CN117616119A - 植酸酶变体 - Google Patents

植酸酶变体 Download PDF

Info

Publication number
CN117616119A
CN117616119A CN202280048612.0A CN202280048612A CN117616119A CN 117616119 A CN117616119 A CN 117616119A CN 202280048612 A CN202280048612 A CN 202280048612A CN 117616119 A CN117616119 A CN 117616119A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acids
variant polypeptide
substitutions
amino acid
phytase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280048612.0A
Other languages
English (en)
Inventor
卡里·云图宁
皮和拉·阿霍拉
斯文·本森
楞兹·洛伦兹
塔拉·美特兹格尔
伊姆克·奎恩
泰尔希·普拉宁
玛丽亚·帕洛黑莫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AB Enzymes Oy
Original Assignee
AB Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AB Enzymes Oy filed Critical AB Enzymes Oy
Priority claimed from PCT/FI2022/050464 external-priority patent/WO2023285736A1/en
Publication of CN117616119A publication Critical patent/CN117616119A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03008—3-Phytase (3.1.3.8)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

公开了一种具有改善的IP4降解活性的植酸酶变体、其制造方法、动物饲料、饲料补充剂、干制剂和液体制剂、降解植酸的方法、制造植酸酶变体的方法、制造饲料颗粒的方法以及经配置以产生至少一种多肽的重组宿主细胞，其中所述植酸酶变体包含氨基酸取代并且与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少80％氨基酸序列同一性。

Description

植酸酶变体
技术领域
本公开总体上涉及酶技术领域。本公开特别地但并非排他地涉及具有改善的IP4降解活性的植酸酶变体。本发明的植酸酶变体可用于需要降解植酸酯的各种应用中，如饲料中。
背景技术
本节说明了有用的背景信息，但不承认本文所述的任何技术代表现有技术水平。
发现植酸(植酸酯，肌醇六磷酸酯，IP6)在许多植物中起储存磷酸酯的作用。储存在IP6分子中的磷酸酯可以作为无机磷酸酯释放出来。当无机酸从肌肉肌醇六磷酸酯(IP6)中释放出来时，它首先转化为肌肉肌醇五磷酸酯(IP5)，然后经由肌肉肌醇四磷酸酯(IP4)、肌肉肌醇三磷酸酯(IP3)、肌肉肌醇二磷酸酯(IP2)转化为肌肉肌醇单磷酸酯(IP1)。
植酸酶是一组催化植酸水解的磷酸酶。市售植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶(HAP)蛋白家族。属于HAP蛋白家族的植酸酶具有保守N端活性位点七肽基序RHGXRXP和C端催化活性HD-二肽。组氨酸酸性磷酸酶是较大的组氨酸磷酸酶超家族的一部分。它们具有一个以组氨酸为中心的保守催化核心，所述组氨酸在反应过程中被磷酸化。PFAM基序His_Phos_2(PF00328)表示组氨酸磷酸酶超家族的分支2，该分支主要含有酸性磷酸酶和植酸酶。
植酸酶用于饲料中以通过植酸酯降解改善植物来源(例如小麦、大麦、玉米、大豆)饲料成分的磷酸酯利用率。这对单胃动物如家禽、鱼类和猪特别有意义，因为这些动物的上肠道中的肠道植酸酯降解是有限的。这种局限性不仅限制了磷的利用，而且由于肌醇磷酸酯(IP)，特别是高IP，即IP6、IP5和IP4的螯合作用，还限制了其它营养物质的利用率。因此，至少IP6至IP4应尽可能完全去磷酸化，但去磷酸化优选应当甚至继续至IP1，以进一步增加磷酸酯和其它营养物质的利用率。
植酸酯被植酸酶分解与IP6逐步降解为低级肌醇磷酸酯(IP5、IP4、IP3、IP2和IP1)有关。意料之中地，使用工业标准水平的植酸酶已显示显著降低了体外和体内的IP6水平。然而，随着IP6降解，在回肠食糜中检测到IP4和IP3增加，这表明第一磷酸酯基团水解切割不是植酸酯降解中的唯一限制性步骤(例如，Zeller等,2015；Menezes-Blackburn等,2015)。由于即使是这些低级肌醇磷酸酯也因与不同的营养物质如矿物质结合而具有抗营养特性(Xu等,1992)，因此动物饲养的目标是使IP酯降解，直至回肠末端(Bedford和Walk,2016)。旨在让肌醇完全释放的另一个原因是增加游离肌醇的含量已被证明能通过不同的机制改善动物的生长表现，这仍在研究中(Lee和Bedford,2016)。
动物肠道中在植酸酶补充后发生最佳肌醇磷酸酯降解的部位是胃，这是因为胃的pH低，导致底物(植酸酯)溶解度最佳。在胃中的停留时间很短，并且部分内容物可能会迅速冲到pH是中性的肠道中。因此，进一步开发对IP6、还有低级肌醇磷酸酯如IP4和IP3异构体快速地、更有效地起作用的植酸酶，对动物饲养行业具有重要意义。这些类型的植酸酶将进一步改善磷酸酯和肌醇的肠道利用率。
本公开的一个目标是提供表现出植酸酶活性并且具有改善的特性从而允许它们在工业过程中使用的植酸酶变体。本公开的另一个目标是提供可以在用于植酸酯降解的酶组合物中使用的植酸酶变体。
发明内容
独立权利要求定义了保护范围。说明书和/或附图中未被权利要求书涵盖的产品和/或方法的任何示例或技术说明，在本文中不是作为本发明的实施方式，而是作为背景技术或作为可用于理解所要求保护的发明的示例来提供。
根据第一方面，提供了一种变体多肽，所述变体多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述变体具有：
在第126位的氨基酸取代；
植酸酶活性；并且
其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。
有利地，与具有SEQ ID NO:1的亲本植酸酶和/或具有SEQ ID NO:2的植酸酶相比，本发明的变体多肽(在本文中也称为植酸酶变体)具有提高的IP4活性。发明人已经鉴定第126位对于提高IP4活性非常重要。本发明的植酸酶变体的IP4降解活性提高意味着所述变体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的植酸酶相比能够降解更多的IP4。提高的IP降解活性可以在需要将植酸降解为低级肌醇磷酸酯时使用，如用于饲料或食品应用中以发挥优势。如下面提供的实施例中所示，所要求保护的植酸酶变体具有与亲本植酸酶和/或具有SEQ IDNO:2的植酸酶相比提高的IP4降解活性。
在一个实施方式中，本发明的变体多肽与SEQ ID NO:1具有小于100％的序列同一性。
在本发明的变体多肽中，第126位被取代为另一个氨基酸，如组氨酸，并且任选地，至少一个其它氨基酸被取代。这导致IP4降解活性增加。作为第126位上的取代以外的取代的至少一个其它氨基酸取代可以选自表1中所示的位置。更优选地，所述至少一个其它氨基酸取代选自表1，使得即使当与其它取代一起存在于变体多肽中时，对于具有所述取代的变体来说，选自IP4降解活性、IP6降解活性、IP4和IP6降解活性以及IP4/IP6的至少一种特性与亲本植酸酶和/或具有SEQ ID NO:2的植酸酶相比也得到了提高。可以如实施例中所述来测量和比较IP6和IP4的降解活性。
在一个实施方式中，本发明的植酸酶变体至少具有IP4降解活性。
在一个实施方式中，本发明的植酸酶变体至少具有IP6降解活性。
在另一个实施方式中，所述变体多肽具有IP4降解活性和IP6降解活性。
在另一个实施方式中，与具有SEQ ID NO:2的植酸酶的IP4/IP6比相比，所述变体的IP4降解活性与其IP6降解活性之比为至少约1.05或在1至2范围内，如在1.05至2范围内，优选在1.05至1.9范围内，更优选在1.2至2范围内或在1.2至1.9范围内。在另一个实施方式中，与具有SEQ ID NO:2的植酸酶的IP4/IP6比相比，所述IP4/IP6比为约1.5、或约1.6、或约1.7、或约1.8。较大的IP4/IP6表示能够将IP降解为低级IP，这在饲料和食品应用中是有用的。
在一个实施方式中，提供了本发明的植酸酶变体的功能片段，所述功能片段具有植酸酶活性。
在一个实施方式中，所述变体多肽在第126位上具有组氨酸，即，第126位可以被取代为组氨酸。
在一个实施方式中，所述变体多肽在选自第121位、第204位、第212位、第216位和第258位的位置上包含至少一个其它氨基酸取代。可以人工地对所述变体多肽进行取代，如通过基因工程改造。
在一个实施方式中，所述变体多肽是大肠杆菌(E.coli)6-植酸酶。根据该实施方式，本发明的变体多肽的氨基酸序列衍生自大肠杆菌6-植酸酶或其变体。第126位上的氨基酸可以天然为组氨酸，或者它从大肠杆菌6-植酸酶中存在的另一个氨基酸取代为组氨酸。
在一个实施方式中，所述至少一个其它氨基酸取代导致存在以下氨基酸中的至少一个：121K、204N/T、212G、216T和258N/A。所述变体多肽被如此修饰，以使它含有至少一个如上所述的氨基酸。
在一个实施方式中，所述至少一个其它氨基酸取代是选自P121K、D204N/T、S212G、M216T和Q258N/A的取代。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含以下氨基酸：
a.126H；以及
b.选自以下的至少一个氨基酸：121K、204N/T、212G、216T和258N/A。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含以下氨基酸取代：
a.N126H；以及
b.选自以下的至少一个氨基酸取代：P121K、D204N/T、S212G、M216T和Q258N/A。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含氨基酸取代P121K、N126H、D204N、W211V、S212G、M216T和V253Y。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含氨基酸取代P121K、N126H、D204T、W211V、S212G、M216T和V253Y。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含氨基酸取代P121K、N126H、D204N/T、W211V、S212G、M216T、V253Y和Q258N/A。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含：
a.氨基酸126H和204N/T，优选取代N126H和D204N/T；或
b.氨基酸126H和212G，优选取代N126H和S212G；或
c.氨基酸126H和258A/N，优选取代N126H和Q258A/N；或
d.氨基酸126H、204N和212G，优选取代N126H、D204N和S212G；或
e.氨基酸126H、204N和258N，优选取代N126H、D204N和Q258N；或
f.氨基酸126H、204T和212G，优选取代N126H、D204T和S212G；或
g.氨基酸126H、212G和258N，优选取代N126H、S212G和Q258N；或
h.氨基酸121K、126H和216T，优选取代P121K、N126H和M216T；或
i.氨基酸126H、204T、212G和258N，优选取代N126H、D204T、S212G和Q258N；或
j.氨基酸121K、126H、204N、212G和216T，优选取代P121K、N126H、S212G和M216T。
在一个实施方式中，所述变体多肽包含选自以下的取代：
a.氨基酸126H、204N、258N，优选取代N126H、D204N和Q258N；或
b.氨基酸126H、204T和212G，优选取代N126H、D204T和S212G；或
c.氨基酸126H、212G和258A，优选取代N126H、S212G和Q258A；或
d.氨基酸121K、126H、204T和216T，优选取代P121K、N126H、D204T和M216T；或
e.氨基酸121K、126H、216T和258N，优选取代P121K、N126H、M216T和Q258N；或
f.氨基酸126H、204N、212G和258A，优选取代N126H、D204N、S212G和Q258A；或
g.氨基酸126H、204T、212G、258N，优选取代N126H、D204T、S212G和Q258N；或
h.氨基酸121K、126H、204N、212G和216T，优选取代P121K、N126H、S212G和M216T；或
i.氨基酸121K、126H、204N、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204N、M216T和Q258A；或
j.氨基酸121K、126H、204N、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204N、M216T和Q258N；或
k.氨基酸121K、126H、204T、212G和216T，优选取代P121K、N126H、D204N、S212G和M216T；或
l.氨基酸121K、126H、204T、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204T、M216T和Q258A；或
m.氨基酸121K、126H、204T、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204T、M216T和Q258N；或
n.氨基酸121K、126H、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、S212G、M216T和Q258A；或
o.氨基酸121K、126H、212G、216T和258N，优选取代P121K、N126H、S212G、M216T和Q258N；或
p.氨基酸121K、126H、204N、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204N、S212G、M216T和Q258A；或
q.氨基酸121K、126H、204T、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204T、S212G、M216T和Q258A；或
r.氨基酸121K、126H、204T、212G、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204T、S212G、M216T和Q258N；或
s.表1所示的一组氨基酸取代。
在一个实施方式中，所述变体多肽在第204位上具有天冬酰胺或苏氨酸。
在一个实施方式中，所述变体多肽还包含氨基酸121K、126H、216T和258N/A；优选氨基酸取代P121K、N126H、M216T和Q258N/A。
在一个实施方式中，所述变体多肽还包含氨基酸75C/V、114T、137E、141T、142D、146R、157G、204C、211W、253Q、267R和341P；或氨基酸D35Y、G70E、S80P、T161P、N176P、L179F、K180N、S187P、K276M、T277A、E315G和A380P。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2相比，所述变体多肽具有增加的IP4降解活性和/或具有高于1.3的IP4与IP6活性比。因此，可以在本发明要求保护的位置上使用取代来改变所述变体多肽的酶活性，以使它对IP4底物具有更大的活性。此外，本发明的变体多肽可以具有IP6降解活性。
相对IP4降解活性增加意味着更高的特异性IP4降解活性(每mg植酸酶蛋白的IP4活性更高)，培养后废培养基中的IP4降解植酸酶浓度更高，具有IP4降解活性的蛋白质更稳定，或这些的任何组合。因此，本发明的变体多肽的相对IP4降解活性增加可以例如在用于降解肌醇磷酸酯的组合物中，特别是在需要将肌醇磷酸酯降解为低级肌醇磷酸酯的情况下使用以发挥优势。本文对相对IP6降解活性给出了相应的解释。
根据第二方面，提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含允许产生至少一种变体多肽的遗传元件，其中所述宿主细胞优选地选自：
a.丝状真菌细胞，来自子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)；优选来自粪壳菌纲(Sordariomycetes)或散囊菌纲(Eurotiomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)或粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)或散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)或粪壳菌目(Sordariales)或散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌科(Hypocreacea)或赤壳菌科(Nectriacea)或毛壳菌科(Chaetomiaceae)或曲霉菌科(Aspergillaceae)、木霉菌属(Trichoderma)(无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))或镰刀菌属(Fusarium)或枝顶孢霉属(Acremonium)或腐质霉属(Humicola)或嗜热疣霉属(Thermothelomyces)或毁丝霉属(Myceliophthora)或曲霉属(Aspergillus)的成员；
更优选地来自物种里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocreajecorina))、桔绿木霉(T.citrinoviridae)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾谷镰孢霉(F.gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F.pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F.venenatum)、产黄枝顶孢霉(头孢霉)(Acremonium(Cephalosporium)chrysogenum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、灰腐质霉(H.grisea)、嗜热嗜热疣霉(Thermothelomycesthermophilus)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉泡盛变种(A.niger var.awamori)和米曲霉(A.oryzae)；
b.细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌目如链霉菌属(Streptomyces sp.)，以及
c.酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；并且
更优选地，所述宿主细胞选自丝状真菌细胞如木霉菌属或选自革兰氏阳性芽孢杆菌如芽孢杆菌属(Bacillus)；
最优选地选自里氏木霉或枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
根据第三方面，提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含经配置以产生至少一种本公开的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞是转基因植物细胞。
根据可选的第三方面，提供了一种酶组合物，所述酶组合物包含本发明的变体多肽。
根据第四方面，提供了一种本发明的多肽变体或本发明的酶组合物在制造饲料或食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物中的用途。
根据第五方面，提供了一种制造本发明的变体多肽的方法，所述方法包括：
a.提供多核苷酸，所述多核苷酸包含被安排用于产生本发明的变体的遗传元件；以及
b.在重组宿主细胞中，优选在本发明的重组宿主细胞中表达所述多核苷酸。
根据第六方面，提供了一种动物饲料，所述动物饲料包含本发明的变体多肽或本发明的酶组合物，以及至少一种植物来源的蛋白质源，以及
a.任选地，至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的其它酶；以及
b.任选地，至少一种选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合的填充剂。
根据第七方面，提供了一种饲料补充剂，所述饲料补充剂包含本发明的变体多肽或本发明的酶组合物；以及
a.任选地，至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的其它酶；以及
b.任选地，至少一种选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠、矿物质、氨基酸、益生元、益生菌、维生素或其组合的载剂(carrier)或成分。
根据第八方面，提供了一种降解或修饰含有植酸和/或植酸酯的材料的方法，所述方法包括用有效量的本发明的变体多肽或本发明的酶组合物处理所述材料。
附图说明
将参考附图描述一些示例性实施方式，其中：
图1示出了用于转化里氏木霉以表达亲本植酸酶(SEQ ID NO:1)和植酸酶变体基因(phy)的表达质粒的示意图片。重组基因在宿主细胞中的表达通过使用以下遗传元件进行控制：用于转录起始的里氏木霉cbh1(Pcbh1)启动子和用于转录终止的里氏木霉cbh2(Tcbh2)终止子。使用编码CBHIICBM和连接区的里氏木霉cbh2载剂(载剂)代替天然植酸酶信号序列，并且在编码的载剂多肽与植酸酶之间包括Kex2蛋白酶切割位点(kex2)。包括编码AmdS标记物的合成基因(amdS)以选择转化体，并任选地使用里氏木霉cbh1 3'和5'侧翼区域(分别为cbh1-3'和cbh1-5')使表达盒靶向cbh1基因座。载体(vector)部分(载体)衍生自pUC19。使用Sci-Ed软件的Clone Manager Professional 9生成图片。图片中示出了限制酶位点的选择。
图2概述了在肌醇磷酸酯降解方面改善的所选植酸酶变体的体外测试(GIT)结果。将用被测植酸酶处理玉米-豆粕后IP6+IP5+IP4的总和的残余量与没有任何植酸酶(空白)或添加相同活性的植酸酶SEQ ID NO:2的这些肌醇磷酸酯残余量进行比较。植酸酶的投加量分别是每kg玉米-豆粕混合物250FTU和500FTU。
图2A示出了添加250FTU/kg和500FTU/kg时，在体外处理(GIT)玉米-豆粕混合物后，IP6至IP4的总和与SEQ ID NO:2植酸酶相比被变体01107稍微进一步降解。
图2B示出了添加250FTU/kg和500FTU/kg时，在体外处理(GIT)玉米-豆粕混合物后，IP6至IP4的总和与SEQ ID NO:2植酸酶相比被变体01134进一步降解。
图2C示出了添加250FTU/kg和500FTU/kg时，在体外处理(GIT)玉米-豆粕混合物后，IP6至IP4的总和与SEQ ID NO:2植酸酶相比被变体01135进一步降解，
图2D示出了添加250FTU/kg和500FTU/kg时，在体外处理(GIT)玉米-豆粕混合物后，IP6至IP4的总和与SEQ ID NO:2植酸酶相比被变体01135进一步降解。
序列表
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2相比具有以下两个氨基酸取代的无信号肽亲本植酸酶氨基酸序列：211V和253Y
SEQ ID NO:2无信号肽亲本植酸酶氨基酸序列
具体实施方式
如本文所用，术语“植酸酶”意指能够将植酸酶促降解为低级肌醇磷酸酯的酶。
植酸酶基于它们优选引发磷酸酯水解的肌醇环上碳位置分类为3-植酸酶、5-植酸酶或6-植酸酶(分别为EC 3.1.3.8、EC 3.1.3.72和EC 3.1.3.26)。6-植酸酶优选首先除去C6位置上的磷酸酯基团。
本发明还涉及包含编码根据第一方面的植酸酶变体多肽的核酸序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，所述包含植酸酶变体的多肽包含选自信号序列、分泌序列、载剂多肽、结合结构域、标签、接头、酶或其任何组合的至少一个其它氨基酸序列。
术语“植酸酶变体”、“植酸酶的变体”或“变体多肽”意指通过定点或随机诱变、插入、取代、缺失、重组和/或任何其它蛋白质工程改造方法(所述方法导致基因修饰的植酸酶在其氨基酸序列方面与亲本植酸酶如野生型植酸酶不同)得到的植酸酶分子。根据本公开的术语“野生型植酸酶”、“野生型酶”、“野生型”或“wt”描述了具有自然界中发现的氨基酸序列的植酸酶或其片段。可以合成变体编码基因或使用基因法修饰亲本基因，例如通过定点诱变，这是一种在编码亲本多肽的多核苷酸中的一个或多个定义位点上引入一个或多于一个突变的技术。术语变体植酸酶还可以通过使用实施例和表格中给予变体的名称来指代。
如本文所用，术语“成熟多肽”意指其中至少一个信号序列或信号肽或信号肽和推定前肽或载剂肽或融合搭配物被切割掉的任何多肽。如本文所用，“肽”和“多肽”是包括多个连续聚合氨基酸残基的氨基酸序列。为了本发明的目的，肽是包括至多20个氨基酸残基的分子，并且多肽包括超过20个氨基酸残基。所述肽或多肽可以包括修饰的氨基酸残基、并非由密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。如本文所用，“蛋白”可以指任何大小的肽或多肽。蛋白可以是酶、蛋白质、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其它蛋白。
如本文所用，“序列同一性”意指两个最佳对齐序列之间的氨基酸残基的精确匹配数相对于两个序列中都存在的残基的位置数的百分比。当一个序列具有在另一个序列中没有对应残基的残基时，对齐方案允许在对齐中的空位，并且该位置不算入同一性计算的分母中。
如本文所用，氨基酸序列的“序列对齐”意指使用如Sievers等2011所述的ClustalOmega(1.2.4)多重序列对齐方案(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和使用默认设定对齐序列。
除非另外规定，否则所有提及某一氨基酸位置的情况都是指SEQ ID NO:1的所述位置上的氨基酸，或与SEQ ID NO:1对齐的氨基酸序列的相应位置上存在或缺失的氨基酸。
如本文所用，术语“二硫桥”或“二硫键”或“SS桥”是指多肽或蛋白质中半胱氨酸残基的硫原子之间形成的键。二硫桥可以是天然存在或非天然存在的，并且是例如通过氨基酸取代的方式引入。
如本文所用，术语“相应位置”或“相应的氨基酸位置”意指根据所识别的相似性或同一性区域将至少两个氨基酸序列对齐为成对对齐或多序列对齐，从而将相应的氨基酸配对。在本公开中，相应的位置通常是指与SEQ ID NO:1中的位置相对应的位置。
如本文所用，“氨基酸取代”意指用在该特定替换位置上与原始氨基酸不同的氨基酸残基进行氨基酸残基替换。术语“氨基酸取代”可以指保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代，这意味着氨基酸残基被替换为与该位置上的原始氨基酸残基具有相似侧链(保守)或不同侧链(非保守)的氨基酸残基。
术语“功能片段”意指当前变体的保留大致相同的酶功能或效果的片段或部分。
术语“分泌信号序列”或“信号序列”或“分泌肽”是指作为较大多肽的组成部分或一部分并指导所述较大多肽通过产生它的宿主细胞的分泌途径的氨基酸序列。分泌信号序列可以是天然的，或者它可以从另一个来源获得。取决于宿主细胞，较大的多肽可以在转运过程中通过分泌途径从分泌肽中切割出来，从而形成缺乏分泌肽的成熟多肽。
术语载剂多肽或融合搭配物是指目标蛋白质(植酸酶)被翻译融合至其中以提高收率的多肽。载剂/融合搭配物可以与其原始生产宿主同源或异源，并且可以是全长蛋白质或蛋白质片段(例如，核心、CBM或CBM和接头区域)。它优选由具有良好表达水平的基因或核苷酸序列编码。
如本文所用，“植酸酶活性”是指植酸降解活性。实施例3和实施例4提供了测定植酸酶活性的方法的实施例。因此，IP4活性是指降解IP4的能力，并且IP6活性是指降解IP6的能力。IP4降解活性与IP6降解活性之比在本文中有时公开为与具有SEQ ID NO:2的植酸酶的IP4/IP6比相比的IP4/IP6。IP4降解活性和IP6降解活性可以如实施例中所述进行测定。
在一个实施方式中，术语“酶组合物”意指酶促发酵产物，可能经过分离和纯化，通常由微生物的纯培养物产生。酶组合物通常包含由微生物产生的许多不同的酶活性。在另一个实施方式中，酶组合物是单组分酶、优选通过使用常规重组生产技术由细菌或真菌物种衍生的酶的混合物。酶组合物可以含有例如稳定剂和防腐剂，由此防止微生物生长并改善储存稳定性。
如本文所用，“宿主细胞”意指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、交配、杂交、CRISPR-Cas等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生突变而不相同的任何后代。宿主细胞的非限制性实例是真菌细胞，优选丝状真菌细胞(例如木霉菌属或里氏木霉、曲霉属或米曲霉或黑曲霉、嗜热疣霉属或异宗嗜热疣霉(Thermothelomyces heterothallica)、毁丝霉属或嗜热毁丝霉、或者腐质菌属或特异腐质霉或者镰刀菌属或威尼斯镰刀菌(Fusarium venenatum))；细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)、放线菌目(例如链霉菌属、弯曲野野村氏菌(Nonomuraea flexuosa))和酵母(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶氏酵母)。
在另一个实施方式中，所述植酸酶变体通过在植物细胞中，即在转基因植物中重组生产而得到。
所述重组宿主细胞可用于产生植酸酶变体并含有编码所述植酸酶变体的多核苷酸。所述重组宿主细胞可以可操作地连接到一个或多个控制序列，所述控制序列指导变体生产，并且可以通过刺激启动本发明的植酸酶变体的生产，如本领域已知。所述重组宿主细胞还可用于制备具有不同性质的变体。例如，可以选择宿主细胞，它提供有利于稳定性或活性的翻译后修饰，或者它有利于宿主细胞中产生的变体的后处理。
在一个实施方式中，所述宿主细胞是非致病性的。这对于将宿主细胞或在其中产生的植酸酶变体用于动物饲料中特别有利。
在一个实施方式中，含有植酸酶变体的组合物是食物或饲料，并且它还可以包含含有植酸的植物材料。
在一个实施方式中，所述组合物是食品添加剂或饲料添加剂，所述食品添加剂或饲料添加剂还包含以下各项中的至少一种：至少一种痕量矿物质、至少一种氨基酸特别是赖氨酸、水溶性维生素、脂溶性维生素、益生元和益生菌。
在一个实施方式中，所述组合物是符合欧洲议会和理事会2003年9月22日关于用于动物营养的添加剂的法规(EC)第1831/2003号的要求的食品添加剂或饲料添加剂。
在一个实施方式中，所述组合物是液体组合物或固体组合物的形式，如溶液、分散体、糊状物、团粒、粉末、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、晶体、晶体浆液、凝胶、挤出物、沉淀物、预混物或其组合。
术语“启动子”是指含有提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常但并非总是存在于基因的5'非编码区中。
术语“前肽”或“前-肽”是在成熟或激活过程中被切割的蛋白质的一部分。一旦被切割后，前肽通常没有独立的生物学功能。
如本文所用，术语“结构域”和“区域”可以与术语“模块”互换使用。
以下缩写用于氨基酸：
A Ala丙氨酸
C Cys半胱氨酸
D Asp天冬氨酸
E Glu谷氨酸
F Phe苯丙氨酸
G Gly甘氨酸
H His组氨酸
I Ile异亮氨酸
K Lys赖氨酸
L Leu亮氨酸
M Met甲硫氨酸
N Asn天冬酰胺
P Pro脯氨酸
Q Gln谷氨酰胺
R Arg精氨酸
S Ser丝氨酸
T Thr苏氨酸
V Val缬氨酸
W Trp色氨酸
Y Tyr酪氨酸
X Xaa上述氨基酸中的任一种
本文通过使用以下命名法描述取代：蛋白质支架，即亲本序列中的氨基酸残基；位置；取代的氨基酸残基。根据这种命名法，例如，第23位上的单个丙氨酸残基取代为酪氨酸残基表示为Ala23Tyr或A23Y。第23位上的任何氨基酸取代为酪氨酸表示为Xaa23Tyr或X23Y或23Y。第179位上的酪氨酸取代为苯丙氨酸、色氨酸或亮氨酸表示为Y179F/W/L。
如本文所用，术语“包含”包括“包括”、“含有”和“涵盖”的较广泛含义，以及较窄的表述“由...组成”和“仅由...组成”。
如本文所用，术语“表达”包括参与在宿主细胞中产生多肽的任何步骤或所有步骤，包括但不限于转录、翻译、翻译后修饰和分泌。表达之后可以是收获(即，回收)宿主细胞或表达产物。
在一个实施方式中，所述植酸酶变体具有植酸酶活性以及与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述变体多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸不具有100％序列同一性。在一个实施方式中，所述变体多肽的氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1。在一个替代实施方式中，所述变体多肽的氨基酸编号部分对应于SEQ ID NO:1。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述变体多肽中的氨基酸取代的总数为至少2个。所述至少一个其它氨基酸可以选自本文公开的位置。在另一个实施方式中，取代的总数为至少5、至少10、至少15、至少20或至少25；或者5、10、15、20或25。在一个实施方式中，在氨基酸序列的非保守区域中进行一个或多个取代。在另一个实施方式中，所述变体多肽包含任何权利要求所述的取代以及在氨基酸序列的非保守区域中的其它取代。这些其它取代对性质的影响可以如实施例中所述进行分析。
在一个实施方式中，所述变体多肽或所述功能片段具有在40与60kDa之间、优选在43至55kDa之间的预测分子量。预测分子量可以通过计算所述变体多肽或其功能片段中个别氨基酸的分子量的总和来确定。当所述变体多肽的预测分子量在上述范围内时，所述变体多肽的结构可能与进行取代的亲本序列相似。
在一个实施方式中，所述组合物以液体组合物或固体组合物的形式提供，如溶液、分散体、糊状物、粉末、颗粒、颗粒状、包衣颗粒、片剂、饼、晶体、晶体浆液、凝胶或团粒。
在一个实施方式中，所述植酸在含有植酸的基于植物的材料或部分基于植物的材料中降解。
在一个实施方式中，本发明的植酸酶变体用于动物饲料中，并且所述动物是反刍动物或非反刍动物。在另一个实施方式中，所述动物是牛属动物如肉牛或奶牛、绵羊或山羊。在另一个实施方式中，所述非反刍动物包括家禽(如肉鸡、蛋鸡和火鸡以及鸭)；猪(如仔猪、生长猪和母猪)；鱼(如鲑鱼、鲤鱼、罗非鱼和鲶鱼)和甲壳动物。在一个实施方式中，所述饲料是意在喂给动物的动物饲料，如任何复合饲料或混合物。在另一个实施方式中，饲料包含以下或由以下组成：谷物如玉米、小麦、燕麦、大麦、高粱和水稻；蛋白质源，如豆粕、向日葵粕和芥花粕；以及矿物质。与不使用所述变体的饲料相比，使用本发明的变体的饲料具有提高的营养价值。本发明的组合物和本发明的植酸酶变体能降解饲料的植酸，从而提高其对动物的营养价值。使用本发明的植酸酶变体或本发明的组合物的动物饲料可以配制成湿组合物或干组合物的形式。
下列编号条款中还公开了实施方案和实施方式：
第1条.一种变体多肽，所述变体多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述变体具有：
在第126位的氨基酸取代；
植酸酶活性；并且
其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。
第2条.根据第1条所述的变体多肽，所述变体多肽在第126位上具有组氨酸，即，它具有126His取代。
第3条.根据第1条或第2条所述的变体多肽，所述变体多肽在选自第121位、第204位、第212位、第216位和第258位的位置上包含至少一个其它氨基酸取代。
第4条.根据第3条所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代导致存在以下氨基酸中的至少一个：121K、204N/T、212G、216T和258N/A。
第5条.根据第3条至第4条中任一条所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代是选自P121K、D204N/T、S212G、M216T和Q258N/A的取代。
第6条.根据第1条至第5条中任一条所述的变体多肽，其中所述变体多肽是大肠杆菌6-植酸酶。
第7条.根据第1条至第6条中任一条所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含以下氨基酸：
126H；以及
选自以下的至少一个氨基酸：121K、204N/T、212G、216T和258N/A。
第8条.根据第1条至第7条中任一条所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含以下氨基酸取代：
N126H；以及
选自以下的至少一个氨基酸取代：P121K、D204N/T、S212G、M216T和Q258N/A。
第9条.根据第1条至第8条中任一条所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含：
氨基酸126H和204N/T，优选取代N126H和D204N/T；或
氨基酸126H和212G，优选取代N126H和S212G；或
氨基酸126H和258A/N，优选取代N126H和Q258A/N；或
氨基酸126H、204N和212G，优选取代N126H、D204N和S212G；或
氨基酸126H、204N和258N，优选取代N126H、D204N和Q258N；或
氨基酸126H、204T和212G，优选取代N126H、D204T和S212G；或
氨基酸126H、212G和258N，优选取代N126H、S212G和Q258N；或
氨基酸121K、126H和216T，优选取代P121K、N126H和M216T；或
氨基酸126H、204T、212G和258N，优选取代N126H、D204T、S212G和Q258N；或
氨基酸121K、126H、204N、212G和216T，优选取代P121K、N126H、S212G和M216T。
第10条.根据第1条至第9条中任一条所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含：
氨基酸126H、204N、258N，优选取代N126H、D204N和Q258N；或
氨基酸126H、204T和212G，优选取代N126H、D204T和S212G；或
氨基酸126H、212G和258A，优选取代N126H、S212G和Q258A；或
氨基酸121K、126H、204T和216T，优选取代P121K、N126H、D204T和M216T；或
氨基酸121K、126H、216T和258N，优选取代P121K、N126H、M216T和Q258N；或
氨基酸126H、204N、212G和258A，优选取代N126H、D204N、S212G和Q258A；或
氨基酸126H、204T、212G、258N，优选取代N126H、D204T、S212G和Q258N；或
氨基酸121K、126H、204N、212G和216T，优选取代P121K、N126H、S212G和M216T；或
氨基酸121K、126H、204N、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204N、M216T和Q258A；或
氨基酸121K、126H、204N、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204N、M216T和Q258N；或
氨基酸121K、126H、204T、212G和216T，优选取代P121K、N126H、D204N、S212G和M216T；或
氨基酸121K、126H、204T、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204T、M216T和Q258A；或
氨基酸121K、126H、204T、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204T、M216T和Q258N；或
氨基酸121K、126H、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、S212G、M216T和Q258A；或
氨基酸121K、126H、212G、216T和258N，优选取代P121K、N126H、S212G、M216T和Q258N；或
氨基酸121K、126H、204N、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204N、S212G、M216T和Q258A；或
氨基酸121K、126H、204T、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204T、S212G、M216T和Q258A；或
氨基酸121K、126H、204T、212G、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204T、S212G、M216T和Q258N；或
表1所示的一组氨基酸取代。
第11条.根据第1条至第10条中任一条所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含氨基酸121K、126H、216T和258N/A；优选氨基酸取代P121K、N126H、M216T和Q258N/A。
第12条.根据第1条至第11条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽还包含氨基酸75C/V、114T、137E、141T、142D、146R、157G、204C、211W、253Q、267R和341P；或D35Y、G70E、S80P、T161P、N176P、L179F、K180N、S187P、K276M、T277A、E315G和A380P。
第13条.根据第1条至第12条中任一条所述的变体多肽，与SEQ ID NO:2相比，所述变体多肽具有增加的IP4降解活性和/或具有高于1.3的IP4与IP6活性比。
第14条.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含允许产生至少一种根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽的遗传元件，其中所述宿主细胞优选地选自：
丝状真菌细胞，来自子囊菌门盘菌亚门；优选来自粪壳菌纲或散囊菌纲、肉座菌亚纲或粪壳菌亚纲或散囊菌亚纲、肉座菌目或粪壳菌目或散囊菌目、肉座菌科或赤壳菌科或毛壳菌科或曲霉菌科、木霉菌属(无性型肉座菌属)或镰刀菌属或枝顶孢霉属或腐质霉属或嗜热疣霉属或毁丝霉属或曲霉属的成员；
更优选地来自物种里氏木霉(红褐肉座菌)、桔绿木霉、长枝木霉、绿木霉、哈茨木霉、棘孢木霉、深绿木霉、近里氏木霉、尖镰孢霉、禾谷镰孢霉、假禾谷镰孢霉、镶片镰孢霉、产黄枝顶孢霉(头孢霉)、特异腐质霉、灰腐质霉、嗜热嗜热疣霉、嗜热毁丝霉、黑曲霉、黑曲霉泡盛变种和米曲霉；
细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌目如链霉菌属，以及
酵母，如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶氏酵母；并且
更优选地，所述宿主细胞选自丝状真菌细胞如木霉菌属或选自革兰氏阳性芽孢杆菌如芽孢杆菌属；
最优选地选自里氏木霉或枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
第15条.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含经配置以产生至少一种根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞是转基因植物细胞。
第16条.一种酶组合物，所述酶组合物包含根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽。
第17条.一种根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽或根据第16条所述的酶组合物在制造饲料或食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物中的用途。
第18条.一种制造根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽的方法，所述方法包括：
提供多核苷酸，所述多核苷酸包含被安排用于产生根据第1条至第13条所述的变体的遗传元件；以及
在重组宿主细胞中，优选在根据第14条或第15条所述的重组宿主细胞中表达所述多核苷酸。
第19条.一种动物饲料，所述动物饲料包含根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽或根据第16条所述的酶组合物，以及至少一种植物来源的蛋白质源，以及
任选地，至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的其它酶；以及
任选地，至少一种选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合的载剂或成分。
第20条.一种饲料补充剂，所述饲料补充剂包含根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽或根据第16条所述的酶组合物；以及
a.任选地，至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的其它酶；以及
b.任选地，至少一种选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠、矿物质、氨基酸、益生元、益生菌、维生素或其组合的载剂或成分。
第21条.一种降解或修饰含有植酸或植酸酯的材料的方法，所述方法包括用有效量的根据第1条至第13条中任一条所述的变体多肽或根据第16条所述的酶组合物处理所述材料。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步公开本发明。
实施例1.IP4活性提高的变体的计算设计
IP4活性提高的变体的计算设计
根据Ariza等,2013(doi:10.1371/journal.pone.0065062)构建了6-植酸酶的最可能IP4中间体的分子结构，即在第1位、第2位、第3位和第4位具有磷酸酯的IP4(IP41,2,3,4)、在第1位、第2位、第5位和第6位具有磷酸酯的IP4(IP41,2,5,6)以及在第1位、第2位、第4位和第6位具有磷酸酯的IP4(IP41,2,4,6)。除去6-植酸酶结构模型中不是蛋白质链的一部分的所有原子，并根据pH 5.0加氢。对于每一种所制备的IP4中间体，通过在酶的底物腔附近添加相应的IP4中间体并用水和离子填充模拟框来构建溶剂化中和系统。然后如上所述使各个如此构建的系统在室温和1巴压力下平衡。用加速分子动力学方法从平衡的系统中对酶-底物相互作用进行取样。对于每一个如此生成的模拟轨迹，基于植酸酶反应机制的基本原理知识得到了生产性和非生产性酶-底物构象的分布。通过几何标准分析底物腔中的所有位置，得到可能减少非生产性结合构象并可能增强生产性结合构象的氨基酸取代候选物(取代候选物)。对于每一种如此得到的取代候选物，如上所述构建、平衡、模拟和分析系统，以产生生产性和非生产性结合构象的分布。取代候选物依据其在生产性构象与非生产性构象之比方面的改善进行排序，并选择最有希望的候选物进行实验表征。表1中详述了设计的植酸酶变体。
表1.计算设计和模拟中设计的以及被选择用于生产和表征的植酸酶变体的列表。氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1中示出的成熟亲本植酸酶分子的氨基酸编号。
实施例2.植酸酶变体的生产
在大肠杆菌转化、测序等中使用标准分子生物学方法对DNA进行分离和酶处理(例如，分离质粒DNA、消化DNA以产生DNA片段)。所使用的基本实验室方法要么如酶、试剂或试剂盒制造商所述，要么如标准分子生物学手册(例如Sambrook和Russell(2001))所述，要么如以下实施例中所述。
编码所设计的植酸酶变体的植酸酶基因(实施例1，表1)作为合成基因订购，其使用经优化以便制备转化体并在里氏木霉中表达的密码子。
使用里氏木霉cbh2(cel6A)的载剂多肽(CBM和接头)编码序列，由里氏木霉cbh1(cel7A)启动子表达构建体中的植酸酶。如Paloheimo等,2003所述，在载剂多肽与植酸酶之间包括Kex2蛋白酶切割位点。使用cbh2终止子终止转录，然后通过合成amdS标记基因进行构建。此外，所述构建体含有cbh1 3'和5'侧翼区域，以便任选地使表达载体靶向cbh1基因座(图1)。
在里氏木霉原生质体中转化圆形表达质粒。在含有乙酰胺作为唯一氮源的平板上选择转化体。所使用的宿主菌株缺乏四种主要的内源里氏木霉纤维素酶：CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A。根据等,1987与Karhunen等,1993所述的修改进行转化。或者，可以使用CRISPR-Cas技术进行转化。
转化体在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上产孢，然后进行培养。
在96孔板上培养转化体(Havukainen等,2020)，以分析转化体的植酸酶产生。如实施例3所述，从作为植酸钠释放的无机磷酸酯的培养物上清中测量重组变体植酸酶的植酸酶活性。还通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从培养上清液检测重组蛋白的产生。
所有转化体都产生植酸酶活性。产生具有最高植酸酶活性的变体植酸酶的转化体和产生亲本植酸酶的参考菌株在选择板上通过单个分生孢子进行纯化，然后使它们在PDA上产孢。经过纯化、选择的转化体在摇瓶和/或生物反应器中的复杂纤维素酶诱导培养基中进行培养，得到的材料用于进一步表征和应用测试。
实施例3.植酸酶活性测定
如下所述，使用IP6和分离的IP4形式作为底物对培养物上清液进行植酸酶活性分析。
分析中使用的植酸十二钠盐(IP6)购自LabChem(C6H6Na12O24P6，EE05501)。主要生成IP4特异性异构体级分的方法分4步进行。第一步，如Greiner和Konietzky,(1996)所述，将Quantum Blue植酸酶固定在来自General Electric(Boston，美国)的5ml HiTrap NHS活化琼脂糖柱上。第二步，固定的植酸酶在0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0中降解IP6，逐步降解为低级肌醇磷酸酯。5ml/min的流速得到了最高部分的IP4。下一步用于从溶液中除去磷酸酯，并将IP4与其它不需要的肌醇磷酸酯分离。因此，用所产生的肌醇磷酸酯混合物装载含有Bio-Rad公司(Hercules，美国)的AG1-x4树脂的手工填充阴离子交换柱，并用0.5M HCl洗脱IP4。在最后一步，用旋转蒸发器除去HCl，并将IP4重新溶解在水中。
如下使用自动化工作站(Tecan基团有限公司，瑞士)筛选微量滴定板培养样品(实施例2)的活性。将用于测定的样品稀释在含有0.01％ Tween 20(Merck 822184)的0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)中。还向底物溶液中加入0.01％ Tween20。此分析中使用的底物浓度是6.35mM。将200μl样品稀释液与200μl底物混合并在37℃温育。温育恰好15分钟后，向混合物中加入400μl 15％(w/v)TCA溶液(三氯乙酸，CCl3COOH，Merck 807)以终止反应。将25μl反应混合物移入另一个孔中并加入225μl水以进行1:10稀释。加入250μl显色试剂，所述显色试剂由三体积1M硫酸(H2SO4，Merck 731)、一体积2.5％(w/v)钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O，Merck 1182)和一体积10％(w/v)抗坏血酸(C6H8O6，AnalaR Normapur 20150)组成，并在50℃将显色反应温育20分钟。温育后，在820nm下测量吸收。将样品的吸光度与参考样品SEQ ID NO:2的吸光度进行比较。
使用植酸酶活性测定法(PPU)分析摇瓶和发酵培养物(实施例2)的活性。在PPU分析中，一个活性单位是在pH 4.0和37℃下、在15分钟反应时间内，每一分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷酸酯的酶的量。此分析中使用的底物浓度是12.7mM。
将用于测定的样品稀释在反应缓冲液(0.2M柠檬酸盐缓冲液，pH4.0)中，并使用1ml酶溶液进行分析。将1ml底物加入酶溶液中并在37℃将混合物温育恰好15分钟后，通过加入2ml 15％(w/v)TCA溶液(三氯乙酸，Merck 807)来终止反应。将反应混合物冷却至室温，然后通过在试管中混合0.2ml混合物与1.8ml水来进行该1:10稀释。向管中加入2.0ml新制显色试剂并混合。显色试剂由三体积1M硫酸(H2SO4，Merck 731)、一体积2.5％(w/v)钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O，Merck 1182)和一体积10％(w/v)抗坏血酸(C6H8O6，AnalaRNormapur 20150)组成。将管在50℃温育20分钟并冷却至室温。此后在820nm下对酶空白测量吸收。对于酶空白，在TCA和通过15分钟温育后加入底物。通过与已知浓度的磷酸酯溶液的显色反应的标准曲线来确定释放的磷酸酯的量。
通过内部验证的植酸酶法(FTU法)分析用于胃肠道测试(GIT)的样品(实施例4)的活性。在FTU测定中，检测了通过植酸酶水解酶促作用从植酸钠底物释放的无机磷酸酯。颜色形成可通过分光光度法测量，是钼酸根和钒酸根离子与无机磷酸酯络合的结果。一个植酸酶单位(FTU)是在37℃、pH 5.50下使用60分钟温育时间时每分钟从植酸钠释放1μmol无机磷酸酯的酶的量。
在所述测定中，将2.0ml 1％植酸钠底物(LabChem EE05501，在250mM乙酸钠缓冲液中，pH 5.5，包括1mM CaCl2·2H2O和0.01％Tween 20)移液到塑料离心管中。底物管在37℃预温育5至10分钟，然后加入1.0ml稀释的酶样品。温育恰好60分钟后，加入2.0ml显色终止溶液，通过涡旋来混合管内容物。像样品那样制备酶空白，但在加入稀释的酶样品之前，向底物管中加入显色终止溶液。对于显色反应，在室温下将管温育20分钟，然后将其以4000rpm离心10分钟。在415nm下对酶空白测量样品吸光度。对于活性单位，制备磷酸钾标准曲线(pH 5.50)(干KH2PO4，使用Merck 1.04873.1作为标准物；在105℃干燥2小时后称重)。
如下制备终止溶液(临使用前制备)：对于100ml显色终止溶液，将25ml储备七钼酸铵(20g(NH4)6Mo7O24·4H2O，Merck 1182，在180ml水中，加入2ml氢氧化铵(NH4OH，Sigma-Aldrich 22122828-30％)，最终体积200ml)与25ml储备钒酸铵溶液(0.47g钒酸铵(NH4VO3，Riedel de Haen 31153)混合在160ml水中；完全溶解后，加入4ml 22.75％硝酸溶液(最终体积200ml)。然后在容量瓶中加入16.5ml 22.75％硝酸溶液(HNO3，Merck 1.00456)，然后加入蒸馏水使其体积达到100ml。
表2.所选变体的IP6活性和IP4活性以及IP4活性与IP6活性之比。这里呈现的数值是与SEQ ID NO:2相比的相对活性。结果表明，与SEQ ID NO:2相比，所述变体的IP4降解活性提高和/或IP4活性与IP6活性之比提高。
实施例4.胃肠道测试(GIT)结果
使用体外胃肠模拟测试系统(GIT)对所选新型植酸酶候选物降解饲料材料中的植酸酯的能力进行比较。使用SEQ ID NO:2作为参考物。
将待测植酸酶以限定的活性水平加入饲料成分混合物(60％玉米；40％豆粕)中，然后进行模拟动物消化条件的三步连续体外测试。在40℃和相应的pH以及肉鸡嗉囊、砂囊和小肠中的pH变化下进行反应。此外，加入消化蛋白酶。为了在GIT测定中取得成功，植酸酶需要具有多种有益生化特性的组合。它需要在消化道温度下抵抗不同的pH并起作用，同时对消化道蛋白酶具有抗性。Sommerfeld等,2017描述了体外测试系统的细节。
根据Blaabjerg等,2010，在体外测试结束时，提取肌醇磷酸酯并从上清液中除去植酸酶，然后使用高效液相色谱法(HPLC)分析肌醇磷酸酯(IP6至IP3)。
从GIT测试获得的结果如图2所示。图2A至图2D示出了与植酸酶SEQ ID NO:2相比，植酸酶变体01107(图2A)、01134(图2B)、01135(图2C)和01138(图2D)当以250FTU/kg和500FTU/kg加入时在体外处理(GIT)玉米-豆粕混合物后对IP6至IP4的总和的进一步降解。
参考文献
Ariza A,Moroz OV,Blagova EV,Turkenburg JP,Waterman J,Roberts SM,VindJ,C,Lassen SF,De Maria L,Glitsoe V,Skov LK和KS Wilson.2013.蜂房哈夫尼亚菌的6-植酸酶降解植酸酯：结构和溶液综合研究(Degradation of phytate by the 6-phytase from Hafnia alvei:a combined structural and solution study).PloS one2013.8(5),e65062.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065062
Bedford M.R.和C.L.Walk.2016.植酸酯还原为四磷酸酯(IP4)至三磷酸酯(IP3)甚至有可能更低级并不会去除其抗营养特性(Reduction of phytate totetrakisphosphate(IP4)to trisphosphate(IP3),or perhaps even lower,does notremove its antinutritive properties).《植酸破坏：精密动物营养的结果》(Phytatedestruction–consequences for precision animal nutrition).Walk,C.L.,Kühn,I.,Stein,H.H.,Kidd,M.T.和Rodehutscord,M.编,Wageningen Academic publishers:45-52。
Blaabjerg,K.,H.A.H.Tauson和H.D.Poulsen.2010.热处理、植酸酶和发酵液饲养影响小麦和大麦饲养猪回肠食糜中肌醇磷酸酯的存在和磷的消化率(Heat-treatment,phytase and fermented liquid feeding affect the presence ofinositol phosphates in ileal digesta and phosphorus digestibility in pigs feda wheat and barley diet).Journal Article 4:876-885。
Greiner R.和U.Konietzny.1996.旨在产生植酸酯的特殊分解产物的生物反应器的构建(Construction of a bioreactor to produce special breakdown products ofphytate).Journal of Biotechnology,48(1-2):153-159。
Havukainen S,Valkonen M,Koivuranta K和Landowski CP.2020.对糖转运蛋白CRT1的研究揭示了对里氏木霉的纤维素酶诱导至关重要的新特征(Studies on sugartransporter CRT1 reveal new characteristics that are critical for cellulaseinduction in Trichoderma reesei).Biotechnol.Biofuels 2020年9月14日；13:158.doi:10.1186/s13068-020-01797-7.eCollection 2020。
Joutsjoki VV,TK Torkkeli和KMH Nevalainen.1993.用树脂枝孢霉葡糖淀粉酶P(gamP)基因转化里氏木霉：里氏木霉产生异源葡糖淀粉酶(Transformation ofTrichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P(gamP)gene:production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei).Curr.Genet.24:223-228.
Karhunen T,AKMH Nevalainen和PL Suominen.1993.里氏木霉的高频一步基因置换.I.内切葡聚糖酶I生产过剩(High frequency one-step gene replacementin Trichoderma reesei.I.Endoglucanase I overproduction).Mol.Gen.Genet.241:515-522。
Lee,S.A.和M.R.Bedford.2016.肌醇，有效的生长促进剂？(Inositol-aneffective growth promotor？)Worlds Poultry Science 72,doi:10.1017/S0043933916000660
Menezes-Blackburn,D.,S.Gabler和R.Greiner.2015.七种市售植酸酶在家禽消化道体外模拟中的性能(Performance of seven commercial phytases in an in Vitrosimulation of poultry digestive tract).J.Agric.Food Chem.,63:6242-6149
Paloheimo M,AJ Kallio和P Suominen.2003.丝状真菌里氏木霉高产细菌木聚糖酶需要具有完整结构域结构的载剂多肽(High-yield production of abacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires acarrier polypeptide with an intact domain structure).Appl.Env.Microbiol.69:7073-7082。
M,H Nevalainen,ME Salminen和J Knowles.1987.用于纤维素水解丝状真菌里氏木霉的多功能转化系统(A versatile transformation system for thecellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei).Gene 61:155-164。
Sambrook J和DW Russell.2001.分子克隆实验室手册(Molecular cloning,alaboratory manual).Cold Spring Harbor Laboratory,New York,US。
Sievers F,A Wilm,D Dineen,TJ Gibson,K Karplus,W Li,R Lopez,HMcWilliam,M Remmert,JJD Thompson和DG Higgins 2011.使用Clustal Omega快速可扩展地生成高质量蛋白质多序列对齐(Fast,scalable generation of high-qualityprotein multiple sequence alignments using Clustal Omega).Mol.Syst.Biol.7:539。
Sommerfeld M,Schollenberger,L Hemberle和M Rodehutscord2017用于检查家禽消化道中的肌醇磷酸酯降解的体外测定法的改进与应用(Modification andapplication of an in vitro assay to examine inositol phosphate degradation inthe digestive tract of poultry).Science of Food and Agiculture；97(12),p 4219-4226；doi.org/10.1002/jsfa.8297
Xu P,J Price,A Wise和PJ Aggett.1992.肌醇磷酸酯与钙、锌和组氨酸的相互作用(Interaction of Inositol Phosphates with Calcium,Zinc,and Histidine).Journal of Inorganic Biochemistry 47:119–130。
Zeller E,M Schollenberger,I Kühn和M Rodehutscord.2015.在未补充或补充30种植酸酶的情况下在肉鸡消化道的不同部位中植酸酯的水解和肌醇磷酸酯异构体的形成(Hydrolysis of phytate and formation of inositol phosphate isomers withoutor with supplemented 30phytases in different segments of the digestive tractof broilers).Journal Nutritional Science 4,e1:1–12。
上文的描述通过具体实施方案和实施方式的非限制性示例的方式提供了发明人目前为进行本发明所设想的最佳模式的完全且详实的描述。
然而，对于本领域技术人员而言，很明显本发明不局限于上面呈现的实施方式的细节，而是本发明可以在不偏离本发明的特征的情况下使用等效的手段在其它实施方式中或在不同的实施方式组合中实施。
此外，上文公开的示例性实施方式的一些特征可以用于在无需相应地使用其它特征的情况下得到优点或技术效果。因此，上面的描述应被视为仅仅说明本发明的原理，并且不具限制性。因此，本发明的范围仅受权利要求限制。
序列表
<110> 生化酶股份有限公司
<120> 植酸酶变体
<130> 32214-ECPHY-IP4
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体
<400> 1
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Glu Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Arg His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Tyr Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体
<400> 2
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Glu Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Arg His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Trp Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410

Claims (21)

1.一种变体多肽，所述变体多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述变体具有：
在第126位的氨基酸取代；
植酸酶活性；并且
其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。
2.根据权利要求1所述的变体多肽，所述变体多肽在第126位上具有组氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的变体多肽，所述变体多肽在选自第121位、第204位、第212位、第216位和第258位的位置上包含至少一个其它氨基酸取代。
4.根据权利要求3所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代导致存在以下氨基酸中的至少一个：121K、204N/T、212G、216T和258N/A。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代是选自P121K、D204N/T、S212G、M216T和Q258N/A的取代。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽是大肠杆菌(E.coli)6-植酸酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含以下氨基酸：
a.126H；以及
b.选自以下的至少一个氨基酸：121K、204N/T、212G、216T和258N/A。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含以下氨基酸取代：
a.N126H；以及
b.选自以下的至少一个氨基酸取代：P121K、D204N/T、S212G、M216T和Q258N/A。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含：
a.氨基酸126H和204N/T，优选取代N126H和D204N/T；或
b.氨基酸126H和212G，优选取代N126H和S212G；或
c.氨基酸126H和258A/N，优选取代N126H和Q258A/N；或
d.氨基酸126H、204N和212G，优选取代N126H、D204N和S212G；或
e.氨基酸126H、204N和258N，优选取代N126H、D204N和Q258N；或
f.氨基酸126H、204T和212G，优选取代N126H、D204T和S212G；或
g.氨基酸126H、212G和258N，优选取代N126H、S212G和Q258N；或
h.氨基酸121K、126H和216T，优选取代P121K、N126H和M216T；或
i.氨基酸126H、204T、212G和258N，优选取代N126H、D204T、S212G和Q258N；或
j.氨基酸121K、126H、204N、212G和216T，优选取代P121K、N126H、S212G和M216T。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含：
a.氨基酸126H、204N、258N，优选取代N126H、D204N和Q258N；或
b.氨基酸126H、204T和212G，优选取代N126H、D204T和S212G；或
c.氨基酸126H、212G和258A，优选取代N126H、S212G和Q258A；或
d.氨基酸121K、126H、204T和216T，优选取代P121K、N126H、D204T和M216T；或
e.氨基酸121K、126H、216T和258N，优选取代P121K、N126H、M216T和Q258N；或
f.氨基酸126H、204N、212G和258A，优选取代N126H、D204N、S212G和Q258A；或
g.氨基酸126H、204T、212G、258N，优选取代N126H、D204T、S212G和Q258N；或
h.氨基酸121K、126H、204N、212G和216T，优选取代P121K、N126H、S212G和M216T；或
i.氨基酸121K、126H、204N、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204N、M216T和Q258A；或
j.氨基酸121K、126H、204N、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204N、M216T和Q258N；或
k.氨基酸121K、126H、204T、212G和216T，优选取代P121K、N126H、D204N、S212G和M216T；或
l.氨基酸121K、126H、204T、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204T、M216T和Q258A；或
m.氨基酸121K、126H、204T、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204T、M216T和Q258N；或
n.氨基酸121K、126H、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、S212G、M216T和Q258A；或
o.氨基酸121K、126H、212G、216T和258N，优选取代P121K、N126H、S212G、M216T和Q258N；或
p.氨基酸121K、126H、204N、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204N、S212G、M216T和Q258A；或
q.氨基酸121K、126H、204T、212G、216T和258A，优选取代P121K、N126H、D204T、S212G、M216T和Q258A；或
r.氨基酸121K、126H、204T、212G、216T和258N，优选取代P121K、N126H、D204T、S212G、M216T和Q258N；或
s.表1所示的一组氨基酸取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽包含氨基酸121K、126H、216T和258N/A；优选氨基酸取代P121K、N126H、M216T和Q258N/A。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽还包含氨基酸75C/V、114T、137E、141T、142D、146R、157G、204C、211W、253Q、267R和341P；或
D35Y、G70E、S80P、T161P、N176P、L179F、K180N、S187P、K276M、T277A、E315G和A380P。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的变体多肽，与SEQ ID NO:2相比，所述变体多肽具有增加的IP4降解活性和/或具有高于1.3的IP4与IP6活性比。
14.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含允许产生至少一种根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽的遗传元件，其中所述宿主细胞优选地选自：
a.丝状真菌细胞，来自子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)；优选来自粪壳菌纲(Sordariomycetes)或散囊菌纲(Eurotiomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)或粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)或散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)或粪壳菌目(Sordariales)或散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌科(Hypocreacea)或赤壳菌科(Nectriacea)或毛壳菌科(Chaetomiaceae)或曲霉菌科(Aspergillaceae)、木霉菌属(Trichoderma)(无性型肉座菌属)或镰刀菌属(Fusarium)或枝顶孢霉属(Acremonium)或腐质霉属(Humicola)或嗜热疣霉属(Thermothelomyces)或毁丝霉属(Myceliophthora)或曲霉属(Aspergillus)的成员；
更优选地来自物种里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocreajecorina))、桔绿木霉(T.citrinoviridae)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾谷镰孢霉(F.gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F.pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F.venenatum)、产黄枝顶孢霉(头孢霉)(Acremonium(Cephalosporium)chrysogenum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、灰腐质霉(H.grisea)、嗜热嗜热疣霉(Thermothelomycesthermophilus)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉泡盛变种(A.niger var.awamori)和米曲霉(A.oryzae)；
b.细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌目如链霉菌属(Streptomyces sp.)，以及
c.酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；并且
更优选地，所述宿主细胞选自丝状真菌细胞如木霉菌属或选自革兰氏阳性芽孢杆菌如芽孢杆菌属(Bacillus)；
最优选地选自里氏木霉或枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
15.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含经配置以产生至少一种根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞是转基因植物细胞。
16.一种酶组合物，所述酶组合物包含根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽。
17.一种根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽或根据权利要求16所述的酶组合物在制造饲料或食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物中的用途。
18.一种制造根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽的方法，所述方法包括：
a.提供多核苷酸，所述多核苷酸包含被安排用于产生根据权利要求1至13所述的变体的遗传元件；以及
b.在重组宿主细胞中，优选在根据权利要求14或15所述的重组宿主细胞中表达所述多核苷酸。
19.一种动物饲料，所述动物饲料包含根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽或根据权利要求16所述的酶组合物，以及至少一种植物来源的蛋白质源，以及
a.任选地，至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的其它酶；以及
b.任选地，至少一种选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合的载剂或成分。
20.一种饲料补充剂，所述饲料补充剂包含根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽或根据权利要求16所述的酶组合物；以及
a.任选地，至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的其它酶；以及
b.任选地，至少一种选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠、矿物质、氨基酸、益生元、益生菌、维生素或其组合的载剂或成分。
21.一种降解或修饰含有植酸或植酸酯的材料的方法，所述方法包括用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的变体多肽或根据权利要求16所述的酶组合物处理所述材料。
CN202280048612.0A 2021-07-16 2022-06-23 植酸酶变体 Pending CN117616119A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21186231.3 2021-07-16
EP21186231.3A EP4119660A1 (en) 2021-07-16 2021-07-16 Phytase variants
EP21186223.0 2021-07-16
PCT/FI2022/050464 WO2023285736A1 (en) 2021-07-16 2022-06-23 Phytase variants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117616119A true CN117616119A (zh) 2024-02-27

Family

ID=76958877

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280048703.4A Pending CN117642504A (zh) 2021-07-16 2022-06-23 植酸酶变体
CN202280048612.0A Pending CN117616119A (zh) 2021-07-16 2022-06-23 植酸酶变体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280048703.4A Pending CN117642504A (zh) 2021-07-16 2022-06-23 植酸酶变体

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP4119660A1 (zh)
CN (2) CN117642504A (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2069486A2 (en) * 2006-08-03 2009-06-17 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
WO2010135588A2 (en) * 2009-05-21 2010-11-25 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
MX2018003389A (es) * 2015-09-18 2019-09-18 Agrivida Inc Fitasas modificadas y metodos de uso.

Also Published As

Publication number Publication date
EP4119660A1 (en) 2023-01-18
CN117642504A (zh) 2024-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2421386T3 (en) Feed grants
DK2650364T3 (en) Hafniaphytase variants
EP2812429B1 (en) Glycosylation as a stabilizer for phytase
JP7275048B2 (ja) リゾチーム活性を有するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド並びにその使用及び組成物
BR112019012771A2 (pt) polipeptídeo gh25 isolado, métodos para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas, para aumentar a digestibilidade de peptidoglicanos em paredes ração animal, para produzir o polipeptídeo, para melhorar a saúde intestinal em um animal e para promover a eliminação de células de lactobacillus johnsonii mortas, aditivo de ração animal, ração animal, composição, polinucleotídeo, célula hospedeira recombinante, uso do polipeptídeo, e, aditivo zootécnico para uso em ração.
BR112015004701B1 (pt) Composição, uso de um polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira de expressão recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e para tratamento de proteínas, composição de ração animal, aditivo de ração animal, e, ração animal
AU2017384228B2 (en) Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof
JP6086614B2 (ja) 生理活性分子の融合
EP3478831B1 (en) Aspartic proteases
EP4119658A1 (en) Phytase variants
US20240336902A1 (en) Phytase Variants
CN117616119A (zh) 植酸酶变体
US20240327808A1 (en) Phytase Variants with Improved Stability and IP4 Activity
US20220046956A1 (en) Polypeptides Having Phytase Activity
CN117651766A (zh) 具有改善的稳定性和ip4活性的植酸酶变体
EP4119659A1 (en) Phytase variants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination