WO2011000933A2 - Variants ameliores d'une phytase - Google Patents

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WO2011000933A2
WO2011000933A2 PCT/EP2010/059413 EP2010059413W WO2011000933A2 WO 2011000933 A2 WO2011000933 A2 WO 2011000933A2 EP 2010059413 W EP2010059413 W EP 2010059413W WO 2011000933 A2 WO2011000933 A2 WO 2011000933A2
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phytase
variant
improved
functional derivative
substitutions
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Stéphane BLESA
Hélène CHAUTARD
Marc Delcourt
Laurent Mesta
Bruno Winter
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03008—3-Phytase (3.1.3.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03026—4-Phytase (3.1.3.26), i.e. 6-phytase

Definitions

  • the present invention relates to the field of protein improvement and in particular that of proteins improved by molecular evolution.
  • HIIe relates to a variant of a phytase, said improved, in that it has a greater thermostability and / or activity than the original phytase.
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding the variant, a cassette or expression vector containing this variant, a host cell expressing this variant, a composition comprising said variant as well as uses thereof, mainly in the preparation of food additives and animal feed.
  • Phytate is the main phosphorus storage compound in the plant. This molecule, also called phytic acid or inositol hexa-phosphate (I ⁇ sl'6 or mvo-inositol hexakisphosphatc), consists of a cyclohexane on which are connected six phosphate groups. Phytate represents about 70% of the vegetable phosphate, the remaining 30% being present in free form. On the other hand, phosphate residues of phytate chelate divalent and trivalent cations such as metal ions calcium, iron, zinc, magnesium, copper, manganese and mohbdenum essential for nutrition.
  • Phytases are enzymes that hydrolyze phytules: these enzymes naturally release one or two phosphates, rarely three, then adsorbable in the digestive system: the other products of the reaction being rinositol-triphosphate reactivated, mainly of the iositol tetra- and penta-phosphate ( Figure 1).
  • Phylascs are a family of enzymes that are widely represented in nature: many organisms, from bacteria to plants to fungi and some animals, express one or more. Mammals, however, express none; ruminants or polygastric animals such as cows and horses have endogenous microorganisms specific to their gastrointestinal tract which can degrade the plntatc.
  • the objective of the present invention to overcome the current limits by generating a phytase that is sufficiently active to significantly affect the need for supplementation. phosphates, and enough power for £ thermnstahlc be added directly to food animals without the use of sprayage technique.
  • Phyuises isolated from fungi are numerous and come mainly from the ⁇ . ⁇ ergi / lus family but also from Absiili ⁇ , Ivn ⁇ hi ⁇ lophor ⁇ .
  • Some phytase from other fungi have shown interesting properties including highierii ⁇ qnes activities such as phyta.se of Tr ⁇ mcws piihesct-ns or Ia phytuse of Pcniophor ⁇ lycii (respectively 1200 l. Mg-1 and 1-Kiso U.mg in WO W28408).
  • Itttfosporiuiti ' shows an interesting phytase with a specific activity of 1 MO l '.my-l and a Km Je 1 5.2 ⁇ M but an optimal temperature busse at 40' - "C. Kgaleme ⁇ l the 6-ph ⁇ tase of Ccripnri ⁇ ⁇ .
  • the phytase of the application WO2007I 28 I60 has a high specific activity greater than 3000 I / mg. of the same order as the specific activity recorded for Yersinia pestis in WO2002048332.
  • WO2007128160 the intrinsic biochemical characteristics of the protein are claimed namely a molecular weight of 45.5 kl) a. an optimal pH of 4.0-5.0. an optimum temperature of 50-6 (PC. a theoretical pi of 7.7. a specific activ ity superior to 3000 l. " 'mg and high resistance to pepsin and your trypsin.
  • the present invention makes it possible to exceed current limits by proposing an improved variant by molecular evolution of the Yersinki intenncilia phtase.
  • improved variant means a variant having a greater degree of thermophilicity and / or activity than the phyiasis of origin of Yersinia irrigatoria. allowing it to be used in industrial processes and in particular as a food additive.
  • the present application discloses an improved variant of a phylase Ia whose sequence is SKQ ID NO: 1 or a functional derivative thereof, wherein it comprises at least one substitution on one of the amino acids of the group consisting of 1 * 3, V4. ⁇ 5. P8. T ' ) . GI O. VIo. V 17. LI 9.
  • the improved variant of the phytase whose sequence is SIiQ ID N 0 I or a functional derivative thereof comprises at least one substitution selected from the group consisting of P3L, P3V. V4G, ⁇ 5I ⁇ P8N. P8V. HI. '1 "9Q, T9S. P9Y. CilO ⁇ . GMLP. V16M Vl. 7W.
  • PI55N PI55T. L156N. F158N. IM58N • S 1601 “, Flh7N, ⁇ 177N, ⁇ 177S, AI 771 " .
  • the improved variant of phytaso whose sequence is SHQ II ) N r 1 or a functional derivative thereof.
  • ci comprises at least one combination of substitutions selected from the substitutions of the preceding group.
  • SHQ ID N -1 1 is the sequence appearing in the NC Bl database filed on October 20, 2005, only the entry number / P U0832361. however, not including the 23 amino acid signal sequence at the 5 'end of the protein.
  • SIiQ ID No. I corresponds to residues 24-4-41 in the previously cited entry number.
  • SKQ ID No. 11 also contains the nucleic sequence coding for the preceding pioleic sequence, referenced under the number NZ ⁇ I. FO 1000052 in the NCBI database.
  • a nucleic acid encoding a variant according to the present invention can easily be prepared on the basis of this sequence by techniques well known to those skilled in the art, for example by "directed mutagenesis of the eodon to be modified, to obtain the substitution of
  • the sequence of the improved variant of the phytasc according to the present invention corresponds to S1, JD N "1 including the selected substitution (s).
  • the improved variant of the present invention comprises a single substitution.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises at least one substitution on one of the amino acids of the group consisting of K20. Q30. Y51. 1 52. ( 1775) 1. VTv Q. 5. IN8 .9 ( K 1-129. H 130. D 140, T142. P155. F 167, ⁇ 177.0189. O ) I. K2I0, L219.1250. S251.1.252, L255, M263, Y2G8.0274, Q292, G293. P297, G3O8. N3I6, Q326. D349. cl 1-391. the positions being indicated in SHQ ID N 0 I.
  • the improved variant Ia present invention or a functional derivative thereof comprises substitutions on a back amino acids of the group 'consisting of K29. Q30. Y51.1,52. 075. C81, V93, Q95. R98, L99, F 129.11130. D 140. Tl 42. Pl 55, F167, ⁇ 177.0189, K201. K210. L2I9.1250. S251. L252. 1.255, M263. Y268.0274. Q292.0293.1 * 2 ⁇ 7. G308, N3I6. Q326, D349, and F.39I. the positions being indicated in SKQ ID N 0 I.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof includes substitutions on one of the amino acids of the group consisting of K29. QM). Y51, L52. O75. V93. R08, 1.99. ⁇ > 9.11130.
  • substitutions on the foregoing amino acids are selected from the group consisting of K29N. Q30D. Y51O. Y51Q. Y51W.1.520 (" 75R. V93 (i.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions selected from the group consisting of G274C ⁇ - N3I6C-. F142N ' - ⁇ 177T * Q326T.
  • K210S ⁇ Y268I- r ( ⁇ D 292P 1401- ⁇ - Y2 (.> 8H - Q292P FI67N * Y2 ⁇ 8l- t ⁇ > 292P I I42N.. + ⁇ 177T + K210S + Q326T.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions consisting of T142N * - ⁇ 177T + K210S + Y268L ⁇ Q292P +
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of I42N * ⁇ substitutions. 177T ⁇ K2i 0S + G274C Y2681- f * t Q292P N316C -.. Q326T positions being indicated in SKQ ID NO: 1 in another preferred embodiment of this particular embodiment I variant improved in present invention or a functional derivative it comprises a combination of substitutions consisting of TI42N + ⁇ I 77T-K2 I0S • Q32o T. the positions being indicated in SIiQ ID N 0 1.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions consisting of (f J274C N3 Î 6C, the positions being indicated in IF-Q ID NO: I.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions consisting of 1 142N- ⁇ I 77T f Q326T, the positions being indicated in SEQ ID NO: i.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions consisting of K.210S + Y268M f -Q2 ⁇ ⁇ 2P. the positions being indicated in SI-; Q ID NO 1 î.
  • the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions consisting of D 140 F + Y 268 I-! + Q2O2P. In another preferred embodiment of this particular embodiment, the improved variant of the present invention or a functional derivative thereof comprises a combination of substitutions consisting of F167N-YIhHIl 'Q292P.
  • the present invention relates to an improved variant of a phyta.se whose sequence is SIiQ ID N 0 I or a functional derivative thereof comprising the at least one substituted substituent.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding an improved variant of the phytase according to the present invention or a functional derivative thereof, an expression cassette comprising a nucleic acid according to the present invention, and a vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the present invention.
  • the vector may be preferably selected from a plasmid. a phage. a phagemid and a viral vector.
  • the present invention also relates to a composition comprising at least one improved variant of the phytase whose sequence is SMQ ID N ⁇ 1 or a functional derivative thereof with the one or more substitutions selected according to the present invention. It also concerns any solid mixture. liquid or gas comprising a certain percentage of at least one improved variant of the phytase according to the present invention. It also relates to mixtures preferably containing one, two, three, four, five or ten improved variants of the phylase according to the present invention or functional derivatives thereof.
  • the present invention also relates to compositions or preparations of phytase containing a certain percentage of at least one v Ariant improved ph) tasc according to the present invention or a functional derivative thereof and one or more other enzymes having properties av antagates.
  • Lu present invention relates to the use of an improved variant of the phytase of the present invention or a functional derivative thereof, for the preparation of a food additive.
  • IA presents invention relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding and / or containing at least one variant of the improved phvtase whose sequence is Sl] Q II) the NP or a functional derivative thereof with the one or more substitutions selected according to the present invention for transforming or trafecting a host cell ; It further relates to a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding an improved variant of the phylase according to present invention or a functional drift thereof.
  • the present invention also relates to the use of such a nucleic acid, such an expression cassette, such a vector or host cell to produce an improved variant of the phytase according to the present invention.
  • lillc also relates to a method for producing an improved variant of the phytase of the present invention comprising transforming or transiccti ⁇ n a host cell with a nucleic acid, expression cassette or a vector according to the present invention, culturing the transformed or truncated transfected cell and harvesting the improved variant of the phytase or a functional derivative thereof, produced by the host cell, the host cell may be procaryolc or cucaryote.
  • the hole cell may be a microorganism, preferably a bacterium, a yeast or a fungus.
  • the host cell may also be a mammalian cell such as a COS7 or CUO cell.
  • “functional derivative” is meant any compound derived from the phvlusc variant of the present invention comprising structural modifications while preserving phytase activity. These modifications can be, for example, an extension of the enzyme by addition of new domains, partial or complete substitutions of domains such as replacements of "siretches” of amino acids by amino acids of other enzymes that can confer other functions / properties.
  • “functional derivative” is also inclusive diinérisée form of the variant of the enzyme of the present invention, homo- or hommerodime tablette, or polymeric. having improved properties, such as thcnnostubilitû for example, by the multiplication of domains.
  • “functional derivative” is also understood a chimeric form of the phytase derivative of the present invention, fused with a protein / molecule of interest or with one or more domains of that enzyme of interest.
  • “functional derivative” is also meant a functional fragment of the phytase variant of the present invention preserving the activity of the phytase. This activity can be measured according to "one of the protocols described in Examples 4 and 5. The fragment may comprise 250. 275. 300, 325. 350. 375. 380. 385, WO. 395. 400. 405. 410 or 415 consecutive amino acids of the phytase according to the present invention This functional moiety may also be dimerized or polyniérisé and;..
  • variant or “mutant” is meant a nucleotide sequence exhibiting mutations with respect to a reference nucleotide sequence. These mutations can be silent due to the degeneracy of the genetic code: in this case the protein encoded by the variant is identical to the protein encoded by the reference nucleotide sequence. These mutations may also result in amino acid substitutions in read by Ic encoded protein variant as compared to the protein encoded by the nucleotide sequence of reference.
  • Variant includes sequences containing mutations obtained by directed muiagenesis. The term “variant” is assigned to the sequences nuciéotidique.s well as protein sequences encoded by iesdites nuclcotidiquus sequences. presenting said mutations.
  • the improved variant of the phyiase according to the present invention or a functional derivative thereof may comprise other substitutions on one of the amino acids of the group consisting of P3. V4. ⁇ 5. PX.19. CiK), V16. V17.1.19. S20. R21, 1122, C23. V24. R25. S26. I J 27. T28. K29, QV ) . T31. Q32, 133. M34.1) 36. P39. K41. W45. ⁇ 49. G50, Y5I.
  • substitutions may be so-called “conservative” substitutions, that is, substitutions within a group of amino acids with similar or equivalent characteristics, such as amino acids having a small footprint of acidic, basic, polar, hydrophobic and aromatic amino acids according to the table below:
  • the improved variant of the present invention or a derivative works! of it may include substitutions equivalent to the P276I substitution. described in the preceding group, such as 1 * 2761 substitutions. P276M or P276V according to the classification of the previous table. The above interpretation also applies to combinations of substitutions.
  • the improved variant of the plasmid according to the present invention or a functional derivative thereof may comprise other mutations not described in this urology. preferably substitutions, including some known in the art.
  • II * improved variant of ptiytase or a functional derivative thereof comprises at most 40. 35, 30, 25. 20. 15. 14. 13. 12. 1 1. IU. 9. 8, 7. 6. 5. 4.
  • the J ar variant improved on emend a variant having improved properties and particularly a et ⁇ the ⁇ nostrise> u a specific activity and / or increased expression compared to the parent phytasc
  • the variant improved by the present invention may have greater resistance to proteolysis. by proteases or other.
  • the increase in one or more properties of the improved variant of the phytase according to the present invention is at least 5%. preferably at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 or a factor of 2.5, K) or 100 relative to the properties of the parent phytase, measured under the same conditions experimental.
  • thermostabiiInstitut phytase can be measured by following the procedures in Example 5.
  • the specific activity of phytase read can be measured by following the procedures in Example 4.
  • I the expression of phytase can be measured following the procedures detailed in Examples 2 CL 3.
  • Such visualizations also allow, in a predictive approach, to target certain residues for mutage ⁇ ippoe experiments.
  • the targeted residues may be those which allow stiffening of the secondary structure. I ; such rigidificalion can be obtained in different ways; for example, the targeted residues may be substituted with a proline residue which.
  • the expression vector may be any type of recombinant vector (in particular, plasmid, virus, etc.) that makes it possible to express the nucleotide sequence of the improved variant of the present invention.
  • the choice of expression vector depends on its compatibility with the H ⁇ ie targeted expression in which it is processed or traasleclé.
  • This vector can be linear or circular closed. He can * e replicate autonomously, that is to say be a cxtruchrom ⁇ s ⁇ miquc entity! Has involvement is independent of the chromosome of the host that contains a plasmidc an extrachromosomal clement. a minichromosome or a .irtilkiel chromosome.
  • the vector can, when introduced into the host cell, s integrate into the host genome to replicate the same time as him. Also, several vectors may be required for the expression of the improved variant of the present invention and may be used simultaneously, as well as a transposon.
  • the vectors for expression of the improved variant of the present invention may contain one or more markers that allow easy selection of transformed or transfected host cells.
  • These selection markers are typically genes whose product confers an advantage on the host and allows, for example, bacterial resistance to an antibiotic, prototrophy for auxotrophs. resistance to heavy metals etc.
  • Examples of bacterial selection markers are genes that confer resistance to antibiotics IcIs as ampicillin, ka ⁇ amycin. Tetracyline and chloramphenol especially.
  • Markers suitable for selection in yeasts are, for example, the ⁇ DF ⁇ 2 genes. HIS3. I .I-U2. LYS 2. MIi Yi, TRJM and 1 : R ⁇ 3 in particular. Examples of markers used in the filamentous fungi were: AmdS (uelamidase).
  • argH tornithino earbamo ⁇ ltransferase bar phosphinolhricinicketyltransferase). liph (hygromycin phosphotransferase). niai ) (nitrate reductant), pyr (orotidine 5 '-phos ⁇ hate deearhoxyla.se), sC (adcnyltransicru.su sulfate) and trpC (anthranilate synthase). especially.
  • the vectors for expression of the improved variant of the present invention may not contain selection markers.
  • the vector, dnns Ie case of an autonomous réplieation must contain an origin of r ⁇ plication suitable host cell Ia.
  • bacterial origin of replication are, in particular, pBR322 plasmids. pl ,! C19, p ⁇ CYC 177 and p ⁇ CYC I 84 allowing replication in Esdiehchia coll. and pL ' BHO, pi-! l c > 4, pT ⁇ I 060 and p. ⁇ MjbetaJ allowing replication in Bacillus.
  • Examples of replication origin in yeasts are, without this list being exhaustive, the origins of 2 micron replieation. ⁇ RSJ. ⁇ RS4.
  • I vector e in the case of integration into Ic genome of the host cell should allow its integration with the coding sequence of the variant of the present invention improves or n 'any other suitable sequence into the vector. in a homologous or non-homologous recinbinization. It may also contain additional nucleic acid sequences to direct its integration into the genome of the host cell. To maximize the chances of integration into the host genome, the sequences of integration must be of sufficient length, such as 100 to 10,000 base pairs, 400 independentlyentielleme ⁇ l ⁇ 10,000, even more preferably 800-10000 base pairs.
  • the integration sequences may be coding or non-coding.
  • this sequence is also a parameter well known to those skilled in the art when an expression of the gene in question is desired in another organism or in another cellular compartment via a plasmid vector or AWRE chosen in line with the body of expression desired. So, this sequence can wax replaced by the signal sequence of other genes such as that of PeIIi, Pho ⁇ , OmpA or ⁇ -luctamasc in particular, for its expression in a prokaryotic host.
  • I .ors of expression in yeast such as Ichia pavions signal sequences present at P 5 'end of the phytase gene of Yersiniti inwnnedia may be the PI signal sequences K) ⁇ làctor I below respectively of a gene phnsphatase and ⁇ faet ⁇ r of this organism.
  • Sacchar ⁇ myccs ecrevisiae the same signal sequence can be used.
  • the signal sequence present at the 5 'end of the Yersinia hueniwdia phytase gene may be the XPR2 signal sequence of the same XPR2 gene. a protease of this organism.
  • the cell may be prokaryotic or cucalandotu: it may be a gram positive bacterium such as liacillus alkulmphil. liacillus ⁇ nyloliquefaciens, liaciilu.v hrevis. liacillus circulam. Bacillus clauxii. liacilhts coagulate. BtK he read liwtux. Iacilus Icntu *. liacillus tichvnifhrmis, Bacillus me ⁇ uie ⁇ um. liactllus swuroiherrm ⁇ hilus.
  • Ht here Uns .whtilis. liacillus tlmringk'tisis, Sireptomyccs lividam or Slrepiamyces murmusque. in particular, or a gram negative bacterium such as ' b ' scherichia cols or Psciuhmionas sp. for example, without this list being exhaustive.
  • the present invention also relates to a method of producing a soluble and active phytase or variant thereof in a bacterium, preferably Escherichia coli. comprising expressing a nucleic acid encoding the phytase or Ie variant thereof in a bacterium, preferably do Hscherichia coli. optionally recovering the phytase thus expressed.
  • the host cell may be a yeast of the genus ( 'anJiih. Llamen ⁇ la. Kkiyveromyccs. The Ichia, Siiccharomyces. SchKosacchar ⁇ mycws. Yarr ⁇ wia or, in particular. LEMENT the host cell can be Sucdiarotmrc.s Preferred carlshcrgemis. Saccharomyccs cvn'vi. ⁇ Iae.
  • the host cell may be a filamentous fungus of the genus Acrcmanium. Aspergillus. Aui T ohasidium. Hji-rkanderu. This is the case, the oprimts. ( 'Nriolus. The ryptococcus, the ilihasidium. ⁇ -u.suri ⁇ m. IlitmicoUt. Magnaporlhi. Yiiicor. ⁇ Lycclinphllmra., ⁇ C ⁇ c ⁇ illi ⁇ mtslix. ⁇ Ewnspora, Ptmciloinycvs. Pvmcillitun. P / uincmcluieie. Phlehiu.
  • Pir ⁇ myccs The Icin niiis. Schiiuphytlum. Talon mnves. Thcnuoascus. the hiulavia. the olyp ⁇ cladium. ⁇ mmctes. or Trichoi / erma.
  • the host cell may be activated by awamori. Aspergillus fumigatus. Aspergillus fungi ⁇ A ⁇ pergillus japonicus. Aspergillus nidukms. Aspergillus et / vr. Aspergillus oryzae, Culdariomyces jumago. Fusarium bactridiaiiies.
  • Fusarium cerealis Fusarhim crniikwi'ilense. Fusai htm culmorum. Fusarium ⁇ rc ⁇ minearum. Fusuhum hetymuspulum, Fusarium negwuti. Fusarium oxyspnrum. Fusarium reliadatum. Fusarium rosvttm. Fusarium sumhuumum, Fusarium sarcochrumum, Fusarium sparotrichioides. Fusarium sulphureum. Fusarium torulosum. Fusarium irichoihecioides.
  • the host cell may be a mammalian cell such as COS7 or CIK) (US 4.8iW.803: 1JS 5.047..V> 5).
  • Pure nucleic acid is understood to mean DNA (cDNA or gDNA), RNA or a mixture of both.
  • the nucleic acid may comprise modified nucleotides, including, for example, a modified linkage, a purified or modified pyrimidine bose, or a modified sugar. It can be prepared by any method known to those skilled in the art, including chemical synthesis, recombination, mulching. eic ...
  • An improved variant variant nucleic acid The phyiase according to the present invention can be optimized in terms of the codons constituting it to maximize its expression in a particular host different from its original organism. Since the universal genetic code is degenerate, there are several codons (codon-triplet of nucleotides) which encode a given amino acid. These homonymous codons are not used at random because the corresponding ⁇ UN ' t (transfer ⁇ RN) do not exist in all cells at the same concentrations. So that certain codons are less likely to be expressed in tissues where the corresponding ⁇ RNi is rare.
  • nucleic acids encoding the improved variant of the phytase of the present invention may require optimization to promote expression in the selected production host.
  • percent identity or identity between two nucleic acid sequences or amino acids within the meaning of In present invention, is intended to denote a percentage of nuciéotides or amino acid residues identical between two sequences to be compared ies, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length, the best alignment or alignment is the alignment for which the percentage identity between the two sequences compare, as calculated below, is the highest.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid sequences or amino ac ⁇ dcs are traditionally carried out by comparing these sequences after having aligned them optimally, said comparison being carried out by segment or by conipuraîMon window to identify and compare local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be realized, besides manually, with the nxne ⁇ of the algorithm the homologue.
  • Smith and Waterman's locality > 81) ( ⁇ dpp Maih 2: 482). using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (l ⁇ > 70) (J. Mol, Hiol 48: 443). using the similarity search method of Pearso ⁇ and Lipman (1 ⁇ > 88) (Rock Natl. adcad. Sci. USA 85: 2444). by means of computer software using these algorithms ( ⁇ i> P.HhSTI-TI.I- ' AST ⁇ and 1! " AS IA in the Wisconsin Cicnutics Software Package, Genets of the Computer Group, 575 Science Dr ..
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two sequences optimally aligned for comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared can comprise additions or deletions relative to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • I e percentage identity is calculated by determining Ic number of identical positions for which the nueléoude or the amino acid residue is identical between the two sequences, dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result obtained by I OD in. to get the percentage of identity between these two sequences.
  • the enhancement conferred by the selected substitution (s) in the improved variant of the present invention can be accomplished by performing an equivalent substitution in a phytase of another organism than that from which the phytase of the present invention originates. understood that these equivalent substitutions are within the scope of the present invention.
  • the improved variant of the phytase according to the present invention can be used in the aforementioned reactions and methods in a purified or partially purified form.
  • the purification of the variant of the phytase according to the present invention may be basic and carried out in particular by lysis and llltration of the content of the flasks or production containers and / or by centrifugation steps. and / or by selective latter successive precipitations ammonium sulfate and / or evaporation. These basic procedures make it possible to obtain fractions of the improved variant of the phytase according to the invention exhibiting a strong increase in specific activity.
  • the purified or partially purified fraction of the improved variant of the phytase according to the present invention can be used in the aforementioned reactions and methods in immobilized or non immobilized form.
  • Methods for immobilizing the improved variant of the present invention on organic or inorganic carriers are well known to those skilled in the art. These last may be especially polyacrylamides, agaroscs. celluloses, sephadex or dextrans. porous glass beads *, hydroxides of aluminum or tilanium.
  • composition is generally meant a composition comprising at least one improved variant of the phytase whose sequence is SLiQ ID N 0 I with or selected substitutions according to the present invention.
  • Kilo also relates to any solid, liquid or titer mixture comprising a certain percentage of at least one improved variant of the phytase according to the present invention.
  • LIIe also relates to mixtures eonte ⁇ .uu a. two, three, four, five or ten improved variants of the phytase according to the present invention.
  • the compositions containing phytases are liquid or so-called dry compositions.
  • the liquid compositions need not contain anything other than the highly purified phytase. However stabilizers such as glycerol. Sulfitol or monopropylene glycol can be added. Said composition may also contain other additives such as salts, sugars, preservatives, buffering agents opposite the fold, protein and phytate. Typical liquid compositions are aqueous compositions or oil-based suspensions. The liquid compositions may be added to the feed before or after an optional granulation step.
  • the so-called dry compositions can be dry compositions by freezing, spraying or extraded dry compositions: in these cases said composition does not need to contain anything other than the enzyme in its dry form.
  • the dry compositions can also be granules that may be mixed or ready to be with a food component, or form a component of a premix.
  • the size of the enzyme granules is preferably ,, compatible with the other components of chronic intestinal disease. This is a safe and convenient way to incorporate enzyme (s) into foods.
  • a stable formulation of enzyme may be prepared by spraying a liquid mixture of phytase on ⁇ m component Here soybean meal and then drying the assembly.
  • the decrease in the percentage of moisture and binding interactions of the phytase ⁇ DC component protect the enzyme external environmental factors such as extreme temperatures used during manufacture of the food component.
  • presentation as a dry preparation of Ia phyiase may increase stability by decreasing the activity of potential proteolytic enzymes may be present ii trace at the end of the liquid fermentation stages during the production process.
  • the dry phytase preparation can, for example, be used as a dietary supplement in the poultry and hog production industry.
  • granules are pre-prepared using agglomeration techniques well known to those skilled in the art, in a mixer inside which a filling material and the enzyme are co- agglomcrés to form granules, f es granules are prepared from the templates on which the enzyme can come s absorb or on which an enzyme layer can be applied.
  • Typical materials that can serve as a matrix are soils such as disodium sulfate.
  • Other potential matrices may be, or based on, clay, magnesium silicate, aluminum silicate or cellulose fibers.
  • binding agents such as dextrins may be included in the granules.
  • Trainers may be included in any of the following components: starch, cassava, potato, rice. corn. corn ... Salts can also be added.
  • the granules may be covered by specifically dedicated blends, and in particular hydrophilic mixtures, based on palm oil, beef tallow and, if necessary, other additives such as calcium carbonate and clay.
  • the phylaxis preparation may contain other agents such as coloring agents, aromatic compounds, stabilizers, vitamins, minerals as well as other enzymes or enzyme mixtures having advantageous properties. This is especially true for premixes.
  • a food additive is meant a substantially pure component or a composition containing several components for wax added to a food.
  • this additive is intended to become a full-fledged component of the food and ot aims to affect, modify, increase one / the properties of said food.
  • a phylase preparation used as a food additive means a pbytase which is not a natural component of the diet in which it is added, or which is not present in this food at its natural concentration, or which is added separately. mature components of the food, alone or in combination with other food additives. T> piqtiemont.
  • a food additive contains several components such as vitamins, minerals, entrainers, excipients, other enzymes or enzyme mixtures with advantageous properties.
  • a food additive is understood that is not produced in situ in food or animal feed.
  • a phytase or preparation can be given directly as food to humans or animals and preferably directly after mixing with other constituents of said food.
  • a food additive according to this aspect of the present invention is combined with other 23 compounds to produce a food. It is included in these other compounds one or more other enzymes, preferably thcrmosiables. vitamins food additives, mineral food additives, amino acids as food additives. Ie result of this mixture or this combination of compounds can be mixed in an appropriate proportion with other compounds such as protein supplements or cereal to form the final food.
  • phytase preparation or phyiase composition of the present invention are meant preparations or compositions which contain a significant amount of at least one improved variant of the phytase according to the present invention and one or more other enzymes having advantageous properties. for the preparation of food.
  • Such enzymes can belong to the following list without this being exhaustive: alpl ⁇ ugaiaclosid ⁇ ses. beta-galactosidases, in particular lactases, other phytases.
  • beta-lluea ⁇ ases in particular endo-beta-1,4-gli ⁇ canuscs and end ⁇ -bcta-).
  • -glucanascs celluloses, xyiosiduses, yalactanases. in the context of arabiuliogulactan-eiidu- 1.4-hetgalalaetosidus and arabino-ulactan-endo-1.3-beta-galutfosida.se:. cndoghicunases. especially e ⁇ do-! 2-betu glucanase. cnd ⁇ -l .3-alpha- ⁇ lucanasc.
  • pectin degrading enzymes especially peetinases. peciincsterases. pectin I vases. polygalacturonase. u ⁇ thinanu ⁇ es. rhuninogalacfuronases. ihamno ⁇ alacîiironan-sceiyl-esteiases. rhamnogalacluronan-alpha-rhamnosidase. peelate lyases. alpha-galaeturoni.sida.ses. mannanasos. beta- i ⁇ annosidases. mannan-acetyl-esierascs. xyian-acetyl-esteiases. proteases. xylanases, arabinoxylanases and lipolytic enzymes such as lipases, phospholipases and eutinases.
  • the addition of the feed additive to the animals according to the present invention can be done before or simultaneously with the meal. Preferably, the supplementation is done at the same time as the meal.
  • 1.1 no effective amount of phyta.se can be added in foods is from about 10 to 20000 I'U- 'kji food; preferably between 10 and 15000 PPU.'kg; more preferably between 10 and 10,000 PI 1 I '/ kg. In particular from 100 to 50 IW ) IMM. ks ". particularly from 100 to 2000 PPl ; ⁇ ky of uliment. 24
  • a variant improves the phytase according to the present invention in the manufacture of foods intended for human consumption or for animal feed.
  • Grains or meals for human consumption may be treated with phytase to reduce their phytate content.
  • a here phyiasis treatment can increase the efficiency of the production of this food.
  • the addition of phytase to white soy mocons during the soy protein extraction process can increase the yield and quality of the extracted proteins.
  • Phytase is active during food production but not in the final product.
  • soybean or col / a grains may be pretreated with phytase prior to manufacture and / or final packaging. Such pretreatment makes it possible to degrade ani-nutritional elements such as phytate and to increase the quality and the nutritional value of the foodstuffs in question. In that case. phytase may or may not always be active in the digestive tract of animals after they have been ingested.
  • L 'sl also included in the scope of the invention, the use of an improved variant of the phytase of the present invention as facilitaleur agent for food processing.
  • the phytase according to the present invention can be used as a supplement in the human diet to facilitate digestion.
  • a cachet (s) containing an adequate amount of phytase may be ingested by a person before consuming food in order to provide an active enzyme to his digestive tract.
  • the benefit of this phthalase ingestion is particularly remarkable in the case of consuming a food which can not be treated with phytase during its manufacture.
  • the phytase according to the present invention can be advantageously used with mono- or polygastric animal islands. especially young calves. Diets for fish and crustaceans can also be treated with phytase to improve conversion efficiencies between Iburnie Ia food and animal growth and 25 reduce the amount of phosphate excreted in intensive production systems.
  • Food treated according to the present invention may be supplied to poultry (turkeys, ducks, owls, partridges, chickens, broilers) to pigs, horses, cattle, goats, canines and retines.
  • KIIe is particularly suitable for poultry and pigs, including but not limited to hens, broilers, turkeys, ducks and geese.
  • I. phyta.se according to the present invention is used to produce novel combinations of food ingredients or foods with advantageous qualities. For example, it can be used to produce foods with a lowered inorganic phosphate content. This content is adjusted depending on the amount and activity of the added phytase, present in the final food or active in a food ingredient in the composition of the final food. In a preferred manner, such a food may contain ingredients which are microbiolitic. vitamins, amino acids and optimized and effective amounts of phytase and inorganic phosphate canvases that the amount of phytase is between 50 and 200 (JO units of phytase per kilogram of food and the amount of inorganic phosphate is less than 0.45%.
  • these two amounts are between 100 and 1000 phytase units per kilogram of feed and less than 0.225% inorganic phosphate; more preferably between 150 and 10,000 units of phytase per kilogram of feed and less than 5% of inorganic phosphate; even more preferably between 250 and 20000 phytase units per kilo of feed and no added inorganic phosphate.
  • These new combinations have various interests such as reducing the release of phosphate into the environment and optimizing the conversion efficiencies between the food supplied and the growth of the animals, which is particularly sought after in intensive livestock production.
  • Table 2 List of mutants having an additional glycosylation site classified according to their percentages of accessibility to the respective solvents.
  • fablcau 3 couples list of mutations permitting the addition of disulfuros additional bridges
  • Table 4 ⁇ extinction coefficients of activity for 80-20 K.2 I0S mutants. Y268: and Q292P.
  • Table 4C Coef cients of extinguishing activity for 80-20 T142-N mutants.
  • Block 3B I wastes substitutions targeting an improvement in activity characterized in a first series of experiments.
  • Figure 1 Degradation of phytate by a phytase
  • Mgurc ⁇ Measurement of ACLI ⁇ ities residual mutants Pl-I Y 1 Y JM 98-4X and 98-6X-products by Succhar ⁇ myccs cerevisiac after preheating from 0 to 2 minutes 80''C *.
  • Figure 4 Measurement of residual activity nants Phy- 1 MMX and J J HY- ⁇ > 8-6X produced by Sitccfuimtnive.s cerevisiue nréchaut ⁇ age after 15 minutes at temperatures of 45 ⁇ ca ⁇ C to 65 "C.
  • I- 'igure 5 Measurement of residual activities of mutants IM IY-98-4X IM and IY-98- ⁇ X produced by Sticcharnmy ⁇ L's vi'revistac crosschaul ⁇ age after 1 minute at temperatures from 60 0 C to 80''C.
  • Figure f> A Measurement of the residual activities of mutants PHY-W-6X and lM lY-W-6X-ssl I produced by Pidiia panions after a precaution tic 0 to 30 minuies at 80 1 C.
  • Figure 8 SDS-PACiI sky-12% of pn> deciding supernatants for different mutants expressed by Pichia pastoris. digested or not by Tendoglycosidase Hf.
  • the production of the improved variants of the phytase according to the present invention required the construction of plasmid vectors which make it possible to carry out the directed-oriented experiments required to obtain variant or mutant libraries as well as the expression of these mutants in different hosts. screening or production.
  • ORF Open Reading the train / P 00,832,561 corresponding to the sequence NCBI ⁇ TCC 2990Q cl Ia corresponding sequence micléotidique NZ ⁇ LI 01000052 region: 188 '
  • ORF Open Reading the train / P 00,832,561 corresponding to the sequence NCBI ⁇ TCC 2990Q cl Ia corresponding sequence micléotidique NZ ⁇ LI 01000052 region: 188 '
  • ORF ZP! 083 236 the cloned by molecular biology techniques well known to the skilled gifts pNCK the vector.
  • This vector makes it possible to express a fusion protein between a protein of interest and a thermostable resistance gene with kanamyein in a thermophilic Thriminus thurmapuHus miemorganism according to the method described in the patent application WO2006134240 and corresponding to the proprietary technique of Hiirmélhodes II. IR 'JM .
  • LORr from ZP 00832361 was cloned according to molecular biology techniques well known to those skilled in the art pYHS2. This ector, containing the peptide Pheniasis phyiasis was isolated at the 5 'position of IORF ZP 00832361, allowing expression of Yeninia phytase intcrmviliu by Saccharomyces cerevixiae.
  • ORF ZP 0083236 was clo ⁇ ée according to molecular biology techniques well known in humans of the melting in the vector pPIC9.
  • This vector containing the signal peptide of Pichia positron P ⁇ laetor (Tnvitr ⁇ gen) 5 'position of 1 "ORF ZP 00832361, allowed the expression of the phytase of Ycrsmia inwrmetiia by Pichia postons. Construction of Mutant Banks in p.NCK. screening and obtaining an improvement in:
  • mutant libraries of your phytase ⁇ erùnhi intermvdia were created by technology owner Miomélhodes Massive Mutagene.MS'R 'described in t' S 7,202,086 cm in Saboulard ei al (Bioteehniques 2005 September 39 (3): 363 -8). Briefly, mulagèn ⁇ s olmonueléotides were synthesized to achieve the phytabc nants on each of the amino acids constituting the enzyme.
  • the mutant libraries were constructed from a pNCK vector containing the phytase gene. according to the Masske Mutagenesis-K 1 protocol described in 7 : 222,086 or in Salmonella (2005). (Sep.
  • the mutant banks are transformed into cultures of Thcrmus ihenm ⁇ hilus made competent. Transformants were grown in liquid medium at 70 ° C to achieve precultures which are then plated on solid medium containing kanamycin stringent concentrations of the order of 25 mcg / ml. After incubation for 48 hours at 70 ° C., only those mutants whose protein structure is resistant to the selection temperature and whose folding is correct allow a functional folding of the resistance gene thcrm ⁇ stahlc to the kananiveinc and therefore can push in the presence of the kanamyc. In this study, isolated key mutants were isolated, their ⁇ DN plasminidic isolated and sequenced, and the different mutants revealed a total of 13S.
  • K.210 therefore seems to be an important residue, in particular because of its positive charge and its large volume, which can generate steric and electrostatic stresses with respect to the entry of the substrate or the exit of the products from the active site.
  • the door of Celtic positive charge in the K.210S substitution and the change in the spatial constraint associated generally may therefore disturb the reaction (entry ⁇ r output products solvataiion substrate of the cavity of the active site) and alter the kinetic constants of the and more particularly the apparent Km for the different substrates generated during the reaction. It is known in some cases. that the produced substrates can participate in the stabilization of the structure 31) of the protein and impart increased stability.
  • Y268 is a potentially solvent accessible residue located in a "loop" secondary strand.
  • I. are signals I N-glyeosy lalions in a protein sequence are Nx 1 "or N ⁇ S Such sites were introduced into the phytasc of Yersinn 't i.'iurmi'iiia cloned djiw the ⁇ ecieur Pyi. S2.
  • Example 5 details the characterization protocols of the residual activity of mutants as a function of temperature.
  • ⁇ 'Is first set of experiments has identified several mutants with .supplpiraire site glycosylalion having a th ⁇ rmoslahilitc increased relative to the wild-type enzyme r. These mutants contain substitutions of amino acids ⁇ 142. ⁇ 177 and Q326 characterized by a solvent accessibility percentage> 70%. More particularly, the substitutions on these amino acids are TI 42N. ⁇ 177F and Q326T. These mutants have an activity extinction coefficient between 80% and 20% of residual activity respectively of 1.62. 1, 62 and 1.52 as presented in the table -IC.
  • the preceding residues have been introduced into the plasmid enzyme inserted in the vector ⁇ YLS2, or by the proprietary technique of Ithomethodes Massive Mutaye ⁇ esistt. as mentioned above or by a technique of mutayenèse well known to those skilled in the art, such that a PCIR overlay.
  • the mutant constructs have been transformed in Succession and Criteria and characterized in more detail in their activity and thermosilability.
  • Example 5 details the protocols for characterization of the residual activity of mutants as a function of temperature.
  • a first series of experiments has identified a mutant with an additional disulfide bridge and improved thermostability.
  • Cc mutant contains two .substitutions on IE- * residues (J274 and N3 l o.
  • This mutant has a coefficient of extinction of activity between 80% and 20% 32 of residual activity of 2.33 as shown in Table 4D Ie.
  • This index is calculated by Io ratio between temperatures dilTércnccs allowing on one hand the maintenance of 80% residual activity and the other 20% of the residual activity for the variant SS I 1 compared to the enzyme wild. The detail of the calculation of this index is shown for the mutant K21 OS in Table 4 B.
  • Example 5 details the protocols for characterizing the residual activity of mutants as a function of temperature.
  • PHY-98-6X and PHY-98-6X-SS 1 1 respectively containing the combinations of imitations T142N * ⁇ I 77T-K2 I0S t O3261 " , ⁇ 42N * - 77 I 77T f-K210S * Y2 ⁇ 8F.
  • - K2I0S T "- * Y268 ⁇ - Q292P> Q '3261” r (J274C. "- I N3 6C positions being indicated in SLQ ID!.
  • Plasmid pY1-! S2 containing the improved variant of the Yemniu intermc ⁇ a phytase as previously described was transformed by electroporation into the yeast strain Succfiarumomyces cerevisiae ⁇ Pho4 strain and the transformants were selected on solid medium Sl) -I '.
  • Several clones were grown in a liquid medium for 30 hours at 30 ° C. under shaking, and these seedlings sown as much cooked rice in YP Galactose production medium. * -a were performed overnight at 30 '1 C. with agitation.
  • Example 3 Expression of Enhanced Variants of the Yersinia intermedia phytase in Pichia Pastom
  • the plasmid pPK ' 9 containing the improved variant of the Yersinia iniermediu phytase as previously described was transformed into competent Pichia pastoris cells. After selection of colonies containing the plasmid, a colony was allowed to grow for 16 hours at 28 'C with stirring in 1 50 ml of FiM medium (J to form a preculture.
  • the production of variants is controlled by induction time Different amounts of 0.5% methanol, depending on the desired amount of the variant dilter, were used to determine the Optical Density (ViO) of the prccultures at oOOnm: for induction, optimal OD values of 2 to 6 uDO were required. then centrifuged and resuspended in a BMVI medium containing 0.5% methanol at a starting I) o between i and .K) uDO ml according to the induction times envisaged: luDO / ml for an induction of 06 flowers. 6 u I XVmI for a 72 hour induction and M ) u IX VmI for a 48 hour induction. 100% methanol was added every hour 24 final concentration 0.5 "• '.” These pmducii ⁇ n procedures were used for productions in L' rlcn ⁇ e ⁇ cr suitable for volumes ranging from IO ml to 200 ml.
  • bioreactor For higher volumes, the productions were carried out in bioreactor from 5 to 50 I. adapted to production volumes ranging from 2 to 20 I.
  • the type of bioreactor used ( ⁇ pplikon) allows automated control of yeast growth by regular measurements of Optical Density at 600 nm and Oxygen pressure (p ⁇ >) optimizing the maintenance of induction conditions by methanol.
  • the procedure used was adapted from the Pichia paxtnris fermentation protocol of Invitrogyn ("Pichia expression kit: a manu ⁇ l de methodes de expression de reeomhina ⁇ i proteins en Pichia pastnris" - Version M of January 1, 2002 *).
  • the Phy 98-6X-SS5 mutant is a mutant containing the substitutions I.52C • I .WC ( T142N '- ⁇ 177T r K210S * Y268I- t ⁇ 2') 2P 'O326T.
  • Phy tracks ⁇ ⁇ S show the profile of i ⁇ igration ⁇ t the phytase healthy age of ⁇ vrtinia inwrmvtliu, not ⁇ lycosveal since not having potential sites of N-giycosN lalions N ⁇ S / T: this is illustrated by the absence of migration difference after Digestion with Pendoglycosidase Wf.
  • nO ⁇ i of the total reaction volume of 160 ⁇ l was transferred for the Union dream with 60 ⁇ l of a Fe-Mo solution.
  • the revelation reaction was left for 1 5 minutes in the absence of light before being iu in a spectrophot ⁇ mèlre to 620 ntn. All the reaction solutions were carried out with the water ppi phosphate.
  • the rcaelionnel buffer is a 0.25 M nH 4.5 sodium acetate buffer.
  • the substrate used was a phytate solution achieved in the previous reaetionnel buffer from a stock solution to 200 g / l.
  • the solution of the solution was formed by four microliters of Mo solution mixed with one volume of Fe solution.
  • the solution of Mo is a solution of Molyhdutc at 0.012M and the solution of I ' is a solution of 1st to O. SM.
  • Figure 7 shows levels of relative activity vs. time (O to 15 minutes) higher for PHY-mutants 98-4X and 98-6X PI-IY compared to the enzyme from PHY-98 origin in Sacchur ⁇ myces cerevisiue .
  • thermostability of the improved variants of the Yersiiriu phytase intermedia i.a thermostability of isolated variants of the phyiasc of Ycrsima Inwrnnulia was determined by measuring a residual activity of the different supernatants of production of the variants either after a pre-harvesting at a constant temperature for various times, either after a fixed time railch.mJ 'wise at varying temperatures, in the first ca.s. the variants are preheated to 80 ° C. for periods ranging from 0 to 30 minutes. In the second case.
  • Figures 3, 4 and 5 show the results obtained for the varimils Phy- 1 JJMX and Phy- *) 8-f "expressed by X Sarcharoinyics ccrevisiue with respect to the original enzyme iY Pi-08.
  • Figure 3 shows the higher residual activities of the two mutants PHY- 4) 8-4X and Pl IY-Wi-GX after 0-2 min pre-chase at 80 ° C relative to the enzyme of PHY-V8 origin.
  • Figure 4 shows the upper residual activities of two mutants PHY- ⁇ 8-4X and PHY-JS-oX after 15 minutes of preheating at room temperature.
  • Ligure 5 shows the higher residual activities of the two PHY-98-4X mutants and PHY-M- ⁇ X beyond 6OT using I minute chargeehaulfage.
  • Figures 6a) and 6b) provided the upper residual activity of mutants PI IY-98- 6X L M PH Y-y8-6X-SS I. expressed by Pichia pusloris. after preheating times at SO 1 C of respectively 0 to M) minutes and 0 to 5 minutes.
  • Example 6 Hermosiabilit ⁇ Mutants in Granulation Assays
  • Granulation tests can be small to determine the thermostability of the different mutants with respect to the wild-type enzyme and existing and / or commercial enzymes, i.
  • Various phytases can be incorporated into the processes for forming and formulating wax granules added to animal feed, for example.
  • the granules formed can be mixed with the food. According! "Largest volume of testing, as island of formed food may vary. For example. 250 g of granules can be mixed with 25 kg feed to form a pr ⁇ mclange. This 53 ⁇ télangc can be incorporated just before the test with 225 kg of
  • food of the same composition, but not limited to, typical poultry feed can be composed as a percentage of 45 to 50% corn 0 to 5% pea 0 to 4.5 0 0 eol flour 0 to 4.5% of sunflower seed meal, 0 to 2.5% of corn flower gluten.
  • the mixture of the order of 250 kg is typically dosed in a mixer / conditioner by v is a dosage in a ⁇ iiesse approximately (> 0U 3X kg / h. where it is heated by steam injection to about 95 ° C.
  • the total residence time is about 10 to 30 seconds after which the hot mixture is directed to a granulation press.
  • the sizes of granules that can be manufactured are 5/45 mm (width / length) or 3/65 mm.
  • the temperature of the pellets at the outlet of the press is typically 82 to 83 ° C for the first type of granules and 91 to 93 ° C for the second type.
  • the granules are cooled on a carpet of cooling, where samples are recovered to determine the activity and stability of the mutants and reference phytases after the formation of the final granules, and granulation yields in terms of activity can be obtained for each mutant, compared to Reference is made to the activity reports after and before the granulation step
  • a protocol for measuring the phytase activity is given in Example 4. Also, a standard protocol for measuring the phytase activity adapted to these methods is published as: van.hngelen et al .. Journal oi " ⁇ O ⁇ C International 1994. 77: 760-764.
  • Dil ⁇ rcnis phytase mutants can be tested compared to phytase retro 'erent.
  • the different samples are incubated at 40 ° C., firstly at pH 3 for 60 minutes and then at 40 ° C. for 30 minutes.
  • the reactions are then stopped and the phytate and the innsilol phosphate are extracted by addition of hydrochloric acid to a final concentration of 0.5M, incubation for 2 hours at 40 ° C. followed by a freeze-thaw cycle and one hour of incubation at 40 ° C.
  • Phytaia and inositus phosphates are separated by high-performance ion exchange chromalography here as described in Chen. Q.C. and Li. B ⁇ V. (2003) and Journal of Chromatography (K) 18. 41-52 as well as in Skoglund. 1- .. Carlson. N. (i.and Snndherg, ⁇ .S. ⁇ J * W7) and J. ⁇ gric. I-ood Chem. 45. 431-436.
  • Rcla ⁇ ic phosphate is calculated as the difference between inositol phosphates-bound phosphate in phytase-treated samples compared to untreated samples with phthalc. Interesting mutants result in a greater amount of phosphate.

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Abstract

La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines et en particulier celui des protéines améliorées par évolution moléculaire. Elle porte sur un variant d'une phytase, dit amélioré, en ce qu'il présente une thermostabilité et / ou une activité supérieures à la phytase d'origine. L'invention porte également sur un acide nucléique codant pour ce variant, une cassette ou un vecteur d'expression contenant ce variant, une cellule hôte exprimant ce variant, une composition comprenant ce variant ainsi que les utilisations de ceux-ci principalement dans la préparation d'additifs alimentaires et l'alimentation animale.

Description

Variants améliorés d'une phytase
La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines et en particulier celui des protéines améliorées par évolution moléculaire. HIIe porte sur un variant d'une phytase, dit amélioré, en ce qu'il présente une thermostabilité et/ou une activité supérieures à la phytase d'origine. L'invention porte également sur un acide nucléique codant pour ce variant, une cassette ou un vecteur d'expression contenant ce variant, une cellule hôte exprimant ce variant, une composition comprenant ce variant ainsi que les utilisations de ceux-ci, principalement dans la préparation d'additifs alimentaires et l'alimentation animale.
I. e phytate est !e principal composé de stockage du phosphore chez Ia plante. Cette molécule, aussi nommée acide phytiqυe ou inositoi-hexa-phosphate (Iπsl'6 ou mvo-inositol hexakisphosphatc), consiste en un cyclo-hexane sur lequel sont branchés six groupements phosphates. Le phytate représente environ 70% du phosphate végétal, les 30% restants étant présents sous forme libre. Par ailleurs, les résidus phosphate du phytate chélatent les cations divalents et trivalcnts tels que les ions métalliques calcium, fer, zinc, magnésium, cuivre, manganèse et moh bdène essentiels à la nutrition, Les phytases sont des en/ymes qui hydrolysent Je phytule : ces enzymes libèrent naturellement un ou deux phosphates, rarement trois, alors adsorbables dans le système digestif : les autres produits de la réaction étant raniment de rinositol-tri-phosphate, principalement de l'înositol tétra- et penta-phosphate (Figure 1 ). Les phylascs constituent une famille d'enzymes largement représentées dans la nature : de irès nombreux organismes, de la bactérie à la plante en passant par les champignons et certains animaux, en expriment une ou plusieurs. Les mammifères, cependant, n'en expriment aucune ; les ruminants ou les animaux polygastriques tels que vaches et chevaux possèdent des microorganismes endogènes propres à leur tractus gastroinlestinal qui peuvent dégrader le plntatc. ce qui n'est pas le cas des animaux monogastriques tels que porcs et volailles principalement, pour qui le phylate provenant des plantes ingérées ne représente donc pas une source utilisable de phosphore, il est donc nécessaire d'ajouter des phosphates libres à leur alimentation. Cependant, une partie île ces phosphates libres ajoutés, et l'essentiel du ph\tate ingéré par les animaux sont rejetés dans l'environnement. Le phylate est alors dégradé par les bactéries du sol et se retrouve, au final, dans les nappes phréatiques et les rivières sous forme de phosphate libre. Dans les régions à forte concentration d'élevage, ces rejets agro-industriels de phosphates, sous forme libre ou sous forme de phytate représentent une pollution importante, qui se traduit notamment par la prolifération d'algues vertes au niveau des rivières et des fleuves. Outre l'aspect esthétique, ces algues ont un fort impact écologique car elles entrent en compétition avec les espèces végétales locales notamment au niveau de la consommation de l'oxygène dissous.
I ;ιιe manière pour permettre que le phosphate stocké sous forme de phytate soit utilisable comme source de phosphate par les mammifères est l'introduction de phytase exogène dans les aliments. L'ajout de cette enzyme représente ainsi une alternative à l'utilisation de phosphate inorganique comme complément alimentaire. Par ailleurs, en rendant le phosphate du phytate accessible, elles permettent également une meilleure accessibilité aux ions métalliques chélatés sur le phosphate du phytate, ainsi qu'aux protéines liées au phytate. les rendant nutritionncllcmcnt disponibles. Des phytases sont aujourd'hui uhϋsées de façon relativement systématique dans l'alimentation animale. Hlles permettent de remplacer partiellement les phosphates et rendent également plus accessibles les protéines, les acides aminés, et le calcium.
II existe cependant plusieurs limitations à l'utilisation des phytases dans l'alimentation animale :
- L'efficacité insuffisante des phytases à libérer les phosphates constitue une première limitation. Des phosphates sont toujours ajoutes à l'alimentation des animaux même en présence de phytases exogènes. Pourtant, si tout le phyiate était converti en phosphates libres, aucune supplémcnlution ne serait plus nécessaire : il existe donc un réel besoin à proposer tics phytases plus actives.
- La plupart des enzymes actuellement utilisées ne peuvent pas être ajoutées directement aux aliments, parce qu'eue ne résistent pas au procédé de granulation, qui implique le chauffage à 950C des aliments pendant 90 secondes. Les en/ymes sont donc sprayées sur les aliments après l'étape de granulation, ce qui représente un coût supplémentaire et constitue une seconde limitation ; il existe donc une forte demande à posséder des phytases plus Ihermostahles.
L'objectif de la présente invention est. de dépasser les limites actuelles en générant une phytase suffisamment active pour impacler sensiblement Ic besoin de supplëmentation en phosphates, et suffisamment thermnstahlc pour pouvoir £tre ajoutée directement à l'alimentation des animaux, sans avoir à utiliser de technique de sprayage.
Nombreuses sonr les phytases qui ont fait l'objet de publications et de demandes de brevets, voire qui ont déjà été ul il usées dans des applications agro-industrielles. Aucune n'a cependant permis de s'affranchir du besoin de supplémentation en phosphates dans l'alimentation d'animaux d'élevage et n'est suffisamment thermostable pour être ajoutée directement à i'aϋmcmation des animaux, sans avoir à utiliser une technique de sprayage. l.a plupart des publications se rapportent aux phytases d'AspergilIus niger et dΕseherichia Ci)Ii. D'autres phytases d'origine microbienne ou provenant de plantes ont également été étudiées avec comme problématique d'obtenir des phytases thermostables possédant une activité spécifique supérieure à celles d'AspergilIus niger (250 U.mg -i ). Les phytases décrites dans la littérature cl les demandes de brevet proviennent de champignons (basidioinycéles et ascomy eûtes), de levures et de bactéries.
Les phyuises isolées de champignons sont nombreuses et proviennent majoritairement de la famille Λ.ψergi/lus mais également d'Absiiliα, Ivnψhiαlophorα. A^wcybe, Cuh-ω-i.ψork'Uα, Chvuiomium. Cotynαscus. Xtucαr. Mycvliα. Myήυcαccum. Pénicillium. feniop/iont. Rhizumwυr, Rhizopus ou encore Trαmetes, Spυrotrk-hum. Neurosporu. i'nchαdermα. ( Uulo.ψorium. Myveluψhthoru. Tαlemmyces. /hiefuviα. Humivolci. PdXiIIm. Thermoitscus.
De nombreuses informations sont disponibles sur les activités spécifiques et Km de ces enzymes telles que dans Wyss et al 191W (Λppi linviron Microbiol 65 (2) 367-373). (ilobalemcnl. les phytases d'Aspergillus se caractérisent par des Km élevés variant de 5 à 20 ftM. une température optimale de 57r'C c\ un pH optimal de 5.5 excepté pour Aspergillus jumiguim (pl i opt. - 6} mais des. activités spécifiques très faibles allant de î (JO â 250 i r.mg- l .
Certaines phytases provenant d'autres champignons ont montré des propriétés intéressantes notamment des activités spéciiïqnes élevées telles que la phyta.se de Trαmcws piihesct-ns ou Ia phytuse de Pcniophorα lycii (respectivement 1200 l '. mg- 1 et KiSO U.mg-1 dans WO W28408). ( 'Itttfosporiuiti ψ. montre une phytase intéressante possédant une activité spécifique de 1MO l '.my-l et un Km Je 1 5.2 μ M mais une température optimale busse à 40'-"C. Kgalemeπl. la 6-ph\ tase de Ccripnriα ψ. présente une activité spécifique de 1 1040 U.mg-1. Plusieurs données complémentaires ont été publiées par Lassen et j|. 2001 (Appl linviron Microbiυl 67 ( 10) 4701 -4707 comparant la therrnostabilité de phytases de basidiomycêtes notamment Pemophara lycii. Ceriporia ,y/λ. Trametus puhescens et Λspi>ιγilhι\ niger ; il ressort que ees enzymes présentent des Tm (température à laquelle l"enzyme est active à 50%) assez proches allant de 55°C (l'rumetes puhescens) à 60"C1 {l\-nivphoru lycii) mais des activités résiduelles {pourcentages d'activité résultant d'une prêineubation de 60 minutes à 80*'C dans du sodium acétate [0, 1 M), pl i 5Jï ) très variables allant de 15% (Trame tes puhescens) à 62% (Penhψhnra Lycii).
De nombreuses sociétés ont déposé des demandes de brevet sur ees enzymes notamment Danisco Genencor (WO2001012792. Pénicillium suhiilis : WO200303X035. Trichυderma rcaui : WO20030381 1 1. Pénicillium. Mumicola. Kineritvlla. I-'usuήum). ΛlïHnzymes/ROΛI . (1'!1'06592J S. phytases û\ \sper^illιts produites par Tήchodurma ri'c-.si'i). DSM/Roche (1:1*6843 P. Aiwrgillus tvrreus. Λspergiihts fumigaius, Λψer\>illus nitluhms. ialaromaces thcrmophilus), BΛSF ( WO2003102174. Λspergillus). Λdisseo ( WO2003054 W. Pénicillium), Choongimg βiotech I.td. (WO2005056835, Pénicillium oxalicum).
Parmi les phytases buetériennes. plusieurs ont été décrites provenant de Iktcillus suhiilis f Paver tind Jayannathan. 1982. Journal ol' Ractoriology 151 : 1 102- 1 108). Pseuthmotuts (Cι>sgrove. 1970. Λustraliaπ Jimmal of liiological Sciences 23" 1207- 1220), et Kh'hsiclla. Plusieurs phytases provenant d'Λ". coli ont é!ê rapportées dans la littérature. Greiner et al. dans Λrcii. liiocliern. Biophys., 303. 107-1 13, 1993. ont purifie et caractérisé une nouvelle phytase d*A* coli : d'autres ont été rapportées par Lim et al., 2000, Nat. Struci. Biol. 7: 108-1 13. Oshima et al.. 1996, DNΛ Research. 3: 137- 155, l ouati nnd Danchin. 1987, Biochimie. 69:215-221. Rodrigue/, et al.. 2000. Λrch. Biochem. Biophys. 382: 105- 1 12, Kivl/. l 'S patent 5.876.997 lroni E. coli W and ιψρ\ by Dassa et al.. 1990, J. Bucleriol. 1 72:5497-5500.
Des mutants de phytase d'/:. coli ont été obtenus par génie génétique résultant en des iheπnoslabililés et des activités spécifiques améliorées (Rodrigue/ et al.. 2000. Λrch. Biochem. lïiophj s.. 382: 105-1 12. I.anahan et al.. 2003. I iS patent application 200301 57046). Cependant, aucune de ces mutations n'a permis une production suffisante de ees ιw.ymes d'origine procaryote dans des organismes de production eucaryαtes. I. Objectif de la présente invention est de fournir une enzyme recombinante qui soit adaptable aux procédés industriels permettant son utilisation comme additif alimentaire, principalement dans l'alimentation animale. Dans la demande WO2002048332. Di versa a identifie, à partir d'un BLΛST de génomes bactériens disponibles à la date de l'invention, en utilisant le gène appΛ d'E. coli, une nouvelle protéine de Yersinia pestis présentant une activité phytase. Celte protéine présente une particularité remarquable en ce qu'elle possède une activité spécifique de 4400 U/mg. Aucune autre caractéristique biochimique concernant cette protéine n'est précisé dans cette demande. Cette demande semblait montrer l'activité élevée potentielle de phytase provenant des bactéries de la famille Yersinia.
Le 20 octobre 2005. la séquence protéique ayant pour référence /P 00832361 , a été soumise à Ia base de données NCUI. Celte séquence est celle d'une protéine hypothétique de Yershtht intermedia A IX1C 29909 dont la séquence nucléotidique correspondante est présentée sous la référence N/ ΛΛI.F01000052 région : 1889...3214. Cette séquence proiéique a été obtenue par îa traduction de la séquence nucléotidique correspondante provenant du sequeneugϋ complet du génome Je la souche Yenhiia intcrnwdu' t Λ'I CC 29909. Bien que le domaine PRKI OI 72 semble prédire une activité phytase. aucun élément expérimental n'accompagne cette prédiction.
Celle-ci semble avoir été cependant confirmée par l'isolement d'une phytase très proche, d'une nouvelle souche de Yersinia intermedia provenant d'un prélèvement de sol d'un glacier, nommée 11-27 et présentée dans la demande WO2007128 l (>0. La phytase issue de la souche 11-27 est référencée dans la base de données NCBl sous le numéro d'entrée ΛB 195370.1 pour la séquence nucléoiidique et PQ986462 pour la séquence protéique: elle présente 98 % d'identité en acides aminés et 97% d'identité avec Ia séquence nuciéotidique codante de la phytase hypothétique de Yersinia intermedia A I CC 29909.
La phytase de la demande WO2007I 28 I60 présente une activité spécifique élev ée supérieure à 3000 I i/mg. du même ordre que l'activité spécifique enregistrée pour Yersinia pestis dans WO2002048332. Dans cette demande WO2007128160. les caractéristiques biochimiques intrinsèques de la protéine sont revendiquées à savoir un poids moléculaire de 45.5 kl)a. un pl i optimal de 4,0-5.0. une température optimale de 50-6(PC. un pi théorique de 7.7. une activ ité spécifique supérieure à 3000 l."'mg et une résistance élevée à la pepsine et à ta trypsine. La présente invention permet de dépasser les limites actuelles en proposant un variant amélioré par évolution moléculaire de la phvtase de Yersinki intenncilia. Par variant amélioré on entend un variant présentant une ihermostubilitc et •' ou une activité supérieures à la phyiase d'origine de Yersinia inlernwJia. lui permettant d'être utilisé dans des procédés industriels et en particulier comme additif alimentaire.
Comme il sera décrit dans la suite du texte et à l'aide des figures associées, la présente demande décrit un variant amélioré d'une phylase dont Ia séquence est SKQ ID N° 1 ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en 1*3, V4. Λ5. P8. T'). G I O. VIo. V 17. LI 9.
S20. R21. ! 122.023. V24. R25. S26. P27, T28, K29. Q30.1131. Q32. L33. M34. D36, P39.
K.4I. W45. Λ49. G50, Y51.1.52. l"53.056, A57. V60. Y67, G75. A78. C81, D92. V93.
IW. Q9x R%. T97, R98, F.99. MOO. GlOI. ΛI03, Vl I fi. V 125, m 26. F 129.11130.
1*131. V 132.1)133. U 140, T142, QI43 ~ H145. ΛI47. I 152. P1S5, 1.156. Hl 58.1-158 + S 160, 1-167. ΛI77.0182. G 189. D193. Nl 96. Fl 97. OH, K206, P207. 1209. K210.
V211. S2I2.1.213, 1-217, A218. L2I9, S220. S221, 1222, 1.223. G224.1-225.1226. F227.
1.228.1.229. Q23O. N23I. Q233. Λ234. P236. R242, 1250, S251.1.252.1,253.1.255.11256,
N257.0259. F260.1)261. M263. Λ264. Y268. K273. G274.1»276. L277. Q292. G293.
F297. P300. ϋ/301. G308. G309, 11310. D31I. T312. N3I3.1314. Λ315. N316. G322. Λ323.0326. P3.ll. U332. N333. TV14. l>335. P336.0337, (Î318. CÎ339. V»4I.1.343.
1)349. Q352. R353. Y 354.1355. A370.1-371. K376. P379. A 380. G381.1)3X8. K391.
S393. G3°4. et i*4J4, les positions étant indiquées dans SFQ 11) Nc I. De préférence, le variant amélioré de la phytase dont la séquence est SIiQ ID N0I ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en P3L, P3V. V4G, Λ5I\ P8N. P8V. HI. '1"9Q, T9S. P9Y. CilOΛ. GMlP. V16M. Vl 7W.
LhKi, S20C. R2IF. FI22Λ. II22S.1122 Y. (i23S. V24C. R25C. S26C. P27F. T28N. J 28S.
128V. K29N. Q30C, ς>30D. Q30R. Q12R. IJ3R. M34C. D36N, P39N. K4IG. W45C.
G50I). CtSOl-:. Y51G, Y5IN. Y5IQ. Y5IW. I.52C. 1.52Ci. T53C. G56C. Λ57C. V601.
Y67I-. Y67W, G75R. Λ78P. C8IN.1W2R. V93G.1W4CÎ, D94S. Q05N. Q95V. R%Λ. '1'97N, R98N, RWf. I.99C. (HOlC. A103C. VM6C. V125N. DI26Q. F 129 W.111. ION.
HI30O.. 1113OR. II HOW. Hl 3OY. P13IS. VI32W. I)133(i. DI33P, D133R. DI33V.
D133W. I)MOi-. 1)140F. D140N. II42N. Q143N + 11145T. Λ147C. [ I52N. I.I52P.
PI55N. PI55T. L156N. F158N. IM58N • S 1601". Flh7N. Λ177N. Λ177S. AI 771".
C182N. G189N. DI°3C. N196C. Fl 97V. K201N. K206Λ. P207N. P207S. P207T.1"2«)9C. K210C. K2101-, K2 I 0N. K210S. K210T. K2 I 0V. K210Y. V21 1 C. V21 IG, S212N. I.217N. Λ218N. L21 »V. S220N. L223S. K225I). K227S. L229H. Q230N. Q230T. N231 K, Q233S. Q233T. Λ234K. P236N. R242N. I250S. I250T. S251 N. L252M. L255T. 1 I256Λ. I I256F. H256P. N257I. Q25"K. Q259S. Q259T, Q25°Y. D261 F. M263L Λ264N. Λ264P. Y268C. Y268K. Y268N. K273N, G274C:, G274S. P276I-. Q292P. (Ï293N. P297N. P297S. 1M00N. 0301 L. (Î308S, I H I ON. I I310R. D31 1 Λ. D3 J I H. 1)31 IG. T312D, T312N. F312P. I'3 I 2V. N3 I 3F. N3 I 3R. 13141-. I314M. N316C. G322C. Λ323I-, Q326S. Q32ftT, P331 R, D332A. D332L. D332N. 1)3320, N333V. P335C. l'335Ci. P335R. P335S. P335T. IÏ339C. V341 Λ, V341 K. r;343Λ. K343U. D349N. D34<»S, D349T. Qλ52S, Q352T, R353C. Y354N. 1355W. Λ37OD. Λ370T. [-.37I S. F.371 T. K376S. P3791.. [079S, P379T. Λ380S. Λ38O L G38 I S, D3K8C. 1-39 I N, S393G. G394S, f 33941 . et P414Q. les positions étant iiuliquccs dans SIiQ ID N° 1. De préférence, le variant amélioré de la phytaso dont la séquence est SHQ II) Nr l ou un dérive fonctionnel de celui-ci comprend au moins une combinaison de substitutions sélectionnées parmi les substitutions du groupe précédent.
SHQ ID N-1 1 est Ia séquence figurant dans lu base de données NC Bl déposée Ic 20 octobre 2005 seuls le numéro d'entrée /P U0832361. ne comprenant cependant pas la séquence signal de 23 acides aminés à l'extrémité 5' de la protéine. SIiQ ID N° I correspond ainsi aux résidus 24-4-41 figurant dans le numéro d'entrée précédemment cité. SKQ ID N'1 1 contient également lu séquence nucléique codant pour Iu séquence pioléique précédente, référencée sous le numéro NZ ΛΛI. FO 1000052 dans la base NCBI. Un acide nucléique codant pour un variant selon la présente invention peut facilement être préparé sur la base de cette séquence par les techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par mutagenèst" dirigée du eodon à modifier, pour obtenir la substitution d'acide aminé désirée. Ainsi, la séquence du variant amélioré de ia phytasc selon la présente invention correspond à Sl-. Q JD N" 1 incluant la ou les substitutions sélectionnées.
SKQ II) N"1 2 reprend uniquement la séquence protéique de Sl-Q ID N° I .
Dans un mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention comprend une unique substitution.
Dans un mode de réalisation préféré, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en K20. Q30. Y51. 1 52. (Ï75. CH l. VTv Q"5. IN8. \.9(K 1-129. H 130. D 140, T142. P155. F 167, Λ177.0189. O)I. K2I0, L219.1250. S251.1.252, L255, M263, Y2G8.0274, Q292, G293. P297, G3O8. N3I6, Q326. D349. cl 1-391. les positions étant indiquées dans SHQ ID N0I. Dans un autre mode de réalisation préféré, le variant amélioré de Ia présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend des substitutions sur un dos acides aminés du groupe' consistant en K29. Q30. Y51.1,52. 075. C81, V93, Q95. R98, L99, F 129.11130. D 140. Tl 42. Pl 55, F167, Λ177.0189, K201. K210. L2I9.1250. S251. L252. 1.255, M263. Y268.0274. Q292.0293.1*2^7. G308, N3I6. Q326, D349, et F.39I. les positions étant indiquées dans SKQ ID N0I. De préférence, les substitutions sur les acides aminés K29. Q30. Y51.1,52. G75, CSI. V93, ϋ*)5. RW, L99.1- 129. I \ 130. D 140. Tl 42, P 155. F 167. Λ 177, Ci 189, K201 , K2 ! 0, L219. 1250, S25I. L252.1.255. M263. Y268. ti274. Q292. G293. P297, O308. N316. Q326. 1)349. ci K39I, sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K29N. Q30D. Y51O, Y51N. Y5IQ. V51W. I 52Ci. G75R. C81N, V93O. Q<>5N. R98T, |,99C\ FI29W. III 3OY. DI40F. D140N.1"142N. P155N. P155T. F1&7N, Λ177N. Λ177S. ΛI77T. OI89N. K201N. K210N. K2I0S. L219V, I250S, 12501", S251N.1.252M. I.255T. M26.1L. Y2ft8N.02741'. CJ292P. CÎ293N, P297N, O308S. N3I6C. O326S. Q326T, D349S, D349T, et 1-39 IN. les positions étant indiquées dans Sl-'Q ID N"l .
Dans un mode de réalisation encore plus préléré, Ic variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend des substitutions sur un des acides aminés du groupe consistant en K29. QM). Y51, L52. O75. V93. R08, 1.99. π>9.11130.
1)140. 1142. P155. F 167. ΛI77. K201, K2H).1.2I1). S251.1.252, 1.255. M263. Y268.
0274. Q292. <i293. tï3O8, N3I6. Q326 et K391. les positions étant indiquées dans SHQ ID
N'" I . Dc préférence, les substitutions sur les acides aminés précédents sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K29N. Q30D. Y51O. Y51Q. Y51W.1.520, («75R. V93(i.
R98T. I.99C FI29W.1H30Y. DI40F. TI42N. PI55T. F167N. Λ177N. Λ177S. Λ177T.
K20IN. K210S. 1.219V. S251N. L252M. L2551. M263L, Y268N. (Î274C. Q292P.
02(>">N, (Ï308S. N316C. O.526S. Q326T. et H39IN. les positions étant indiquées dans SÏ-.Q
IDN' I.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant amélioré do la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions sélectionnée parmi Ie groupe consistant en G274C <- N3I6C-. F142N '- Λ177T * Q326T.
K210S < Y268I- r (^292P. D 1401- ι- Y2(>8H - Q292P. FI67N * Y2ή8l- t <>292P. I I42N + Λ177T + K210S + Q326T. T142N J- A I 77T < K210S - Y268H + Q292P -+ Q326T.
F142N «- Λ177T + K210S + Y268K + Q292P * Q326T * G274C *- N316C, 1.52C i- I.99C r TJ42N + Λ 177T H K210S *- Y268K * Q2O2P >- Q3261". les positions étant indiquées dans SIiQ if) N° 1. Dans un mode préféré de ce mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N *- Λ177T + K210S + Y268L ^ Q292P +
Q326T. les positions étant indiquées dans SI-IQ ID N" 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de ia présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en I I42N * Λ 177T < K2I 0S + Y2681- f G274C * Q292P t N316C - Q326T. les positions étant indiquées dans SKQ ID N° 1 . Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier Je variant amélioré de In présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en TI42N + Λ I 77T - K2 I0S • Q32o T. les positions étant indiquées dans SIiQ ID N0 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en (J274C f N3 Î 6C, les positions étant indiquées dans SI-Q ID N° I . Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en 1 142N - ΛI 77T f Q326T, les positions étant indiquées dans SIlQ ID N° i . Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en K.210S + Y268M f- Q2ιλ2P. les positions étant indiquées dans SI-;Q ID N'1 î . Dan* un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la pié*en1e invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une comhinaison de .substitutions consistant en D 140F + Y268I-! + Q2O2P. Dans \m autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une comhinaison de substitutions consistant en F167N - YIhHIl ' Q292P.
I , a présente invention concerne un variant amélioré d'une phyta.se dont Ia séquence est SIiQ ID N0 I ou un dérivé fonctionnel de celle-ci comprenant la ou les substitutions telectiυnuée.s. I. a présente invention concerne également un acide nucléique codant pour un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, une cassette d'expression comprenant un acide nucléique scion la présente invention, et un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné de préférence parmi un plasmidc. un phage. un phagemide et un vecteur viral.
I. a présente invention concerne également une composition comprenant au moins un variant amélioré de la phytase dont la séquence est SMQ ID Nα l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci avec la ou les substitutions sélectionnées selon la présente invention. HHe concerne également tout mélange solide. liquide ou gazeux comprenant un certain pourcentage d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention. IiIIe concerne également les mélanges contenant préférentiel lement un, deux, trois, quatre, cinq ou dix variants améliorés de la phylase selon la présente invention ou des dérivés fonctionnels de ceux-ci. La présente invention concerne également des préparations ou compositions de phytase contenant un certain pourcentage d'au moins un v ariant amélioré de la ph) tasc selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci et une ou plusieurs autres enzymes ayant des propriétés av antageuses. Lu présente invention concerne l'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, pour la préparation d'additif alimentaire. I, 'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci concerne les procédés industriels qui permettent la libération des minéraux et en particulier du phosphate des plantes, soit in vitro dans le cas de traitement des aliments avant leur ingestion par le variant amélioré de la phytase selon la présente invention, suit in vivo par administration dudil variant directement mix animaux avant ou avec leur alimentation.
I a présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur codant et / ou contenant au moins un variant amélioré de la phvtase dont la séquence est Sl]Q II) NP l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci avec la ou les substitutions sélectionnées selon la présente invention, pour transformer ou traπsfecter une cellule hôte l;lle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant amélioré de la phylase selon la présente invention ou un dérive fonctionnel de celui-ci. I. a présente invention concerne également, l'utilisation d'un tel acide nucléique, d'une telle cassette d'expression, d'un tel vecteur ou d'une telle cellule hôte pour produire un variant amélioré de la phytase selon Ia présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, lillc concerne également une méthode de production d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention comprenant la transformation ou transicctiυn d'une cellule hôte par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention, la mise en culture de la cellule liôle transformée ou trunsfectée et la récolte du variant amélioré de ia phytase ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, produit par la cellule hôte, l.a cellule hôte peut-être procaryolc ou cucaryote. .Ainsi, la cellule hôle peut être un microorganisme, de préférence une bactérie, une levure ou un champignon. La cellule hôte peut également être une cellule de mammifère telle qu'une cellule COS7 ou CUO.
Par « dérivé fonctionnel » est entendu toute cn/yme dérivée du variant de la phvlusc de ta présente invention comprenant des modifications structurales tout en préservant une activité phytase. Ces modifications peuvent être, par exemple, un prolongement de l'enzyme par addition de nouveaux domaines, des substitutions partielles ou entières de domaines telles que des remplacements de « siretches » d'acides aminés par des acides aminés d'autres enzymes pouvant conférer d'autres fonctions/propriétés. Dans « dérivé fonctionnel » est également compris une forme diinérisée du variant de l'enzyme de la présente invention, homo- ou hélérodimerique, ou encore polymérique. présentant des propriétés améliorées, telle que la thcnnostubilitû par exemple, de par la multiplication des domaines. Dans « dérivé fonctionnel » est également compris une forme chimérique du v ariant de la phytase de la présente invention, fusionné av ec une attire protéine/en/y me d'intérêt ou avec un/des domaines de cet enzyme d'intérêt. Par « dérivé fonctionnel .» est également entendu un fragment fonctionnel du variant de la phytase de la présente invention préservant l'activité de Ia phytase. Cette activité peut être mesurée selon l"un des protocoles décrits dans les exemples 4 et 5. Le fragment peut comprendre 250. 275. 300, 325. 350. 375. 380. 385, WO. 395. 400. 405. 410 ou 415 acides aminés consécutifs de la phytase selon la présente invention. Ce fragment fonctionnel peut également être dimérisé ou polyniérisé et.;ou fusionné avec une autre proiόiπe'cnzynie d'intérêt ou avec un/des domaines do celle-ci. Par « variant » ou « mutant » est entendu une séquence nueléolidique présentant des mutations par rapport à une séquence nueléotidique de référence. Ces mutations peuvent être silencieuses dues à la dégénérescence du code génétique : dans ce cas la protéine codée par Ie variant est identique à la protéine codée par la séquence nueléotidique de référence. Ces mutations peuvent également engendrer des substitutions d'acides aminés dans lu protéine codée par Ic variant par rapport à la protéine codée par la séquence nuciéotidique de référence. Dans « variant » sont incluses les séquences contenant des mutations obtenues par muiagénèse dirigée. L'expression « variant » est attribuée aux séquences nuciéotidique.s ainsi qu'aux séquences protéiques codées par iesdites séquences nuclcotidiquus. présentant Iesdites mutations.
I.e variant amélioré de Ia phyiase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci peut comprendre d'autres substitutions sur un des acides aminés du groupe consistant en P3. V4. Λ5. PX.19. CiK), V16. V17.1.19. S20. R21, 1122, Ci23. V24. R25. S26. IJ27. T28. K29, QV). T31. Q32, 133. M34.1)36. P39. K41. W45. Λ49. G50, Y5I.
1.52. T53. Ci56. Λ57. V60. Y67. (i75. Λ78. C81. IW2. V03.1)94. Q95, R%. ï 97, R98,
1.99. 1100. (ÎIOI. AI03. Vl 16, V 125. Dl 26. IM 29. H 130, 1*1 Jl. Vl 32. DI33. D 140.
T 142. φ43 -r III 45, Λ147. L 152. PI55.1.156, 1-158. I-1SR + SIoO. IM 67. ΛI77. C 182.
C il 89. D 193, N 196. IM 97. K20I. K206. P207. H(W. K210. V2II. S2I2. [213.1.217. Λ218.1.219. S220. S22Î, T222.1,223. G224. H225.1226.1-227, 1,228.1.229. Q2?0. N231.
Q2J3. Λ234. P236. R242.1250. S251.1.252, L253.1.255.11256. N257, Q259.1-260.1)261.
M263. Λ264. Y268, K273, (i274. P276.1277.0292, G293.1*297. P300. φθl. (Î3«)8.
G309. IBM).1)311. T312. N3I3.1314. Λ315, N316. «322. Λ323. Q326. P331.1)332,
N3?1. '1334. P335. P336. G337, G338. G339. V34I.1-343. TO49, Q352. R353. Y354, 1355, Λ37O.1:371. K376. P379. ΛJ80. Ir38l.1)388. h39|. S393. (i.194. et P4I4 non décrite dans le groupe PM.. P3V. V4G. Λ5P. P8N. P8V. F9I. '19Q. T9S, 19Y. GIOΛ,
GIOP. VIhM. Vl 7 W. I.I9G. S20C. R2IF. II22Λ.1122S.1122 Y. G23S. V24C. R25C
S26C. P27I-'. '1'28N. 12SS- T28V. K29N, Q30C. Q30D. Q30R. QMR. L33R. M34C1.
D36N. P39N. K41CJ. W45C. G50D. G50K. Y5Ki. Y51N. Y5IQ. Y51W, L52C. L52G. I53C. G5M\ Λ57C. V601. Y67K. Y67W. G75R. A78P. C1SlN. D92R. V93(i. D94G. f)94S. Q95N, ^95 V. R96Λ.1"7N. R98N. R98Ï. I.99C. (il 01 C. ΛI03C, Vl I6C. V125N.
DI26Q. IM29W. MHON. M130Q. Il 130R, III30W. H13DY. P131S. V132W. I)13Ki.
D133P. DI33R. D133V. Dl^nV. DI401-. 1)1401-'. I)I-H)N. H42N. QI43N • 111451I.
Λ147C. I.I52N.1.1521». PI55N. P155T. I 156N.1:158N. IM58N -ι SlOOl. IM67N. Λ177N. Λ I 77S, Λ I 77T. C 182N1. G189N. D I 93C. N 1 %C. F 197V. K201N. K206Λ. P207N, P207S. P207T. l'2(WC, K2I0C, K2 IOli, K2I 0N. K2 I 0S. K.2101, K210V. K.210Y. V21 I C. V2 I 1 G. S212N. L2I 7N. Λ218N. 1219V. S220N. L223S. K225D. F227S. I.229H. Q230N. Q23OT. N23 I K. Q233S. Q233T. Λ234K. P236N. R242N. I25OS. I250T. S251 N. L252M 1.2551. H256Λ. 112561-;. I I25ΛP. N257I. Q259K. Q259S, Q259T, Q259Y. 1)261 F. M263L. A264N. Λ264P. Y268C. Y268K. Y268N. K273N. G274C. G274S. P276L. Q2«>2P. CÎ293N. P297N. P297S. P3U0N. Q301 L, (13O8S. 113 J ON. 113 K)R. 1)31 1 Λ. D31 I I.. D3 I I Ci. 13121). 1312N. H I 2P. ['312V. N313F. N313R. I3 I4K. 1314M, N3 I6C. (Î322C. Λ3231-, Q32hS. Q326 r. P331 R, D332Λ. 1)3321.. D332N. D332Q. N333V. P335C. P335G, P.135R. P335S, P335T. G339C. V341Λ. V34H-. I-343A. lv343Ci. D34W, D349S, 1)3491, Q352S. CJ352T. R353C. Y354N. 1355 W. Λ37OI). Λ3701. 1:371 S. 1-3711. K376S, P379L. P379S. P3791 . Λ38OS. Λ3801. (38 I S. D388C, 1-391 N. S393CÎ, (J394S. (13941. cl P4 I 4Q, les positions étant indiquées dans SMQ II) N" 1 ou des combinaisons de substitutions issues de ce groupe comme mentionné précédemment. Par exemple, ces substitutions peuvent être des substitutions dites « conservatives >>. c'est-à-dire des substitutions à l'intérieur d'un groupe d'acides aminés présentant des caractéristiques similaires ou équivalentes, tels que les acides aminés a\ant un faible encombrement sicriquc les acides aminés acides, basiques, polaires, hydrophobes et aromatiques selon ie tableau ci-dessous :
Faible encombrement
AIa (A) GIy (Ci) Scr (S)
slëriytie rhr CI ) Acides Λ<φ <ή)
Λrg (R) r Glu ( V.)
Basiques Mis (H) I .ys (K)
Polaires Λsn (N) GÏπ (Q)'
I lydrophobes Uc (I) I. eu (L) ; MeUM) t' Val (V) j
Aromatiques Phe\l--r [ T>r"(Ϋ)" "1 firp lwV !...
Ainsi, par exemple, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionne! de celui-ci peut comprendre des substitutions équivalentes à la substitution P276I . décrite dans le μroupe précédent, telles que les substitutions 1*2761. P276M ou P276V selon la classification du tableau précédent. I/ interprétation précédente s'entend également pour les combinaisons de substitutions. Par ailleurs, le variant amélioré dt: la phviase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci peut comprendre d'aulres mutations non décrites dans ce uroupe. de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. Dans un mode de réalisation particulier. II* variant amélioré de la ptiytase ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au maximum 40. 35, 30, 25. 20. 15. 14. 13. 12. 1 1. IU. 9. 8, 7. 6. 5. 4. 3, 2 substitutions ou 1 substitution par rapport à la phytase sauvage, notamment par rapport à SIiQ ID N0 I . lJar variant amélioré, on emend un variant présentant des propriétés améliorées et en particulier, une theπnostabilité etΛ>u une activité spécifique et/ou une expression augmentée par rapport à la phytasc parente, également, le variant amélioré de la présente invention peut présenter une plus grande résistance à la protéolyse. par les protéases ou autre. 1, 'augmentation d'une/des propriétés du variant amélioré de la phytase selon la présente invention est d'au moins 5 %. de préférence au moins 10, 20, 30, 40, 50. 60. 70, 80. 90 ou 100 ou d'un facteur 2. 5, K) ou 100 par rapport aux propriétés de la phytase parente, mesurées dans les mêmes conditions expérimentales. Dans un mode de réalisation préféré, ces augmentations sont d'au moins 20 %. La thermostabiiité de la phytase peut être mesurée en suivant les procédures détaillées dans l'exemple 5. L'activité spécifique de lu phytase peut être mesurée en suivant les procédures détaillées dans l'exemple 4. I , 'expression de la phytase peut être mesurée en suivant les procédures détaillées dans les exemples 2 CL 3.
1 a visualisation de structures modèles en 3D utilisant des logiciels tels que swiss-model (!UîfiI^>iïiViCXβ:»sy.eh/) et spdbv v4.0 ! (< îlaκoSmithKlme) permet souvent de construire des hypothèses d'explications en rapport avec des modifications structurales d'enzymes entraînant des changements d'activité et/ou de propriétés, particulièrement en ce qui concerne les liens possibles entre des acides aminés adjacents. Dc telles visualisations peπuetttent également, dans une approche prédictive, de cibler certains résidus pour des expériences de mutageπèse. Par exemple, lorsqu'une amélioration de la thermostabilité est recherchée, les résidus ciblés peuvent être ceux qui permettent une rigidification de In structure secondaire. I ;ne telle rigidificalion peut être obtenue de différentes manières ; par exemple, les résidus ciblés peuvent être substitués par un résidu proline qui. classiquement, génère peu de rotamêres et par conséquent rigidifie la structure secondaire à laquelle il appartient, ({gaiement, une rigidificatioπ des structures secondaires peut être obtenue en genémui de nouvelles liaisons hydrogène et de nouveaux ponts salins ; la visualisation de structures modèles en 3D permet de cibler les résidus permettant rétablissement de telles liaisons avec les résidus slnictimilcment proches, l 'ne autre approche que la v isualisation de .modèles en 31) permel. lorsqu'une amélioration de la ihermostabilité et / ou de l'activité est recherchée, est la modification des charges portées par un résidu et les contraintes stériques qui en découlent, il est connu que dans certains cas le substrat / produit d'une cn/> me participe à la stabilisation de la conformation 3D de l'enzyme et peut conférer une thermosiabilité accrue. Il est évident que la visualisation de telles structures modèles en 31) permet de cibler des résidus pour augmenter d'autres paramètres de l'enzyme présentant un intérêt industriel tels que l'activité. l'expression, ou la résistance à la protéolyse par exemple. Il est également é\ ident que cette approche par visualisation de structures modèles en 3 D est un outil prédictif permettant de construire des stratégies de mυtagéncsc sans aucunement garantir une quelconque amélioration de propriétés cn/ymaiiqucs.
Par vecteur d'expression, il est entendu que le vecteur d'expression peut être n'importe quel type de vecteur (notamment, plasmidc, virus, etc... ) recombinant, permettant d'exprimer la séquence nucléotidique du variant amélioré dε la présente invention. Le choix de ce vecteur d'expression dépend de sa compatibilité avec l'hôie d'expression ciblé, dans lequel il est transformé ou traasleclé. Cc vecteur peut être linéaire ou circulaire fermé. Ii peut *e répliquer de façon autonome, c'est-à-dire être une entité cxtruchromαsυmiquc dont !a implication est indépendante du chromosome de l'hôte qui le contient, un plasmidc, un clément extrachromosomal. un minichromosome ou un chromosome .irtilkiel. Λ l'opposé, le vecteur peut, quand il est introduit dans la cellule hôte, s'intégrer dans le génome de l'hôte pour se répliquer en même temps que lui. Egalement, plusieurs vecteurs peuvent être nécessaires à l'expression du variant amélioré de la présente invention ci peuvent être utilisés simultanément, ainsi qu'un transposon.
Les vecteurs permettant l'expression du variant amélioré de la présente invention, peuvent contenir un ou plusieurs marqueurs qui permettent une sélection facile des cellules hôtes transformées ou tmnsfectées. C es marqueurs de sélection sont typiquement des gènes dont le produit confère un avantage à Unir hôte et permet, par exemple, une résistance bactérienne à un antibiotique, une prototrophie pour les auxotrophes. une résistance à des métaux lourds etc.. Des exemples de marqueurs de sélection bactériens sont les gènes qui confèrent une résistance à des antibiotiques IcIs que l'ampicilline, la kaπamycine. la tétracλ cline et le ehloramphëπieol notamment. Les marqueurs appropriés à la sélection dans les levures sont par exemple les gènes ΛDFΛ2. HIS3. I .I- U2. LYS2. MIi Yi, TRJM et 1 :RΛ3 notamment. Des exemples de marqueurs utilisés dans lus champignons filamenteux St)Ut amdS (ucélamidase). argH tornithino earbamoγltransférase). bar f phosphinolhricinc iicétyltraπsférase). liph (hygromycine phosphotransfërase). niai) (nitrate réductaiie), pyrϋ (orotidine-5'-phosρhate deearhoxyla.se), sC (sulfate adcnyltransicru.su) et trpC (anthranilate synthase). notamment. J . es vecteurs permettant l'expression du variant amélioré de la présente invention, peuvent ne pus contenir de marqueurs de sélection.
Le vecteur, dnns Ie cas d'une réplieation autonome, doit contenir une origine de rέplication adaptée à Ia cellule hôte. Des exemples d'origine de réplication bactérienne sont, notamment, eelles des plasmides pBR322. pl,!C l9, pΛCYC 177 et pΛCYC I 84 permettant une réplieation dans Esdiehchia coll. et pL'B H O, pi-! l c>4, pTΛ I 060 et p.ΛMjbetaJ permettant une réplication dans Bacillus. Des exemples d'origine de réplieation dans les levures sont, sans que eelte liste soit exhaustive, les origines de réplieation 2 microns. ΛRSJ . ΛRS4. la combinaison de ARS l et C1-N3 ci la combinaison de ARS4 et CPN6. I . Origine de répiication peut également contenir une mutation qui lui permet d'être sensible à la température. Des exemples d'origine de réplieation utiles dans les champignons filamenteux sont ΛMΛI et ΛNS I d'Aspergillus nidulans (Ciems et ni.. I 4Wl, Gène 98 :61-67 ; Cullcn et a!.. î 987. N'ucleic Λeids Research 15 : *> 163-75 ; WO 00/24883).
I e vecteur, dans le cas d'une intégration dans Ic génome de la cellule hôte, doit permettre son intégration grâce à la séquence codante du variant améliore de la présente invention ou de n'importe quelle autre séquence adéquate dans le vecteur. \ ia une recoinbinaison homologue ou non homologue. Il peut également contenir des séquences d'acides nucléiques supplémentaires pour diriger son intégration dans le génome de la cellule hôte. Pour maximiser les chances d'intégration dans le génome de l'hôte, les séquences d'intégration doivent être d'une longueur suffisante, telle que 100 à 10000 paires de bases, préférentiellemeπl 400 ύ 10000, de façon encore plus préférentielle 800 à 10000 paires de bases. Les séquences d'intégration peuvent être codantes ou non codantes.
I. a séquence nucléottJique '< signai » de 23 codons présente à l'extrémité 5' du gène de la ph>tase de Yersinia intermedia (telle que référencée dans Nt'lil sous les numéros N/ ΛΛf .1 01000052 et /P 00832361 ) et clivée dans la l'orme mature. eonUibue à la sécrétion de l'enzyme dans son hôte d'origine. I .a présence d'une telle séquence est classique et bien connue de l'homme du métier. L.e changement de cette séquence, et son remplacement par une séquence adéquate, est également un paramètre bien connu de l'homme du métier lorsqu'une expression du gène considéré est souhaitée dans un autre organisme ou dans un autre compartiment cellulaire via un vecteur plasmidiψie ou awre choisi en adéquation avec l'organisme d'expression souhaité. Ainsi, cette séquence peut cire remplacée par la séquence signal d'autre gènes telles que celle de PeIIi, PhoΛ, OmpA ou β-luctamasc notamment, pour son expression dans un hôte procaryotc. I .ors de l'expression dans une levure telle que l'ichia pavions les séquences signal présentes à P extrémité 5* du gêne de la phytase de Yersiniti inwnnedia peuvent être les séquences signal PI K)I ci αlàctor respectivement des gènes d'une phnsphatase et de l'αfaetαr de cet organisme. Lors de l'expression dans Saccharυmyccs ecrevisiae. la même séquence signal (xiuelor peut être utilisée. I.ors de l'expression dans Yarnmia lypolylica. la séquence signal présente à l'extrémité 5' du gène de la phytase de Yersinia hueniwdia peut être la séquence signal XPR2 du même gène XPR2 d'une protéase de cet organisme.
Par cellule hôte, il est entendu que la cellule peut être procaryote ou cucαryotu : il peut s'agir d'une bactérie gram positive telle que liacillus alkulυphilm. liacillus ωnyloliquefaciens, liaciilu.v hrevis. liacillus circulam. Bacillus clauxii. liacilhts coagulons. BtK il lus liwtux. ïïaciilus Icntu*. liacillus tichvnifhrmis, Bacillus meχuieήum. liactllus swuroiherrmφhilus. Ht ici Uns .whtilis. liacillus tlmringk'tisis, Sireptomyccs lividam ou Slrepiamyces murmusque. notamment ou une bactérie gram négative telle qu' ' b'scherichia cols ou Psciuhmionas sp. par exemple, sans que cette liste ne soit limitative. La présente inveniion concerne également une méthode do production d'une phytase ou d'un variant de celle-ci soluble et active dans une bactérie, de préférence Eschetïchia coli. comprenant l'expression d'un acide nucléique codant la phytase ou Ie variant de celle-ci dans une bactérie, do préférence Hscherichia coli et. facultativement la récupération de lu phytase ainsi exprimée.
La cellule hôte peut être une levure du genre ( 'anJiih. llamenυla. Kkiyveromyccs. l'ichia, Siiccharomyces. SchKosaccharυmycws. ou Yarrυwia, notamment. Préférentiel lement la cellule hôte peut être Sucdiarotmrc.s carlshcrgemis. Saccharomyccs cvn'vi.\iae. Stnï-han>mycL'x tliu.staticus, Sacchcirontycc.s dotiφisiu' Sticcharnmyt es kluyveri. Sacdhimmyce.s norkcnΦ. Sacchuromyces orito' rmix. Kiuywrowyces lactis. Pichia pustarix ou Yttrmwia lipolytica.
La cellule hôte peut être un champignon filamenteux du genre Acrcmanium. Aspergillus. AuiTohasidium. Hji-rkanderu. C 'cήporiopsis, I oprimts. ( 'nriolus. L 'ryptococcus, l 'ilihasidium. ï-u.suriιιm. IlitmicoUt. Magnaporlhi'. Yiiicor. \lycclinphllmra. ,\cυcιilliιmtslix. \ewnspora, Ptmciloinycvs. Pvmcillitun. P/uincmcluieie. Phlehiu. Pirυmyccs. l'Icin niiis. Schiiuphytlum. Talon mnves. Thcnuoascus. l'hiulavia. l'olypυcladium. ïmmctes. ou Trichoi/erma. Préféreπtiellement Ia cellule hôte peut cire ΛψcrfiiUu.s awamori. Aspergillus fumigatus. Aspergillus fυi'tiώιs\ A\pergillus japonicus. Aspergillus nidukms. Aspergiltus ni/îvr. Aspergillus oryzae, Culdariomyces jumago. Fusarium bactridiaiiies. Fusarium cerealis, Fusarhim crniikwi'ilense. Fusai htm culmorum. Fusarium χrcιminearum. Fusuhum hetïmspυrum, Fusarium negwuti. Fusarium oxyspnrum. Fusarium reliadatum. Fusarium rosvttm. Fusarium sumhuάnum, Fusarium sarcochrυum, Fusarium sparotrichioides. Fusarium sulphureum. Fusarium torulosum. Fusarium irichoihecioides. Fusarium vcnvnuium, lijerktmdvra adusta, ( 'eripυriopsis anciritia. ( 'chpnriop.sis aneirhui. ( 'criporiopsis ciin^iea. C 'eήpoήopsis xilvuscem. ( eriporhipsis pamtovinia. Vcriporiopsis rivido.su. { 'criporiopsis subru/d. Ceήporuψsis suhvermisporu. Coprimis anerem. Coriolm hirsuius, Humicola insalens. f/unticoh Utmtginma, Uiicυr michei, Alyivliυphthoru ihermtψhifa. N^uraspora crassa. Pénicillium jntrpuroiζL'num. Phancrochaew chrysospuήunu l'htchia radiutu. Pleurotus t'ryni>ii. 7'hh'lavia terreslris. liametes villn.sa. Tramelcs wrsicolor. Trich.odenua harziωwm, Irichodcrma kaningii, Tήchadcrma langihrtivhnitum. Triuioderma ree\ei. υu Trivluklerma \ iride.
I a cellule hôte peut être une cellule de mammifère telle que COS7 ou CIK) ( US 4.8iW.803 : lJS 5.047..V>5). Pur acide nucléique un entend de i'ΛDN (ADNc ou ADNg), de PARN ou un mélange des deux. L'acide nucléique pcul comprendre des nuclέotides modifies, comprenant par exemple une liaison modifiée, une bose purkμie ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. II peut être préparé p;tr toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, lu mulagcnese. eic...
1. 'acide nucléique codant un variant amélioré Je la phyiase selon la présente invention peut être optimisé en termes de codons le constituant pour maximiser son expression dans tin hôte particulier différent de son organisme d'origine. Le code génétique universel étant dégénéré, il exisîc* plusieurs codons (codon -- triplet de πucléotidcs) qui codent pour un acide aminé donné. Ces codons homonymes ne sont pas employés au hasard parce que les ΛUN't (ΛRN de transfert) correspondants n'existent pas dans toutes les cellules aux mêmes concentrations. De sorte que certains codons auront moins de chances de s'exprimer dans les tissus où l'ΛRNi correspondant est rare. Cette donnée, bien connue de l'homme du métier, esi un paramètre important à considérer lorsqu'on effectue l'expression dans un hôte donné différent de l'organisme- d'origine d'un transgene particulier. Les tables de fréquence d'utilisation des codons dans un organisme particulier sont publiques et bien connues Je l'homme du métier. Ainsi, les acides nucléiques codant pour les variants améliorés de la phytase selon la présente invention peuvent nécessiter une optimisation pour favoriser leur expression dans l'hôte de production choisi.
Par « pourcentage d'identité » ou identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de In présente invention, on entend désigner un pourcentage de nuciéotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre ies deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les diflërcnccs entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur, l.e meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acïdcs aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de conipuraîMon pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. I -'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au nxneπ de l'algorithme «l'homologû. locale de Smith et Waterman ( l'>81 ) (Λd. Λpp. Maih. 2 : 482). au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch ( l ι>70) (J. Mol. Hiol. 48 : 443). au moven de la méthode de recherche de similarité de Pearsoπ et Lipman ( 1 <>88) (l'roc. Natl. Λcad. Sci. USA 85 : 2444). au moven de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (< iΛP. HhSTI-TI . I-'ASTΛ et 1 !"AS I A dans le Wisconsin Cicnutics Software Package. Genêt ies Computer Group. 575 Science Dr.. Madison. Wl). I e pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale pur fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des delétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. I e pourcentage d'identité est calculé en déterminant Ic nombre de positions identiques pour lesquelles le nueléoude ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en div isant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par I DO pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Ainsi, des ;ieides aminés conservé;» ou équivalents à ceux présents dans le variant améliore de la présente invention 20
peuvent être retrouvés dans des phytases d'autres organismes. Ainsi, l'amélioration conférée par la ou les substitutions sélectionnées dans Ic variant amélioré de la présente invention peut se retrouver en effectuant une substitution équivalente dans une phytase d'un autre organisme que celui dont est originaire la phytase de la présente invention, fl est entendu que ces substitutions équivalentes sont comprises dans le périmètre de la présente invention.
Le variant amélioré de la phytase selon la présente invention peut être utilisé dans les réactions et procédés mentionnés précédemment sous une forme purifiée ou partiellement purifiée. La puriiicatiυπ du variant améliore de la phytase selon la présente invention peut être basique et réalisée notamment par lyse et llltration du contenu des fiasques ou conteneurs de production et/ou par des étapes de cenirifugαtiυn. et/ou par précipitations successives ci sélectives à l'ammonium sulfate et/ou par évaporation. Ces procédures basiques permettent d'obtenir des fractions du variant amélioré de la phytase selon l'invention présentant une forte augmentation d'activité spécifique. La purification du variant amélioré selon l'invention peut être complète et nécessiter différentes étapes bien connues de l'homme du métier notamment des étapes de chromatographie (échangeuse d'ions, d'affinité, hydrophobe, par exclusion de taille), d'électrophorèse (préparative par concentration isoélectrique) j l'rotein Purification, J. C Junson and I ars Ryden. VCI l Publishers. New York, IW)J.
La fraction purifiée ou partiellement purifiée du variant amélioré de la phytase selon Ii] présente invention peut être utilisée dans les réactions et procédés mentionnés précédemment sous une forme immobilisée ou non. Los procédés pour immobiliser Ie variant amélioré de la présente invention sur des supports organiques ou inorganiques sont bien connus de l'homme du métier. C es derniers peu\eiu être notamment des polyacrylamides, des agaroscs. des celluloses, des sephadex ou dextrans. des billes de verre poreuse*, des hydroxydes d'aluminium ou de tilanium.
Par « composition•> on entend généralement une composition comprenant au moins un variant amélioré de la phytase dont la séquence est SLiQ ID N0I avec lu ou les substitutions sélectionnées selon la présente invention. Kilo concerne également tout mélange solide, liquide ou tta/.eux comprenant un certain pourcentage d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention. LIIe concerne également les mélanges eonteπ.uu un. deux, trois, quatre, cinq ou dix variants améliorés de ta phytase selon la présente invention. Généralement, les compositions contenant des phytases sont des compositions liquides ou dites sèches.
Les compositions liquides ne nécessitent pas de contenir autre chose que la phytase hautement purifiée. Cependant des stabilisateurs tels que glycérol. sυrbitol ou monopropyléne glycol peuvent être ajoutés. Ladite composition peut également contenir d'autres additifs tels que sels, sucres, conservateurs, agents tamponnant vis à vis du pli, des protéines et du phytate. Des compositions liquides typiques sont des compositions aqueuses ou des suspensions à base d'huile. Les compositions liquides peuvent être ajoutées à l'alimentation avant ou après une étape optionnelle de granuiatiυn.
I es compositions dites sèches peuvent être des compositions sèches par congélation, par pulvérisation ou des compositions sèches extradées : dans ces cas ladite composition ne nécessite pas Je contenir autre chose que l'enzyme sous sa forme sèche. Les compositions sèches peuvent également être des granulés qui peuvent être mixés ou prêts à l'être avec un composant alimentaire, ou former un composant d'un pré-mélange. La taille des granulés d'enzyme est, de manière préférée,, compatible avec celle des autres composants du mélanμe. Ceci représente un moyen sécurisé et pratique pour incorporer une/des enzymes dans des aliments.
Par exemple, une formulation stable d'enzyme peut être préparée par pulvérisation d'une mixture liquide de phytase sur ιm composant Ici que le tourteau de soja puis séchage de l'ensemble. La diminution du pourcentage d'humidité et les interactions de liaison de la phytase a\cc le composant protègent l'enzyme des facteurs environnementaux extérieurs telles que les températures extrêmes utilisées lors de la fabrication du composant alimentaire. I paiement, la présentation sous forme sèche de Ia préparation de phyiase peut augmenter sa stabilité en diminuant l'activité de potentielles enzymes protéolytiques pouvant être présentes ii l'état de traces à l'issue des étapes de fermentation liquides lors du procédé de production. La préparation sèche de phytase peut, par exemple, être utilisée comme un supplément alimentaire dans l'industrie de production de volailles et de porcs. Λ partir d'une préparation sèche d'enzyme, des granulés sont prépaies en utilisant des techniques d'agglomération bien connues de l'homme du métier, dans un mixeur à l'intérieur duquel un matériel de remplissage et l'enzyme sont co-agglomcrés pour former des granulés, f es granulés sont préparés à partir de matrices sur lesquelles l'enzyme peut venir s'absorber ou sur lesquelles une couche d'enzymes peut être appliquée. Des matériaux typiques pouvant servir de matrice sont des sols tels que du sulfate disodique. D'autres matrices potentielles peuvent être, ou à base de, taîc, argile, silieate de magnésium, silicate d'aluminium ou fibres de cellulose. Optionnel lement. des agents liants tels que les dextrincs peuvent être inclus dans les granules.
Des agents entraîneurs peuvent être inclus sous une forme quelconque des composants ci- après : amidon, manioc, pomme de terre, riz. blé. maïs... Des sels peuvent également être ajoutés.
Optionnellement. les granulés peuvent être recouverts par des mélanges dédiés spécifiquement, et en particulier des mélanges hydrnphobcs, à base d'huile de palme, de suif de bœuf, et si besoin, d'autres additifs tels que carbonate de calcium et argile.
Par ailleurs, ia préparation de phyla.se peut contenir d'autres agents tels que des agents colorants, des composés aromatiques, des stabilisants, des vitamines, des minéraux ainsi que d'autres enzymes ou mélanges d'enzymes ayant des propriétés avantageuses. C eci est particulièrement vrai pour les pré-mélanges.
Par additif alimentaire, on entend un composant pratiquement pur ou une composition contenant plusieurs composants destinés à cire ajoutés à un aliment. Un particulier, cet additif est destiné à devenir un composant à part entière dudil aliment ot a pour objectif d'affecter, de modifier, d'augmenter une/des propriétés dudit aliment. Ainsi, une préparation de phylase utilisée comme additif alimentaire signifie υn^ pbytase qui n'est pas un composant naturel de Paument dans lequel elle est ajoutée, ou qui n'est pas présente dans cet aliment à sa concentration naturelle, ou qui est ajoutée séparément des mures composants de l'aliment, seule ou en association avec d'autres additifs alimentaires. T> piqtiemont. un additif alimentaire contient plusieurs composants tels que vitamines, minéraux, agents entraîneurs, excipients, autres enzymes ou mélanges d'enzymes ayant des propriétés avantageuses.
Par préparation de phylase comme additif alimentaire prêt à l'emploi ou phytase comme additif alimentaire prêt à l'emploi, on entend un additif alimentaire qui n'est pas produit in situ dans la nourriture ou l'alimentation animale. Une telle phytase ou préparation peut être donnée directement comme aliment aux êtres humains ou aux animaux et de manière préférée, directement après mélange avec d'autres constituants dudit aliment. Par exemple, un additif alimentaire selon cet aspect de la présente invention est combiné avec d'autres 23 composes pour produire un aliment. Il est inclus dans ces autres composés une ou plusieurs autres enzymes, de préférence thcrmosiables. des additifs alimentaires vitamines, des additifs alimentaires minéraux, des acides aminés comme additifs alimentaires. I.e résultat de ce mélange ou cette combinaison de composés peut être mélangé dans une proportion appropriée avec d'autres composés tels que des suppléments proteiques ou céréaliers pour former l'aliment final. Les procédés de fabrication de ces aliments peuvent être réalisés en utilisant tout appareil bien connu par l'homme du métier, telle qu'une machine à double granulation, une granuleuse à vapeur, un expundeur ou un extrudeur. Par préparation de phytase ou composition de phyiase de la présente invention, on entend des préparations ou compositions qui contiennent une quantité significative d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention et une ou plusieurs autres en/ymes ayant des propriétés avantageuses pour la préparation d'aliments. De telles enzymes peuvent appartenir à la liste .suivante sans que celle-ci soit exhaustive : alplτu- gaiaclosidαses. beta-gaiactosidases, en particulier les lactases, d'autres phytases. beta- «lueaπases, en particulier des endo-beta-1.4-glιιcanuscs et des endϋ-bcta-) .3(4)-glucanascs, celluloses, xyiosiduses, yalactanases. en puitieuliur des arabiιiogϋlactan-eιidυ- 1.4-hetn- galaetosiduses et des arabinoμulactan-endo- 1.3-beta-galutfosida.se:;. cndoghicunases. en particulier des eπdo- ! ,2-betu-glucanase. cndα- l .3-alpha-μlucanasc. et endo- l .3-beta- glueanase. des en/ymes dégradant les pectines, en particulier des peetinases. peciincsterases. des pectine I vases. polygalacturonases. uπthinanu^es. rhuninogalacfuronases. ihamnoμalacîiironan-sceiyl-esteiases. rhamnogalacluronan-alpha- rhamnosidase. peelate lyases. des alpha-galaeturoni.sida.ses. mannanasos. beta- iπannosidases. mannan-acetyl-esierascs. xyian-acetyl-esteiases. proteases. xylanases, arabinoxylanases et en/ymes lipolyiiqucs telles (jue lipases, phospholipases et eutinases.
I . a supplcincntαtion de l'additif alimentaire aux animaux, selon la présente invention, peut être faite avant ou de manière simultanée par rapport au repas. De manière préférée, la supplémentalion se fait en même temps que le repas.
1.1 ne quantité efficace de phyta.se pouvant être ajoutée dans les aliments est d'environ 10 à 20000 l'I'U-'kjï d'aliment; de manière préférée entre 10 et 15000 PPU.'kg; de manière encore préférée entre 10 et 10000 PI1I '/kg. l-n particulier de 100 a 50IW) IMM . ks». particulièrement de 100 à 2000 PPl ;<ky d'uliment. 24
Dans Ic périmètre do ia présente invention est également comprise l'utilisation d'un variant améliore de la phytase selon la présente invention dans la fabrication d'aliments destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale. Des grains ou des farines destines à l'alimentation humaine peuvent être traités avec de Ia phytase pour réduire leur teneur en phytate. permettant un accroissement de la valeur nutritionnclle de ces produits en augmentant la disponibilité de minéraux essentiels tels que 1er. calcium et /inc par exemple. Λu delà de la valeur nutritionnellc. un ici traitement par la phyiase peut augmenter l'efficacité de la production de cet aliment. Par exemple, l'addition de phytase à des Mocons de soja blancs durant Ie proeédé d'extraction de protéines du soja peut augmenter le rendement et la qualité des protéines extraites. La phytase est active durant la fabrication des aliments mais pas dans îe produit final. Ceci est particulièrement vrai dans la fabrication et la cuisson des pâles pour boulangerie. De façon similaire, dans la production d'alimentation animale, des grains de soja ou de col/a peuvent être prétraités par la phytase avant leur fabrication et/ou conditionnement final. l,'n tel prétraitement permet de dégrader des éléments anli-nutritionnels tels que le phytate et augmenter la qualité et la valeur nuiritionnelle des aliment:» en question. Dans ce cas. la phytase peut ou ne pas être toujours active dans le tractus digestif des animaux après leur ingestion des aliments.
L-'sl également comprise dans le périmètre de l'invention, l'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention comme agent facilitaleur de la transformation des aliments. Kn particulier, la phytase selon la présente invention peut être utilisée comme un supplément dans l'alimentation humaine pour faciliter la digestion. Par exemple, un/des cachets contenant une quantité adéquate de phytase peuvent être ingérés par une personne av ant kt consommation de nourriture afin de fournir une enzyme active à son tractus digestif. I .e bénéfice île cette ingestion de phvtase est particulièrement remarquable dans le cas de consommation d'une nourriture ne pouvant être traitée par la phytase durant sa fabrication.
I a phytase selon la présente i mention peut être avantageusement utilisée avec îles aniimux mono- ou polygastriques. spécialement les jeunes veaux. Les régimes destinés aux poissons et crustacés peuvent également être traités par la phytase afin d'améliorer les rendements de conversion entre la nourriture Iburnie et Ia croissance des animaux, ainsi 25 que réduire les quantités de phosphate excrété dans les systèmes de production intensifs. La nourriture traitée selon la présente im ention peut-être fournie ά la volaille (dindes, canards, υies, perdrix, poules, poulets de chair) aux porcs, aux chevaux, aux bovins, aux caprins, aux canins, aux retins. KIIe s'adresse particulièrement à la volaille et aux porcs, incluant sans que cela ne soit limitatif, les poules, poulets de chair, dindes, canards et oies.
I. a phyta.se selon la présente invention est utilisée pour produire de nouvelles combinaisons d'ingrédients alimentaires ou aliments avec des qualités avantageuses. Par exemple, elle peut être utilisée pour produire des aliments ayant une teneur abaissée en phosphate inorganique. Cette teneur est ajustée en fonction de la quantité et de l'activité de la phytase ajoutée, présente dans l'aliment final, ou active dans un des ingrédients alimentaires rentrant dans la composition de l'aliment final. D'une manière préférée, un tel aliment peut contenir des ingrédients iels que micrυiuilrimcnts. vitamines, acides aminés et des quantités elïïcaces et optimisées de phytase cl de phosphate inorganique toiles que la quantité de phytase est comprise entre 50 et 200(JO unités de phytase par kilo d'aliment et la quantité de phosphate inorganique est inférieure à 0.45%. Préfèrent iellcmcnl. ces deux quantités se situent entre 100 et H)OOO unités de phytase par kilo d'aliment et moins que 0.225% de phosphate inorganique ; d'une manière encore préférée entre 150 et 10000 unités de phytase par kilo d'aliment et moins de OJ 5% de phosphate inorganique ; d'une manière encore plus préférée entre 250 et 20000 unités de phytase par kilo d'aliment et aucun phosphate inorganique ajouté. Ces nouvelles combinaisons présentent des intérêts divers tels que Sa réduction des rejets de phosphate dans l'environnement et l'optimisation des rendements de conversion entre la nourriture fournie et Ia croissance des animaux, particulièrement recherchée dans la production intensive en élevage.
La présente invention sera décrite plus en détail dans les exemples suivants qui n'ont en aucun cas un caractère limitatif, à l'aide des tableaux et figures associés suivants :
Tableau 1 : Mutants isolés par l'approche THR™.
Tableau 2 : Liste des mutants présentant un site supplémentaire de glycosylation classes en fonction de leurs pourcentages d'accessibilité aux solvants respectifs.
fablcau 3 : Liste des couples de mutations permettant l'addition de ponts disulfuros supplémentaires,
fablcau 4 : Ccn-ffieients d'extinction d'activité 80-20 pour différents mutants. 26
Tableau 4Λ : Coefficients d'extinction d'activité 80-20 pour les mutants K.2 I0S. Y268Ï: et Q292P.
Tableau 4!î . Détails des données permettant le calcul du coefficient d'extinction d'activité 80-20 du mutant K.2 K)S.
Tableau 4C : Coef ficients d'extinction d'activité 80-20 pour les mutants T142-N.
Λ 1 77T et Q326 T.
I ableau 4[) : Coefficient d'extinction d'activité 80-20 pour le mutant G2?4(7N Η OC.
Tableau 5 : Listes des mutants ciblant une amélioration d'activité
Tableau 5Λ : Li.ste des positions cibiées par une disnince inférieure ou égale à iO
Λngstrϋms autour du siie ealalyiique Je l'en/yme.
I ableau 3B : I iste des substitutions ciblant une amélioration d'activité caractérisées dans une première série d'expériences.
Figure 1 : Dégradation du phytate par une phytase
Figure 2 : Principe de la technologie M 1RÎ M
Mgurc λ : Mesure des acli\ ités résiduelles des mutants Pl I Y-98-4X et JM 1 Y-98-6X produits par Succharυmyccs cerevisiac après un préchauffage de 0 a 2 minutes à 80''C*.
Figure 4 : Mesure des activités résiduelles des minants PHY-1MMX et JJHY-ι>8-6X produits par Sitccfuimtnive.s cerevisiue après un nréchautïage 15 minutes à άca températures de 45ι C à 65"C.
I-'igure 5 : Mesure des activités résiduelles des mutants IM IY-98-4X et IM IY-98-όX produits par SticcharnmyïL's vi'revistac après un préchaulïage de 1 minute à des températures de 600C à 80''C.
Figure f>A : Mesure des activités résiduelles des mutants PHY-W-6X et lM lY-W-6X-ssl I produits par Pidiia panions après un préchaυiTuge tic 0 à 30 minuies à 801 C.
l-'igure hli : Mesure des aeth ités résiduelles des mutants PHY-98-6X et PH Y-98-6X-ssl I produits par Pichiu pastnris iiprès un préchaufluge lie 0 à 5 minutes à 80''C.
f igure 7 : Mesure des niveaux d'activités relatifs des mutants Pf IY-WMX et IM IY-(>K-6X comparativement à l'enzyme d'origine PMY-MH produits par Succhurυmyres veruvisiai:. en fonction du temps.
f-igure 8 : Ciel SDS-PACiI- 12% de surnageants de pn>dιιction pour différents mutants exprimes par Pichia pastoris. digérés υu non par Tendoglycosidase Hf.
Exemples : 27
ICxempie I : Obtention des variants améliorés de la phytase de Ϋersinia intermedia
Çontructions pia.smidiques :
La réalisation des variants améliores de la phytase selon la présente invention a nécessité la construction de JiJTtTCiHs vecteurs plasmidiques permettant Ia réalisation des expériences de rnuUîgenêse dirigée nécessaires à l'obtention de banques de variants ou mutants ainsi que l'expression de ces mutants dans différents hôtes de criblage ou de production.
C onstructions dans pJ-T25b :
Selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, PORF (Open Reading l'rame! /P 00832561 correspondant à la séquence NCBi ΛTCC 2990Q cl à Ia séquence micléotidique correspondante NZ ΛΛ Ll 01000052 région : 188')...3214 a été clonée dans le vecteur pJasmidique pHT25h. Avant clonage, l'ORF a été dèléiée de sa séquence signal d'origine (23 premiers acides aminés) remplacée par la séquence signal de la phytase ά" Esvherichkt coll. Cette séquence signai de la phytase LY Eschctïchia coli a été préalablement eionée dans le veeieur pli 125b aJïn d'optimiser ("expression de la phytase de yersinia huermtntia dans /;'. euh. Le vecteur pl:T25b permet également d'exprimer la protéine d'intérêt sous la forme d'une protéine de fusion ai'ec un « tag όl iis *> facilitant l'isolement et/ou la purification de la protéine d'intérêt selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur contenant la phytase de ) Vr.wH/c/ intermctiiu fusionnée à la séquence signa! de la ph>tase (.VF. coli a été transformé dans une souche d*F. coli iïL2 i (i)lî.>) tiélétée du μètie ΛppΛ codant pour la phytase endogène d'/:'. cnli.
Constructions dans pNCK:
L'ORF de ZP !)083236 l a été clonée selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier dons le vecteur pNCK. Ce vecteur permet d'exprimer dans un miemorganisme thermophile Thcrnius thurmapUHus une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt et un gène de résistance thermostable à la kanamyeine selon le procédé décrit dans Ia demande de brevet WO2006134240 et correspondant à la technique propriétaire de Hiirmélhodes I I IR'JM.
Constructions dans pYKS2 :
LORr de ZP 00832361 a été clonée selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier dans le vecteur pYHS2. Ce \ecteur, contenant le peptide 28 s ignal de la phyiase ά\-\sμerχillm niger en position 5' de IORF ZP 00832361 , a permis "expression de la phytase de Yeninia intcrmviliu par Saccharυmyce.s cerevixiae.
Constructions dans pPIC9 :
1 ,"ORF de ZP 0083236 î a été cloπée selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du mélier dans le vecteur pPIC9. Ce vecteur, contenant le peptide signal de Pαlaetor de Pichia posions (Tnvitrυgen) en position 5' de 1"ORF ZP 00832361 , a permis l'expression de la phytase de Ycrsmia inwrmetiia par Pichia postons. Construction de banques de mutants dans p.NCK. criblage et obtention __djî^arianjs arnéliorΛr:
Plusieurs banques de mutants de ta phytase de ïerùnhi intermvdia ont été créées par la technique propriétaire de Miomélhodes Massive Mutagene.MS'R' décrite dans t 'S 7.202.086 cm dans Saboulard ei al (Bioteehniques, 2005 Sep 39(3) : 363-8). Brièvement, des olmonueléotides mulagènυs ont été synthétises pour réaliser des minants de la phytabc sur chacun des acides aminés constituant l'enzyme. Les banques de mutants ont été construites à partir Uu vecteur pNCK contenant Ic gène de la phytase. selon le protocole de Masske Mutagenesis-K1 décrit dans \ :S 7,202.086 ou dans Saboulard cr al (iîioledmiques. 2005 Sep .W(3 ) : 363-8). puis transformées et amplifiées dans la souche d* Eschcrichia coli I)H lOIi. Les mutants de la phyiase contenus dans ces bπnques ont ensuite été criblés par la technique i'I IR1 M décrite dans la demande de brevet WO2006134240. dont le principe est résumé dans la figure 2. La possibilité offerte p.ιr le système de sélectionner en une seule étape un très grand nombre de molécules mutantes permet de travailler avec des banques de très haute diversité. ( ine telle banque, ciblant tous les résidus de la protéine, env iron 10* clones, a été construite grâce à Massiv e Mulagenesis*.
Brièvement, les banques de mutants sont transformées dans des cultures de Thcrmus ihenmφhilus rendues compétentes. Les transformants sont mis à pousser en milieu liquide à 70''C pour réaliser des précultures qui seront ensuite étalées sur un milieu solide contenant des concentrations stringentes en kanamycine de Tordre de 25 μG/ml. Après une ncubation de 48 heures à 70"C. seuls les mutants dont ia structure protéique résiste à laempérature de sélection et dont le repliement esl correct permettent un repliement fonctionnel du gène de résistance thcrmυstahlc à la kananiveinc et donc peuvent pousser en présence «le kanamyc-ine. P:tr cette jpprochc. différents mutants uni clé isolés, leurs ΛDN plasinidiques isolés et séquences. Les différents mutants ont révélé un total de 13S 29 substitutions -sur 89 positions présentées dans le tableau I . Les différentes substitutions ont etc introduites individuellement dans la phytase clonée dans le vecteur plasmidique pHT25b afin d'être exprimés dans li.wherichia col: et caractérisés plus en détail au niveau de leur activité et de leur thcπnoslabililé. L'exemple 4 détaille les protocoles de mesure d'activité utilisés et l'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. I; nu première série d'expériences a permis d'identifier au moins 5 mutants ayant une theπnostahilitë augmentée par rapport à l'enzyme sauvage. Parmi ceux-ci. ."> mutants contiennent respectivement des substitutions sur les acides aminés K210. Y268 et Q292. particulièrement les substitutions K2 I0S. Y26XK et Q292P. Ces mutants présentent un coefficient d'extinction d'activité entre HO % et 20 % d'activité résiduelle respectivement de 1 ,75. 1.98 et 2.30 tels que présentés dans le tableau 4Λ. t'es indices sont calculés par le rapport entre les différences de températures permettant d'une part le maintien de 80% de l'activité résiduelle et d'autre part de 20% de cette activité résiduelle pour les différents variants comparativement à l'enzyme sauvage. I .e détaii du calcul de cet indice est montré pour le mutant K21 OS dans le tableau 413.
La visualisation de structures modèles en 30 utilisant des logiciels tels que swiss-mode!
UΛtφ--i\^.^:V:xr?isX^-hz) t :φdb\ v 4.01 i( JlaxoSmithKline) permet d'avancer certaines explications concernant les gains de lhermnstabililέ obtenus pour les 3 mutants mentionnés ci-dessus. K.2I 0 ost un résidu potentiellement incessible au solvant et localisé dans une structure secondaire de tvpe «* feuillet ». éventuellement impliqué dans la liaison et / ou l'interaction avec le substrat (ph> tate) ou les produits issus de lu réaction. K.210 semble donc être un résidu important notamment à cause de sa charge positive cl de son volume important pouvant générer des contraintes stériques et électrostatiques vis à vis de l'entrée du substrat ou de la sortie des produits du site actif. La porte de celte charge positive dans la substitution K.210S et la modification de la contrainte spatiale associée peuvent donc perturber globalement la réaction (entrée du substrat ι sortie des produits r solvataiion de la cavité du site actif) et modifier les constantes cinétiques de celle-ci, et plus particulièrement les Km apparents pour les différents substrats générés au cours de la réaction. 11 est connu, clans certains cas. que les substrat ' produit peuvent participer à la stabilisation de la structure 31) de la protéine et conférer une tliermostabilité accrue. I! est envisageable que cette subMitution facilite, par exemple, le positionnement du substrat en augmentant le nombre de eonformères tolérés dans le site actif et/ou puisse également faciliter l'évacuation des phosphates libérés au cours de la réaction en empêchant que ceux-ci ne soient trop présents dans lu ea\ hé du site actif, présence qui pourrait clairement 30 perturber le complexe enzyme-substrat et déstabiliser l'ensemble de la structure. Y268 est un résidu potentiellement accessible au solvant et localisé dans une struelure secondaire de type "boucle". IJi mυdélisant la substitution Y268I: à l'aide des logiciels précédemment mentionnés, on constate qu'on augmente le nombre de liaisons hydrogènes potentielles avec les résidus struαuralemeπl proches (avec la fonction t O peptidique du résidu Q 143 par exemple), mais aussi, que cette substitution peut engendrer un pont salin supplémentaire avec notamment K 146. Globalement, on consulte une rigidificaiion de la région en question qui pourrait expliquer le gain en thcrmostabililc constaté. Q292 est également un résidu potentiellement accessible au solvant. localisé dans une structure secondaire de type « boucle ». La substitution par un résidu praline est une approche d'ingénierie relativement classique dans ce type de structures secondaires faiblement conservées. Ce type de résidu génère peu de rotamères et va. par conséquent, rituditter la structure secondaire dans laquelle it se situe et ainsi conférer dans certains cas. un gain de thermosiabililé que pourrait donc engendrer ia substitution Q2O2I*.
^"Ili-iT-J-Uit1" vK1 mutant?, possédant des >ites supplémentaires de «lyeos>lation :
Certaines modifications ρost-iraJueiiυnnelK*.s comme les ylvcosylations sont décrites comme stabilisant les protéines. I. es signaux Je N-glyeosy lalions dans une séquence protéique sont Nx 1" ou N\S. De tels sites ont été introduits dans la phytasc de Yersinn' t i.'iurmi'iiia clonée djiw le \ecieur pYI:S2. soit par la technique propriétaire de βiomêlliodes Massive Mutugcncsis-fc' comme mentionné ci-dessus ou par une technique de muiagenèse bien connue de l'homme du métier, telle qu'une PCR par recouvrement, en introduisant un résidu 1 à la position < 2 par rapport à un résidu N présent dans la phytase de Yersiniu intermedia ou en introduisant un résidu N à la position -2 par rapport à un résidu S ou T. I. es portions sur lesquelles des siies de ylyeo«*ylutiυn ont été introduits sont classées en fonction de leur pourcentage d'accessibilité aux solvants (% ΛSΛ) par utilisation du logiciel disponible à : hi!p;iZ!ÏVΛfryJe^^^
l.îiπiβi.r^lP.y^ϋlλO.v^M (Richmond. 1.1. Solvent accessible surface area and excluded volume in proteins. J. Mol. liiol., 178. 63-80 ( 1084). Préléreπtiellcment, 22 substitutions sur des résidus ayant un pourcentage d'accessibilité aux solvants > 35 % ont été sélectionnées. Encore plus préférentiel lement. I t) suhstitulions sur des résidus ayant un pourcentage d'accessibilité aux solvants > 70 % on! été sélectionnées. Ces différents \arianis construits permettant l'ajout de sites de glycosylations sont classés dans le tableau 2 en fonction de leurs pourcentages d'accessibilité aux solvants respectifs. I ,cs constructions imitantes ont été transformées dans Sucdnirυmyces cetwisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur theπnostabilité. I, 'exemple 5 détaille les protocoles de earactérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. \ 'ne première série d'expériences a permis d'identifier plusieurs mutants avec un site .supplémentaire de glycosylalion possédant une thυrmoslahilitc augmentée par rapport à lr enzyme sauvage. Ces mutants contiennent des substitutions sur les acides aminés 'ï 142. Λ 177 et Q326 caractérisés par un pourcentage d'accessibilité aux solvants > 70%. Plus particulièrement, les substitutions sur ces acides aminés sont TI 42N. Λ 177F et Q326T. Ces mutants présentent un coefficient d'extinction d'activité entre 80 % et 20 % d'activité résiduelle respectivement de 1 ,62. 1 ,62 et 1.52 tels que présentés dans le tableau -IC. ("es indices sont calculés par le rapport entre les différences de températures permettant d'une part le maintien de 80% de l'activité résiduelle et d'autre part de 20% de celte activité résiduelle pour les différents variants comparativement à l'enzyme sauvage. Le délai! du calcul de cet indice es! montré pour le mutant K210S dans le tableau 411.
CjH«.siruj;tjoj]L de muants possédant des ponts disuil'urc supplémentaires :
Plusieurs couples de résidus ont été identifiés pour leurs distance et orientation compatibles avec la formation d'un pont disulfurc et remplacés par des résidus eystéine. L'identification de ces couples a été faite par visualisation de structures modèles ou homologues de phytases sous format pdb en utilisant un programme type Swisspdb Vievver (CïlaxoSmilhKline) et en tenant compte des dislances optimales entre résidus et orientation des chaînes latérales de ceux-ci. Par cette approche, 12 paires de résidus s'il nés à em iron 2 Λngstroms oui été sélectionnées et sont listées dans !c tableau 3 :
I es résidus précédents ont été introduits dans la phjtase de ïvrsinia intermetiiu clonée dans le vecteur ρYLS2, soit par Ia technique propriétaire de Itiométhodes Massive Mutayeπesistt. comme mentionné ci-dessus ou par une technique de mutayenèse bien connue de l'homme du métier, telle qu'une PCiR par recouvrement. Les constructions mutantes unt été transformées dans Succfnιrυmycc.\ ccrerisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité cl de leur thermosiabilité. L'exemple 5 détaille les protocoles de caraelérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Une première .série d'expériences a permis d'identifier un mutant possédant un pont disulfure supplémentaire et une thermostabilité améliorée. Cc mutant contient deux .substitutions sur Ie-* résidus ( J274 et N3 l o. plus particulièrement les substitutions ( i274C ei N^ I oC. Ce mutant présente un coefficient d'extinction d'activité entre 80 % et 20 % 32 d'activité résiduelle de 2.33 tel que présenté dans Ie tableau 4D. Cet indice est calculé par Io rapport entre les dilTércnccs de températures permettant d'une part le maintien de 80% de l'activité résiduelle et d'autre part de 20% de cette activité résiduelle pour le variant SS I 1 comparativement à l'enzyme sauvage. Le détail du calcul de cet indice est montré pour le mutant K21 OS dans le tableau 4 B.
Plusieurs résidus ont été ciblés pour identifier des mutants présentant une activité améliorée. L'identification de ces résidus a été faite par visualisation de structures modèles ou homologues de phytases sous format pdb en utilisant un programme type Swisspdb Viewer ((ilaxυSmithKline). Le critère de séleetiυn choisi est la situation des résidus à une distance inférieure ou égaie à I O Angstroms autour du site eaiuiytique de l'enzyme. Par cette approche 76 positions ont été sélectionnées et sont listées dans le tableau 5Λ. t . 'ne diversité totale, par l'utilisation d'oligonucléotides NNS a été introduite au niveau de ces positions dam la phytasc de Yarsiniu înienneclia clouée dans le vecteur pYHS2. soit par la technique propriétaire de Hiomcthodcs Massive Mutagenesis-tt comme mentionné ci- dessus ou par une technique de mulagcncsc bien connue de l'homme du métier, telle qu'une PCR par recouvrement. Ainsi, pour chacune des positions listées dans Ic tableau 5Λ. les mutants comportant indiv iduellement l'une des 19 substitutions possibles parmi la liste lies 20 acides aminés existants ont ëlé construits : selon le code à une lettre communément adopté, ces 20 acides aminés sont : Λ. R. N, Iλ C. II. Q. Ii. ! 1. 1. L, K. M. K P. S1 1 . W. Y el V. I . es constructions minantes sont transformées dans Saccharamyci's t crvvisiai' et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur themnosiabiiité rcpeciivcs. f. 'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Une première série d'expériences a permis de caractériser 14 mutants contenant les substitutions listées dans le tableau 5H. f.'i?-πib_iiuu.soπ_d£Lti!ii^iyrMkirJ^_i
Les différentes approches utilisées permettent de cumuler les gains de ihermostabiliië et/ou d'activité et/ou de résistance à la proléolyse obtenues par les criblages ei caractérisations tics différents mutants dans chacune des approches Tl IR™. ajout de sites de giyeosylatioπ. ajout de ponts disulfurcs et eihlaye de l'activité. Une première série d'expériences a permis de construire plusieurs mutants combinant les améliorations de tliermnsiabilité obtenues par criblage des banques selon IΗR™, P ajout de nouveaux sites de glycosylaiion el l'ajout de ponts disullurcs. Ces imitant ont été construits par la technique propriétaire de βiométhodes Massive Mutagenesis R' comme mentionné ci-dessus. Plusieurs mutants ont clc construits comprenant les combinaisons de substitutions G274C u N3 I 6C. TI42N » Λ 177 F * Q326T. K2 I 0S * Y268E + Q292P. I) 140F t Y268E t- Q292P. FI 67N•- Y268E + O202P. T142N • Λ I 77T + K210S -1 Q326T, IÏ42N - Λ 177T ^ K2 I 0S -» Y2&8I- ^ Q292P * Q326T. 1 142N '- Λ 177T H K2 KJS * Y2&8E *- Q292P *- Q326T > «274C + N316C. Les constructions mutantes ont été transformées dans Saccharomyces ceravisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur ihcrmυstabilitc. L'exemple 5 détaille les protocoles de caraelérisation de l'activité résiduelle dos mutants en l'onction de Ia température. Les figures 3 à 7 présentent les lêsullats des caractériMitions de certains de ces mutants en particulier les mutants PHY-9X-4X. PHY-98-6X cl PHY-98-6X-SS 1 1 contenant respectivement les combinaisons de imitations T142N * Λ I 77T - K2 I0S t O3261", ÏÏ42N *- Λ I 77T f- K210S * Y2Λ8F. ι- Q292P * Q326 T il F 142N ! Λ1 77 T .- K2I0S »- Y268Ï- * Q292P > Q'3261" r (J274C: »- N3 I 6C. les positions étant indiquées dans SLQ ID N" I . Trois souches bactériennes coπienant respectivement Penzjnie d'origine PI IY-98 et les mutants PI 1Y-98-0X et PHY-98-6X-SS 1 1 mentionnés ci-dessus, clones dans le vecteur plasmidiι|ue pYHS2 comme décrit par ailleurs, ont lait l'objet d'un dépôt dti matériel biologique sous les références respectives CNCM 1-4172, CNCM 1-41 7.» cl CNCM 1-4174, îe 24 juin 2(JO1J. Ces différents mutants peuvent servir de base pour ajouter une ou des substitutions .supplémentaires provenant des différentes approches de sélection ot montrant une/des améliorations d'activité/thermostabilité afin de créer de nouvelles combinaisons de mutations cumulant ies gains d'améliorations ou montrant des synergies dans les améliorations dues à ces nouvelles combinaisons de mutations. Kxemple 2 : Kxprettiiυn des variants améliorés de fa phytase de Yersinia intermedia dans Saccharnmyces cerevisiae
La plasmide pYI-!S2 contenant le variant amélioré de la phytase de Yemniu intermcώa comme décrit précédemment a été transformé par électroporation dans la souche île levure Succfiarυmyce.s cerevisiae ΔPho4 et les transformants ont été sélectionnés sur milieu solide Sl)-I '. Plusieurs clones ont Jté mis à pousser en précullure on milieu SD-I ' liquide pendant une nuit à 30'C" sous agitation. Ces préeultures ont permis d'ensemencer autant de cuittue dans le milieu de production YP Galactose 2%. 1 es productions ont été réalisées -un* une nuit à 30'1C sous agitation. Exemple 3 : Expression des variants améliores de la phytase de Yersinia intermedia dans Pichia Pastom Le plasmide pPK'9 contenant le variant améliore de la phytase de Yersinia iniermediu comme décrit précédemment a été transformé dans des cellules de Pichia pastoris rendues compétentes. Après sélection des colonies contenant le plasmide, une colonie a été mise à pousser pendant 16 heures à 28'1C sous agitation dans 50 ml de milieu FiM(J pour former une préculture. La production des variants est contrôlée par des temps d'induction différents au méthanol 0.5% selon la quantité désirée dudil variant. Avant induction, la Densité Optique (ViO) des prccult lires a été mesurée à oOOnm : pour l'induction, des DO optimales Je 2 à 6 uDO sυπl exigées. Los prόcul turcs ont alors été centrifugées et resu -pendues dans un milieu BMVI contenant 0.5% de méthanol à une I)O de démarrage comprise entre i et .K) uDO ml selon les temps d'induction envisagés : luDO/ml pour une induction de 06 fleures. 6 u I XVmI pour une induction de 72 heures et M) u IX VmI pour une induction de 48 heures. Du méthanol 100% est ajouté toutes les 24 heures à une concentration finale de 0.5"•'». Ces procédures de pmduciiυn ont été utilisées pour des productions en L-'rlcnπιe\cr adaptées à des volumes allant de I O ml à 200 ml.
Pour des volumes supérieurs, les productions ont été réalisées en bioréacteur de 5 à 50 I. adapté à des volumes Je production allant de 2 à 20 I . Le type du bioréacteur utilisé (Λpplikon) permet un contrôle automatisé de la pousse des levures par mesures régulières de la Densité Optique à 600 nm et de la pression en Oxygène (pθ.>) optimisant le maintien des conditions d'induction par méthanol. I. a procédure utilisée a été adaptée du protocole de fermentation en Pichia paxtnris d'Invitrogcn (<< Pichia expression kit : a manuαl of methods for expression of reeomhinaπi proteins in Pichia pastnris >> - Version M du 1 1 janvier 2002*. La llμure 8 présente un (ïei SI)S-PACiI-" 12% de surnageants de production pour différents mutants exprimés par Pichia pastorh. digérés ou non par l'endoglycosidase Hf (NeU l- ngland Rinluhs PO7O3 ). Les pistes du gel notées Phv 98. lJhy 98 6x et Phy ι>8 6.x SSl I correspondent à 10 μli de surnageants de production des molécules PHY-0U. PHY- 98-6X et P1 IY-9H-6X-SS I 1 décrits dans l'exemple 1. Le mutant Phy 98-6X-SS5 est un mutant contenant ies substitutions I .52C• I .WC ( T142N '- Λ 177T r K210S * Y268I- t ^2')2P ' O326T. Les pistes PhyιλS montrent le profil de iπigration Λt la phytase sain âge de \ vrtinia inwrmvtliu. non μlycosv lée puisque ne possédant pas de sites potentiels de N- giycosN lalions N\S/T : ceci est illustré par l'absence de différence de migration après 35 digestion par Pendoglycosidase Wf. Les pistes I'hy «8 6x. Phy ^8 ftx SS5 et Phy 98 6x SS l 1 , en absence de digestion par rcndoglycosida.se Hf, montrent les profils de migration des phytascs mutantes présentant des masses moléculaires supérieures dues à la glycosylalion respective des mutants. Cette glycosylalion est montrée, après digestion par l'endoglycosidase Hf (pistes notées « digéré Hπdo I II" »). par un retour du prolîl île migration des différents mutants vers celui de la phytase sauvage, même si dans certains cas la digestion par Pendoglyeosida.se peut être incomplète.
Exemple 4 : Mesure de l'activité des variants améliorés de la phytase de Yersima inter média
I, 'activité des variants! de la phytase de Ycrsinia iniermetlia ainsi que l'activité de la protéine d'origine prise comme contrôle, a clé mesurée à l'aide d'un test colorimétrique mesurant le phosphate libéré en présence d'une solution de phytate prise comme substrat. Brièvement. 40 μl de surnageant de l'échantillon à tester (dilué ou non en tampon acétate de sodium) ou 40 μl d'une solution étalon d'une gamme de phosphate ont été mélangés à 40 μl de phytate (20 g/l i. I -a réaction a été incubée classiquement 15 minutes à 37X. La réaction a été stoppée par 80 μl de NaC)H à 0,5M ou TO Λ 20%. nO μi du volume total de la réaction de 160 μl ont été transférés pour la rêve Union avec 60 μl d'une solution Fe-Mo. La réaction de révélation a été laissée pendant 1 5 minutes à l'abri de la lumière avant d'être iu dans un spectrophotυmèlre à 620 ntn. Toutes les solutions de la réaction ont été réalisées avec de l'eau ppi sans phosphate. Le tampon rcaelionnel est un tampon acétate de sodium 0.25 M nH 4.5. Le substrat utilisé est une solution de phytate réalisée dans le tampon reaetionnel précédent à partir d'une solution stock à 200g/l. La solution de révélai ion a été formée cxtcmportinémeni par 4 \olumcs de solution de Mo mélangés à I volume de solution de Fe. I a solution de Mo est une solution de Molyhdutc à 0,012M et la solution de I'e est une solution de 1er i l à O. ?SM.
Pour le calcul de l'activité une gamme étalon de phosphate a élé réalisée à partir d'une gamme de KM2PO4 allant de 0 à I O μmol/ml. F.n utilisant les conditions réactionnclles décrites ci-dessus, l'activité phytase des échantillons à lester a été calculée en appliquant la formule suivante : Activité phytase en U/ml r |{ I)O o20 ntn) x (facteur de dilution)) ' [(pente gamme étalon) x {temps de réaction en miπutes)|.
I .e cakul des concentrations en protéines a élé déterminé selon la méthode classique de lîradford bien connu de l'homme du métier. 36
La figure 7 montre des niveaux d'activités relatifs en fonction du temps (O à 15 minutes) supérieurs pour les mutants PHY-98-4X et PI IY-98-6X comparativement à l'enzyme d'origine PHY-98 dans Sacchurυmyces cerevisiue. F.xeπψie 5 : Caractérisation de Ia thermostabilitc des variants améliorés de la phytase de Yersiiriu intermedia i .a thermostabiiité des variants isolés de la phyiasc de Ycrsima Inwrnnulia a été détemiinée en mesurant une activité résiduelle des différents surnageants de production des variants soit après un préehaυffage à une température constante pendant des temps variables, soit après un temps fixe de préch.mJ'fage à des températures variables, Dans le premier ca.s. les variants sont préchauffés à 80 C pendant des temps allant de 0 à 30 minutes. Dans le second cas. deux ivpes d'activité résiduelle des variants ont été mesurés, soit après un préehauflage de 15 minutes à des températures allant de 4$'JC. ù 6v!(\ soit après un préchau liage de I minute à des températures allant de <)()"(.' à 800C. Les activités résiduelles ont clé déterminées dans le premier cas en % de l'activité du même échantillon siiπs préchauiïage ou dans le second cas en % de l'activité du même échantillon préchauffe à lu première te-mpératiirc mesurée, les deux activités références étant considérées comme les points 100%. I 'activité résiduelle est montrée en valeurs brutes de Densité Optique Ï'I 600 nm après un préchauffage de 15 minutes dans la figure 4,
Les figures 3, 4 et 5 présentent des résultats obtenus pour les varimils PHY-1JJMX et PHY- *)8-f»X exprimés par Sarcharoinyics ccrevisiue par rapport à l'enzyme d'origine Pi iY-08. La figure 3 montre les activités résiduelles .supérieures des deux mutants PHY-4)8-4X et Pl IY-Wi-GX après un prëchaulïnge de 0 à 2 minutes à 80°C par rapport à l'enzyme d'origine PHY-V8. La figure 4 montre les activités résiduelles supérieures îles deux mutants PHY-υ8-4X et PHY-'JS-oX après 15 minutes de préehauflage à des tempéra! lires variables allant de 45'1C à b5'X\ La ligure 5 montre les activités résiduelles supérieures des deux mutants PHY-98-4X et PHY-M-ήX au delà de 6OT en utilisant I minute de préehaulfage.
Les figures 6a) et 6b) munirent le;» activ ités résiduelles supérieures des mutants PI IY-98- 6X LM PH Y-y8-6X-SS l I . exprimés par Pichia pusloris. après des temps de preehauffuye à SO1C de respectivement 0 à M) minutes et 0 à 5 minmes. Exemple 6 : f hermosiabilitέ des mutants dans des essais de granulation
Des tests de granulation peuvent être menus pour déterminer la thermostabiliié des différents mutants par rapport à l'enzyme sauvage et des enzymes existantes et/ou commerciales, i. es différentes phytases peuvent être incorporées dans les procédés de formation et de formulation de granulés destinés à cire ajoutés à l'alimentation animale, par exemple.
("es granulés peuv ent être formés en mixani/pétrissant dans les mêmes conditions des surnageants de production des mutants et enzymes réfèrentes devant être comparées, avec, par exemple, une matrice composée d'amidon de mais et d'eau. La matrice de granulation peut contenu' des pourcentages relatifs phytase-'πuiïs/cau différents. Classiquement, après pétrissage, la matrice peut être extrudée avec une extrudeuse semblable au type MCA™ H-
220 et directement sphéronisee à partir d'un sphéroniseur NICΛ™ nu de type Fuji l'audal IM QJ-IWf'- Les particules obtenues sont ensuite séchc'ϋs sur un sécheur à 1:1 Jluidisé du I) pe Olatt (il'CCî 1.1. t. 'activité phytasc dans les granulés est généralement comprise entre 2500 et 3000 I 1 1 -:/g.
Les granulés formés peuvent être mélangés à la nourriture. Selon !" importance en volume des tests, la quant ilé de nourriture formée peut être variable. Par exemple. 250 g de granules peuvent être mélangés avec 25 kg de nourriture pour former un prόmclange. Ce préπtélangc peut être incorporé juste avant le test à 225 kg de nourriture, par exemple, de la même composition. De façon non limitative, une nourriture pour volaille typique peut être composée en pourcentage de 45 a 50% de maïs. 0 à 5% de pois. 0 à 4.50O de farine de eol/a. 0 à 4.5% de farine de graines de tournesol, 0 à 2.5% de gluten de fleur de maïs. 6 à
10% de fèves de soja entières, environ 25% de tourteau de soja, environ 4% de tapioca. 1 a 3.5% d'huile de soja, 0 à 4% de graisse animale, 0.5 à \% d'un cocktail de vitamines
{ Viervit 100). environ I 1Jo de calcaire en poudre. 0.2 à 1.3% de phosphate mυnoealeique.
0.1 à 0.4?O de seis. 0 à 0.3% do bicarbonate de sodium (NaI K-O1), 0.05 à 0.3% de L- l.ysinc. 0.15 à 0.25% de DL-Méthionine el 0 à 0.05% de L- l hréonine. Le prémélaniic de l'ordre de 25 kg est typiquement mélangeahle dans un mélangeur planétaire type Colleté Ml"»() pendant 10 minutes, i .- mélange de l'ordre de 225 kg peut être mélangé dans un mélangeur du type Nauta 1200 Litres. Des échantillons de ce mélange sont prélevés à ce stade pour déterminer l'activité et la stabilité des mutants et des phytases de référence avant la formation des granulés finaux. Le mélange de l'ordre de 250 kg est typiquement dosé dans un mélangeur/conditionneur par une v is de dosage à une \ iiesse d'environ (>0U 3X kg /h. où il est chauffé par injection de vapeur jusqu'à environ 95°C. Le temps de résidence total est d'environ IO à 30 secondes après quoi le mélange chaud est dirigé vers une presse à granulation. Pour les lests, les tailles de granules pouvant être fabriqués sont du type 5/45 mm (largeur/ longueur) ou 3/65 mm. La température des granulés à la sortie de la presse est typiquement de 82 a 83°C pour le premier type de granulés et 91 à 93 "C pour le second type. Λ la suite de cette étape, les granules sont refroidis sur un tapis de refroidissement où des échantillons sont récupérés pour déterminer l'activité et la stabilité des mutants et des phytases de référence après !a formai ion des granulés finaux. Des rendements de granulation en terme d'activité peuvent ainsi être obtenus pour chaque mutant, comparativement aux en/ymes de référence, en faisant les rapports d'activité après et avant l'étape de granulation. Un protocole de mesure de l'activité phytase est donné dans i'exemple 4. également, un protocole standard de mesure de Taetivité phytase adapté à ces procédés est publié sous la référence : van.hngelen et al.. Journal oi" ΛOΛC International 1994. 77 : 760-764.
Exemple 7 : Tests dans des essais d'alimentation animale
Plusieurs approches peuvent être utilisées pour mesurer l'efficacité des mutants de rinveπtioπ à libérer le phosphate du phytate in vim afin de contribuer à la croissance des animaux, comparativement à des phytases rélérentes.
Différents animaux tels que des pores peuvent être intégrés dans des protocoles bien établis. Ceux-ci ont un accès libre à de Peau et à un régime typique constitué par exemple de 67% de maïs. 28% de farine de soja. 1% de calcaire en poudre. 0, 1 % L-I ysine, 1% d'huile de maïs, 0.25% de cocktail vitaminé classiquement utilisé, 0,5% de sels. 0.5% d'antibiotiques. Les déchets de nourriture sont collectés quotidiennement. La prise de poids des animaux est mesurée hebdomadairement pour calculer le gain moyen par jour, la prise de nourriture moyenne quotidienne et le rapport gain/prise. Les mutants présentant un iniérC'l particulier et les meilleurs performances sont typiquement ceux qui présentent un rapport gain/prise accru.
roulement des modèles in \iιm existent qui permettent de simuler la digestion dans le tract us d'un animal monogastrique. Par exemple des échantillons de nourriture composés de .U)" » de farine de soja et 70"« de farine de maïs peuvent être supplëmeπlés avec du calcium de phniphate à un taux de 5 μ-kg de nourriture et préincubé^ à 40"(Λ pi I 3 pendant 30 minutes, suivi d'une addition de pepsine à 3000 U/g de nourriture et différents dosages 39
de phylase compris entre O (blanc témoin) et 1 i τ phytase/g de nourriture. Dilïύrcnis mutants de phytase peuvent être testés comparativement à des phytases rét'érentes. Les différents échantillons sont incubés à 4O0C. d'abord à pH 3 pendant 60 minutes puis à pi] 4 pendant 30 minutes. Les réactions sont alors stoppées et le phytate et les innsilol phosphate sont extraits par addition d'acide chlorhydrique à une concentration finale de 0,5M, une incubation pendant 2 heures à 40"C. suivi d'un cycle de congélation-décongélation et d'une heure d'incubation à 400C.
Le phytaie et les inositυl phosphates sont séparés par chromalographie éehangeuse d'ions à haute performance ici que décrit dans Chen. Q.C. and Li. BΛV. (2003) et journal of Chromatography Λ K)18. 41-52 ainsi que dans Skoglund. 1-.. Carlson. N.(i. and Snndherg, Λ.S. < J *W7) ci J. Λgric. I-ood Chem. 45. 431 -436. Le phosphate rclaημic est calculé comme la différence entre le phosphate lié aux inositol phosphates dans des échantillons traités avec une phytase comparativement à des échantillons non traités avec une phj lasc. Les mutants intéressants rchirgucnt une plus grande quantité de phosphate.
Dépôt de matériel biologique :
l rois souches bactériennes contenant les constructions P) IY-1W, PMY-98-6X et PHY-Og. όX-SSI l utilisées dans les exemples précédents ont été déposées et acceptées par la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur. 25. Rue du Docteur Rou\. 75724 Paris Cedex hance, selon les termes du Traité de Budapest :
Références d'identilicaiion ! Dates de dépôt j Numéros d'enregistrement des i des souches déposées j ' matériels biologiques reçus
PIlY-OS j 24 juin 2009 CNCM 1-4172
PHY-««-ftX ! 24 juin 2000 CNCM Wl 71
]»l IY-*»8-6X-SS 1 1 24 juin 2000 CNCM 1-4174 -IO
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FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 43
TABLEAU 1
Figure imgf000045_0001
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 44
ΓΛBU-AIJ :
Figure imgf000046_0001
45
TABLEAU 3
SER20 GLY339
VAL24 GLY56
SER26 TRP45
GLN30 MET34
LEU52 LEU99
THR53 GLY56
ALA57 ALAl 03
GLYlOl VAL116
ALAl 47 TYR268
ASPl 93 ASNl 96
GLY274 ASN316
Figure imgf000047_0001
GLY322 ASP388
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 46
TABLEAU 4
Tableau 4A
Figure imgf000048_0001
Tableau 4B
Figure imgf000048_0002
Tableau 4C
Figure imgf000048_0003
Tableau 4D
Figure imgf000048_0004
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 47
IABLEAl! 5
Tableau 5A
Figure imgf000049_0001
Tableau 5Ii
Figure imgf000049_0002
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Claims

48 Revendications : 1- Variant améliore d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en P3. V4, Λ5, P8, T9. (JlO. V 16. V 17.1,19. S20,R21.1122. O23. V24. R25, S26. P27. T28. K29, Q30, Hl. Q32. L33. M34. D3b. P39.K41, W45, Λ49. (i5(). Y51.1.52. T53. G56. Λ57. V60. Y67. «75. Λ78. CHl. D92, V93.WA. Q95. R96. T97. R98.1.99. TlOO. GlOl, A 103. Vl 16, V 125. D 126. F 129.11130.P131. V132. DI33. U 140, I 142. Q143 - 11145. Λ147, 1.152, P155, Ll 56, 1-158.1-158 ' S 160, M 67. Λ177, C182. G189. Dl 93. N1196. Fl 97, K20I. K20(>.1*207. T209. K210.V2I1, S212, 1.213.1.217. Λ218.1.219, S220. S221.1222, 1.223. CJ224. f-225, 1226.1-127.[.228.1.229. Q230. N231. Q233, Λ234. {'236. R242.1250, S251.1.252, L,253.1.255, 11256.N257. Q259. F260. |>261. M263, A264, Y268, K273. Ci274, [»276, L277. Q292. G293.P297. P300. Q30I. Ci3O8. G309.11310, D31I. T312. N3I3.1314. A315. N316, G322. Λ32.λ Q32ft.1*331, D332. N333, T334, P335. P336, G337. CÏ338, 0339. V341, 1:343.1)349. Q352. R353. Y354, 1355, Λ370. K371. K376. P379. Λ380. G38I. D388.1:391.S39^. G394. cl P414, les positions étant indiquées dans SHQ 11) N'M . 2- Vnriani amélioré d'une phytnse dont la séquence est ShQ ID N"l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon la revendication 1. caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en P3I . P3V, V4G. A5P, P8N.P8V. T9|, T9Q. I"9S. P9Y. Gl 0Λ. GlOP. VI6M. V17W, LÎ9CÏ. S20C. R2M-". II21Λ. i 122S. I I22Y. G23S. V24t:. R25C. S26C. P27F. I28N.128S. T28V. K29N, Q3()C. Q30I).Q30R. Q32R. I.33R. M34C'. D36N, P39N. K41G. W45C". O50IX CiSOl:. Y5K». Y51N. Y51Q. Y51W.1.52C. I.52G. T53C. G56C'. Λ57C. V60I. Y67F, Y67W. G75R, Λ78P.L1SlN. D92R. V93G. D94G. D94S, O95N. Q95V. R96Λ. IWN. RMHN. R98T.1.99C".(UOIC. Λ103C. V1I6C. VI25N. D126Q. F 129 W. Hl 30N. 11130Q. Hl 30R. Il 130W,II 130Y. P131S. V132W. Dl 3.Ui, D133P. D133R. D133V. Dl 33 W. D140H. D140F.DI40N. T142N. Q143N i H145T. Λ147C, 1.152N. 1.1521». PI55N. P155T. I.I56N, I-158N. M158N • S160T. F167N. Λ177N. Λ177S. Λ177T. CI82N. <.il8ι>N. DI93C.N196C. Fl 97V. K20IN. K206Λ, P2O7N, P2O7S, P2O71. T2091'. K210C. K2I0I-.. K210N.K210S. K210T. K210V. K210Y. V2I1C, V21IG. S212N. L217N, Λ218N. 1.219V.S220N, I 22"S, 1-225D. F227S. L2291I. Q23ON. Q230T. N23IK. Q233S. Q233T. Λ234K. 49 P236N. R242N.1250S. I250T. S25IN, L252M. I.2S51\ H256Λ. II256K. II256P. N257I.Q259K. O259S, Q259T. Q250Y. 1)261 F. M263L. Λ264N. Λ264P. Y268C, Y268K.Y268N. K273N. G274C. G274S, P276L. Q292P. G293N, P297N. P297S. P300N. Q301L.G3O8S, 1131 ON.1131OR, D311 Λ.1)3 ! I K.1)31 IG. T312D, T312N. T312P, 1312V. N313F. N313R.1314M.1314M. N316C. G322C, Λ323 K. Q326S. Q326T. P331 R. D332Λ.1)3321.,D332N. D332Q. N333V. P335C. P335G. P335R. P335S, P335T, G339C. V341Λ. V341I-,[:343Λ. K343G. D349N. D349S, D349T. Q352S. Q352T. R353C. Y354N. I355W. Λ37OD.Λ37OT. I-371S. U371Ï. K37ήS, P379!.. P379S, P37<>T, Λ38OS. Λ380T. U381S. D388C.Ii3«)lN. S393C/.031MS- CÏ394T, et P4I4Q. les positions éuint indiquées dans SI-Q II") N0I. 3- Variant amélioré d'une phytasc dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon la revendication 2. caraeîérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en FHN. P8V, T9I, 19S- GI0Λ,CUOP. V16M. Vi7W. S20C. G23S. V24C S26C". P27F. T28N. T28S. K2'JN. Q3(K.:, Q301). Q30R. O32R. I33K. M34C\ 1)36N, P39N. K4IG. W451*. G50I.X CiSOE. Y5HKY5IN. Y51Q. Y.S1W. I.52C. L52G. T53C. GShC. Λ57C. VoOl. Y671-". (i75R. Λ78P. C81N. V93(i. Q<)5N. I07N. R98N. IW81". I.WC CiH)IC, ΛH>3CΛ V116C. FI29W. M 130N. I It 30Q. Hl 30R, H130Y. P131S. V132W, D133G. I) 140F. D14UN. FI42N. QI43N H H145T. ΛI47C. LI52N. I.I52P, P155N. P155T. I.I56N, 1-!158N. UI58N ' S 160T. F167K. Λ177N. Λ177S. Λ177S t- Q326S. ΛI77S * Q326T. AI 77 T, CIS2N. (Ï189N. DI93C. N196C*. FI97V, O)IN.0.)oΛ. P2O7N, P207S. P207T. K.2I0N. K2HJS, K2I0T. K2I0Y, V21 IG. S212N. I.217N. Λ2I8N. L21«>V. S220N, L.223S.1,22911. Q230N. N23IK. Q233S. Q233T. Λ234K. P236N. R242N. I250S, I250T, S251N, I.252M.1.255 T. II256R. N257I. Q259S, Q25*r\\ M263I.. Λ264N, Λ264P. Y268C. Y268L. Y268N. <iJ74C, Q292P. G293N. P297N. P297S. KM)ONi. Q301L. G3O8S. II3I0N. 13121). F3I2N. I314I-. I314M. N316C1. G322C. Λ323I-.. Q326S. Q326T. P331R. D332Λ. D332I . D332N. D332Q. P335C. P335S. P335T. (i339f. V34IF!.1-343Λ. I-343G. I)34«*N. D349S, D349T. Q352S. Q352T. Λ370D. I-37IS.1-371 T. K376S, P379L. P379S. P379T. Λ38OS. Λ.Ï80I1. G38IS. I.)388C\ 1-39! N. S393G, (i»4S. G394T. et P414Q. les positions étant indiquées dans SL-Q IDN" 1. 4- Variant amélioré d'une phylase dont la séquence est SF-Q Ii) N "1 ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon la rcvendiciition 1. caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en K2ι>. Q3(>. Y51.1.52. 50 G75. CHI, V93. Q95. R98.1.99.1-129. ni 30. 1)140, 1142. PI55. Fl 67. ΛÎ77. G189. K201. K210.1.219, 1250. S251.1,252.1.255. M263. Y268, G274. Q292, G293. P297. «308. N316. Q326. D349. et R391, les positions clam indiquées dans SF.Q ID N°l . 5- Variant amélioré d'une phytase dont !a séquence est SFQ II) N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon la revendication 4, caractérisé en ce que les substitutions sur les acides aminés K29. Q30. Y5I.1.52. «75. CSl. V93. Q95. R98.1.99.1-129. III 30.D 140. I-Il 4ON. T142.1*155. H 67. Λ177. G 189. K20I. K2I0, L219.1250. S251.1.252.
1.255, M2ft3, Y268. «274. Q292. G293. P297. «308. N316. Q326. D349. et 1-.J9I. sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K29N. Q30D, Y5lϋ, Y51N. Y5!Q. YSl W.
1.52C. L52«. CJ75R. ('8IN. V93(i, Q95N, R98T. L99C. R29W. LII30Y.1)1401-'. I) 140N.
II42N. IM55N. PI55T. K167N. Λ177N. Λ177S. ΛI77T. GJS1JN, K201 N. K210N, K2I0S.
1.2I1JV.1250S.1250T. S251N, 1.252M.1.255T. M263I., Y268I:. Y268N, (Ï274C, Q292P.
G293N.1»297N. (J3O8S. N316C1. Q32bS, Q326T. D349S, D349T. et 1-.391N. les positions étant indiquées dans Sl-Q ID Nu i . h- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1-5. caractérise en ce qu'il comprend une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en G27K1 < N3I0C. I I42N - ΛI77T t- Q326T. K210S - Y268I- < Q292P.1)140F t- Y2681- H Q292P. I-167N + Y 268 K »- Q292P, H42N * Λ177T - K210S t Q326T. TI42N • Λ177T• K210S « Y268H >- Q292P -i Q326T. TI42N *- AI77T t- K2I0S «- Y2681: i O292P• Q326T « CÎ274C * N3I6C.1.52C + I.99C >- T142N f A177T ι K210S » Y2681- t Q2')2P - Q326 f . les positions élant indiquées dans SIiQ (D N" I .
7- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est Sl-Q il) VI ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1-fi. caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de substitutions consistant en TI42N r ΛI77T < K210S i- Y26S1-: i ti274C - Q292P t N31&C : Q326T. les positions élant indiquées dans Sl-Q ID NM.
S- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SF.Q ID N"l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1-7, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N f Λ 177T + K2 I 0S l Y268E + Q292P i- Q326T. les positions étant indiquées dans SHQ ID N1M .
9- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon l'une des revendications 1 à 8. caractérisé en ce que sa séquence est SIiQ ID N1M a\ec la ou les substitutions sélectionnées.
10- Λcidc nucléique codant un variant amélioré d'une phytase selon Tune quelconque des revendications 1 -ι).
1 !- Cassette ou vecteur d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 10.
12- Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication K) ou un vecteur d'expression selon la revendication 1 1.
1 3- Composition comprenant au moins un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est Sl-Q ïf> N0 I ou un dérhé fonctionnel de celui-ci .selon l'une des revendications ! à 9 a\ cc la ou les substitutions sélectionnées. 14- Utilisation d'un variant amélioré d'un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est Sl-'Q ID N0I ou un dérivé fonctionnel de celui-ci selon l'une des revendications I à 9 avec la ou les substitutions sélectionnées, pour la préparation d'un additii'alimeniairc. 1 > I tilisation d'un acide nucléique scion la revendication 10. une cassette d'expression selon la revendication 1 1 , ou d'une cellule selon la revendication 12 pour produire un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N0 I ou un dérivé Ionctionnel de celui-ci selon l'une des revendications 1 à 9 avec la ou les substitutions sélectionnées.
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