KR20230050402A

KR20230050402A - 피타제 변이체 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20230050402A
Application number: KR1020237008331A
Authority: KR
Inventors: 예스퍼 빈드; 라르스 코베뢰에 스코프; 헹샤오 자이; 치안 장; 에스터 산티고사; 호세-오타비오 소르바라; 아우렐리아 앤 캐서린 샬롯 선; 캐리 루이즈 워크
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 2020-08-13
Filing date: 2021-08-13
Publication date: 2023-04-14
Also published as: EP4196575A1; MX2023001397A; BR112023002578A2; AU2021324389A1; JP2023537982A; WO2022034211A1; CL2023000385A1; CA3189083A1; PE20231568A1; US20220049230A1

Abstract

본 발명은 피타제 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물, 벡터 및 숙주 세포; 및 변이체의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

피타제 변이체 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

서열목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다.

원자 좌표에 대한 참조

본 출원은 도 5에 피타제 변이체(phytase variant)(var400)의 3차원 구조의 원자 좌표를 제시한다.

기술분야

본 발명은 피타제 변이체, 이 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이 변이체를 제조하는 방법, 및 이 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

피타제는 널리 알려진 효소이며, 인간을 포함하여 동물을 위한 식량에 피타제를 첨가하는 것의 이점도 널리 알려져 있다. 피타제는 많은 진균 및 박테리아 균주를 포함하여 다양한 공급원으로부터 단리되었다.

본 발명의 목적은 피타제 활성을 갖는 대안적인 폴리펩티드(피타제) 및 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 피타제 변이체는 모체 피타제에 비해서 변형된 또는 변경된, 바람직하게는 개선된 특성을 나타낸다. 본 발명의 이러한 특성의 비제한적인 예는 안정성(예컨대, 산-안정성, 열-안정성 및/또는 증기 안정성, 펠릿화 안정성 및/또는 프로테아제 안정성, 특히 펩신 안정성), 온도 프로파일, pH 프로파일, 특정 활성, 물질 특이성, 동물 사료에서의 성능(예컨대, 개선된 피테이트 방출 및/또는 분해), 당화에 대한 민감성 및/또는 당화 패턴)이다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 피타제를 암호화하는 모체 폴리뉴클레오티드의 돌연변이생성을 사용하여 모체 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 피타제에 비해서 개선된 특성을 갖는 피타제를 암호화하는 변이체(합성) DNA를 제조한다.

시트로박터(Citrobacter)

시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii) 균주로부터의 phyA 유전자의 서열은 Zinin 등에 의해서 EMBL/GenBank/DDBJ 데이터베이스에 수탁 번호 AY390262로 제출되었다. 상응하는 피타제 아미노산 서열은 UniProt/TrEMBL 데이터베이스에 수탁 번호 Q676V7로 발견된다. Q676V7의 추정된 성숙 부분은 서열번호 4로서 본 서열목록에 포함된다.

WO-2004/085638(Republic of National Fisheries Research and Development Institute of Korea)에는 서열번호 7로서 KCCM 10427로서 기탁된 시트로박터 브라키(Citrobacter braakii) YH-15로부터의 피타제의 아미노산 서열이 개시되어 있다. 이러한 아미노산 서열의 서열 부분은 본 명세서에서 서열번호 3으로서 포함된다. 이 서열은 수탁 번호 ADU50737로 Geneseqp 데이터베이스에서 발견된다.

WO 2006/037328(Novozymes A/S)에는 시트로박터 브라키의 야생형 피타제 ATCC 51113(즉, 본 명세서에서 서열번호 2), 뿐만 아니라 이의 변이체가 개시되어 있으며, 이는 또한 즉 서열번호 6으로서 본 서열 목록에 포함된다.

WO 2006/038062 및 WO 2006/038128(Danisco A/S) 둘 다에는 수탁 번호 NCIMB 41247 하에 기탁된 시트로박터 프레운디 P3-42의 피타제 유전자의 아미노산 서열 및 다수의 이의 변이체가 개시된다. 이러한 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열번호 9로 포함된다. 이들 출원에는 233번 위치에서 시스테인으로의 단지 하나의 치환(S233C)이 개시되어 있는데 본 명세서에서 사용된 넘버링에 따르면 이것은 S211C일 것이다. WO 2006/038062 및 WO 2006/038128의 내용은 동일해 보인다.

WO 2007/112739(Novozymes A/S)에는 모체로서 시트로박터 브라키 ATCC 51113 피타제를 사용한 예시와 함께 상당한 수의 피타제 변이체가 개시되어 있다. WO 2007/112739는 특히 이황화물 다리의 생성을 나타낸다.

WO2011/117396(Novozymes A/S)에는 분자에 2개 이상의 이황화물 다리를 도입함으로써 변이체로서 시트로박터 브라키 ATCC 51113 피타제를 사용한 예시와 함께 추가적인 피타제 변이체가 개시되어 있다.

본 발명은 일 양태에서 52번 위치와 99번 위치, 31번 위치와 177번 위치, 그리고 141번 위치와 199번 위치 사이에 이황화물 다리를 형성하기 위해서, 서열번호 2와 비교할 때 변경(alteration) N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C를 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134,138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 추가로 포함하는 서열번호 2와 적어도 70% 동일성을 갖는 피타제 변이체에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖지만 100% 미만의 동일성을 갖고, 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C+N203L을 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134,138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 추가로 포함하고, 피타제 활성을 갖는 피타제 변이체에 관한 것이다.

추가 양태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, 피타제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다:

a) 서열번호 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

b) 서열번호 14와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

c) 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

d) 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및

e) 서열번호 20과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드.

전형적으로 상기 폴리펩티드는 하기 특성 중 하나 이상을 포함하도록 pH 안정적이고 열안정적이다:

i. 적어도 75℃의 pH 4에서의 언폴딩(unfolding) 온도;

ii. 적어도 70℃의 pH 3에서의 언폴딩 온도; 및

iii. 적어도 55℃의 pH 2에서의 언폴딩 온도.

대안적으로 정의하면, 상기 폴리펩티드는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 각각에서 24시간 후에 90% 초과의 잔류 활성을 유지하도록 산 안정적이다.

또한, 본 발명은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물, 벡터 및 숙주 세포; 및 변이체의 생성 방법에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 피타제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(a) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서:

a. 서열번호 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

b. 서열번호 15와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

c. 서열번호 17과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

d. 서열번호 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

e. 서열번호 21과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

폴리뉴클레오티드가 발현되고, 폴리펩티드가 생성되는, 배양하는 단계;

(b) 선택적으로 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및

(c) 선택적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계.

본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은,

(a) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서:

a. 서열번호 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100 동일성을 갖는 폴리펩티드;

b. 서열번호 14와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100 동일성을 갖는 폴리펩티드;

c. 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100 동일성을 갖는 폴리펩티드;

d. 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및

e. 서열번호 20과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

(b) 선택적으로 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및

(c) 선택적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명의 변이체를 포함하는 조성물, 특히 동물 사료 조성물, 및 동물 사료의 영양값(nutritional value)을 개선시키고/시키거나; 동물 거름에서 피테이트 수준을 감소시키고/시키거나; 식물성 단백질을 처리하고/하거나; 피테이트 기질로부터 인을 유리시키고/시키거나; 동물의 체중 증가를 증가시키고/시키거나, 비성장률(specific growth rate)을 개선시키고/시키거나 사료 요구율을 개선시키기 위한 이러한 조성물의 용도; 또는 동물에서 영양소 보유율(nutrient retention) 및 영양소 소화율(nutrient digestibility)을 개선시키기 위한 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

서열 목록의 간단한 설명

서열 목록에서 서열에 하기와 같이 적용한다:

서열번호 1은 시트로박터 브라키 ATCC 51113으로부터의 피타제의 폴리뉴클레오티드 서열(WO 2006/037328)을 나타낸다.

서열번호 2는 시트로박터 브라키 ATCC 51113으로부터의 피타제의 폴리펩티드 서열(WO 2006/037328)을 나타낸다.

서열번호 3은 시트로박터 브라키 YH-15로부터의 피타제의 폴리펩티드 서열(WO-2004/085638)을 나타낸다.

서열번호 4는 시트로박터 프레운디로부터의 피타제의 폴리펩티드 서열(UniProt/TrEMBL 수탁 번호 Q676V7)을 나타낸다.

서열번호 5는 서열번호 2의 변이체(18은 Xaa이고, 323은 Xaa임)를 나타낸다.

서열번호 6은 서열번호 2의 변이체(18은 Gly이고, 323은 Pro임)를 나타낸다.

서열번호 7은 시트로박터 브라키 ATCC 51113 신호 펩티드를 나타낸다.

서열번호 8은 시트로박터 브라키 ATCC 51113 프로-펩티드를 나타낸다.

서열번호 9는 시트로박터 프레운디 NCIMB 41247로부터의 피타제의 폴리펩티드 서열(WO 2006/038062 및 WO 2006/038128)을 나타낸다.

서열번호 10은 var300이라는 명칭의 서열번호 2의 변이체의 성숙 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

서열번호 11은 뉴클레오티드 11에서 뉴클레오티드 1351까지의 암호 서열(CDS)을 갖는 서열번호 10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 12는 var400이라는 명칭의 서열번호 2의 변이체의 성숙 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

서열번호 13은 뉴클레오티드 11에서 뉴클레오티드 1351까지의 CDS를 갖는 서열번호 12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 14는 var404라는 명칭의 서열번호 2의 변이체의 성숙 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

서열번호 15는 뉴클레오티드 11에서 뉴클레오티드 1351까지의 CDS를 갖는 서열번호 14를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 16은 var405라는 명칭의 서열번호 2의 변이체의 성숙 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

서열번호 17은 뉴클레오티드 11에서 뉴클레오티드 1351까지의 CDS를 갖는 서열번호 16을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 18은 var406이라는 명칭의 서열번호 2의 변이체의 성숙 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

서열번호 19는 뉴클레오티드 11에서 뉴클레오티드 1351까지의 CDS를 갖는 서열번호 18을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 20은 var411이라는 명칭의 서열번호 2의 변이체의 성숙 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

서열번호 21은 뉴클레오티드 1에서 뉴클레오티드 1341까지의 CDS를 갖는 서열번호 20을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 22는 프로테아제의 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

도 1은 서열번호 2의 피타제 및 서열번호 9의 피타제의 정렬의 예를 나타낸다.
도 2는 실험 동안 사료 소비율(feed consumption ratio: FR) 및 체중(body weight: BW) 증가를 나타낸다.
도 3은 뼈(bone) P 보유 샘플링에 대한 도식을 도시한다.
도 4는 급여(feed) 91일 후 상이한 실험 처리로부터의 물고기의 혈장에서 인을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD(표준 편차)로 제시된다. 유의한 처리(p<0.05)는 상이한 문자로 나타낸다.
도 5는 피타제 변이체(var400)의 3차원 구조의 원자 좌표를 제시한다. 이들 원자 좌표는 피타제 변이체(var400)의 구조를 도시한 3차원 모델 및 상동성 구조, 예컨대, 상기에 언급된 피타제 변이체의 3차원 모델을 생성하는 데 도움을 줄 수 있다.

개선된 고유 온도 및 pH 안정성 및 개선된 효소 단위(FYT)당 생체내 효능을 포함하는 개선된 특성을 갖는 피타제가 본 명세서에 기재되어 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이러한 유형의 개선은 생성물 제형의 유연성 및 결과적으로 이러한 유연성으로 인한 비용 절감을 허용할 뿐만 아니라, 피테이트 및 항-영양 인자의 개선된 제거, 인, 칼슘 및 미오-이노시톨의 개선된 유리 및 인의 소화율 증가, 미오-이노시톨 유리에 의한 근육 단백질 부착 개선 및 개선된 지속 가능성을 위한 P 배설 최소화를 제공한다.

본 발명은 일 양태에서 52번 위치와 99번 위치, 31번 위치와 177번 위치, 그리고 141번 위치와 199번 위치 사이에 이황화물 다리를 형성하기 위해서, 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C를 포함하는 서열번호 2와 적어도 70% 동일성을 갖는 피타제 변이체에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 동일성을 갖고, 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C를 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134,138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 추가로 포함하는 피타제 변이체에 관한 것이며, 피타제 변이체는 피타제 활성을 갖는다.

변이체

본 발명은 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134,138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 변경을 추가로 포함하는 피타제 변이체를 제공하며, 피타제 변이체는 피타제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 변경은 치환이다.

일 실시형태에서, 변이체는 모체 피타제의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이되, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다.

또 다른 실시형태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.

일 양태에서, 본 발명의 변이체는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L 및 추가 변경을 포함하고, 본 발명의 변이체에서 추가 변경의 수는 1 내지 30개, 예를 들어, 1 내지 20개, 1 내지 10개 및 1 내지 5개, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 변경을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 변이체는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 57, 73, 121, 134, 155, 207 및 273에 상응하는 위치에 하나 이상의 치환을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 변이체는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 57, 73, 121, 134, 155, 207 및 273에 상응하는 위치에 2개 이상의 치환, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 치환을 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 변이체는 57번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 57번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 바람직하게는 Tyr로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 E57Y를 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 73번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 바람직하게는 Pro으로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 N73P를 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 121번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 바람직하게는 Pro으로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 N121P를 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 134번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val, 바람직하게는 Gln으로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 S134Q를 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 155번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 155번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, 또는 Val, 바람직하게는 Phe으로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 Y155F를 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 207번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 207번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val, 바람직하게는 Thr으로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 P207T를 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 273번 위치에 상응하는 위치에 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 273번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val, 바람직하게는 Leu으로 치환된다. 또 다른 양태에서, 변이체는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 M273L을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57번 및 73번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57 및 121번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57번 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73 및 121번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73 및 121번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121 및 134번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 및 155번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 155, 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 155, 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 207, 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134, 155, 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134, 155, 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 121, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 155 및 207번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 155 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 121, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 73, 121, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 양태에서, 변이체는 57, 73, 121, 134, 155, 207 및 273번 위치에 상응하는 위치, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 위치에 변경을 포함하거나 이로 이루어진다.

또 다른 양태에서, 변이체는 30Q, 36A, 43C, 46C, 57Y, 60H, 64Q, 73P, 79Q, 119P, 121P, 123C, 130T,C, 134Q, 138A, 151S, 155F, 161T, 162A, 176P, 180N, 184Q, 190T, 207T, 224Q, 230E, 243N, 273L, 286S, 336R, 340L,P, 358Q 및 375K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상(예를 들어, 몇몇) 치환을 포함하고 이루어진다.

또 다른 양태에서, 변이체는 K30Q, Q36A, P43C, W46C, E57Y, Q60H, L64Q, N73P, S79Q, E119P, N121P, P123C, M130T,C, S134Q, L138A, N151S, Y155F, S161T, S162A, N168R, E176P, T180N, S184Q, P190T, P207T, E224Q, Q230E, R243N, M273L, N286S, K336R, T340L,P, D358Q 및 D375K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상(예를 들어, 몇몇) 치환을 포함하고 이루어진다.

또 다른 양태에서, 변이체는 치환을 포함하거나 이로 이루어진다.

바람직한 실시형태에서, 변이체는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함하고, 피타제 활성을 갖는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 추가로 변이체는 57, 73, 121, 134, 155, 207 및 273, 바람직하게는 57Y, 73P, 121P, 134Q, 155Y, 207T 및 273L번 위치에 치환을 포함하고; 추가로 30, 36, 43, 46, 60, 64, 79, 119, 123, 130, 138, 151, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 224, 230, 243, 286, 336, 340, 358 및 375번 위치 중 하나 이상에 하나 이상의 치환을 포함한다.

변이체가 서열번호 2와 비교할 때 치환 P43C를 포함하는 경우, 치환 W46C를 또한 포함하는 것이 바람직하다. 변이체가 서열번호 2와 비교할 때 치환 W46C를 포함하는 경우, 치환 P43C를 또한 포함하는 것이 바람직하다. 변이체가 서열번호 2와 비교할 때 치환 P123C를 포함하는 경우, 치환 M130C를 또한 포함하는 것이 바람직하다. 변이체가 서열번호 2와 비교할 때 치환 M130C를 포함하는 경우, 치환 P123C를 또한 포함하는 것이 바람직하다.

아미노산 변화는 부수적인 특성, 즉 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 유의미하게 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 전형적으로 1개 내지 30개 아미노산의, 소규모 결실; 소규모 아미노- 또는 카복실-말단 연장, 예컨대, 아미노-말단 메티오닌 잔기; 최대 20개 내지 25개 잔기의 소규모 링커 펩티드; 또는 순(net) 전하 또는 또 다른 기능을 변화시킴으로써 정제를 촉진하는 소규모 연장, 예컨대, 폴리-히스티딘 지대(tract), 항원성 에피토프 또는 결합 도메인일 수 있다.

보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 소형 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌) 그룹 내에 있다. 일반적으로 비활성(specific activity)을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 문헌[H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York]에 기재되어 있다. 일반적 치환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly이다.

대안적으로, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 물리-화학적 특성이 변경되는 특성을 갖는다. 예를 들어, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 열 안정성을 개선하고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적 pH를 변화시키는 등의 작용을 할 수 있다.

폴리펩티드에서 필수 아미노산은 당분야에 알려진 절차, 예컨대, 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라 확인될 수 있다(Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 후자의 기법에서는, 단일 알라닌 돌연변이가 분자 내의 모든 잔기에 도입되며, 생성 돌연변이체 분자가 피타제 활성에 대해 시험되어 분자의 활성에 중추적인 아미노산 잔기를 확인한다. 또한, 문헌[Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708]을 참조. 효소 또는 다른 생물학적 상호작용의 활성 부위는 또한 추정 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께, 핵 자기 공명, 결정측정, 전자 회절, 또는 광친화도 표지화와 같은 기법에 의해 결정되는 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; [Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904]; [Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64] 참조. 필수적인 아미노산의 정체는 또한 관련 폴리펩티드와의 정렬로부터 추정될 수 있다.

피타제 변이체(var400)의 결정 구조는 1.33 Å의 분해능으로 해석되었다. 이러한 구조의 원자 좌표는 도 5에 제시되어 있다. 이러한 원자 좌표는 피타제 변이체(var400) 또는 상동성 구조(예컨대, 본 발명의 추가의 변이체)의 구조를 도시하는 3차원 모델을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 3차원 구조는, 도입된 돌연변이의 분자 결과를 나타내고, 그것은 52번 위치와 99번 위치, 31번 위치와 177번 위치, 및 141번 위치와 199번 위치 사이에 이황화물 다리가 형성된다는 것을 확인해준다.

일 실시형태에서, 변이체는 모체 효소에 비해서 저장 조건 하에서 개선된 안정성을 갖는다.

일 실시형태에서, 변이체는 모체 효소에 비해서 개선된 열안정성을 갖는다.

서열번호 2와 비교하여 하기 치환을 갖는 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 변이체의 예:

피타제 폴리펩티드, 동일성 백분율

본 문맥에서 피타제는 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드, 즉, 피테이트(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)의 (1) 미오-이노시톨 및/또는 (2) 이의 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 및/또는 펜타-포스페이트 및 (3) 무기 포스페이트로의 가수분해를 촉매하는 효소이다.

본 발명의 내용에서 용어 피테이트 기질은 즉, 피트산 및 임의의 피테이트(피트산의 염), 뿐만 아니라 상기 (2) 하에 열거된 포스페이트를 포함한다.

인터넷에서 ENZYME 사이트(http://www.expasy.ch/enzyme/)는 효소의 명칭에 대한 정보의 리포지터리이다. 이것은 주로 문헌[the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB)]의 권장 사항을 기반으로 하며, 이것은 EC(효소 위원회) 번호가 제공된 각각의 유형의 특징규명된 효소를 설명한다(문헌[Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305]). 또한 문헌[handbook Enzyme Nomenclature from NC-IUBMB, 1992)] 참조.

ENZYME 사이트에 따르면, 3개의 상이한 유형의 피타제가 알려져 있다: 소위 3-피타제(대안 명칭 1-피타제; 미오-이노시톨 헥사포스페이트 3-포스포히드롤라제, EC 3.1.3.8), 소위 4-피타제(대안 명칭 6-피타제, 1D-넘버링이 아닌 1L-넘버링 시스템에 기초한 명칭, EC 3.1.3.26) 및 소위 5-피타제(EC 3.1.3.72). 본 발명의 목적을 위해서, 3개 유형 모두가 피타제의 정의에 포함된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 산 히스티딘 포스파타제의 과에 속하며, 이는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) pH 2.5 산 포스파타제(유전자 appA) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergilllus awamorii) 피타제 A 및 B (EC: 3.1.3.8)(유전자 phyA 및 phyB)와 같은 진균 피타제를 포함한다. 히스티딘 산 포스파타제는 서열 유사성의 두 영역을 공유하며, 이들 각각은 보존된 히스티딘 잔기 주변에 집중된다. 이들 두 히스티딘은 효소의 촉매 기전에 포함되는 것으로 보인다. 제1 히스티딘은 N-말단 부분에 위치하고 포스포-히스티딘 중간체를 형성하는 한편, 제2 히스티딘은 C-말단 부분에 위치하고 가능하게는 양성자 공여자로서 작용한다.

추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 보존된 활성 부위 모티프, 즉, R-H-G-X-R-X-P을 가지며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 지정한다(서열번호 2, 3, 4, 6의 아미노산 16 내지 22 및 서열번호 9의 아미노산 38 내지 44 참조). 바람직한 실시형태에서, 보존된 활성 부위 모티프는 R-H-G-V-R-A-P이고, 즉, 아미노산 16 내지 22(서열번호 2)는 RHGVRAP이다.

본 발명의 목적을 위해서, 피타제 활성은 FYT의 단위로 결정되며, 1 FYT는 하기 조건 하에서 분당 1 마이크로-몰의 무기 오르토-포스페이트를 유리시키는 효소의 양이다: pH 5.5; 온도 37℃; 기질: 0.0050㏖/ℓ 농도의 피트산나트륨(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂). 적합한 피타제 검정은 WO 00/20569의 실시예 1에 기재된 FYT 및 FTU 검정이다. FTU는 사료 및 프리믹스 내의 피타제 활성을 결정하기 위한 것이다. 또한 피타제 활성은 실시예 1의 검정을 사용하여 결정할 수 있다("포스파타제 활성의 결정" 또는 "피타제 활성의 결정").

특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 단리된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된"은 SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같이, 적어도 20% 순수한, 바람직하게는 적어도 40% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 60% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 보다 가장 바람직하게는 적어도 95% 순수한 폴리펩티드를 지칭한다. 특히, 폴리펩티드가 "본질적으로 순수한 형태"로 존재하는 것, 즉, 폴리펩티드 제제에 본래 회합된 다른 폴리펩티드 물질이 본질적으로 존재하지 않는 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어, 널리 알려진 재조합 방법의 수단에 의해 또는 전통적 정제 방법에 의해 폴리펩티드를 제조함으로써 달성될 수 있다.

2개의 아미노산 서열간의 관련성은 매개변수 "동일성"에 의해 기재된다. 본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 정렬은 EMBOSS 패키지(http://emboss.org) 버전 2.8.0으로부터의 Needleman 프로그램을 사용하여 결정된다. Needle 프로그램은 문헌[Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453]에 기재된 글로벌 정렬 알고리즘을 구현한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 오프닝 페널티는 10이고, 갭 연장 페널티는 0.5이다.

본 발명의 아미노산 서열("본 발명의 서열")과 청구범위에서 지칭되는 아미노산 서열(서열번호 2) 간의 동일성 정도는 2개의 서열의 정렬의 정확한 매치의 수를, "본 발명의 서열"의 길이 또는 서열번호 2의 길이(둘 중 가장 짧은 것)로 나눈 값으로서 계산된다. 결과는 동일성 백분율로 표현된다.

정확한 매치는 "본 발명의 서열" 및 서열번호 2가 동일한 중첩 위치에 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우에 발생한다(하기 정렬 예에서 이것은 "|"로 표현됨). 서열의 길이는 서열에서 아미노산 잔기의 수이다(즉, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 411의 길이는 411임).

WO2011/117396에서 실시예 11은 서열번호 2의 피타제 및 서열번호 9의 피타제의 정렬의 예이고, 이 예는 이들 두 골격 간의 동일성 백분율을 계산하는 방법을 예시한다.

하기 또 다른 순전히 가설적인 정렬 예에서, 중첩은 서열 1의 아미노산 서열 "HTWGER-NL"; 또는 서열 2의 아미노산 서열 "HGWGEDANL"이다. 이러한 예에서 갭은 "-"로 제시된다.

가설적인 정렬 예:

특정 실시형태에서, 서열번호 2와 또는 이에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열의 동일성 백분율은 i) BLOSUM62 치환 매트릭스, 갭 오프닝 페널티 10 및 갭 연장 페널티 0.5와 함께 Needle 프로그램을 사용하여 2개의 아미노산 서열을 정렬하고; ii) 정렬에서 정확한 매치의 수를 계수하고; iii) 정확한 매치의 수를 2개의 아미노산 서열 중 가장 짧은 것의 길이로 나누고, iv) iii)의 나눗셈의 결과를 백분율로 변환함으로써 결정된다.

상기 가설적인 예에서, 정확한 매치의 수는 6이고, 2개의 아미노산 서열 중 가장 짧은 것의 길이는 12이고; 따라서 동일성 백분율은 50%이다.

본 발명의 피타제의 특정 실시형태에서, 서열번호 2의 동일성 정도는 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%이다. 더 추가의 특정 실시형태에서, 동일성 정도는 적어도 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 적어도 99.9%이다. 대안적인 실시형태에서, 동일성 정도는 적어도 70%, 71%, 72% 또는 적어도 73%이다.

더 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이하 또는 10개 이하의 변형(modification); 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 이하 또는 20개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29개 이하 또는 30개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39개 이하 또는 40개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49개 이하 또는 50개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이하 또는 60개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69개 이하 또는 70개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79개 이하 또는 80개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89개 이하 또는 90개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99개 이하 또는 100개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109개 이하 또는 110개 이하의 변형; 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119개 이하 또는 120개 이하의 변형; 또는 서열번호 2 또는 임의의 다른 모체 피타제와 비교할 때 121, 122, 123 또는 124개 이하의 변형을 갖는다.

본 발명의 일 양태는 피타제 활성을 갖고 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다:

c) 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및

d) 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및

바람직하게는, 폴리펩티드는 시트로박터 브라키로부터 얻거나 얻을 수 있다.

흥미로운 양태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, 피타제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이고:

e) 서열번호 20과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

폴리펩티드는 하기 특성 중 하나 이상을 포함하도록 pH 안정적이고 열안정적이다:

i. 적어도 75℃의 pH 4에서의 언폴딩(unfolding) 온도;

ii. 적어도 70℃의 pH 3에서의 언폴딩 온도; 및

iii. 적어도 55℃의 pH 2에서의 언폴딩 온도.

추가로 흥미로운 양태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, 피타제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이고:

b) 서열번호 14와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 98% 동일성, 적어도 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

c) 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

상기 폴리펩티드는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 각각에서 24시간 후에 90% 초과의 잔류 활성을 유지하도록 산 안정적이다.

전형적으로, 폴리펩티드는 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C를 포함한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함한다. 보다 전형적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134, 138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 포함한다.

위치 넘버링

아미노산 위치를 정의하기 위해서 본 명세서에서 사용되는 명명법은 시트로박터 브라키 ATCC 51113로부터 유래된 피타제의 아미노산 서열에 기초하는데, 이의 성숙 서열은 서열번호 2로서 열거된 서열(서열번호 2의 아미노산 1 내지 411)에 제공된다. 따라서, 본 문맥에서, 위치를 넘버링하기 위한 기초는 E1에서 시작하여 E411으로 끝나는 서열번호 2이다.

본 명세서에서 사용되는 경우, 용어 "성숙"은 유전 장비의 일부로서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포에 의해서 분비되는 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 다시 말해서, 성숙 폴리펩티드 부분은 신호 펩티드 부분뿐만 아니라 존재하는 경우 프로펩티드가 절단된 후에 남아있는 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 신호 펩티드 부분은 당업계에 공지된 프로그램에 의해서 예측될 수 있다(예를 들어, SignalP). 서열번호 2의 예측된 신호 펩티드 부분은 서열번호 7에 의해서 암호화된 서열번호 8로서 열거된 현재 서열에 포함된다. 서열번호 2는 예측된 성숙 부분이다. 일반적으로, 효소의 성숙 부분의 제1 아미노산은 정제된 효소의 N-말단 서열측정에 의해서 결정될 수 있다. 그 다음 신호 펩티드 부분과 성숙 부분 간의 임의의 차이는 프로펩티드의 존재로 인한 것이어야 한다.

변형, 예컨대, 치환, 결실, 삽입

피타제 변이체는 주형(즉, 참조 또는 비교 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 2)에 비해서 다양한 유형의 변형을 포함할 수 있다: 아미노산은 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고; 아미노산은 결실될 수 있고; 아미노산은 삽입될 수 있고; 뿐만 아니라 임의의 수의 이러한 변형의 임의의 조합일 수 있다. 본 문맥에서, 용어 "삽입"은 또한 N- 및/또는 C-말단 연장을 포함하도록 의도된다.

단일 변형을 위해 본 명세서에서 사용되는 일반적인 명명법은 다음과 같다: XDcY, 여기서 "X" 및 "Y"는 독립적으로 1문자 아미노산 암호 또는 "*"(아미노산의 결실)를 지정하고, "D"는 수를 지정하고, "c"는 알파벳순 카운터(a, b, c 등)를 지정하는데, 이것은 삽입에만 존재한다. 이 명명법을 다양한 유형의 변형에 적용하는 순전히 가설적인 예를 설명하는 아래 표를 참조한다.

[표]

상기에서 설명한 바와 같이 위치 번호("D")는 서열번호 2의 첫 번째 아미노산 잔기부터 계수된다.

동일한 순서의 몇몇 변형은 "/"(슬래시)로 구별되고, 예를 들어, "1*/2*/3*"의 표기는 1, 2 및 3번 위치의 아미노산이 모두 결실되었음을 의미하고, "104A/105F" 표기는 104번 위치의 아미노산이 A에 의해서 치환되고, 그리고 105번 위치의 아미노산은 F로 치환된다는 것을 의미한다.

다른 변형은 ","(쉼표)로 구별되고, 예를 들어, "119R,K"의 표기는 119번 위치의 아미노산이 R 또는 K로 치환된다는 것을 의미한다.

다양한 다른 가능성 열거에서 본 명세서에서 사용된 쉼표는 이것이 일반적으로 문법적으로 수행하는 것, 즉, 보통 및/또는을 의미한다. 예를 들어, 목록 "53V,Q, 121D 및/또는 167Q"의 첫 번째 쉼표는 대안(V 또는 Q)을 나타내는 반면, 다음 두 개의 쉼표는 및/또는 옵션으로 해석되어야 한다: 53 V 또는 Q, 및/또는 121D, 및/또는 167Q.

본 문맥에서 "적어도 하나"(예를 들어, 변형)는 하나 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형; 또는 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28, 또는 30개의 변형 등, 그리고 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개의 최대 수까지의 변형. 그러나 본 발명의 피타제 변이체는 여전히 서열번호 2와 적어도 74% 동일해야 하고, 이 백분율은 상기에서 기재된 바와 같이 결정된다.

무엇을 치환시키거나 연장시킬지에 대해서 어떠한 표시도 없는 치환 또는 연장은 주형에서 이 위치를 차지하는 아미노산을 제외한 임의의 자연 또는 비천연 아미노산의 삽입을 지칭한다.

상응하는 위치 번호의 식별

상기에서 설명한 바와 같이, 시트로박터 브라키 ATCC 51113(서열번호 2)의 성숙 피타제는 위치 번호 넘버링에 대한 표준으로 사용되며, 따라서 명명법에도 사용된다.

또 다른 피타제, 특히 본 발명의 피타제 변이체의 경우, 서열번호 2의 위치 D에 상응하는 위치는 "피타제 폴리펩티드, 동일성 백분율"이라는 제목의 섹션에 명시된 바와 같이 두 서열을 정렬하여 찾는다. 정렬로부터, 서열번호 2의 위치 D에 상응하는 본 발명의 서열 내의 위치는 명확하고 모호하지 않게 식별될 수 있다(정렬에서 서로 위에 있는 2개의 위치).

본 발명의 도 1은 서열번호 2의 피타제와 서열번호 9의 피타제의 정렬의 예이며, 이 예는 이들 두 골격에서 상응하는 위치를 식별하는 방법을 예시한다.

제3 열에 두 서열의 다수의 정렬을 포함하는 상기 표에서 유래된 하기 일부 추가적인 순전히 가설적인 예가 포함되어 있다.

상기 표의 제1 행에서 제3 셀을 고려하기 바란다. 위의 서열은 주형이고 아래는 변이체이다. 위치 번호 80은 주형의 아미노산 잔기 G를 지칭한다. 아미노산 A는 변이체 내의 상응하는 위치를 차지한다. 따라서 이 치환은 G80A로 지정된다.

이제 상기 표의 제2 행에서 제3 셀을 고려하기 바란다. 다시 위의 서열은 주형이고 아래는 변이체이다. 다시 위치 번호 80은 주형의 아미노산 잔기 G를 지칭한다. 변이체는 주형에 2개의 삽입 즉, G80 이후 그리고 V81 이전의 TY를 갖는다. 물론 T와 Y는 변이체 아미노산 서열에서 그 자신의 "실제" 위치 번호를 갖지만, 본 목적을 위해서 본 발명자들은 항상 주형 위치 번호를 참조하므로 T 및 Y는 각각 위치 번호 80a 및 80b에 존재한다고 한다.

마지막으로, 상기 표의 마지막 행에서 제3 셀을 고려하기 바란다. 위치 번호 275는 주형의 마지막 아미노산을 지칭힌다. ST의 C-말단 연장은 각각 위치 번호 275a 및 275b에 존재한다고 하지만, 물론 이들은 변이체 아미노산 서열에서 그 자신의 "실제" 위치 번호를 갖는다.

변형된 특성, 참조 피타제

특정 실시형태에서, 피타제 변이체를 생성하기 위한 본 발명의 방법은 변형된, 바람직하게는 개선된 특성을 갖는 변이체를 제공한다.

용어 "변형된" 및 "개선된"은 다른 피타제와의 비교를 의미한다. 이러한 다른, 참조 또는 비교 피타제의 예는 서열번호 2 및 서열번호 6이다. 참조 피타제의 추가 예는 서열번호 3 및/또는 서열번호 4일 수 있다. 참조 피타제의 더 추가의 다른 예는 서열번호 9 및 이의 변이체일 수 있다.

변형된, 바람직하게는 개선된 특성의 비제한적 예는 다음과 같다: 열안정성, pH 프로파일, 비활성, 동물 사료에서의 성능, 펠릿화 안정성, 프로테아제 민감성 및/또는 글리코실화 패턴. 본 발명의 방법에 의해 생성된 피타제 변이체는 개선된 열안정성을 나타내고 또한 변형된, 바람직하게는 개선된 온도 프로파일을 가질 수 있고/있거나 잠재적인 프로테아제 절단 부위의 변화를 포함할 수 있다.

열 성능

온도-안정성

온도 안정성은 WO2011/117396, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 60℃ 이상의 온도에서 30분 인큐베이션 동안 활성을 결정하고, 37℃에서 수행된 참조 실험과 비교함으로써 결정될 수 있다.

열안정성

열안정성은 WO2011/117396, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 즉, DSC 측정을 사용하여 정제된 피타제 단백질의 변성 온도, Td를 결정하기 위해서 결정될 수 있다. Td는 단백질의 열안정성을 나타낸다: Td가 높을수록 열안정성이 높다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 참조 피타제의 Td보다 높은 Td를 가지며, 여기서 Td는 정제된 피타제 샘플에서 결정된다(바람직하게는 SDS 페이지에 의해서 결정되는 순도가 적어도 90% 또는 95%임).

열-안정성

열 안정성은 WO2011/117396, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 변이체 피타제의 온도/활성 프로파일을 결정함으로써 결정될 수 있다.

증기 안정성

증기 안정성은 WO 2011/117396, 실시예 7에 기재된 바와 같이, 단시간 동안 85℃또는 90℃에서 증기 처리 후 피타제 분자의 잔류 활성을 결정함으로써 결정될 수 있다.

펠릿화 안정성

펠릿 안정성은 사료와 미리 혼합된 효소 과립을 사용하여 WO 2001/117396, 실시예 8에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 이 프리믹스를 사료와 혼합한다. 혼합기로부터 공급물을 증기로 95℃까지 컨디셔닝한다. 컨디셔닝 후 사료를 펠릿으로 압착시키고 잔류 활성을 결정한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 피타제의 잔류 활성, Td 또는 기타 매개변수에 의해서 제공되는 바와 같은 열적 안정성, 예컨대, 열-안정성, 온도 안정성, 열안정성, 증기 안정성 및/또는 펠릿화 안정성은 서열번호 2의 피타제의 상응하는 값, 예컨대, 잔류 활성 또는 Td보다 더 높고, 보다 바람직하게는 이의 적어도 101%, 또는 적어도 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109% 또는 적어도 110%이다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 피타제의 잔류 활성 또는 Td와 같은 매개변수의 값은 서열번호 2의 피타제에 대한 값의 적어도 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 또는 적어도 190%이다.

더 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 열안정성 피타제는 실시예에 기재된 바와 같이(즉, 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.0에서) 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 결정된 바와 같은 적어도 50℃의 용융 온도, Tm(또는 변성 온도, Td)을 갖는다. 더 추가의 특정 실시형태에서, Tm은 적어도 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62.5. 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 적어도 100℃이다. DSC 측정은 또한 실시예에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

온도 프로파일/온도 안정성

본 발명의 피타제가 참조 피타제와 비교할 때 변형된 온도 프로파일을 갖는지 갖지 않는지는 WO 2011/117396, 실시예 5에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 참조 피타제와 비교할 때 변형된 온도 프로파일을 갖고, 온도 프로파일은 pH 5.5에서 20 내지 90℃의 온도 범위(10℃ 단계)에서 피트산나트륨에 대한 온도의 함수로서의 피타제 활성으로서 결정된다. 바람직한 완충제는 0.25 M Na-아세테이트 완충제 pH 5.5이다. 각각의 온도에서 활성은 바람직하게는 최적의 온도에서의 값에 정규화된 상대 활성(% 단위)으로 제시된다. 최적 온도는 활성이 최대인 시험 온도 이내의 온도이다(즉, 5 내지 10℃ 점프를 갖는 것).

동물 사료에서의 성능

특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 참조 피타제와 비교할 때 동물 사료에서 개선된 성능을 갖는다. 동물 사료에서의 성능은 시험관내 모델에 의해서 결정될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 동물 사료에서 개선된 성능을 갖고, 성능은, 1 ㎏ 사료당 5 g 칼슘의 농도로 CaCl₂가 첨가된 30% 대두박 및 70% 옥수수분으로 구성된 사료 샘플을 제조하는 단계; 이것을 40℃ 및 pH 3.0에서 30분 동안 사전 인큐베이션시킨 후 펩신(3000 U/g 사료) 및 피타제를 첨가하는 단계; 샘플을 40℃ 및 pH 3.0에서 60분 동안 그 다음 pH 4.0에서 30분 동안 인큐베이션시키는 단계; 반응을 중단시키는 단계; 0.5 M의 최종 농도까지 HCl을 첨가하고, 40℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후 1회의 동결-해동 주기를 거치게 하고, 40℃에서 1시간 인큐베이션시킴으로써 피트산 및 이노시톨-포스페이트를 추출하는 단계; 고성능 이온 크로마토그래피에 의해서 피트산 및 이노시톨-포스페이트를 분리시키는 단계; 잔류 피테이트 인(IP6-P)의 양을 결정하는 단계; 피타제-처리된 샘플과 피타제 처리되지 않은 블랭크 샘플 사이의 잔류 IP6-P의 차이(이 차이는 분해된 IP6-P임)를 계산하는 단계; 및 참조 피타제의 분해된 IP6-P에 대해서 본 발명의 피타제의 분해된 IP6-P를 표현하는 단계에 의해서 시험관내 모델로 결정된다.

본 발명의 피타제 및 참조 피타제는 바람직하게는 피타제 활성 단위(phytase activity unit: FYT)에 기초하여 동일한 양으로 투여된다. 적합한 투여량은 100 내지 5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏이다. 피타제는 정제된 피타제의 형태 또는 발효 상청액의 형태로 투여될 수 있다. 정제된 피타제는 SDS-PAGE에 의해서 결정되는 경우 바람직하게는 적어도 95%의 순도를 갖는다.

바람직한 실시형태에서, 참조 피타제의 분해된 IP6-P 값에 대한 본 발명의 정제된 피타제의 분해된 IP6-P 값은 적어도 101% 또는 적어도 102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115% 또는 적어도 120%이다. 더 추가의 바람직한 실시형태에서, 참조 피타제의 분해된 IP6-P 값에 대한 본 발명의 정제된 피타제의 분해된 IP6-P 값은 적어도 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 적어도 200%이다. 바람직하게는, 서열번호 2 피타제의 분해된 IP6-P 값에 대한 본 발명의 정제된 피타제의 분해된 IP6-P 값은 적어도 105%, 110%, 113%, 115%, 120%, 125% 또는 적어도 130%이다.

본 발명의 피타제의 상대 성능은 또한 참조 피타제에 의해서 방출된 인의 백분율로서 결정될 수 있다.

더 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제의 상대 성능은 참조 피타제에 의해서 방출된 인의 양에 대한, 본 발명의 피타제에 의해서 방출된 인의 백분율로서 계산될 수 있다.

더 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 피타제의 상대 성능은 적어도 105%, 바람직하게는 적어도 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200%이다.

증기 안정성

열안정성은 중요한 매개변수이지만 이와 관련하여 증기 안정성이 또한 중요하다. 이와 관련하여 WO 2011/117396, 실시예 8을 참조한다.

낮은-알레르기 유발 변이체

특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 사람을 포함하여 동물에 노출되었을 때 감소된 면역 반응을 일으키도록 설계된 낮은-알레르기 유발 변이체이다. 용어 면역 반응은 피타제 변이체에 노출되는 동물의 면역계에 의한 임의의 반응으로 이해될 것이다. 면역 반응 중 한 형태는 노출된 동물에서 IgE 수준 증가를 일으키는 알레르기 반응이다. 낮은-알레르기 유발 변이체는 당업계 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 피타제 변이체는 면역 반응에 포함되는 피타제 변이체의 중합체 모이어티 차폐 부분 또는 에피토프와 접합될 수 있다. 중합체와의 접합은 예를 들어, WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, 및/또는 WO 99/00489에 기재된 바와 같이 피타제 변이체에 대한 중합체의 시험관내 화학적 커플링을 포함할 수 있다. 여기에 추가로 또는 대안적으로 접합은 피타제 변이체에 대한 중합체의 생체내 커플링을 포함할 수 있다. 이러한 접합은 피타제 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 조작, 피타제 변이체에서 추가 글리코실화 부위를 암호화하는 공통 서열의 삽입 및 피타제 변이체를 글리코실화할 수 있는 숙주에서 피타제 변이체의 발현에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어, WO00/26354를 참조한다. 낮은-알레르기 유발 변이체를 제공하는 또 다른 방식은 폴리펩티드가 자가-올리고머화하도록 피타제 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 조작인데, 이는 피타제 변이체 단량체가 다른 피타제 변이체 단량체의 에피토프를 차단하여 올리고머의 항원성을 저하시킬 수 있도록 작용한다. 이러한 산물 및 이들의 제조는 예를 들어, WO96/16177에 설명되어 있다. 면역 반응에 포함되는 에피토프는 WO 00/26230 및 WO 01/83559에 설명된 파지 디스플레이 방법과 같은 다양한 방법 또는 EP 561907에 설명된 랜덤 접근법에 의해 식별될 수 있다. 일단 에피토프가 식별되면, 그것의 아미노산 서열을 변경하여 부위 지정 돌연변이생성과 같은 공지된 유전자 조작 기술에 의해 피타제 변이체의 변경된 면역 특성을 생성할 수 있고/있거나(예를 들어, WO 00/26230, WO 00/26354 및/또는 WO00/22103 참조) 중합체의 접합은 중합체를 위해 에피토프에 충분히 근접하게 수행하여 에피토프를 차단할 수 있다.

조류당 1일 BW 증가(BW 증가) 및 사료 요구율(feed conversion ratio: FCR)

조류당 1일 체중 증가(BW 증가) 및 사료 요구율(FCR)을 하기와 같이 계산하였다:

조류당 체중 증가: 연구 완료와 연구 시작 시 조류당 BW 간의 차이

1일 BW 증가: 연구 연료와 연구 시작 시 새당 BW 간의 차이를 일수로 나눈 값

FCR: 우리(pen)의 총 사료 소비량을 해당 우리의 총 BW 증가로 나눈 값(총 BW 증가 = 완료 시 총 BW + 제거 및 손실 중량 - 시작 시 총 BW).

핵산 서열 및 작제물

본 발명은 또한 본 발명의 피타제 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열에 관한 것이다.

본 발명의 양태는 하기 단계를 포함하는 피타제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다:

d. 서열번호 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(b) 선택적으로 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및

(c) 선택적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계.

대안의 양태는 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

a. 서열번호 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

b. 서열번호 14와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

c. 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

d. 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및

(b) 선택적으로 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및

(c) 선택적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계.

전형적으로, 본 발명의 방법에서, 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함한다. 보다 전형적으로, 폴리펩티드는 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134, 138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 추가로 포함한다.

용어 "단리된 핵산 서열"은 다른 핵산 서열이 본질적으로 존재하지 않는, 예를 들어, 아가로스 전기영동에 의해서 결정되는 경우 적어도 약 20% 순수한, 바람직하게는 적어도 약 40% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 순수한 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 핵산 서열은 유전 공학에서 사용되는 표준 클로닝 절차에 의해 핵산 서열을 이의 자연 위치에서 이것이 복제될 다른 위치로 재배치함으로써 얻어질 수 있다. 클로닝 절차는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 원하는 핵산 단편의 절제 및 단리, 벡터 분자 내로의 단편의 삽입 및 숙주 세포로의 재조합 벡터의 혼입을 포함할 수 있고, 숙주 세포에서 핵산 서열의 다중 카피 또는 클론이 복제될 것이다. 핵산 서열은 게놈 폴리뉴클레오티드, cDNA 또는 RNA이거나, 반합성 또는 합성되어 유래된 폴리뉴클레오티드들, 또는 이것들의 임의의 조합물일 수 있다.

본 발명의 핵산 서열은 적어도 하나의 돌연변이를 주형 피타제 암호 서열 또는 이의 하위서열에 도입함으로써 제조될 수 있으며, 여기서 돌연변이 핵산 서열은 변이체 피타제를 암호화한다. 또 다른 뉴클레오티드 대신 하나의 뉴클레오티드를 교환하기 위해 핵산 서열 내에 돌연변이를 도입하는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이생성에 의해서, 랜덤 돌연변이생성에 의해서, 도핑되거나, 스파이킹되거나, 국재화된 무작위 돌연변이생성에 의해서 달성될 수 있다.

무작위 돌연변이생성은 적합하게는 해당 또는 전체 유전자 내에 제시된 아미노산 서열로 번역하는 유전자의 적어도 3개의 부분에서의 국재화된 또는 영역-특이적 무작위 돌연변이생성으로서 적합하게 수행된다. 돌연변이생성이 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해서 수행되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 변화될 위치에서 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 3개의 비-모체 뉴클레오티드로 도핑되거나 스파이킹될 수 있다. 도핑 또는 스파이킹은 원하지 않는 아미노산을 피하기 위해서 수행될 수 있다. 도핑 또는 스파이킹 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, PCR, LCR 또는 적절하다고 여겨지는 임의의 DNA 폴리머라제 및 리가제를 사용하여 임의의 기술에 의해서 피타제 효소를 암호화하는 DNA에 혼입될 수 있다.

바람직하게는, 도핑은 "불변 무작위 도핑"을 사용하여 수행되고, 여기서 각각의 위치에서 야생형 및 돌연변이의 백분율이 미리 한정된다. 추가로, 도핑은 특정 뉴클레오티드의 도입에 대한 선호에 대한 것일 수 있어서, 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입이 선호된다. 도핑은 각각의 위치에서 예를 들어, 90 % 야생형 및 10% 돌연변이의 도입을 허용하기 위해서 만들어질 수 있다. 도핑 계획의 선택에서 추가적인 고려는 유전적뿐만 아니라 단백질-구조 제약조건에 기초한다.

무작위 돌연변이생성은 해당 모체 피타제의 부분에 유리하게 국재화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 효소의 특정 영역이 효소의 주어진 특성에 대해 특히 중요한 것으로 확인된 경우 유리할 수 있다.

본 발명의 변이체를 제공하기 위한 대안적인 방법은 예를 들어, WO 95/22625 또는 WO 96/00343에 기재된 바와 같은 유전자 셔플링 및 EP 897985에 기재된 바와 같은 공통 유도체화를 포함한다.

핵산 작제물

핵산 작제물은 제어 서열과 상용성인 조건 하에 적합한 숙주 세포에서 암호 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함한다. 발현은 비제한적으로 전사, 전사-후 개질, 번역, 번역-후 개질 및 분비를 포함하는, 폴리펩티드의 생산에 관여되는 임의의 단계를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "핵산 작제물은"는 자연 발생 유전자로부터 단리되거나 또는 자연계에 달리 존재하지 않을 방식으로 핵산의 분절을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 지칭한다. 용어 핵산 작제물은 핵산 작제물이 본 발명의 암호 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유하는 경우 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.

본 명세서에서 용어 "제어 서열"은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 본 명세서에서 정의된다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 동질적이거나 이질적일 수 있다. 이러한 제어 서열은 비제한적으로 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결자를 포함한다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 제어 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호 영 역과 제어 서열의 결찰을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입할 목적으로 링커와 함께 제공될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제어 서열이 폴리펩티드의 암호 서열의 발현을 지시하도록 폴리뉴클레오티드 서열의 암호 서열에 대하여 적절한 위치에 위치한 형태를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 경우 때 용어 "암호 서열"은 그것의 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 명시하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 암호 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 의해 결정되며, 이는 보통 ATG 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈, 예컨대, GTG 및 TTG로 시작한다. 암호 서열은 DNA, cDNA, 또는 재조합 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

발현 벡터

용어 "발현"은 비제한적으로 전사, 전사-후 개질, 번역, 번역-후 개질 및 분비를 포함하는, 폴리펩티드의 제조에 관여되는 임의의 단계를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 선형 또는 원형 DNA 분자로서 정의되며, 그것의 발현을 위해 제공되는 추가 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다.

본 발명의 피타제 변이체를 암호화하는 핵산 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 선택적으로 억제 유전자 또는 다양한 활성화 유전자를 암호화하는 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 발현될 수 있다.

본 발명의 피타제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 보유하는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 그것이 도입될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 벡터는 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙제 세포 게놈 내로 통합되며 이것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.

피타제 변이체는 또한 적어도 하나의 다른 관심 동물 사료 효소, 예컨대, 피타제, 포스파타제, 자일라나제, 갈락타나제, 알파-갈락토시다제, 프로테아제, 포스포리파제, 아밀라제 및/또는 베타-글루카나제와 함께 공발현될 수 있다. 효소는 상이한 벡터, 하나의 벡터 또는 두 기술의 혼합을 사용하여 공발현될 수 있다. 상이한 벡터를 사용하는 경우, 벡터는 다른 선택 가능한 마커와 다른 복제 기점을 가질 수 있다. 하나의 벡터만 사용하는 경우 유전자는 하나 이상의 프로모터에서 발현될 수 있다. 하나의 프로모터(이시스트론성 또는 다시스트론성)의 조절 하에 클로닝되는 경우 유전자가 클로닝되는 순서는 단백질의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 피타제 변이체는 또한 융합 단백질로 발현될 수 있고, 즉, 피타제 변이체를 암호화하는 유전자는 또 다른 단백질을 암호화하는 유전자에 인프레임으로 융합되어 있다. 이 단백질은 또 다른 효소이거나 또 다른 효소의 기능적 도메인일 수 있다.

숙주 세포

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물을 사용한 형질전환, 형질감염, 형질도입 등에 감수성이 있는 임의의 세포 유형을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이며, 폴리펩티드의 재조합 생산에 유리하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 상기에 설명한 바와 같이 벡터가 염색체 성분 또는 자기-복제 염색체외 벡터로서 유지되도록 숙주 세포로 도입된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생하는 돌연변이에 기인하여 모세포와 동일하지 않은 모세포의 임의의 자손을 포괄한다. 숙주 세포의 선택은 상당 부분이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 및 그 원천에 의존할 것이다.

숙주 세포는 단세포 미생물, 예컨대, 원핵생물, 또는 비-단세포 미생물, 예컨대, 진핵생물일 수 있다.

유용한 단세포 미생물은 박테리아 세포, 예컨대, 그램 양성 박테리아, 예컨대, 비제한적으로 바실러스 세포(Bacillus cell), 예를 들어, 바실러스 알카로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우터스(Bacillus lautus), 바실러스 렌터스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis); 또는 스트렙토마이세스 세포(Streptomyces cell), 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 및 스트렙토마이세스 뮤리너스(Streptomyces murinus), 또는 그램 음성 박테리아, 예컨대, 이.콜라이 및 슈도모나스 종이다. 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 바실러스 렌터스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스 또는 바실러스 서브틸리스 세포이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 바실러스 세포는 호알칼리성(alkalophilic) 바실러스이다.

박테리아 숙주 세포로 벡터의 도입은, 예컨대, 수용성 세포(예컨대, 문헌[Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829], 또는 [Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221] 참조)를 사용하는 원형질체 형질전환(예컨대, 문헌[Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115]), 전기천공법(예컨대, 문헌[Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751] 참조), 또는 접합(예컨대, 문헌[Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278]참조)에 의해 이루어질 수 있다.

숙주 세포는 또한 진핵생물, 예를 들어 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포일 수도 있다.

바람직한 양태에서, 숙주 세포는 진균 세포이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "진균"은 자낭균(phyla Ascomycota), 담자균(Basidiomycota), 병꼴균(Chytridiomycota) 및 접합균(Zygomycota) 문(문헌[Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의됨) 및 난균(Oomycota)(상기 문헌[Hawksworth et al., 1995, page 171]에 설명됨) 및 모든 미토스포릭 진균(mitosporic fungi)(상기 문헌[Hawksworth et al., 1995])을 포함한다.

보다 바람직한 양태에서, 진균 숙주 세포는 효모 세포이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은"효모"는 자낭포자형성 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자균 효모, 그리고 불완전 진균에 속하는 효모(블라스토마이세스(Blastomycetes))를 포함한다. 효모의 분류법은 추후에 바뀔 수 있으므로, 본 발명에 의하면 효모는 문헌["Biology and Activities of Yeast", Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980]에 기술된 바와 같이 정의되어야 할 것이다.

보다 더 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로이야(Yarrowia) 세포이다.

가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 더글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포이다.

또 다른 보다 바람직한 양태에서, 진균 숙주 세포는 사상 진균 세포이다. "사상 진균"은 하위 체계의 진균문(Eumycota) 및 난균문(Oomycota)의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 문헌[Hawksworth et al., 1995]에 정의됨). 사상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 기타 복합 다당체로 이루어진 균사체 벽을 특징으로 한다. 무성생식 성장은 균사 신장에 의하며 탄소 이화는 절대 호기성이다. 이와는 대조적으로, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에 의한 영양 생장은 단일 세포 엽상체의 출아에 의해 이루어지고, 탄소 이화 작용은 발효일 수 있다.

보다 더 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 아크레모니움(Acremonium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 오레오바시디움(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 코프리너스(Coprinus), 코리오러스(C또는iolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 필로바시디움(Filobasidium), Fusarium(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로차트( P hanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레유로터스(Pleurotus), 스키조필럼(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 터모아스커스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마(Trichoderma) 세포이다.

가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 자포니커스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium 곡류is), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미니어룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 샘부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크럼(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리치오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술퍼레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토루로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리초테시오이데스(Fusarium trichothecioides) 또는 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 브제르칸데라 아더스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레지아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 질베스센(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 수브루파(Ceriporiopsis subrufa) 또는 세리포리옵시스 서브베미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 코프리너스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리오러스 히르수터스(Coriolus hirsutus), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 랑퀴노사(Humicola lanuginosa), 무코르 메이헤이(Mucor miehei), 미셀리오프토라 테르모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 프레비아 라비아타(Phlebia radiata), 프레우로터스 에린지(Pleurotus eryngii), 티에라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메 테스빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시컬러(Trametes versicolor), 트리초데마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리초데마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리초데르마 롱지브라치아텀 (Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 또는 트리초데르마 비리드(Trichoderma viride) 균주 세포이다.

진균 세포는 본래 공지된 방식으로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환 및 세포벽의 재생을 포함하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. 아스퍼질러스 및 트리초데르마 숙주 세포의 형질전환을 위한 적합한 과정은 EP 238 023 및 문헌[Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474]에 기재되어 있다. 푸사리움 종의 형질변환을 위한 적합한 방법은 문헌[Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156] 및 WO 96/00787에 기재되어 있다. 효모는 문헌[Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163]; 및 문헌[Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920]에 기재된 절차를 사용하여 형질전환될 수 있다.

생산 방법

본 발명은 (a) 피타제의 생산에 적당한 조건 하에서 숙수 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 피타제를 회수하는 단계를 포함하는, 피타제 변이체의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 생산 방법에서, 숙주 세포는 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 폴리펩티드의 제조에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어 세포는 진탕 플라스크 배양 및 적당한 배지 중에 폴리펩티드가 발현 및/또는 분리될 수 있는 조건들 하에서 수행되는 실험실 또는 산업용 발효조 내에서의 소규모 또는 대규모 발효(연속, 회분, 유가 또는 고체상 발효 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당분야에 알려진 절차를 사용하여 탄소원 및 질소원 그리고 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적 공급업체로부터 이용 가능하거나 (예를 들어, ATCC(American Type Culture Collection)의 카탈로그에서) 공개된 조성에 따라 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지 내로 분비되는 경우, 폴리펩티드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않는 경우, 이는 세포 용해액으로부터 회수될 수 있다.

생성된 폴리펩티드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 비제한적으로 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 비제한적으로 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기별 배제 크로마토그래피), 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전점 전기 영동법), 용해도 차이를 이용하는 방법(예를 들어, 황산암모늄 침전법), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어, 문헌[Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조])을 통하여 정제될 수 있다.

조성물 및 용도

더 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이의 사용 방법에 관한 것이다.

폴리펩티드 조성물은 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있고 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 조성물에 포함될 폴리펩티드는 당업계에 알려진 방법에 따라서 안정화될 수 있다.

액체 제형의 경우, 제형화제는 폴리올(예를 들어 글리세롤, 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜), 염(예를 들어 염화나트륨, 벤조산나트륨, 소르브산칼륨) 또는 당 또는 당 유도체(예를 들어 덱스트린, 글루코스, 수크로스 및 소르비톨)를 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 및 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 1,2-프로필렌 글리콜, 1,3-프로필렌 글리콜, 염화나트륨, 벤조산나트륨, 소르브산칼륨, 덱스트린, 글루코스, 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 제형화제를 포함하는 액체 조성물이다. 액체 제형은 펠릿화한 후 사료에 스프레이되거나 동물에게 제공되는 음용수에 첨가될 수 있다.

고체 제형의 경우, 제형은 예를 들어 과립, 스프레이 건조 분말 또는 응집체일 수 있다. 제형화제는 염(유기 또는 무기 아연, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염, 예를 들어 아세트산칼슘, 벤조산칼슘, 탄산칼슘, 염화칼슘, 시트르산칼슘, 소르브산칼슘, 황산칼슘, 아세트산칼륨, 벤조산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 시트르산칼륨, 소르브산칼륨, 황산칼륨, 아세트산나트륨, 벤조산나트륨, 탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 황산나트륨, 아세트산아연, 벤조산아연, 탄산아연, 염화아연, 시트르산아연, 소르브산아연, 황산아연), 전분 또는 당 또는 당 유도체(예를 들어 수크로스, 덱스트린, 글루코스, 락토스, 소르비톨)를 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 고체 조성물은 과립 또는 과립 또는 미세과립의 형태이다. 과립은 성분이 균질하게 혼합되는 매트릭스 구조를 가질 수 있다. 그러나, 과립은 전형적으로 염 및/또는 왁스 코팅제인 1종 이상의 코팅제 및 코어 입자를 전형적으로 포함한다. 왁스의 예는 폴리에틸렌 글리콜; 폴리프로필렌; 카르나우바 왁스; 칸데릴라 왁스; 밀랍; 수소화 식물유 또는 동물성 수지(animal tallow), 예컨대, 수소화 황소 수지(ox tallow), 수소화 야자유, 수소화 면실유 및/또는 수소화 대두유; 지방산 알코올; 모노-글리세리드 및/또는 디-글리세리드, 예컨대, 글리세릴 스테아레이트(여기서, 스테아레이트는 스테아르산과 팔미트산의 혼합물임); 미정질 왁스; 파라핀; 및 지방산, 예컨대, 수소화 선형 장쇄 지방산 및 이의 유도체이다. 바람직한 왁스는 야자유 또는 수소화 야자유이다. 코어 입자는 1종 이상의 추가 효소 및 선택적으로 1종 이상의 염과 함께 선택적으로 조합된 본 발명의 피타제의 균질 블렌드 또는 상부에 적용된 1종 이상의 추가 효소와 선택적으로 조합된 본 발명의 피타제를 갖는 불활성 입자일 수 있다.

일 실시형태에서, 코어 임자의 물질은 무기염(예컨대, 아세트산칼슘, 벤조산칼슘, 탄산칼슘, 염화칼슘, 시트르산칼슘, 소르브산칼슘, 황산칼슘, 아세트산칼륨, 벤조산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 시트르산칼륨, 소르브산칼륨, 황산칼륨, 아세트산나트륨, 벤조산나트륨, 탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 황산나트륨, 아세트산아연, 벤조산아연, 탄산아연, 염화아연, 시트르산아연, 소르브산아연, 황산아연), 전분 또는 당 또는 당 유도체(예를 들어 수크로스, 덱스트린, 글루코스, 락토스, 소르비톨), 당 또는 당 유도체(예를 들어, 수크로스, 덱스트린, 글루코스, 락토스, 소르비톨), 작은 유기 분자, 전분, 가루, 셀룰로오스 및 미네랄 및 점토 미네랄(수화 알루미늄 필로실리케이트로도 공지됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 코어는 카올리나이트 또는 카올린과 같은 점토 미네랄을 포함한다.

염 코팅은 전형적으로 적어도 1 ㎛ 두께이고, 하나의 특정 염 또는 염, 예컨대, Na₂SO₄, K₂SO₄, MgSO₄ 및/또는 시트르산나트륨의 혼합물일 수 있다. 다른 예는 예를 들어, WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO 1997/05245, WO 1998/54980, WO 1998/55599, WO 2000/70034에 기재된 것 또는 예컨대, WO 2001/00042에 기재돈 것과 같은 중합체 코팅이다.

또 다른 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 피타제, 및 염화나트륨, 벤조산나트륨, 소르브산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산마그네슘, 티오황산나트륨, 탄산칼슘, 시트르산나트륨, 덱스트린, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 락토스, 전분 및 셀룰로스로 이루어진 목록으로부터 선택되는 1종 이상의 제형화제를 포함하는 고체 조성물이다. 바람직한 실시 형태에서, 제형화제는 하기 화합물 중 하나 이상으로부터 선택된다: 황산나트륨, 덱스트린, 셀룰로오스, 티오황산나트륨 및 탄산칼슘. 바람직한 실시형태에서, 고체 조성물은 과립화된 형태이다. 일 실시형태에서, 고체 조성물은 과립화된 형태이고, 코어 입자, 본 발명의 피타제를 포함하는 효소 층 및 염 코팅을 포함한다.

추가 실시형태에서, 제형화되는 하기 화합물 중 1종 이상으로부터 선택된다: 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 1,2-프로필렌 글리콜 또는 1,3-프로필렌 글리콜, 염화나트륨, 벤조산나트륨, 소르브산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산마그네슘, 티오황산나트륨, 탄산칼슘, 시트르산나트륨, 덱스트린, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 락토스, 전분, 카올린. 바람직한 실시 형태에서, 제형화제는 하기 화합물 중 하나 이상으로부터 선택된다: 1,2-프로필렌 글리콜, 1,3-프로필렌 글리콜, 황산나트륨, 덱스트린, 셀룰로스, 나트륨 티오설페이트, 카올린 및 탄산칼슘.

본 발명의 피타제는 임의의 예를 들어, 미오-이노시톨의 피테이트, 피트산 및/또는 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 및/또는 펜타-포스페이트의 임의의 산업적 문맥에서 분해에 대해서 사용될 수 있다. 이들 화합물의 포스페이트 모이어티는 2가 및 3가 양이온, 예컨대, 금속 이온, 즉, 칼슘, 철, 아연 및 마그네슘뿐만 아니라 미량 미네랄인 망간, 구리 및 몰리브덴의 영양학적 필수 이온과 같은 2가 및 3가 양이온을 킬레이트화한다는 것이 잘 알려져 있다. 뿐만 아니라, 피트산은 또한 정전기적 상호작용에 의해서 단백질에 어느 정도 결합한다.

본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 사용은 동물 사료 제제(인간 식품 포함) 또는 이러한 제제의 첨가제에서의 용도이다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 동물 사료의 영양값의 개선을 위해 사용될 수 있다. 동물 사료(인간 식품 포함)의 영양값 개선의 비제한적 예는 사료 소화율 개선; 동물의 성장 촉진; 사료 효율성 개선; 단백질의 생체-이용률 개선; 소화 가능한 포스페이트의 수준 증가; 피테이트의 방출 및/또는 분해 개선; 미량 미네랄의 생체-이용률 개선; 다량 미네랄(macro mineral)의 생체-이용률 개선; 보충적인 포스페이트, 미량 미네랄 및/또는 거대 미네랄의 첨가 필요성 제거; 및/또는 난각 품질 개선이다. 따라서 사료의 영양값이 증가하고, 성장 속도 및/또는 체중 증가 및/또는 사료 요구율(즉, 체중 증가에 대한 섭취 사료의 중량)이 개선된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 동물에서 영양소 보유율 및/또는 영양소 소화율을 개선시키기 위해서 사용될 수 있다.

추가로 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 거름의 피테이트 수준을 감소시키기 위해서 사용될 수 있다.

동물, 동물 사료 및 동물 사료 첨가제

용어 동물은 인간을 포함하여 모든 동물을 포함한다. 동물의 예는 비-반추동물 및 반추 동물이다. 반추 동물은, 예를 들어, 양, 염소 및 암소, 예를 들어, 젖소, 예컨대, 육우, 젖소와 같은 동물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 동물은 비-반추 동물이다. 비-반추 동물은 단위(mono-gastric) 동물, 예를 들어, 돼지 또는 돼지류(새끼 돼지, 성장 돼지 및 암퇘지를 포함하지만 이들로 제한되지 않음); 가금류, 예컨대, 칠면조, 오리 및 닭(브로일러(broiler) 닭, 레이어(layer)를 포함하지만 이들로 제한되지 않음); 어류(연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어를 포함하지만 이들로 제한되지 않음); 및 갑각류(쉬림프 및 프라운을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)을 포함한다.

용어 사료 또는 사료 조성물은 동물에 의한 섭취에 적합하거나 섭취가 의도되는 임의의 화합물, 제제, 혼합물 또는 조성물을 의미한다.

본 발명에 따른 사용에서, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 규정식(diet) 전, 후 또는 동시에 공급될 수 있다. 후자가 바람직하다.

본 발명은 추가로 동물에서 성장률, 인 소화율, 전신 인 보유율로부터 선택된 군 중 하나 이상을 개선시키는 방법 및/또는 FCR을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 동물에게 급여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 전형적으로 100~5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 피타제 보충 용량을 포함한다.

본 발명은 추가로 단위 동물에서 성장률을 향상시키거나 FCR을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 동물에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 급여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 전형적으로 100~5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 피타제 보충 용량을 포함한다.

본 발명은 추가로 가금류, 돼지류, 어류 또는 갑각류로 이루어진 군으로부터 선택된 동물에서 성장률을 향상시키거나 FCR을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 동물에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 급여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 전형적으로 100~5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 피타제 보충 용량을 포함한다.

본 발명은 추가로 가금류에서 성장률을 향상시키거나 FCR을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 가금류에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 급여하는 것을 포함한다. 가금류는 전형적으로 칠면조, 오리 및 닭(비제한적으로 브로일러 닭, 레이어 포함), 전형적으로 닭, 특히 브로일러 닭 및 레이어 닭으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 방법은 전형적으로 100~5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 피타제 보충 용량을 포함한다.

본 발명은 추가로 돼지류에서 성장률을 향상시키거나 FCR을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 돼지류에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 급여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 전형적으로 100~5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 피타제 보충 용량을 포함한다.

본 발명은 추가로 어류 또는 갑각류에서 성장률을 향상시키거나 FCR을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 어류 또는 갑각류에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 급여하는 것을 포함한다. 어류는 전형적으로 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 도미, 예컨대, 귀족 도미(gilthead seabream), 배스, 예컨대, 농어 및 잉어로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 갑각류는 전형적으로 바닷가재, 게, 가재, 크릴새우, 쉬림프 및 프라운으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 방법은 전형적으로 100~5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 피타제 보충 용량을 포함한다.

특정 실시형태에서, 사료에 첨가되는 형태의 폴리펩티드 또는 사료에 첨가될 경우 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다. 특정 실시형태에서, 이것은 잘 정의된다. 용어 "잘-정의된"은 피타제 제제가 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정되는 경우 적어도 50% 순수하다는 것을 의미한다(WO 01/58275의 실시예 12 참조). 다른 특정 실시형태에서, 피타제 제제는 이 방법에 의해 결정되는 경우 적어도 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 또는 적어도 95% 순수하다.

실질적으로 순수한 및/또는 잘-정의된 폴리펩티드 제제가 유리하다. 예컨대, 다른 폴리펩티드의 방해 또는 오염이 본질적으로 없는 폴리펩티드를 사료에 정확하게 투여하는 것이 훨씬 더 용이하다. 용어 정확하게 투여하는 것은 특히 일관되고 일정한 결과를 얻을 목적 및 목적하는 효과에 기초한 최적화 투여량의 가능성을 지칭한다.

그러나, 동물 사료에 사용하기 위해서, 본 발명의 피타제 폴리펩티드는 그 정도로 순수할 필요는 없으며; 예를 들어, 이것은 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이 경우 이것은 피타제 제제로 명명될 수 있다.

피타제 제제는 (a) 사료에 직접 첨가(또는 단백질의 처리 과정에서 직접 사용)할 수 있거나, 또는 (b) 사료에 후속하여 첨가되는 사료 첨가제 또는 프리믹스와 같은 하나 이상의 중간 조성물의 제조에 사용(또는 처리 과정에서 사용)될 수 있다. 상기에 설명된 순도의 정도는 상기 (a) 또는 (b)에 따라 사용되던 그렇지 않던 간에 원 폴리펩티드 제제의 순도를 지칭한다.

이 정도의 규모의 순도를 갖는 폴리펩티드 제제는 특히 재조합 제조 방법을 사용하여 얻어질 수 있는 반면, 이들은 폴리펩티드가 전통적인 발효 방법으로 제조되는 경우 쉽게 얻어지지 않고 또한 매우 높은 배치-대-배치 변형에 적용된다.

이러한 폴리펩티드 제제는 당연히 다른 폴리펩티드와 혼합될 수 있다.

폴리펩티드는 그것이 비교적 순수한 폴리펩티드가 되는 임의의 형태, 또는 동물 사료에 첨가가 의도되는 다른 성분과의 혼합물, 즉 소위 동물 사료를 위한 프리믹스와 같은 동물 사료 첨가제의 형태로 사료에 첨가될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 동물 사료, 동물 사료 첨가제, 예컨대, 프리믹스과 같은 동물 사료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 양태는 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 포함하는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다. 동물 사료 첨가제는 단위 또는 반추 동물, 전형적으로 단위 동물을 위한 사료에 사용될 수 있다. 동물 사료 첨가제는 전형적으로는 가금류, 돼지류, 어류 또는 갑각류로 이루어진 군으로부터 선택된 동물을 위한 동물 사료에 사용된다. 동물 사료 첨가제는 100 내지 5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 양으로 피타제를 포함한다.

본 발명은 추가로 가금류를 위한 사료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 포함하는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다. 가금류용 사료 첨가제는 전형적으로 칠면조, 오리 및 닭(비제한적으로 브로일러 닭, 레이어 포함), 전형적으로 닭, 특히 브로일러 닭 및 레이어 닭으로 이루어진 군으로부터 선택된 가금류를 위한 사료용이다.

본 발명은 추가로 돼지류를 위한 사료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 포함하는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 어류 또는 갑각류를 위한 사료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 포함하는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다. 어류는 전형적으로 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 도미, 예컨대, 귀족 도미, 배스, 예컨대, 농어 및 잉어로 이루어진 군으로부터 선택된다. 갑각류는 전형적으로 바닷가재, 게, 가재, 크릴새우, 쉬림프 및 프라운으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 이외에, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 적어도 1종의 지용성 비타민 및/또는 적어도 1종의 수용성 비타민 및/또는 적어도 1종의 미량 미네랄을 함유한다. 사료 첨가제는 또한 적어도 1종의 다량 미네랄을 함유할 수 있다.

또한, 선택적인 사료-첨가 성분은 착색제, 예를 들어, 카로티노이드, 예컨대, 베타-카로틴, 아스타잔틴 및 루테인; 방향 화합물; 안정화제; 항미생물 펩티드; 다중불포화 지방산; 반응성 산소 발생 종; 및/또는 피타제(EC 3.1.3.8 또는 3.1.3.26); 포스파타제(EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC 3.1.3.39); 자일라나제(EC 3.2.1.8); 갈락타나제(EC 3.2.1.89); 알파-갈락토시다제(EC 3.2.1.22); 프로테아제 (EC 3.4.-.- ), 포스포리파제 A1(EC 3.1.1.32); 포스포리파제 A2(EC 3.1.1.4); 리소포스포리파제(EC 3.1.1.5); 포스포리파제 C(3.1.4.3); 포스포리파제 D EC 3.1.4.4); 아밀라제, 예를 들어, 알파-아밀라제(EC 3.2.1.1); 및/또는 베타-글루카나제(EC 3.2.1.4 또는 EC 3.2.1.6) 중에서 선택된 적어도 1종의 다른 폴리펩티드이다.

브로일러에 대한 급여에서 실시예 14에 입증된 바와 같이, 프로테아제와 본 발명의 피타제의 조합은 단백질 소화율이 0.7 내지 1.6%, 단백질 보유율이 0.9 내지 4.4% 그리고 에너지 보유율이 0.6 내지 1.3%만큼 증가되었다. 이는 체중 증가(BWG)의 2.3 또는 3.7% 그리고 사료 요구율의 4.6 또는 2.8%의 개선을 초래하였다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 본 발명의 피타제 및 프로테아제를 포함하는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다. 프로테아제는 Ronozyme ProAct™, Ronozyme ProAct360™, Axtra® PRO, Avizyme 1502, Cibenza, Enolzyme, Poultrygrow-250 또는 Aquagrow-175에 포함된 프로테아제로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 Ronozyme ProAct™, Ronozyme ProAct360™, Axtra® PRO 및 Cibenza로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 Ronozyme ProAct™, Ronozyme ProAct360™, 가장 바람직하게는 Ronozyme ProAct360™ 프로테아제로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 추가로 본 발명의 피타제, 및 WO0158276의 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 프로테아제 및 WO2019043191의 서열번호 3과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제를 포함하는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 본 발명의 서열번호 22의 서열을 포함하는 프로테아제와 적어도 75% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 95% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 98% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 99% 서열 동일성, 예컨대, 100% 서열 동일성을 갖는 프로테아제로부터 선택된다.

전형적으로, 프로테아제 및 피타제를 포함하는 동물 사료는 사료에 100 내지 5,000 FYT/㎏, 예컨대, 500 내지 2000 FYT/㎏의 피타제를 포함한다. 전형적으로, 프로테아제 및 피타제를 포함하는 동물 사료는 사료에 10,000 내지 50,000 U/㎏, 예컨대, 15,000 내지 35,000 U/㎏ 전형적으로 20,000 내지 40,000 U/㎏의 프로테아제를 포함한다.

특정 실시형태에서, 이들 다른 폴리펩티드는 잘-정의된다(피타제 제제에 대해서 상기에 정의된 바와 같음).

본 발명의 피타제는 또한 다른 피타제, 예를 들어, 아스퍼질러스 피쿰, 아스퍼질러스 나이거 또는 아스퍼질러스 아와모리 유래의 아스퍼질러스 피타제와 같은 자낭균 피타제; 또는 예를 들어, 페니오포라 라이시(Peniophora lycii), 아그로사이베페디아데스(Agrocybe pediades), 트라메테스 퍼베센스(Trametes pubescens) 또는 파실러스 인볼루터스(Paxillus involutus) 유래의 담자균 피타제; 또는 피타제 활성을 갖는 이들의 유도체, 단편 또는 변이체와 조합될 수 있다.

따라서, 본 발명의 동물 사료에서의 용도의 바람직한 실시형태 및 본 발명의 동물 사료 첨가제 및 동물 사료의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 피타제는 이러한 피타제와 조합된다.

항미생물 펩티드(AMP)의 예는 WO 03/044049 및 WO 03/048148에 개시된 화합물 및 폴리펩티드를 비롯한, CAP18, 류코신 A, 트리트립티신, 프로테그린-1, 타나틴, 디펜신, 락토페린, 락토페리신 및 오비스피린, 예컨대, 노비스피린(Robert Lehrer, 2000), 플렉타신 및 스타틴뿐만 아니라 항미생물 활성을 보유하는 이들의 변이체 또는 단편이다.

항진균 펩티드(AMP)의 예는 WO 94/01459 및 WO 02/090384에 개시된 바와 같은 아스퍼질러스 기간테우스(Aspergillus giganteus) 및 아스퍼질러스 나이거 펩티드뿐만 아니라 항진균 활성을 보유하는 이의 변이체 및 단편이다.

다중불포화 지방산의 예는 C18, C20 및 C22 다중불포화 지방산, 예컨대, 아라키돈산, 도코소헥사에노산, 에이코사펜타엔산 및 감마-리놀렌산이다.

반응성 산소 발생 종의 예는 과붕산염, 과황산염 또는 과탄산염과 같은 화학물질; 및 옥시다제, 옥시게나제 또는 신테타제와 같은 폴리펩티드이다.

일반적으로 지용성 및 수용성 비타민과, 미량 미네랄은 사료에 첨가하기 위한 것으로 의도된 소위 예비혼합물의 일부를 형성하며, 반면에, 다량 미네랄은 일반적으로 사료에 별개로 첨가된다. 본 발명의 폴리펩티드가 풍부한 경우 이들 조성물 유형 중 하나가 본 발명의 동물 사료 첨가제이다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 동물 규정식 또는 사료에 0.01 내지 10.0%; 보다 특별하게는 0.05 내지 5.0%; 또는 0.2 내지 1.0%(%는 100 g 사료 당 첨가제 g을 의미)의 수준으로 포함되도록 의도된다(또는 포함되도록 처방된다). 이것은 특히 프리믹스의 경우에 그러하다.

하기는 이들 성분의 예의 비배타적 목록이다:

지용성 비타민의 예는 비타민 A, 비타민 D3, 비타민 E, 및 비타민 K, 예컨대, 비타민 K3이다.

수용성 비타민의 예는 비타민 B12, 비오틴 및 콜린, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니아신, 엽산 및 판토텐산, 예를 들어, Ca-D-판토텐산이다.

미량 미네랄의 예는 망간, 아연, 철, 구리, 아이오딘, 셀레늄 및 코발트이다.

다량 미네랄의 예는 칼슘, 인 및 나트륨이다.

이들 성분의 영양학적 요구량(가금류 및 새끼 돼지/돼지로 예시됨)는 WO 01/58275의 표 A에 열거되어 있다. 영양학적 요구량은 이러한 성분이 표시된 농도로 규정식에 제공되어야 함을 의미한다.

대안적으로, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 WO 01/58275의 표 A에 명시된 개별 성분 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나는 하나 이상, 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷 등 최대 열셋 모두, 또는 최대 열다섯의 모든 개별 성분을 의미한다. 보다 구체적으로, 이러한 적어도 하나의 개별 성분은 표 A의 컬럼 4, 또는 컬럼 5, 또는 컬럼 6에 나타낸 범위 내의 사료 중 농도를 제공하도록 하는 양으로 본 발명의 첨가제에 포함된다.

본 발명은 또한 동물 사료 조성물에 관한 것이다. 동물 사료 조성물 또는 규정식은 비교적 높은 함량의 단백질을 갖는다. 가금류 및 돼지 규정식은 WO 01/58275의 표 B, 컬럼 2 내지 3에 표시된 바와 같이 특징규명될 수 있다. 어류 규정식은 이 표 B의 컬럼 4에 표시된 바와 같이 특징규명될 수 있다. 또한 이러한 어류 규정식은 일반적으로 200~310g/㎏의 조지방 함량을 갖는다.

WO 01/58275는 US 09/779334에 대응하며 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.

본 발명에 따른 동물 사료 조성물은 50~800g/㎏의 조단백질 함량을 가지며 또한 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

추가로 또는 대안으로(상기에 제시된 조단백질 함량에 대하여), 본 발명의 동물 사료 조성물은10~30 MJ/㎏의 대사 가능한 에너지 함량; 및/또는 0.1~200 g/㎏의 칼슘 함량; 및/또는 0.1~200 g/㎏의 이용 가능한 인 함량; 및/또는 0.1~100 g/㎏의 메티오닌 함량; 및/또는 0.1~150 g/㎏의 메티오닌 + 시스테인의 함량; 및/또는 0.5~50 g/㎏의 라이신 함량을 갖는다.

특정 실시형태에서, 대사 가능한 에너지, 조단백질, 칼슘, 인, 메티오닌, 메티오닌 + 시스테인, 및/또는 라이신의 함량은 WO 01/58275(R. 2-5)의 표 B의 범위 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나 내에 있다.

조단백질은 질소(N)에 계수 6.25를 곱한 것으로 계산된다(즉, 조단백질(g/㎏) = N(g/㎏) × 6.25). 질소 함량은 Kjeldahl 방법(문헌[A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC])에 의해 결정된다.

대사 에너지는 NRC 간행물인 문헌[Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6], 및 문헌[European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5]에 기초하여 계산될 수 있다.

완전한 동물 규정식에서의 칼슘, 이용 가능한 인 및 아미노산의 규정식 함량은 사료 표, 예컨대 문헌[Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7]에 기초하여 계산된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 동물 사료 조성물은 적어도 하나의 단백질을 함유한다. 단백질은 육류 및 골분 및/또는 어분과 같은 동물 단백질이거나; 또는 식물성 단백질일 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같은 용어 식물성 단백질은 변형된 단백질 및 단백질-유도체를 포함하여 식물로부터 유래한 또는 기원한 적어도 하나의 단백질을 포함하는 임의의 화합물, 조성물, 제제 또는 혼합물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 식물성 단백질의 단백질 함량은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% (w/w)이다.

식물성 단백질은 식물성 단백질 공급원, 예컨대 콩류 및 곡류, 예를 들어 파바세애(Fabaceae)과(레구미노사에(Leguminosae)과), 크루시페라세애(Cruciferaceae)과, 케노포디아세애(Chenopodiaceae)과 및 포아세애(Poaceae)과의 식물로부터의 물질, 예컨대 대두박, 루핀박 및 평지씨박으로부터 유래될 수 있다.

특정 실시 형태에서, 식물성 단백질 공급원은 파바세애과의 하나 이상의 식물, 예를 들어, 대두, 루핀, 완두콩 또는 콩으로부터의 물질이다.

또 다른 특정 실시 형태에서, 식물성 단백질 공급원은 케노포디아세애과의 하나 이상의 식물, 예를 들어, 비트, 사탕무, 시금치 또는 퀴노아로부터의 물질이다.

식물성 단백질 공급원의 다른 예는 평지씨, 해바라기씨 목화씨 및 양배추이다.

대두가 바람직한 단백질 공급원이다.

식물성 단백질 공급원의 다른 예는 곡류, 예컨대, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 옥수수(maize, corn), 벼, 라이밀 및 수수이다.

또 다른 특정 실시 형태에서, 본 발명의 동물 사료 조성물은 0~80%의 옥수수; 및/또는 0~80%의 수수; 및/또는 0~70%의 밀; 및/또는 0~70%의 보리; 및/또는 0~30%의 귀리; 및/또는 0~40%의 대두박; 및/또는 0~25%의 어분; 및/또는 0~25%의 육골분; 및/또는 0~20%의 유청을 함유한다.

동물 규정식은 예를 들어 매시 사료(비-펠릿화) 또는 펠릿화 사료로 제조될 수 있다. 전형적으로, 밀링된 사료를 혼합하고 해당 종에 대한 사양에 따라 충분한 양의 필수 비타민 및 미네랄을 첨가한다. 폴리펩티드는 고체 또는 액체 폴리펩티드 제형으로서 첨가할 수 있다. 예컨대, 고체 폴리펩티드 제형은 통상적으로 혼합 단계 이전 또는 혼합 단계 중에 첨가하고; 액체 폴리펩티드 제제는 통상적으로 펠릿화 단계 후에 첨가한다. 폴리펩티드는 또한 사료 첨가제 또는 프리믹스에 혼입될 수 있다.

규정식 중의 최종 폴리펩티드 농도는 규정식 ㎏당 0.01~200mg 폴리펩티드 단백질의 범위 내, 예를 들어, 동물 규정식 ㎏당 5~30 ㎎ 폴리펩티드 단백질 범위 내이다.

본 발명의 피타제는 당연히 유효량으로, 즉 용해화 개선 및/또는 사료의 영양값 개선에 충분한 양으로 적용되어야 한다. 현재 이러한 폴리펩티드는 하기 양(투여량 범위) 중 하나 이상으로 투여되는 것으로 생각된다: 0.01~200; 0.01~100; 0.5~100; 1~50; 5~100; 10~100; 0.05~50; 또는 0.10~10 - 모든 이들 범위는 사료 ㎏당 파이타제 폴리펩티드 단백질 ㎎임(ppm).

사료 ㎏당 피타제 폴리펩티드 단백질 ㎎을 결정하기 위해서, 피타제를 사료 조성물로부터 정제하고, 관련 검정을 사용하여 정제된 피타제의 비활성을 결정한다. 이러한 사료 조성물의 피타제 활성을 또한 동일한 검정을 사용하여 결정하고, 이들 두 결정값에 기초하여 사료 ㎏당 피타제 단백질 ㎎의 투여량을 계산한다.

사료 첨가제 중의 피타제 폴리펩티드 단백질 ㎎을 결정하기 위해서 동일한 원리를 적용한다. 물론, 샘플이 사료 첨가제 또는 사료의 제조에 사용되는 피타제를 이용할 수 있는 경우에는, 이 샘플로부터 비활성을 결정한다(사료 조성물 또는 첨가제로부터 피타제를 정제할 필요 없음).

발효 산물의 생산 방법

본 발명의 또 다른 양태는 발효 산물, 예컨대, 에탄올, 맥주, 와인, 주정박(distillers dried grain: DDG)의 제조방법에 관한 것이며, 발효는 본 발명에 의해서 생산된 피타제의 존재 하에서 수행한다. 발효 방법의 예는, 예를 들어, WO 01/62947에 기재된 방법을 포함한다. 효모와 같은 발효 미생물을 사용하여 발효를 수행한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 피타제의 존재 하에서 탄수화물 함유 물질(예를 들어, 전분)을 (발효 미생물, 예컨대, 효모를 사용) 배양하는 단계 및 (b) 배양된 탄수화물 함유 물질로부터 발효 산물을 생산하는 단계를 포함하는 발효 산물의 제조방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 피타제의 존재 하에서 탄수화물 함유 물질(예컨대, 전분)을 배양하는 단계(효모와 같은 발효 미생물 사용) 및 배양된 탄수화물 함유 물질로부터 에탄올을 제조 또는 회수하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 a) 예를 들어, 액화 및/또는 당화 공정에 의해 전분을 가수분해시키는, 생 전분 가수분해 공정, b) 생성된 전분을 본 발명의 피타제의 존재 하에서 발효시키는 단계 및 c) 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 에탄올의 생산 방법을 제공한다.

피타제를 임의의 적합한 단계에서, 그리고 단독으로 또는 다른 효소, 예컨대, 1종 이상의 알파-아밀라제, 글루코아밀라제, 프로테아제 및/또는 셀룰라제와 조합하는 것을 포함하여 임의의 적합한 조성물로 발효 공정에 첨가할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 바이오매스를 가수분해시키는 단계, 및 생성된 바이오매스를 본 발명의 피타제의 존재 하에서 (발효 미생물, 예컨대, 효모를 사용하여) 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 생산 방법을 제공한다.

식물

본 발명은 또한 회수 가능한 양으로 피타제를 발현하고 생산하기 위해서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 예를 들어, 트랜스제닉 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에 관한 것이다. 피타제는 식물 또는 식물 부분으로부터 회수될 수 있다. 대안적으로, 피타제를 함유하는 식물 또는 식물 부분은 음식 또는 사료의 품질 개선, 예를 들어, 영양값, 미각 및 유변학적 특성의 개선, 또는 영양 저해 인자(antinutritive factor)의 파괴를 위해 사용될 수 있다.

트랜스제닉 식물은 쌍떡잎식물(dicot) 또는 외떡잎식물(monocot)일 수 있다. 외떡잎 식물의 예는 풀, 예컨대, 왕포아풀(블루 글래스, 포아(Poa)), 사료초, 예컨대, 페스투카(Festuca), 롤륨(Lolium), 북방형목초, 예컨대, 아그로스티스(Agrostis) 및 곡류, 예를 들어, 밀, 귀리, 호밀, 보리, 벼, 수수 및 옥수수이다.

쌍떡잎 식물의 예는 담배, 콩류, 예컨대, 루핀, 감자, 사탕무, 완두콩, 강낭콩 및 대두 및 십자화 식물(브라시카세아(Brassicaceae) 과), 예컨대, 콜리플라워, 평지씨 및 밀접하게 관련된 모델 유기체 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다.

식물 부분의 예는 줄기, 캘러스, 잎, 뿌리, 열매, 종자 및 구근뿐만 아니라 이들 부분을 포함하는 개별 조직, 예컨대, 표피, 잎살, 유조직, 관다발 조직, 분열 조직이다. 또한 엽록체, 아포플라스트, 미토콘드리아, 액포, 퍼옥시좀 및 세포질과 같은 특정한 식물 세포 구획이 식물 부분으로 간주된다. 추가로, 조직 기원인 임의의 식물 세포가 식물 부위로 간주된다. 마찬가지로, 본 발명의 이용을 용이하게 하기 위해서 단리된 특정 조직 및 세포와 같은 식물 부분, 예를 들어, 배낭, 내배유, 호분 및 종피가 또한 식물 부분으로 간주된다.

본 발명의 범주 내에 또한 이러한 식물의 2대, 식물 부분 및 식물 세포가 포함된다.

피타제를 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포는 당업계에 알려진 방법에 따라 작제될 수 있다. 간단히 말해서, 식물 또는 식물 세포는 피타제를 암호화하는 1종 이상의 발현 작제물을 식물 숙주 게놈에 혼입하고, 생성된 변형된 식물 또는 식물 세포를 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포로 번식시킴으로써 작제된다.

편리하게는 발현 작제물은 선택한 식물 또는 식물 부분에서 폴리펩티드의 발현에 필요한 적절한 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 피타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물이다. 추가로, 발현 작제물은 발현 작제물이 통합된 식물 세포 및 해당 식물에 작제물을 도입하는 데 필요한 DNA 서열을 식별하는 데 유용한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다(후자는 사용될 DNA 도입 방법에 좌우됨).

조절 서열, 예컨대, 프로모터 및 터미네이터 서열 및 선택적으로 신호 또는 전이 서열과의 선택은, 예를 들어, 피타제가 발현되는 것이 바람직한 장소, 시간 및 방법을 기준으로 결정된다. 예를 들어, 피타제를 암호화하는 유전자의 발현은 구성적이거나 유도성일 수 있거나, 발달, 단계 또는 조직 특이적일 수 있고, 유전자 산물은 특정 조직 또는 종자 또는 잎과 같은 식물 부분을 표적으로 할 수 있다. 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506]에 기재되어 있다.

구성적 발현을 위해서, 35S-CaMV, 옥수수 유비퀴틴 1, 또는 벼 액틴 1 프로모터가 사용될 수 있다(Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). 기관-특이적 프로모터는, 예를 들어, 저장 싱크 조직, 예컨대, 종자, 감자 구근 및 과일로부터의 프로모터(Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) 또는 대사 싱크 조직, 예컨대, 분열조직으로부터 프로모터(Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), 종자 특이적 프로모터, 예컨대, 벼로부터의 글루텔린, 프롤라민, 글로불린 또는 알부민 프로모터(Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), 레구민 B4로부터의 비셔 파바(Vicia faba) 프로모터 및 비셔 파바로부터의 미지의 종자 단백질 유전자(Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), 종자 유체(oil body) 단백질로부터의 프로모터(Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), 브라시카 나푸스(Brassica napus)로부터의 저장 단백질 napA 프로모터 또는 예를 들어, WO 91/14772에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 다른 종자 특이적 프로모터일 수 있다. 또한, 프로모터는 벼 또는 토마토로부터의 rbcs 프로모터와 같은 잎 특이적 프로모터(Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트랜스페라제 유전자 프로모터(Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93) 또는 벼로부터의 aldP 유전자 프로모터(Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) 또는 감자 pin2 프로모터와 같은 상처 유도 프로모터(Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588)일 수 있다. 마찬가지로, 프로모터는 온도, 건조 또는 염분 변화와 같은 비생물적 처리에 의해 유도 가능하거나 또는 프로모터를 활성화하는 외인적으로 적용된 물질, 예컨대, 에탄올, 오데스트로젠, 식물 호르몬, 예컨대, 에틸렌, 아브시스산, 지베렐린산 및/또는 중금속에 의해 유도 가능할 수 있다.

프로모터 인핸서 요소를 또한 사용하여 식물에서 피타제의 더 높은 발현을 달성할 수 있다. 예컨대, 프로모터 인핸서 요소는 프로모터와 피타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 간에 위치한 인트론일 수 있다. 예컨대, 상기 문헌[Xu et al., 1993]는 발현을 향상시키기 위한 벼 액틴 1 유전자의 제1 인트론의 사용을 개시한다.

선택 가능한 마커 유전자 및 발현 작제물의 임의의 다른 부분은 당업계에서 입수 가능한 것으로부터 선택될 수 있다.

핵산 작제물은 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스-매개 형질전환, 미량주사법, 입자 충격, 유전자총 형질전환 및 전기천공법을 포함하는 당업계에 알려진 종래 기술에 따라 식물 게놈에 혼입된다(Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

현재, 다른 형질전환 방법이 이들 식물에 대해서 사용될 수 있지만, 아그로박테리움 투메파시언스-매개 유전자 전달이 트랜스제닉 쌍떡잎 식물의 생성 방법(검토에 대해서는 문헌[Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38] 참조) 및 외떡잎 식물의 형질전환 방법이다. 트랜스제닉 외떡잎 식물을 생성하는 방법은 배아 캘러스 또는 발달 중인 배아의 입자 충격(형질전환 DNA로 코팅된 미세한 금 또는 텅스텐 입자)이다(Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). 외떡잎 식물의 형질전환을 위한 대안적인 방법은 문헌[Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428]에 기재된 바와 같은 원형질체 형질전환에 기초한다. 추가 형질전환 방법은 미국 특허 제6,395,966호 및 제7,151,204호(이들 두 특허는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 기재된 것을 포함한다.

형질전환 후, 발현 작제물을 혼입한 형질전환체를 선택하고, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 완전한 식물로 재생된다. 대개, 형질전환 절차는 예를 들어, 2개의 개별 T-DNA 작제물을 사용한 동시 형질전환 또는 특이적 재조합효소에 의한 선택 유전자의 부위 특이적 절제를 사용하여, 재생 동안 또는 생성 후 선택 유전자의 선택적 제거를 위해 설계된다.

본 발명의 작제물로 특정 식물 유전자형을 직접 형질전환시키는 것 외에도, 작제물을 갖는 식물과 작제물이 결여된 제2 식물에 교배시켜 트랜스제닉 식물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 피타제를 암호화하는 작제물은 주어진 품종의 식물을 직접 형질전환할 필요 없이도 교배에 의해 특정 식물 품종에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따라 형질전환된 세포로부터 직접 재생된 식물뿐만 아니라 이러한 식물의 자손도 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 자손은 본 발명에 따라 제조된 모체 식물의 임의 세대의 후손을 지칭할 수 있다. 이러한 자손은 본 발명에 따라 제조된 DNA 작제물을 포함할 수 있다. 교배는 출발 계통을 공여자 식물 계통과 교차 수분함으로써 트랜스진을 식물 계통에 도입한다. 이러한 단계의 비제한적 예는 미국 특허 제7,151,204호에 기재되어 있다.

식물은 역교배 전환 과정을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 식물은 역교배 전환된 유전자형, 계통, 근친교배 또는 잡종으로 지칭되는 식물을 포함한다.

유전자 마커는 본 발명의 1종 이상의 트랜스진이 하나의 유전적 배경으로부터 다른 유전적 배경으로 이입되는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 마커 지원 선택은 표현형 변이로 인한 오류를 방지하는 데 사용할 수 있다는 점에서 기존 육종에 비해 이점을 제공한다. 또한, 유전자 마커는 특정 교배의 개별 자손에서 엘리트 생식질의 상대적 정도에 관한 데이터를 제공할 수 있다. 예를 들어, 비농경학적으로 바람직한 유전적 배경을 갖는 목적하는 형질을 갖는 식물이 엘리트 부모와 교배될 때, 유전자 마커는 관심 형질을 보유할 뿐만 아니라 비교적 큰 비율의 목적하는 생식질을 갖는 자손을 선택하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 하나 이상의 형질을 특정 유전적 배경으로 이입하는 데 필요한 세대 수가 최소화된다.

본 발명은 또한 (a) 피타제의 생산에 도움이 되는 조건 하에서 피타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 피타제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 피타제의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 다음 단락에서 추가로 정의된다:

1. 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134, 138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 추가로 포함하는, 피타제 변이체.

2. 단락 1에 있어서, 57, 73, 121, 134, 155, 207 및 273번 위치에 치환을 포함하는, 변이체.

3. 단락 2에 있어서, 36, 60, 64, 73, 119, 130, 138, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 224, 230, 243, 336 및 340번 위치에 치환을 추가로 포함하는, 변이체.

4. 단락 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 치환은 30Q, 36A, 43C, 46C, 57Y, 60H, 64Q, 73P, 79Q, 119P, 121P, 123C, 130T,C, 134Q, 138A, 151S, 155F, 161T, 162A, 168R, 176P, 180N, 184Q, 190T, 207T, 224Q, 230E, 243N, 273L, 286S, 336R, 340L,P, 358Q 및 375K로부터 선택되는, 변이체.

5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 치환 31C/52C/57Y/73P/99C/121P/134Q/141C/155F/177C/199C/203L/207T/273L을 포함하는, 변이체.

6. 단락 5에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는 변이체 중에서 선택되는, 변이체:

7. 단락 6에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는, 변이체:

8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 모체 피타제는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 변이체.

9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 모체 피타제는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 변이체.

10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 갖는 피타제에 비해서 개선된 열안정성을 갖는, 변이체.

11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.

12. 단락 11의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터.

13. 단락 11의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.

14. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 피타제 변이체의 생산 방법으로서,

변이체 발현에 적당한 조건 하에서 단락 13의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

변이체를 회수하는 단계

를 포함하는, 방법.

15. 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체 및/또는 단락 11의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 식물.

16. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 적어도 1종의 피타제 변이체를 포함하는, 조성물.

17. 단락 16에 있어서,

적어도 1종의 지용성 비타민;

적어도 1종의 수용성 비타민; 및/또는

적어도 1종의 미량 미네랄

을 추가로 포함하는, 조성물.

18. 단락 16 또는 17에 있어서, 아밀라제, 피타제, 포스파타제, 자일라나제, 갈락타나제, 알파-갈락토시다제, 프로테아제, 포스포리파제 및/또는 베타-글루카나제인 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 효소를 추가로 포함하는, 조성물.

19. 단락 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 동물 사료 첨가제인, 조성물.

20. 50 내지 800 g/㎏의 조단백질 함량을 갖고, 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체, 단락 11의 폴리뉴클레오티드 또는 단락 16 내지 19 중 어느 하나의 조성물을 포함하는, 동물 사료 조성물.

21. 동물 사료의 영양값을 개선시키는 방법으로서, 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체, 단락 11의 폴리뉴클레오티드 또는 단락 16 내지 19 중 어느 하나의 조성물이 사료에 첨가되는, 방법.

22. 동물 거름에서 피테이트 수준을 감소시키는 방법으로서, 동물에게 유효량의 단락 20의 사료 조성물을 급여하는 단계를 포함하는, 방법.

23. 식물성 단백질의 처리 방법으로서, 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체, 단락 11의 폴리뉴클레오티드 또는 단락 16 내지 19 중 어느 하나의 조성물을 적어도 1종의 식물성 단백질 또는 단백질 공급원에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.

24. 동물의 체중 증가를 증가시키고/거나 동물의 사료 요구율을 개선시키는 방법으로서, 동물에게 유효량의 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체, 단락 11의 폴리뉴클레오티드 또는 단락 16 내지 19 중 어느 하나의 조성물을 갖는 사료를 공급하는 단계를 포함하는, 방법.

25. 동물 사료에서의; 동물 사료의 제제에서의; 동물 사료의 영양값을 개선시키기 위한; 동물 거름에서 피테이트 수준을 감소시키기 위한; 식물성 단백질을 처리하기 위한; 피테이트 기질로부터 인을 유리시키기 위한; 또는 동물의 체중 증가를 증가시키고/시키거나, 비성장률을 개선시키고/시키거나 사료 요구율을 개선시키기 위한; 또는 동물에서 영양소 보유율 및/또는 영양소 소화율을 개선시키기 위한, 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체, 단락 11의 폴리뉴클레오티드 또는 단락 16 내지 19 중 어느 하나의 조성물의 용도.

26. 발효 산물의 생산 방법으로서, (a) 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 피타제 변이체 또는 단락 11의 폴리뉴클레오티드의 존재 하에서 발효 미생물을 사용하여 탄수화물 함유 물질을 배양하는 단계 및 (b) 발효된 탄수화물 함유 물질로부터 발효 조산물의 발효 산물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.

27. 단락 26에 있어서, 발효 산물은 에탄올, 맥주, 와인, 주정박(distillers dried grain: DDG)인, 방법.

28. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 피타제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드:

29. 단락 28에 있어서, 시트로박터 브라키로부터 얻거나 얻을 수 있는, 폴리펩티드.

30. 단락 28 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하기 특성 중 하나 이상을 포함하도록 pH 안정적이고 열안정적인, 단리된 폴리펩티드:

i. 적어도 75℃의 pH 4에서의 언폴딩 온도;

ii. 적어도 70℃의 pH 3에서의 언폴딩 온도; 및

iii. 적어도 55℃의 pH 2에서의 언폴딩 온도.

31. 단락 28 내지 30 중 어느 하나에 따른 단리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 각각에서 24시간 후에 90% 초과의 잔류하는 활성을 유지하도록 산 안정적인, 단리된 폴리펩티드.

32. 단락 28 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2와 비교할 때 변경 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C를 포함하는, 폴리펩티드.

33. 단락 28 내지 32 중 어느 하나에 따라서, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134, 138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 포함하는, 폴리펩티드.

34. 하기 단계를 포함하는 피타제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법:

(b) 선택적으로 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및

(c) 선택적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계.

35. 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드의 생산 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:

a. 서열번호 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

b. 서열번호 14와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

c. 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;

d. 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및

(b) 선택적으로 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및

(c) 선택적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계.

36. 단락 35에 있어서, 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2와 비교할 때 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C를 포함하는, 방법.

37. 단락 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134, 138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.

38. 가금류, 돼지류, 어류 또는 갑각류로 이루어진 군으로부터 선택된 동물용 동물 사료에 사용하기 위한, 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 피타제를 포함하는 동물 사료 첨가제.

39. 단락 38에 있어서, 가금류용 사료에 사용하기 위한 것이되, 가금류는 칠면조, 오리 및 닭(비제한적으로 브로일러 닭, 레이어 포함), 전형적으로 닭, 특히 브로일러 닭 및 레이어 닭으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동물 사료 첨가제.

40. 단락 38에 있어서, 돼지류용 사료에 사용하기 위한 동물 사료 첨가제.

41. 단락 38에 있어서, 어류 또는 갑각류용 사료에 사용하기 위한 동물 사료 첨가제.

42. 단락 41에 있어서, 어류는 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 도미, 예컨대, 귀족 도미, 배스, 예컨대, 농어 및 잉어로 이루어진 군으로부터 선택되는, 갑각류는 바닷가재, 게, 가재, 크릴새우, 쉬림프 및 프라운으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동물 사료 첨가제.

43. 단락 38 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 100 내지 5000 FYT/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 4000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 125 내지 3000 FTY/㎏ 사료의 양의 단락 1 내지 10의 피타제를 포함하는, 동물 사료 첨가제.

본 명세서에 개시되는 특정 실시형태는 본 발명의 몇몇 양태의 예시로서 의도되므로, 본 명세서에 기재되고 청구되는 본 발명은 이들 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 어떠한 동등한 실시형태도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 실제로, 본 명세서에 나타내고 기재되는 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형도 첨부되는 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 한다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 개시가 우선이 될 것이다.

다양한 참고문헌이 본 명세서에 인용됨, 이들의 개시내용은 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.

본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 본 발명이 추가로 설명된다.

실시예

사용된 화학 물질은 적어도 시약 등급인 시판 제품이다.

실시예 1: 변이체의 제조 및 활성 결정

아스퍼질러스 오리재에서 피타제 변이체의 발현

본 실시예에서 씨. 브라키 피타제 변이체 유전자를 포함하는 작제물을 사용하여 아스퍼질러스를 위한 발현 벡터를 작제하였다. 아스퍼질러스 발현 벡터는 아스퍼질러스 니듈란스 트리오스 포스페이트 이소머라제 미번역 리더 서열(Pna2/tpi) 및 아스퍼질러스 나이거 아밀로글리코시다제 종결자(Tamg)에 융합된 아스퍼질러스 나이거 중성 아밀라제 II 프로모터 프로모터에 기초한 발현 카세트로 이루어진다. 또한 플라스미드에는 pyrG 마이너스인 아스퍼질러스를 위한 최소 배지에서 성장할 수 있는 아스퍼질러스 니듈란스로부터의 아스퍼질러스 선택적인 마커인 pyrG가 존재하였다. 피타제 변이체를 위한 발현 플라스미드를 문헌[Lassen et al. (2001), Applied and Environmental Micorbiology, 67, 4701-4707]에 기재된 바와 같이 아스퍼질러스에서 형질전환시켰다. 각각의 작제물에 대해 4~6개의 균주를 단리시키고, 정제시키고, 마이크로타이터플레이트에서 배양하였다. p-니트로페닐 포스페이트 기질을 사용하여 발현을 결정하였다. 최고의 생산 균주를 진탕 플라스크에서 발효시켰다.

씨. 브라키 피타제 변이체의 정제

피타제 변이체가 있는 발효 상청액을 0.22 ㎛ 컷오프가 있는 Fast PES Bottle top 필터를 통해 여과하였다. 생성된 용액을 물로 2배 부피로 희석시키고, pH를 아세트산으로 4.5로 조정하였다. 때때로, 용액이 약간 흐려졌고, 이것을 0.22㎛ 컷오프가 있는 Fast PES Bottle top 필터를 통한 여과에 의해 제거하였다.

전처리 후, 피타제 변이체를 완충액 A로서 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.5) 및 완충액 B로서 50 mM 아세트산나트륨 + 1 M NaCl(pH 4.5)을 사용하여 XK26 컬럼에서 대략 30 ㎖의 S Sepharose 상의 크로마토그래피로 정제시켰다. 컬럼으로부터의 분획을 포스파타제 검정(하기 참조)을 사용하여 활성에 대해 분석하였고, 활성이 있는 분획을 풀링시켰다.

일부 경우에, 정제된 피타제 변이체를 함유하는 용액을 30 kDa 컷오프 막이 있는 Amicon ultra-15 여과 장치를 사용하여 농축시켰다.

SDS-PAGE로부터 추정된 분자량은 약 45 내지 50 kDa이었고, 순도는 95% 초과였다.

포스파타제 활성의 결정

75 마이크로리터의 피타제-함유 효소 용액을 마이크로타이터 플레이트 웰, 예를 들어, NUNC 269620에 분배하고, 75 마이크로리터의 기질을 첨가한다(기질 제조를 위해, 2개의 5 mg의 p-니트로페닐 포스페이트 정제(Sigma, 카탈로그 번호 N-9389)를 10 ㎖의 0.1 M Na-아세테이트 완충액, pH 5.5에 용해시킨다). 플레이트를 밀봉하고 15분 동안 인큐베이션시키고, 37℃에서 750 rpm으로 진탕한다. 인큐베이션 시간 후 75 마이크로리터의 정지 시약을 첨가하고(정지 시약은 물에 중의 0.1 M 디소듐테트라보레이트임), 마이크로타이터 플레이트 분광광도계에서 405 ㎚에서의 흡광도를 측정한다. 1의 포스파타제 단위는 주어진 반응 조건에서 분당 1 마이크로몰의 인산염을 방출하는 효소 활성으로 정의된다(완충제 블라인드 차감). 1 마이크로몰의 p-니트로페놀의 흡광도를 검정 조건 하에서 56 AU(AU= 흡광도 단위)로 결정한다.

피타제 활성의 결정

0.25 M의 아세트산나트륨, 0.005%(w/v) Tween-20, pH 5.5에 적절하게 희석된 75 마이크로리터의 피타제-함유 효소 용액을 마이크로타이터 플레이트 웰, 예를 들어, NUNC 269620에 분배하고, 75 마이크로리터의 기질을 첨가한다(쌀로부터의 100 ㎎의 피트산나트륨(Aldrich 카탈로그 번호 274321)을 10 ㎖의 0.25 M 아세트산나트륨 완충액, pH 5.5에 용해시켜 제조함). 플레이트를 밀봉하고 15분 동안 인큐베이션시키고, 37℃에서 750 rpm으로 진탕한다. 인큐베이션 후, 75 마이크로리터의 정지 시약을 첨가하고(정지 시약은 10 ㎖의 몰리브데이트 용액(0.25%(w/v) 암모니아 용액에 10%(w/v) 암모늄 헵타-몰리브데이트를 혼합하여 제조함), 10 ㎖의 암모늄 바나데이트(0.24%, Bie&Berntsen의 시판 제품, 카탈로그 번호 LAB17650) 및 20 ㎖의 21.7%(w/v) 질산을 혼합함으로써 제조함), 마이크로타이터 플레이트 분광광도계에서 405 ㎚에서의 흡광도를 측정한다. 피타제 활성은 FYT 단위로 표현되며, 1 FYT는 상기의 조건에서 분당 1 마이크로몰의 무기 오르토-포스페이트를 유리시키는 효소의 양이다. 측정된 피타제 활성의 절대값은 무기 인산염의 적절한 희석액으로부터 생성된 표준 곡선을 참조하거나, 알려진 활성을 갖는 피타제 효소 제제의 희석액으로 생성된 표준 곡선을 참조하여 얻을 수 있다(알려진 활성을 갖는 이러한 표준 효소 제제는 요청 시 Novozymes A/S(DK-2880박스바에르트 크록쇼이베이 36 소재)로부터 입수 가능함).

실시예 2: 단일 위치 변이체

본 실시예에 대한 모체 피타제는 치환: (var300) N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 갖는 서열번호 2의 서열을 갖는 변이체였다.

모체 피타제의 96개의 단일 위치 변이체를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 치환은 공지된 피타제의 정렬 및 당업계에 공지된 공통 서열의 식별에 기초하여 선택하였다. 변이체의 열안정성은 제조사의 지침에 따라 Protein Thermal Shift™(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 시험하였다. 모체와 비교하여 개선된 열안정성을 갖는 변이체를 표 1에 제시한다.

[표 1]

실시예 3: 이로운 위치 조합

실시예 2에 개시된 결과에 기초하여, 다음 치환을 갖는 서열번호 2의 서열을 갖는 몇몇 이로운 치환을 조합한 변이체를 생성시켰다:

실시예 1에 기재된 바와 같이 유전자를 설계하고 변이체를 생성시켰다. 81℃를 나타내는 변이체에 대해 열 이동 검정을 3회 수행하였다.

실시예 4: 추가 조합 변이체

실시예 2에 개시된 결과에 기초하여, 모체 피타제로서 실시예 3에서 생성된 변이체를 사용하여 추가로 이로운 치환을 조합한 변이체. 치환을 갖는 서열번호 2의 서열을 갖는 다음 변이체를 생성시켰다:

실시예 5: 생성된 변이체의 열안정성

하기 변이체를 작제하였고, 열안정성에 대해서 시험하였다.

[표 2]

변이체를 나노 시차 주사 형광(nanoDSF)에 의해 열안정성에 대해 시험하였다.

Nano-DSF는 330 및 350 ㎚에서 온도의 함수로서 단백질의 고유한 트립토판(Trp) 형광을 모니터링한다. 단백질의 온도 안정성은 형광 신호의 변곡점에서 발견되는 Tm(폴딩된 분자와 언폴딩된 분자의 동일한 집단이 존재하는 온도)로 표현될 수 있다.

nanoDSF Prometheus NT.48 기기(NanoTemper Technologies GmbH(독일 뮌헨 소재))로 NanoDSF를 수행하였다. 피타제 변이체 샘플(실시예 1에 기재된 바와 같이 정제됨, 이들 모두 50 mM Na-아세테이트, pH 4.5 중에 존재함)을 모세관 작용을 통해 nanoDSF 표준 등급 모세관(NanoTemper Technologies GmbH; 카탈로그 번호 PR-C002)에 로딩하였다. 각각의 샘플에 대해 3개의 모세관을 채웠다. 그 다음 모세관을 기기에 넣고(최대 48개의 단일 모세관을 단일 실행으로 로딩할 수 있음), 최적의 신호 생성에 필요한 레이저 강도를 결정하였다. 샘플을 하기 실험 설정으로 실행하였다: 온도 기울기 2℃/분, 시작 온도 20℃ 및 종료 온도 95℃.

기기와 함께 제공된 소프트웨어(PR. ThermControl v2.0.4, NanoTemper Technologies GmbH)를 사용하여 데이터를 분석하고, Tm(비율 350 ㎚/330 ㎚에 대해)을 결정하였다(결과는 아래 표 3에 표시됨).

추가로 WO 2011/117396의 실시예 4에 개시된 검정을 사용하여 DSC를 사용하여 변이체를 시험하였다. 결과를 표 3에 제시한다.

[표 3]

변이체를 또한 NanoDSF(상기에 기재됨)를 사용하여 pH 범위 1.0 내지 8.5에서 열안정성에 대해 시험하였다. 변이체 샘플은 0.5 M HCl 또는 0.1 M NaOH로 목적하는 pH로 조정된 0.1 M 글리신, 0.1 M 아세트산, 0.1 M Bis-Tris 중에 존재하였다. 본 실험에서 온도 기울기는 3.33℃/분이었다. 결과를 하기 표 4a 및 표 4b에 제시한다.

[표 4a]

[표 4b]

결론: 변이체는 시험된 모든 pH 값에서 언폴딩 온도가 증가하였다. 변이체는 모든 pH에서 야생형에 비해 열안정성이 개선되었다.

실시예 6: pH-안정성

37℃에서 그리고 다양한 pH 값에서 1.0시간 및 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 잔류 피타제 활성을 측정함으로써 37℃에서 C.b. Wt(서열번호 2)의 정제된 피타제 및 var400(서열번호 12)의 pH 안정성을 결정하였다. 피타제를 목적하는 pH로 조정된 0.1 M 글리신, 0.1 M 아세트산, 0.1 M Bis-Tris에서 인큐베이션시켰다. 각각의 인큐베이션 혼합물의 샘플을 0, 1.0 및 24시간 후에 회수하고, 샘플의 pH를 0.25 M 아세트산나트륨, 0.005%(w/v) Tween20(pH 5.5)에 희석시켜 5.5로 조정하고, pH 5.5에서의 잔류 활성을 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다. 0시간에서 발견된 활성으로 정규화된 결과를 24시간 동안 하기 표 5에 제시한다.

[표 5]

Var400은 24시간 인큐베이션 후 매우 낮은 pH(pH 1.0~3.0)에서 인큐베이션 후 더 높은 잔류 활성을 갖는다.

실시예 7: 펩신의 존재 하에서의 pH-안정성

37℃에서 그리고 다양한 pH 값에서 각각 30분 및 60분 동안 인큐베이션시킨 후 잔류 피타제 활성을 측정함으로써 37℃에서 그리고 펩신의 존재 하에서 C.b. Wt(서열번호 2)의 정제된 피타제 및 변이체(하기 표 참조)의 pH 안정성을 결정하였다. 피타제를 목적하는 pH로 조정된 0.1 M 글리신, 0.1 M 아세트산, 0.1 M Bis-Tris에서 인큐베이션시키고, 500 U/㎖의 펩신(Sigma P7000)을 첨가하였다. 각각의 인큐베이션 혼합물의 샘플을 0분, 30분 및 60분 후에 회수하고, 샘플의 pH를 0.25 M 아세트산나트륨, 0.005%(w/v) Tween20(pH 5.5)에 희석시켜 5.5로 조정하고, pH 5.5에서의 잔류 활성을 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다. 0시간에서 발견된 활성으로 정규화된 결과를 하기 표 6 및 표 7에 제시한다.

[표 6]

[표 7]

변이체는 var300 참조에 비해서 3.0 미만의 pH-값에서 펩신의 존재 하에서 증가된 pH-안정성을 갖는다.

실시예 8: 브로일러 닭 및 젖을 뗀 새끼돼지(Weaned Piglet)의 피타제의 효능 연구

브로일러 연구에서, 닭(Cobb 500, 수컷, Yukou Poultry Husbandary Co., Ltd.(중국 베이징 소재)에서 시판)를 환경 제어실의 철조 바닥 배터리 케이지에 수용하였다. 실험 시작(8일령) 시에, 닭을 무게별로 분류하고, 각각 8마리의 닭을 포함하는 반복군으로 나누었다. 유사한 케이지 무게를 가진 닭을 다른 처리 중 하나에 무작위로 할당하였고, 각각의 처리는 12개의 케이지를 사용하여 반복하였다. 음성 대조군 및 7가지 수준의 피타제 변이체(var400): 187.5, 375, 750, 1125, 1500, 1875 또는 2250 FYT/㎏가 보충된 음성 대조군으로 구성된 8종의 규정식 처리가 존재하였다. 기본 규정식은 옥수수분과 대두박을 주원료로 하여 제조되었고, 총 P(0.46%)만 부족하도록 제형화되었다. 혼합의 균일성을 보장하기 위해 피타제 변이체를 소량의 기본 규정식과 사전 혼합한 후 실험 규정식을 완전히 혼합하였다. 사료를 75℃에서 펠릿화하였다. 규정식 처리의 분석된 피타제 변이체 활성은 182, 328, 640, 1060, 1347, 1560 및 1931 FYT/㎏이었다.

실험 규정식을 8일령 내지 18일령의 닭에게 급여하였고, 사료 및 물은 전체 시험을 통해 자유식으로 제공하였다. 8일령 및 17일령에, 케이지별 사료 소비량 및 체중(BW)을 기록하여 체중 증가(WG), 사료 섭취량(FI) 및 사료 요구율(FCR)을 계산하였다. 배설물은 14일에서 17일까지 수집하였다. 이 기간 동안, 각각의 처리군의 12개 케이지로부터의 배설물을 1일 1회 정량적으로 수집하였고, 4일로부터의 케이지당 배설물을 함께 풀링시키고, 수집 후 -20℃에서 즉시 동결시켰다. 해동 후, 각각의 케이지의 총 배설물을 균질화하고, 대표적인 하위 샘플을 채취하고, 건물(DM), P, Ca 및 피테이트-P를 결정하기 위해 동결 건조시켰다. 배설물 수집 기간 동안 총 사료 소비량을 또한 기록하였다. 18일령에, 12개의 반복 케이지 각각에서 무작위로 선택된 2마리의 닭에서 우측 경골을 채취하였다. 경골을 제거하고, 연골 캡을 수집 후 제거하였다. 이들을 애쉬(ash), Ca 및 총 P 함량 분석 시까지 습기를 유지하기 위해 -20℃에서 비닐 봉지에 냉동 보관하였다.

새끼 돼지 연구에서, 140마리의 거세된 수컷 새끼 돼지(Redon x Large White)를 사용하였다. 새끼 돼지는 28일령에 젖을 뗐고, 실험 시작 시 평균 체중은 7.5±1.1 ㎏(평균 ± 표준 편차)이었다. 새끼 돼지를 환경 제어실에서 케이지당 4마리의 동물로 35개의 플랫-데크 케이지에 수용하였다. 각각의 케이지는 플라스틱 코팅된 용접 와이어 바닥이 있고, 2개의 물 꼭지 및 2개의 스테인리스강 급여 장치가 있다. 실험 규정식을 42일 동안 급여하였고, 스타터 단계(starter phase)는 14일, 성장기 단계(grower phase)는 28일로 나누었다. 물 및 사료는 자유식으로 급여하였다. 사료는 매쉬 형태로 제공하였다.

양성 대조군(PC), 음성 대조군(NC) 및 187.5, 375, 750, 1500 또는 3000 FYT 시험 피타제/㎏ 사료(분석 시: 스타터 규정식에서는 266, 383, 771, 1445 및 2914 FYT/㎏; 성장기 규정식에서는 219, 395, 884, 1408 및 2730 FYT/㎏)가 보충된 NC로 이루어진 7개의 규정식 처리가 존재하였다. 스타터 단계 및 성장기 단계의 PC 규정식은 NRC(2012)에서 규정한 체중 범위가 각각 7 내지 11 ㎏ 및 11 내지 25 ㎏인 돼지의 에너지 및 영양소에 대한 요구 사항을 충족하였으며, 주성분으로 옥수수, 대두박 및 평지씨박으로 제형화되었다. NC 규정식은 PC 규정식에서 인산이칼슘을 제거하여 적절한 Ca가 포함된 P 결핍 규정식(스타터 및 성장기에 대해 각각 0.43% 및 0.41%의 총 P)를 초래함으로써 확립되었다. 규정식의 성분 및 영양소 조성을 표 8에 제시한다.

[표 8]

돼지를 개별적으로 칭량하고, 각각의 우리에 대해 사료 소비량을 기록하여 평균 일일 증체량(average daily gain: ADG), 평균 일일 사료 섭취량(ADFI) 및 FCR을 계산하였다. 시험 종료 시, 우리의 평균 체중에 가장 가까운 체중을 갖는 각각의 우리의 돼지 2마리를 대퇴골 수집을 위해 도살하였다. 우측 대퇴골을 분리하여 연조직을 제거하였다. 톱질하여 각각의 대퇴골의 골간 단면(길이 3.5 cm)을 얻은 다음 압축을 가해 뼈를 부러뜨리는 뉴턴 단위의 힘을 결정하였다. 부러진 뼈를 애쉬, Ca 및 P 함량을 결정하는 데 사용하였다.

브로일러 및 돼지 실험에서 수집된 사료 및 배설물의 샘플을 0.5 mm 스크린을 통과하도록 분쇄한 후 분석하였다. 모든 샘플을 이중으로 분석하였다. 건물 결정을 위해 샘플을 오븐에서 105^oC로 4시간 동안 건조시켰다(방법 934.01; AOAC International, 2006). 황산 무기물화 후 유도 결합 플라즈마-광학 방출 분광법(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry)(ICP-OES; 5100 Dual View, Agilent(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재); 방법 985.01; AOAC International, 2006)에 의해 Ca 및 P를 결정하였다. 총 P와 유리 P 사이의 차이로 규정식 피테이트 P를 계산하였다. 규정식 샘플을 피타제의 메가도스로 처리하여 피테이트에 의해 결합된 P를 방출시킨 후 총 P를 결정하였다. 0.66 M HCl에서 밤새 추출한 후 피테이트에 의해 결합되지 않은 유리 P를 결정하였다. 파티제 활성을 비색법으로 측정하였다. 1 피타제 단위는 37℃ 및 pH 5.5에서 분당 5.0 mM 피테이트로부터 1 μ㏖의 무기 인산염을 방출하는 효소의 양으로 정의된다.

브로일러 및 돼지 실험 둘 다에서, SAS의 GLM 절차(SAS Inc.(미국 노쓰캐롤라이나주 개리 소재), 버전 9.0)를 사용하여 일원 ANOVA로 데이터를 분석하였다. NC 규정식에 대한 피타제 변이체 보충의 선형 및 2차 효과를 시험하기 위해 직교 대조를 구축하였다. Tukey의 다중 비교 검정을 또한 브로일러 실험에 적용하였다. 최소 제곱 평균을 제시한다.

결과

브로일러 연구에서, NC에서 닭의 체중 증가 및 사료 소비량은 8 내지 17일령 동안 Cobb 500 성능 목표보다 10~15% 낮았는데, 이는 NC 규정식의 P 결핍 때문이었다. NC 규정식에 피타제 변이체를 증가하는 양으로 첨가하면 제8일 내지 제17일에 닭의 체중 증가 및 사료 섭취량이 선형 및 2차적으로 개선되었다(p < 0.01). 피타제 변이체를 고용량으로 사용한 처리에서 성능 목표의 달성이 관찰되었지만 부작용은 나타나지 않았다. 또한 배설물로부터의 데이터는 피테이트-P 분해로부터의 P 방출 및 상응하는 P 및 Ca 보유가 피테이트 변이체 보충의 증가로 선형 및 2차적으로 개선되었음을 입증하였다(p < 0.01). 성능 및 배설물 결과와 일관되게, Ca 및 P는 피타제 변이체 첨가의 증가에 따라 용량-의존적 방식으로 골회(bone ash)에 증가하게 침착되었다.

새끼 돼지 연구에서, 새끼 돼지의 성장 성능은 제14일 내지 제42일 그리고 전체 시험 기간 동안 PC에 비해 NC 새끼 돼지의 ADG 및 ADFI의 현저한 감소에 의해 입증된 바와 같이 사료 내의 P 결핍으로 인해 저하되었는데, 이는 피타제 변이체의 첨가 증가에 의해서 점차적으로 교정되었다. 시험 피타제는 피타제 변이체의 용량 증가에 따라 제14일 내지 제42일 동안 그리고 전체 시험 기간 동안 ADG 및 ADFI를 선형 및 2차적으로 개선시켰다(p < 0.01). 이 패턴은 시험 종료 시 새끼 돼지의 평균 체중에서도 관찰되었다. 성장 성능 결과를 따라가면서, 피타제 변이체 첨가와 관련하여 골 강도 및 애쉬, Ca 및 P의 골 함량에서의 유의한 개선(p < 0.01)이 또한 용량-반응 관계를 나타내었다. 또한, 본 연구에서 시험된 피타제 변이체의 최고 용량인 3,000 FYT/㎏ 사료에서 달성된 성장 성능 및 골 측정은 시험 동안 어떠한 눈에 띄는 부작용도 유발하지 않으면서 PC의 수준을 초과하였다. 이는 PC 규정식에서 인산이칼슘 형태로 공급된 Ca 및 P 둘 다가 3,000 FYT/㎏ 사료에 포함되었을 때 피타제 변이체로 완전히 대체될 수 있음을 나타낸다.

[표 9]

[표 10]

실시예 9: 피타제 변이체가 보충된 임신 말기 및 수유 중인 암퇘지에서 칼슘 및 인의 겉보기 총 소화관 소화율

본 연구의 목적은 Large white, Landrace 및 Duroc의 유전적 배경을 갖는 임신 말기 및 수유 중인 암퇘지에서 피타제 변이체(var400)를 평가하는 것이었고, National Research Council(NRC) (2012)에서 제안된 사료 성분용의 소화 가능한 P를 사용하여 제형화된 규정식을 급여하였다. 45마리의 임신 말기 암퇘지 및 45마리의 수유 중인 암퇘지를 실시예 1 및 2에서 각각 완전 무작위 설계로 사용하였다. 암퇘지에게 대조군 규정식(표 11) 및 187.5 또는 375 FYT 피타제/㎏ 사료가 첨가된 대조군 규정식을 제공하였다. 규정식에는 어떠한 무기 P 보충제도 없었고 소화 불가능한 마커로서 3 g/㎏의 TiO₂가 포함되었다. 분만 축사에 개별적으로 수용된 15마리의 암퇘지에서 각각의 규정식 처리를 반복하였다. 암퇘지를 5일 동안 실험 규정식에 적응하도록 한 후에 그랩 샘플링(grab sampling)에 의해 5일 분변을 수집하였다. 건물의 소화율, Ca 및 P를 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:

여기서 D_d 및 D_m은 각각 DM 및 미네랄의 소화율(%)이고; T_i 및 T_o는 각각 규정식 및 분변 중의 티타늄 농도(DM의 %)이고; M_i 및 M_o는 각각 규정식 및 분변 중의의 미네랄 농도(DM의 %)이다. 사료 내 Ca 및 P의 농도(%)에 상응하는 D_m을 곱하여 소화된 Ca 및 P를 계산하였다.

규정식 치료를 유일한 고정 효과 및 오차항으로 포함하는 모델을 사용하여 SAS(SAS Inst. Inc.(미국 노쓰캐롤라이나주 캐리 소재))의 GLM 절차로 소화율 및 성능 데이터를 분석하였다. 피타제 보충의 선형 및 2차 효과를 시험하고 대조군과 피타제가 첨가된 처리를 비교하기 위해 직교 대조를 구축하였다.

결과를 표 12에 제시한다. 피타제는 피타제 용량 및 암퇘지의 생리학적 단계에 따라 암퇘지에 대해 0.07~0.12%의 소화 가능한 P를 방출하였다(수유 중인 암퇘지의 경우 더 많은 P를 방출함).

[표 11]

[표 12]

실시예 10: 무지개 송어(rainbow trout)(옹코링쿠스 미키스( Oncorhynchus mykiss ))에서 피타제 효능

실험 규정식

표 13에 자세히 설명된 제형에 따라 빌리지 네프(Village-Neuf)(프랑스)의 Research Centre for Animal Nutrition & Health, DSM Nutritional Products의 실험 사료 밀에서 실험 규정식을 제조하였다. 규정식을 매시로 제조하고, 뷜러 이축 압출기를 사용하여 펠릿을 압출하였다. 압출 후 펠릿을 40℃로 가열한 오일과 피타제(var400)의 혼합물로 코팅하였다. 실험 규정식을 급식 시험 동안 4℃로 유지시켰다.

이론적 계산은 총 인의 경우 0.821%, 피테이트 인의 경우 0.326%, 피틴산의 경우 11.5 g/㎏이었다(Allix 3 소프트웨어에 따름, A-systems(프랑스 소재)).

어류 및 사육 시설

240마리의 단성(모두 암컷) 무지개 송어(IBW= 46.3 ± 1.2g)를 12개의 수조(250 ℓ; 수조당 20마리)에 무작위로 분배하였다.

[표 13]

급여

동물에게 91일 동안 급여하였다. 송어에게 주중에는 하루에 두 번(오전 및 오후) 손으로 급여하고, 주말에는 자동 급여기로 급여하였다. 모든 물고기에게 동일한 수온에서 유지되는 물고기에게 급여하는 유사한 상업적 규정식에 대한 급여량 표에 따라 급여하였다. 실험을 통한 사료 소비량 및 체중을 도 2에 나타낸다. 사료 소비량을 2주 기간 동안 주당 실제 섭취량 및 물고기의 성장(비성장률)을 기준으로 백분율로 계산했다. 사료 소비량은 실험 사료 급여 전체에서 2.31% 내지 1.65% 범위였다(도 2).

동물공학 매개변수

물고기를 시험 시작 시 개별적으로 칭량하고, 고려된 각각의 시점에서 물고기의 벌크 무게를 측정한 후 3개의 수조당 물고기의 평균 체중을 결정하였다. 벌크 중량을 2주마다 기록하였다. 취급 전, 물고기를 마취시켰다(0.08 g/ℓ 트리카인 메탄 설포네이트; MS222; PharmaQ Ltd.(노르웨이 오버할라 소재)).

다음 동물공학 매개변수를 측정/계산하였다.

- 생존율(%)

- 성능

- 초기 체중, IBW(g)

- 최종 체중, FBW(g)

- 체중 증가, FBW - IBW(g)으로서의 WG

- 비성장률, {100 * (ln (FBW/IBW)]} * d^-1 (%BW d^-1)로서의 SGR

- 사료 활용

- 사료 요구율, 사료 섭취 * 바이오매스 증가^-1(급여 상태 기준(as-fed basis))로서의 FCR

인 전신 보유율

인 전신 보유 시험 시작과 종료 시 전체 물고기를 샘플링하고, -80℃에서 냉동하여 인 전신 보유율을 분석하였다.

혈장

실험 급여 시험 종료 시, 수조당 5마리(처리당 15마리)를 80 ㎎ MS222·L^-1을 사용하여 개별적으로 마취시켰다.

리튬-헤파린 4.5 ㎖ 주사기를 사용하여 4 ㎖의 혈액을 샘플링하고 추가 처리까지 얼음에 두었다. 혈액 샘플을 원심분리(10분, 2000 g, 4℃)시키고, 1.5 ㎖ 혈장 분취물을 분석할 때까지 냉동(-20℃)시켰다. 샘플을 개별적으로 분석하였다.

샘플을 개별적으로 분석하였지만, 통계 목적을 위해 각각의 수조는 반복물로 간주되었다.

겉보기 소화율 계수(ADC)

인 ADC 결정을 위해 실험 급여 시작 후 77일 및 91일에 두 가지 다른 분변 수집을 수행하였다. 동물을 약하게 마취시키고(80 ㎎ MS222·L^-1), 각각의 물고기에 대해 3회 통과를 사용하여 복강에 압력을 가하여 장의 원위부로부터 분변을 수동으로 제거함으로써 각각의 수조 내의 모든 물고기의 분변 물질을 수집하였다. 두 수집일로부터의 샘플을 풀링시키고, 수조당 하나의 샘플을 저장 및 분석 전에 동결건조시켰다.

건물 기준으로 NRC(2001)에 의해 요약된 바와 같이 겉보기 소화율 계수(ADC)를 계산하였다:

CMf = 사료 중의 마커 농도; CMe = 분변 중의 마커 농도;

CNf = 사료 중의 영양소 농도; CNe = 분변 중의 영양소 농도

인 방출은 피타제 보충으로 인해 방출된 인의 %를 나타낸다. 이것은 다음과 같이 계산된다:

(사료의 총 P% × 인 ADCPHY X) - (사료의 총 P% * 인 ADC시험)

여기서 총 P%는 규정식 중의 인의 총 비율이고; ADCPHY X는 주어진 피타제 용량에서 인의 소화율이고; 인 ADC시험은 피타제 보충이 없는 시험 규정식의 인 소화율이다.

뼈 인 보유율

시험 시작과 종료 시, 수조당 5마리 물고기(처리당 15마리)의 3~4cm 슬라이드(도 3 참조)를 샘플링하고 -80℃에서 냉동하였다. 분석을 위해 뼈만 추가 처리하기 위해 피부와 살을 제거할 것이다.

분석 및 계산

사료, 배설물, 혈장, 전체 어류 및 척추 샘플 중의 영양소 함량의 분석을 표준 방법(VDLUFA 1976; AOAC, 2006)에 따라 수행하였다.

문헌[Zhai et al., 2001]에 따라서 총 P와 유리 P의 차이를 계산함으로써 몰리브덴산 암모늄을 사용하는 효소적 방법으로 효소 실험실 DNP R&D Solution Center(카우저라욱스트 소재)에 의해서 사료 내 피테이트-P를 측정하였다.

Dumas 방법(CP=N*6.25)을 사용하여 질소 분석기(FP 528, LECO(미국 세인트 요셉 소재))로 조단백질을 결정하였다.

단열 충격 열량계(C 2000 basic, IKA(독일 스타우펜 소재))를 사용하여 총 에너지 측정을 수행하였다.

황산 무기물화 후 DIN EN ISO 11885:1997 (DIN EN ISO 1998; AOAC, 2006)에 따라서 유도 결합 플라즈마-광학 방출 분광법(ICP-OES, 5100 Dual View, Agilent)에 의해서 사료 내 칼슘, 인, 아연 및 이트륨 산화물 농도를 결정하였다. 직접 주입에 의해 동결된 물 샘플에 대해 동일한 기기에서 인의 수분 분석을 수행하였다.

각각의 Roche Diagnostic 키트를 사용하여 Biomedical automatic COBAS 6000(Roche Diagnostics(CH-4202 바젤 소재))의 평균에 의해 P 농도의 혈장 농도를 결정하였다.

염산을 사용하여 고온 산성 에칭하고, 그 다음 석유 에테르로 연속 추출하고, 중량 측정 방법으로 결정하여 외부 회사인 Larebron에서 사료의 지질 분석을 수행하였다.

사료 내 피타제 분석은 독일 BioPract GmbH에서 ISO 30024:2009(Animal feeding stuffs ― Determination of phytase activity, https://www.iso.org/standard/45787.html)에 따라 수행하였다.

결과

표 14는 BioPract GmbH에서 얻은 분석 결과를 나타낸다.

[표 14]

물고기 행동 및 수질

전체 실험을 통해 사망률이 기록되지 않았고, 물고기는 모든 실험 규정식을 양호하게 허용하였다.

성능

표 15는 91일 실험 급여 기간 종료 시점의 동물학적 매개변수를 제시한다. 대조군 규정식은 가장 낮은 성장률을 나타내었다. 피타제로의 보충은 성장에 긍정적인 영향을 미쳤다. 이러한 경향은 용량과 관련이 있고, 1000 FYT/㎏ 군 성장에서 보충은 대조군보다 상당히 높았고; 유사하게, 2000 및 3000 FYT/㎏ 효소 보충을 사용한 동물은 1000 FYT/㎏보다 훨씬 더 양호하게 성장한다.

비성장률 및 사료 요구율은 또한 피타제의 임의의 포함 수준에 따라서 상당히 개선되었지만 포함 수준과는 독립적이었다.

[표 15]

전신 인 보유율

표 16은 미네랄 및 단백질에 대한 전신 보유율(섭취량의 %)을 나타낸다. 임의의 보충 용량에서 전신 아연 및 단백질 보유율의 현저한 개선. 인은 피타제가 1000 및 3000 FYT/㎏로 보충되었을 때 상당히 개선되었다. 놀랍게도, 2000 FYT/㎏의 피타제 포함은 중간 반응을 나타내었다.

[표 16]

혈장 중의 인 함량

혈장 인 농도는 피타제의 보충으로 유의하게 증가하였다. 외인성 효소의 보충은 대조군 규정식과 비교할 때 순환 인을 1.99, 2.3 및 2.44배 증가시켰다.

겉보기 소화율 계수(ADC)

건물, 단백질, 에너지 및 미네랄(인, 칼슘 및 아연)에 대한 분변 소화율을 표 17에 요약한다.

데이터는, 1000 FYT/㎏의 피타제를 보충하면 분변 건물, 에너지 소화율뿐만 아니라 분변 칼슘, 인 및 아연 소화율이 크게 개선된다는 것을 나타낸다. 피타제 1000 FYT/㎏, 피타제 2000 FYT/㎏ 및 피타제 3000 FYT/㎏에 대해서 인 소화율은 비-보충 대조군에 비해 각각 60.1, 82.9 및 89.7% 증가하였다. 따라서, 상기 결과에 기초하여, 본 발명의 양태는 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 예컨대, 500 내지 5000 FYT/㎏의 양으로 첨가하는 것을 포함하는 물고기 급여 방법에 관한 것이다. 전형적인 실시형태에서, 피타제의 양은 500 내지 3000 FYT/㎏, 예컨대 750 내지 3000 FYT/㎏, 예컨대 1000 내지 3000 FYT/㎏이다.

[표 17]

뼈 인 보유율

인의 보유율을 표 18에 요약한다. 척추에서, 애쉬의 백분율 및 인의 농도는 음성 대조군과 비교할 때 피타제 혼입으로 상당히 증가하였다.

[표 18]

결론

1000, 2000 및 3000 FYT/㎏의 피타제를 갖는 참조 규정식(0.74 총 인)의 보충은 실험 급여 91일 후 성장, 혈장 인 및 혈장 겉보기 소화율에서 용량 의존적이고 상당한 증가를 나타내었다. 임의의 수준의 피타제의 포함은 동물의 전신 및 척추에서 인의 보유율을 증가시켰다.

본 발명의 피타제는 피테이트로부터 인을 방출하는 데 효율적이며, 본 발명은 부분적으로 연어류 어류의 규정식에서 어분을 이러한 항영양 인자가 풍부한 식물성 원료로 대체할 때 피타제를 사용하는 것에 관한 것이다.

실시예 11: 식물성 단백질이 풍부한 규정식을 급여한 유럽 농어(디센트라추스 라브락스(Dicentrarchus labrax))의 성장 성능, 전신 영양소 보유율 및 영양소 소화율에 대한 단계별 보충 수준의 피타제의 효과

시험은 5가지 규정식 처리를 포함하였다: 총 규정식 인(P) 수준이 0.7%인 대조군 규정식(CTRL), 여기서 P의 상당한 분율은 피테이트-결합 P(0.3%)의 형태로 존재하였다. CTRL 제형에 기초한 3개의 다른 규정식은 단계별 용량(500, 1000 및 2000 FTY/㎏ 사료)으로 피타제(var400)가 보충되어 있다(규정식 PHY500, PHY1000, PHY2000). 코팅에 의해 피타제를 압출 후 적용하였다. 또한 CTRL 제형에 기초한 제5 규정식(MCP)은 총 P 수준 0.9%까지 인산일칼슘이 보충되어 있고, 해당 종의 알려진 요구 사항보다 높은 사용 가능한 P 수준을 제공하였다. 모든 규정식은 등질소, 등지방성 및 등에너지성이었다. 평균 초기 체중이 57.6 ± 3.8 g인 38마리의 유럽 농어 4중 군에 94일 동안 22.1 ± 0.4℃의 수온 프로파일에서 5가지 실험 규정식 중 하나를 급여하였다.

[표 19]

결과

시험 종료 시 최종 체중(FBW)은 142.0 내지 156.5 그램 범위였다. 최고 성능 처리(PHY2000)로부터의 물고기는 초기 체중(IBW)이 2.7배 증가한 것으로 나타났다. 제94일에 모든 보충된 규정식은 CTRL 규정식을 급여한 것보다 유의하게 더 높은 FBW 및 SGR을 초래하였다(P<0.05). PHY500, PHY1000, PHY2000 및 MCP 규정식을 급여한 물고기는 CTRL 규정식을 급여한 물고기보다 상당히 낮은 FCR을 나타내었다(P<0.05). CTRL 처리는 전신 인 보유율 및 인의 겉보기 소화율에 대해서 다양한 처리 중에서 상당히 낮은 값과 일관되게 연관되었다. 더 높은 피타제 보충 용량(1000 및 2000 FTY/㎏)은 전신 P 함량의 상당한 증가로 이어졌다(P<0.05). MCP 규정식을 급여한 물고기는, PHY1000 및 PHY2000 규정식을 급여한 물고기보다 훨씬 낮기는 하지만, CTRL 규정식을 급여한 물고기보다 훨씬 더 높은 전신 P 보유율을 나타내었다. 총 P 및 피테이트-P 소화율의 상당한 향상은 피타제 식이 용량 증가와 관련이 있는데, 규정식 치료 PHY2000이 PHY1000보다 훨씬 더 높은 P 소화율을 갖고 후자는 PHY500보다 훨씬 더 높은 P 소화율을 갖는다. 또한, 피타제 보충 용량(0, 500, 1000 및 2000 FTY/㎏)의 증가는 전신 인 보유율의 단계적 증가와 긍정적으로 연관되어 있다. 따라서, 상기 결과에 기초하여, 본 발명의 양태는 본 명세서에 정의된 바와 같은 피타제를 예컨대, 250 내지 5000 FYT/㎏의 양으로 첨가하는 것을 포함하는 물고기 급여 방법에 관한 것이다. 전형적인 실시형태에서, 피타제의 양은 300 내지 4000 FYT/㎏, 예컨대, 500 내지 3000 FYT/㎏이다.

[표 20]

[표 21]

[표 22]

결론

500 내지 5000 FTY/㎏ 사료, 예컨대 500 내지 3000 FTY/㎏, 예컨대 500 내지 2500 FTY/㎏, 예컨대 500 내지 2000 FTY/㎏, 예컨대 1000 내지 2000 FTY/㎏ 사료의 보충 용량의 피타제는 식물 단백질이 풍부한 규정식을 급여한 유럽 농어에서 성장률, 인 소화율, 전신 인 보유율을 향상시키고 FCR을 줄이는 효과적인 전략이다.

실시예 12: 물 단백질이 풍부한 규정식을 급여한 나일 틸라피아(Nile tilapia)(오레오크로미스 닐로티쿠스( Oreochromis niloticus ))에서 성장 성능, 전신 영양소 보유율 및 영양소 소화율에 대한 피타제의 효능

시험은 5가지 규정식 처리를 포함하였다: 총 규정식 인(P) 수준이 0.96%인 대조군 규정식(CTRL), 여기서 P의 상당한 분율은 피테이트-결합 P(0.6%)의 형태로 존재하였다. CTRL 제형에 기초한 3개의 다른 규정식은 단계별 용량(500, 1000 및 2000 FTY/㎏ 사료)으로 피타제(var400)가 보충되어 있다(규정식 PHY500, PHY1000, PHY2000). 코팅에 의해 피타제를 압출 후 적용하였다. 또한 CTRL 제형에 기초한 제5 규정식(DCP)은 총 P 수준 1.2%까지 인산이칼슘이 보충되어 있고, 해당 종의 알려진 요구 사항보다 높은 사용 가능한 P 수준을 제공하였다. 모든 규정식은 등질소, 등지방성 및 등에너지성이었다. 평균 초기 체중이 39.5 ± 1.4 g인 30마리의 틸라피아의 4중 군에 93일 동안 25.5 ± 0.4℃의 수온 프로파일에서 5가지 실험 규정식 중 하나를 급여하였다.

[표 23]

결과

시험 종료 시, 최고 성능 처리(PHY2000)로부터의 물고기는 초기 체중이 4.7배 증가한 것으로 나타났다. CTRL 규정식을 급여한 물고기는 다른 모든 규정식을 급여한 물고기보다 FBW, SGR, PER이 상당히 낮았고, FCR이 높았다(P<0.05). 더욱이, PHY1000, PHY2000 및 DCP 규정식을 급여한 물고기는 PHY500 및 CTRL 규정식을 급여한 물고기보다 상당히 높은 FBW 및 SGR을 나타내었다(P<0.05). PHY2000 규정식을 급여한 물고기는 PHY500 규정식을 급여한 물고기보다 상당히 낮은 FCR을 나타내었다(P<0.05). 사료 섭취량(FI)은 1일당 1.75 내지 1.82%ABW로 다양했으며 규정식 처리에 의해 크게 영향을 받지 않았다(P>0.05). CTRL 규정식을 급여한 물고기는 다른 모든 규정식을 급여한 물고기보다 전신 인(P) 함량이 상당히 낮았다(P<0.05). 피타제 보충 용량의 단계적 증가는 전신 P 함량의 유의한 증가를 초래하였다(P<0.05). 식이 피타제의 단계적 증가는 전신 P 보유율의 상당한 증가를 초래하였다(P<0.05). DCP 규정식을 급여한 물고기는, PHY1000 및 PHY2000 규정식(P<0.05)을 급여한 물고기보다 훨씬 낮기는 하지만, CTRL 및 PHY500 규정식(P<0.05)을 급여한 물고기보다 훨씬 더 높은 전신 P 보유율을 나타내었다. CTRL 규정식을 급여한 물고기는 다른 모든 규정식을 급여한 물고기보다 P 소화율이 상당히 낮았다(P<0.05). P 소화율의 상당한 향상(P<0.05)은 피타제 식이 용량 증가와 관련이 있는데, 규정식 치료 PHY2000이 PHY1000(P<0.05)보다 훨씬 더 높은 P 소화율을 갖고 후자는 PHY500(P<0.05)보다 훨씬 더 높은 P 소화율을 갖는다. DCP 규정식의 인 소화율은 PHY2000 규정식보다 상당히 낮았고(P<0.05) PHY500 및 CTRL 규정식(P<0.05)보다 상당히 높았다.

[표 24]

[표 25]

[표 26]

결론

500, 1000 및 2000 FTY/㎏ 사료, 예컨대, 500 내지 200 FYT/㎏의 보충 용량에서 피타제는 식물 단백질 풍부 규정식을 급여한 나일 틸라피아에서 성장률, 인 소화율, 전신 인 보유율을 향상시키고 FCR을 줄이는 효과적인 전략이다.

실시예 13: 식물성 단백질이 풍부한 규정식을 급여한 귀족 도미(스파러스 오라타( Sparus aurata ))의 성장 성능, 전신 영양소 보유율 및 영양소 소화율에 대한 등급화된 보충 수준의 피타제의 효과

시험은 5가지 규정식 처리를 포함하였다: 총 규정식 인(P) 수준이 0.78%인 대조군 규정식(CTRL), 여기서 P의 상당한 분율은 피테이트-결합 P(0.4%)의 형태로 존재하였다. CTRL 제형에 기초한 3개의 다른 규정식은 단계별 용량(500, 1000 및 2000 FTY/㎏ 사료)으로 피타제(var400)가 보충되어 있다(규정식 PHY500, PHY1000, PHY2000). 코팅에 의해 피타제를 압출 후 적용하였다. 또한 CTRL 제형에 기초한 제5 규정식(MCP)은 총 P 수준 1.1%까지 인산일칼슘이 보충되어 있고, 해당 종의 알려진 요구 사항보다 높은 사용 가능한 P 수준을 제공하였다. 모든 규정식은 등질소, 등지방성 및 등에너지성이었다. 평균 초기 체중이 55.3 ±4.1 g인 37마리의 귀족 도미의 4중 군에 94일 동안 22.4 ± 0.2℃의 수온 프로파일에서 5가지 실험 규정식 중 하나를 급여하였다.

[표 27]

결과

시험 종료 시 최종 체중(FBW)은 142.8 내지 157.5 그램 범위였다. 최고 중량 증가를 갖는 물고기는 초기 체중(IBW)이 2.8배 증가를 나타내었다. 비성장률(SGR)은 1.01 내지 1.11 %/일로 다양하였다. 제94일에 모든 보충된 규정식은 CTRL 규정식을 급여한 것보다 유의하게 더 높은 FBW 및 SGR을 초래하였다(P<0.05). PHY500, PHY1000, PHY2000 및 MCP 규정식을 급여한 물고기는 CTRL 규정식을 급여한 물고기보다 상당히 낮은 FCR을 나타내었다(P<0.05). CTRL 처리는 전신 인 보유율 및 인의 겉보기 소화율에 대해서 다양한 처리 중에서 상당히 낮은 값과 일관되게 연관되었다. 더 높은 피타제 보충 용량(1000 및 2000 FTY/㎏)은 CTRL 및 MCP 처리 둘 다에 비해서 상당한 전신 P 보유율로 이어졌다(P<0.05). 총 P 및 피테이트-P 소화율의 상당한 향상은 피타제 식이 용량 증가와 관련이 있는데, 규정식 치료 PHY2000이 PHY500보다 훨씬 더 높은 P 소화율을 갖는다 (P<0.05). 또한, 피타제 보충 용량(0, 500, 1000 및 2000 FTY/㎏)의 증가는 전신 인 보유율의 증가와 긍정적으로 연관되어 있다.

[표 28]

[표 29]

[표 30]

결론

500, 1000 및 2000 FTY/㎏ 사료의 보충 용량에서 피타제는 성장률 및 인 소화율을 향상시키는 데 효과적인 전략이다. 1000 및 2000 FTY/㎏ 사료의 보충 용량의 피타제는 식물성 단백질이 풍부한 규정식을 급여한 귀족 도미에서 전신 인 보유율을 상당히 증가시킨다.

실시예 14: 브로일러에서 피타제와 프로테아제의 효능

1,500 FYT/㎏의 피타제(var400) 및 30,000 U/㎏의 프로테아제(Ronozyme^®ProAct 360)를 갖는 사료를 사용하여 브로일러의 성장 성능에 대한 효과를 조사하였다. 수컷 브로일러(Ross 308)에게 부화 후 28일까지 표 31에 기재된 바와 같은 4가지 사료 중 하나를 급여하였다. 각각의 처리는 케이지 당 6마리의 8개의 복제 케이지를 가졌다. 시험에 사용된 기본 규정식은 표준 Ca, 표준 조단백질 규정식 또는 저함량 Ca, 고함량 조단백질 규정식을 갖는 규정식이었다(표 32).

[표 31]

[표 32]

결과

[표 33]

[표 34]

결론

추가의 1,000 FYT/㎏의 피타제와 조합하여 프로테아제를 급여한 브로일러는 단백질 소화율이 0.7 내지 1.6%, 단백질 보유율이 0.9 내지 4.4% 그리고 에너지 보유율이 0.6 내지 1.3% 증가되었다. 이는 체중 증가(BWG)의 2.3 또는 3.7% 그리고 사료 요구율의 4.6 또는 2.8%의 개선을 초래하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> PHYTASE VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME <130> 15106-WO-PCT[2] <150> EP20190917.3 <151> 2020-08-13 <150> EP20201328.0 <151> 2020-10-12 <150> EP21172706.0 <151> 2021-05-07 <150> PCT/CN2021/081613 <151> 2021-03-18 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1233 <212> DNA <213> Citrobacter braakii ATCC 51113 <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(1233) <220> <221> CDS <222> (1)..(1233) <400> 1 gaa gag cag aat ggt atg aaa ctt gag cgg gtt gtg ata gtg agt cgt 48 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 cat gga gta aga gca cct acg aag ttc act cca ata atg aaa aat gtc 96 His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val 20 25 30 aca ccc gat caa tgg cca caa tgg gat gtg ccg tta gga tgg cta acg 144 Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 cct cgt ggg gga gaa ctt gtt tct gaa tta ggt cag tat caa cgt tta 192 Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu 50 55 60 tgg ttc acg agc aaa ggt ctg ttg aat aat caa acg tgc cca tct cca 240 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 ggg cag gtt gct gtt att gca gac acg gat caa cgc acc cgt aaa acg 288 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 ggt gag gcg ttt ctg gct ggg tta gca cca aaa tgt caa att caa gtg 336 Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 cat tat cag aag gat gaa gaa aaa aat gat cct ctt ttt aat ccg gta 384 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 aaa atg ggg aaa tgt tcg ttt aac aca ttg cag gtt aaa aac gct att 432 Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ile 130 135 140 ctg gaa cgg gcc gga gga aat att gaa ctg tat acc caa cgc tat caa 480 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 tct tca ttt cgg acc ctg gaa aat gtt tta aat ttc tca caa tcg gag 528 Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu 165 170 175 aca tgt aag act aca gaa aag tct acg aaa tgc aca tta cca gag gct 576 Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala 180 185 190 tta ccg tct gaa ctt aag gta act cct gac aat gta tca tta cct ggt 624 Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly 195 200 205 gcc tgg agt ctt tct tcc acg ctg act gag ata ttt ctg ttg caa gag 672 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu 210 215 220 gcc cag gga atg cca cag gta gcc tgg ggg cgt att acg gga gaa aaa 720 Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 gaa tgg aga gat ttg tta agt ctg cat aac gct cag ttt gat ctt ttg 768 Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 caa aga act cca gaa gtt gcc cgt agt agg gcc aca cca tta ctc gat 816 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 atg ata gac act gca tta ttg aca aat ggt aca aca gaa aac agg tat 864 Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr 275 280 285 ggc ata aaa tta ccc gta tct ctg ttg ttt att gct ggt cat gat acc 912 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 aat ctt gca aat tta agc ggg gct tta gat ctt aac tgg tcg cta ccc 960 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 ggt caa ccc gat aat acc cct cct ggt ggg gag ctt gta ttc gaa aag 1008 Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys 325 330 335 tgg aaa aga acc agt gat aat acg gat tgg gtt cag gtt tca ttt gtt 1056 Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 tat cag acg ctg aga gat atg agg gat ata caa ccg ttg tcg tta gaa 1104 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 aaa cct gct ggc aaa gtt gat tta aaa tta att gca tgt gaa gag aaa 1152 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 aat agt cag gga atg tgt tcg tta aaa agt ttt tcc agg ctc att aag 1200 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 gaa att cgc gtg cca gag tgt gca gtt acg gaa 1233 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 2 <211> 411 <212> PRT <213> Citrobacter braakii ATCC 51113 <400> 2 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val 20 25 30 Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu 50 55 60 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ile 130 135 140 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu 165 170 175 Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala 180 185 190 Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly 195 200 205 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu 210 215 220 Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr 275 280 285 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys 325 330 335 Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 3 <211> 411 <212> PRT <213> Citrobacter braakii YH-15 <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(411) <400> 3 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asp Val 20 25 30 Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu 50 55 60 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Lys Val Lys Asn Ala Ile 130 135 140 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu 165 170 175 Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala 180 185 190 Leu Pro Ser Glu Phe Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly 195 200 205 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu 210 215 220 Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr 275 280 285 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Lys Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys 325 330 335 Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 4 <211> 411 <212> PRT <213> citronbacter freundii <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(411) <400> 4 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asp Val 20 25 30 Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu 50 55 60 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 Lys Met Gly Thr Cys Ser Phe Asn Thr Leu Lys Val Lys Asn Ala Ile 130 135 140 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu 165 170 175 Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala 180 185 190 Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly 195 200 205 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu 210 215 220 Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr 275 280 285 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys 325 330 335 Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 5 <211> 1236 <212> DNA <213> Variant of SEQ ID NO.2 <220> <221> CDS <222> (1)..(1233) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(1233) <400> 5 gaa gag cag aat ggt atg aaa ctt gag cgg gtt gtg ata gtg agt cgt 48 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 cat ggr gta aga gca cct acg aag ttc act cca ata atg aaa aat gtc 96 His Xaa Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val 20 25 30 aca ccc gat caa tgg cca caa tgg gat gtg ccg tta gga tgg cta acg 144 Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 cct cgt ggg gga gaa ctt gtt tct gaa tta ggt cag tat caa cgt tta 192 Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu 50 55 60 tgg ttc acg agc aaa ggt ctg ttg aat aat caa acg tgc cca tct cca 240 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 ggg cag gtt gct gtt att gca gac acg gat caa cgc acc cgt aaa acg 288 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 ggt gag gcg ttt ctg gct ggg tta gca cca aaa tgt caa att caa gtg 336 Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 cat tat cag aag gat gaa gaa aaa aat gat cct ctt ttt aat ccg gta 384 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 aaa atg ggg aaa tgt tcg ttt aac aca ttg cag gtt aaa aac gct att 432 Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ile 130 135 140 ctg gaa cgg gcc gga gga aat att gaa ctg tat acc caa cgc tat caa 480 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 tct tca ttt cgg acc ctg gaa aat gtt tta aat ttc tca caa tcg gag 528 Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu 165 170 175 aca tgt aag act aca gaa aag tct acg aaa tgc aca tta cca gag gct 576 Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala 180 185 190 tta ccg tct gaa ctt aag gta act cct gac aat gta tca tta cct ggt 624 Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly 195 200 205 gcc tgg agt ctt tct tcc acg ctg act gag ata ttt ctg ttg caa gag 672 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu 210 215 220 gcc cag gga atg cca cag gta gcc tgg ggg cgt att acg gga gaa aaa 720 Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 gaa tgg aga gat ttg tta agt ctg cat aac gct cag ttt gat ctt ttg 768 Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 caa aga act cca gaa gtt gcc cgt agt agg gcc aca cca tta ctc gat 816 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 atg ata gac act gca tta ttg aca aat ggt aca aca gaa aac agg tat 864 Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr 275 280 285 ggc ata aaa tta ccc gta tct ctg ttg ttt att gct ggt cat gat acc 912 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 aat ctt gca aat tta agc ggg gct tta gat ctt aac tgg tcg cta ccc 960 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 ggt caa ccs gat aay acc ccg ccg ggc gac aag ctt gta ttc gaa aag 1008 Gly Gln Xaa Asp Asn Thr Pro Pro Gly Asp Lys Leu Val Phe Glu Lys 325 330 335 tgg aaa aga acc agt gat aat acg gat tgg gtt cag gtt tca ttt gtt 1056 Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 tat cag acg ctg aga gat atg agg gat ata caa ccg ttg tcg tta gaa 1104 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 aaa cct gct ggc aaa gtt gat tta aaa tta att gca tgt gaa gag aaa 1152 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 aat agt cag gga atg tgt tcg tta aaa agt ttt tcc agg ctc att aag 1200 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 gaa att cgc gtg cca gag tgt gca gtt acg gaa taa 1236 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 6 <211> 411 <212> PRT <213> Variant of SEQ ID NO.2 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> The 'Xaa' at location 18 stands for Gly. <220> <221> misc_feature <222> (323)..(323) <223> The 'Xaa' at location 323 stands for Pro. <400> 6 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 His Xaa Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val 20 25 30 Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu 50 55 60 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 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Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg 325 330 335 Trp Lys Arg Leu Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 17 <211> 1360 <212> DNA <213> Citrobacter braakii <220> <221> gene <222> (1)..(1360) <400> 17 gggatccacc atgaagttct tcaccaccat cctcagcacc gccagccttg ttgctgctct 60 ccccgccgct gttgactcga accatacccc ggccgctcct gaacttgttg cccgggaaga 120 gcagaacgga atgaagttgg agcgagtcgt gattgtctcc aggcacggag tccgcgcccc 180 tactaagttc acgcctatca tgaagtgcgt cacccccgac gcctggcctc agtgggacgt 240 gtgtttggga tgtctcacgc cgcggggatg cgagctcgtc tcctacctcg gccactacca 300 gcgccagtgg ttcacatcga aaggactctt gcccaaccag acttgtcctt cgcccggaca 360 ggtcgcggtc attgcggata ccgaccagcg cacaaggaag accggtgagt gcttcctcgc 420 cggtttggcg cccaaatgtc agatccaggt ccattaccag aaagacgagt cgaaacccga 480 tcctttgttc aacccggtca aaaccggcaa atgtcagttc aacactgcgc aggtctgcaa 540 cgcaatcttg gaacgcgcag gaggtaacat tgagctcttc acacagcgat accagacggc 600 gttcaggacc ctcgaaaacg tcttgaactt ctcgcagtcg ccgtgctgta agaacaccga 660 gaagcagact aaatgtaccc tcacggaggc attgccttcc gagttgaagt gcactcccga 720 tctcgtgtcg ctcaccggcg cgtggtcgtt gtcgtcgaca ttgacggaga tcttcctcct 780 ccagcaggcc cagggcatgc ccgaggtcgc gtggggtagg atcaccggcg agaaggagtg 840 gaacgacctc ttgtccttgc ataacgcaca gttcgacttg ttgcagcgca cccccgaagt 900 ggcaaggtcg agggcaactc ccttgctcga tctcatcgat actgccctct tgaccaacgg 960 caccaccgaa agccggtacg gtatcaaatt gcccgtgtcc ctcttgttca tcgccggcca 1020 cgataccaac ttggcaaacc tctccggcgc cctcgatctc aactggtccc tccctggtca 1080 gccggataac accccgcctg gcggagagct cgtcttcgag cgctggaagc ggctgtcgga 1140 taacacggac tgggtccagg tctccttcgt ctatcagacc ttgagggata tgcgtgacat 1200 ccagcccctc tcgctggaga agcccgccgg taaggtggac ttgaaactca tcgcctgtga 1260 ggaaaagaac tcgcagggta tgtgttcgct caagtccttc tcgcggctca ttaaggagat 1320 ccgtgtgccc gagtgtgccg tcacagagta gctcgagatc 1360 <210> 18 <211> 411 <212> PRT <213> Citrobacter braakii <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(411) <400> 18 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Cys Val 20 25 30 Thr Pro Asp Ala Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Gly Cys Glu Leu Val Ser Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln 50 55 60 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Pro Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 Gly Glu Cys Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 His Tyr Gln Lys Asp Glu Ser Lys Pro Asp Cys Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 Lys Cys Gly Lys Cys Gln Phe Asn Thr Ala Gln Val Cys Asn Ala Ile 130 135 140 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Glu Leu Phe Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 Thr Ala Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Cys Cys Lys Asn Thr Glu Lys Gln Thr Lys Cys Thr Leu Thr Glu Ala 180 185 190 Leu Pro Ser Glu Leu Lys Cys Thr Pro Asp Leu Val Ser Leu Thr Gly 195 200 205 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln 210 215 220 Ala Gln Gly Met Pro Glu Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 Glu Trp Asn Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 Leu Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr 275 280 285 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg 325 330 335 Trp Lys Arg Leu Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 19 <211> 1360 <212> DNA <213> Citrobacter braakii <220> <221> gene <222> (1)..(1360) <400> 19 gggatccacc atgaagttct tcaccaccat cctcagcacc gccagccttg ttgctgctct 60 ccccgccgct gttgactcga accatacccc ggccgctcct gaacttgttg cccgggaaga 120 gcagaacgga atgaagttgg agcgagtcgt gattgtctcc aggcacggag tccgcgcccc 180 tactaagttc acgcctatca tgaagtgcgt cacccccgac gcctggcctc agtgggacgt 240 gcctttggga tggctcacgc cgcggggatg cgagctcgtc tcctacctcg gccactacca 300 gcgccagtgg ttcacatcga aaggactctt gcccaaccag acttgtcctt cgcccggaca 360 ggtcgcggtc attgcggata ccgaccagcg cacaaggaag accggtgagt gcttcctcgc 420 cggtttggcg cccaaatgtc agatccaggt ccattaccag aaagacgagt cgaaacccga 480 ttgtttgttc aacccggtca aatgtggcaa atgtcagttc aacactgcgc aggtctgcaa 540 cgcaatcttg gaacgcgcag gaggtagcat tgagctcttc acacagcgat accagacggc 600 gttcaggacc ctcgaaaacg tcttgaactt ctcgcagtcg ccgtgctgta agaacaccga 660 gaagcagact aaatgtaccc tcacggaggc attgccttcc gagttgaagt gcactcccga 720 tctcgtgtcg ctcaccggcg cgtggtcgtt gtcgtcgaca ttgacggaga tcttcctcct 780 ccagcaggcc cagggcatgc ccgaggtcgc gtggggtagg atcaccggcg agaaggagtg 840 gaacgacctc ttgtccttgc ataacgcaca gttcgacttg ttgcagcgca cccccgaagt 900 ggcaaggtcg agggcaactc ccttgctcga tctcatcgat actgccctct tgaccaacgg 960 caccaccgaa aaccggtacg gtatcaaatt gcccgtgtcc ctcttgttca tcgccggcca 1020 cgataccaac ttggcaaacc tctccggcgc cctcgatctc aactggtccc tccctggtca 1080 gccggataac accccgcctg gcggagagct cgtcttcgag cgctggaagc ggctgtcgga 1140 taacacggac tgggtccagg tctccttcgt ctatcagacc ttgagggata tgcgtgacat 1200 ccagcccctc tcgctggaga agcccgccgg taaggtggac ttgaaactca tcgcctgtga 1260 ggaaaagaac tcgcagggta tgtgttcgct caagtccttc tcgcggctca ttaaggagat 1320 ccgtgtgccc gagtgtgccg tcacagagta gctcgagatc 1360 <210> 20 <211> 411 <212> PRT <213> Citrobacter braakii <400> 20 Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Cys Val 20 25 30 Thr Pro Asp Ala Trp Pro Gln Trp Asp Val Cys Leu Gly Cys Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Gly Cys Glu Leu Val Ser Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln 50 55 60 Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Pro Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr 85 90 95 Gly Glu Cys Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val 100 105 110 His Tyr Gln Lys Asp Glu Ser Lys Pro Asp Cys Leu Phe Asn Pro Val 115 120 125 Lys Cys Gly Lys Cys Gln Phe Asn Thr Ala Gln Val Cys Asn Ala Ile 130 135 140 Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Phe Thr Gln Arg Tyr Gln 145 150 155 160 Thr Ala Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Cys Cys Lys Asn Thr Glu Lys Gln Thr Lys Cys Thr Leu Thr Glu Ala 180 185 190 Leu Pro Ser Glu Leu Lys Cys Thr Pro Asp Leu Val Ser Leu Thr Gly 195 200 205 Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln 210 215 220 Ala Gln Gly Met Pro Glu Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys 225 230 235 240 Glu Trp Asn Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu 245 250 255 Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 260 265 270 Leu Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Ser Arg Tyr 275 280 285 Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr 290 295 300 Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro 305 310 315 320 Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg 325 330 335 Trp Lys Arg Leu Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val 340 345 350 Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu 355 360 365 Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys 385 390 395 400 Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu 405 410 <210> 21 <211> 1341 <212> DNA <213> Citrobacter braakii <220> <221> gene <222> (1)..(1341) <400> 21 atgaagttct tcaccaccat cctcagcacc gccagccttg ttgctgctct ccccgccgct 60 gttgactcga accatacccc ggccgctcct gaacttgttg cccgggaaga gcagaacgga 120 atgaagttgg agcgagtcgt gattgtctcc aggcacggag tccgcgcccc tactaagttc 180 acgcctatca tgaagtgcgt cacccccgac gcctggcctc agtgggacgt gtgtttggga 240 tgtctcacgc cgcggggatg cgagctcgtc tcctacctcg gccactacca gcgccagtgg 300 ttcacatcga aaggactctt gcccaaccag acttgtcctt cgcccggaca ggtcgcggtc 360 attgcggata ccgaccagcg cacaaggaag accggtgagt gcttcctcgc cggtttggcg 420 cccaaatgtc agatccaggt ccattaccag aaagacgagt cgaaacccga ttgcttgttc 480 aacccggtca aatgtggcaa atgtcagttc aacactgcgc aggtctgcaa cgcaatcttg 540 gaacgcgcag gaggtaacat tgagctcttc acacagcgat accagacggc gttcaggacc 600 ctcgaaaacg tcttgaactt ctcgcagtcg ccgtgctgta agaacaccga gaagcagact 660 aaatgtaccc tcacggaggc attgccttcc gagttgaagt gcactcccga tctcgtgtcg 720 ctcaccggcg cgtggtcgtt gtcgtcgaca ttgacggaga tcttcctcct ccagcaggcc 780 cagggcatgc ccgaggtcgc gtggggtagg atcaccggcg agaaggagtg gaacgacctc 840 ttgtccttgc ataacgcaca gttcgacttg ttgcagcgca cccccgaagt ggcaaggtcg 900 agggcaactc ccttgctcga tctcatcgat actgccctct tgaccaacgg caccaccgaa 960 agccggtacg gtatcaaatt gcccgtgtcc ctcttgttca tcgccggcca cgataccaac 1020 ttggcaaacc tctccggcgc cctcgatctc aactggtccc tccctggtca gccggataac 1080 accccgcctg gcggagagct cgtcttcgag cgctggaagc ggctgtcgga taacacggac 1140 tgggtccagg tctccttcgt ctatcagacc ttgagggata tgcgtgacat ccagcccctc 1200 tcgctggaga agcccgccgg taaggtggac ttgaaactca tcgcctgtga ggaaaagaac 1260 tcgcagggta tgtgttcgct caagtccttc tcgcggctca ttaaggagat ccgtgtgccc 1320 gagtgtgccg tcacagagta g 1341 <210> 22 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Engineered variant <400> 22 Ala Val Pro Ser Thr Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser Ile Tyr Asn 1 5 10 15 Asp Gln Ser Ile Thr Lys Thr Thr Gly Gly Lys Gly Ile Lys Val Ala 20 25 30 Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Ser His Leu Asp Leu Ala Gly Ser 35 40 45 Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Asn Pro Leu Val Asp Gly 50 55 60 Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val 65 70 75 80 Leu Ala His Gly Gly Ser Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro 85 90 95 Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Lys Gly Glu Gly 100 105 110 Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala Asp Glu Ala 115 120 125 Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser 130 135 140 Ala Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Gly Lys 145 150 155 160 Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Lys Pro Asn 165 170 175 Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Gly Phe Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala 180 185 190 Leu Glu Asn Val Gln Glu Lys Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser 195 200 205 Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Ala Gly Asp Tyr Ile Ile Gln Glu Arg 210 215 220 Asp Ile Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Val Glu Ser Thr Trp Tyr 225 230 235 240 Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His 245 250 255 Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ala Asn Thr Ser Leu Ser 260 265 270 His Ser Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Val Tyr Asp 275 280 285 Ile Lys Gly Gly Ile Gly Ala Gly Pro Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly 290 295 300 Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys 305 310

Claims

서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열번호 2와 비교할 때 변경(alteration) N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 포함하고, 넘버링을 위해서 서열번호 2를 사용하여 30, 36, 43, 46, 57, 60, 64, 73, 79, 119, 121, 123, 130, 134, 138, 151, 155, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 207, 224, 230, 243, 273, 286, 336, 340, 358 및 375로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에 치환을 더 포함하는, 피타제 변이체(phytase variant).
제1항에 있어서, 57, 73, 121, 134, 155, 207 및 273번 위치에 치환을 포함하는, 변이체.
제2항에 있어서, 36, 60, 64, 73, 119, 130, 138, 161, 162, 168, 176, 180, 184, 190, 224, 230, 243, 336 및 340번 위치에 치환을 더 포함하는, 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환은 30Q, 36A, 43C, 46C, 57Y, 60H, 64Q, 73P, 79Q, 119P, 121P, 123C, 130T,C, 134Q, 138A, 151S, 155F, 161T, 162A, 168R, 176P, 180N, 184Q, 190T, 207T, 224Q, 230E, 243N, 273L, 286S, 336R, 340L,P, 358Q 및 375K 중에서 선택되는, 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 있어서, 치환 31C/52C/57Y/73P/99C/121P/134Q/141C/155F/177C/199C/203L/207T/273L을 포함하는, 변이체.
제5항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는 변이체 중에서 선택되는, 변이체:
제6항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는, 변이체:
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 피타제는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 변이체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 피타제는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 변이체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 치환 N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L을 갖는 피타제에 비해서 개선된 열안정성을 갖는, 변이체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터.
제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 피타제 변이체의 생산 방법으로서,
제13항의 숙주 세포를 상기 변이체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
상기 변이체를 회수하는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피타제 변이체 및/또는 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 식물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 피타제 변이체를 포함하는, 조성물.
제16항에 있어서,
적어도 1종의 지용성 비타민;
적어도 1종의 수용성 비타민; 및/또는
적어도 1종의 미량 미네랄
을 더 포함하는, 조성물.
제16항 또는 제17항에 있어서, 아밀라제, 피타제, 포스파타제, 자일라나제, 갈락타나제, 알파-갈락토시다제, 프로테아제, 포스포리파제 및/또는 베타-글루카나제인 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 효소를 더 포함하는, 조성물.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 사료 첨가제인, 조성물.
50 내지 800 g/㎏의 조 단백질 함량을 갖고, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피타제 변이체, 제11항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 동물 사료 조성물.
동물 사료의 영양값(nutritional value)을 개선시키는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피타제 변이체, 제11항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물이 상기 사료에 첨가되는, 방법.
식물성 단백질의 처리 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피타제 변이체, 제11항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 적어도 1종의 식물성 단백질 또는 단백질 공급원에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
동물의 체중 증가를 증가시키고/거나 동물의 사료 요구율(Feed Conversion Ratio)을 개선시키는 방법으로서, 상기 동물에게 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피타제 변이체, 제11항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 갖는 사료를 공급하는 단계를 포함하는, 방법.
동물 사료에서의; 동물 사료의 제제에서의; 동물 사료의 영양값을 개선시키기 위한; 동물 거름에서 피테이트 수준을 감소시키기 위한; 식물성 단백질을 처리하기 위한; 피테이트 기질로부터 인을 유리시키기 위한; 동물의 체중 증가를 증가시키고/시키거나, 비성장률(specific growth rate)을 개선시키고/시키거나 사료 요구율을 개선시키기 위한; 또는 동물에서 영양소 보유율(nutrient retention) 및/또는 영양소 소화율(nutrient digestibility)을 개선시키기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피타제 변이체, 제11항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 피타제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드:
a) 서열번호 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;
b) 서열번호 14와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;
c) 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
e) 서열번호 20과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드.
제25항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하기 특성 중 하나 이상을 포함하도록 pH 안정적이고 열안정적인, 단리된 폴리펩티드:
i. 적어도 75℃의 pH 4에서의 언폴딩(unfolding) 온도;
ii. 적어도 70℃의 pH 3에서의 언폴딩 온도; 및
iii. 적어도 55℃의 pH 2에서의 언폴딩 온도.
피타제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
(a) a. 서열번호 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b. 서열번호 15와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c. 서열번호 17과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d. 서열번호 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e. 서열번호 21과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서,
상기 폴리뉴클레오티드가 발현되고, 상기 폴리펩티드가 생성되는, 단계;
(b) 선택적으로 상기 폴리펩티드를 단리시키는 단계; 및
(c) 선택적으로 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계
를 포함하는, 방법.