CN117651766A

CN117651766A - 具有改善的稳定性和ip4活性的植酸酶变体

Info

Publication number: CN117651766A
Application number: CN202280048616.9A
Authority: CN
Inventors: 卡里·云图宁; 皮和拉·阿霍拉; 劳拉·约基宁; 塔拉·美特兹格尔; 伊姆克·奎恩; 泰尔希·普拉宁; 玛丽亚·帕洛黑莫
Original assignee: AB Enzymes Oy
Current assignee: AB Enzymes Oy
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2024-03-05

Abstract

公开了一种具有增加的IP4活性和改善的热稳定性的植酸酶变体多肽，以及含有所述变体多肽的组合物、用于产生它的重组宿主细胞、其生产方法、使用所述变体多肽的用途和方法，以及含有所述变体多肽的饲料产品。

Description

具有改善的稳定性和IP4活性的植酸酶变体

技术领域

本公开总体上涉及酶技术领域。本公开特别地但并非排他地涉及具有改善的热稳定性和IP4降解活性的植酸酶变体。本发明的植酸酶变体可用于需要在环境、生产和加工条件下降解植酸酯的各种应用中，如饲料中。

背景技术

本节说明了有用的背景信息，但不承认本文所述的任何技术代表现有技术水平。

发现植酸(植酸酯，肌醇六磷酸酯，IP6)在许多植物中起储存磷酸酯的作用。储存在IP6分子中的磷酸酯可以作为无机磷酸酯释放出来。当无机酸从肌肉肌醇六磷酸酯(IP6)中释放出来时，它首先转化为肌肉肌醇五磷酸酯(IP5)，然后进一步经由肌肉肌醇四磷酸酯(IP4)、肌肉肌醇三磷酸酯(IP3)、肌肉肌醇二磷酸酯(IP2)转化为肌肉肌醇单磷酸酯(IP1)。

植酸酶是一组催化植酸水解的磷酸酶。市售植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶(HAP)蛋白家族。属于HAP蛋白家族的植酸酶具有保守N端活性位点七肽基序RHGXRXP和C端催化活性HD-二肽。组氨酸酸性磷酸酶是较大的组氨酸磷酸酶超家族的一部分。它们具有一个以组氨酸为中心的保守催化核心，所述组氨酸在反应过程中被磷酸化。PFAM基序His_Phos_2(PF00328)表示组氨酸磷酸酶超家族的分支2，该分支主要含有酸性磷酸酶和植酸酶。

植酸酶可以用于饲料中以通过植酸酯降解改善植物来源(例如小麦、大麦、玉米、大豆)饲料成分的磷酸酯利用率。这对单胃动物如家禽、鱼类和猪特别有意义，因为这些动物的上肠道中的肠道植酸酯降解是有限的。这种局限性不仅限制了磷的利用，而且由于肌醇磷酸酯(IP)，特别是高IP，即IP6、IP5和IP4的螯合作用，还限制了其它营养物质的利用率。因此，至少IP6至IP4应尽可能完全去磷酸化，但去磷酸化优选应当甚至继续至IP1，以进一步增加磷酸酯和其它营养物质的利用率。

植酸酯被植酸酶分解与IP6逐步降解为低级肌醇磷酸酯(IP5、IP4、IP3、IP2和IP1)有关。意料之中地，使用工业标准水平的植酸酶已显示显著降低了体外和体内的IP6水平。然而，在IP6降解实验中，在回肠食糜中检测到IP4和IP3增加，这表明第一磷酸酯基团水解切割不是植酸酯降解中的唯一限制性步骤(Zeller等,2015)。由于即使是这些低级肌醇磷酸酯也因与不同的营养物质如矿物质与它们结合而具有抗营养特性，因此动物饲养的目标是使IP酯降解，直至回肠末端(Bedford和Walk,2016)。旨在让肌醇完全释放的另一个原因是增加游离肌醇的含量已被证明能通过不同的机制改善动物的生长表现，这仍在研究中。

动物肠道中在植酸酶补充后发生最佳肌醇磷酸酯降解的部位是胃，这是因为胃的pH低，导致底物(植酸酯)溶解度最佳。在胃中的停留时间很短，并且部分内容物可能会迅速冲到pH是中性的肠道中。因此，进一步开发对IP6、还有低级肌醇磷酸酯如IP4和IP3异构体快速地、更有效地起作用的植酸酶，对动物饲养行业具有重要意义。这些类型的植酸酶将进一步改善磷酸酯和肌醇的肠道利用率。

本公开的一个目标是提供表现出植酸酶活性并且具有改善的特性从而允许它们在工业过程中使用的植酸酶变体。本公开的另一个目标是提供可以在用于植酸酯降解的酶组合物和饲料中使用的植酸酶变体。

发明内容

权利要求定义了保护范围。说明书和/或附图中未被权利要求涵盖的设备、系统、产物和/或方法的任何示例或技术说明在本文中不是作为本发明的实施方式，而是作为可用于理解本发明的示例来提供。

根据第一方面，提供了一种变体多肽，所述变体多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性并且包含在以下位置上的氨基酸取代的氨基酸序列：

第126位；以及

选自30、80、94、118、176、179、212、224、227、253、287、315和380的至少一个位置；并且

其中所述变体多肽具有植酸酶活性；并且

其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。

在一个实施方式中，所述变体多肽在第126位上具有组氨酸。

在一个实施方式中，所述变体还包含在第121位和/或第216位上的取代。

在一个实施方式中，所述在第121位和/或第216位上的取代选自121K和216T，优选地选自P121K和M216T。

在一个实施方式中，与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的植酸酶相比，所述变体多肽具有增加的IP4降解活性。在一些实施方式中，所述增加的IP4降解活性意指IP4降解活性与IP6降解活性之比增加。

在一个实施方式中，所述变体多肽包含在选自56、67、107、154、174、180、183、202、204、211、258、271、276、277、285、302、344、352和395的位置上的至少一个其它氨基酸取代。

在一个实施方式中，所述至少一个其它氨基酸取代导致存在以下氨基酸中的至少一个：56S、67I、107N、154N、174E、180N、183A、202S、204N、204T、211V、258N、271I、276M、277A、285E、302A、344D、352M或395A。

在一个实施方式中，所述至少一个其它氨基酸取代是选自以下的取代：A56S、V67I、D107N、D154N、Q174E、K180N、K183A、A202S、D204N、D204T、W211V、Q258N、L271I、K276M、T277A、Q285E、G302A、N344D、L352M或G395A。

在一个实施方式中，所述变体多肽具有至少88℃、优选至少89℃、甚至更优选至少90℃的展开温度。展开温度可以如实施例4中所述进行测定。

在一个实施方式中，与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的植酸酶相比，所述变体多肽具有改善的热稳定性。热稳定性可以如实施例5中所述进行测定。

在另一个实施方式中，改善的热稳定性意指所述变体多肽具有比亲本酶，即具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的植酸酶更高的熔融温度(T_m)。

在一个实施方式中，所述变体多肽包含：

在位置30、80、94、118、121、126、176、179、180、183、204、211、212、216、224、227、253、276、277、287、315、352和380上的一组取代；或一组取代30R、80P、94L、118L、121K、126H、176P、179K、180N、183A、204N、211V、212G、216T、224E、227E、253Y、276M、277A、287S、315G、352M和380P；或

一组取代Q30R、S80P、R94L、T118L、P121K、N126H、N176P、L179K、K180N、K183A、D204N、W211V、S212G、M216T、Q224E、Q227E、V253Y、K276M、T277A、Q287S、E315G、L352M和A380P。

在一个实施方式中，所述变体多肽包含：

在位置30、80、94、118、126、176、179、180、183、204、211、212、216、224、227、253、276、277、287、315、352和380上的一组取代；或

一组取代30R、80P、94L、118L、126H、176P、179K、180N、183A、204N、211V、212G、216T、224E、227E、253Y、276M、277A、287S、315G、352M和380P；或

一组取代Q30R、S80P、R94L、T118L、N126H、N176P、L179K、K180N、K183A、D204N、W211V、S212G、M216T、Q224E、Q227E、V253Y、K276M、T277A、Q287S、E315G、L352M和A380P。

在一个实施方式中，所述变体多肽包含：

在位置30、56、67、80、94、107、118、121、126、154、174、176、179、180、202、204、211、212、224、227、253、271、276、277、285、287、302、315、344、352、380和395上的一组取代；或

一组取代30R、56S、67I、80P、94L、107N、118L、121K、126H、154N、174E、176P、179K、180N、202S、204N、211V、212G、224E、227E、253Y、271I、276M、277A、285E、287S、302A、315G、344D、352M、380P和395A；或

一组取代Q30R、A56S、V67I、S80P、R94L、D107N、T118L、P121K、N126H、D154N、Q174E、N176P、L179K、K180N、A202S、D204N、W211V、S212G、Q224E、Q227E、V253Y、L271I、K276M、T277A、Q285E、Q287S、G302A、E315G、N344D、L352M、A380P和G395A。

在一个实施方式中，所述变体多肽包含：

在位置30、56、67、80、94、107、118、126、154、174、176、179、180、202、204、211、212、216、224、227、253、271、276、277、285、287、302、315、344、352、380和395上的一组取代；或

一组取代30R、56S、67I、80P、94L、107N、118L、126H、154N、174E、176P、179K、180N、202S、204N、211V、212G、216T、224E、227E、253Y、271I、276M、277A、285E、287S、302A、315G、344D、352M、380P和395A；或

一组取代Q30R、A56S、V67I、S80P、R94L、D107N、T118L、N126H、D154N、Q174E、N176P、L179K、K180N、A202S、D204N、W211V、S212G、M216T、Q224E、Q227E、V253Y、L271I、K276M、T277A、Q285E、Q287S、G302A、E315G、N344D、L352M、A380P和G395A。

根据第二方面，提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含允许产生至少一种本发明的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞优选地选自

a.丝状真菌细胞，来自子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)；优选来自粪壳菌纲(Sordariomycetes)或散囊菌纲(Eurotiomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)或粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)或散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)或粪壳菌目(Sordariales)或散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌科(Hypocreacea)或赤壳菌科(Nectriacea)或毛壳菌科(Chaetomiaceae)或曲霉菌科(Aspergillaceae)、木霉菌属(Trichoderma)(无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))或镰刀菌属(Fusarium)或枝顶孢霉属(Acremonium)或腐质霉属(Humicola)或嗜热疣霉属(Thermothelomyces)或毁丝霉属(Myceliophthora)或曲霉属(Aspergillus)的成员；

更优选地来自物种里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocreajecorina))、桔绿木霉(T.citrinoviridae)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾谷镰孢霉(F.gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F.pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F.venenatum)、产黄枝顶孢霉(头孢霉)(Acremonium(Cephalosporium)chrysogenum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、灰腐质霉(H.grisea)、嗜热嗜热疣霉(Thermothelomycesthermophilus)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉泡盛变种(A.niger var.awamori)和米曲霉(A.oryzae)；

b.细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌目如链霉菌属(Streptomyces sp.)，以及

c.酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；并且

更优选地，所述宿主细胞选自丝状真菌细胞如木霉菌属或选自革兰氏阳性芽孢杆菌如芽孢杆菌属(Bacillus)；

最优选地选自里氏木霉或枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

在一个实施方式中，所述重组宿主细胞包含经配置以产生至少一种本发明的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞是转基因植物细胞。

根据第三方面，提供了一种酶组合物，所述酶组合物包含至少一种本发明的变体多肽以及任选的防腐剂和/或载剂(carrier)。

根据第四方面，提供了至少一种本发明的变体多肽或本发明的酶组合物在制造饲料或食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物中的用途和使用方法，包括将所述变体多肽或所述酶组合物与所述饲料、食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物混合。所述用途或所述使用方法优选地至少包括加入本发明的变体多肽或酶组合物并混合。

根据第五方面，提供了一种制造本发明的变体多肽的方法，所述方法包括：

a.提供多核苷酸，所述多核苷酸包含被安排用于产生本发明的变体多肽的遗传元件；以及

b.在重组宿主细胞中，优选在本发明的重组宿主细胞中表达所述多核苷酸。

根据第六方面，提供了一种动物饲料，所述动物饲料包含本发明的变体多肽或本发明的酶组合物，以及至少一种植物来源的蛋白质源，以及

a.任选地，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的至少一种其它酶；以及

b.任选地，选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合的至少一种载剂或成分。

根据第七方面，提供了一种饲料补充剂，所述饲料补充剂包含本发明的变体多肽或本发明的酶组合物；以及

b.任选地，选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠、矿物质、氨基酸、益生元、益生菌、维生素或其组合的至少一种载剂或成分。

在一个实施方式中，所述饲料补充剂是饲料预混物。所述饲料预混物可以在使用前加入饲料。

根据第八方面，提供了一种降解或修饰含有植酸或植酸酯的材料的方法，所述方法包括用有效量的本发明的变体多肽或本发明的酶组合物处理所述材料。

在一个实施方式中，所述处理包括将有效量的所述变体多肽加入优选处于水性介质中的所述材料。

附图说明

将参考附图描述一些示例性实施方式，其中：

图1示出了用于转化里氏木霉以表达亲本植酸酶(SEQ ID NO:1)和植酸酶变体基因(phy)的表达质粒的示意图片。重组基因在宿主细胞中的表达通过使用以下遗传元件进行控制：用于转录起始的里氏木霉cbh1(Pcbh1)启动子和用于转录终止的里氏木霉cbh2(Tcbh2)终止子。使用编码CBHIICBM和连接区的里氏木霉cbh2载剂代替天然植酸酶信号序列，并且在编码的载剂多肽与植酸酶之间包括Kex2蛋白酶切割位点(kex2)。包括编码AmdS标记物的合成基因(amdS)以选择转化体，并任选地使用里氏木霉cbh1 3'和5'侧翼区域(分别为cbh1-3'和cbh1-5')使表达盒靶向cbh1基因座。载体(vector)部分(载体)衍生自pUC19。使用Sci-Ed软件的Clone Manager Professional 9生成图片。图片中示出了限制酶位点的选择。

图2示出了在肌醇磷酸酯降解方面改善的所选植酸酶变体的体外测试(GIT)结果。示出了用被测植酸酶处理基于玉米-豆粕的肉鸡饲料后IP6+IP5+IP4之和的残余量。植酸酶的投加量是500FTU/kg饲料，并且值作为HPLC分析的IP6+IP5+IP4峰面积之和给出。

图3示出了在90℃和95℃适应然后进行饲料团粒化之后植酸酶SEQ ID NO:1和变体BB81的恢复率。恢复率是指在未处理粉状饲料中分析的活性。

序列表

SEQ ID NO:1无信号肽亲本植酸酶氨基酸序列，本文中也称为QPT2。SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1相比包含以下氨基酸取代的无信号肽亲本植酸酶变体氨基酸序列：Q30R、S80P、R94L、

T118L、P121K、N126H、N176P、L179K、K180N、

K183A、D204N、W211V、S212G、M216T、Q224E、

Q227E、V253Y、K276M、T277A、Q287S、E315G、

L352M、A380P，本文中也称为BB71。

SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:1相比包含以下氨基酸取代的无信号肽亲本植酸酶变体氨基酸序列：Q30R、S80P、R94L、

T118L、N126H、N176P、L179K、K180N、K183A、

D204N、W211V、S212G、M216T、Q224E、Q227E、

V253Y、K276M、T277A、Q287S、E315G、L352M、

A380P，本文中也称为BB73。

SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:1相比包含以下氨基酸取代的无信号肽亲本植酸酶变体氨基酸序列：Q30R、A56S、V67I、S80P、

R94L、D107N、T118L、P121K、N126H、D154N、

Q174E、N176P、L179K、K180N、A202S、D204N、

W211V、S212G、Q224E、Q227E、V253Y、L271I、

K276M、T277A、Q285E、Q287S、G302A、E315G、

N344D、L352M、A380P、G395A，本文中也称为BB78。SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:1相比包含以下氨基酸取代的无信号肽亲本植酸酶变体氨基酸序列：Q30R、A56S、V67I、S80P、

R94L、D107N、T118L、N126H、D154N、Q174E、

N176P、L179K、K180N、A202S、D204N、W211V、

S212G、M216T、Q224E、Q227E、V253Y、L271I、

K276M、T277A、Q285E、Q287S、G302A、E315G、

N344D、L352M、A380P、G395A，本文中也称为BB81。

具体实施方式

如本文所用，术语“植酸酶”意指能够将植酸酶促降解为低级肌醇磷酸酯的酶。

植酸酶基于它们优选引发磷酸酯水解的肌醇环上碳位置分类为3-植酸酶、5-植酸酶或6-植酸酶(分别为EC 3.1.3.8、EC 3.1.3.72和EC 3.1.3.26)。6-植酸酶优选首先除去C6位置上的磷酸酯基团。

在一个实施方式中，提供了所述变体多肽的功能片段。功能片段是所述变体多肽的较短多肽，它并未含有所述变体多肽的所有氨基酸，但在功能上仍与所述变体多肽相同或相似。功能相似性可以是例如相似的热稳定性和/或相似的酶活性。

本发明还涉及包含编码根据第一方面的植酸酶变体多肽的核酸序列的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述包含植酸酶变体的多肽包含选自信号序列、分泌序列、载剂多肽、结合结构域、标签、接头、酶或其任何组合的至少一个其它氨基酸序列。

术语“植酸酶变体”、“植酸酶的变体”或“变体多肽”意指通过定点或随机诱变、插入、取代、缺失、重组和/或任何其它蛋白质工程改造方法(所述方法导致基因修饰的植酸酶在其氨基酸序列方面与亲本植酸酶如野生型植酸酶不同)得到的植酸酶分子。根据本公开的术语“野生型植酸酶”、“野生型酶”、“野生型”或“wt”是指具有自然界中发现的氨基酸序列的植酸酶或其片段。可以合成变体编码基因或使用基因法修饰亲本基因，例如通过定点诱变，这是一种在编码亲本多肽的多核苷酸中的一个或多个定义位点上引入一个或多于一个突变的技术。术语变体植酸酶还可以通过使用实施例、表格、附图和权利要求中给予变体的名称来指代。

本发明的变体优选为重组产生的非天然存在的蛋白质。它们可以使用通常已知的重组DNA技术来制备。简而言之，将编码变体的多核苷酸克隆并插入表达载体中，转化至宿主细胞中，然后表达。优选地，将突变与所选宿主菌株优选的密码子一起引入编码序列中。通过重组技术在不同的宿主系统中产生蛋白质的方法在本领域中是已知的。优选地，所述变体产生为细胞外蛋白质，所述细胞外蛋白质被分泌到培养宿主细胞的培养基中并且可以容易地从其中回收和分离它们。

如本文所用，术语“成熟多肽”意指其中至少一个信号序列或信号肽或信号肽和推定前肽或载剂肽或融合搭配物被切割掉的任何多肽。如本文所用，“肽”和“多肽”是包括多个连续聚合氨基酸残基的氨基酸序列。为了本发明的目的，肽是包括至多20个氨基酸残基的分子，并且多肽包括超过20个氨基酸残基。所述肽或多肽可以包括修饰的氨基酸残基、并非由密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。如本文所用，“蛋白”可以指任何大小的肽或多肽。蛋白可以是酶、蛋白质、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其它蛋白。

如本文所用，“序列同一性”意指两个最佳对齐序列之间的氨基酸残基的精确匹配数相对于两个序列中都存在的残基的位置数的百分比。当一个序列具有在另一个序列中没有对应残基的残基时，对齐方案允许在对齐中的空位，并且该位置不算入序列同一性计算的分母中。

在一个实施方式中，氨基酸序列的“序列对齐”意指使用如Sievers等2011所述的Clustal Omega(1.2.4)多重序列对齐方案(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和使用默认设定对齐序列。

除非另外规定，否则所有提及某一氨基酸位置的情况都是指SEQ ID NO:1的所述位置上的氨基酸，或与SEQ ID NO:1对齐的氨基酸序列的相应位置上存在或缺失的氨基酸。

如本文所用，术语“二硫桥”或“二硫键”或“SS桥”是指多肽或蛋白质中半胱氨酸残基的硫原子之间形成的键。二硫桥可以是天然存在或非天然存在的，并且是例如通过氨基酸取代的方式引入。

如本文所用，术语“相应位置”或“相应的氨基酸位置”意指根据所识别的相似性或同一性区域将至少两个氨基酸序列对齐为成对对齐或多序列对齐，从而将相应的氨基酸配对。在本公开中，相应的位置通常是指与SEQ ID NO:1中的位置相对应的位置。

如本文所用，“氨基酸取代”意指用在该特定替换位置上与原始氨基酸不同的氨基酸残基进行氨基酸残基替换。术语“氨基酸取代”可以指保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代，这意味着氨基酸残基被替换为与该位置上的原始氨基酸残基具有相似侧链(保守)或不同侧链(非保守)的氨基酸残基。

术语“分泌信号序列”或“信号序列”或“分泌肽”是指作为较大多肽的组成部分或一部分并指导所述较大多肽通过产生它的宿主细胞的分泌途径的氨基酸序列。分泌信号序列可以是多肽天然存在的，或者它可以从另一个来源获得。取决于宿主细胞，较大的多肽可以在转运过程中通过分泌途径从分泌肽中切割出来，从而形成缺乏分泌肽的成熟多肽。

术语载剂多肽或融合搭配物是指目标蛋白质(植酸酶)被翻译融合至其中以例如提高收率的多肽。载剂/融合搭配物可以与其原始生产宿主同源或异源，并且可以是全长蛋白质或蛋白质片段(例如，核心、CBM或CBM和接头区域)。它优选由具有良好表达水平的基因或核苷酸序列编码。

如本文所用，“植酸酶活性”是指植酸降解活性。实施例3提供了测定植酸酶活性的方法。因此，IP4活性是指降解IP4的能力，并且IP6活性是指降解IP6的能力。IP4降解活性与IP6降解活性之比在本文中有时公开为IP4/IP6活性比。

在一个实施方式中，术语“酶组合物”意指酶促发酵产物，可能经过分离和纯化，通常由微生物的纯培养物产生。酶组合物通常包含由微生物产生的许多不同的酶活性。在另一个实施方式中，酶组合物是单组分酶、优选通过使用常规重组生产技术由细菌或真菌物种衍生的酶的混合物。酶组合物可以含有例如稳定剂和/或防腐剂，由此防止微生物生长并改善储存稳定性。酶组合物中还可以包括填充剂组分，如麦芽糖糊精、面粉和/或盐。

如本文所用，“宿主细胞”意指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、交配、杂交、CRISPR-Cas等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生突变而不相同的任何后代。宿主细胞的非限制性实例是真菌细胞，优选丝状真菌细胞(例如木霉菌属或里氏木霉、曲霉属或米曲霉或黑曲霉、嗜热疣霉属或异宗嗜热疣霉(Thermothelomyces heterothallica)、毁丝霉属或嗜热毁丝霉、或者腐质菌属或特异腐质霉或者镰刀菌属或威尼斯镰刀菌(Fusarium venenatum))；细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)、放线菌目(例如链霉菌属、弯曲野野村氏菌(Nonomuraea flexuosa))和酵母(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶氏酵母)。

在另一个实施方式中，所述植酸酶变体通过在植物细胞中，即在转基因植物中重组生产而得到。

所述重组宿主细胞可用于产生植酸酶变体并含有编码所述植酸酶变体的多核苷酸。所述重组宿主细胞可以可操作地连接到一个或多个控制序列以指导变体生产，并且可以通过刺激启动本发明的植酸酶变体的生产，如本领域已知。所述重组宿主细胞还可用于制备具有不同性质的变体。例如，可以选择宿主细胞，它提供有利于稳定性或活性的翻译后修饰，或者它有利于宿主细胞中产生的变体的后处理。

在一个实施方式中，所述宿主细胞是非致病性的。这对于将宿主细胞或在其中产生的植酸酶变体用于动物饲料产品中特别有利。

在一个实施方式中，含有植酸酶变体的组合物是食物或饲料，并且它还可以包含含有植酸的植物材料。

在一个实施方式中，所述组合物是食品添加剂或饲料添加剂，所述食品添加剂或饲料添加剂还包含以下各项中的至少一种：至少一种痕量矿物质、至少一种氨基酸特别是赖氨酸、水溶性维生素、脂溶性维生素、益生元和益生菌。

在一个实施方式中，所述组合物是符合欧洲议会和理事会2003年9月22日关于用于动物营养的添加剂的法规(EC)第1831/2003号的要求的食品添加剂或饲料添加剂。

在一个实施方式中，所述组合物是液体组合物或固体组合物的形式，如溶液、分散体、糊状物、团粒、粉末、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、晶体、晶体浆液、凝胶、挤出物、沉淀物、预混物或其组合。

术语“启动子”是指含有提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常但并非总是存在于基因的5'非编码区中。

术语“前肽”或“前-肽”是在成熟或激活过程中被切割的蛋白质的一部分。一旦被切割后，前肽通常没有独立的生物学功能。

如本文所用，术语“结构域”和“区域”可以与术语“模块”互换使用。

以下缩写用于氨基酸：

A Ala丙氨酸

C Cys半胱氨酸

D Asp天冬氨酸

E Glu谷氨酸

F Phe苯丙氨酸

G Gly甘氨酸

H His组氨酸

I Ile异亮氨酸

K Lys赖氨酸

L Leu亮氨酸

M Met甲硫氨酸

N Asn天冬酰胺

P Pro脯氨酸

Q Gln谷氨酰胺

R Arg精氨酸

S Ser丝氨酸

T Thr苏氨酸

V Val缬氨酸

W Trp色氨酸

Y Tyr酪氨酸

X Xaa上述氨基酸中的任一种

本文通过使用以下命名法描述取代：蛋白质支架，即亲本序列中的氨基酸残基；位置；取代的氨基酸残基。根据这种命名法，例如，第121位上的单个脯氨酸残基取代为赖氨酸残基表示为Pro121Lys或P121K。第121位上的任何氨基酸取代为赖氨酸表示为Xaa121Lys或X121K或121K。作为另一个示例，第179位上的酪氨酸取代为苯丙氨酸、色氨酸或亮氨酸在本文中表示为Y179F/W/L。

如本文所用，术语“表达”包括参与在宿主细胞中产生多肽的任何步骤或所有步骤，包括但不限于转录、翻译、翻译后修饰和分泌。表达之后可以是收获(即，回收)宿主细胞或表达产物。

在一个实施方式中，所述植酸酶变体具有植酸酶活性以及与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述变体多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸不具有100％序列同一性。在一个实施方式中，所述变体多肽的氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1。在一个替代实施方式中，所述变体多肽的氨基酸编号部分对应于SEQ ID NO:1。

在一个实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述变体多肽中的氨基酸取代的总数为至少两个。取代数量还可以是至少三个或至少四个。所述氨基酸取代可以选自本文公开的位置。在另一个实施方式中，取代的总数为至少5、至少10、至少15、至少20或至少25；或者5、10、15、20或25。优选地，取代的数量不超过25、20、15或10。

合适数量的取代的其它示例是2至25个取代、2至20个取代、2至15个取代、2至10个取代和2至5个取代。合适数量的取代的其它示例是3至25个取代、3至20个取代、3至15个取代、3至10个取代和3至5个取代。合适数量的取代的其它示例是4至25个取代、4至20个取代、4至15个取代、4至10个取代和4至5个取代。

在一个实施方式中，在氨基酸序列的非保守区域中进行一个或多个取代。在另一个实施方式中，所述变体多肽包含任何权利要求所述的取代以及在氨基酸序列的非保守区域中的其它取代。这些其它取代对性质的影响可以如实施例中所述进行分析。

在一个实施方式中，所述变体多肽或所述功能片段具有在40与60kDa之间、优选在43至55kDa之间的预测分子量。预测分子量可以通过计算所述变体多肽或其功能片段中个别氨基酸的分子量的总和来确定。当所述变体多肽的预测分子量在上述范围内时，所述变体多肽的结构与进行取代的亲本序列相似。可能优选上述范围内的预测分子量以提供具有与亲本多肽相似的结构或功能特性的变体多肽。

在一个实施方式中，含有所述变体多肽的酶组合物或产物以液体组合物或固体组合物的形式提供，如溶液、分散体、糊状物、粉末、颗粒、颗粒状、包衣颗粒、片剂、饼、晶体、晶体浆液、凝胶或团粒。由于本发明的变体多肽具有良好的热稳定性，因此在此类制剂中使用所述变体多肽是有利的。

在一个实施方式中，所述多肽变体降解含有植酸的基于植物的材料或部分基于植物的材料中的植酸。

在一个实施方式中，本发明的植酸酶变体用于或提供于动物饲料中，并且所述动物是反刍动物或非反刍动物。在另一个实施方式中，所述动物是牛属动物如肉牛、奶牛、绵羊或山羊。在另一个实施方式中，所述动物是非反刍动物，如家禽(如肉鸡、蛋鸡和火鸡以及鸭)；猪(如仔猪、生长猪和母猪)；鱼(如鲑鱼、鲤鱼、罗非鱼和鲶鱼)和甲壳动物。在一个实施方式中，所述饲料是意在喂给动物的动物饲料，如任何复合饲料或混合物。在另一个实施方式中，饲料包含以下或由以下组成：谷物如玉米、小麦、燕麦、大麦、高粱和水稻；蛋白质源，如豆粕、向日葵粕和芥花粕；以及一种或多种矿物质。与不使用所述变体的饲料相比，使用本发明的变体的饲料具有提高的营养价值。本发明的组合物和本发明的植酸酶变体能降解饲料的植酸，从而提高其对动物的营养价值。使用本发明的植酸酶变体或本发明的组合物的动物饲料可以配制成湿组合物或干组合物的形式。

除非上下文另有说明或与上下文明显相矛盾，否则在描述要素或特征的上下文中使用的术语“一个”、“一种”和“所述”以及类似术语应解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明，否则值(包括取代位点)的范围仅旨在作为单独地引用落在所述范围内的各个单独的值的方式，并因此在本说明书中公开了各个单独的值，就好像单独地叙述它一样。除非本文另有指示或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则使用本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“如”、“例如”和“任选地”)仅旨在更好地说明实施方式，而不限制权利要求的范围。本说明书中的任何语言都不应被视为表明任何未要求保护的要素是基本特征。

除非另外指明，否则本说明书和权利要求中使用的表达成分的量、反应条件等的所有数值在所有情况下都应当理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中列出的数值参数是可以根据通过本公开的实施方式设法得到的所需特性而变化的近似值。如本文所用，“约”可以被本领域普通技术人员理解，并且可以根据使用它的上下文在一定程度上变化。如果使用了本领域普通技术人员不清楚的术语，则鉴于使用它的上下文，“约”可以意指特定术语的至多加10％或至多减10％。

除非另有说明，否则术语“％”、“按重量计的％”、“重量％”和“wt％”都意指基于100％最终组合物重量的总重量的重量百分比。因此，10重量％意指组分构成了每100重量份总组合物中的10重量份。

如本文所用，术语“包含”包括“包括”、“含有”和“涵盖”的较广泛含义，以及较窄的表述“由...组成”和“仅由...组成”。

在一个实施方式中，方法步骤按任何方面、实施方式或权利要求中确定的顺序进行。在另一个实施方式中，指定对前一个方法步骤中得到的产物或中间体进行的任何方法步骤都是直接对所述产物或中间体进行，即在所述两个连续步骤之间不存在会化学和/或物理改变产物或中间体的额外、可选或辅助加工步骤。

在一个实施方式中，本发明的方法是工业方法。在另一个实施方式中，所述工业方法不包括小规模方法，如未按比例放大到工业用体积的实验室规模方法。

权利要求定义了保护范围。说明书和/或附图中未被权利要求涵盖的设备、产物和/或方法的任何示例或技术说明不是作为本发明的实施方式，而是作为可用于理解本发明的背景技术或示例来提供。

下列编号条款中还公开了实施方案和实施方式：

第1条.一种变体多肽，所述变体多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性并且包含在以下位置上的氨基酸取代的氨基酸序列：

第126位；以及

其中所述变体多肽具有植酸酶活性；并且

其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。

第2条.根据第1条所述的变体多肽，所述变体多肽具有在第126位上的组氨酸。

第3条.根据第1条或第2条所述的变体，所述变体还包含在第121位和/或第216位上的取代。

第4条.根据第3条所述的变体多肽，其中所述在第121位和/或第216位上的取代选自121K和216T，优选地选自P121K和M216T。

第5条.根据第1条至第4条中任一条所述的变体多肽，与具有氨基酸序列SEQ IDNO:1的植酸酶相比，所述变体多肽具有增加的IP4降解活性。

第6条.根据第1条至第5条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽包含在选自56、67、107、154、174、180、183、202、204、211、258、271、276、277、285、302、344、352和395的位置上的至少一个其它氨基酸取代。

第7条.根据第6条所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代导致存在以下氨基酸中的至少一个：56S、67I、107N、154N、174E、180N、183A、202S、204N、204T、211V、258N、271I、276M、277A、285E、302A、344D、352M或395A。

第8条.根据第6条至第7条中任一条所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代是选自以下的取代：A56S、V67I、D107N、D154N、Q174E、K180N、K183A、A202S、D204N、D204T、W211V、Q258N、L271I、K276M、T277A、Q285E、G302A、N344D、L352M或G395A。

第9条.根据第1条至第8条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽具有至少88℃、优选至少89℃、甚至更优选至少90℃的展开温度。

第10条.根据第1条至第9条中任一条所述的变体多肽，与具有氨基酸序列SEQ IDNO:1的植酸酶相比，所述变体多肽具有改善的热稳定性。

第11条.根据第1条至第10条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

在位置30、80、94、118、121、126、176、179、180、183、204、211、212、216、224、227、253、276、277、287、315、352和380上的一组取代；或

一组取代30R、80P、94L、118L、121K、126H、176P、179K、180N、183A、204N、211V、212G、216T、224E、227E、253Y、276M、277A、287S、315G、352M和380P；或

第12条.根据第1条至第10条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

第13条.根据第1条至第10条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

第14条.根据第1条至第10条中任一条所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

第15条.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含允许产生至少一种根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞优选地选自：

丝状真菌细胞，来自子囊菌门盘菌亚门；优选来自粪壳菌纲或散囊菌纲、肉座菌亚纲或粪壳菌亚纲或散囊菌亚纲、肉座菌目或粪壳菌目或散囊菌目、肉座菌科或赤壳菌科或毛壳菌科或曲霉菌科、木霉菌属(无性型肉座菌属)或镰刀菌属或枝顶孢霉属或腐质霉属或嗜热疣霉属或毁丝霉属或曲霉属的成员；

更优选地来自物种里氏木霉(红褐肉座菌)、桔绿木霉、长枝木霉、绿木霉、哈茨木霉、棘孢木霉、深绿木霉、近里氏木霉、尖镰孢霉、禾谷镰孢霉、假禾谷镰孢霉、镶片镰孢霉、产黄枝顶孢霉(头孢霉)、特异腐质霉、灰腐质霉、嗜热嗜热疣霉、嗜热毁丝霉、黑曲霉、黑曲霉泡盛变种和米曲霉；

细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌目如链霉菌属，以及

酵母，如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶氏酵母；并且

更优选地，所述宿主细胞选自丝状真菌细胞如木霉菌属或选自革兰氏阳性芽孢杆菌如芽孢杆菌属；

第16条.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含经配置以产生至少一种根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞是转基因植物细胞。

第17条.一种酶组合物，所述酶组合物包含根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽以及任选的防腐剂和/或载剂。

第18条.一种根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽或根据第17条所述的酶组合物在制造饲料或食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物中的用途，包括将所述变体多肽或所述酶组合物与所述饲料、食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物混合。

第19条.一种制造根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽的方法，所述方法包括：

提供多核苷酸，所述多核苷酸包含被安排用于产生根据第1条至第14条所述的变体多肽的遗传元件；以及

在重组宿主细胞中，优选在根据第15条或第16条所述的重组宿主细胞中表达所述多核苷酸。

第20条.一种动物饲料，所述动物饲料包含根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽或根据第17条所述的酶组合物，以及至少一种植物来源的蛋白质源，以及

任选地，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶或其组合的至少一种其它酶；以及

任选地，选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合的至少一种载剂或成分。

第21条.一种饲料补充剂，所述饲料补充剂包含根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽或根据第17条所述的酶组合物；以及

任选地，选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠、矿物质、氨基酸、益生元、益生菌、维生素或其组合的至少一种载剂或成分。

第22条.一种降解或修饰含有植酸或植酸酯的材料的方法，所述方法包括用有效量的根据第1条至第14条中任一条所述的变体多肽或根据第17条所述的酶组合物处理所述材料。

实施例

提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明。所述实施例不应被视为限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书确定。在提及具体材料的程度上，它仅用于说明的目的，而不是意图限制本发明。本领域技术人员可以在不运用发明能力和不脱离本发明范围的情况下开发等效的手段或反应物。应当理解，在本文所述的程序中可以在保持处于权利要求范围内的同时进行许多变化。

实施例1.具有改善的热稳定性和相对IP4活性的变体的设计

基于植酸酶结构进行计算分析和设计，以改善SEQ ID NO:1植酸酶的植酸酯降解活性和热稳定性。

根据Ariza等,2013(doi:10.1371/journal.pone.0065062)构建了6-植酸酶的最可能IP4中间体的分子结构。除去6-植酸酶结构模型中不属于蛋白质链的所有原子，根据pH5.0加氢，并使用加速分子动力学方法研究酶-底物相互作用。基于这些研究，确定了最有希望具有增加的植酸酯降解活性的取代候选物。

基于大肠杆菌6-植酸酶(1DKP)的晶体结构进行分子动力学研究以揭示温度敏感位置。

在上述设计后，在里氏木霉中产生具有单突变的变体，并以本申请的实施例2至实施例4中所述的方式分析了这些变体植酸酶的热稳定性以及IP6和IP4活性。在如实施例6所述的GIT测定(体外应用试验)中测试了性能最好的候选物，并根据所进行的所有分析测试最佳候选物在饲养试验中的功效。

根据实验室实验、体外和体内应用试验结果以及额外的计算设计，设计了组合有益突变的变体。这些设计的植酸酶变体旨在与SEQ ID NO:1相比具有改善的植酸酯降解能力和热稳定性，被详述在表1中。表1的变体在多个位置上具有能改善酶的热稳定性并允许IP底物、尤其是IP4底物与活性位点结合，从而增强植酸酯降解活性的取代。

此外，基于计算设计和/或表征结果，表1中针对各个变体列出的各个位置与IP4底物与底物结合位点的结合或与改善酶的热稳定性有关。此外，所述位置可以单独使用或者以与表1中列出的一个或多个取代位置的任何组合使用，以改善所述酶的IP4降解和/或稳定性，如计算和其它实验所证明。在其它研究中通过制备具有表1所示的变体代码的变体来分析所鉴定的取代位点的优选组合。

表1.设计用于生产和表征的植酸酶变体的列表。氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1中示出的成熟亲本植酸酶分子的氨基酸编号。

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实施例2.植酸酶变体的生产

在大肠杆菌转化、测序等中使用标准分子生物学方法对DNA进行分离和酶处理(例如，分离质粒DNA、消化DNA以产生DNA片段)。所使用的基本实验室方法要么如酶、试剂或试剂盒制造商所述，要么如标准分子生物学手册所述，要么如以下实施例中所述。

编码所设计的植酸酶变体的植酸酶基因(实施例1，表1)作为合成基因订购，其使用经优化以便在里氏木霉中表达的密码子。

使用里氏木霉cbh2(cel6A)的载剂多肽(CBM和接头)编码序列，由里氏木霉cbh1(cel7A)启动子表达构建体中的植酸酶。如Paloheimo等,2003所述，在载剂多肽与植酸酶之间包括Kex2蛋白酶切割位点。使用cbh2终止子终止转录，然后通过合成amdS标记基因进行构建。此外，所述构建体含有cbh1 3'和5'侧翼区域，以便任选地使表达载体靶向cbh1基因座(图1)。

在里氏木霉原生质体中转化圆形表达质粒。在含有乙酰胺作为唯一氮源的平板上选择转化体。所使用的宿主菌株缺乏四种主要的内源里氏木霉纤维素酶：CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A。根据等,1987与Karhunen等,1993所述的修改进行转化。或者，可以使用CRISPR-Cas技术进行转化。

转化体在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上产孢，然后进行培养。

在96孔板上培养转化体(Havukainen等,2020)，以分析转化体的植酸酶产生。如实施例3所述，从作为植酸钠释放的无机磷酸酯的培养物上清中测量重组变体植酸酶的植酸酶活性。还通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从培养上清液检测重组蛋白的产生。

所有转化体都产生植酸酶活性。产生具有最高植酸酶活性的变体植酸酶的转化体和产生亲本植酸酶的参考菌株在选择板上通过单个分生孢子进行纯化，然后使它们在PDA上产孢。经过纯化、选择的转化体在摇瓶和/或生物反应器中的复杂纤维素酶诱导培养基中进行培养，得到的材料用于进一步表征和应用测试。

实施例3.植酸酶活性测定

如下所述，使用IP6和分离的IP4形式作为底物对培养物上清液进行植酸酶活性分析。

分析中使用的植酸十二钠盐(IP6)购自LabChem(C₆H₆Na₁₂O₂₄P₆，EE05501)。主要生成IP4特异性异构体级分的方法分4步进行。第一步，如Greiner和Konietzky,(1996)所述，将Quantum Blue植酸酶固定在来自General Electric(Boston，美国)的5ml HiTrap NHS活化琼脂糖柱上。第二步，固定的植酸酶在0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0中降解IP6，逐步降解为低级肌醇磷酸酯。5ml/min的流速得到了最高部分的IP4。下一步用于从溶液中除去磷酸酯，并将IP4与其它不需要的肌醇磷酸酯分离。因此，用所产生的肌醇磷酸酯混合物装载含有Bio-Rad公司(Hercules，美国)的AG1-x4树脂的手工填充阴离子交换柱，并用0.5M HCl洗脱IP₄。在最后一步，用旋转蒸发器除去HCl，并将IP4重新溶解在水中。

如下使用自动化工作站(Tecan基团有限公司，/>瑞士)筛选用于转化体选择的微量滴定板培养样品(实施例2)的活性。将用于测定的样品稀释在含有0.01％ Tween 20(Merck 822184)的0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中。还向底物溶液中加入0.01％ Tween 20。此分析中使用的底物浓度是12.7mM。将200μl样品稀释液与200μl底物混合并在37℃温育。温育恰好15分钟后，向混合物中加入400μl15％(w/v)TCA溶液(三氯乙酸，CCl₃COOH，Merck 807)以终止反应。将25μl反应混合物移入另一个孔中并加入225μl水以进行1:10稀释。加入250μl显色试剂，所述显色试剂由三体积1M硫酸(H₂SO₄，Merck 731)、一体积2.5％(w/v)钼酸铵((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，Merck1182)和一体积10％(w/v)抗坏血酸(C₆H₈O₆，AnalaR Normapur 20150)组成，并在50℃将显色反应温育20分钟。温育后，在820nm下测量吸收。将样品的吸光度与参考样品SEQ ID NO:1的吸光度进行比较。

使用植酸酶活性测定法(PPU)分析摇瓶和发酵培养样品(实施例2)的活性。在PPU分析中，一个活性单位是在pH 4.0和37℃下、在15分钟反应时间内，每一分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷酸酯的酶的量。此分析中针对IP6和IP4两种形式使用的底物浓度都是12.7mM。

将用于测定的样品稀释在反应缓冲液(0.2M柠檬酸盐缓冲液，pH4.0)中，并使用1ml酶溶液进行分析。将1ml底物加入酶溶液中并在37℃将混合物温育恰好15分钟后，通过加入2ml 15％(w/v)TCA溶液(三氯乙酸，Merck 807)来终止反应。将反应混合物冷却至室温，然后通过在试管中混合0.2ml混合物与1.8ml水来进行该1:10稀释。向管中加入2.0ml新制显色试剂并混合。显色试剂由三体积1M硫酸(H₂SO₄，Merck 731)、一体积2.5％(w/v)钼酸铵((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，Merck 1182)和一体积10％(w/v)抗坏血酸(C₆H₈O₆，AnalaRNormapur 20150)组成。将管在50℃温育20分钟并冷却至室温。此后在820nm下对酶空白测量吸收。对于酶空白，在TCA和通过15分钟温育后加入底物。通过与已知浓度的磷酸酯溶液的显色反应的标准曲线来确定释放的磷酸酯的量。

通过内部验证的植酸酶法(FTU法)分析用于胃肠道测试(GIT)的样品(实施例6)的活性。在FTU测定中，检测了通过植酸酶水解酶促作用从植酸钠底物释放的无机磷酸酯。颜色形成可通过分光光度法测量，是钼酸根和钒酸根离子与无机磷酸酯络合的结果。一个植酸酶单位(FTU)是在37℃、pH 5.50下使用60分钟温育时间时每分钟从植酸钠释放1μmol无机磷酸酯的酶的量。

在所述测定中，将2.0ml 1％植酸钠底物(LabChem EE05501，在250mM乙酸钠缓冲液中，pH 5.5，包括1mM CaCl₂·2H₂O和0.01％Tween 20)移液到塑料离心管中。底物管在37℃预温育5至10分钟，然后加入1.0ml稀释的酶样品。温育恰好60分钟后，加入2.0ml显色终止溶液，通过涡旋来混合管内容物。像样品那样制备酶空白，但在加入稀释的酶样品之前，向底物管中加入显色终止溶液。对于显色反应，在室温下将管温育20分钟，然后将其以4000rpm离心10分钟。在415nm下对酶空白测量样品吸光度。对于活性单位，制备磷酸钾标准曲线(pH 5.50)(干KH₂PO₄，使用Merck 1.04873.1作为标准物；在105℃干燥2小时后称重)。

如下制备终止溶液(临使用前制备)：对于100ml显色终止溶液，将25ml储备七钼酸铵(20g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，Merck 1182，在180ml水中，加入2ml氢氧化铵(NH₄OH，Sigma-Aldrich 22122828-30％)，最终体积200ml)与25ml储备钒酸铵溶液(0.47g钒酸铵(NH₄VO₃，Riedel de Haen 31153)混合在160ml水中；完全溶解后，加入4ml 22.75％硝酸溶液(最终体积200ml)。然后在容量瓶中加入16.5ml 22.75％硝酸溶液(HNO₃，Merck 1.00456)，然后加入蒸馏水使其体积达到100ml。

表2.由所选变体的摇瓶培养上清液测量的IP4活性与IP6活性之比。这里呈现的数值是与SEQ ID NO:1相比的相对活性。结果显示所述变体与SEQ ID NO:1相比具有增加的IP4与IP6活性之比。

实施例4.植酸酶的展开温度的分析

使用Prometheus NT.48设备(NanoTemper有限公司，Munich，德国)从培养上清液分析植酸酶变体(实施例1和实施例2)的展开温度。

测量前，样品在4℃以16000g离心10分钟，以除去任何大的聚集物。将标准级玻璃毛细管(NanoTemper有限公司)填充10至15μl样品，预先调节激发光以得到充足的F330和F350荧光信号，并且在20℃至110℃的温度范围内以1℃/min的温度梯度对样品进行测量。

展开曲线的拐点，也称为熔融温度(T_m)，由实验推导或曲线拟合确定。T_m越高的蛋白质样品越稳定。

亲本植酸酶(SEQ ID NO:1)用作分析中的参考物。

最佳变体的展开温度提高了高达3.2℃。所选变体的Prometheus分析的结果如表3所示。

表3.亲本植酸酶变体和所选植酸酶变体的展开温度。使用Prometheus设备NT.48从得自96孔培养的培养物上清液测量展开温度。

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实施例5.在饲料加工中的稳定性测试

对于在饲料加工中的稳定性测试，将植酸酶样品添加到基于小麦-豆粕的饲粮中，在90℃和95℃的温度下适应30秒，然后通过3mm模具进行团粒化。将团粒冷却并分析植酸酶活性。

所述饲料含有约65％小麦、28％豆粕、4％大豆油、1％磷酸一钙、1.4％石灰石、0.4％盐以及维生素与痕量矿物质的预混物(0.5％)。该饲料的一部分用于生产与植酸酶的预混物，加入到总饲料量并在卧式混合机中混合10分钟。取出粉状样品后，在通过阶式混合机时通过调节蒸汽添加量将饲料加热至目标温度，然后通过团粒模具。对于各个温度，在达到目标适应温度(如在临团粒化前的饲料中所测量)后10分钟获取样品。

获取团粒化饲料的样品，并通过冷空气流进行冷却。在样品分离器上均匀地获取饲料的子样品以使用饲料中植酸酶测定法(ISO 30024:2009；动物饲料——植酸酶活性的测定)进行分析。

相对于相应饲料粉状样品预处理时的活性计算植酸酶恢复率。

例如，对于BB81，植酸酶恢复率与在粉状饲料中的相应活性的比较示于图3中。如针对植酸酶SEQ ID NO:1所分析，在90℃和95℃下进行饲料加工后的BB81恢复率明显更高。这说明变体(表3)的展开温度提高转化为商业饲料团粒化中常见的条件下的高稳定性。因此，变体的高展开温度表示在涉及高温的饲料加工中的稳定性。

实施例6.胃肠道测试(GIT)结果

使用体外胃肠模拟测试系统(GIT)对所选新型植酸酶候选物降解饲料材料中的植酸酯的能力进行比较。使用SEQ ID NO:1作为参考物。

将待测植酸酶以限定的活性水平(500FTU/kg)加入基于玉米豆粕的肉鸡饲料中，然后进行模拟动物消化条件的三步连续体外测试。在40℃和相应的pH以及肉鸡嗉囊、砂囊和小肠中的pH变化下进行反应。此外，加入消化蛋白酶。为了在GIT测定中取得成功，植酸酶需要具有多种有益生化特性的组合。它需要在消化道温度下抵抗不同的pH并起作用，同时对动物消化道中存在的蛋白酶具有抗性。Sommerfeld等,2017描述了体外测试系统的细节。

根据Blaabjerg等,2010，在体外测试结束时，提取肌醇磷酸酯并从上清液中除去植酸酶，然后使用高效液相色谱法(HPLC)分析肌醇磷酸酯(IP6至IP4)。

从GIT测试获得的结果如图2所示。在GIT模拟结束时计算所分析的IP6、IP5和IP4的合计残余量，并与未使用任何植酸酶(空白)或使用相同量的SEQ ID NO:1植酸酶时得到的结果进行比较。

数据表明，与SEQ ID NO:1植酸酶相比，所述变体显著更好地降解植酸酯。与用SEQID NO:1植酸酶体外处理植酸酯后分析的量相比，IP6、IP5和IP4合计残余量为2％(BB71)；11％(BB73)；15％(BB75)；12％(BB76)；9％(BB78)；4％(BB79)；5％(BB80)；16％(BB81)和62％(BB86)。

实施例7.饲养试验

上述植酸酶变体可以单独或与其它酶组合用于动物饲养，以便从肌肉肌醇1,2,3,4,5,6六磷酸酯(InP6)释放磷。动物肠道中的InsP6降解改善了磷消化率。此外，由于InsP6及其低级肌醇磷酸酯与蛋白质、矿物质和痕量矿物质螯合导致的抗营养特性被植酸酶降低。

本发明的一些重组植酸酶变体在动物饲养中的功效已在肉鸡的生长性能研究中得到证实。对包括重组植酸酶的发酵肉汤的超滤液进行干燥，将定义的活性水平应用于试验饲粮，并将禽类的性能与饲喂不含植酸酶或含有植酸酶SEQ ID NO:1的相同饲粮组合物的肉鸡进行比较。

肉鸡试验1：将日龄雄性Cobb 430肉鸡分配到不同的处理组(各17栏×26只禽)。基于玉米-豆粕的饲粮的磷(P)和钙(Ca)含量低于饲粮的种畜推荐量(可用P1.5g/kg和Ca8.0g/kg)。添加植酸酶SEQ ID NO:1或者变体BB73、BB78或BB81，目标活性是500FTU/kg饲料。第21天，饲喂添加了BB73、BB78或BB81的饲粮的禽类的体重增加高于饲喂添加了SEQ IDNO:1植酸酶的相同饲粮的禽类。饲料效率要么与饲喂SEQ ID NO:1的禽类相同，要么改善。

肉鸡试验2：将日龄雄性Ross 308肉鸡分配到不同的处理组(各8栏×12只鸡)。玉米-大豆-油菜籽粕基础饲粮的磷和钙含量降低(BD：分别可用P含量1.9g/kg和Ca 7.5g/kg)。添加植酸酶SEQ ID NO:1或者变体BB73、BB78和BB81，目标活性是500FTU/kg饲料。第21天，饲喂添加了SEQ ID NO:1、BB73、BB78或BB81的饲粮的禽类分别实现了比饲喂无补充剂基础饲粮的禽类高出13％、15％、16％和13％的体重增加。饲料转化率要么与饲喂SEQ IDNO:1的禽类相同，要么改善。

结果显示所设计的变体在动物饲养中是有效的。

参考文献

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上文的描述通过具体实施方案和实施方式的非限制性示例的方式提供了发明人目前为进行本发明所设想的最佳模式的完全且详实的描述。

然而，对于本领域技术人员而言，很明显本发明不局限于上面呈现的实施方式的细节，而是本发明可以在不偏离本发明的特征的情况下使用等效的手段在其它实施方式中或在不同的实施方式组合中实施。

此外，上文公开的示例性实施方式的一些特征可以用于在无需相应地使用其它特征的情况下得到优点或技术效果。因此，上面的描述应被视为仅仅说明本发明的原理，并且不具限制性。因此，本发明的范围仅受权利要求限制。

序列表

<110> 生化酶股份有限公司

<120> 具有改善的稳定性和IP4活性的植酸酶变体

<130> 32243

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 1

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

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20 25 30

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<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 3

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1 5 10 15

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385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 4

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Arg Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr

35 40 45

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Leu Cys Lys Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

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Gly Ala Val Gly Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Glu

210 215 220

Gln Ala Glu Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Tyr Phe Asp Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Ile Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Glu Lys Ser Ala

275 280 285

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Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

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Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asp Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Met

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Pro Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Ala Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 5

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 5

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Arg Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ser Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Ile Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Glu Gly Cys Pro Gln Pro

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Leu Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asn Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His His Gln Ala Asp Leu Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe His Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala Ile

130 135 140

Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asn Phe Thr Arg His Tyr Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Glu Ser Pro

165 170 175

Leu Cys Lys Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ser Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Glu

210 215 220

Gln Ala Glu Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Tyr Phe Asp Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Ile Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Glu Lys Ser Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Ala His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asp Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Met

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Pro Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Ala Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 6

Arg His Gly Xaa Arg Xaa Pro

1 5

Claims

1.一种变体多肽，所述变体多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性并且包含在以下位置上的氨基酸取代的氨基酸序列：

第126位；以及

其中所述变体多肽具有植酸酶活性；并且

其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号。

2.根据权利要求1所述的变体多肽，所述变体多肽具有在第126位上的组氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的变体，所述变体还包含在第121位和/或第216位上的取代。

4.根据权利要求3所述的变体多肽，其中所述在第121位和/或第216位上的取代选自121K和216T，优选地选自P121K和M216T。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的变体多肽，与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的植酸酶相比，所述变体多肽具有增加的IP4降解活性。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽包含在选自56、67、107、154、174、180、183、202、204、211、258、271、276、277、285、302、344、352和395的位置上的至少一个其它氨基酸取代。

7.根据权利要求6所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代导致存在以下氨基酸中的至少一个：56S、67I、107N、154N、174E、180N、183A、202S、204N、204T、211V、258N、271I、276M、277A、285E、302A、344D、352M或395A。

8.根据权利要求6至7中任一项所述的变体多肽，其中所述至少一个其它氨基酸取代是选自以下的取代：A56S、V67I、D107N、D154N、Q174E、K180N、K183A、A202S、D204N、D204T、W211V、Q258N、L271I、K276M、T277A、Q285E、G302A、N344D、L352M或G395A。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽具有至少88℃、优选至少89℃、甚至更优选至少90℃的展开温度。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的变体多肽，与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的植酸酶相比，所述变体多肽具有改善的热稳定性。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

12.根据权利要求1至10中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

13.根据权利要求1至10中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

14.根据权利要求1至10中任一项所述的变体多肽，所述变体多肽包含：

15.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含允许产生至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞优选地选自：

a.丝状真菌细胞，来自子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)；优选来自粪壳菌纲(Sordariomycetes)或散囊菌纲(Eurotiomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)或粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)或散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)或粪壳菌目(Sordariales)或散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌科(Hypocreacea)或赤壳菌科(Nectriacea)或毛壳菌科(Chaetomiaceae)或曲霉菌科(Aspergillaceae)、木霉菌属(Trichoderma)(无性型肉座菌属)或镰刀菌属(Fusarium)或枝顶孢霉属(Acremonium)或腐质霉属(Humicola)或嗜热疣霉属(Thermothelomyces)或毁丝霉属(Myceliophthora)或曲霉属(Aspergillus)的成员；

16.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含经配置以产生至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽的遗传元件，并且其中所述宿主细胞是转基因植物细胞。

17.一种酶组合物，所述酶组合物包含根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽以及任选的防腐剂和/或载剂。

18.一种根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽或根据权利要求17所述的酶组合物在制造饲料或食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物中的用途，包括将所述变体多肽或所述酶组合物与所述饲料、食品、饲料添加剂、膳食补充剂或药物混合。

19.一种制造根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽的方法，所述方法包括：

a.提供多核苷酸，所述多核苷酸包含被安排用于产生根据权利要求1至14所述的变体多肽的遗传元件；以及

b.在重组宿主细胞中，优选在根据权利要求15或16所述的重组宿主细胞中表达所述多核苷酸。

20.一种动物饲料，所述动物饲料包含根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽或根据权利要求17所述的酶组合物，以及至少一种植物来源的蛋白质源，以及

21.一种饲料补充剂，所述饲料补充剂包含根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽或根据权利要求17所述的酶组合物；以及

22.一种降解或修饰含有植酸或植酸酯的材料的方法，所述方法包括用有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的变体多肽或根据权利要求17所述的酶组合物处理所述材料。