MXPA04011224A - Fitasas modificadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe fitasas modificadas. Estas fitasas estan modificadas en comparacion con una fitasa modelo en diversas posiciones, en particular para incrementar la termoestabilidad de la fitasa modificada en comparacion con la de la fitasa modelo. Las fitasas modificadas han retenido otras propiedades favorables de la fitasa de Aspergillus Niger, en particular porque en la fitasa modificada se han retenido residuos de aminoacidos especificos de la fitasa de Aspergillus Niger.

Description

FITAS AS MODIFICADAS Campo de la invención La presente invención se relaciona con fitasas modificadas. Antecedentes de la invención El fitato es abundante en plantas como una forma de almacenamiento de fosfatos. Los animales monogástricos no tienen la capacidad para liberar fosfato a partir de fitato y por ello necesitan suplementos de fosfato en sus alimentos. Actualmente, la enzima fitasa es un suplemento que se incluye en los alimentos para animales para liberar fosfato a partir de fitato. Típicamente, se agrega fitasa al alimento para animales durante el proceso de preparación del alimento. En algunas etapas del proceso de producción del alimento para animales, la fitasa es sometida a condiciones de temperatura y humedad relativamente altas. Estas condiciones tienen un efecto negativo sobre la actividad de compuestos lábiles., tal como enzimas. .

La fitasa derivada de Aspergillus niger se utiliza comúnmente en las aplicaciones de alimentos debido a las propiedades favorables de esta fitasa. Por ejemplo, presenta un amplio rango de pH óptimo en el rango ácido, una gran especificidad junto con una actividad específica relativamente alta y una gran afinidad por el ácido fítíco, de modo que aún a concentraciones bajas de ácido fítíco la enzima degrada dicho ácido fítico de forma eficaz. Además elimina de forma bastante uniforme a 5 de los 6 fosfatos del fitato sin una acumulación significativa de intermediarios, no necesita co-factores para su actividad o estabilidad y no es muy sensible a la inhibición por los ingredientes y iones de metales en el alimento. Sin embargo, la termoestabilidad de la fitasa de Aspergillus niger es relativamente baja. Por ello, persiste la necesidad de una fitasa con las mismas propiedades favorables que la fitasa de Aspergillus niger combinadas con una gran estabilidad y actividad a temperaturas altas. En la presente invención se describen fitasas modificadas con propiedades favorables, por ejemplo con respecto a la resistencia condiciones de temperatura y humedad altas. Descripción de las figuras Figura 1. Residuos del sitio activo de Aspergillus niger. Figura 2. Coordenadas del modelo IHP-S de los residuos del sitio activo de la fitasa de Aspergillus niger formando complejos con el ácido fítico (IHP 550H) Figura 3. Productividad de fitasas versus temperatura. Descripción detallada de la invención En el contexto de la presente invención, una fitasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (mioinositol hexakisfosfato) en uno o varios de los siguientes compuestos: mioinositol penta-, tetra-, tri-, di- y monofosfato y/o mioinositol. Es un hecho conocido en general que algunas fitasas no pueden hidrolizar sustancialmente el mioinositol monofosfato en mioinositol. Las enzimas fitasa pueden ser 3-fitasas o 6-fitasas (EC 3.1 .3.8 o EC 3.1.3.26, respectivamente), con referencia a la posición del primer enlace éster que es h id rol izado. Un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un polipéptido que es una fitasa modificada. El polipéptido acorde con la invención está modificado en comparación con la fitasa modelo de manera tal que el polipéptido acorde con la invención, cuando es alineado con la fitasa modelo, contiene una modificación seleccionada del grupo formado por: una sustitución de un aminoácido presente en la fitasa modelo por un aminoácido diferente, una supresión de un aminoácido presente en la fitasa modelo o una inserción de un aminoácido. La alineación del polipéptido acorde con la invención con una fitasa modelo se efectúa de manera tal que sea posible obtener una cantidad máxima de residuos homólogos (idénticos) entre el polipéptido acorde con la invención y la fitasa modelo. En una realización preferida de la invención, la modificación es una sustitución. La cantidad de modificaciones puede ser al menos uno, preferentemente al menos 10, más preferentemente al menos 20, más preferentemente al menos 30, más preferentemente al menos 40, más preferentemente al menos 50, más preferentemente al menos 70, más preferentemente al menos 80. En la presente invención, una indicación de tipo, por ejemplo, "5QS" significa que el aminoácido en la posición 5 de la fitasa modelo en cuestión es sustituido ya sea por Q o S. La naturaleza del residuo aminoacídico original depende de la fitasa modelo usada. Una indicación tipo, por ejemplo, "Q5S" significa que un residuo aminoacídico específico presente en la fitasa modelo, por ejemplo Q, es sustituido por un aminoácido diferente, por ejemplo S. La fitasa modificada ha cambiado en comparación con la fitasa modelo en, preferentemente, al menos una de las siguientes posiciones: 5, 6, 13, 19, 21 , 29, 31 , 36, 39, 43, 53, 69, 78, 81 , 85, 87, 99, 1 12, 1 13, 122, 125, 126, 128, 137, 147, 148, 157, 160, 163, 165, 169, 172, 176, 178, 180, 181 , 182, 183, 189, 194, 197, 201 , 203, 21 1 , 213, 215, 218, 222, 223, 225, 232, 233, 242, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 254, 269, 291 , 296, 310, 312, 315, 322, 330, 342, 346, 362, 365, 367, 368, 372, 374, 375, 382, 384, 395, 414, 417, 425, 428, 438, 440; o en, preferentemente, al menos una de las siguientes posiciones: 13, 19, 21 , 29, 31 , 36, 39, 43, 53, 69, 78, 81 , 85, 87, 99, 112, 1 13, 122, 125, 126, 128, 137, 147, 148, 157, 160, 163, 165, 169, 172, 176, 178, 180, 181 , 182, 183, 189, 194, 197, 201 , 203, 211 , 213, 215, 218, 222, 223, 225, 232, 233, 242, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 254, 269, 291 , 296, 310, 312, 315, 322, 330, 342, 346, 362, 365, 367, 368, 372, 374, 375, 382, 384, 395, 414, 417, 425, 428, 438, 440; o en, preferentemente, al menos una de las siguientes posiciones: 13, 19, 21 , 29, 36, 39, 43, 53, 69, 81 , 85, 87, 99, 112, 1 13, 122, 125, 126, 128, 137, 147, 148, 157, 160, 165, 169, 172, 176, 178, 181 , 183, 189, 197, 201 , 203, 213, 218, 222, 223, 225, 232, 233, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 291 , 296, 310, 312, 315, 322, 330, 342, 346, 362, 365, 367, 368, 372, 374, 375, 382, 384, 395, 417, 425, 438, 440. Más preferentemente aún, la fitasa modificada ha cambiado en comparación con la fitasa modelo en al menos una de las siguientes posiciones 31 , 78, 163,. 180, 182, 194, 211 , 215, 242, 254, 269, 414, 428, 440. En particular, la fitasa modificada contiene al menos una de las siguientes modificaciones en comparación con la fitasa modelo: 5QS, 6SH, 13G, 19P, 211, 29S, 31 FY, 36D, 39A, 43D, 53V, 69S, 78EA, 81 K, 85A, 87K, 99T, 1 12Q, 113M, 122R, 125K, 126A, 128A, 137A, 147A, 148E, 157A, 160A, 163RG, 165N, 169A, 172V, 1761, 178P, 180AG, 181A, 182STG, 183Y, 189H, 194VA, 197E, 201G, 203D, 211TL, 213A, 215SA, 218A, 222A, 223H, 225P, 232E, 233D, 242SP, 246V, 247A. 248R, 249T, 250S, 251 D, 252A, 254KE, 269NQ, 291A, 296F, 310Q, 312H, 315T, 322N, 330A, 342M, 346F, 362S, 365S, 367E, 368E, 372Y, 374A, 375S, 382A, 384A, 395K, 414PA, 417K, 425D, 428RKE, 438?, 440??; o, más preferentemente, al menos una de las siguientes modificaciones en comparación con la fitasa modelo: 5QS, 6SH, 13G, 19P, 211, 29S, 31 Y, 36D, 39A, 43D, 53V, 69S, 78A, 81K, 85A, 87K, 99T, 112Q, 113M, 122R, 125K, 126A, 128A, 137A, 147A, 148E, 157A, 160A, 163G, 165N, 169A, 172V, 1761, 178P, 180G, 181A, 182G, 183Y, 189H, 194A, 197E, 201 G, 203D, 211 L, 213A, 215A, 218A, 222A, 223H, 225P, 232E, 233D, 242P, 246V, 247A, 248R, 249T, 250S, 251 D, 252A, 254E, 269Q, 291 A, 296F, 310Q, 312H, 315T, 322N, 330A, 342M, 346F, 362S, 365S, 367E, 368E, 372Y, 374A, 375S, 382A, 384A, 395K, 414A, 417K, 425D, 428E, 438N, 440E. Más preferentemente, la fitasa modificada contiene al menos una de las siguientes modificaciones en comparación con la fitasa modelo: 31 Y, 78A, 163G, 180G, 182G, 194A, 211 L, 215A, 242P, 254E, 269Q, 414A, 428E, 440E.

La numeración de la posición usada en toda la presente invención es acorde con la numeración de la posición en la SEQ ID N°: 1. La fitasa modelo empleada en la presente invención es una fitasa que se puede obtener de un hongo filamentoso del género Aspergillus, preferentemente de la especie Aspergillus niger, o una variante de fitasa derivada de cualquiera de estas fitasas. Es un hecho conocido que las fitasas de cepas individuales de la especie Aspergillus niger muestran un bajo grado de variación, es decir, la homología de estas fitasas es de al menos un 90%. También es un hecho conocido que la especie Aspergillus niger comprende especies conocidas anteriormente como Aspergillus fícuum y Aspergillus awamorí. Más preferentemente, la fitasa modelo es la fitasa que se puede obtener de la cepa NRRL 3135 de Aspergillus niger, como se indica en la SEQ ID N°: 1. Una fitasa modelo especialmente preferida es una fitasa que contiene una combinación de residuos de aminoácidos específicos que únicamente se encuentran en la fitasa de Aspergillus niger. La fitasa modelo especialmente preferida contiene los mismos residuos de aminoácidos en el sitio activo que los aminoácidos presentes en la fitasa de Aspergillus niger en las posiciones correspondientes. Para tal fin, la presente invención describe un método para definir dichos residuos del sitio activo de la fitasa de Aspergillus niger que están presentes dentro de una determinada distancia del fitato unido. Los residuos de aminoácidos que conforman el sitio activo de la fitasa de Aspergillus niger y que son relevantes para las propiedades catalíticas en la degradación de ácido fítico por la fitasa de Aspergillus niger fueron identificados usando la estructura tridimensional de la fitasa de Aspergillus niger, que se puede obtener de Protein Data Bank (PDB) con la entrada 1 IHP (Kostrewa et al. Nature Structural Biology, 1997, 4, 185). La estructura tridimensional de Aspergillus niger no contiene el sustrato ácido fítico (mioinositol hexakisfosfato). Sin embargo, se encuentra disponible la estructura tridimensional de una fitasa de E. coli formando un complejo con el ácido fítico (PDB, entrada 1 DKQ, Lim et al., Nature Structural Biology, 2000, 7, 108). Aunque la homología de secuencias es baja, ambas fitasas presentan un parecido estructural sustancial. La superposición de las coordenadas atómicas para la fitasa(I IHP) de Aspergillus niger y la fitasa de E. coli se inició utilizando solamente los átomos de carbono alfa de los residuos que presentan un patrón de plegamiento similar en ambas fitasas. A continuación, la cantidad de residuos incluida en la superposición fue extendida en un proceso iterativo hasta que no era posible obtener una mejora adicional de la superposición. La calidad de la superposición se evaluó usando la desviación cuadrática media de los átomos usados para la superposición. En la superposición final, se sobrepusieron los segmentos de aminoácido 1 DKQ: 6-22, 46-66, 83-106, 246-257, 268-278, 296-313, 328-338, 346-351 , 375-381 , 392-398 sobre 1 IHP: 48-64, 104-124, 133-156, 270-281 , 293-303, 331 -348, 379-389, 397-402, 406-412, 422-428. Después de la superposición se tomó el sustrato de ácido fítico del sitio activo de la fitasa de E. coli y se lo transfirió al correspondiente sitio en la fitasa de Aspergillus niger. Después se tomó el complejo formado por la fitasa de Aspergillus niger con ácido fítico y se lo sometió a minimización de energía permitiendo cambios del sustrato y de los residuos del sitio activo manteniendo fija el resto de la estructura. Las minimizaciones de energía se llevaron a cabo con el programa Insight & Discover (Accelrys, San Diego, CA) con el campo de fuerza CVFF usando una estación de trabajo SGI Octane. El modelo resultante para la fitasa de Aspergillus niger formando complejo con el ácido fítico recibió el código IHP-S. Se encontró que el cálculo de la superficie disponible para el solvente para dichos residuos de aminoácidos, que presentaban al menos un átomo de carbono a una distancia de 7 Ángstroms de cualquier átomo del sustrato de ácido fítico, dio como resultado una superficie continua uniforme que delineaba un bolsillo que permitía acomodar el ácido fítico de una forma casi perfecta. Las coordenadas atómicas de los residuos que contribuyen en este bolsillo de sitio activo se muestran en la Figura 1 . El modelo IHP-S se usó además para identificar diferentes zonas de residuos alrededor del sustrato.

Los resultados se muestran en la Figura 2. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, los residuos de aminoácidos del sitio activo de la fitasa de Aspergillus niger son aquellos residuos de aminoácidos que se encuentran a una determinada distancia del ácido fítico cuando está unido al sitio activo. Preferentemente, dicha distancia es de 6 Angstrom, más preferentemente 7 Angstrom. Por lo tanto, la fitasa modelo especialmente preferida contiene los aminoácidos Q27, Y28, R58, H59, R62, P64, T65, S67, K68, Y72, D103, S140, R142, V143, E179, D188, F243, KN277, K278, H282, S337, H338, D339, N340, F380 (a una distancia de 6 Angstrom), preferentemente los aminoácidos Q27, Y28, R58, H59, G60, R62, Y63, P64, T65, DE66, S67, K68, K71 , Y72, D103, S140, R142, V143, E179, D188, E196, D239, F243, Q274, KN277, K278, H282, S337, H338, D339, N340, G341 , V378, F380 (a una distancia de 7 Angstrom). La fitasa modelo especialmente preferida contiene además los siguientes aminoácidos presentes en la fitasa de Aspergillus niger. A35, A46, N130, S141 , G167, Q168, D174, T191 , E199, E205, L220, T235, D244, I268, H306, G341 , K356, A381. Los aminoácidos de las posiciones no especificadas no son críticos para la invención. Dicha posición no especificada es una posición que no se encuentra dentro del sitio activo de la fitasa de Aspergillus niger que no es un aminoácido de Aspergillus niger como se indicó previamente y que no está sometida a modificaciones específicas como las indicadas previamente. La alineación de fitasas usando un programa de alineación conocida revelará en general cuáles son los aminoácidos que típicamente aparecen en una determinada posición. Dichos aminoácidos se pueden encontrar en cualquiera de las correspondientes posiciones no especificadas del polipéptido de la invención. Por consiguiente, un polipéptido preferido acorde con la invención es una fitasa que contiene los mismos residuos de aminoácidos en el sitio activo que los aminoácidos presentes en la fitasa de Aspergillus niger en las posiciones correspondientes, así como los aminoácidos adicionales especificados de Aspergillus niger (es decir A35, A46, N130, S141 , G167, Q168, D174, T191 , E199, E205, L220, T235, D244, I268, H306, G341 , K356, A381 ), y que además contiene una de las modificaciones indicadas previamente. Un polipéptido especialmente preferido acorde con la invención es una fitasa que además contiene al menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos: 31 Y, 78A, 163G, 180G, 182G, 194A, 21 1 L, 215A, 242P, 254E, 269Q, 414A, 428E y/o 440E. Otro polipéptido especialmente preferido acorde con la invención contiene al menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos: 180G, 182G, 242P y/o 440E; o preferentemente al menos 180G, 182G y/o 242P. En particular, la presente invención describe un polipéptido que es una fitasa modificada acorde con la SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 5 o SEQ ID N°: 7. El polipéptido de la invención puede comprender todas las modificaciones indicadas previamente. Además, el polipéptido de la invención puede comprender modificaciones adicionales que se refieren a las posiciones en el polipéptido donde dicha modificación no afecta el plegamiento o la actividad del polipéptido. Típicamente, dichas modificaciones pueden ser sustituciones conservadoras, es decir, sustituciones donde se sustituye un aminoácido no polar, polar sin carga, polar con carga o aromático por un aminoácido diferente de la misma categoría. En una realización, el polipéptido de la invención comprende un polipéptido con al menos 91 , preferentemente al menos 92, más preferentemente al menos 93, más preferentemente al menos 94, más preferentemente al menos 95, más preferentemente al menos 96, más preferentemente al menos 97, más preferentemente al menos 98 o más preferentemente al menos un 99% de homología de secuencia (identidad) con la SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 5 o SEQ ID N°: 7. El polipéptido acorde con la invención es modificado para incrementar la termoestabilidad y/o para modificar la actividad específica y/o para modificar la especificidad por un determinado sustrato y/o para modificar el pH óptimo de la enzima y/o para mejorar la estabilidad de peletizado y/o para mejorar la bioeficacia y/o para mejorar la expresión, el transporte, la maduración y semejantes, en el organismo huésped usado para producir la fitasa modificada, cuando se la compara con la fitasa modelo. En una realización preferida, el polipéptido acorde con la invención ha retenido varias de las propiedades bioquímicas de la fitasa de Aspergillus niger, en particular de la fitasa que se puede obtener de la cepa NRRL 3135 de Aspergillus niger. La propiedad bioquímica que es retenida es el valor de la Km y/o el pH óptimo en dos valores pH de 5,5 y 2,5 aproximadamente y/o la actividad específica y/o una gran actividad a temperatura fisiológica. En una realización preferida, el polipéptido acorde con la invención presenta una mayor termoestabilidad. La mayor termoestabilidad de la fitasa modificada acorde con la invención en comparación una fitasa modelo se puede expresar en términos de una vida media más prolongada a una temperatura elevada dada y/o mejores características de replegamiento / reactivación y/o una desnaturalización a mayor temperatura. Inesperadamente, el polipéptido acorde con la invención combina varias propiedades favorables de la fitasa de Aspergillus niger con una mayor termoestabilidad. Los aminoácidos que son importantes por ejemplo para la termoestabilidad o actividad del polipéptido de la invención, y por ello potencialmente sujetos a sustitución, pueden ser identificados y modificados de acuerdo con los procedimientos conocidos en el arte, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por barrido de alanina. Con esta última técnica se introducen mutaciones en cada residuo en la molécula y luego se evalúan las moléculas mutantes resultantes por su actividad biológica (por ejemplo, actividad fitasa) para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de la interacción de enzima-sustrato también pueden ser determinados mediante análisis de la estructura cristalina utilizando técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcación por foto-afinidad o modelación molecular. Los polipéptidos de la invención se pueden producir mediante síntesis aunque habitualmente se producirán por recombinación mediante expresión de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido en un organismo huésped adecuado. Se espera que el uso de células huésped de levaduras y hongos proporcione las modificaciones de post-traducción (por ejemplo, procesamiento proteolítico, miristilación, glicosilación, truncamiento y fosforilación de tirosina, serina o treonina) que pueden ser necesarias para conferir una actividad biológica óptima en los productos de expresión recombinantes de la invención.

Los polipéptidos de la invención se pueden proveer en una forma tal que se encuentren fuera de su entorno celular natural. Por consiguiente, se pueden aislar o purificar sustancialmente, como se describió previamente, o producir en una célula en la cual no aparecen en la naturaleza, por ejemplo una célula de otra especie fúngica, de animales, levaduras o bacteriana. Los polipéptidos de la invención se pueden analizar utilizando cualquier ensayo adecuado conocido por el especialista para medir una mejora en comparación con una fitasa modelo conocida en el arte. En un segundo aspecto, la presente invención provee un polinucleótido (por ejemplo aislado y/o purificado) que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto. En particular, la presente invención provee un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 5 o SEQ ID N°: 7 o un polinucleótido que comprende la SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 o SEQ ID N°: 6. Los polinucleótidos del segundo aspecto incluyen además cualquier versión degenerada de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto. Por ejemplo, el especialista puede efectuar sustituciones de nucleótidos, usando técnicas de rutina, que no afectan la secuencia de proteína codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar la utilización de codones de cualquier organismo huésped particular en el cual se expresarán los polipéptidos de la invención.

La secuencia de polinucleótidos del segundo aspecto puede ser de ARN o ADN e incluye ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferentemente, el polinucleótido es una secuencia de ADN. Los polinucleótidos de la invención se pueden sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Se pueden producir por combinación de oligonucleótidos sintetizados de acuerdo con y a lo largo de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de la invención. Como alternativa, se pueden sintetizar por mutagénesis de un polinucleótido progenitor en cualquier posición deseada. Por ejemplo, el polinucleótido de la invención se puede construir a partir de una serie de oligonucleótidos sintéticos con una longitud de 80 nucleótidos, que tienen una superposición de aproximadamente 20 nucleótidos. La PCR, típicamente de 10 pasos, se lleva a cabo con una polimerasa con una actividad correcta en todos los oligonucleótidos de 80-mer para alinear y extender los oligonucleótidos. Se lleva a cabo otra PCR con una polimerasa correcta con cebadores para PCR ubicados por los extremos 5' y 3' del fragmento deseado, para sintetizar el fragmento completo deseado. El fragmento completo se clona en un vector adecuado y se secuencia a fin de establecer si se ha obtenido, o no, la secuencia correcta. Optativamente, es posible corregir errores de secuencia, usando por ejemplo el conjunto de elementos QuickChange de Stratagene de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los polinucleótidos de la invención se pueden usar para obtener polinucleótidos que codifican otro polipéptido modificado, por ejemplo sometiendo los polinucleótidos de la invención a técnicas de mutagénesis. Se puede emplear mutagénesis dirigida al sitio para alterar los polinucleótidos de la invención en una o más posiciones específicas. Se puede emplear la tecnología de entremezclado [shuffiing] (por ejemplo como se describe en W095/22625, WO98/27230, WO98/01581 y/o WOOO/46344) para obtener variantes de polinucleótidos con una combinación aleatoria de cualquier posición variante presente en cualquier miembro de la población inicial de polinucleótidos, donde dicha población inicial incluye uno o más de los polinucleótidos acordes con la invención. La invención también provee vectores que comprenden un polinucleótido de la invención, inclusive vectores de clonación y expresión. El vector en el cual se insertará el cásete de expresión o el polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la cual se introducirá posteriormente. Por consiguiente, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un vector de plásmido, cósmido, virus o fago, provisto habitualmente con un origen de replicación. Como alternativa, el vector puede ser aquel que, cuando es introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el/los cromosoma(s) en los cuales se ha integrado. El vector puede ser un polinucleótido circular, por ejemplo un plásmido, o lineal, por ejemplo un cásete de expresión. Preferentemente, el polinucleótido de la invención se inserta en un cásete de expresión. En el cásete de expresión, el polinucleótido de la invención está ligado operativamente a una secuencia reguladora que permite expresar un polipéptido a partir de su secuencia de codificación en la célula huésped, es decir el vector es un vector de expresión. El término "ligado operativamente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descriptos guardan una relación entre sí que les permite funcionar de la manera pretendida. La secuencia reguladora, tal como un promotor, un potenciador u otra señal reguladora de la expresión, "ligada operativamente" a una secuencia de codificación está ubicada de manera tal que la expresión de dicho polipéptido a partir de la correspondiente secuencia de codificación se logra bajo condiciones que son compatibles con las secuencias reguladoras. El cásete de expresión para una célula huésped dada puede comprender los siguientes elementos ligados operativamente entre sí en orden consecutivo desde el extremo 5' hacia el extremo 3' con relación a la cadena codificadora de la secuencia que codifica el polipéptido del primer aspecto: una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido en una célula huésped dada; optativamente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde una célula huésped dada hacia el medio de cultivo; una secuencia de ADN que codifica una forma madura y preferentemente activa del polipéptido; y preferentemente también una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido. Además del promotor nativo para el gen que codifica un predecesor natural del polipéptido de la invención, se pueden usar otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El promotor puede ser seleccionado por su eficacia para dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el huésped de expresión deseado. Se pueden seleccionar promotores/potenciadores y otras señales reguladoras de la expresión para que sean compatibles con la célula huésped para la cual se ha diseñado el cásete o vector de expresión. Preferentemente, la secuencia promotora deriva de un gen de gran expresión. En el contexto de esta invención, un gen de gran expresión es un gen cuyo ARNm constituye al menos un 0,01 % (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas o, como alternativa, un gen cuyo producto genético constituye al menos un 0,2% (p/p) de las proteínas celulares totales o, en el caso de un producto genético secretado, puede ser secretado a un nivel de al menos 0,05 g/l. Los ejemplos de genes de gran expresión preferidos de los cuales derivan preferentemente los genes y/o que están comprendidos en los loci de interés predeterminados preferidos para la integración de los casetes de expresión incluyen, por ejemplo, genes que codifican enzimas glicolíticas, tal como triosa-fosfato isomerasas (TPI), gliceraldehído-fosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato quinasas (PGK), piruvato quinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), así como genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, glucanasas, cellobiohidrolasas, ß-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de elongación y proteínas ribosómicas. Los ejemplos específicos de genes de gran expresión adecuados incluyen, por ejemplo, el gen LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de metanol oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de glucoamilasa {glaA) de A. niger y A. awamori, el gen de TAKA-amilasa de A. oryzae, el gen de gpdA de A. nidulans y los genes de cellobiohidrolasa de T. reesei.

Para lograr expresión en bacterias, se pueden utilizar promotores procariontes, en particular los que son adecuados para su uso en cepas de E. coli. Los ejemplos de promotores bacterianos fuertes son los promotores de a-amilasa y SPo2, así como ios promotores los genes de proteasas extracelulares. Los promotores de levadura incluyen los promotores GAL4 y ADH de S. cerevisiae, los promotores nmt 1 y adh de S. pombe. Los ejemplos de promotores de levadura fuertes son los que se pueden obtener de los genes de alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y triosafosfato isomerasa. Los ejemplos de promotores constitutivos y/o inducibles fuertes que son preferidos para su uso en huéspedes de expresión fúngicos son los que se pueden obtener de los promotores de genes fúngicos para xilanasa (xlnA), fitasa, ATP-s inte tasa, la subunidad 9 (o/ C), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), a-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG-del gen g/aA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (9Pd). Los promotores adecuados para células vegetales incluyen los promotores de nopalina sintetasa (nos), octopina sintetasa (oes), manopina sintetasa (mas), subunidad pequeña de la ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, 35S y 19S del virus en mosaico de la coliflor (CMV) y de circovirus. Todos estos promotores se encuentran fácilmente disponibles en el arte. Si el polipéptido se produce como una proteína secretada, la secuencia de polinucleótidos que codifica la forma madura del polipéptido en el cásete de expresión está ligada operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido señal. Preferentemente, la secuencia señal es nativa (homologa) de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido. En una realización preferida de la invención, la secuencia señal se obtiene del gen de fitasa de Aspergillus niger, en particular la secuencia señal descripta en la publicación EP 0 420 358. Como alternativa, la secuencia señal es extraña (heteróloga) para la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferentemente endógena para la célula huésped en la cual se expresa la secuencia de ADN. La secuencia señal se puede usar en combinación con el promotor que dirige la expresión de la secuencia de codificación de la cual se obtuvo dicha secuencia señal, por ejemplo el promotor de amiloglucosidasa (también denominada (gluco)amilasa) de Aspergillus (niger) en combinación con la secuencia señal del gen de amiloglucosidasa (AG), ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, así como en combinación con otros promotores. También se pueden usar secuencias señal híbridas en el contexto de la presente invención. Los ejemplos de secuencias señal adecuadas para células huésped de levaduras son las secuencias señal derivadas de los genes del factor a de levadura. Una secuencia señal adecuada para bacterias es la que deriva del gen de a-amilasa (Bacillus). En algunos casos, el clivaje del péptido señal durante el pasaje del polipéptido a través de la vía secretora puede tener lugar en más de una posición, lo cual implica que se trata de un polipéptido maduro con un extremo N-terminal variable. La presente invención abarca los polipéptidos con dichos extremos N-terminales variables. En posición 3' con respecto a la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido puede haber una región no traducida 3' que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo, un terminador). El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede ser, por ejemplo, nativo para la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido. Sin embargo, se usa preferentemente un terminador de levadura en las células huésped de levadura y un terminador de un hongo filamentoso en las células huésped de hongos filamentosos. Más preferentemente, el terminador es endógeno para la célula huésped (en la cual se expresará la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido). El vector puede contener uno o varios genes marcadores seleccionares, para poder seleccionar las células transformadas entre una mayoría de células no transformadas. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen, por ejemplo, los que complementan un defecto en la célula huésped o los que confieren resistencia a un fármaco. Incluyen por ejemplo, genes marcadores versátiles que se pueden usar en la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, tal como genes o ADNc de acetamidasa (los genes o ADNc de amdS, niaD, facA de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) o genes que proveen resistencia a antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina o benomilo (benA). Como alternativa, se pueden emplear marcadores de selección específicos, tal como marcadores auxotróficos que necesitan las correspondientes cepas huésped mutantes: por ejemplo URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pirG o pirA (de A. nidulans o A. niger), argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección es suprimido de la célula huésped transformada después de introducir la construcción de expresión con el fin de obtener células huésped transformadas capaces de producir un polipéptido libre de los genes de los marcadores de selección. Otros marcadores incluyen el gen de ATP sintetasa, de la subunidad 9 (o//C), de orotidina-5'-fosfato-decarboxilasa (pwA), el gen de resistencia bacteriano G418 (que también se puede emplear en levadura, pero no en hongos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina {Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica ß-glucuronidasa (GUS). Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o para usar en la transfección o transformación de una célula huésped. La secuencia de ADN que codifica el polipéptido es introducida preferentemente en la célula huésped adecuado como parte de un cásete de expresión. Para transformar el huésped adecuado con un cásete de expresión, existen procedimientos de transformación que son bien conocidos por los especialistas. El cásete de expresión se puede usar en la transformación del huésped como parte de un vector que contiene un marcador seleccionable o bien, el cásete de expresión puede ser co-transformado como una molécula separada junto con el vector que contiene un marcador seleccionable. El vector puede comprender uno o varios genes marcadores seleccionares. Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el vector o la construcción de expresión se integra preferentemente en el genoma de la célula huésped con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para determinadas levaduras también son adecuados los vectores episómicos en los cuales se puede incorporar la construcción de expresión para lograr un nivel de expresión alto y estable. Los ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo AMA1 de Aspergillus). Cuando las construcciones de expresión se integran en el genoma de las células huésped, dichas construcciones se integran ya sea en loci aleatorios en el genoma o bien, en loci de interés predeterminados usando recombinación de homólogos, en cuyo caso los loci de interés comprenden preferentemente un gen de gran expresión. Previamente en este documento se enumeraron varios ejemplos de genes de gran expresión adecuados. También se proveen células huésped que comprenden un polinucleótido o un vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo para el genoma de la célula huésped. En este contexto, el término "heterólogo" significa que el polinucleótido no aparece naturalmente en el genoma de la célula huésped o que el polipéptido no es producido naturalmente por dicha célula. Las células huésped adecuadas son preferentemente microorganismos procariontes, tal como bacterias, o más preferentemente organismos eucariontes, por ejemplo hongos, tal como levaduras u hongos filamentosos, o células vegetales. Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como huéspedes heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas hacia el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.

Las células huésped de levaduras preferidas para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la invención pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia y Schizosaccharomyces. Más preferentemente, la célula huésped de levadura se selecciona del grupo formado por las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia apolítica y Schizosaccharomyces pombe. Las más preferidas son células huésped de hongos filamentosos. Dichas células huésped de hongos filamentosos se seleccionan del grupo formado por los géneros Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia y Talaromyces. La célula huésped de hongos filamentosos más preferida pertenece a las especies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o el grupo de especies de Aspergillus niger (según la definición de Raper y Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, págs. 293-344, 1965). Estas incluyen, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, y comprende además las especies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris. Los ejemplos de huéspedes de expresión preferidos comprendidos por el alcance de la presente invención son hongos, tal como especies de Aspergillus y especies de Trichoderma; bacterias, tal como especies de Bacillus, por ejemplo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amiloliquefaciens, especies de Pseudomonas; y levaduras, tal como especies de Kluyveromyces por ejemplo Kluyveromyces lactis y especies de Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. Las células huésped acordes con la invención incluyen además células vegetales, y la invención por ello se extiende a organismos transgénicos, tal como plantas y partes de las mismas, que contienen una o varias células de la invención. En la planta transgénica (o modificada genéticamente) se puede entonces haber insertado (por ejemplo de forma estable) en su genoma una secuencia que codifica uno o varios de los polipéptidos de la invención. La transformación de células vegetales se puede llevar a cabo usando técnicas conocidas, por ejemplo con un plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede entonces contener las secuencias necesarias para infectar una planta y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri. Como alternativa, se puede infectar directamente una parte de una planta, tal como una hoja, raíces o tallos. En esta técnica, la planta a infectar puede ser lesionada, por ejemplo cortando la planta con una hoja de afeitar o pinchando la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. A continuación se inocula Agrobacterium en la lesión. La planta o parte de planta se puede cultivar luego sobre un medio de cultivo adecuado y dejar que se desarrolle en una planta madura. La regeneración de las células transformadas en plantas modificadas genéticamente se puede lograr usando técnicas conocidas, por ejemplo por selección de los brotes transformados usando un antibiótico y por subcultivo de los brotes sobre un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas vegetales y semejantes. Un aspecto adicional de la invención provee entonces células huésped transformadas o transfectadas o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferentemente, el polinucleótido está contenido en un vector para la replicación del polinucleótido y la expresión del polipéptido. Se elegirán las células que son compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procariontes (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levadura o vegetales. También se puede elegir un huésped heterólogo en el cual el polipéptido de la invención se pueda producir de una forma que está sustancialmente libre de otros polipéptidos con actividad similar a la del polipéptido de la invención. Esto se puede lograr seleccionando un huésped que no produce normalmente dichos polipéptidos con actividad similar. Si los polinucleótidos de la invención se incorporan en un vector de replicación recombinante, se puede usar el vector para replicar el polinucleótido en una célula huésped compatible. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención provee un método para producir un polinucleótido acorde con la invención que comprende la introducción de un polinucleótido acorde con la invención en un vector replicable, la introducción del vector en una célula huésped compatible y el cultivo de la célula huésped bajo condiciones que permitan la replicación del vector. El vector que contiene el polinucleótido acorde con la invención puede ser recuperado de la célula huésped. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, tal como E. coli. En un aspecto adicional, la invención provee un proceso para preparar un polipéptido acorde con la invención que comprende el cultivo de una célula huésped (por ejemplo transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió previamente) bajo condiciones que permitan expresar (por el vector) el polipéptido acorde con la invención y, optativamente, recuperar el polipéptido expresado. Preferentemente, el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de polinucleótidos que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión está ligada operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido señal. Las células huésped recombinantes acordes con la invención se pueden cultivar usando los procedimientos conocidos en el arte. Para cada combinación de promotor y célula huésped, existen condiciones de cultivo que conducen a la expresión del polipéptido de la invención. Después de alcanzar la densidad de células deseada o se detiene el título del polipéptido en el cultivo y luego se recupera el polipéptido usando procedimientos conocidos. El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contenga una fuente de carbono (por ejemplo glucosa, maltosa, molasas), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, fuentes de nitrógeno orgánico, por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona) y otras fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Se puede incluir, optativamente, un inductor.

La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del huésped de expresión y/o se puede basar en los requerimientos reguladores de la construcción de expresión. Dichos medios son conocidos por los especialistas en el arte. El medio puede contener, si se desea, componentes adicionales que favorezcan los huéspedes de expresión transformados con respecto a microorganismos potencialmente contaminantes. La fermentación se puede llevar a cabo sobre un período de 0,5-30 días. Puede ser un proceso por lotes, continuo o de lotes alimentados, convenientemente a una temperatura en el rango entre 0 y 45 °C y, por ejemplo, a un pH entre 2 y 10. Las condiciones de fermentación preferidas son: una temperatura en el rango entre 20 y 37 °C y/o un pH entre 3 y 9: Las condiciones apropiadas se seleccionan habitualmente sobre la base de la elección del huésped de expresión y la proteína a expresar. Después de la fermentación, si fuera necesario, las células se pueden retirar del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Una vez terminada la fermentación o después de retirar las células, se puede recuperar el polipéptido de la invención y, si se desea, puede ser purificado y aislado utilizando medios convencionales. Convenientemente, el polipéptido de la invención se combina con vehículos o diluyentes adecuados (sólidos o líquidos), que incluyen soluciones amortiguadoras, para producir una composición de polipéptidos. El polipéptido se puede unir o mezclar con un transportador, por ejemplo se puede inmovilizar sobre un transportador sólido. Por consiguiente la presente invención provee en un aspecto adicional una composición que comprende un polipéptido de la invención. Esta se puede encontrar en una forma adecuada para el envasado, transporte y/o almacenamiento, preferentemente para que sea retenida la actividad del polipéptido. Las composiciones pueden ser en pasta, líquidas, emulsiones, polvos, escamas, granulados, pelets u otra forma extrudada. La composición puede comprender además ingredientes adicionales, tal como una o varias enzimas (adicionales). El polipéptido se formula típicamente de manera estable, ya sea en una forma líquida o seca. Típicamente, el producto se elabora como una composición que optativamente puede incluir, por ejemplo, una solución amortiguadoras estabilizante y/o un conservante. La invención se relaciona además con una composición o un aditivo para alimentos o alimentos para animales que comprende uno o varios polipéptidos de la invención. El polipéptido presente en el alimentos puede encontrarse a una concentración diferente de su concentración natural. Las cantidades preferidas comprenden entre 0,1 y 100, tal como entre 0,5 y 50, preferentemente entre 1 y 10, mg por kg de alimento. La invención también se relaciona con un proceso para la preparación de una composición de alimento para animales, comprendiendo dicho proceso la adición del polipéptido de la invención a una o varias sustancias o ingredientes comestibles. Los polipéptidos se pueden agregar a la composición de alimento para animales separadamente de las sustancias o ingredientes del alimento, individualmente o en combinación con otros aditivos de alimentos. El polipéptido puede ser una parte integral de una de las sustancias o ingredientes del alimento. Los polipéptidos de la invención también se pueden agregar al alimento para animales para mejorar la degradación de los constituyentes vegetales, por ejemplo fitato, que conducirá a una mejor utilización de los nutrientes de la planta por el animal. Ventajosamente, los polipéptidos de la invención puede continuar la degradación de fitato en el alimento in vivo. Los polipéptidos basados en hongos de la invención tienen en particular un pH óptimo más bajo y tienen la capacidad de liberar nutrientes importantes en entornos acídicos tal como el estómago de un animal. Los polipéptidos de la invención también se pueden usar durante la producción de sustitutos (o reemplazos) de leche de soja. Estos sustitutos lácteos pueden ser consumidos por seres humanos y/o animales. La composición puede comprender además (en particular cuando se formula para su uso en alimentos para animales) uno o varios ionóforos, agentes oxidantes, agentes tensioactivos, aminoácidos protegidos contra el rumen, mejoradores de enzimas o enzimas que pueden ser producidas de forma natural en el tracto gastrointestinal de los animales que recibirán el alimento. Cuando se agrega a los alimentos (incluyendo el ensilaje) de rumiantes o animales monogástricos (por ejemplo, aves de corral o porcinos) los alimentos pueden comprender cereales, tal como cebada, trigo, maíz, centeno o avena, o productos secundarios de cereales, tal como salvado de trigo o salvado de maíz, u otros materiales vegetales, tal como porotos de soja y otras legumbres. La o las enzimas pueden mejorar significativamente la degradación del material vegetal lo que conducirá a una mejor utilización de los nutrientes vegetales por el animal. Como consecuencia de ello es posible mejorar el índice de crecimiento y/o de conversión del alimento. Los polipéptidos de la invención se pueden aplicar particularmente a los alimentos para animales ya que aún pueden estar activos bajo condiciones muy acídicas, tal como en el estómago de los animales. Un método para lograr una adición (exógena) del polipéptido de la invención consiste en agregar dicho polipéptido como un material vegetal transgénico y/o como semillas (por ejemplo transgénicas). El polipéptido se puede haber sintetizado entonces por expresión genética heterologa, por ejemplo el gene que codifica la enzima deseada se puede clonar en un vector de expresión vegetal, bajo el control de las señales de expresión vegetales apropiadas, por ejemplo un promotor específico de tejidos, tal como un promotor específico de semillas. El vector de expresión que contiene al gen que codifica el polipéptido se puede transformar posteriormente en células vegetales y las células transformadas pueden ser seleccionadas para su regeneración en plantas completas. Las plantas transgénicas obtenidas de esa manera se pueden cultivar y cosechar y aquellas partes de las plantas que contienen el polipéptido heterólogo (para la planta) se pueden incluir en una de las composiciones, ya sea como tal o después de un procesamiento adicional. El polipéptido heterólogo puede estar contenido en las semillas de las plantas transgénicas o puede estar contenido en otras partes de la planta, tal como raíces, tallos, hojas, madera, flores, corteza y/o frutos. Las plantas adecuadas incluyen cereales, tal como avena, cebada, trigo, maíz y arroz. La adición del polipéptido en la forma de un material vegetal transgénico, por ejemplo en semillas transgénicas, puede requerir el procesamiento de dicho material vegetal para que el polipéptido se vuelva disponible, o al menos para mejorar su disponibilidad. Dichas técnicas de procesamiento pueden incluir diversas técnicas mecánicas (por ejemplo molienda y/o trituración) o tratamientos termomecánicos, tal como extrusión o expansión. La presente invención también se relaciona entonces con un proceso para promover el crecimiento y/o la conversión de alimentos en un animal monogástrico o no rumiante, comprendiendo dicho proceso la alimentación del animal con el polipéptido de la invención. Los animales adecuados incluyen animales de granja, monogástricos y/o no rumiantes, tal como cerdos (o lechones), aves de corral (tal como pollos, pavos), novillos o terneros o animales acuáticos (por ejemplo marinos) (por ejemplo peces). Ejemplo 1 Construcción de cepas productoras de fitasa Se obtuvieron fragmentos de ADN con secuencias acordes con las SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 y SEQ ID N°: 6 de forma sintética. Después de verificar la secuencia de ADN, estos fragmentos de genes sintéticos se fusionaron con la secuencia señal de fitasa de A. niger usando PCR y clonaron bajo el control de un promotor de glucoamilasa. Para tal fin, se reemplazó el gen phyA presente en el vector de expresión pGBTOPFYTI como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 98/46772 por los genes de fitasa modificada que se describieron previamente, con lo cual se obtuvieron los vectores pTHFYT2, pTHFYT4 y pTHFYT6, respectivamente. Los vectores de expresión pTHFYT2, pTHFYT4 y pTHFYT6 fueron introducidos en la cepa CBS 646.97 de Aspergillus niger (descripta en WO 98/46772). Los transformantes que contenían pTHFYT2, pTHFYT4 o pTHFYT6 fueron seleccionados usando PCR. Con el fin de determinar si estos transformantes podían secretar una fitasa activa, los transformantes fueron cultivados sobre placas que contenían fitato como describió Chen (1998, Biotechnol. Technique 12, 759-761 ). En esto ensayo se visualiza un halo alrededor de las colonias de Aspergillus si hay secreción de una fitasa activa, debido a la degradación del fitato. El uso de este ensayo permitió demostrar que todos los vectores de expresión dieron como resultado transformantes que secretaban una fitasa activa FYT2, FYT4 o FYT6 hacia el medio. Los transformantes que claramente mostraban halos fueron cultivados en frascos con agitación. Se inocularon 107 esporas de transformantes seleccionados y cepas control en los frascos con agitación, que contenían 20 mi de medio de precultivo líquido que contenía, por litro: 30 g de maltosa. H20; 5 g de extracto de levadura; 10 g de caseína hidrolizada; 1 g de KH2PO4; 0,5 g de MgS04.7H20; 0,03 g de ZnCI2; 0,02 g de CaCI2; 0,01 g de MnS04.4H20; 0.3 g de FeS04.7H20; 3 g de Tween 80; 10 mi de penicilina (5000 UI/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); pH 5,5. Estos cultivos fueron a 34 °C durante 20-24 horas. Se tomaron 10 mi de este cultivo y se inocularon en 100 mi de medio de fermentación de A. niger que contenía, por litro: 70- g de maltodextrinas; 25 g de caseína hidrolizada; 12,5 g de extracto de levadura; 1 g de KH2P04; 2 g de K2S04; 0,5 g de gS04.7H20; 0,03 g de ZnCI2; 0,02 g de CaCI2; 0,01 g de MnS04.4H20; 0,3 g de FeS04.7H20; 0 mi de penicilina (5000 UI/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); ajustado a pH 5,6 con H2S04 4 N. Estos cultivos fueron cultivados a 34 °C durante aproximadamente 6 días. Se centrifugaron muestras tomadas del caldo de fermentación (10', 5.000 rpm en una centrífuga de canasto basculante) y se recolectaron los sobrenadantes. Ejemplo 2 Termoestabilidad de FYT2, FYT4 v FYT6 Se produjeron las fitasas FYT2, FYT4, FYT6 y la fitasa de tipo salvaje de A. ficuum (EP 0 420 358) en frascos con agitación como se explicó en el Ejemplo 1. Después de producir las fitasas se tomaron muestras a intervalos de tiempo apropiados y se evaluaron los sobrenadante por su actividad fitasa de acuerdo con el método descripto por van Engelen et al. (Journal of AOAC International 1994, 77: 760-764). La actividad se expresó en FTU, donde 1 FTU es la cantidad de enzima que libera 1 µ???? de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones de la prueba (pH = 5,5, temperatura 37 °C, fitato de sodio 5 mM). La termoestabilidad se midió con los sobrenadantes como tal. Cuando fuera necesario, los sobrenadantes de fitasa fueron concentrados además por ultrafiltración. La termoestabilidad se midió de tres maneras diferentes. En primer lugar, se determinó la T50 de la fitasa. La T50 (en °C) es la temperatura a la cual el 50% de la actividad se ha perdido después de haber calentado las muestras durante 20 minutos. Condiciones experimentales: la prueba del estrés se llevó a cabo en HAc/NaAc/Tween20 250 mM pH = 4,0. La fitasa se incorporó en dosis de 0,6 FTU/ml. Después del calentamiento, las muestras se enfriaron inmediatamente sobre hielo. A continuación, se midió la actividad fitasa residual en HAc/NaAc/Tween20 250 mM, pH = 4,0. Los resultados se muestran en la Tabla 1 . Los compuestos FYT2 y FYT4 son aproximadamente 8-9 °C más estables. Tabla 1 : Termoestabilidad de diversas fitasas Fitasa T50 (°C) Topt (°C) DSC Td (°C) FYT2 74 75 79 FYT4 73 75 79 FYT6 65 68 70 Tipo salvaje 65 64 70 En segundo lugar, se determinó la actividad de las fitasas durante el calentamiento. Cuando se lleva a cabo en función de la temperatura de calentamiento, el experimento permite obtener la temperatura óptima (Topt) de la enzima con respecto a la productividad. La incubación se llevó a cabo sobre un período de tiempo fijo de 30 minutos. La cantidad de sustrato convertida depende de la actividad enzimática así como de la inactivación. Por ello se prefiere usar el término productividad en lugar de actividad. Condiciones experimentales: HAc/NaAc/Tween20 250 mM, pH = 4,0, dosis de fitasa de aproximadamente 0,012 FTU/ml. El fosfato liberado se puede medir utilizando los métodos de ensayo estándar descriptos previamente. Los resultados se muestran en la Figura 3. La FYT2 así como la FYT4 son las más eficaces con respecto a la productividad catalítica a 75 °C, temperatura a la cual el control de tipo salvaje ha perdido completamente su actividad catalítica. Aunque la actividad comienza a disminuir por encima de los 75 °C, en la Figura 3 se muestra que FYT2 así como FYT4 son catalíticamente competentes hasta una temperatura de aproximadamente 85 °C. El comportamiento de FYT6 es intermedio entre el tipo salvaje y FYT2 o FYT4. En tercer lugar, además de medir la termoestabilidad mediante un ensayo de actividad apropiado, la termoestabilidad de las fitasas también se midió directamente por determinación de la temperatura a la cual se desnaturaliza la estructura tridimensional de la enzima fitasa. El efecto del calor que acompaña a la desnaturalización se puede medir directamente por Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC). Condiciones experimentales de la DSC: HAc NaAc 250 mM, pH = 4,0, fitasa 5mg/ml aproximadamente, la velocidad de calentamiento es de 2,5 °C/min. Los resultados se muestran en ia Tabla 1. Se puede observar que la estructura de la enzima nativa se conserva a una temperatura que es aproximadamente 9 °C mayor para las fitasas modificadas FYT2 y FYT4 que para la fitasa de tipo salvaje. Ejemplo 3 Estabilidad del peletizado de FYT2, FYT4 y FYT6 Se llevaron a cabo pruebas con dos matrices peletizadas y ajustes de temperatura con filtrados de cultivos de FYT2, FYT4 y FYT6. Todos los granulados se obtuvieron mezclando / amasando filtrados de cultivos con la cantidad requerida de almidón de maíz (gel C de Cerestar) y agua. Véase las Tablas 2 y 3 por la composición de la mezcla húmeda. Después del mezclado y amasado, la mezcla se extruyó con un extrusor Nica E-220 y se esferonizó con un esferonizador Fuji Paudal QJ-400G. Las partículas obtenidas se secaron en el secador de lecho fluido Glatt GPCG 1.1. La actividad de los gránulos comprendía entre 2500 y 3000 FTU/g. Tabla 2: Composición de la mezcla de gránulos RDS 05 Fitasa Enzima líquida (g) Almidón (g) Agua (g) FYT2 176 748 123 FYT4 238 1 137 194 FYT-6 377 1300 156 Tipo salvaje 127 1300 352 Tabla 3: Composición de la mezcla c e gránulos RDS A1 Fitasa Enzima líquida (g) Almidón (g) Agua (g) FYT2 241 1300 274 FYT4 271 1300 259 FYT-6 290 1622 362 Tipo salvaje 109 1300 363 Se mezclaron 250 gramos de granulos en 25 kg de alimento con la composición acorde con la Tabla 4 y se mezcló todo justo antes de la prueba con 225 kg de la misma receta. Los 25 kg de alimento se mezclaron en un mezclador orbital Cohete MP90 durante 10 minutos. Se mezclaron 25 kg y 225 kg de alimento en un mezclador Nauta de 1200 litros. Se tomaron muestras de esta mezcla para determinar la estabilidad del peletizado. Esta mezcla de 250 kg se dosificó en un mezclador / acondicionador con un dosificador a rosca, a una velocidad de 600 kg/h, donde se calentó por inyección directa de vapor hasta alcanzar 80 °C. El tiempo de residencia fue de aproximadamente 0-15 segundos, después de lo cual la mezcla caliente se empujo dentro de la prensa de peletizado. La matriz usada en las pruebas era de 5/45 mm (ancho / longitud; RDS 05) o 3/65 mm (ancho / longitud; RDS A1 ). La temperatura de los pelets que salían de la prensa de peletizado era de 82-83 °C (RDS 05) o 91-93 °C (RDS A1 ). Después del prensado los pelets caían sobre una cinta de enfriamiento, de esta cinta se tomaron muestras para evaluar la estabilidad. Tabla 4: Composición del alimento para aves de corral usado en las pruebas con los peletizados RDS 05 y RDS A1 Materiales crudos Contenido en % RDS 05 RDS A1 Maíz 45 50 Arvejas (20,7% cp) 5 - Harina de colza 4,5 Harina de semillas de girasol 4,5 Harina con gluten de maíz 2,5 Porotos de soja enteros (tostados) 10 6 Harina de soja (46,7% cp) 27,50 21 Tapioca (almidón 62,5-67,5) 4,72 3,85 Aceite de soja (aceite vegetal) 3,50 1.0 Grasa animal - 3,7 Premezcla de vit./min. Mervit 100 1 ,00 0,5 Piedra caliza 1 ,35 1 ,35 Fosfato monocálcico 1 ,30 0,2 Sal 0,35 0,18 NaHCOs 0,25 L-lisina 0,05 0,26 DL-metionina 0,23 0,18 L-treonina 0,03 Tabla 5: Rendimiento del peletizado de las fitasas termoestables (RDS 05). La temperatura de la harina caliente era de 80 °C. La temperatura del pelet alcanzó aproximadamente 82-83 °C. Los rendimientos se basan en la medición de la actividad antes y después del peletizado usando el ensayo de fitasa estándar (van Engelen et al., Journal of AOAC International 1994, 77: Tabla 6: Rendimiento del peletizado de las fitasas termoestables (RDS 01 ). La temperatura de la harina caliente era de 80 °C. La temperatura del pelet alcanzó aproximadamente 92-93 °C. Los rendimientos se determinaron Fitasa Rendimiento del peletizado en % FYT2 39 FYT4 37 FYT6 19 De tipo salvaje 12 Las pruebas con el peletizado muestran un incremento similar en la termoestabilidad de FYT2, FYT4 y FYT6 en comparación con el tipo salvaje a 82 °C, mientras que a 92 °C, FYT2 y FYT4 mostraron una mayor estabilidad en comparación con FYT6. Ejemplo 4 Características bioquímicas de las fitasas Se determinó la actividad específica de las fitasas después de purificar dichas fitasas a partir de filtrados que se obtuvieron después de filtración del caldo de fermentación. La purificación de las fitasas se realizó utilizando cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad o una combinación de ambos métodos. La cromatografía de afinidad de las fitasas glicosiladas se llevó a cabo usando una matriz de afinidad ConA (Concanavalina A) (HiTrap Con A, Amersham Pharmacia Biotech). La fitasa se unió a la columna en Tris 20 mM / NaCI 0,5 M /MnCI2 1 mM /CaCI2 1 mM / pH = 7,4. Después de un lavado exhaustivo de la columna, la fitasa se eluyó con Tris 20 mM / NaCI 0,5 M / metil-a-glucopiranósido 0,5 M / pH = 7,4. La regeneración de la columna se hizo con Tris 20 mM pH = 8,5. El pH de las soluciones amortiguadoras se ajustó con HCI 4N. La cromatografía de intercambio iónico se llevó a cabo usando un intercambiador de aniones (Resource Q, Amersham Pharmacia Biotech). El desalado y los cambios de solución amortiguadora se efectuaron usando una columna de gel filtración PD-10. El equilibrio de la columna se efectuó en Tris 50 mM, pH = 7,5. Después de cargar la muestra de fitasa, dicha fitasa se eluyó usando un gradiente de NaCI de 0 a 1 M en Tris 50 mM, pH = 7,5.

El contenido de proteínas de la fitasa purificada se determinó por medición E280, donde una concentración de fitasa de 1 mg/ml corresponde a una D028o,icm = 0,938. Para FYT2, FYT4 y FYT6, los valores de D028o,icm a 1 mg/ml corresponden a 0,995, 0,995 y 0,963, respectivamente. La actividad se determinó en FTU como describió van Engelen et al. (Journal of AOAC International 1994, 77: 760-764). Los valores de Km para el ácido fítico fueron determinados por medición de la velocidad de reacción inicial en función de la concentración de sustrato. Las mezclas de ensayo contenían ya sea 1 ,0; 0,5; 0,2; 0,1 ; 0,05; 0,025; 0,015 mM de ácido fítico en solución amortiguadora de NaAc 250 mM pH = 5,5. La reacción enzimática se detuvo con TCA 15% (1 :1 ). El fosfato inorgánico liberado fue determinado mezclando la mezcla de reacción detenida con H2SO4 0,6 M - ácido ascórbico 2% - molibdato de amonio 0,5% (1 :1 ), incubando la mezcla durante 20 minutos a 50 °C y midiendo la absorbancia a 820 nm (Wyss et al. Appl Env Microbiol 1999, 65: 367-373). Los resultados se muestran en Tabla 7. Tabla 7: Propiedades catalíticas de las fitasas con ácido fítico como sustrato En la Tabla 7 se muestra que en comparación con el tipo salvaje la actividad específica así como la gran afinidad por el ácido fítico no son afectadas por las modificaciones efectuadas. La dependencia del pH de la actividad de las fitasas se determinó midiendo la velocidad de liberación de fosfato del ácido fítico a diferentes valores de pH. En principio se usó el ensayo de fitasa estándar, excepto que se varió el pH. La actividad a pH = 5,6 se tomó como el 100% de actividad. Se usaron las siguientes soluciones amortiguadoras para definir el pH del experimento: glicina 250 mM en el rango de pH de 2,8 a 3,2; NaAc 250 mM en el rango de pH de 3,6 a 5,6; imidazol 250 mM en el rango de pH de 6 a 7 y Tris 250 mM en el rango de pH de 7,5 a 9. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Tabla 8: Dependencia del pH de la actividad enzimática fitasa. La actividad se expresa como el porcentaje de actividad máxima observada a pH = La dependencia del pH de la actividad de las fitasas modificadas es muy similar a la del tipo salvaje. En particular, se mantiene la característica de la fitasa de tipo salvaje de exhibir dos valores de pH óptimos. Un pH óptimo se encuentra alrededor de pH = 2,5 y el segundo óptimo alrededor de pH = 5,5. En la Tabla 8 se muestra que esta característica particular de la fitasa de tipo salvaje de Aspergillus niger no es afectada por las modificaciones que dan como resultado FYT2, FYT4 y FYT6. Las curvas cinéticas después de la degradación del ácido fítico por la fitasa en función del tiempo se registraron en NaAc 250 mM, pH = 5,5 a 37 °C. La dosificación de la fitasa fue de 0,05 FTU/ml a una concentración de sustrato de 0,2 mM de ácido fítico. La reacción enzimática se detuvo con TCA 15% (1 :1 ). El fosfato inorgánico liberado fue determinado mezclando 100 µ? de la mezcla de reacción con 1400 µ? de H2S04 0,3 M - ácido ascórbico 1 % -molibdato de amonio 0,27%, incubando después la mezcla durante 20 minutos a 50 °C y midiendo la absorbancia a 820 nm. Los resultados se muestran en Tabla 9. Tabla 9: Curvas cinéticas ara la de radación de ácido fítico or fitasas Se muestra que las fitasas modificadas tienen un comportamiento muy similar a la fitasa de tipo salvaje en cuanto a liberación de fosfato del ácido fitico. Después de una hora, las curvas cinéticas alcanzaron una meseta con un 80-85% aproximadamente de los fosfatos liberados. Todas las fitasas alcanzan esta meseta a una velocidad similar, lo cual indica que la eficacia de la fitasa de tipo salvaje en cuanto a liberación de fosfatos del ácido fitico no es afectada por las modificaciones efectuadas en las fitasas modificadas. En conclusión, los resultados muestran que las modificaciones de FYT2, FYT4 y FYT6 no afectan el rendimiento catalítico de las fitasas modificadas dadas en comparación con el tipo salvaje. Se muestra que el hecho de evitar toda mutación de los aminoácidos que se muestran en la Figura 1 (Residuos dentro de la zona de 7 Ángstroms alrededor del sustrato) y la retención de los aminoácidos adicionales de Aspergillus niger permite conservar las propiedades funcionales de la fitasa de tipo salvaje de Aspergillus niger. Ejemplo 5 Bioeficacia de las fitasas modificadas Prueba con fitasas líquidas Se llevó a cabo una prueba de bioeficacia para comparar las fitasas termoestables recientemente generadas usándolas en una formulación líquida aplicada a los pelets después del peletizado. Las enzimas fueron aplicadas a dosis tales que la actividad fitasa añadida sería de 100, 200 o 300 FTU/kg de alimento. La prueba se llevó a cabo con pollos (5-33 días) alimentados con una dieta basada en maíz-soja (un alimento los primeros 14 días de la prueba y otra dieta, ligeramente diferente, durante los últimos 14 días). El contenido de fósforo absorbible de las dietas básales era de 2,2 g/kg de alimento (día 5-19) y 1 ,7 g/kg de alimento (día 19-33). Estos valores son muy inferiores a los requerimientos estimados para los animales. Los animales fueron alojados en seis corrales de piso por tratamiento, con 14 aves en cada uno. Los resultados fueron calculados sobre la base del contenido de fitasa analizado (FTU/kg), usando los métodos descriptos por Finney (1964: Statistical method in biological assay. Charles Griffin, Londres). Los resultados para el peso corporal se muestran en la Tabla 10. Tabla 10. Eficacia relativa de las diferentes fitasas (aplicadas después del peletizado como líquidos) sobre el peso corporal, en comparación con el tipo salvaje (= 100%), calculada sobre todo el período experimental (5-33 días), basado en la ac Las pendientes de las curvas de regresión para todos los productos eran significativamente diferentes de cero. Como resulta evidente a partir de los datos de la tabla 10, se aprecia poca diferencia entre los productos con la FYT4. Los animales alimentados con esta enzima no se comportaron como los animales alimentados con las otras fitasas, pero la diferencia no era estadísticamente significativa. Prueba con fitasas en qránulos Se llevó a cabo una prueba para comparar las fitasas termoestables en una formulación de gránulos, aplicada a los pelets antes del peletizado. Esto significa que las fitasas pasaron por ei proceso de peletizado. En esta prueba, el peletizado se llevó a cabo a temperaturas realmente altas: los pelets se encontraban aproximadamente a 92 °C. Dado que la meta era lograr adiciones de 100, 200 ó 300 FTU/kg al alimento ofrecido a los animales, se realizó una prueba de pre-peletizado para estimar la pérdida de actividad durante este proceso y los productos fueron sobredosificados hasta tal grado que se alcanzaron las actividades mencionadas. La prueba se llevó a cabo de manera similar a la prueba con el producto líquido, usando pollos (5-33 días) alimentados con una dieta basada en maíz-soja (solamente una dieta para todo el período), con un contenido de fósforo absorbible muy inferior al requerimiento estimado para estos animales (1 ,9 g/kg de alimento). Los animales fueron alojados en seis jaulas de piso por tratamiento, con 14 aves en cada jaula. Los resultados de las pendientes relativas de las curvas de regresión para la ganancia de peso se muestran en la Tabla 1 1 . Tabla 11. Eficacia relativa de las diferentes fitasas sobre la ganancia de peso corporal (aplicadas como granulados, excepto el tipo salvaje que se aplicó a los pelets como una formulación líquida después del peletizado) en comparación con el tipo salvaje (= 100%), calculada sobre todo el período experimental (5-33 días), basada en la actividad fitasa analizada.

La fitasa FYT2 presentó el mejor rendimiento en esta prueba, seguida de las fitasas FYT6, FYT4 y la de tipo salvaje. Ejemplo 6 Mutantes individuales de las fitasas FYT2 y FYT6 Se prepararon los siguientes mutantes individuales de las fitasas FYT2: Y31 F, A78E, G163R, G180A, G182S, A194V, L21 1T, A215S, P242S, E254K, Q269N, A414P, E428R y E440A y de la fitasa FYT6: E440A. Para ello, se amplificó el gen que codifica FYT-2 (SEQ ID N°: 2) o FYT6 (SEQ ID N°: 6) por PCR en un volumen total de 50 µ? usando 2,5 U de Pwo polimerasa (Roche diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemania), 100 ng de templado de ADN, dNTP 0,5 mM, solución amortiguadoras Pwo 1 x, DSM-1 F 10 pmol y DSM-1 R 10 pmol bajo las siguientes condiciones: 5' 94 °C, 30x (.30" 94 °C 1 " 60 °C 2' 72 °C), 5' 72 °C. El fragmento amplificado se clonó en el vector PCR®-Blunt-TOPO (Invitrogen life technologies, Carisbad, CA, EE.UU.) y las mutaciones fueron introducidas usando el conjunto de elementos QuickChange de Stratagene (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Las secuencias de los cebadores DSM-1 F y DSM- R eran: DSM-1 F 5' GGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT 3* DSM-1 R 5' GTCATCGCGATTAATTAATCTAAGCAAAACACTCCTCCCAGTT 3' Se usaron los siguientes cebadores para la mutagénesis, en los cuales se han resaltado los codones mutados. Mutación Conjunto de cebadores Y31 F 5'- GGTCAATACTCCCCGTTCTTCTCTCTGGCAGAC - 3' 5 - GTCTGCCAGAGAGAAGAACGGGGAGTATTGACC - 3' A78E 5' - TCCGCTCTCATTGAGGAGATCCAGAAGAACGCG - 3' 5' - CGCGTTCTTCTGGATCTCCTCAATGAGAGCGGA - 3' G163R 5' - AAGCTGGCCGATCCTCGTGCCAACCCCGGCCAA - 3' 5' - TTGGCCGGGGTTGGCACGAGGATCGGCCAGCTT - 3' G180A 5' - GTGATCATTCCCGAGGCCGCCGGCTACAACAAC - 3' 5 - GTTGTTGTAGCCGGCGGCCTCGGGAATGATCAC - 3* G182S 5' - ATTCCCGAGGGCGCCTCATACAACAACACTCTC - 3' 5' - GAGAGTGTTGTTGTATGAGGCGCCCTCGGGAAT - 3' A194V 5' - CACGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAGAGCGAA - 3' 5' - TTCGCTCTCTTCGAAGACAGTGCAGGTGCCGTG - 3' L21 1T 5' - GCCAATTTCACCGCCACGTTCGCCCCCGCCATT - 3' 5' - AATGGCGGGGGCGAACGTGGCGGTGAAATTGGC - 3' A215S 5' - GCCCTGTTCGCCCCCTCCATTCGTGCCCGTCGT - 3' 5" - ACGACGGGCACGAATGGAGGGGGCGAACAGGGC - 3' P242S 5' - CTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCGTCGCC - 3' 5' - GGCGACGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG - 3' E254K 5' - ACCTCCGACGCCACCAAGCTGTCCCCCTTCTGT - 3' 5' - ACAGAAGGGGGACAGCTTGGTGGCGTCGGAGGT - 3' Q269N 5' - CATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAG - 3* 5' - CTGGAGGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTCATG - 3' A414P 5' - CCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATAAGTTGGGG - 3' 5' - CCCCAACTTATCAACCGGACACCCATGCAGCGG - 3' E428R 5' -CGGGATGACTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCT - 3' 5' - AGCAAAGCTCAACCCCCTCACAAAGTCATCCCG - 3' E440A 5' - TCCGGGGGTAACTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG - 3' 5' - CTAAGCAAAACACTCCGCCCAGTTACCCCCGGA - 3' Las secuencias de los fragmentos de ADN de fitasa resultantes fueron comprobadas mediante análisis de secuencia. Las secuencias de fitasas se clonaron en el pGBTOPFYTI y los sobrenadantes de cultivo se prepararon como se describió en el Ejemplo 1. Se determinó el valor T50 para cada mutante individual y para FYT2 y FYT6 (véase el Ejemplo 2). Los resultados se muestran en la Tabla 12. Tabla 12: Valores T50 de mutan es de fitasas Fitasa T50 °C FYT2-Y31 F 74 FYT2-A78E 74 FYT2-G163R 74 FYT2-G180A 71 FYT2-G182S 73 FYT2-A194V 74 FYT2-L21 1 T 74 FYT2-A215S 74 FYT2-P242S 73 FYT2-E254K 73 FYT2-Q269N 74 FYT2-A414P 74 FYT2-E428R 74 FYT2-E440A 74 FYT6-E440A 65 FYT2 74 FYT6 65 La mayoría de los mutantes obtenidos muestran valores de T50 comparables a la fitasa FYT2. Inesperadamente, el valor T50 de FYT6, que contenía una combinación de todas las mutaciones individuales, es considerablemente inferior al de los mutantes individuales.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> DSM IP Assets B.V. <120> FITASAS MODIFICADAS <130> 20720WO <160> 7 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> FITASA MADURA DE ASPERGILLUS NIGBR <400> 1 Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln 1 5 10 15 Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe 20 25 30 Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val lie Ser Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Glu lie Gln 65 70 75 80 Gln Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu 100 105 110 Leu Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr 115 120 125 Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140 Ala Ser Gly Lys Lys Phe lie Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160 Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys lie Asp Val Val 165 170 175 Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys 180 185 190 Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser lie Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Le 210 215 220 Ser Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 Cys Ser Phe Asp Thr lie Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu 245 250 255 Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Asn Tyr Asp Tyr 260 265 270 Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285 Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 Ser Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 Ser His Asp Asn Gly lie lie Ser lie Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu Asn lie Thr Gln 355 360 365 Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Leu 370 375 380 Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp 405 410 415 Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe 420 425 430 Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Ala Glu Cys Phe Ala 435 440 <210> 2 <211> 1335 <212> ADN <213> ADN SINTÉTICO <220> <221> CDS <222> (1) .. (1335) <223> > <400> 2 gcc tcg aga aat tcc cae agt tgc gat acg gtc gat ggc ggg tat caá 48 Ala Ser Arg Asn Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln 1 5 10 15 tgc ttc ecc gag ate tcg cat ctt tgg ggt caá tac tcc ceg tac ttc 96 Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 tet ctg gca gac gaa tcg gcc ate tcc ect gac gtg ecc gcc gga tgc 144 Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 aga gtc act ttc gtc cag gtc etc tcc cgt cat gga gcg cgg tat ceg 192 Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 acc gac tcc aag tcc aag aaa tac tcc gct etc att gag gcc ate cag 240 Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala lie Gln 65 70 75 80 aag aac gcg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag acá tac Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 aac tac acc ttg ggt gca gat gac ctg act ecc ttc gga gaa cag cag 336 Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln 100 105 110 atg gtc aac tcc ggc ate aag ttc tac cgc cgg tac aag gcc ctc gcc Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125 agg aac ate gtt cea ttc ate cga gcc tet ggc tcc age cgc gtg ate Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140 gcc tcc gcc gag aaa ttc ate gag ggc ttc cag age gcc aag ctg gcc Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 160 gat ect ggc gcc aac ecc ggc caá gcc teg ecc gtc ate gac gtg ate Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 att ecc' gag ggc gcc ggc tac aac aac act ctc gac cae ggc acc tgc lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 act gcc ttc gaa gag age gaa ttg ggc gat gac gtc gaa gcc aat ttc Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 acc gcc ctg ttc gcc ecc gcc att cgt gcc cgt ctg gag gcc cae ctg Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220 ecc ggt gtg act ctc acá gac gag gac gtg acc tac ctc atg gac atg Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 tgc ecc ttc gac acc gtc gcc cgc acc tcc gac gcc acc gag ctg tcc Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255 ecc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gaa tgg ate cag tac gac tac Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gln Tyr Asp Tyr 260 265 270 ctc cag tcc ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac ceg ctc Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285 ggc ceg gcc cag ggc gtc ggc ttc gct aac gag ctc ate gcc cgt ctg Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 acc cae teg ect gtc cag gat cae acc agt acc aac cae act ttg gac Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 teg aac ceg gct acc ttt ceg ctc aac gcc act ctc tac gcg gac ttt Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 teg cat gac aac ggc atg ate tcc att ttc ttt gct tta ggt ctg tac Ser His Asp Asn Gly Met He Ser He Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 aac ggc act aag ccg cta tct acc acg tcc gtg gag tcc ate gag gag 1104 Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser He Glu Glu 355 360 365 acá gat gga tac teg gee tcc tgg acg gtt ccg ttt gct gee cgt gee Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380 tac gtc gag atg atg cag tgt cag gcg gag aag gag ccg ctg gtc cgt 1200 Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 gtc ttg gtt aat gat cgc gtt gtc ccg ctg cat ggg tgt gee gtt gat 1248 Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415 aag ttg ggg aga tgt acc cgg gat gac ttt gtg gag ggg ttg age ttt 1296 Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430 gct aga tcc ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt gct tag 1335 Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440 <210> 3 <211> 444 <212 P T <213 PROTEÍNA PRODUCIDA A PARTIR DE LA SEQ ID N° : 2 <400> 3 Ala Ser Arg Asn Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln 1 5 10 15 Cys Phe Pro Glu He Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala He Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu He Glu Ala He Gln 65 70 75 80 Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln 100 105 110 Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125 Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val 130 135 140 Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 ISO Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220 Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Árg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255 Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gln Tyr Asp Tyr 260 265 270 Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285 Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365 Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380 Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415 Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430 Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440 210> 4 211> 1335 212> ADN 213 > ADN SINTÉTICO 220> 221> CDS 222> (1) .. (1335) 223> <400> 4 gcc tcg aga aat caá tcc agt tgc gat acg gtc gat ggc ggg tat caá 48 Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln 1 5 10 15 tgc ttc ccc gag ate tcg cat ctt tgg ggt caá tac tcc ceg tac ttc 96 Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 tet ctg gca gac gaa tcg gcc ate tcc ect gac gtg ccc gcc gga tgc 144 Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys aga gtc act ttc gtc cag gtc ctc tcc cgt cat gga gcg cgg tat ccg 192 Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 acc gac tcc aag tcc aag aaa tac tcc gct ctc att gag gcc ate cag 240 Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala lie Gln 65 70 75 80 aag aac gcg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag ac tac 288 Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 aac tac acc ttg ggt gca gat gac ctg act ecc ttc gga gaa cag cag 336 Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln ¦ ··· 100 105 110 atg gtc aac tcc ggc ate aag ttc tac cgc cgg tac aag gcc ctc gcc 384 Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125 agg aac ate gtt cea ttc ate cga gcc tet ggc tcc age cgc gtg ate 432 Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140 gcc tcc gcc gag aaa ttc ate gag ggc ttc cag age gcc aag ctg gcc 480 Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 160 gat ect ggc gcc aac ecc ggc caá gcc teg ecc gtc ate gac gtg ate 528 Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 att ecc gag ggc gcc ggc tac aac aac act ctc gac cae ggc acc tgc 576 lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 act gcc ttc gaa gag age gaa ttg ggc gat gac gtc gaa gcc aat ttc 624 Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 acc gcc ctg ttc gcc ecc gcc att cgt gcc cgt ctg gag gcc cae ctg 672 Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220 ecc ggt gtg act ctc acá gac gag gac gtg acc tac ctc atg gac atg 720 Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 tgc ecc ttc gac acc gtc gcc cgc acc tcc gac gcc acc gag ctg tcc 768 Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255 ecc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gaa tgg ate cag tac gac tac 816 Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gln Tyr Asp Tyr 260 265 270 ctc cag tcc ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac ccg ctc 864 Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285 ggc ccg gcc cag ggc gtc ggc ttc gct aac gag etc ate gcc cgt ctg 912 Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 acc cae teg ect gtc cag gat cae acc agt acc aac cae act ttg gac 960 Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 teg aac ccg gct acc ttt ccg etc aac gcc act etc tac gcg gac ttt 1008 Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 teg cat gac aac ggc atg ate tec att ttc ttt gct tta ggt ctg tac 1056 Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 aac ggc act aag ccg cta tet acc acg tec gtg gag tec ate gag gag 1104 Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365 acá gat gga tac teg gcc tec tgg acg gtt ccg ttt gct gcc cgt gcc 1152 Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380 tac gtc gag atg atg cag tgt cag gcg gag aag gag ccg ctg gtc cgt 1200 Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 gtc ttg gtt aat gat cgc gtt gtc ccg ctg cat ggg tgt gcc gtt gat 1248 Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415 aag ttg ggg aga tgt acc cgg gat gac ttt gtg gag ggg ttg age ttt 1296 Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430 gct aga tec ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt gct tag 1335 Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440 <210> 5 <211> 444 <212> PRT <213> PROTEÍNA PRODUCIDA A PARTIR DE LA SEQ ID N° : 4 <400> 5 Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln 1 5 10 15 Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala lie Gln 65 70 75 80 Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln 100 105 110 Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125 Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140 Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 160 Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220 Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255 Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gln Tyr Asp Tyr 260 265 270 Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285 Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365 Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380 Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415 Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430 Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440 <210> 6 <211> 1335 <212> ADN < 13> ADN SINTÉTICO <220> <221> CDS <222> (1) (1335) gcc tcg aga aat caá tcc agt tgc gat acg gtc gat ggc ggg tat caá 46 Ala Sar Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr al Asp Gly Gly Tyr Gln 1 5 10 15 tgc ttc ccc gag ate tcg cat ctt tgg ggt caá tac tcc ceg ttc ttc 96 Cys Phe Pro Glu lie Ser Bis Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe 20 25 30 tet ctg gca gac gaa tcg gcc ate tcc cct gac gtg ccc gcc gga tgc 144 Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 aga gtc act tt gtc cag gtc etc tcc CQt. c&t gga gcg cgg tat ceg 192 Arg Vil Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg Hia Cly Ala Arg í'ys Pro 50 55 60 acc gac tcc aag tcc aag aaa tac tcc gct etc att gag gag ate cag 240 Thr. Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Glu lie Gln 65 10 "75 80 aag aac gcg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag acá tac 28T Lya Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 aac tac acc ttg ggt gca gat gac Ctg act ccc ttc gga gaa cag cag Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln 100 105 110 atg gtc aac tcc ggc ate aag ttc tac cgc cgg tac aag gcc etc gcc Met val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125 agg aac ate gtt cea ttc ate cga gcc tet ggc tcc age cgc gtg ate Arq Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140 gcc tcc gcc gag aaa ttc ate gag ggc ttc cag age gcc aag ctg gcc Ala Ser Alo Glu Ly3 Phe lie Glu Gly Phe Gln Ser Ala Ly5 Leu Ala 145 150 155 160 gat cct cgt gcc aac ccc ggc caá gcc tcg ccc gtc ate gac gtg ate Asp Pro Arg Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 H5 att ccc gag gcc gcc tea tac aac aac act etc gac cae ggc acc tgc lie Pro Glu Ala Ala Ser Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 act gtc ttc gaa gag age gaa ttg ggc gat gac gtc gaa gcc aat ttc Thr Val Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 acc gcc acg ttc gcc ccc tcc att cgt gcc cgt ctg gag gcc cae ctg Thr Ala Thr Phe Ala Pro Ser lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220. ccc ggt gtg act cfcc acá gac gag gac gtg acc tac ctc atg gac atg Pro Gly Val Thr Leu Thi Asp Glu Asp Val Thr í'yx Leu Met Asp Met 225 230 235 240 tgc tcc ttc gac acc grtc gcc cqc acc tcc gac gcc acc aag ctg tcc Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Lys Leu Ser 245 250 255 ccc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gas tgg ate aac tac gac tac Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Asn Tyr Asp Tyr 260 265 270 ctc cag tcc ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac c g ctc Leu Gln Ser Leu Lys Lya Tyr Tyr Gly His Gly Ala; Gly Asn Pro Leu 275 280 285 ggc ceg gcc cag ggc gtc ggc ttc gct aac gag ctc ate gcc cgt ctc Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 acc cae teg ect gtc cag gat cae acc agt acc aac cae act ttg gac Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr 3er Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 tcg aac ceg gct acc ttt ceg ctc aac gcc act ctc tac gcg gac ttt Ser, Asn Pro Ala Thr Fhe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 tcg cat gac aac ggc atg ate tcc att ttc ttt gct tta ggt ctg tac Ser His Asp Asn Gly Met lia Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 aac ggc act aag ceg cta tet acc acg tcc gcg gag tcc ate gag gag Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser al Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365 acs gat gga tac tcg gcc tcc tgg acg gtt ceg ttt gct gcc cgt gcc 1152 Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 310 375 380 tac gtc gag atg atg cag tgt cag gcg gag aag gag ceg ctg gtc cgt 1200 Tyr al Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 3B5 390 395 400 gtc ttg gtt aat gat cgc gtt gtc ceg ctg cat ggg tgt ceg gtt gat 12 AB Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp 405 410 415 aag ttg ggg aga tgt acc cgg get gac ttt gtg agg ggg ttg age ttt 1296 Lys Leu G) y Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe 420 425 0 gct aga tcc ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt gct tag 1335 Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Aló 435 440 <210> 7 <211> 444 <212> PRT Val Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 Thr Ala Thr Phe Ala Pro Ser lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220 Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Lys Leu Ser 245 Z50 255 Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Asn Tyr Asp 260 265 270 Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 2T5 Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Pfte 325 330 335 Ser His Asp Asn Gly Mee lie Ser lie Phe Ph« Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 A3A Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365 Thr Asp Gly Tyr Ser Ala 3er Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Aro Ala 370 375 380 Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp 405 «10 41S Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg A=p Asp Phe Val Arg Gl.y Leu Ser Fhe «20 425 430 Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glü Cys Phe Ala 435 440

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido, caracterizado porque es la SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 5 o SEC ID NO : 7. 2. Un polipéptido con al menos 91, preferiblemente al menos 92, más preferiblemente al menos 93, más preferiblemente al menos 94, más preferiblemente al menos 95, más preferiblemente al menos 96, más preferiblemente al menos 97, más preferiblemente al menos 98 o más preferiblemente al menos 99% de homología de secuencia (identidad) a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1. 3. Un polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes . 4. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es el ADN. 5. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende la SEC ID NO : 2 , SEC ID NO : 4 O SEC ID NO: 6. 6. Un vector caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 7. Un vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque es un vector de expresión, tal como donde la secuencia del polinucleótido que codifica al péptido está enlazada operablemente a una secuencia reguladora. 8. Una célula hospedera caracterizada porque expresa, como una proteína heteróloga, un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2. 9. Una célula hospedera caracterizada porque está transformada con el polinucleótido de las reivindicaciones 3 a 5, o el vector de la reivindicación 6 o 7. 10. Un proceso para producir un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, el proceso caracterizado porque comprende el cultivo de células hospederas como se define en la reivindicación 8 o 9 bajo condiciones que proporcionan la expresión del polipéptido. 11. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
2. 2.