BR112012023840A2 - métodos para produzir uma variante de fitase, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal e para produzir um produto de fermentação, variante de fitase, sequência de ácidos nucleicos isolada, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, composição, e, uso da fitase ou da composição - Google Patents

métodos para produzir uma variante de fitase, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal e para produzir um produto de fermentação, variante de fitase, sequência de ácidos nucleicos isolada, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, composição, e, uso da fitase ou da composição Download PDF

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Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA VARIANTE DE FITASE, PARA MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, PARA O TRATAMENTO DE PROTEÍNAS VEGETAIS E PARA PRODUZIR UM RPODUTO DE FERMENTAÇÃO, VARIANTE DE FITASE, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADOS, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, PLANTA TRANSGÊNICA, COMPOSIÇÃO, PROCESSO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE FITANO NO ESTERCO ANIMAL, E, USO DA FITASE A presente invenção diz respeito a um método para produzir Variantes de fitase que apresentam pelo menos 74% de identidade com uma fitase derivada de Citrobacter braakii, e compreendem pelo menos duas ligações dissulfeto adicionais comparados a esta fitase. Estas variantes de fitase modificaram, preferivelmente melhoraram, propriedades tais como termoestabilidade, perfil de temperatura, perfil de pH, atividade específica, desempenho na ração animal, menor sensibilidade à protease e/ou um padrão de glicosilação modificado. A invenção também diz respeito aos Variantes produzidos, DNA que codifica estas fitases, métodos de sua produção, bem como o uso destes, por exemplo, na ração animal e em aditivos de ração animal.

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA VARIANTE DE FITASE, PARA
MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, VARIANTE DE FITASE, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADA, 5 CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO, E, USO DA FITASE OU DA COMPOSIÇÃO.”
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível em computador. A forma legível em computador é aqui incorporada pela referência.
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um método de produzir variantes de fitase que apresentam pelo menos 74 % de identidade com uma fitase derivada de Citrobacter braakii ATCC 51113, e compreendem o estabelecimento de pelo menos duas pontes dissulfeto que não estão entre as quatro pontes dissulfeto de ocorrência natural comparadas a estas e fitases muito relacionadas (isto é, é um variante desta). A invenção também diz respeito a DNA que codifica estas fitases, os variantes produzidos, bem como o uso destes, por exemplo, na ração animal e em aditivos de ração animal. A parte madura da fitase de Citrobacter braakii ATCC 51113 é incluída na listagem de sequência as SEQ ID NO:2.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Fundamentos da técnica As fitases são enzimas bem conhecidas, uma vez que é vantajoso a adição das mesmas aos produtos alimentícios para animais, incluindo humanos. As fitases foram isoladas de várias fontes, incluindo

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para produzir uma variante de fitase, caracterizado pelo fato de ter pelo menos 74 % de identidade com SEQ ID NO:2, e compreender o estabelecimento de pelo menos duas pontes dissulfeto 5 comparado à SEQ ID NO:2, em que as ditas duas pontes dissulfeto não estão entre aquelas quatro de ocorrência natural nas posições 77/108, 133/407, 178/187 e 381/390 com a numeração fornecida em SEQ ID NO:2.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas pontes dissulfeto são estabelecidas nas posições selecionadas do grupo que consiste nos pares de posição: A) 52/99; B) 31/177; C) 46/91; D) 141/199; E) 31/176; F) 59/100; e G) 162/247.
3. Método de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato de que o número de pontes dissulfeto estabelecido é dois, usando as seguintes combinações de pares de posição: A+B, A+C, A+D, A+E, A+F, A+G, B+C, B+D, B+E, B+F, B+G, C+D, C+E, C+F, C+G, D+E, D+F, D+G, E+F, E+G, e F+G, em que A significa 52/99; B significa 31/177; C significa 46/91; D significa 141/199; E significa 31/176, F significa 59/100; e G significa 162/247.
4. Método de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato de que o número de pontos dissulfeto estabelecido é três, usando as seguintes combinações de pares de posição: A+B+C, A+B+D, A+B+E, A+B+F, A+B+G, A+C+D, A+C+E, A+C+F, A+C+G, A+D+E, A+D+F, A+D+G, A+E+F, A+E+G, A+F+G, B+C+D, B+C+E, B+C+F, B+C+G, B+D+E, B+D+F, B+D+G, B+E+F, B+E+G, B+F+G, C+D+E, C+D+F, C+D+G, C+E+F, C+E+G, C+F+G, D+E+F, D+E+G, D+F+G, e E+F+G, em que A significa 52/99; B significa 31/177; C significa 46/91; D significa 141/199; E significa 31/176, F significa 59/100; e G significa 162/247.
5. Método de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato de que o número de pontes dissulfeto estabelecido é quatro, usando as seguintes combinações de pares de posição: A+B+C+D, A+B+C+E, A+B+C+F, A+B+C+G, A+B+D+E, A+B+D+F, A+B+D+G, A+B+E+F, A+B+E+G, A+B+F+G, A+C+D+E, 5 A+C+D+F, A+C+D+G, A+C+E+F, A+C+E+G, A+C+E+H, A+C+F+G, A+D+E+F, A+D+E+G, A+D+F+G, A+E+F+G, B+C+D+E, B+C+D+F, B+C+D+G, B+C+E+F, B+C+E+G, B+C+F+G, B+D+E+F, B+D+E+G, B+D+F+G, B+E+F+G, C+D+E+F, C+D+E+G, C+D+F+G, C+E+F+G, C+E+F+H, e D+E+F+G, em que A significa 52/99; B significa 31/177; C significa 46/91; D significa 141/199; E significa 31/176, F significa 59/100; e G significa 162/247.
6. Método de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma modificação em pelo menos uma posição selecionada a partir do seguinte: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 31, 35, 41, 45, 46, 52, 53, 55, 56, 57, 59, 60, 64, 66, 73, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 100, 104, 105, 106, 107, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 129, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 139, 142, 146, 148, 154, 155, 157, 161, 162, 164, 167, 171, 173, 175, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 190, 193, 196, 200, 202, 203, 205, 207, 211, 213, 215, 217, 218, 223, 231, 239, 240, 241, 247, 252, 254, 257, 266, 273, 276, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 300, 308, 314, 316, 321, 324, 330, 331, 336, 338, 339, 340, 344, 345, 348, 351, 355, 361, 362, 363, 364, 369, 371, 372, 373, 375, 379, 385, 386, 392, 406, 409, 410, e 411.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma das seguintes modificações: 1*, 1H,K,R,Q, 2D, 2*, 3*, 4P, 5P, 6L, 24R,E, 31T,K,N, 35Y, 41P, 45R, 46D,E, 52E,R, 53V,Q,K, 53V, 55D,I, 56T, 57Y,V, 60P,H,K,R, 66Y, 73D,P, 74P,S,Y,A, 75T, 76G,P, 79F, 80L, 81E, 82E, 83I, 84Y, 87T, 90V,Y, 91P,
100Y, 104I,A, 105F,E, 106A,G, 107D,E,G, 109A,G, 111P, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118V,I,L,M,T, 119G,K,R,S, 120K,S,T,Q,R 121A,D,M,P,T,V 121I, 122D, 123P,S, 124L,T,V, N126D, K129G 129I,R,P,Q, 130K,V, 132I, 134T 136P, 137P, 138F, 139N, 142D, 146D, 148T 5 154P,Q,V 155F, 157F, 161P, 164D,E, 167Q, 171T, 173P,T 175L, 177I, 179G,I,K,N,Q, 180A,E,G,T, 181D,G,I,K,L,S,W 182G,N,R,V,H,K,S,Q, 183RA,L,P,S,V,Q, 184RT, 184*, 185A,S, 185*, 186*, 188P, 193F, 196Q, 200K,R, 202N,H, 203D,E,T,L, 205P, 207G,S, 211C, 213A, 215M, 218Q, 223E, 231P, 239Q, 240P, 241Q, 252H,L, 254Y, 257E, 266M, 273L,Q, 276K,R, 279S, 280P, 281H, 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, E285Y, 286D,T,K,Q, 289P, 294T, 299L, 300V, 308A, 314G,N, 316D, 321A, 324N, 330D, 331K, 336R, 338N, 339D, 340A,I, 343D, 344S, 345N, 348H, 351Y, 355P, 361V, 362K,R, I362F, I362L, 362M, 363R, 364Q, 369N, 371P, 373T, 375N, 379K,R, 385D, 386I, 392I, 406A, 409D,E, 410D,E, e/ou 411R,K.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos na posição 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 foram substituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV, ou KTDKL..
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de modificações selecionadas das seguintes: 1*/2*, 1*/2*/3*, 55D/331K, 111P/241Q, 179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*, 179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*, 179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*, 179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*, 114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L, e 114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as substituições para estabelecer as pontes dissulfeto são: A’: G52C/A99C, B’: N31C/T177C, C’: W46C/Q91C, 5 D’: K141C/V199C, E’: N31C/E176C, F’: G59C/F100C, e/ou G’: S162C/S247C.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação adicional selecionada das seguintes: E1K, E1Q, E2D, M6L, K24E, K24R, D31K, D31N, D35Y, G45R, G52R, E53K, E53V, V55I, S56T, E57V, Q60H, Q60K, Q60R, F66Y, N73D, N73P, N74P, N74S, N74Y, Q75T, T76G, T76P, S79F, P80L, G81E, V83I, A87T, D90V, D90Y, F100Y, L104I, Y114N, E118V, K120R, T121I, T121P, N126D, K129G, M130K, M130V, T132I, S134T, L138F, K139N, N142D, E146D, A148T, L154Q, L154V, Y155F, S173T, T177I, T181I, T181L, T181S, T181W, E182A, E182G, E182H, E182I, E182N, E182R, E182V, K183P, K183R, S184R, S184T, T185A, T185S, L193F, D202H, N203D, N203E, P207S, S211C, S213A, Q252H, Q252L, Q257E, R266M, L279S, E285Y, N286D, N286T, A300V, G321A, K336R, K338N, T340A, T340I, N343D, T344S, D345N, Q348H, D361V, I362F, I362L, I362M, Q363R, P364Q, K369N, A371P, K373T, D375N, S386I e L392I ou uma combinação de modificações selecionada do grupo que consiste de: K24E/Q60H; Q60K/V83I; N126D/T340I; K24E/L392I; F66Y/Y114N; T132I/P364Q; N73P/N74S; N73P/N74P; Q75T/T76G; D202H/N203E; Y155F/T177I; Q252L/Q348H; K24E/N74Y; N126D/L279S; E2D/R266M; E118V/A300V; K24E/S173T; E53K/N343D; T76P/S213A; L138F/L193F; Q252L/K373T; G45R/Q257E/N286T; K139N/P207S/R266M; D31N/D35Y/M130V; F100Y/S134T/P207S; T177I/S184R/T185S; E1K/K24E/Q60H;
K24E/Q60H/Q363R; T181W/E182N/K183R; T181W/E182H/K183R; T181W/E182R/K183R; T181W/E182A/K183R; A0T/K129G/N286D; E1K/E53K/F66Y; M130K/N203D/L279S; S56T/Q252L/S386I; L154Q/T177I/T344S; K24E/V55I/T181S; K24R/T177I/D345N; 5 G52R/E182G/R266M, A0T/T177I/S184T/T185A, Q60R/F66Y/L104I/I362L, K24E/Q60H/E146D/Q252L, Q60K/T132I/Q257E/N284T, Q60R/D90V/Q252H/T340A, E22D/E57V/N73D/K338N, E1K/M6L/A87T/T121P/I362L, D31N/D35Y/T177I/P207S/R266M, K24E/Q60H/N126D/T132I/T340I, D31N/D35Y//P207S/R266M/K336R, D31N/D35Y/T132I/P207S/R266M, Y114N/T177I/T181L/E182I/K183P, E1Q/S79F/Q252L/I362M/K369N, K24E/Q60H/N73D/D90V/K120R/D361V, D31N/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P, D31K/D35Y/M130V/P207S/R266M/A371P, D31N/D35Y/F66Y/M130V/P207S/Q257E/N286T, D31N/D35Y/M130V/E182V/P207S/R266M/A371P, D31N/D35Y/M130V/T132I/P207S/R266M/A371P, D31N/D35Y/Q60H/G81E/M130V/P207S/R266M/A371P, K24E/D31N/D35Y/T121I/M130V/L154V/P207S/R266M/A371P, Q60K/F66Y/N74P/Q75T/T76G/V83I/Q252H/Q257E/A371P, Q60K/F66Y/N73P/N74P/Q75T/Q257E/I362L/P364Q/A371P, H(- 4)Q/D31N/D35Y/E53V/M130V/A148T/P207S/R266M/Q363R/A371P, Q60K/F66Y/N74P/T76G/Y114N/M130V/Y155F/T340I/I362F/A371P/D375 N, D31N/D35Y/F66Y/N73P/N74P//V83I/D90V/Y114N/N126D/N142D/Q252H/ T340I/I362L/A371P, D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N73P/P80L//V83I//Y117N/N126D/Y155F/Q252H/ Q257E/T340I/A371P, e D31N/D35Y/Q60K/F66Y/N74P/T76G//V83I/D90V/Y155F/Q252L/G321A/T 340I/I362L/A371P.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a fitase produzida compreende as modificações: A/B/K129P, A/B/K129Q, A/B/K129I, A/B/K129R, A/B/P207GA/B/N203L/P207G, A/B/K129R/N203L, 5 A/B/K129R/N203L/P207G, A/B/K24R, A/B/K24R/K129P, A/B/K24R/K129R/N203L/P207G, A/B/K24R/K129R/N203L, A/B/D, A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S2 13G/T217A/K336V, A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V, A/D/L64F/F66L/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A, A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252W, A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y, A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252F, A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A, A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V, A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V/Q252Y, A/B/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A, A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217 A/K336V, A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/N121R/T188S/P190T/S213G/T217 A, A/D/R94V/K116A/E118T/E119S/K120S/T188S/P190T/T217A, A/D/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V, D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V, A/D/F66L/R94V/∑a/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S2 13G/T217A/ K336V, A/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V, D/F66L/R94V/∑a/K179N/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207 G/S213G/T217A/ K336V,
D/F66L/R94V/∑a/E182N/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213 G/T217A/K336V, D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R, D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/S213G/T217A/K33 5 6R, D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/E196R/S213G/T21 7A/K336R, D/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336R/K393G/R397Q/ K400A, D/∑b/E182K/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A/K336V, D/∑c/K183Q/T185G/K186L/S213G/T217A, D/F66L/∑b/E182R/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/N203L/S213G, D/F66L/R94V/∑d/E182K/K183Q/T185G/K186L/T188S/P190T/P207G/S213 G/T217A/K336V, A/D/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A, A/B/D/F66L/R94V/∑a/T188S/P190T/P207G/S213G/T217A/K336V, D/K116A/E119S/T217A, D/E1*/E2*/R94V/K116A/E119S/T188S/P190T/T217A, em que A significa G52C/A99C, B significa N31C/T177C, C significa W46C/Q91C, D significa K141C/V199C, E significa N31C/E176C, F significa G59C/F100C, e G significa S162C/S247C; e em que ∑a significa a substituição do fragmento TQADTSSR pelo fragmento YQKDEEKN nas posições 114-121, ∑b significa a substituição do fragmento TQADTSSP pelo fragmento YQKDEEKN, ∑c significa a substituição do fragmento TQADTSSN pelo fragmento YQKDEEKN, ∑d significa a substituição do fragmento TQADTSS pelo fragmento YQKDEEKN.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a parte madura da fitase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:9 é usada como um parente/cadeia principal para produzir um variante de fitase.
14. Variante de fitase, caracterizada pelo fato de que é produzido por quaisquer dos métodos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, com uma melhor termoestabilidade, um melhor perfil 5 de temperatura, um melhor perfil de pH, melhor atividade específica, melhor desempenho na ração animal e/ou que incorpora uma mudança de um sítio de clivagem de protease potencial.
15. Sequência de ácidos nucleicos isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a fitase como definida na reivindicação 14.
16. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 15, operavelmente ligada a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção da fitase em um hospedeiro de expressão adequado.
17. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 16.
18. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 16, e/ou o vetor de expressão como definido na reivindicação
17.
19. Método para produzir a fitase como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 18 para produzir um sobrenadante compreendendo a fitase; e (b) recuperar a fitase.
20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 14, e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura;
(b) pelo menos uma vitamina solúvel em água; e/ou (c) pelo menos um mineral traço.
21. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos uma 5 enzima selecionada dos seguintes grupos de enzimas: amilase, fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, protease, fosfolipase e/ou beta-glucanase.
22. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que a fitase como definida na reivindicação 14 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20-21 são adicionadas à ração.
23. Uso da fitase como definida na reivindicação 14 ou da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20-21, caracterizado pelo fato de que é na ração animal; na preparação de ração animal; para melhorar o valor nutricional de ração animal; para reduzir os níveis de fitase no esterco animal; para o tratamento de proteínas vegetais; ou para liberar fósforo de um substrato de fitase.
24. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fermentar, usando um microrganismo fermentador, um material contendo carboidrato na presença de uma fitase como definida na reivindicação 14, e (b) produzir o produto de fermentação ou coproduto de fermentação a partir do material contendo carboidrato fermentado.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é etanol, cerveja, vinho, ou grãos de destilação secos (DDG).
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