FR2947563A1

FR2947563A1 - Variants ameliores d'une phytase

Info

Publication number: FR2947563A1
Application number: FR0954490A
Authority: FR
Inventors: Stephane Blesa; Helene Chautard; Marc Delcourt; Laurent Mesta; Bruno Winter
Original assignee: Biomethodes SA
Current assignee: Biomethodes SA
Priority date: 2009-07-01
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2011-01-07
Anticipated expiration: 2029-07-01
Also published as: US9109210B2; EP2449100A2; CA2766704C; FR2947563B1; WO2011000933A2; CA2766704A1; CN102597227A; WO2011000933A3; US20130122567A1; CN102597227B; HK1173185A1

Abstract

La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines et en particulier celui des protéines améliorées par évolution moléculaire. Elle porte sur un variant d'une phytase, dit amélioré, en ce qu'il présente une thermostabilité et/ou une activité supérieures à la phytase d'origine. L'invention porte également sur un acide nucléique codant pour ce variant, une cassette ou un vecteur d'expression contenant ce variant, une cellule hôte exprimant ce variant, une composition comprenant ce variant ainsi que les utilisations de ceux-ci, principalement dans la préparation d'additifs alimentaires et l'alimentation animale.

Description

Variants améliorés d'une phytase

Le phytate est le principal composé de stockage du phosphore chez la plante. Cette molécule, aussi nommée acide phytique ou inositol-hexa-phosphate (InsP6 ou myo-inositol hexakisphosphate), consiste en un cyclo-hexane sur lequel sont branchés six groupements phosphates. Le phytate représente environ 70% du phosphate végétal, les 30% restants étant présents sous forme libre. Par ailleurs, les résidus phosphate du phytate chélatent les cations divalents et trivalents tels que les ions métalliques calcium, fer, zinc, magnésium, cuivre, manganèse et molybdène essentiels à la nutrition.

Les phytases sont des enzymes qui hydrolysent le phytate : ces enzymes libèrent naturellement un ou deux phosphates, rarement trois, alors adsorbables dans le système digestif; les autres produits de la réaction étant rarement de l'inositol-tri-phosphate, principalement de l'inositol tétra- et penta-phosphate (Figure 1). Les phytases constituent une famille d'enzymes largement représentées dans la nature : de très nombreux organismes, de la bactérie à la plante en passant par les champignons et certains animaux, en expriment une ou plusieurs. Les mammifères, cependant, n'en expriment aucune ; les ruminants ou les animaux polygastriques tels que vaches et chevaux possèdent des microorganismes endogènes propres à leur tractus gastrointestinal qui peuvent dégrader le phytate, ce qui n'est pas le cas des animaux monogastriques tels que porcs et volailles principalement, pour qui le phytate provenant des plantes ingérées ne représente donc pas une source utilisable de phosphore. Il est donc nécessaire d'ajouter des phosphates libres à leur alimentation. Cependant, une partie de ces phosphates libres ajoutés, et l'essentiel du phytate ingéré par les animaux sont rejetés dans l'environnement. Le phytate est alors 1 dégradé par les bactéries du sol et se retrouve, au final, dans les nappes phréatiques et les rivières sous forme de phosphate libre. Dans les régions à forte concentration d'élevage, ces rejets agro-industriels de phosphates, sous forme libre ou sous forme de phytate représentent une pollution importante, qui se traduit notamment par la prolifération d'algues vertes au niveau des rivières et des fleuves. Outre l'aspect esthétique, ces algues ont un fort impact écologique car elles entrent en compétition avec les espèces végétales locales notamment au niveau de la consommation de l'oxygène dissous. Une manière pour permettre que le phosphate stocké sous forme de phytate soit utilisable comme source de phosphate par les mammifères est l'introduction de phytase exogène dans les aliments. L'ajout de cette enzyme représente ainsi une alternative à l'utilisation de phosphate inorganique comme complément alimentaire. Par ailleurs, en rendant le phosphate du phytate accessible, elles permettent également une meilleure accessibilité aux ions métalliques chélatés sur le phosphate du phytate, ainsi qu'aux protéines liées au phytate, les rendant nutritionnellement disponibles. Des phytases sont aujourd'hui utilisées de façon relativement systématique dans l'alimentation animale. Elles permettent de remplacer partiellement les phosphates et rendent également plus accessibles les protéines, les acides aminés, et le calcium.

Il existe cependant plusieurs limitations à l'utilisation des phytases dans l'alimentation 20 animale : - L'efficacité insuffisante des phytases à libérer les phosphates constitue une première limitation. Des phosphates sont toujours ajoutés à l'alimentation des animaux même en présence de phytases exogènes. Pourtant, si tout le phytate était converti en phosphates libres, aucune supplémentation ne serait plus nécessaire ; il 25 existe donc un réel besoin à proposer des phytases plus actives. - La plupart des enzymes actuellement utilisées ne peuvent pas être ajoutées directement aux aliments, parce qu'elle ne résistent pas au procédé de granulation, qui implique le chauffage à 95°C des aliments pendant 90 secondes. Les enzymes sont donc sprayées sur les aliments après l'étape de granulation, ce qui représente 30 un coût supplémentaire et constitue une seconde limitation ; il existe donc une forte demande à posséder des phytases plus thermostables.

L'objectif de la présente invention est de dépasser les limites actuelles en générant une phytase suffisamment active pour impacter sensiblement le besoin de supplémentation en phosphates, et suffisamment thermostable pour pouvoir être ajoutée directement à l'alimentation des animaux, sans avoir à utiliser de technique de sprayage.

Nombreuses sont les phytases qui ont fait l'objet de publications et de demandes de brevets, voire qui ont déjà été utilisées dans des applications agro-industrielles. Aucune n'a cependant permis de s'affranchir du besoin de supplémentation en phosphates dans l'alimentation d'animaux d'élevage et n'est suffisamment thermostable pour être ajoutée directement à l'alimentation des animaux, sans avoir à utiliser une technique de sprayage.

La plupart des publications se rapportent aux phytases d'Aspergillus niger et d'Escherichia coli. D'autres phytases d'origine microbienne ou provenant de plantes ont également été étudiées avec comme problématique d'obtenir des phytases thermostables possédant une activité spécifique supérieure à celles d'Aspergillus niger (250 U.mg -1). Les phytases décrites dans la littérature et les demandes de brevet proviennent de champignons (basidiomycètes et ascomycètes), de levures et de bactéries.

Les phytases isolées de champignons sont nombreuses et proviennent majoritairement de la famille Aspergillus mais également d'Absidia, Acrophialophora, Agrocybe, Calcarisporiella, Cheatomium, Corynascus, Mucor, Mycelia, Myriococcum, Penicillium, Peniophora, Rhizomucor, Rhizopus ou encore Trametes, Sporotrichum, Neurospora, Trichoderma, Cladosporium, Myceliophthora, Taleromyces, Thielavia, Humicola, Paxillus, Thermoascus. De nombreuses informations sont disponibles sur les activités spécifiques et Km de ces enzymes telles que dans Wyss et al 1999 (Appl Environ Microbiol 65 (2) 367-373).

Globalement, les phytases d'Aspergillus se caractérisent par des Km élevés variant de 5 à 20 M, une température optimale de 57°C et un pH optimal de 5,5 excepté pour Aspergillus fumigatus (pH opt. = 6) mais des activités spécifiques très faibles allant de 100 à 250 U.mg-1. Certaines phytases provenant d'autres champignons ont montré des propriétés intéressantes notamment des activités spécifiques élevées telles que la phytase de Trametes pubescens ou la phytase de Peniophora lycii (respectivement 1200 U. mg-1 et 1080 U.mg-1 dans WO 98/28408). Cladosporium sp. montre une phytase intéressante possédant une activité spécifique de 900 U.mg-1 et un Km de 15,2 M mais une température optimale basse à 40°C. Egalement, la 6-phytase de Ceriporia sp. présente une activité spécifique de 11040 U.mg-1. Plusieurs données complémentaires ont été publiées par Lassen et al, 2001 (Appl Environ Microbiol 67 (10) 4701-4707 comparant la thermostabilité de phytases de basidiomycètes notamment Peniophora lycii, Ceriporia sp., Trametes pubescens et Aspergillus piger ; il ressort que ces enzymes présentent des Tm (température à laquelle l'enzyme est active à 50%) assez proches allant de 55°C (Trametes pubescens) à 60°C (Peniophora lycii) mais des activités résiduelles (pourcentages d'activité résultant d'une préincubation de 60 minutes à 80°C dans du sodium acétate [0,1M], pH 5,5) très variables allant de 15% (Trametes pubescens) à 62% (Peniophora Lycii). De nombreuses sociétés ont déposé des demandes de brevet sur ces enzymes notamment Danisco/Genencor (W02001012792, Penicillium subtilis ; WO2003038035, Trichoderma reesei ; W 0 2 0 0 3 0 3 81 1 1, Penicillium, Mumicola, Emericella, Fusarium ABEnzymes/ROAL (EP0659215, phytases d'Aspergillus produites par Trichoderma reesei), DSM/Roche (EP684313, Apergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Talaromaces thermophilus), BASF (W02003102174, Aspergillus), Adisseo (W02003054199, Penicillium), Choongang Biotech Ltd. (W02005056835, Penicillium oxalicum).

Parmi les phytases bactériennes, plusieurs ont été décrites provenant de Bacillus subtilis (Paver and Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151:1102-1108), Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23:1207-1220), et Klebsiella. Plusieurs phytases provenant d'E. coli ont été rapportées dans la littérature. Greiner et al, dans Arch. Biochem. Biophys., 303, 107-113, 1993, ont purifié et caractérisé une nouvelle phytase d'E. coli ; d'autres ont été rapportées par Lim et al., 2000, Nat. Struct. Biol. 7: 108-113, Oshima et al., 1996, DNA Research, 3:137-155, Touati and Danchin, 1987, Biochimie, 69:215-221, Rodriguez et al., 2000, Arch. Biochem. Biophys, 382:105-112, Kretz, US patent 5,876,997 from E. coli B, and appA by Dassa et al., 1990, J. Bacteriol. 172:5497-5500. Des mutants de phytase d'E. coli ont été obtenus par génie génétique résultant en des thermostabilités et des activités spécifiques améliorées (Rodriguez et al., 2000, Arch.

Biochem. Biophys., 382:105-112, Lanahan et al., 2003, US patent application 20030157646). Cependant, aucune de ces mutations n'a permis une production suffisante de ces enzymes d'origine procaryote dans des organismes de production eucaryotes.

L'objectif de la présente invention est de fournir une enzyme recombinante qui soit adaptable aux procédés industriels permettant son utilisation comme additif alimentaire, principalement dans l'alimentation animale.

Dans la demande WO2002048332, Diversa a identifié, à partir d'un BLAST de génomes bactériens disponibles à la date de l'invention, en utilisant le gène appA d'E. coli, une nouvelle protéine de Yersinia pestis présentant une activité phytase. Cette protéine présente une particularité remarquable en ce qu'elle possède une activité spécifique de 4400 U/mg. Aucune autre caractéristique biochimique concernant cette protéine n'est précisé dans cette demande. Cette demande semblait montrer l'activité élevée potentielle de phytase provenant des bactéries de la famille Yersinia. Le 20 octobre 2005, la séquence protéique ayant pour référence ZP00832361, a été soumise à la base de données NCBI. Cette séquence est celle d'une protéine hypothétique de Yersinia intermedia ATCC 29909 dont la séquence nucléotidique correspondante est présentée sous la référence NZAALF01000052 région : 1889...3214. Cette séquence protéique a été obtenue par la traduction de la séquence nucléotidique correspondante provenant du séquençage complet du génome de la souche Yersinia intermedia ATCC 29909. Bien que le domaine PRK10172 semble prédire une activité phytase, aucun élément expérimental n'accompagne cette prédiction.

Celle-ci semble avoir été cependant confirmée par l'isolement d'une phytase très proche, d'une nouvelle souche de Yersinia intermedia provenant d'un prélèvement de sol d'un glacier, nommée H-27 et présentée dans la demande WO2007128160. La phytase issue de la souche H-27 est référencée dans la base de données NCBI sous le numéro d'entrée AB195370.1 pour la séquence nucléotidique et DQ986462 pour la séquence protéique; elle présente 98 % d'identité en acides aminés et 97% d'identité avec la séquence nucléotidique codante de la phytase hypothétique de Yersinia intermedia ATCC 29909. La phytase de la demande WO2007128160 présente une activité spécifique élevée supérieure à 3000 U/mg, du même ordre que l'activité spécifique enregistrée pour Yersinia pestis dans WO2002048332. Dans cette demande WO2007128160, les caractéristiques biochimiques intrinsèques de la protéine sont revendiquées à savoir un poids moléculaire de 45,5 kDa, un pH optimal de 4,0-5,0, une température optimale de 50-60°C, un pI théorique de 7,7, une activité spécifique supérieure à 3000 U/mg et une résistance élevée à la pepsine et à la trypsine.

La présente invention permet de dépasser les limites actuelles en proposant un variant amélioré par évolution moléculaire de la phytase de Yersinia intermedia. Par variant amélioré on entend un variant présentant une thermostabilité et / ou une activité supérieures à la phytase d'origine de Yersinia intermedia, lui permettant d'être utilisé dans des procédés industriels et en particulier comme additif alimentaire.

Comme il sera décrit dans la suite du texte et à l'aide des figures associées, la présente demande décrit un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en P3, V4, A5, P8, T9, G10, V16, V17, L19, S20, R21, H22, G23, V24, R25, S26, P27, T28, K29, Q30, T31, Q32, L33, M34, D36, P39, T41, W45, A49, G50, Y51, L52, T53, G56, A57, V60, Y67, G75, A78, C81, D92, V93, D94, Q95, R96, T97, R98, L99, T100, G101, A103, V116, V125, D126, F129, H130, P131, V132, D133, D140, T142, Q143 + H145, A147, L152, P155, L156, E158, E158 + S160, F167, A177, C182, G189, D193, N196, F197, K201, K206, P207, T209, K210, V211, S212, L213, L217, A218, L219, S220, S221, T222, L223, G224, E225, I226, F227, L228, L229, Q230, N231, Q233, A234, P236, R242, I250, S251, L252, L253, L255, H256, N257, Q259, F260, D261, M263, A264, Y268, K273, G274, P276, L277, Q292, G293, P297, P300, Q301, G308, G309, H310, D311, T312, N313, I314, A315, N316, G322, A323, Q326, P331, D332, N333, T334, P335, P336, G337, G338, G339, V341, E343, D349, Q352, R353, Y354, V355, A370, E371, K376, P379, A380, G381, D388, E391, S393, G394, et P414, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. De préférence, le variant amélioré de la phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en P3L, P3V, V4G, A5P, P8N, P8V, T9I, T9Q, T9S, T9Y, G1OA, G1OP, V16M, V17W, L19G, S20C, R21F, H22A, H22S, H22Y, G23S, V24C, R25C, S26C, P27F, T28N, T28S, T28V, K29N, Q30C, Q30D, Q30R, Q32R, L33R, M34C, D36N, P39N, T41G, W45C, G50D, G50E, Y51G, Y51N, Y51Q, Y51W, L52C, L52G, T53C, G56C, A57C, V60I, Y67F, Y67W, G75R, A78P, C81N, D92R, V93G, D94G, D94S, Q95N, Q95V, R96A, T97N, R98N, R98T, L99C, G101C, A103C, V116C, V125N, D126Q, F129W, H130N, H130Q, H130R, H130W, H130Y, P131S, V132W, D133G, D133P, D133R, D133V, D133W, D140E, D140F, D140N, T142N, Q143N + H145T, A147C, L152N, L152P, P155N, P155T, L156N, E158N, E158N + S160T, F167N, A177N, A177S, A177T, C182N, G189N, D193C, N196C, F197V, K201N, K206A, P207N, P207S, P207T, T209C, K210C, K210E, K210N, K210S, K210T, K210V, K210Y, V211 C, V211 G, S212N, L217N, A218N, L219V, S220N, L223S, E225D, F227S, L229H, Q230N, Q230T, N231K, Q233S, Q233T, A234K, P236N, R242N, I250S, I250T, S251N, L252M, L255T, H256A, H256E, H256P, N257I, Q259K, Q259S, Q259T, Q259Y, D261F, M263L, A264N, A264P, Y268C, Y268E, Y268N, K273N, G274C, G274S, P276L, Q292P, G293N, P297N, P297S, P300N, Q301L, G308S, H310N, H310R, D311A, D311E, D311G, T312D, T312N, T312P, T312V, N313F, N313R, I314E, I314M, N316C, G322C, A323E, Q326S, Q326T, P331R, D332A, D332L, D332N, D332Q, N333V, P335C, P335G, P335R, P335S, P335T, G339C, V341A, V341E, E343A, E343G, D349N, D349S, D349T, Q352S, Q352T, R353C, Y354N, V355W, A370D, A370T, E371S, E371T, K376S, P379L, P379S, P379T, A380S, A380T, G381S, D388C, E391N, S393G, G394S, G394T, et P414Q, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. De préférence, le variant amélioré de la phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au moins une combinaison de substitutions sélectionnées parmi les substitutions du groupe précédent.

SEQ ID N° 1 est la séquence figurant dans la base de données NCBI déposée le 20 octobre 2005 sous le numéro d'entrée ZP00832361, ne comprenant cependant pas la séquence signal de 23 acides aminés à l'extrémité 5' de la protéine. SEQ ID N° 1 correspond ainsi aux résidus 24-441 figurant dans le numéro d'entrée précédemment cité. SEQ ID N° 1 contient également la séquence nucléique codant pour la séquence protéique précédente, référencée sous le numéro NZAALF01000052 dans la base NCBI. Un acide nucléique codant pour un variant selon la présente invention peut facilement être préparé sur la base de cette séquence par les techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par mutagenèse dirigée du codon à modifier, pour obtenir la substitution d'acide aminé désirée.

Ainsi, la séquence du variant amélioré de la phytase selon la présente invention correspond à SEQ ID N° 1 incluant la ou les substitutions sélectionnées. SEQ ID N° 2 reprend uniquement la séquence protéique de SEQ ID N° 1.

Dans un mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention 30 comprend une unique substitution.

Dans un mode de réalisation préféré, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en K29, Q30, Y51, L52, G75, C81, V93, Q95, R98, L99, F129, H130, D140, T142, P155, F167, A177, G189, K201, K210, L219, 1250, S251, L252, L255, M263, Y268, G274, Q292, G293, P297, G308, N316, Q326, 1D349, et E391, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1. Dans un autre mode de réalisation préféré, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend des substitutions sur un des acides aminés du groupe consistant en K29, Q30, Y51, L52, G75, C81, V93, Q95, R98, L99, F129, H130, D140, T142, P155, F167, A177, G189, K201, K210, L219, 1250, S251, L252, L255, M263, Y268, G274, Q292, G293, P297, G308, N316, Q326, D349, et E391, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1._De préférence, les substitutions sur les acides aminés K29, Q30, Y51, L52, G75, C81, V93, Q95, R98, L99, F129, H130, D140, T142, P155, F167, A177, G189, K201, K210, L219, 1250, S251, L252, L255, M263, Y268, G274, Q292, G293, P297, G308, N316, Q326, D349, et E391, sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K29N, Q30D, Y51G, Y51N, Y51Q, Y51W, L52G, G75R, C81N, V93G, Q95N, R98T, L99C, F129W, H130Y, D140F, D140N, T142N, P155N, P155T, F167N, A177N, A177S, A177T, G189N, K201N, K210M K210S, L219V, 1250S,1250T, S251N, L252M, L255T, M263L, Y268N, G274C, Q292P, G293N, P297N, G308S, N316C, Q326S, Q326T, D349S, D349T, et E391N, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend des substitutions sur un des acides aminés du groupe consistant en K29, Q30, Y51, L52, G75, V93, R98, L99, F129, H130, D140, T142, P155, F167, A177, K201, K210, L219, S251, L252, L255, M263, Y268, G274, Q292, G293, G308, N316, Q326 et E391, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1. De préférence, les substitutions sur les acides aminés précédents sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K29N, Q30D, Y51G, Y51Q, Y51W, L52G, G75R, V93G, R98T, L99C, F129W, H130Y, D140F, T142N, P155T, F167N, A177N, A177S, A177T, K201N, K210S, L219V, S251N, L252M, L255T, M263L, Y268N, G274C, Q292P, G293N, G308S, N316C, Q326S, Q326T, et E391N, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en G274C + N316C, T142N + A177T + Q326T, K210S + Y268E + Q292P, D140F + Y268E + Q292P, F167N + Y268E + Q292P, T142N + A177T + K210S + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T + G274C + N316C, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un mode préféré de ce mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T + G274C + N316C, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N + A177T + K210S + Q326T, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en G274C + N316C, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N + A177T + Q326T, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en K210S + Y268E + Q292P, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en D140F + Y268E + Q292P. Dans un autre mode préféré de ce mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend une combinaison de substitutions consistant en F167N + Y268E + Q292P.

La présente invention concerne un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celle-ci comprenant la ou les substitutions sélectionnées.

La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la présente invention, et un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné de préférence parmi un plasmide, un phage, un phagemide et un vecteur viral.

La présente invention concerne également une composition comprenant au moins un variant amélioré de la phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci avec la ou les substitutions sélectionnées selon la présente invention. Elle concerne également tout mélange solide, liquide ou gazeux comprenant un certain pourcentage d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention. Elle concerne également les mélanges contenant un, deux, trois, quatre, cinq ou dix variants améliorés de la phytase selon la présente invention ou des dérivés fonctionnels de ceux-ci.

La présente invention concerne également des préparations ou compositions de phytase contenant un certain pourcentage d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci et une ou plusieurs autres enzymes ayant des propriétés avantageuses.

La présente invention concerne l'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, pour la préparation d'additif alimentaire. L'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci concerne les procédés industriels qui permettent la libération des minéraux et en particulier du phosphate des plantes, soit in vitro dans le cas de traitement des aliments avant leur ingestion par le variant amélioré de la phytase selon la présente invention, soit in vivo par administration dudit variant directement aux animaux avant ou avec leur alimentation.

La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur codant et / ou contenant au moins un variant amélioré de la phytase dont la séquence est SEQ ID N°l ou un dérivé fonctionnel de celui-ci avec la ou les substitutions sélectionnées selon la présente invention, pour transformer ou transfecter une cellule hôte. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci. La présente invention concerne également l'utilisation d'un tel acide nucléique, d'une telle cassette d'expression, d'un tel vecteur ou d'une telle cellule hôte pour produire un variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci. Elle concerne également une méthode de production d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule hôte par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention, la mise en culture de la cellule hôte transformée ou transfectée et la récolte du variant amélioré de la phytase ou un dérivé fonctionnel de celui-ci, produit par la cellule hôte. La cellule hôte peut-être procaryote ou eucaryote. Ainsi, la cellule hôte peut être un microorganisme, de préférence une bactérie, une levure ou un champignon. La cellule hôte peut également être une cellule de mammifère telle qu'une cellule COS7 ou CHO.

Par dérivé fonctionnel est entendu toute enzyme dérivée du variant de la phytase de la présente invention comprenant des modifications structurales tout en préservant une activité phytase. Ces modifications peuvent être, par exemple, un prolongement de l'enzyme par addition de nouveaux domaines, des substitutions partielles ou entières de domaines telles que des remplacements de stretches d'acides aminés par des acides aminés d'autres enzymes pouvant conférer d'autres fonctions/propriétés. Dans dérivé fonctionnel est également compris une forme dimérisée du variant de l'enzyme de la présente invention, homo- ou hétérodimérique, ou encore polymérique, présentant des propriétés améliorées, telle que la thermostabilité par exemple, de par la multiplication des domaines. Dans dérivé fonctionnel est également compris une forme chimérique du variant de la phytase de la présente invention, fusionné avec une autre protéine/enzyme d'intérêt ou avec un/des domaines de cet enzyme d'intérêt. Par dérivé fonctionnel est également entendu un fragment fonctionnel du variant de la phytase de la présente invention préservant l'activité de la phytase. Cette activité peut être mesurée selon l'un des protocoles décrits dans les exemples 4 et 5. Le fragment peut comprendre 250, 275, 300, 325, 350, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410 ou 415 acides aminés consécutifs de la phytase selon la présente invention. Ce fragment fonctionnel peut également être dimérisé ou polymérisé et/ou fusionné avec une autre protéine/enzyme d'intérêt ou avec un/des domaines de celle-ci.

Par variant ou mutant est entendu une séquence nucléotidique présentant des mutations par rapport à une séquence nucléotidique de référence. Ces mutations peuvent être silencieuses dues à la dégénérescence du code génétique ; dans ce cas la protéine codée par le variant est identique à la protéine codée par la séquence nucléotidique de référence. Ces mutations peuvent également engendrées des substitutions d'acides aminés dans la protéine codée par le variant par rapport à la protéine codée par la séquence nucléotidique de référence. Dans variant sont incluses les séquences contenant des mutations obtenues par mutagénèse dirigée. L'expression variant est attribuée aux séquences nucléotidiques ainsi qu'aux séquences protéiques codées par lesdites séquences nucléotidiques, présentant lesdites mutations.

Le variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci peut comprendre d'autres substitutions non décrites dans le groupe P3L, P3V, V4G, A5P, P8N, P8V, T9I, T9Q, T9S, T9Y, GlOA, GlOP, V16M, V17W, L19G, S20C, R21F, H22A, H22S, H22Y, G23S, V24C, R25C, S26C, P27F, T28N, T28S, T28V, K29N, Q30C, Q30D, Q30R, Q32R, L33R, M34C, D36N, P39N, T41G, W45C, G50D, G50E, Y51G, Y51N, Y51Q, Y51W, L52C, L52G, T53C, G56C, A57C, V601, Y67F, Y67W, G75R, A78P, C81N, D92R, V93G, D94G, D94S, Q95N, Q95V, R96A, T97N, R98N, R98T, L99C, G101C, A103C, V116C, V125N, D126Q, F129W, H130N, H130Q, H130R, H130W, H130Y, P131S, V132W, D133G, D133P, D133R, D133V, D133W, D140E, D140F, D140N, T142N, Q143N + H145T, A147C, L152N, L152P, P155N, P155T, L156N, E158N, E158N + S160T, F167N, A177N, A177S, A177T, C182N, G189N, D193C, N196C, F197V, K201N, K206A, P207N, P207S, P207T, T209C, K210C, K210E, K210N, K210S, K210T, K210V, K210Y, V211 C, V211 G, S212N, L217N, A218N, L219V, S220N, L223S, E225D, F227S, L229H, Q230N, Q230T, N231K, Q233S, Q233T, A234K, P236N, R242N, 1250S, 1250T, S251N, L252M, L255T, H256A, H256E, H256P, N2571, Q259K, Q259S, Q259T, Q259Y, D261F, M263L, A264N, A264P, Y268C, Y268E, Y268N, K273N, G274C, G274S, P276L, Q292P, G293N, P297N, P297S, P300N, Q301L, G308S, H310N, H310R, D311A, D311E, D311G, T312D, T312N, T312P, T312V, N313F, N313R, I314E, I314M, N316C, G322C, A323E, Q326S, Q326T, P331R, D332A, D332L, D332N, D332Q, N333V, P335C, P335G, P335R, P335S, P335T, G339C, V341A, V341E, E343A, E343G, D349N, D349S, D349T, Q352S, Q352T, R353C, Y354N, V355W, A370D, A370T, E371S, E371T, K376S, P379L, P379S, P379T, A380S, A380T, G381S, D388C, E391N, S393G, G394S, G394T, et P414Q, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1 ou des combinaisons de substitutions issues de ce groupe, comme mentionné précédemment. Par exemple, ces substitutions peuvent être des substitutions dites conservatives , c'est-à-dire des substitutions à l'intérieur d'un groupe d'acides aminés présentant des caractéristiques similaires ou équivalentes, tels que les acides aminés ayant un faible encombrement stérique, les acides aminés acides, basiques, polaires, hydrophobes et aromatiques selon le tableau ci-dessous : Faible encombrement Ala (A) Gly(G) Sér (S) Thr (T) stérique Acides Asp (D) Glu (G) Basiques Arg (R) His (H) Lys (K) Polaires Asn (N) Gln (Q) Hydrophobes Ile (I) Leu (L) Met (M) Val (V) Aromatiques Phe (F) Tyr (Y) Trp (W) Ainsi, par exemple, le variant amélioré de la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci peut comprendre des substitutions équivalentes à la substitution P276L décrite dans le groupe précédent, telles que les substitutions P276I, P276M ou P276V selon la classification du tableau précédent. Par ailleurs, le variant amélioré de la phytase selon la présente invention ou un dérivé fonctionnel de celui-ci peut comprendre d'autres mutations non décrites dans ce groupe, de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. Dans un mode de réalisation particulier, le variant amélioré de la phytase ou un dérivé fonctionnel de celui-ci comprend au maximum 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 substitutions ou 1 substitution par rapport à la phytase sauvage, notamment par rapport à SEQ ID N°1.

Par variant amélioré, on entend un variant présentant des propriétés améliorées et en particulier, une thermostabilité et/ou une activité spécifique et/ou une expression augmentée par rapport à la phytase parente. Egalement, le variant amélioré de la présente invention peut présenter une plus grande résistance à la protéolyse, par les protéases ou autre. L'augmentation d'une/des propriétés du variant amélioré de la phytase selon la présente invention est d'au moins 5 %, de préférence au moins 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ou d'un facteur 2, 5, 10 ou 100 par rapport aux propriétés de la phytase parente, mesurées dans les mêmes conditions expérimentales. Dans un mode de réalisation préféré, ces augmentations sont d'au moins 20 %. La thermostabilité de la phytase peut être mesurée en suivant les procédures détaillées dans l'exemple 5. L'activité spécifique de la phytase peut être mesurée en suivant les procédures détaillées dans l'exemple 4. L'expression de la phytase peut être mesurée en suivant les procédures détaillées dans les exemples 2 et 3.

La visualisation de structures modèles en 3D utilisant des logiciels tels que swiss-model (} _kt s _Ir_ _ __ ___ _ç11/) et spdbv v4.01 (GlaxoSmithKline) permet souvent de construire des hypothèses d'explications en rapport avec des modifications structurales d'enzymes entrainant des changements d'activité et/ou de propriétés, particulièrement en ce qui concerne les liens possibles entre des acides aminés adjacents. De telles visualisations permetttent également, dans une approche prédictive, de cibler certains résidus pour des expériences de mutagenèse. Par exemple, lorsqu'une amélioration de la thermostabilité est recherchée, les résidus ciblés peuvent être ceux qui permettent une rigidification de la structure secondaire. Une telle rigidification peut être obtenue de différentes manières ; par exemple, les résidus ciblés peuvent être substitués par un résidu proline qui, classiquement, génère peu de rotamères et par conséquent rigidifie la structure secondaire à laquelle il appartient. Egalement, une rigidification des structures secondaires peut être obtenue en générant de nouvelles liaisons hydrogène et de nouveaux ponts salins ; la visualisation de structures modèles en 3D permet de cibler les résidus permettant l'établissement de telles liaisons avec les résidus structuralement proches. Une autre approche que la visualisation de modèles en 3D permet, lorsqu'une amélioration de la thermostabilité et / ou de l'activité est recherchée, est la modification des charges portées par un résidu et les contraintes stériques qui en découlent. Il est connu que dans certains cas le substrat / produit d'une enzyme participe à la stabilisation de la conformation 3D de l'enzyme et peut conférer une thermostabilité accrue. Il est évident que la visualisation de telles structures modèles en 3D permet de cibler des résidus pour augmenter d'autres paramètres de l'enzyme présentant un intérêt industriel tels que l'activité, l'expression, ou la résistance à la protéolyse par exemple. Il est également évident que cette approche par visualisation de structures modèles en 3D est un outil prédictif permettant de construire des stratégies de mutagénèse sans aucunement garantir une quelconque amélioration de propriétés enzymatiques.

Par vecteur d'expression, il est entendu que le vecteur d'expression peut être n'importe quel type de vecteur (notamment, plasmide, virus, etc...) recombinant, permettant d'exprimer la séquence nucléotidique du variant amélioré de la présente invention. Le choix de ce vecteur d'expression dépend de sa compatibilité avec l'hôte d'expression ciblé, dans lequel il est transformé ou transfecté. Ce vecteur peut être linéaire ou circulaire fermé. Il peut se répliquer de façon autonome, c'est-à-dire être une entité extrachromosomique dont la réplication est indépendante du chromosome de l'hôte qui le contient, un plasmide, un élément extrachromosomal, un minichromosome ou un chromosome artificiel. A l'opposé, le vecteur peut, quand il est introduit dans la cellule hôte, s'intégrer dans le génome de l'hôte pour se répliquer en même temps que lui. Egalement, plusieurs vecteurs peuvent être nécessaires à l'expression du variant amélioré de la présente invention et peuvent être utilisés simultanément, ainsi qu'un transposon. Les vecteurs permettant l'expression du variant amélioré de la présente invention, peuvent contenir un ou plusieurs marqueurs qui permettent une sélection facile des cellules hôtes transformées ou transfectées. Ces marqueurs de sélection sont typiquement des gènes dont le produit confère un avantage à leur hôte et permet, par exemple, une résistance bactérienne à un antibiotique, une prototrophie pour les auxotrophes, une résistance à des métaux lourds etc...Des exemples de marqueurs de sélection bactériens sont les gènes qui confèrent une résistance à des antibiotiques tels que l'ampicilline, la kanamycine, la tétracycline et le chloramphénicol notamment. Les marqueurs appropriés à la sélection dans les levures sont par exemple les gènes ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 et URA3 notamment. Des exemples de marqueurs utilisés dans les champignons filamenteux sont amdS (acétamidase), argB (ornithine carbamoyltransférase), bar (phosphinothricine acétyltransférase), hph (hygromycine phosphotransférase), niaD (nitrate réductase), pyrG (orotidine-5'-phosphate décarboxylase), sC (sulfate adényltransférase) et trpC (anthranilate synthase), notamment. Les vecteurs permettant l'expression du variant amélioré de la présente invention, peuvent ne pas contenir de marqueurs de sélection. Le vecteur, dans le cas d'une réplication autonome, doit contenir une origine de réplication adaptée à la cellule hôte. Des exemples d'origine de réplication bactérienne sont, notamment, celles des plasmides pBR322, pUC19, pACYC177 et pACYC184 permettant une réplication dans Escherichia coli, et pUB110, pE194, pTA1060 et pAM[beta] permettant une réplication dans Bacillus. Des exemples d'origine de réplication dans les levures sont, sans que cette liste soit exhaustive, les origines de réplication 2 microns, ARS 1, ARS4, la combinaison de ARS1 et CEN3 et la combinaison de ARS4 et CEN6. L'origine de réplication peut également contenir une mutation qui lui permet d'être sensible à la température. Des exemples d'origine de réplication utiles dans les champignons filamenteux sont AMAl et ANS1 d'Aspergillus nidulans (Gems et al., 1991, Gene 98 :61-67 ; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15 : 9163-75 ; WO 00/24883). Le vecteur, dans le cas d'une intégration dans le génome de la cellule hôte, doit permettre son intégration grâce à la séquence codante du variant amélioré de la présente invention ou de n'importe quelle autre séquence adéquate dans le vecteur, via une recombinaison homologue ou non homologue. I1 peut également contenir des séquences d'acides nucléiques supplémentaires pour diriger son intégration dans le génome de la cellule hôte. Pour maximiser les chances d'intégration dans le génome de l'hôte, les séquences d'intégration doivent être d'une longueur suffisante, telle que 100 à 10000 paires de bases, préférentiellement 400 à 10000, de façon encore plus préférentielle 800 à 10000 paires de bases. Les séquences d'intégration peuvent être codantes ou non codantes.

La séquence nucléotidique signal de 23 codons présente à l'extrémité 5' du gène de la phytase de Yersinia intermedia (telle que référencée dans NCBI sous les numéros NZ AALF01000052 et ZP 00832361) et clivée dans la forme mature, contribue à la sécrétion de l'enzyme dans son hôte d'origine. La présence d'une telle séquence est classique et bien connue de l'homme du métier. Le changement de cette séquence, et son remplacement par une séquence adéquate, est également un paramètre bien connu de l'homme du métier lorsqu'une expression du gène considéré est souhaitée dans un autre organisme ou dans un autre compartiment cellulaire via un vecteur plasmidique ou autre choisi en adéquation avec l'organisme d'expression souhaité. Ainsi, cette séquence peut être remplacée par la séquence signal d'autre gènes telles que celle de Pe1B, PhoA, OmpA ou 13-lactamase notamment, pour son expression dans un hôte procaryote. Lors de l'expression dans une levure telle que Pichia pastoris les séquences signal présentes à l'extrémité 5' du gène de la phytase de Yersinia intermedia peuvent être les séquences signal PHO1 et afactor respectivement des gènes d'une phosphatase et de l'afactor de cet organisme. Lors de l'expression dans Saccharomyces cerevisiae, la même séquence signal afactor peut être utilisée. Lors de l'expression dans Yarrowia lypolytica, la séquence signal présente à l'extrémité 5' du gène de la phytase de Yersinia intermedia peut être la séquence signal XPR2 du même gène XPR2 d'une protéase de cet organisme.

Par cellule hôte, il est entendu que la cellule peut être procaryote ou eucaryote ; il peut s'agir d'une bactérie gram positive telle que Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinusque, notamment ou une bactérie gram négative telle qu'Escherichia coli ou Pseudomonas sp. par exemple, sans que cette liste ne soit limitative. La présente invention concerne également une méthode de production d'une phytase ou d'un variant de celle-ci soluble et active dans une bactérie, de préférence Escherichia coli, comprenant l'expression d'un acide nucléique codant la phytase ou le variant de celle-ci dans une bactérie, de préférence Escherichia coli et, facultativement la récupération de la phytase ainsi exprimée. La cellule hôte peut être une levure du genre Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, notamment. Préférentiellement la cellule hôte peut être Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris ou Yarrowia lipolytica. La cellule hôte peut être un champignon filamenteux du genre Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma. Préférentiellement la cellule hôte peut être Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus piger, Aspergillus oryzae, Caldariomyces fumago, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Tram etes villosa, Tram etes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o u Trichoderma viride. La cellule hôte peut être une cellule de mammifère telle que COS7 ou CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335).

Par acide nucléique on entend de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN ou un mélange des deux. L'acide nucléique peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, la mutagénèse, etc... L'acide nucléique codant un variant amélioré de la phytase selon la présente invention peut être optimisé en termes de codons le constituant pour maximiser son expression dans un hôte particulier différent de son organisme d'origine. Le code génétique universel étant dégénéré, il existe plusieurs codons (codon = triplet de nucléotides) qui codent pour un acide aminé donné. Ces codons homonymes ne sont pas employés au hasard parce que les ARNt (ARN de transfert) correspondants n'existent pas dans toutes les cellules aux mêmes concentrations. De sorte que certains codons auront moins de chances de s'exprimer dans les tissus où l'ARNt correspondant est rare. Cette donnée, bien connue de l'homme du métier, est un paramètre important à considérer lorsqu'on effectue l'expression dans un hôte donné différent de l'organisme d'origine d'un transgène particulier. Les tables de fréquence d'utilisation des codons dans un organisme particulier sont publiques et bien connues de l'homme du métier. Ainsi, les acides nucléiques codant pour les variants améliorés de la phytase selon la présente invention peuvent nécessiter une optimisation pour favoriser leur expression dans l'hôte de production choisi.

Par pourcentage d'identité ou identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48 : 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Ainsi, des acides aminés conservés ou équivalents à ceux présents dans le variant amélioré de la présente invention peuvent être retrouvés dans des phytases d'autres organismes. Ainsi, l'amélioration conférée par la ou les substitutions sélectionnées dans le variant amélioré de la présente invention peut se retrouver en effectuant une substitution équivalente dans une phytase d'un autre organisme que celui dont est originaire la phytase de la présente invention. Il est entendu que ces substitutions équivalentes sont comprises dans le périmètre de la présente invention.

Le variant amélioré de la phytase selon la présente invention peut être utilisé dans les réactions et procédés mentionnés précédemment sous une forme purifiée ou partiellement purifiée. La purification du variant amélioré de la phytase selon la présente invention peut être basique et réalisée notamment par lyse et filtration du contenu des flasques ou conteneurs de production et/ou par des étapes de centrifugation, et/ou par précipitations successives et sélectives à l'ammonium sulfate et/ou par évaporation. Ces procédures basiques permettent d'obtenir des fractions du variant amélioré de la phytase selon l'invention présentant une forte augmentation d'activité spécifique. La purification du variant amélioré selon l'invention peut être complète et nécessiter différentes étapes bien connues de l'homme du métier notamment des étapes de chromatographie (échangeuse d'ions, d'affinité, hydrophobe, par exclusion de taille), d'électrophorèse (préparative par concentration isoélectrique) [Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989]. La fraction purifiée ou partiellement purifiée du variant amélioré de la phytase selon la présente invention peut être utilisée dans les réactions et procédés mentionnés précédemment sous une forme immobilisée ou non. Les procédés pour immobiliser le variant amélioré de la présente invention sur des supports organiques ou inorganiques sont bien connus de l'homme du métier. Ces derniers peuvent être notamment des polyacrylamides, des agaroses, des celluloses, des sephadex ou dextrans, des billes de verre poreuses, des hydroxydes d'aluminium ou de titanium.

Par composition on entend généralement une composition comprenant au moins un variant amélioré de la phytase dont la séquence est SEQ ID N°l avec la ou les substitutions sélectionnées selon la présente invention. Elle concerne également tout mélange solide, liquide ou gazeux comprenant un certain pourcentage d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention. Elle concerne également les mélanges contenant un, deux, trois, quatre, cinq ou dix variants améliorés de la phytase selon la présente invention. Généralement, les compositions contenant des phytases sont des compositions liquides ou dites sèches. Les compositions liquides ne nécessitent pas de contenir autre chose que la phytase hautement purifiée. Cependant des stabilisateurs tels que glycérol, sorbitol ou monopropylène glycol peuvent être ajoutés. Ladite composition peut également contenir d'autres additifs tels que sels, sucres, conservateurs, agents tamponnant vis à vis du pH, des protéines et du phytate. Des compositions liquides typiques sont des compositions aqueuses ou des suspensions à base d'huile. Les compositions liquides peuvent être ajoutées à l'alimentation avant ou après une étape optionnelle de granulation. Les compositions dites sèches peuvent être des compositions sèches par congélation, par pulvérisation ou des compositions sèches extrudées ; dans ces cas ladite composition ne nécessite pas de contenir autre chose que l'enzyme sous sa forme sèche. Les compositions sèches peuvent également être des granulés qui peuvent être mixés ou prêts à l'être avec un composant alimentaire, ou former un composant d'un pré-mélange. La taille des granulés d'enzyme est, de manière préférée, compatible avec celle des autres composants du mélange. Ceci représente un moyen sécurisé et pratique pour incorporer une/des enzymes dans des aliments.

Par exemple, une formulation stable d'enzyme peut être préparée par pulvérisation d'une mixture liquide de phytase sur un composant tel que le tourteau de soja puis séchage de l'ensemble. La diminution du pourcentage d'humidité et les interactions de liaison de la phytase avec le composant protègent l'enzyme des facteurs environnementaux extérieurs telles que les températures extrêmes utilisées lors de la fabrication du composant alimentaire. Egalement, la présentation sous forme sèche de la préparation de phytase peut augmenter sa stabilité en diminuant l'activité de potentielles enzymes protéolytiques pouvant être présentes à l'état de traces à l'issue des étapes de fermentation liquides lors du procédé de production. La préparation sèche de phytase peut, par exemple, être utilisée comme un supplément alimentaire dans l'industrie de production de volailles et de porcs.

A partir d'une préparation sèche d'enzyme, des granulés sont préparés en utilisant des techniques d'agglomération bien connues de l'homme du métier, dans un mixeur à l'intérieur duquel un matériel de remplissage et l'enzyme sont co-agglomérés pour former des granulés. Les granulés sont préparés à partir de matrices sur lesquelles l'enzyme peut venir s'absorber ou sur lesquelles une couche d'enzymes peut être appliquée. Des matériaux typiques pouvant servir de matrice sont des sels tels que du sulfate disodique. D'autres matrices potentielles peuvent être, ou à base de, talc, argile, silicate de magnésium, silicate d'aluminium ou fibres de cellulose. Optionnellement, des agents liants tels que les dextrines peuvent être inclus dans les granulés. Des agents entraîneurs peuvent être inclus sous une forme quelconque des composants ci-après : amidon, manioc, pomme de terre, riz, blé, maïs...Des sels peuvent également être ajoutés. Optionnellement, les granulés peuvent être recouverts par des mélanges dédiés 30 spécifiquement, et en particulier des mélanges hydrophobes, à base d'huile de palme, de suif de boeuf, et si besoin, d'autres additifs tels que carbonate de calcium et argile.

Par ailleurs, la préparation de phytase peut contenir d'autres agents tels que des agents colorants, des composés aromatiques, des stabilisants, des vitamines, des minéraux ainsi que d'autres enzymes ou mélanges d'enzymes ayant des propriétés avantageuses. Ceci est particulièrement vrai pour les pré-mélanges.

Par additif alimentaire, on entend un composant pratiquement pur ou une composition contenant plusieurs composants destinés à être ajoutés à un aliment. En particulier, cet additif est destiné à devenir un composant à part entière dudit aliment et a pour objectif d'affecter, de modifier, d'augmenter une/des propriétés dudit aliment. Ainsi, une préparation de phytase utilisée comme additif alimentaire signifie une phytase qui n' est pas un composant naturel de l'aliment dans lequel elle est ajoutée, ou qui n'est pas présente dans cet aliment à sa concentration naturelle, ou qui est ajoutée séparément des autres composants de l'aliment, seule ou en association avec d'autres additifs alimentaires. Typiquement, un additif alimentaire contient plusieurs composants tels que vitamines, minéraux, agents entraîneurs, excipients, autres enzymes ou mélanges d'enzymes ayant des propriétés avantageuses.

Par préparation de phytase comme additif alimentaire prêt à l'emploi ou phytase comme additif alimentaire prêt à l'emploi, on entend un additif alimentaire qui n'est pas produit in situ dans la nourriture ou l'alimentation animale. Une telle phytase ou préparation peut être donnée directement comme aliment aux êtres humains ou aux animaux et de manière préférée, directement après mélange avec d'autres constituants dudit aliment. Par exemple, un additif alimentaire selon cet aspect de la présente invention est combiné avec d'autres composés pour produire un aliment. Il est inclus dans ces autres composés une ou plusieurs autres enzymes, de préférence thermostables, des additifs alimentaires vitaminés, des additifs alimentaires minéraux, des acides aminés comme additifs alimentaires. Le résultat de ce mélange ou cette combinaison de composés peut être mélangé dans une proportion appropriée avec d'autres composés tels que des suppléments protéiques ou céréaliers pour former l'aliment final. Les procédés de fabrication de ces aliments peuvent être réalisés en utilisant tout appareil bien connu par l'homme du métier, telle qu'une machine à double granulation, une granuleuse à vapeur, un expandeur ou un extrudeur.

Par préparation de phytase ou composition de phytase de la présente invention, on entend des préparations ou compositions qui contiennent une quantité significative d'au moins un variant amélioré de la phytase selon la présente invention et une ou plusieurs autres enzymes ayant des propriétés avantageuses pour la préparation d'aliments. De telles enzymes peuvent appartenir à la liste suivante sans que celle-ci soit exhaustive : alphagalactosidases, beta-galactosidases, en particulier les lactases, d'autres phytases, betaglucanases, en particulier des endo-beta-1,4-glucanases et des endo-beta-1,3(4)-glucanases, cellulases, xylosidases, galactanases, en particulier des arabinogalactan-endo-1,4-beta- galactosidases et des arabinogalactan-endo-1,3-beta-galactosidases, endoglucanases, en particulier des endo-1,2-beta-glucanase, endo-1,3-alpha-glucanase, et endo-1,3-betaglucanase, des enzymes dégradant les pectines, en particulier des pectinases, pectinesterases, des pectine lyases, polygalacturonases, arabinanases, rhamnogalacturonases, rhamnogalacturonan-acetyl-esterases, rhamnogalacturonan-alpha- rhamnosidase, pectate lyases, des alpha-galacturonisidases, mannanases, betamannosidases, mannan-acetyl-esterases, xylan-acetyl-esterases, proteases, xylanases, arabinoxylanases et enzymes lipolytiques telles que lipases, phospholipases et cutinases.

La supplémentation de l'additif alimentaire aux animaux, selon la présente invention, peut être faite avant ou de manière simultanée par rapport au repas. De manière préférée, la supplémentation se fait en même temps que le repas.

Une quantité efficace de phytase pouvant être ajoutée dans les aliments est d'environ 10 à 20000 PPU/kg d'aliment; de manière préférée entre 10 et 15000 PPU/kg; de manière encore préférée entre 10 et 10000 PPU/kg. En particulier de 100 à 5000 PPU/kg, particulièrement de 100 à 2000 PPU/kg d'aliment.

Dans le périmètre de la présente invention est également comprise l'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention dans la fabrication d'aliments destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale. Des grains ou des farines destinés à l'alimentation humaine peuvent être traités avec de la phytase pour réduire leur teneur en phytate, permettant un accroissement de la valeur nutritionnelle de ces produits en augmentant la disponibilité de minéraux essentiels tels que fer, calcium et zinc par exemple. Au delà de la valeur nutritionnelle, un tel traitement par la phytase peut augmenter l'efficacité de la production de cet aliment. Par exemple, l'addition de phytase à des flocons de soja blancs durant le procédé d'extraction de protéines du soja peut augmenter le rendement et la qualité des protéines extraites. La phytase est active durant la fabrication des aliments mais pas dans le produit final. Ceci est particulièrement vrai dans la fabrication et la cuisson des pâtes pour boulangerie. De façon similaire, dans la production d'alimentation animale, des grains de soja ou de colza peuvent être prétraités par la phytase avant leur fabrication et/ou conditionnement final. Un tel prétraitement permet de dégrader des éléments anti-nutritionnels tels que le phytate et augmenter la qualité et la valeur nutritionnelle des aliments en question. Dans ce cas, la phytase peut ou ne pas être toujours active dans le tractus digestif des animaux après leur ingestion des aliments.

Est également comprise dans le périmètre de l'invention, l'utilisation d'un variant amélioré de la phytase selon la présente invention comme agent facilitateur de la transformation des aliments. En particulier, la phytase selon la présente invention peut être utilisée comme un supplément dans l'alimentation humaine pour faciliter la digestion. Par exemple, un/des cachets contenant une quantité adéquate de phytase peuvent être ingérés par une personne avant la consommation de nourriture afin de fournir une enzyme active à son tractus digestif. Le bénéfice de cette ingestion de phytase est particulièrement remarquable dans le cas de consommation d'une nourriture ne pouvant être traitée par la phytase durant sa fabrication.

La phytase selon la présente invention peut être avantageusement utilisée avec des animaux mono- ou polygastriques, spécialement les jeunes veaux. Les régimes destinés aux poissons et crustacés peuvent également être traités par la phytase afin d'améliorer les rendements de conversion entre la nourriture fournie et la croissance des animaux, ainsi que réduire les quantités de phosphate excrété dans les systèmes de production intensifs. La nourriture traitée selon la présente invention peut-être fournie à la volaille (dindes, canards, oies, perdrix, poules, poulets de chair) aux porcs, aux chevaux, aux bovins, aux caprins, aux canins, aux félins. Elle s'adresse particulièrement à la volaille et aux porcs, incluant sans que cela ne soit limitatif, les poules, poulets de chair, dindes, canards et oies.

La phytase selon la présente invention est utilisée pour produire de nouvelles combinaisons d'ingrédients alimentaires ou aliments avec des qualités avantageuses. Par exemple, elle peut être utilisée pour produire des aliments ayant une teneur abaissée en phosphate inorganique. Cette teneur est ajustée en fonction de la quantité et de l'activité de la phytase ajoutée, présente dans l'aliment final, ou active dans un des ingrédients alimentaires rentrant dans la composition de l'aliment final. D'une manière préférée, un tel aliment peut contenir des ingrédients tels que micronutriments, vitamines, acides aminés et des quantités efficaces et optimisées de phytase et de phosphate inorganique telles que la quantité de phytase est comprise entre 50 et 20000 unités de phytase par kilo d'aliment et la quantité de phosphate inorganique est inférieure à 0,45%. Préférentiellement, ces deux quantités se situent entre 100 et 10000 unités de phytase par kilo d'aliment et moins que 0,225% de phosphate inorganique ; d'une manière encore préférée entre 150 et 10000 unités de phytase par kilo d'aliment et moins de 0,15% de phosphate inorganique ; d'une manière encore plus préférée entre 250 et 20000 unités de phytase par kilo d'aliment et aucun phosphate inorganique ajouté. Ces nouvelles combinaisons présentent des intérêts divers tels que la réduction des rejets de phosphate dans l'environnement et l'optimisation des rendements de conversion entre la nourriture fournie et la croissance des animaux, particulièrement recherchée dans la production intensive en élevage.

La présente invention sera décrite plus en détail dans les exemples suivants qui n'ont en aucun cas un caractère limitatif, à l'aide des tableaux et figures associés suivants : 15 Tableau 1 : Mutants isolés par l'approche THRTM Tableau 2 : Liste des mutants présentant un site supplémentaire de glycosylation classés en fonction de leurs pourcentages d'accessibilité aux solvants respectifs. Tableau 3 : Liste des couples de mutations permettant l'addition de ponts disulfures supplémentaires. 20 Tableau 4 : Coefficients d'extinction d'activité 80-20 pour différents mutants. Tableau 4A : Coefficients d'extinction d'activité 80-20 pour les mutants K210S, Y268E et Q292P. Tableau 4B : Détails des données permettant le calcul du coefficient d'extinction d'activité 80-20 du mutant K210S. 25 Tableau 4C : Coefficients d'extinction d'activité 80-20 pour les mutants T142N, A177T et Q326T. Tableau 4D : Coefficient d'extinction d'activité 80-20 pour le mutant G274C/N316C. Tableau 5 : Listes des mutants ciblant une amélioration d'activité 30 Tableau 5A : Liste des positions ciblées par une distance inférieure ou égale à 10 Angstrôms autour du site catalytique de l'enzyme. Tableau 5B : Liste des substitutions ciblant une amélioration d'activité caractérisées dans une première série d'expériences. Figure 1 : Dégradation du phytate par une phytase Figure 2 : Principe de la technologie THRTM Figure 3 : Mesure des activités résiduelles des mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X produits par Saccharomyces cerevisiae après un préchauffage de 0 à 2 minutes à 80°C. Figure 4 : Mesure des activités résiduelles des mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X produits par Saccharomyces cerevisiae après un préchauffage 15 minutes à des températures de 45°C à 65°C. Figure 5 : Mesure des activités résiduelles des mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X produits par Saccharomyces cerevisiae après un préchauffage de 1 minute à des températures de 60°C à 80°C.

Figure 6A : Mesure des activités résiduelles des mutants PHY-98-6X et PHY-98-6X-ssl l produits par Pichia pastoris après un préchauffage de 0 à 30 minutes à 80°C. Figure 6B : Mesure des activités résiduelles des mutants PHY-98-6X et PHY-98-6X-ssl 1 produits par Pichia pastoris après un préchauffage de 0 à 5 minutes à 80°C. Figure 7 : Mesure des niveaux d'activités relatifs des mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X 15 comparativement à l'enzyme d'origine PHY-98 produits par Saccharomyces cerevisiae, en fonction du temps. Figure 8 : Gel SDS-PAGE 12% de surnageants de production pour différents mutants exprimés par Pichia pastoris, digérés ou non par l'endoglycosidase Hf.

20 Exemples : Exemple 1 : Obtention des variants améliorés de la phytase de Yersinia intermedia

Contructions plasmidiques : La réalisation des variants améliorés de la phytase selon la présente invention a nécessité la 25 construction de différents vecteurs plasmidiques permettant la réalisation des expériences de mutagenèse dirigée nécessaires à l'obtention de banques de variants ou mutants ainsi que l'expression de ces mutants dans différents hôtes de criblage ou de production.

Constructions dans pET25b : 30 Selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, l'ORF (Open Reading Frame) ZP00832361 correspondant à la séquence NCBI ATCC 29909 et à la séquence nucléotidique correspondante NZAALF01000052 région : 1889...3214 a été clonée dans le vecteur plasmidique pET25b. Avant clonage, l'ORF a été délétée de sa séquence signal d'origine (23 premiers acides aminés) remplacée par la séquence signal de la phytase d'Escherichia coli. Cette séquence signal de la phytase d'Escherichia coli a été préalablement clonée dans le vecteur pET25b afin d'optimiser l'expression de la phytase de Yersinia intermedia dans E. coli. Le vecteur pET25b permet également d'exprimer la protéine d'intérêt sous la forme d'une protéine de fusion avec un tag 6His facilitant l'isolement et/ou la purification de la protéine d'intérêt selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur contenant la phytase de Yersinia intermedia fusionnée à la séquence signal de la phytase d'E. coli a été transformé dans une souche d'E. coli BL21(DE3) délétée du gène AppA codant pour la phytase endogène d'E. coli.

Constructions dans pNCK: L'ORF de ZP00832361 a été clonée selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier dans le vecteur pNCK. Ce vecteur permet d'exprimer dans un microorganisme thermophile Thermus thermophilus une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt et un gène de résistance thermostable à la kanamycine selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO2006134240 et correspondant à la technique propriétaire de Biométhodes THRTM

Constructions dans pYES2 : L'ORF de ZP00832361 a été clonée selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier dans le vecteur pYES2. Ce vecteur, contenant le peptide signal de la phytase d'Aspergillus piger en position 5' de l'ORF ZP00832361, a permis l'expression de la phytase de Yersinia intermedia par Saccharomyces cerevisiae.

Constructions dans pPIC9 : L'ORF de ZP00832361 a été clonée selon des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier dans le vecteur pPIC9. Ce vecteur, contenant le peptide signal de l'afactor de Pichia pastoris (Invitrogen) en position 5' de l'ORF ZP00832361, a permis l'expression de la phytase de Yersinia intermedia par Pichia pastoris.

Construction de banques de mutants dans pNCK, criblage et obtention de variants améliorés : Plusieurs banques de mutants de la phytase de Yersinia intermedia ont été créées par la technique propriétaire de Biométhodes Massive Mutagenesis décrite dans US 7,202,086 ou dans Saboulard et al (Biotechniques, 2005 Sep 39(3) : 363-8). Brièvement, des oligonucléotides mutagènes ont été synthétisés pour réaliser des mutants de la phytase sur chacun des acides aminés constituant l'enzyme. Les banques de mutants ont été construites à partir du vecteur pNCK contenant le gène de la phytase, selon le protocole de Massive Mutagenesis décrit dans US 7,202,086 ou dans Saboulard et al (Biotechniques, 2005 Sep 39(3) : 363-8), puis transformées et amplifiées dans la souche d'Escherichia coli DH10B. Les mutants de la phytase contenus dans ces banques ont ensuite été criblés par la technique THRTM décrite dans la demande de brevet WO2006134240, dont le principe est résumé dans la figure 2. La possibilité offerte par le système de sélectionner en une seule étape un très grand nombre de molécules mutantes permet de travailler avec des banques de très haute diversité. Une telle banque, ciblant tous les résidus de la protéine, environ 108 clones, a été construite grâce à Massive Mutagenesis . Brièvement, les banques de mutants sont transformées dans des cultures de Thermus thermophilus rendues compétentes. Les transformants sont mis à pousser en milieu liquide à 70°C pour réaliser des précultures qui seront ensuite étalées sur un milieu solide contenant des concentrations stringentes en kanamycine de l'ordre de 25 G/ml. Après une incubation de 48 heures à 70°C, seuls les mutants dont la structure protéique résiste à la température de sélection et dont le repliement est correct permettent un repliement fonctionnel du gène de résistance thermostable à la kanamycine et donc peuvent pousser en présence de kanamycine. Par cette approche, différents mutants ont été isolés, leurs ADN plasmidiques isolés et séquencés. Les différents mutants ont révélé un total de 138 substitutions sur 89 positions présentées dans le tableau 1. Les différentes substitutions ont été introduites individuellement dans la phytase clonée dans le vecteur plasmidique pET25b afin d'être exprimés dans Escherichia coli et caractérisés plus en détail au niveau de leur activité et de leur thermostabilité. L'exemple 4 détaille les protocoles de mesure d'activité utilisés et l'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Une première série d'expériences a permis d'identifier au moins 5 mutants ayant une thermostabilité augmentée par rapport à l'enzyme sauvage. Parmi ceux-ci, 3 mutants contiennent respectivement des substitutions sur les acides aminés K210, Y268 et Q292, particulièrement les substitutions K210S, Y268E et Q292P. Ces mutants présentent un coefficient d'extinction d'activité entre 80 % et 20 % d'activité résiduelle respectivement de 1,75, 1,98 et 2,30 tels que présentés dans le tableau 4A. Ces indices sont calculés par le rapport entre les différences de températures permettant d'une part le maintien de 80% de l'activité résiduelle et d'autre part de 20% de cette activité résiduelle pour les différents variants comparativement à l'enzyme sauvage. Le détail du calcul de cet indice est montré pour le mutant K210S dans le tableau 4B. La visualisation de structures modèles en 3D utilisant des logiciels tels que swiss-model (http;//wwwexpasy.ch/) et spdbv v4.01 (GlaxoSmithKline) permet d'avancer certaines explications concernant les gains de thermostabilité obtenus pour les 3 mutants mentionnés ci-dessus. K210 est un résidu potentiellement accessible au solvant et localisé dans une structure secondaire de type feuillet , éventuellement impliqué dans la liaison et / ou l'interaction avec le substrat (phytate) ou les produits issus de la réaction. K210 semble donc être un résidu important notamment à cause de sa charge positive et de son volume important pouvant générer des contraintes stériques et électrostatiques vis à vis de l'entrée du substrat ou de la sortie des produits du site actif. La perte de cette charge positive dans la substitution K210S et la modification de la contrainte spatiale associée peuvent donc perturber globalement la réaction (entrée du substrat + sortie des produits + solvatation de la cavité du site actif) et modifier les constantes cinétiques de celle-ci, et plus particulièrement les Km apparents pour les différents substrats générés au cours de la réaction. Il est connu, dans certains cas, que les substrat / produit peuvent participer à la stabilisation de la structure 3D de la protéine et conférer une thermostabilité accrue. Il est envisageable que cette substitution facilite, par exemple, le positionnement du substrat en augmentant le nombre de conformères tolérés dans le site actif et/ou puisse également faciliter l'évacuation des phosphates libérés au cours de la réaction en empêchant que ceux-ci ne soient trop présents dans la cavité du site actif, présence qui pourrait clairement perturber le complexe enzyme-substrat et déstabiliser l'ensemble de la structure. Y268 est un résidu potentiellement accessible au solvant et localisé dans une structure secondaire de type "boucle". En modélisant la substitution Y268E à l'aide des logiciels précédemment mentionnés, on constate qu'on augmente le nombre de liaisons hydrogènes potentielles avec les résidus structuralement proches (avec la fonction CO peptidique du résidu Q143 par exemple), mais aussi, que cette substitution peut engendrer un pont salin supplémentaire avec notamment K146. Globalement, on constate une rigidification de la région en question qui pourrait expliquer le gain en thermostabilité constaté. Q292 est également un résidu potentiellement accessible au solvant, localisé dans une structure secondaire de type boucle . La substitution par un résidu proline est une approche d'ingénierie relativement classique dans ce type de structures secondaires faiblement conservées. Ce type de résidu génère peu de rotamères et va, par conséquent, rigidifier la structure secondaire dans laquelle il se situe et ainsi conférer dans certains cas, un gain de thermostabilité que pourrait donc engendrer la substitution Q292P.

Construction de mutants possédant des sites supplémentaires de glycosylation : Certaines modifications post-traductionnelles comme les glycosylations sont décrites comme stabilisant les protéines. Les signaux de N-glycosylations dans une séquence protéique sont NxT ou NxS. De tels sites ont été introduits dans la phytase de Yersinia intermedia clonée dans le vecteur pYES2, soit par la technique propriétaire de Biométhodes Massive Mutagenesis comme mentionné ci-dessus ou par une technique de mutagenèse bien connue de l'homme du métier, telle qu'une PCR par recouvrement, en introduisant un résidu T à la position +2 par rapport à un résidu N présent dans la phytase de Yersinia intermedia ou en introduisant un résidu N à la position -2 par rapport à un résidu S ou T. Les positions sur lesquelles des sites de glycosylation ont été introduits sont classées en fonction de leur pourcentage d'accessibilité aux solvants (% ASA) par utilisation du logiciel disponible à : htlp_r i_nobyle_rpbsni___-Jsa:ri_s-dïderot_{1!cgïbin/portal.py?from=ASA (Richmond, TJ. Solvent accessible surface area and excluded volume in proteins. J. Mol. Biol.,178, 63-89 (1984). Préférentiellement, 22 substitutions sur des résidus ayant un pourcentage d'accessibilité aux solvants > 35 % ont été sélectionnées. Encore plus préférentiellement, 10 substitutions sur des résidus ayant un pourcentage d'accessibilité aux solvants > 70 % ont été sélectionnées. Ces différents variants construits permettant l'ajout de sites de glycosylations sont classés dans le tableau 2 en fonction de leurs pourcentages d'accessibilité aux solvants respectifs. Les constructions mutantes ont été transformées dans Saccharomyces cerevisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur thermostabilité. L'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Une première série d'expériences a permis d'identifier plusieurs mutants avec un site supplémentaire de glycosylation possédant une thermostabilité augmentée par rapport à l'enzyme sauvage. Ces mutants contiennent des substitutions sur les acides aminés T142, A177 et Q326 caractérisés par un pourcentage d'accessibilité aux solvants > 70%. Plus particulièrement, les substitutions sur ces acides aminés sont T142N, A177T et Q326T. Ces mutants présentent un coefficient d'extinction d'activité entre 80 % et 20 % d'activité résiduelle respectivement de 1,62, 1,62 et 1,52 tels que présentés dans le tableau 4C. Ces indices sont calculés par le rapport entre les différences de températures permettant d'une part le maintien de 80% de l'activité résiduelle et d'autre part de 20% de cette activité résiduelle pour les différents variants comparativement à l'enzyme sauvage. Le détail du calcul de cet indice est montré pour le mutant K210S dans le tableau 4B.

Construction de mutants possédant des ponts disulfure supplémentaires : Plusieurs couples de résidus ont été identifiés pour leurs distance et orientation compatibles avec la formation d'un pont disulfure et remplacés par des résidus cystéine. L'identification de ces couples a été faite par visualisation de structures modèles ou homologues de phytases sous format pdb en utilisant un programme type Swisspdb Viewer (GlaxoSmithKline) et en tenant compte des distances optimales entre résidus et orientation des chaînes latérales de ceux-ci. Par cette approche, 12 paires de résidus situés à environ 2 Angstrôms ont été sélectionnées et sont listées dans le tableau 3 : Les résidus précédents ont été introduits dans la phytase de Yersinia intermedia clonée dans le vecteur pYES2, soit par la technique propriétaire de Biométhodes Massive Mutagenesis comme mentionné ci-dessus ou par une technique de mutagenèse bien connue de l'homme du métier, telle qu'une PCR par recouvrement. Les constructions mutantes ont été transformées dans Saccharomyces cerevisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur thermostabilité. L'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Une première série d'expériences a permis d'identifier un mutant possédant un pont disulfure supplémentaire et une thermostabilité améliorée. Ce mutant contient deux substitutions sur les résidus G274 et N316, plus particulièrement les substitutions G274C et N316C. Ce mutant présente un coefficient d'extinction d'activité entre 80 % et 20 % d'activité résiduelle de 2,33 tel que présenté dans le tableau 4D. Cet indice est calculé par le rapport entre les différences de températures permettant d'une part le maintien de 80% de l'activité résiduelle et d'autre part de 20% de cette activité résiduelle pour le variant SS11 comparativement à l'enzyme sauvage. Le détail du calcul de cet indice est montré pour le mutant K210S dans le tableau 4B.

Construction de mutants ciblant une amélioration d'activité : Plusieurs résidus ont été ciblés pour identifier des mutants présentant une activité améliorée. L'identification de ces résidus a été faite par visualisation de structures modèles ou homologues de phytases sous format pdb en utilisant un programme type Swisspdb Viewer (GlaxoSmithKline). Le critère de sélection choisi est la situation des résidus à une distance inférieure ou égale à 10 Angstrôms autour du site catalytique de l'enzyme. Par cette approche 76 positions ont été sélectionnées et sont listées dans le tableau 5A. Une diversité totale, par l'utilisation d'oligonucléotides NNS a été introduite au niveau de ces positions dans la phytase de Yersinia intermedia clonée dans le vecteur pYES2, soit par la technique propriétaire de Biométhodes Massive Mutagenesis comme mentionné ci- dessus ou par une technique de mutagenèse bien connue de l'homme du métier, telle qu'une PCR par recouvrement. Ainsi, pour chacune des positions listées dans le tableau 5A, les mutants comportant individuellement l'une des 19 substitutions possibles parmi la liste des 20 acides aminés existants ont été construits ; selon le code à une lettre communément adopté, ces 20 acides aminés sont : A, R, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V. Les constructions mutantes sont transformées dans Saccharomyces cerevisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur thermostabilité respectives. L'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Une première série d'expériences a permis de caractériser 14 mutants contenant les substitutions listées dans le tableau 5B.

Combinaison des améliorations : Les différentes approches utilisées permettent de cumuler les gains de thermostabilité et/ou d'activité et/ou de résistance à la protéolyse obtenues par les criblages et caractérisations des différents mutants dans chacune des approches THRTM, ajout de sites de glycosylation, ajout de ponts disulfures et ciblage de l'activité. Une première série d'expériences a permis de construire plusieurs mutants combinant les améliorations de thermostabilité obtenues par criblage des banques selon THRTM, l'ajout de nouveaux sites de glycosylation et l'ajout de ponts disulfures. Ces mutant ont été construits par la technique propriétaire de Biométhodes Massive Mutagenesis comme mentionné ci-dessus. Plusieurs mutants ont été construits comprenant les combinaisons de substitutions G274C + N316C, T142N + A177T + Q326T, K210S + Y268E + Q292P, D140F + Y268E + Q292P, F167N + Y268E + Q292P, T142N + A177T + K210S + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T + G274C + N316C. Les constructions mutantes ont été transformées dans Saccharomyces cerevisiae et caractérisées plus en détail au niveau de leur activité et de leur thermostabilité. L'exemple 5 détaille les protocoles de caractérisation de l'activité résiduelle des mutants en fonction de la température. Les figures 3 à 7 présentent les résultats des caractérisations de certains de ces mutants en particulier les mutants PHY-98-4X, PHY-98-6X et PHY-98-6X-SS11 contenant respectivement les combinaisons de mutations T142N + A177T + K210S + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T et T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T + G274C + N316C, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1. Trois souches bactériennes contenant respectivement l'enzyme d'origine PHY-98 et les mutants PHY-98-6X et PHY-98-6X-SS11 mentionnés ci-dessus, clonés dans le vecteur plasmidique pYES2 comme décrit par ailleurs, ont fait l'objet d'un dépôt de matériel biologique sous les références respectives CNCM I-4172, CNCM I-4173 et CNCM I-4174, le 24 juin 2009. Ces différents mutants peuvent servir de base pour ajouter une ou des substitutions supplémentaires provenant des différentes approches de sélection et montrant une/des améliorations d'activité/thermostabilité afin de créer de nouvelles combinaisons de mutations cumulant les gains d'améliorations ou montrant des synergies dans les améliorations dues à ces nouvelles combinaisons de mutations.

Exemple 2 : Expression des variants améliorés de la phytase de Yersinia intermedia dans Saccharomyces cerevisiae La plasmide pYES2 contenant le variant amélioré de la phytase de Yersinia intermedia comme décrit précédemment a été transformé par électroporation dans la souche de levure Saccharomyces cerevisiae APho4 et les transformants ont été sélectionnés sur milieu solide SD-U. Plusieurs clones ont été mis à pousser en préculture en milieu SD-U liquide pendant une nuit à 30°C sous agitation. Ces précultures ont permis d'ensemencer autant de culture dans le milieu de production YP Galactose 2%. Les productions ont été réalisées sur une nuit à 30°C sous agitation.

Exemple 3 : Expression des variants améliorés de la phytase de Yersinia intermedia 25 dans Pichia Pastoris

Le plasmide pPIC9 contenant le variant amélioré de la phytase de Yersinia intermedia comme décrit précédemment a été transformé dans des cellules de Pichia pastoris rendues compétentes. Après sélection des colonies contenant le plasmide, une colonie a été mise à 30 pousser pendant 16 heures à 28°C sous agitation dans 50 ml de milieu BMG pour former une préculture. La production des variants est contrôlée par des temps d'induction différents au méthanol 0,5% selon la quantité désirée dudit variant. Avant induction, la Densité Optique (DO) des précultures a été mesurée à 600nm ; pour l'induction, des DO optimales de 2 à 6 uDO sont exigées. Les précultures ont alors été centrifugées et resuspendues dans un milieu BMM contenant 0,5% de méthanol à une DO de démarrage comprise entre 1 et 30 uDO/ml selon les temps d'induction envisagés : luDO/ml pour une induction de 96 heures, 6 uDO/ml pour une induction de 72 heures et 30 uDO/ml pour une induction de 48 heures. Du méthanol 100% est ajouté toutes les 24 heures à une concentration finale de 0,5%. Ces procédures de production ont été utilisées pour des productions en Erlenmeyer adaptées à des volumes allant de 10 ml à 200 ml. Pour des volumes supérieurs, les productions ont été réalisées en bioréacteur de 5 à 50 L adapté à des volumes de production allant de 2 à 20 L. Le type de bioréacteur utilisé (Applikon) permet un contrôle automatisé de la pousse des levures par mesures régulières de la Densité Optique à 600 nm et de la pression en Oxygène (pO2) optimisant le maintien des conditions d'induction par méthanol. La procédure utilisée a été adaptée du protocole de fermentation en Pichia pastoris d'Invitrogen ( Pichia expression kit ; a manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris û Version M du 11 janvier 2002). La figure 8 présente un Gel SDS-PAGE 12% de surnageants de production pour différents mutants exprimés par Pichia pastoris, digérés ou non par l'endoglycosidase Hf (New England Biolabs P0703). Les pistes du gel notées Phy 98, Phy 98 6x et Phy 98 6x SS11 correspondent à 10 G de surnageants de production des molécules PHY-98, PHY-98-6X et PHY-98-6X-SS11 décrits dans l'exemple 1. Le mutant Phy 98-6X-SS5 est un mutant contenant les substitutions L52C + L99C + T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T. Les pistes Phy98 montrent le profil de migration de la phytase sauvage de Yersinia intermedia, non glycosylée puisque ne possédant pas de sites potentiels de N-glycosylations NxS/T ; ceci est illustré par l'absence de différence de migration après digestion par l'endoglycosidase Hf. Les pistes Phy 98 6x, Phy 98 6x SS5 et Phy 98 6x SS11, en absence de digestion par l'endoglycosidase Hf, montrent les profils de migration des phytases mutantes présentant des masses moléculaires supérieures dues à la glycosylation respective des mutants. Cette glycosylation est montrée, après digestion par l'endoglycosidase Hf (pistes notées digéré Endo Hf ), par un retour du profil de migration des différents mutants vers celui de la phytase sauvage, même si dans certains cas la digestion par l'endoglycosidase peut être incomplète.

Exemple 4 : Mesure de l'activité des variants améliorés de la phytase de Yersinia intermedia L'activité des variants de la phytase de Yersinia intermedia ainsi que l'activité de la protéine d'origine prise comme contrôle, a été mesurée à l'aide d'un test colorimétrique mesurant le phosphate libéré en présence d'une solution de phytate prise comme substrat. Brièvement, 40 l de surnageant de l'échantillon à tester (dilué ou non en tampon acétate de sodium) ou 40 l d'une solution étalon d'une gamme de phosphate ont été mélangés à 40 l de phytate (20 g/1). La réaction a été incubée classiquement 15 minutes à 37°C. La réaction a été stoppée par 80 l de NaOH à 0,5M ou TCA 20%. 60 l du volume total de la réaction de 160 l ont été transférés pour la révélation avec 60 l d'une solution Fe-Mo. La réaction de révélation a été laissée pendant 15 minutes à l'abri de la lumière avant d'être lu dans un spectrophotomètre à 620 nm. Toutes les solutions de la réaction ont été réalisées avec de l'eau ppi sans phosphate. Le tampon réactionnel est un tampon acétate de sodium 0,25 M pH 4,5. Le substrat utilisé est une solution de phytate réalisée dans le tampon réactionnel précédent à partir d'une solution stock à 200g/1. La solution de révélation a été formée extemporanément par 4 volumes de solution de Mo mélangés à 1 volume de solution de Fe. La solution de Mo est une solution de Molybdate à 0,012M et la solution de Fe est une solution de fer II à 0,38M. Pour le calcul de l'activité une gamme étalon de phosphate a été réalisée à partir d'une gamme de KH2PO4 allant de 0 à 10 mol/ml. En utilisant les conditions réactionnelles décrites ci-dessus, l'activité phytase des échantillons à tester a été calculée en appliquant la formule suivante : Activité phytase en U/ml = [(DO 620 nm) x (facteur de dilution)] / [(pente gamme étalon) x (temps de réaction en minutes)]. Le calcul des concentrations en protéines a été déterminé selon la méthode classique de Bradford bien connu de l'homme du métier. La figure 7 montre des niveaux d'activités relatifs en fonction du temps (0 à 15 minutes) 25 supérieurs pour les mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X comparativement à l'enzyme d'origine PHY-98 dans Saccharomyces cerevisiae.

Exemple 5 : Caractérisation de la thermostabilité des variants améliorés de la phytase de Yersinia intermedia La thermostabilité des variants isolés de la phytase de Yersinia intermedia a été déterminée en mesurant une activité résiduelle des différents surnageants de production des variants soit après un préchauffage à une température constante pendant des temps variables, soit après un temps fixe de préchauffage à des températures variables. Dans le premier cas, les 30 variants sont préchauffés à 80°C pendant des temps allant de 0 à 30 minutes. Dans le second cas, deux types d'activité résiduelle des variants ont été mesurés, soit après un préchauffage de 15 minutes à des températures allant de 45°C à 65°C, soit après un préchauffage de 1 minute à des températures allant de 60°C à 80°C. Les activités résiduelles ont été déterminées dans le premier cas en % de l'activité du même échantillon sans préchauffage ou dans le second cas en % de l'activité du même échantillon préchauffé à la première température mesurée, les deux activités références étant considérées comme les points 100%. L'activité résiduelle est montrée en valeurs brutes de Densité Optique à 600 nm après un préchauffage de 15 minutes dans la figure 4.

Les figures 3, 4 et 5 présentent des résultats obtenus pour les variants PHY-98-4X et PHY-98-6X exprimés par Saccharomyces cerevisiae par rapport à l'enzyme d'origine PHY-98. La figure 3 montre les activités résiduelles supérieures des deux mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X après un préchauffage de 0 à 2 minutes à 80°C par rapport à l'enzyme d'origine PHY-98. La figure 4 montre les activités résiduelles supérieures des deux mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X après 15 minutes de préchauffage à des températures variables allant de 45°C à 65°C. La figure 5 montre les activités résiduelles supérieures des deux mutants PHY-98-4X et PHY-98-6X au delà de 60°C en utilisant 1 minute de préchauffage. Les figures 6a) et 6b) montrent les activités résiduelles supérieures des mutants PHY-98-20 6X et PHY-98-6X-SS11, exprimés par Pichia pastoris, après des temps de préchauffage à 80°C de respectivement 0 à 30 minutes et 0 à 5 minutes.

Exemple 6 : Thermostabilité des mutants dans des essais de granulation 25 Des tests de granulation peuvent être menés pour déterminer la thermostabilité des différents mutants par rapport à l'enzyme sauvage et des enzymes existantes et/ou commerciales. Les différentes phytases peuvent être incorporées dans les procédés de formation et de formulation de granulés destinés à être ajoutés à l'alimentation animale, par exemple. 30 Ces granulés peuvent être formés en mixant/pétrissant dans les mêmes conditions des surnageants de production des mutants et enzymes référentes devant être comparées, avec, par exemple, une matrice composée d'amidon de maïs et d'eau. La matrice de granulation peut contenir des pourcentages relatifs phytase/maïs/eau différents. Classiquement, après pétrissage, la matrice peut être extrudée avec une extrudeuse semblable au type NICATM E- 220 et directement sphéronisée à partir d'un sphéroniseur NICATM ou de type Fuji PaudalTM QJ-400G. Les particules obtenues sont ensuite séchées sur un sécheur à lit fluidisé du type Glatt GPCG 1.1. L'activité phytase dans les granulés est généralement comprise entre 2500 et 3000 FTU/g.

Les granulés formés peuvent être mélangés à la nourriture. Selon l'importance en volume des tests, la quantité de nourriture formée peut être variable. Par exemple, 250 g de granulés peuvent être mélangés avec 25 kg de nourriture pour former un prémélange. Ce prémélange peut être incorporé juste avant le test à 225 kg de nourriture, par exemple, de la même composition. De façon non limitative, une nourriture pour volaille typique peut être composée en pourcentage de 45 à 50% de maïs, 0 à 5% de pois, 0 à 4,5% de farine de colza, 0 à 4,5% de farine de graines de tournesol, 0 à 2,5% de gluten de fleur de maïs, 6 à 10% de fèves de soja entières, environ 25% de tourteau de soja, environ 4% de tapioca, 1 à 3,5% d'huile de soja, 0 à 4% de graisse animale, 0,5 à 1% d'un cocktail de vitamines (Mervit 100), environ 1% de calcaire en poudre, 0,2 à 1,3% de phosphate monocalcique, 0,1 à 0,4% de sels, 0 à 0,3% de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 0,05 à 0,3% de L-Lysine, 0,15 à 0,25% de DL-Méthionine et 0 à 0,05% de L-Thréonine. Le prémélange de l'ordre de 25 kg est typiquement mélangeable dans un mélangeur planétaire type Collete MP90 pendant 10 minutes. Le mélange de l'ordre de 225 kg peut être mélangé dans un mélangeur du type Nauta 1200 Litres. Des échantillons de ce mélange sont prélevés à ce stade pour déterminer l'activité et la stabilité des mutants et des phytases de référence avant la formation des granulés finaux. Le mélange de l'ordre de 250 kg est typiquement dosé dans un mélangeur/conditionneur par une vis de dosage à une vitesse d'environ 600 kg /h, où il est chauffé par injection de vapeur jusqu'à environ 95°C. Le temps de résidence total est d'environ 10 à 30 secondes après quoi le mélange chaud est dirigé vers une presse à granulation. Pour les tests, les tailles de granulés pouvant être fabriqués sont du type 5/45 mm (largeur/longueur) ou 3/65 mm. La température des granulés à la sortie de la presse est typiquement de 82 à 83°C pour le premier type de granulés et 91 à 93°C pour le second type. A la suite de cette étape, les granulés sont refroidis sur un tapis de refroidissement où des échantillons sont récupérés pour déterminer l'activité et la stabilité des mutants et des phytases de référence après la formation des granulés finaux. Des rendements de granulation en terme d'activité peuvent ainsi être obtenus pour chaque mutant, comparativement aux enzymes de référence, en faisant les rapports d'activité après et avant l'étape de granulation. Un protocole de mesure de l'activité phytase est donné dans l'exemple 4. Egalement, un protocole standard de mesure de l'activité phytase adapté à ces procédés est publié sous la référence : van.Engelen et al., Journal of AOAC International 1994, 77 :760-764.

Exemple 7 : Tests dans des essais d'alimentation animale Plusieurs approches peuvent être utilisées pour mesurer l'efficacité des mutants de l'invention à libérer le phosphate du phytate in vivo afin de contribuer à la croissance des animaux, comparativement à des phytases référentes. Différents animaux tels que des porcs peuvent être intégrés dans des protocoles bien établis. Ceux-ci ont un accès libre à de l'eau et à un régime typique constitué par exemple de 67% de maïs, 28% de farine de soja, 1% de calcaire en poudre, 0,1% L-Lysine, 1% d'huile de maïs, 0,25% de cocktail vitaminé classiquement utilisé, 0,5% de sels, 0,5% d'antibiotiques. Les déchets de nourriture sont collectés quotidiennement. La prise de poids des animaux est mesurée hebdomadairement pour calculer le gain moyen par jour, la prise de nourriture moyenne quotidienne et le rapport gain/prise. Les mutants présentant un intérêt particulier et les meilleurs performances sont typiquement ceux qui présentent un rapport gain/prise accru. Egalement des modèles in vitro existent qui permettent de simuler la digestion dans le tractus d'un animal monogastrique. Par exemple des échantillons de nourriture composés de 30% de farine de soja et 70% de farine de maïs peuvent être supplémentés avec du calcium de phosphate à un taux de 5 g/kg de nourriture et préincubés à 40°C, pH 3 pendant 30 minutes, suivi d'une addition de pepsine à 3000 U/g de nourriture et différents dosages de phytase compris entre 0 (blanc témoin) et 1 U phytase/g de nourriture. Différents mutants de phytase peuvent être testés comparativement à des phytases référentes. Les différents échantillons sont incubés à 40°C, d'abord à pH 3 pendant 60 minutes puis à pH 4 pendant 30 minutes. Les réactions sont alors stoppées et le phytate et les inositol phosphate sont extraits par addition d'acide chlorhydrique à une concentration finale de 0,5M, une incubation pendant 2 heures à 40°C, suivi d'un cycle de congélation-décongélation et d'une heure d'incubation à 40°C.

Le phytate et les inositol phosphates sont séparés par chromatographie échangeuse d'ions à haute performance tel que décrit dans Chen, Q.C. and Li, B.W. (2003) et journal of Chromatography A 1018, 41-52 ainsi que dans Skoglund, E., Carlson, N.G. and Sandberg, A.S. (1997) et J. Agric. Food Chem. 45, 431-436. Le phosphate relargué est calculé comme la différence entre le phosphate lié aux inositol phosphates dans des échantillons traités avec une phytase comparativement à des échantillons non traités avec une phytase. Les mutants intéressants relarguent une plus grande quantité de phosphate.

Dépôt de matériel biologique : Trois souches bactériennes contenant les constructions PHY-98, PHY-98-6X et PHY-98-6X-SS11 utilisées dans les exemples précédents ont été déposées et acceptées par la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex France, selon les termes du Traité de Budapest : Références d'identification Dates de dépôt Numéros d'enregistrement des des souches déposées matériels biologiques reçus PHY-98 24 juin 2009 CNCM I-4172 PHY-98-6X 24 juin 2009 CNCM I-4173 PHY-98-6X-SS11 24 juin 2009 CNCM I-4174 Littérature citée : Cosgrove DJ (1970) Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin, Inositol phosphate intermediates in the dephosphorylation of the hexaphosphates of myo-inositol, 15 scyllo-inositol, and D-chiro-inositol by a bacterial (Pseudomonas sp.) phytase. Australian Journal of Biological Sciences 23:1207-1220 Cullen et al. (1987) Sequence and centromere proximal location of a transformation enhancing fragment ansl from Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Research 15 : 9163-75 Dassa J. et al. (1990) The complete nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH 2.5 acid phosphatase and glucose-l-phosphatase. J. Bacteriol. 172:5497-5500 25 Gems et al. (1991) An autonomously replicating plasmid transforms Aspergillus nidulans at high frequency. Gene 98 :61-67 Greiner et al, Purification and characterization of two phytases from E. Coli. Arch. Biochem. Biophys., 303, 107-113, 1993 20 Janson J.C. and Ryden L (1989) Protein Purification, VCH Publishers, New York

Karhunen T, Mntyl A, Nevalainen KMH, Suominen PL (1993) High frequency one-step 5 gene replacement inTrichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol Gen Genet 241: 515-522

Laemmli UK (1970) Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685 Lim et al., 2000, Crystal structures of Escherichia coli phytase and its complex with phytate. Nat. Struct. Biol. 7: 108-113

Needleman et Wunsch (1970) A general method applicable to the search for similarities in 15 the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 48 : 443

Oshima et al. (1996) A 718-kb DNA sequence of the Escherichia coli K-12 genome corresponding to the 12.7-28.0 min region on the linkage map. DNA Research, 3:137-155

20 Pearson et Lipman (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8) : 2444-8

Penttil M, Nevelainen H, R ttô M, Salminen E, Knowles J (1987) A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 25 61: 155-164

Powar VK and Jagannathan V (1982) Purification and properties of phytate-specific phosphatase from Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 151:1102-1108

30 Raeder U, Broda P (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett Appl Microbiol 1: 17-20

Richmond, TJ. (1984) Solvent accessible surface area and excluded volume in proteins. J. Mol. Biol.,178, 63-89 10 Rodriguez et al. (2000) Site-directed mutagenesis improves catalytic efficiency and thermostability of Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase/phytase expressed in Pichia pastoris. Arch. Biochem. Biophys., 382:105-112

Saboulard et al (2005) High-throughput site-directed mutagenesis using oligonucleotides synthesized on DNA chips. Biotechniques Sep 39(3) : 363-8)

Smith et Waterman (1981) Ad. App. Math. 2 : 482

Touati and Danchin (1987) The structure of the promoter and amino terminal region of the pH 2.5 acid phosphatase structural gene (appA) of E. coli: a negative control of transcription mediated by cyclic AMP. Biochimie, 69:215-221

15 Wyss et al (1999) Biochemical Characterization of Fungal Phytases. Appl Environ Microbiol 65 (2) 367-373 10 42 TABLEAU 1 P3L P3V V4G A5P P8N P8V T91 T9Q T9S T9Y G10A G1OP V16M V17W L19G S20C R21 F H22A H22S H22Y G23S R25C P27F T28N T28S T28V Q30R Q32R L33R T41 G G50D G50E V601 Y67F Y67W G75R A78P D92R D94G D94S Q95V R96A T97N V125N D126Q H130N H1300 H130R H130W P131S V132W D133G D133P D133R D133V D133W D140E D140F L152N L152P L156N F167N C182N F197V K206A T209C K210C K210E K210S K210T K210V K210Y V211C V211G L217N L223S E225D F227S L229H 0230T N231K A234K P236N S251N L252M H256A H256E H256P N2571 0259K 0259Y D261F A264P Y268N Y268E K273N G274S P276L 0292P P297S 0301L H310R D311A D311E D311G T312D T312N T312P T312V N313F N313R 1314E 1314M A323E P331R D332A D332L D3320 N333V P335C P335G P335R P335S V341A V341E E343A E343G D349N R353C Y354N V355W A370D A370T K376S P379L G 381S S393G P4140 TABLEAU 2 < 35% ASA < 35% ASA < 35% ASA 35%<x<70% ASA > 70 % ASA Q7N S220N P335S Y51N K29N D36N Q230N P335T C81N T142N P39N Q233S Q352S Q95N A177N R98N Q233T Q352T D140N A177S Q143N + H145T R242N E371S P155N A177T E158N Q259S E371T G189N K201N E158N + S160T Q259T P379S K210N G293N P207N A264N P379T I250S Q326S P207S K273N A380S I250T Q326T P207T P300N A380T P297N E391N S212N H310N G394S D349S A218N D332N G394T D349T 43 44 TABLEAU 3 SER20 - GLY339 VAL24 - GLY56 SER26 - TRP45 GLN30 - MET34 LEU52 - LEU99 THR53 - GLY56 ALA57 - ALA103 GLY101 - VAL116 ALA147 - TYR268 ASP193 - ASN196 GLY274 - ASN316 GLY322 - ASP388 45 TABLEAU 4 Tableau 4A Mutants K210S Y268E Q292P Coefficients d'extinction d'activité 80-20 1,75 1,98 2,3 Tableau 4B Sauvage K210S T°C 80% 50,77 50,51 T°C 20% 53,44 55,17 Delta 80-20 2,67 4,66 R(K21OS/Sauv) 1,74531835 Tableau 4C Mutants T142N A177T Q326T Coefficients d'extinction d'activité 80-20 1,62 1,62 1,52 Tableau 4D 30 Mutants G274C/N316C(SS11) Coefficients d'extinction d'activité 80-20 2,33 10 15 20 25 35 5 15 20 TABLEAU 5 Tableau 5A L19 S20 R21 H22 G23 V24 R25 S26 P27 T28 K29 Q30 T31 M34 A49 G50 Y51 L52 D92 V93 D94 Q95 R96 T97 R98 T100 V125 D126 F129 H130 D133 P207 T209 K210 V211 S212 L213 L217, A218, L219, S220, S221, T222 L223 G224 E225 1226 F227 L228 L229 L253 L255 H256 N257 Q259 F260 M263 A264 K273 L277 G308 G309 H310 D311 T312 N313 1314 A315 N316 D332 N333 T334 P335 P336 G337 G338 Tableau 5B Q30D Y51 G Y51 Q Y51 W L52G V93G R98T F129W H130Y P155T L219V L255T M263L G308S 46

Claims

Revendications: 1- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en P3, V4, A5, P8, T9, G10, V16, V17, L19, S20, P27, T28, K29, Q30, T31, Q32, L33, M34, D36, P39, T53, G56, A57, V60, Y67, G75, A78, C81, D92, V93, T100, G101, A103, V116, V125, D126, F129, H130, P131, V132, D133, D140, T142, Q143 + H145, A147, L152, P155, L156, E158, E158 + S160, F167, A177, C182, G189, D193, N196, F197, K201, K206, P207, T209, K210, V211, S212, L213, L217, A218, L219, S220, S221, T222, L223, G224, E225, 1226, F227, L228, L229, Q230, N231, Q233, A234, P236, R242, I250, S251, L252, L253, L255, H256, N257, Q259, F260, D261, M263, A264, Y268, K273, G274, P276, L277, Q292, G293, P297, P300, Q301, G308, G309, H310, D311, T312, N313, I314, A315, N316, G322, A323, Q326, P331, D332, N333, T334, P335, P336, G337, G338, G339, V341, E343, D349, Q352, R353, Y354, V355, A370, E371, K376, P379, A380, G381, D388, E391, S393, G394, et P414, les positions étant indiquées dans SEQ ID Na 1.
2- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en P3L, P3V, V4G, A5P, P8N, P8V, T9I, T9Q, T9S, T9Y, G1OA, G1OP, V16M, V17W, L19G, S20C, R21F, H22A, H22S, H22Y, G23S, V24C, R25C, S26C, P27F, T28N, T28S, T28V, K29N, Q30C, Q30D, Q30R, Q32R, L33R, M34C, D36N, P39N, T41G, W45C, G50D, G50E, Y51G, Y51N, Y51Q, Y51W, L52C, L52G, T53C, G56C, A57C, V601, Y67F, Y67W, G75R, A78P, C81N, D92R, V93G, D94G, D94S, Q95N, Q95V, R96A, T97N, R98N, R98T, L99C, G101C, A103C, V116C, V125N, D126Q, F129W, H130N, H130Q, H130R, H130W, H130Y, P131S, V132W, D133G, D133P, D133R, D133V, D133W, D140E, D140F, D140N, T142N, Q143N + H145T, A147C, L152N, L152P, P155N, P155T, L156N, E158N, E158N + S160T, F167N, A177N, A177S, A177T, C182N, G189N, D193C, N196C, F197V, K201N, K206A, P207N, P207S, P207T, T209C, K210C, K210E, 1(210N, K210S, K210T, 1(210V, K210Y, V211C, V211G, S212N, L217N, A218N, L219V, S220N, L223S, E225D, F227S, L229H, Q230N, Q230T, N231K, Q233S, Q233T, A234K, 47 R21, H22, G23, V24, R25, S26, T41, W45, A49, G50, Y51, L52, D94, Q95, R96, T97, R98, L99,P236N, R242N, I250S, 1250T, S251N, L252M, L255T, H256A, H256E, H256P, N257I, Q259K, Q259S, Q259T, Q259Y, D261F, M263L, A264N, A264P, Y268C, Y268E, Y268N, K273N, G274C, G274S, P276L, Q292P, G293N, P297N, P297S, P300N, Q301L, G308S, H310N, H310R, D311A, D311E, D311G, T312D, T312N, T312P, T312V, N313F, N313R, I314E, 1314M, N316C, G322C, A323E, Q326S, Q326T, P331R, D332A, D332L, D332N, D332Q, N333V, P335C, P335G, P335R, P335S, P335T, G339C, V341A, V341E, E343A, E343G, D349N, D349S, D349T, Q352S, Q352T, R353C, Y354N, V355W, A370D, A370T, E371S, E371T, K376S, P379L, P379S, P379T, A380S, A380T, G381S, D388C, E391N, S393G, G394S, G394T, et P414Q, les positions étant indiquées dans SEQ IDN°1.
3- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en P8N, P8V, T91, T9S, G10A, G1OP, V16M, V17W, S20C, G23S, V24C, S26C, P27F, T28N, T28S, K29N, Q30C, Q30D, Q30R, Q32R, L33R, M34C, D36N, P39N, T41G, W45C, G50D, G50E, Y51G, Y51N, Y51Q, Y51W, L52C, L52G, T53C, G56C, A57C, V60I, Y67F, G75R, A78P, C81N, V93G, Q95N, T97N, R98N, R98T, L99C, G101C, A103C, V116C, F129W, H130N, H130Q, H130R, H130Y, P131S, V132W, D133G, D140F, D140N, T142N, Q143N + H145T, A147C, L152N, L152P, P155N, P155T, L156N, E158N, E158N + S160T, F167N, A177N, A177S, A177T, C182N, G189N, D193C, N196C, F197V, K201N, K206A, P207N, P207S, P207T, K210N, K210S, K210T, K210Y, V211G, S212N, L217N, A218N, L219V, S220N, L223S, L229H, Q230N, N231K, Q233S, Q233T, A234K, P236N, R242N, 1250S, 1250T, S251N, L252M, L255T, H256E, N2571, Q259S, Q259T, M263L, A264N, A264P, Y268C, Y268E, Y268N, G274C, Q292P, G293N, P297N, P297S, P300N, Q301L, G308S, H310N, T312D, T312N, I314E, 1314M, N316C, G322C, A323E, Q326S, Q326T, P331R, D332A, D332L, D332N, D332Q, P335C, P335S, P335T, G339C, V341E, E343A, E343G, D349N, D349S, D349T, Q352S, Q352T, A370D, E371S, E371T, K376S, P379L, P379S, P379T, A380S, A380T, G381S, D388C, E391N, S393G, G394S, G394T, et P414Q, les positions étant indiquées dans SEQ IDN°1.
4- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en K29, Q30, Y51, L52,G75, C81, V93, Q95, R98, L99, F129, H130, D140, T142, P155, F167, A177, G189, K201, K210, L219, I250, S251, L252, L255, M263, Y268, G274, Q292, G293, P297, G308, N316, Q326, D349, et E391, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1.
5- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon la revendication 4, caractérisé en ce que les substitutions sur les acides aminés K29, Q30, Y51, L52, G75, C81, V93, Q95, R98, L99, F129, H130, D140, D140N, T142, P155, F167, A177, G189, K201, K210, L219, I250, S251, L252, L255, M263, Y268, G274, Q292, G293, P297, G308, N316, Q326, D349, et E391, sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K29N, Q30D, Y51 G, Y51N, Y51 Q, Y51 W, L52G, G75R, C81N, V93G, Q95N, R98T, L99C, F129W, H130Y, D140F, D140N, T142N, P155N, P155T, F167N, A177N, A177S, A177T, G189N, K201N, 1(210N, K210S, L219V, 12505, I250T, S251N, L252M, L255T, M263L, Y268N, G274C, Q292P, G293N, P297N, G308S, N316C, Q326S, Q326T, D349S, D349T, et E391N, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1.
6- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1-5, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en G274C + N316C, T142N + A177T + Q326T, K210S + Y268E + Q292P, D140F + Y268E + Q292P, F167N + Y268E + Q292P, T142N + A177T + K210S + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T, T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T + G274C + N316C, les positions étant indiquées dans SEQ ID N° 1.
7- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N + A177T + K210S + Y268E + G274C + Q292P + N316C + Q326T, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1.
8- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N° 1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de substitutions consistant en T142N + A177T + K210S + Y268E + Q292P + Q326T, les positions étant indiquées dans SEQ ID N°1.
9- Variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°1 ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que sa séquence est SEQ ID N°1 avec la ou les substitutions sélectionnées.
10- Acide nucléique codant un variant amélioré d'une phytase selon l'une quelconque des revendications 1-9.
11- Cassette ou vecteur d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 10.
12- Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 10 ou un vecteur d'expression selon la revendication 11.
13- Composition comprenant au moins un variant amélioré d'une phytase dont la 15 séquence est SEQ ID N°1 avec la ou les substitutions sélectionnées ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon les revendications 1 à 9.
14- Utilisation d'un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°1 avec la ou les substitutions sélectionnées ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon les 20 revendications 1-9 pour la préparation d'un additif alimentaire.
15- Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 10, une cassette d'expression selon la revendication 11, ou d'une cellule selon la revendication 12 pour produire un variant amélioré d'une phytase dont la séquence est SEQ ID N°1 avec la ou les 25 substitutions sélectionnées ou un fragment fonctionnel de celui-ci selon les revendications 1 à9. 10