0nL/*0oL/*0pC/*0qG/*0rS/*0sF/*0tS/*0uI/*0vH/*0wA/Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K。
Figure IDA00002464556400011
Figure IDA00002464556400021
Figure IDA00002464556400031
Figure IDA00002464556400041
Figure IDA00002464556400051
Figure IDA00002464556400071
Figure IDA00002464556400081
Figure IDA00002464556400091
Figure IDA00002464556400101
Figure IDA00002464556400111

Claims (36)

1.一种产生变体肌醇六磷酸酶的方法，所述变体肌醇六磷酸酶与SEQ IDNO:2具有至少74%同一性，并与SEQ ID NO:2相比包含至少两个二硫桥联的建立，其中所述两个二硫桥联不属于在如SEQ ID NO:2中规定的编号的位置77/108，133/407，178/187和381/390的四个天然存在的二硫桥联。
2.权利要求1的方法，其中所述至少两个二硫桥联在选自下组位置对的位置建立：A)52/99；B)31/177；C)46/91；D)141/199；E)31/176；F)59/100；和G)162/247。
3.权利要求1或2的方法，其中所述第一二硫桥联在位置52和99的残基之间的位置对A建立。
4.权利要求1-3的方法，其中所述第二二硫桥联在位置31和177的残基之间的位置B建立。
5.权利要求1-4的方法，其中建立的二硫桥联的数量是2，3，4，5，6，和/或7。
6.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是2并使用下述位置对的组合：
A+B，A+C，A+D，A+E，A+F，A+G，B+C，B+D，B+E，B+F，B+G，C+D，C+E，C+F，C+G，D+E，D+F，D+G，E+F，E+G，和F+G，其中A意指52/99，B意指31/177，C意指46/91，D意指141/199，E意指31/176，F意指59/100，而G意指162/247。
7.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是3并使用下述位置对的组合：
A+B+C，A+B+D，A+B+E，A+B+F，A+B+G，A+C+D，A+C+E，A+C+F，A+C+G，A+D+E，A+D+F，A+D+G，A+E+F，A+E+G，A+F+G，B+C+D，B+C+E，B+C+F，B+C+G，B+D+E，B+D+F，B+D+G，B+E+F，B+E+G，B+F+G，C+D+E，C+D+F，C+D+G，C+E+F，C+E+G，C+F+G，D+E+F，D+E+G，D+F+G，和E+F+G，其中A意指52/99，B意指31/177，C意指46/91，D意指141/199，E意指31/176，F意指59/100，而G意指162/247。
8.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是4并使用下述位置对的组合：
A+B+C+D，A+B+C+E，A+B+C+F，A+B+C+G，A+B+D+E，A+B+D+F，A+B+D+G，A+B+E+F，A+B+E+G，A+B+F+G，A+C+D+E，A+C+D+F，A+C+D+G，A+C+E+F，A+C+E+G，A+C+E+H，A+C+F+G，A+D+E+F，A+D+E+G，A+D+F+G，A+E+F+G，B+C+D+E，B+C+D+F，B+C+D+G，B+C+E+F，B+C+E+G，B+C+F+G，B+D+E+F，B+D+E+G，B+D+F+G，B+E+F+G，C+D+E+F，C+D+E+G，C+D+F+G，C+E+F+G，C+E+F+H，和D+E+F+G，其中A意指52/99，B意指31/177，C意指46/91，D意指141/199，E意指31/176，F意指59/100，而G意指162/247。
9.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是5并使用下述位置对的组合：
A+B+C+D+E，A+B+C+D+F，A+B+C+D+G，A+B+C+E+F，A+B+C+E+G，A+B+C+F+G，A+B+D+E+F，A+B+D+E+G，A+B+D+F+G，A+B+E+F+G，A+B+F+G+H，A+C+D+E+F，A+C+D+E+G，A+C+D+F+G，A+C+E+F+G，A+D+E+F+G，B+C+D+E+F，B+C+D+E+G，B+C+D+F+G，B+C+E+F+G，B+D+E+F+G，和C+D+E+F+G，其中A意指52/99，B意指31/177，C意指46/91，D意指141/199，E意指31/176，F意指59/100，而G意指162/247。
10.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是6并使用组合：
A+B+C+D+E+F，A+B+C+D+E+G，A+B+C+D+F+G，A+B+C+E+F+G，A+B+D+E+F+G，A+C+D+E+F+G，和B+C+D+E+F+G，其中A意指52/99，B意指31/177，C意指46/91，D意指141/199，E意指31/176，F意指59/100，而G意指162/247。
11.权利要求1-5任一项的方法，其中建立的二硫桥联的数量是7并使用下述位置对的组合：
A+B+C+D+E+F+G，其中A意指52/99，B意指31/177，C意指46/91，D意指141/199，E意指31/176，F意指59/100，而G意指162/247。
12.权利要求1-11任一项的方法，进一步在选自下组的至少一个位置包含修饰：1，2，3，4，5，6，24，31，35，41，45，46，52，53，55，56，57，59，60，64，66，73，74，75，76，79，80，81，82，83，84，87，90，91，94，100，104，105，106，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，129，130，132，134，136，137，138，139，142，146，148，154，155，157，161，162，164，167，171，173，175，176，177，179，180，181，182，183，184，185，186，188，190，193，196，200，202，203，205，207，211，213，215，217，218，223，231，239，240，241，247，252，254，257，266，273，276，279，280，281，282，283，284，285，286，289，294，299，300，308，314，316，321，324，330，331，336，338，339，340，344，345，348，351，355，361，362，363，364，369，371，372，373，375，379，385，386，392，406，409，410，和411。
13.权利要求12的方法，其包含至少一种下述修饰：1*，1H,K,R,Q，2D，2*，3*，4P，5P，6L，24R,E，31T,K,N，35Y，41P，45R，46D,E，52E,R，53V，Q,K，53V，55D,I，56T，57Y，V，60P，H,K,R，66Y，73D,P，74P，S,Y，A，75T，76G，P，79F，80L，81E，82E，83I，84Y，87T，90V，Y，91P，100Y，104I,A，105F,E，106A,G，107D,E,G，109A,G，111P，114H,N,T，115Q，116A,E,P，T,Q，117D,E,K，118V，I,L,M,T，119G，K,R,S，120K,S,T,Q,R121A,D,M,P，T,V 121I，122D，123P，S，124L,T,V，N126D，K129G 129I,R,P，Q，130K,V，132I，134T 136P，137P，138F，139N，142D，146D，148T 154P，Q,V155F，157F，161P，164D,E，167Q，171T，173P，T 175L，177I，179G，I,K,N,Q，180A,E,G，T，181D,G，I,K,L,S,W 182G，N,R,V，H,K,S,Q，183RA,L,P，S,V，Q，184RT，184*，185A,S，185*，186*，188P，193F，196Q，200K,R，202N,H，203D,E,T,L，205P，207G,S，211C，213A，215M，218Q，223E，231P，239Q，240P，241Q，252H,L，254Y，257E，266M，273L,Q，276K,R，279S，280P，281H，282P，283P，284P，285G，N,R，E285Y，286D,T,K,Q，289P，294T，299L，300V，308A，314G，N，316D，321A，324N，330D，331K，336R，338N，339D，340A,I，343D，344S，345N，348H，351Y，355P，361V，362K,R，I362F，I362L，362M，363R，364Q，369N，371P，373T，375N，379K,R，385D，386I，392I，406A，409D,E，410D,E，和/或411R,K。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中在位置179，180，181，182，183，184，185，和186的氨基酸已由QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV，或KTDKL替代。
15.权利要求1-14任一项的方法，其包含选自下组的修饰的组合：1*/2*，1*/2*/3*，55D/331K，111P/241Q，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L，和114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L。
16.权利要求1-15的方法，其中建立二硫桥联的取代是：
A'.G52C/A99C,
B'.N31C/T177C,
C'.W46C/Q91C,
D'.K141C/V199C，
E'.N31C/E176C，
F'.G59C/F100C，和/或
G'.S162C/S247C。
17.权利要求16的方法，其包括选自下组的进一步修饰：
E1K，E1Q，E2D，M6L，K24E，K24R，D31K，D31N，D35Y，G45R，G52R，E53K，E53V，V55I，S56T，E57V，Q60H，Q60K，Q60R，F66Y，N73D，N73P，N74P，N74S，N74Y，Q75T，T76G，T76P，S79F，P80L，G81E，V83I，A87T，D90V，D90Y，F100Y，L104I，Y114N，E118V，K120R，T121I，T121P，N126D，K129G，M130K，M130V，T132I，S134T，L138F，K139N，N142D，E146D，A148T，L154Q，L154V，Y155F，S173T，T177I，T181I，T181L，T181S，T181W，E182A，E182G，E182H，E182I，E182N，E182R，E182V，K183P，K183R，S184R，S184T，T185A，T185S，L193F，D202H，N203D，N203E，P207S，S211C，S213A，Q252H，Q252L，Q257E，R266M，L279S，E285Y，N286D，N286T，A300V，G321A，K336R，K338N，T340A，T340I，N343D，T344S，D345N，Q348H，D361V，I362F，I362L，I362M，Q363R，P364Q，K369N，A371P，K373T，D375N，S386I和L392I或选自下组的修饰的组合：K24E/Q60H；Q60K/V83I；N126D/T340I；K24E/L392I；F66Y/Y114N；T132I/P364Q；N73P/N74S；N73P/N74P；Q75T/T76G；D202H/N203E；Y155F/T177I；Q252L/Q348H；K24E/N74Y；N126D/L279S；E2D/R266M；E118V/A300V；K24E/S173T；E53K/343D；T76P/S213A；L138F/L193F；Q252L/K373T；G45R/Q257E/N286T；K139N/P207S/R266M；D31N/D35Y/M130V；F100Y/S134T/P207S；T177I/S184R/T185S；E1K/K24E/Q60H；K24E/Q60H/Q363R；T181W/E182N/K183R；T181W/E182H/K183R；T181W/E182R/K183R；T181W/E182A/K183R；A0T/K129G/N286D；E1K/E53K/F66Y；M130K/N203D/L279S；S56T/Q252L/S386I；L154Q/T177I/T344S；K24E/V55I/T181S；K24R/T177I/D345N；G52R/E182G/R266M，A0T/T177I/S184T/T185A，Q60R/F66Y/L104I/I362L，K24E/Q60H/E146D/Q252L，Q60K/T132I/Q257E/N284T，Q60R/D90V/Q252H/T340A，E22D/E57V/N73D/K338N，E1K/M6L/A87T/T121P/I362L，D31N/D35Y/T177I/P207S/R266M，K24E/Q60H/N126D/T132I/T340I，D31N/D35Y//P207S/R266M/K336R，D31N/D35Y/T132I/P207S/R266M，Y114N/T177I/T181L/E182I/K183P，E1Q/S79F/Q252L/I362M/K369N，K24E/Q60H/N73D/D90V/K120R/D361V，D31N/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P，D31K/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/F66Y/M130V/P207S/Q257E/N286T，D31N/D35Y/M130V/E182V/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/M130V/T132I/P207S/R266M/A371P，D31N/D35Y/Q60H/G81E/M130V/P207S/R266M/A371P，K24E/D31N/D35Y/T121I/M130V/L154V/P207S/R266M/A371P，Q60K/F66Y/N74P/Q75T/T76G/V83I/Q252H/Q257E/A371P，Q60K/F66Y/N73P/N74P/Q75T/Q257E/I362L/P364Q/A371P，H(-4)Q/D31N/D35Y/E53V/M130V/A148T/P207S/R266M/Q363R/A371P，Q60K/F66Y/N74P/T76G/Y114N/M130V/Y155F/T340I/I362F/A371P/D375N，D31N/D35Y/F66Y/N73P/N74P//V83I/D90V/Y114N/N126D/N142D/Q252H/T340I/I362L/A371P，D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N73P/P80L//V83I//Y117N/N126D/Y155F/Q252H/Q257E/T340I/A371P，和D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N74P/T76G//V83I/D90V/Y155F/Q252L/G321A/T340I/I362L/A371P。
18.权利要求16的方法，其中产生的肌醇六磷酸酶包含修饰：A/B/K129P，A/B/K129Q，A/B/K129I，A/B/K129R，A/B/P207GA/B/N203L/P207G，A/B/K129R/N203L，A/B/K129R/N203L/P207G，A/B/K24R，A/B/K24R/K129P，A/B/K24R/K129R/N203L/P207G，A/B/K24R/K129R/N203L，A/B/D，A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/L64F/F66L/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252W，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y，
A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252F，
A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y，
A/B/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217A/K336V，
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217A，
A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/T188S/P190T/T217A，
A/D/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/K179N/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/F66L/R94V/∑a/E182N/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R，
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/S213G/T217A/K336R,
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/E196R/S213G/T217A/K336R，
D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R/K393G/R397Q/K400A，
D/∑b/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V，
D/∑c/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A，
D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/N203L/S213G，
D/F66L/R94V/∑d/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V，
D/K116A/E119S/T217A，
D/E1*/E2*/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A，
其中A意指G52C/A99C，B意指N31C/T177C，C意指W46C/Q91C，D意指K141C/V199C，E意指N31C/E176C，F意指G59C/F100C，和G意指S162C/S247C；且其中∑a意指在位置114-211用片段TQADTSSR取代片段YQKDEEKN，∑b意指用片段TQADTSSP取代片段YQKDEEKN，∑c意指用片段TQADTSSN取代片段YQKDEEKN，∑d意指用片段TQADTSS取代片段YQKDEEKN。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9的肌醇六磷酸酶的成熟部分用作供产生肌醇六磷酸酶变体的亲本/骨架。
20.一种由权利要求1-19任一项的任意方法产生的肌醇六磷酸酶变体，其具有改善的热稳定性，改善的温度概貌，改善的pH概貌，改善的比活性，改善的在动物饲料中的性能，和/或并入潜在的蛋白酶切割位点的改变。
21.一种分离的核酸序列，其包含编码权利要求20的肌醇六磷酸酶的核酸序列。
22.一种核酸构建体，其包含权利要求21的核酸序列可操作地连接于一个或多个指导肌醇六磷酸酶在合适的表达宿主中的产生的调控序列。
23.一种重组表达载体，其包含权利要求22的核酸构建体。
24.一种重组宿主细胞，其包含权利要求22的核酸构建体和/或权利要求23的表达载体。
25.一种产生权利要求20的肌醇六磷酸酶的方法，其包括：
(a)培养权利要求24的宿主细胞以产生包含所述肌醇六磷酸酶的上清；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶。
26.一种转基因植物或植物部分，其能够表达权利要求20的肌醇六磷酸酶。
27.一种组合物，其包含至少一种权利要求20的肌醇六磷酸酶，和
(a)至少一种脂溶性维生素；
(b)至少一种水溶性维生素；和/或
(c)至少一种痕量矿物质。
28.权利要求27的组合物，其进一步包含至少一种选自下组的酶：淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，α-半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶和/或β-葡聚糖酶。
29.权利要求27-28任一项的组合物，其为动物饲料添加剂。
30.一种动物饲料组合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并包含权利要求20的肌醇六磷酸酶或权利要求27-29任一项的组合物。
31.一种改善动物饲料营养价值的方法，其中将权利要求20的肌醇六磷酸酶或权利要求27-29任一项的组合物添加至饲料。
32.一种降低动物粪便中植酸水平的方法，其包括用有效量的权利要求30的饲料饲喂动物。
33.一种处理植物蛋白的方法，其包括将权利要求20的肌醇六磷酸酶或权利要求27-30任一项的组合物添加至至少一种植物蛋白或蛋白源的步骤。
34.权利要求20的肌醇六磷酸酶或权利要求28-30任一项的组合物在动物饲料，在动物饲料的制备，在改善动物饲料的营养价值，在减少动物粪便中植酸(盐)水平，在处理植物蛋白，或在从肌醇六磷酸酶底物释放磷中的用途。
35.一种产生发酵产物的方法，其包括(a)在权利要求20的肌醇六磷酸酶存在下使用发酵微生物发酵含糖材料，和(b)从经发酵的含糖材料产生发酵产物或发酵共产物。
36.权利要求35的方法，其中所述发酵产物是乙醇，啤酒，葡萄酒，或蒸馏干酒糟。
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