TW200403341A - Modified phytases - Google Patents

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200403341 (1) 玖、發明說明 ί胃明所屬之技術領域】 本發明係關於改質之植酸|每。 【先前技術】 植物含有大量之植酸鹽作爲磷酸鹽之儲藏形式。單 同動物不^從植酞鹽中釋出磷酸鹽，因此需要在飼料中 補充磷酸鹽。如今可在動物飼料中補充植酸酶以自植酸 鹽中釋出磷酸鹽。 植酸酶一般是在製作飼料的過程中添加動物飼料。 在某些動物飼料製造過程的階段中，植酸酶會逢及較高 溫及較高溼度。此類條件對於不穩定型化合物（例如酵 素）之活性上有負面影響。 源自黑曲霉的植酸酶，由於植酸酶的有利性質而常 用於飼料用途。例如，在酸性的範圍中其具有較大的最 適酸鹼度、寬廣的專一性、對植酸有相對的高比活性以 及高親和性，即使在低植酸濃度下該酵素亦可有效地降 解植酸。彼可從植酸鹽中順利地移除6個磷酸鹽中的5 個磷酸鹽，而不會顯著的堆積中間物，彼之活性或穩定 性不需要輔助因子加以維持，彼對飼料成份及金屬離子 之抑制並不敏感。 然而，黑曲霉植酸酶的耐熱性較低。因此，植酸酶 須要具有與黑曲霉植酸酶相等的有利性質且在高溫下具 S4y - 4 - (2) (2)200403341 有高穩定性及活性。 本發明揭示具有有利性質的改質之植酸酶，例如對 高溫及溼度具有抗性。 【發明內容】 本發明中’植酸酶是酵素，其可催化植酸鹽（肌纖 維醇六磷酸鹽）水解形成一種或多種下列化合物：肌纖 維醇五_、四_、二_、二-以及單-磷酸鹽及/或肌纖維醇。 一般已知某些植酸酶不能將肌纖維醇單磷酸鹽大量水解 成肌纖維醇。植酸酶酵素可爲3 ·植酸酶或6 -植酸酶（分 別爲E C 3 . 1 . 3 . 8或E C 3 . 1 · 3 · 2 6 )，代表第一個水解的酯 鍵位置。 本發明之第一特色係關於改質之植酸酶的多肽。相 較於模型植酸酶’依據本發明之多肽係經修飾，當彼排 列至模型植酸酶後，含有之修改係選自：取代存在於模 型植酸酶之胺基酸成爲不同之胺基酸、刪除存在於模型 植酸酶之胺基酸、或插入胺基酸。將依據本發明多狀排 列至模型植酸酶後可取得依據本發明之多肽與模型植酸 酶之間最大量的同源殘基。 本發明較佳的具體實施例中，該修改爲取代。 修飾數目可至少爲一個，較佳者至少1〇個，更佳者 至少20個，更佳者至少30個，更佳者至少4〇個，更佳 者至少50個’更佳者至少70個’更佳者至少8〇個。 在本發明中，例如” 5 Q s ”的表 衣不沄思指，模型植酸酶 (3) (3)200403341 中位置5之胺基酸經Q或S取代。原本的胺基酸殘基的 本質取決於使用之模型植酸酶。例如’’ Q 5 S ”的表示法意 指，存在於模型植酸酶之專一性胺基酸殘基（例如 Q ) 經不同胺基酸例如S取代。 優於模型植酸酶之改質植酸酶至少有一個下列位置 係經修飾：5，6，1 3，1 9，2 1，2 9，3 1，3 6，3 9，4 3， 53， 69， 78， 81， 85， 87， 99， 112， 113， 122， 125， 126，1 28，137，147，148，157，1 60，163，165，169 ，1 72，176，1 78，1 80，181，182，183，189，1 94， 1 97，20 1，2 0 3，2 1 1，213，215，218，222，22 3，225 ，2 3 2，2 3 3，242，246，2 4 7，24 8，249，2 5 0，25 1， 252 ， 254 ， 269 ， 291 ， 296 ， 310 ， 312 ， 315 ， 322 ， 330 ，3 42，3 4 6，3 62，3 6 5，3 6 7，3 6 8，3 72，3 74，3 7 5， 382， 384， 395， 414， 417， 425， 428， 438， 440 ；或較 佳者至少一個下列位置： 1 3，1 9，2 1，2 9，3 1，3 6，3 9 ，43， 53， 69， 78， 81， 85， 87， 99， 112， 113， 122， 125，1 26，128，137，147，148，157，160，1 63，1 65 ，1 69，1 72，1 76，1 78，1 80，181，1 82，1 83，1 89， 1 94，1 97，20 1，20 3，21 1，213，215，218，22 2，223 ，2 2 5，2 3 2，2 3 3，242 ， 2 4 6，247，24 8，249，2 5 0， 25 1，2 5 2，2 5 4，269，291，2 9 6，310，312，315，322 ，3 3 0 ， 3 42 ， 3 46 ， 3 62 ， 3 6 5 ， 3 67 ， 3 6 8 ， 3 72 ， 3 74 ， 3 7 5 ， 3 82 ， 3 8 4 ， 3 9 5 ， 414 ， 417， 42 5 ， 42 8 ， 4 3 8 ， 440 (4) (4)200403341

特 定言之 ，相較 於模型植酸酶， 改質之植酸 酶含有 至少一 個下列 修飾： 5QS， 6SH， 13G， 19P， 21 1，29S ，3 1 Y， 36D， 39A，43D，53V，69S ，78 A，8 1 K， 85Α， 87K，99 丁，112Q，113M，122R，125K，126A， I 28 A， 1 3 7 A， 1 47 A， 1 48E， 1 57A，160A， 1 63G，1 65Ν ，1 69 A ，1 72 V ，176 1 ,178P， 1 80G，181 A， 1 82G，1 83Υ ，1 89H ，1 94 A ，1 97E ，20 1 G ， 203D ， 211 L，2 1 3 A， 2 1 5 A， 2 1 8 A， 222A， 2 2 3 H， 225P ， 232E ， 2 3 3 D，242Ρ ，246 V ，24 7 A ，24 8 R，249T，2 5 0 S，25 1 D ， 252Α ， 2 5 4E， 26 9Q， 29 1 A， 2 96F， 3 1 0Q，312H， 315Τ ， 322Ν ，3 3 0A ，3 42M ，3 4 6 F ，3 62 S ，365S ， 367E ， 368Ε ， 372Υ ，3 74A ，3 7 5 5，3 8 2 A，3 8 4A，3 95 K，414A，417K，42 5D， 428E， 438N， 440E° 本發明使用之位置編號係依據序列確認號碼：1之位 置編號。 本發明中使用之模型植酸酶是得自曲霉屬絲狀真菌 之植酸酶，較佳者是得自黑曲霉，或源自任何此類植酸 酶之變異體植酸酶。已知在黑曲霉個別品系內的植酸酶 顯示低程度之變化，即此類植酸酶之同源現象至少爲 9 0 %。已知黑曲霉菌種包含習知的無花果曲霉以及泡盛曲 霉。最佳之模型植酸酶是得自黑曲霉NRRL 3135的植酸 酶，如序列確認號碼：1。 尤佳的模型植酸酶是內含專一性胺基酸殘基組合之 植酸酶，其係獨特地存在於黑曲霉植酸酶。 (5) (5)200403341 尤佳者’模型植酸酶之活性部位的胺基酸與在黑曲 霉植酸酶對應位置上的胺基酸殘基相同。因此，本發明 揭不一種方法’耢以定義一些位於黑曲霉植酸酶活性部 位上、出現在距結合植酸鹽一段距離內之殘基。 形成黑曲霉植酸酶活性部位以及黑曲霉植酸酶降解 植酸相關的催化性質的胺基酸殘基係使用黑曲霉植酸酶 ：> D結構加以確g忍’該結構可來自蛋白質資料庫（p 〇 b ) 之入口 1IHP ( Kostrewa et al.Nature Structural Biology ，1 997，4，185 )。黑曲霉3D結構不含反應受質植酸（ 肌肌醇六磷酸鹽）。然而，是可得到與植酸複合的大腸 f干囷植酸酶之3D結構的（PDB入口 1 DKQ，Lim et al. 5 Nature Structural Biology，2000，7，108)。雖然序 列同源現象低，此二植酸酶均顯示實質構造的類似性。 開始時僅使用展示相似的摺疊模式之黑曲霉植酸酶（ 1 I Η P )以及大腸桿菌植酸酶的α碳原子之重疊的原子座 標。其後，延伸疊加的殘基，反複延伸直到疊加數目不 再增加爲止。使用疊加原子的均方根差判斷疊加品質。 於最終疊加後，胺基酸片段1 D K Q : 6 - 2 2，4 6 - 6 6，8 3 _ 106 ， 246-257 ， 268-278 ， 296-313 ， 328338 ， 346-351 ， 375-381’ 392-398 可重豐上 1ΙΗΡ:48-64， 104-124， 133 ，156 ， 270-281 ， 293-303 ， 331-348 ， 379-389 ， 397-402 ，406-412 ， 422-428 ° 疊加大腸桿菌植酸酶活性部位之受質植酸之後，轉 移至黑曲霉植酸酶的對應位點。接著將複合植酸的黑曲 (6) (6)200403341 霉植酸酶之能量最小化’使受質與活性部位殘基位移而 仍使其餘的結構保持固定。用I n s i g h t & D i s c 〇 v e r程式（ Accelrys，San Diego CA)，使用 SGI Octane 工作站之 力場CVFF進行能量最小化。產生的複合植酸與黑曲霉植 酸酶的模型編碼爲IHP-S。計算胺基酸殘基溶劑易接近的 表面後發現受質植酸任何原子之距離7埃內至少有一個 原子，可勾劃出內含植酸袋幾近理想之光滑的連續表面 。促成此活性部位袋之殘基的原子座標給定於圖1。此外 ，：[ΗΡ-S模型可用以確認受質周圍殘基的不同區域。結果 如圖2。 因此，在本發明中，黑曲霉植酸酶之活性部位的胺 基酸殘基係與在活性部位結合的植酸相距某段距離內。 較佳者相距6埃，更佳者7埃。 因此，尤佳的模型植酸酶含有胺基酸 Q27，Y28， R58 ， H59 ， R62 ， P64 ， T65 ， S67 ， K68 ， Y72 ， D103 ， S140，R142，V143，E179，D188，F243，KN2 7 7，K278 ，H282， S337， H338， D339， N340， F380(距離 6 埃以 內），較佳之胺基酸爲 Q27，Y28，R58，H59，G60， R62 ， Y63 ， P64 ， T65 ， DE66 ， S67 ， K68 ， K71 ， Y72 ， D 1 03，S 140，R 1 42，V 1 43，E 1 79，D 1 88，E196，D23 9 ，F243，Q2 74，KN277，K27 8，H2 8 2，S 3 3 7，H 3 3 8， D339，N340，G341，V378，F380 (距離 7 埃以內）。 尤佳的模型植酸酶尙含有存在於黑曲霉植酸酶之下 列胺基酸： A35， A46， N130， S141 ， G167， Q168， (7) (7)200403341 D174，T1 9 1，Ε199，Ε2 0 5，L220，Τ2 3 5，D2 44，I2 6 8， Η306 ， G341 ， Κ356 ， Α381 。 對於本發明而言，非特定位置上具有何種胺基酸殘 基並不具關鍵性。該非特定位置是不在黑曲霉植酸酶活 性部位內之位置，而且不是以上黑曲霉額外地特定胺基 酸’而且不是用在以上特定的專一性修飾。使用習知的 排列程式排列植酸酶將可暸解那一個胺基酸會典型地發 生在那些位置上。任何該胺基酸均可存在於本發明多肽 對應的非特定位置。 因此，依據本發明較佳的多肽是與存在於黑曲霉植 酸酶活性部位對應位置的胺基酸含有相同胺基酸殘基， 以及額外地特定的黑曲霉胺基酸（即A 3 5，A 4 6，N 1 3 0， S141 ， G167 ， Q168 ， D174 ， ΤΙ 91 ， El 99 ， E205 ， L220 ’ T2 3 5，D244，I2 6 8，H3 0 6，G341，K3 5 6，A3 8 1 )、而 且進一步的含有以上特定修飾之植酸酶。 特定言之’本發明揭示之多肽是依據序列確認號碼 :3或序列確認號碼：5的改質之植酸酶。 本發明多肽可包含所有以上設定之修飾。此外，本 發明多肽可包含額外的修飾，其中該多肽之修飾位置不 會影響多肽之摺疊或活性。典型地，該修飾可爲保守的 取代，即非極性、極性不帶電的、極性帶電價的或芳系 胺基酸可經相同類型之不同胺基酸取代。 具體貫施例之一中’本發明多肽可包含與序列確認 號碼：3或序列確認號碼·· 5之序列有至少9 ；[，較佳者至 (8) 200403341 少9 2，更佳者至少9 3，更佳者至少9 4，更佳者至少9 5 ，更佳者至少96，更佳者至少97，更佳者至少98或最 佳者至少9 9 %的同源現象（相同性）。

相較於模型植酸酶，依據本發明之多肽係經修飾以 提高耐熱性及/或修改比活性及/或修改某些受質之專一性 及/或修改酵素之最適酸鹼度；及/或改良成錠穩定性及/ 或改良生物功效，及/或改良在用於產生改質之植酸酶的 宿主生物體內之表現、運輸、成熟、及其類似者。 在較佳的具體實施例中，依據本發明之多肽仍保留 許多黑曲霉植酸酶（尤其是黑曲霉NRRL 3135植酸酶） 的生化學性質。保留的生化學性質是生理溫度的Km値及 /或一個p Η値約5 · 5及2.5之最適酸驗度及/或比活性及/ 或高活性。

在較佳的具體實施例中，依據本發明之多肽可提高 耐熱性。相較於模型植酸酶，依據本發明改質之植酸酶 耐熱性增加，可在升高的溫度下有更長的生命期及/或在 較高的溫度下改良重新摺疊/再活化之特性及/或反摺疊之 特性。 出人意外地’依據本發明之多肚在提高耐熱性後有 許多黑曲霉植酸酶的有利性質。 因此對本發明多肽之（例如1 ^如）耐熱性或活性重要的

胺基酸’可依據技藝上已知的方吐 /rl ^ ^ L % ~万法，例如定點突變或丙 胺酸-掃描誘變確認及經修飾加^ / b ’加U取代。後一技術中係在 分子的每一個殘基引入突變，淘丨 爾試產生突變分子之生物 -11 . (9) 200403341 活性（例如植酸酶活性）以確認明分子 酸殘基。亦可用核磁共振、結晶學或光 分子模型測定之晶體結構分析測定酵素 點。 本發明多胜肽通常是在適當宿主生 多肽之聚核苷酸序列重組製作，但亦可 〇 使用預期可提供後轉譯修飾作用（ 加工、十六烷基化作用、糖基化作用、 、絲胺酸或蘇胺酸磷酸化作用）的酵母 胞，在重組表現本發明產物時可賦予彼 〇 本發明多肽可提供其天然細胞環境 此，彼實質上可被分離或純化（討論如 天然上不含此肽之細胞，例如其它真菌 母菌細菌。 相較於技藝上已知的模型植酸酶， 熟悉此技藝的專業人士習知的任何適當 改進之處。 於第二特色中，本發明提供（例如： )多核苷酸，其係包含編碼第一特色多 列。特定言之，本發明提供多一種核苷 碼序列確認號碼：3或序列確認號碼：5 核苷酸序列或包含序列確認號碼：2或j 活性關鍵的胺基 親合力、標記或 受質交互作用位 物體中表現編碼 用合成方法製作 例如蛋白質水解 截斷以及酪胺酸 菌及真菌宿主細 最佳的生物活性 以外的形式。因 上）、或製作自 、動物細胞、酵 本發明多肽可用 的分析以測量其 今離及/或純化的 肽之聚核苷酸序 酸，其係包含編 胺基酸序列之聚 茅列確認號碼：4 -12- (10) (10)200403341 之多核苷酸。 第二特色之多核苷酸進一步的包含編碼第一特色多 肽任何退化版本之聚核苷酸序列。例如，熟悉此技藝的 專業人士可使用常規地技藝，反映任何表現本發明多肽 特定的宿主生物體密碼子選擇進行核苷酸取代而不影響 本發明多核苷酸編碼之蛋白質序列。 第二特色之聚核苷酸序列可爲RNA或DNA以及包 括基因體DNA、合成的DNA或互補DNA。較佳者，多 核苷酸是D N A序列。 本發明之多核苷酸可依據技藝上已知的方法合成。 彼之製作可合倂依據以及沿著本發明多核苷酸之核苷酸 序列合成的寡核苷酸。 此外，彼在母系多核苷酸之任何所要求的位置可經 爲誘變後加以合成。 例如，本發明多核苷酸可構築自一系列具有約2 0個 核苷酸重疊長度爲80個核苷酸的合成寡核苷酸。用具有 校對活性之聚合酶進行PCR (典型的1 0個步驟），將所 有8 0體之寡核苷酸退火並延長寡核苷酸。用具有校對活 性之聚合酶以位於所要求的片段之以及3’端的PCR引 子進行進一步的PCR，合成完整的片段。將完整的片段 選殖入適當的載體並加以定序檢驗是否得到正確的序列 。可視需要，校正序列誤差，例如使用來自Stratagene 的QuickChange組套，依據製造者之說明。 可使用本發明之多核苷酸取得編碼進一步修飾之多 -13- (11) (11)200403341 肽的多核苷酸，例如以誘變技藝將本發明之多核苷酸誘 變。可使用定點突變在本發明多核苷酸的一個或多個專 一性位置加以改變。可使用基因置換技藝（例如如揭示 於 W095/2262 5 、 WO 9 8/2 7 2 3 0 、 WO 9 8 /0 1 5 8 ]及 / 或 W Ο 0 0 / 4 6 3 4 4 )取得於任何成員之多核苷酸起始族群位置 具有隨機組合之任何多核苷酸變異體，該起始族群包括 依據本發明之多核苷酸。 本發明亦提供包含本發明多核苷酸之載體，包括選 殖及表現載體。 插入表現卡式盒或本發明多核苷酸的載體可爲任何 可方便地使用在重組D N A方法之載體，載體之選擇經常 取決於引入之宿主細胞。因此，載體是可獨立自主複製 的載體，即載體爲外染色體的貫體物，其複製彳系染色 體的被製無關’例如爲提供被製起始點之質_、黏接菅 體、病毒或噬菌體載體。此外，當載體引入宿主細胞後 可插入宿主細胞的染色體，且與彼插入的染色體共同複 製。載體可爲圓形（例如質體）或線性（例如表現卡式 盒）的多核苷酸。 較佳者，本發明多核苷酸可插入表現卡式盒。在表 現卡式盒中，本發明多核苷酸係操作性聯結至能提供宿 主細胞自其編碼序列表現多肽的調控序列，即該載體是 表現載體。本文術語之’’操作性聯結”意指並置，其中所 描述成份之關係爲可以其預期方式作用。調控的序列例 如啓動子、強化子或其他的表現調控偏號，係，，操作性聯 -14- (12) 200403341 結”至編碼序列，其置入方法係足以使調控 之條件下表現其編碼序列。 給定的宿主細胞之表現卡式盒係包容 次序從5 1 -端至3 1 -端.（相對於編碼第一特 密碼股）操作性聯結的下列元件：能在給 內直接地轉錄編碼多肽之DNA序列的啓動 需要能直接地從給定的宿主細胞分泌多肽 序列；編碼成熟的以及較佳者活性形式多月i ;以及較佳者亦包含在編碼多肽之DNA序 DNA序列轉錄的轉錄終止區域（終止子）。 除了編碼本發明多肽之基因的天然啓動子 其它啓動子表現本發明之多肽。可選擇在 有效表現本發明多肽之啓動子。 可選擇表現卡式盒或載體其設計係具 胞相容共存之啓動子/增強子以及其它表現 較佳者，啓動子序列係源自高度表現的基 高度表現的基因是指傳訊RNA佔總細胞傳f 0 · 0 1 % ( w/w )之基因（例如在誘發的條件 產物佔總細胞蛋白質至少0.2% ( w/w )的 泌的基因產物其分泌量至少爲0.0 5克/升。 啓動子及/或其包含可表現卡式盒嵌入作用 標基因座之較佳高度表現基因的實施例包 )編碼糖解酵素，例如丙糖-磷酸鹽異構翻 油醛磷酸鹽去氫酶（G A P D )、磷酸甘油酸 的序列在相容 相互以連續的 色多肽序列之 定的宿主細胞 子序列；可視 至培養基信號 :之DNA序列 列下游能終止 以外，可使用 表現宿主中可 有能和宿主細 調控的訊息。 因。本發明中 迅RNA的至少 下），或基因 基因，或所分 用以衍生較佳 的較佳預定目 含（但非限於 I ( TPI)、甘 激酶（P G K ) (13) (13)200403341 、丙酮酸激酶（PYK)、乙醇脫氫酶（ADH )之基因，與 編碼澱粉酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、細胞生 物水解酶、/3 -半乳糖苷酶、酒精（甲醇）氧化酶、延伸 因子以及核糖體的蛋白質之基因。適當的高度表現基因 的特定實施例包含例如：克魯維酵母之LAC4基因、漢遜 酵母以及畢赤酵母之甲醇氧化基因（分別地爲AOX以及 MOX)、黑曲霉以及泡盛曲霉之葡糖澱粉酶（glaA)基 因、米曲霉之TAKA澱粉基因、構巢曲菌之gpdA基因以 及裡氏木黴之細胞生物水解酶基因。 爲了要在細菌中有效進行表現，尤其可使用適用於 大腸桿菌品系之啓動子。有力的細菌啓動子的實施例是 α -澱粉酶以及 S P 〇 2啓動子，與細胞外蛋白質基因之啓動 子。 酵母菌啓動子包含釀酒酵母菌之GAL4以及ADH啓 動子、粟酒裂殖酵母之n m t I以及a d h啓動子。有力的酵 母菌啓動子之實施例係來自乙醇脫氫酶、乳糖酶、3 -磷 酸甘油酸激酶以及丙糖磷酸異構酶基因。 應用於真圃表現宿主的強力構成型及/或可誘發的較 佳啓動子之實施例可取自真菌基因木聚糖酶（x I n A )、 植酸酶、A T P -合成酶、次單體9 ( ο 1 i C )、丙糖磷酸鹽異 構酶（tpi )、乙醇脫氫酶（AdhA ) 、α-澱粉（amy )、 戊基葡萄糖苷酶（AG-來自gUA基因）、乙醯胺酶（ a m d S )以及甘油醛-3 -磷酸鹽去氫酶（g p d )的啓動子。 適用於植物細胞之啓動子包含胭脂鹼合成酶（110S ) -16- (14) (14)200403341 、章魚鹼合成酶（〇 c s )、甘露鹼合成酶（m a s )、核酮 糖小次單體（r u b i c 0 s s u )、組織蛋白、稻米肌動蛋白、 菜豆蛋白、花椰菜鑲嵌病毒（CMV ) 35S以及19S以及 環狀病毒之啓動子。在此技藝中可立即提供所有的此類 啓動子。 若要將多肽製作成分泌型蛋白質，則卡式盒中表現 編碼成熟多肽形式的聚核苷酸序列可操作性聯結至編碼 信號肽的聚核苷酸序列。 較佳者，該信號序列是編碼多肽的天然（同源的） 聚核苷酸序列。本發明的較佳具體實施例中信號序列係 得自黑曲霉植酸酶基因，尤其是如揭示於EP 0 42 0 3 5 8 之信號序列。此外，信號序列可爲編碼多肽的聚核苷酸 序列之外來的（異性的）聚核苷酸序列，在此案例中， 較佳之信號序列是表現DNA序列的宿主細胞之內生性序 列。信號序列可結合驅動信號序列編碼序列之啓動子共 同使用，例如可結合（黑）麴黴戊基葡萄糖苷酶（亦稱 爲（gluco )澱粉酶）啓動子與戊基葡萄糖苷酶（AG )基 因之信號序列（1 8以及2 4個胺基酸之版本均可）’以及 可與其它啓動子結合。 本發明中亦可使用混合的信號序列。適當的酵母菌 宿主細胞信號序列之實施例是源自酵母菌α -因子基因之 信號序列。適當的細菌信號序列是來自α -丨殿粉基因（桿 菌）。 在一些案例中，多肽經由分泌的路徑可在一個以上 -17- (15) (15)200403341 的位置發生信號肽的裂解，此意味著可產生多種可變的 N-端之成熟多肽。本發明包含該可變的N-端之多肽。 編碼多肽之聚核苷酸序列下游可爲內含一個或多個 轉錄終止位點（例如終止子）之3 ’未轉譯的區域。終止 子的起點較不重要。終止子可爲例如天然的編碼多肽之 聚核苷酸序列。然而，較佳者是在酵母菌宿主細胞中使 用酵母菌終止子以及在絲狀真菌的宿主細胞中使用絲狀 真菌的終止子。更佳者，是宿主細胞（其中表現編碼多 肽之聚核苷酸序列）之內生的終止子。 載體可含有一個或多個選擇性標記基因，以在多數 的未轉形細胞中選出轉形細胞。 較佳的選擇性標識包含（但非限於）那些可互補宿 主細胞缺點或賦予藥物抗性的標識。彼包含例如可作爲 轉型大多數絲狀真菌以及酵母菌之各種標記基因，例如 乙醯胺酶基因或cDNA (構巢曲菌、米曲霉、或黑曲霉之 amdS、niaD、facA基因或 cDNA)，或提供抗生素如 G 4 1 8、潮黴素、博來霉素、康黴素、腐草黴素或免賴得 抗性（benA )之抗性基因。此外，可使用需要對應的突 變宿主品系之專一性選擇標識（例如營養缺陷的標識） :例如U R A 3 (來自啤酒酵母或其它酵母菌的同功基因） 、Py rG或pyr A (來自構巢曲菌或黑曲霉）、arSB (來自 構巢曲菌或黑曲霉）或trP C。在較佳的具體實施例中， 自轉形的宿主細胞刪除選擇標記之後引入表現建構體以 便取得能產生不含選擇標記基因之多肽的轉形宿主細胞 (16) 200403341 其它標識包含ATP合成酶、次單體9 ( 〇Hc )、乳严 嘧啶-5’-磷酸鹽脫羧酶（pvrA)、細菌的G41R卜^ 1 δ ί几性基因 (此亦可爲用於酵母菌，但非真菌）、抗氨比西林基因 (大腸桿菌）、新黴素抗性基因（桿菌）以及大腸桿菌 uidA基因，編碼 在活體外使用載體 R-葡萄糖醒酸音酶（Gus)之基因。可 ’例如產生RNA或用以轉染或轉形宿 主細胞。

編碼肽之DNA序列，較佳者係以表現卡式盒之一 1 份引入適當的宿主。轉型表現卡式盒引入適當的宿主時 ’可使用熟悉此技藝的專業人士熟知的轉型方法。轉型 宿主之表現卡式盒可爲攜帶可選擇標記的載體之一部份 ’或表現卡式盒可與篇帶可選擇標記的載體之分開分子 共同進行共轉形的作用。載體可包含一種或多種可選擇 的標記基因。

對大多數的絲狀真菌及酵母菌而言，載體或表現建 構體較佳者係插入宿主細胞染色體以取得穩定轉形株。 然而’對某些酵母菌而言適當的基因附體載體亦可提供 穩定及高度表現之倂入性表現建構體。包含此類載體之 實施例分別爲源自酵母菌及克魯維酵母之2μ及PKD1質 體’或內含ΑΜΑ序列（例如曲霉屬之AMA1)的載體。 在表現構築體插入宿主細胞基因組的案例中，構築體可 使用同源重組作用隨機插入基因組中之基因座，或預定 目標的基因座，在後一案例中，較佳之目標基因座係包 -19- (17) (17)200403341 含高度表現的基因。稍早已提供許多高度表現基因的適 當實施例。 亦提供包含多核苷酸或本發明載體之宿主細胞。多 核苷酸對宿主細胞染色體而言可爲異生性。本文術語之” 異生性’’葸指非天然發生在宿主細胞染色體的多核苷酸或 非該細胞天然製作的多肽。 適當的較佳宿主細胞爲原核的微生物例如：細菌， 或更佳者爲真核的生物體，例如：真菌例如酵母菌或絲 狀真菌，或植物細胞。 來自桿菌屬之細菌爲非常適當的異生性宿主，因爲 其可分泌蛋白質至培養基。其它適當的細菌宿主是來自 鏈黴菌以及假單胞菌屬。 表現編碼本發明多肽D N A序列之較佳的酵母菌宿主 細胞爲酵母菌、克魯維酵母、漢遜酵母、畢赤酵母、蓍 草酵母、以及裂殖酵母。更佳之酵母菌宿主細胞，係選 自：釀酒酵母、乳酸克魯維酵母（亦爲習知的克魯維酵 母乳酸亞種）、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂 蓍草酵母菌、及粟酒裂殖酵母。 最佳者是絲狀真菌的宿主細胞。較佳的絲狀真菌宿 主細胞係選自：曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬、雙側孢黴屬 、青霉屬、頂孢菌屬、脈孢菌屬、嗜熱子囊菌屬、毀絲 霉屬、孢子絲菌屬、梭孢殻屬、以及塔拉霉屬（ T a 1 a ι_ 〇 m y c e s )。更佳的絲狀真菌宿主細胞是稻米麴黴、 大豆麴黴、構巢曲霉，或黑曲霉群之菌種（經 Raper -20- (18) 200403341 and Fennell， The Genus Aspergillus，The Wilkins Company，Baltimore ’ pp 293-344， 。此類菌種包含（但非限於）：黑曲霉、泡 賓曲霉、棘孢曲霉、臭曲霉、構巢曲霉、日 菌以及無花果曲霉，並含有品種：菌種裡氏 鐮刀菌、產黃青黴、阿拉巴馬頂孢黴、粗糙 熱毀絲霉屬、嗜纖維側孢黴、雙形孢雙側孢 梭孢殼。 本發明範圍內較佳表現宿主的實施例是 如麴黴反木霉屬；細菌，例如桿菌例如枯草 地衣芽胞杆菌活菌制劑、解澱粉芽孢桿菌、 以及酵母菌例如克魯維酵母，例如：乳酸克 及酵母菌，例如釀酒酵母。 依據本發明的宿主細胞並包含植物細胞 明包含含有一種或多種本發明細胞之基因轉 例如植物以及部份。因此導入外來基因的（ 飾之）植物是在染色體插入（例如穩定地） 多個本發明多胜肽之序列。可使用已知的技 用土壤根瘤桿菌之Ti或Ri質體轉型植物細 質體（或載體）可含有感染植物之必要的序 使用T i及/或R i質體衍生物。 此外可直接侵染植物的一部份，例如葉 在此技術中可感染創傷的植物，例如用剌毛 切割植物或用針穿刺植物或用磨蝕物磨擦植

Williams & 1 9 6 5定義） 盛曲霉、塔 本麴菌、麴 木黴、禾榖 脈孢菌、嗜 黴以及陸生 :真菌，例 芽孢桿菌、 假單胞菌； 魯維酵母以 ，因此本發 殖生物體， 或基因經修 編碼一個或 藝，例如使 胞。如此， 列，以及可 、根或莖。 刀，保險刀 物。然後在 -21 - (19) (19)200403341 創口引入土壤桿菌。 然後植物或植物部份可生長在適當的培養基並發展 成成熟的植物。可使用已知技藝將轉形細胞再生成基因 經修飾之植物，例如使用抗生素選擇轉形的芽以及在內 含適當的營養物、植物荷爾蒙等之培養基中次培養芽。 如此本發明進一步的特色是提供轉形的或轉染包含 本發明之多核苷酸或載體的宿主細胞。較佳之多核苷酸 內含複製多核苷酸以及表現多肽之載體。可選擇與該載 體能相容共存之細胞，例如原核的（例如細菌的）、真 菌、酵母菌或植物細胞。 亦可選擇異性的宿主，其中本發明之肽被製作成不 含本發明多肽活性之其它多胜肽。可選擇通常不產生該 多胜肽相似活性的宿主達成此目的。 若本發明多核苷酸係倂入重組可複製的載體，則該 載體可在相容的宿主細胞中複製多核苷酸。 如此本發明進一步的特色是提供產生依據本發明多 核苷酸之方法，其係將依據本發明之多核苷酸引入可複 製的載體，將載體引入相容的宿主細胞，以及生長宿主 細胞之條件下複製載體。內含依據本發明多核苷酸之載 體可回收自宿主細胞。適當的宿主細胞包含細菌例如大 腸桿菌。 本發明進一步的特色是提供製備依據本發明多肽之 方法，其係在表現（以載體）依據本發明之多肽之條件 下培養宿主細胞（例如轉形或轉染說明如上之表現載體 -22 - (20) 200403341 )以及可視需要回收表現的多肽。較佳之多肽 分泌型蛋白質，此案例中表現建構體中編碼成 式的聚核苷酸序列可操作性聯結至編碼信號肽 酸序列。 依據本發明之重組宿主細胞可用技藝上已 培養。在各啓動子以及宿主細胞之組合中，可 於表現本發明多肽之培養條件。達成所要求的 或多肽滴度之後，可停止培養，並用習知的方 肽。 發酵培養基可包含習知的培養基，其中內 例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜）、氮源（例如硫 酸銨、氯化銨、有機氮源，例如酵母菌抽出物 出物、蛋白腺）、以及其它無機的營養來源（ 鹽、鎂、鉀、鋅、鐵、等）。可視需要包括誘導 適當培養基的選擇可基於表現宿主及/或基 築體的調控需求。該培養液爲熟悉此技藝的專 知的培養液。培養基可視需要含有附加成份使 現宿主比其它可能地污染微生物更具生長優勢。 發酵可進行0 · 5 - 3 0天。發酵可爲整批次、 料分批法，適當地溫度介於〇至4 5 °C之間，酸 例如2至1 0之間。較佳的發酵溫度介於2 〇至 及/或酸鹼度介於3至9之間。通常是基於選擇 主以及表現的蛋白質選擇適當條件。 發酵之後，若必要，可使用離心或過濾自 係製作成 熟多肽形 的聚核苷 知的方法 提供有助 細胞密度 法回收多 含碳源（ 酸銨、硝 、麥芽抽 例如磷酸 物。 於表現建 業人士習 轉形的表 連續或進 鹼度介於 3 7 X：之間 之表現宿 發酵培養 (21) (21)200403341 液中移除細胞。發酵停止之後或去除細胞之後，然後可 回收本發明之多肽，視需要用習見的方法純化的及分離 一般而言，本發明之多肽可合倂適當的載體（固態 或液體）或包括產生多肽成分緩衝溶液之稀釋劑。多肽 可附著至或與載體混合，例如固定於固態載體。如此本 發明進一步的特色提供含本發明多肽之成分。彼可爲適 用於包裝、運送及/或儲藏之形成，較佳者仍保留多肽之 活性。組成物可爲糊狀醬料、液體、乳膠、感光乳劑、 粉劑、薄片、顆粒、片或其它押出的形式。 成分可進一步的包含額外成分，例如一種或多種額 外的酵素。 一般多肽可穩定地調製成液體或乾燥形式。一般產 物成分可視需要包括例如穩定化緩衝劑及/或防腐劑。 本發明額外地係關於食品或動物飼料成份或包含一 種或多種本發明多胜肽之添加物。多狀可存在於飼料， 其濃度可不同於天然的濃度。$交佳的量是〇1至1〇〇，例 如〇 ·5至5 0，較佳者爲1至1 〇毫克/公斤飼料。 ^本發明亦關於製備動物飼料成份之方法，該方法包 含添加入-種或多種可食用的飼料物質或成分（本發明 ::目太）。多胜肽可分別與飼料物質或成分，單獨的或 :合其它飼料添加劑添加人動物飼料成份中。多肚可爲 5料物質或成分之整體的一部份。 … 本發明多胜肚亦可添加入動物飼料中以改良植物組 •24- (22) (22)200403341 份（例如植酸鹽）之分解，改良植物營養物被動物的利 用。有利地，本發明多胜肽可在生物體內中繼續降解植 酸鹽。本發明的真菌多胜肽，特別而言具較低的酸驗度 迤大活|主範圍以及能在動物胃中該酸性的環境中釋放重 要的營養物。 本發明多胜肽亦可用於自大豆產生牛奶取代物（或 替代品）。此類牛奶取代物供應人類及/或動物。 成分可額外地包含（尤其是當其係調製成應用於動 物飼料）種或多種離子載體、氧化劑、表面活性劑、 保濩瘤胃的胺基酸、酵素增強子或可在進食動物胃腸道 爲製作的天然酵素。當添加至反芻動物或單胃動物（例 如家禽或豬）飼料（包括青貯飼料）中時，飼料可包含 榖類植ί勿，例如大冑、小麥、玉米、黑麥或燕麥或榖類 植物副產品，例如麩皮或玉米糠，或其它植物材料，例 如大丑以及其它莢果。酵素可顯著的改良植物材料的降 解，使動物更能利用植物營養物。結果可改良成長率及/ 或飼料轉化。 本發明多胜肽在局度酸性的條件下（例如在動物胃 中）仍有活性，尤其是可採用動物飼料。 外生I生添加本發明多肽之方法是以導入外來基因的 植物材料及/或（例如導入外來基因的）種子的形式加入 多肽。如此多肽可經由異性的基因表現合成，例如編碼 所要求酵素的基因可選殖入植物表現載體，並由適當的 植物表現訊息加以控制，例如組織-專一性啓動子，例如 •25- (23) (23)200403341 種子-專一性啓動子。內含編碼多肽基因之表現載體可接 著轉形入植物細胞，轉形的細胞可選擇性的再生成整個 植物。如此得到的導入外來基因植物可生長及收穫，以 及內含異性（對植物而言）多肽的植物部份可直接或經 進一步的加工之後包括於組成物之一。異性的多肽可內 含於導入外來基因植物的種子或可內含於其它植物部份 ，例如根、莖、葉、木材、花、樹皮及/或水果。適當的 植物包含榖類植物，例如：燕麥、大麥、小麥、玉米以 及稻米。 添加導入外來基因植物材料形式的多肽，例如導入 外來基因的種子，需要對植物材料加工以得到多肽，或 至少改良其利用率。該加工技藝可包含各式各樣機械性 (例如磨碎及/或硏磨）的技藝或熱機械性的處理例如擠 壓成形或擴張。 如此本發明亦關於促進單胃或非反芻型動物之生長 及/或飼料轉化之方法，該方法包含用本發明之多肽飼育 動物。適當的動物包含農場之單胃及/或非反芻動物，例 如豬隻（或小豬）、家禽（例如雞、火雞）、小牛或犢 牛或水產（例如海產類）動物（例如魚類）。 【實施方式】 實施例1 構築產生植酸酶之品系 合成具有依據序列確認號碼：2以及序列確認號碼： 4序列之DNA片段。證實DNA序列之後，將此類合成的 •26- (24) (24)200403341 基因片段使用P C R融合至黑曲霉植酸酶信號序列，以及 在蔔糖澱粉酶啓動子的控制下選殖。將描述於國際性的 專利申請案 W098/46772 中內含 phyA 基因之 pGBTOPFYTI表現載體用說明如上之改質之植酸酶基因 取代’產生的載體分別稱爲pTHFYT2以及pTHFYT4。 將表現載體PTHFYT2及pTHFYT4引入黑曲霉CBS 646.97 (描述於 W098/4 6772)。使用 PCR選擇內含 PTHFYT2或pTHFYT4的轉形株。爲了測定此類轉形株是 否能分泌活性的植酸酶，將轉形株生長在內含植酸鹽的 平板如描述於 Chen ( 1998，Bioteclinol. Techniquel2， 7 5 9 7 6 1 )。在此分析中，若分泌出活性植酸酶，則由於 植酸鹽降解而在麴黴菌落的附近可看見燦爛的光環。使 用此分析展示所有表現載體可使轉形株分泌活性的植酸 酶FYT2或FYT4至培養液。 將顯示燦爛光環的轉形株生長於搖動燒瓶中。將！ 〇7 個選擇轉形株及對照組的孢子接種入動燒瓶中燒瓶，燒 瓶中內含20毫升之培養液，每公升培養液內含：30克麥 芽糖· ΙΟ ; 5克酵母菌抽出物；】〇克水解的酪蛋白；1 克 KH2P〇4; 0.5 克 MgS04· 7H20; 0.03 克 ZnCl2; 〇.〇2 克 CaCl2 ; 0.01 克 MnS04 · 4H20 ; 0.3 克 FeSCU · 7H20 ; 3克Tween 80; 10毫升青黴素（5000 Itj/毫升）/鏈黴素 (5 0 00 UG/毫升）；酸鹼度5.5。此類培養物在34它下生 長2 0 - 2 4小時。將1 〇毫升之培養菌種接種至1 〇 〇毫升黑 曲霉發酵培養液，每公升培養液中含：7 0克麥芽糊精； -27- Ιλ Φ ^ (25) (25)200403341 25克水解的酪蛋白；12·5克酵母菌抽出物；！克Kh2p〇4 ;2 克 K2S〇4· 〇.5 克 MgS04· 7H2〇； 0.03 克 ZnCl2; 0.02 克 CaCl2 ; 0.01 克 MnS04 · 4H2〇；0.3 克 FeS04· 7 Η 2〇；1 0毫升青黴素（5 0 0 0 I U /毫升）/鏈黴素（5 0 0 0 UG/毫升）；用4N H2S04調至酸鹼度5.6。此類培養物在 3 4 °C下生長約6天。將發酵培養液之樣品離心（1 〇分鐘 ，5.0 0 0 rpm，swinging bucket離心機）以及收集懸浮液 實施例2 FYT2以及FYT4之熱穩定性。 依據實施例1在搖動燒瓶中製作FYT2、FYT4以及 野生型A. ficuum植酸酶（EP 0 42 0 3 5 8 )。在適當時間 間隔取樣並依據描述於 v a n . E n g e 1 e n e t a 1. ( J 〇 u r n a 1 〇 f AOAC International 1994，77:760-764)之方法測定上淸 液中植酸酶之活性以追蹤植酸酶之產生。活性用 FTU表 示’ 1 F T U之酵素量是在測驗條件下（p Η = 5 . 5，溫度37 °C，5毫莫耳濃度植酸鈉）每分鐘釋出1 4莫耳之無機正 磷酸鹽。測量懸浮液中酵素之耐熱性。視需要，植酸酶 懸浮液可用超濾法進一步濃縮。 用三種不同方法測量耐熱性。首先，測定植酸酶之 T5 0。T5 0 ( t )是樣品加熱20分鐘後具有50%活性之溫 度。實驗條件：壓力測驗在 25 0 毫莫耳濃度 HAc/NaAc/Tween20，pH = 4.0下進行。植酸酶之劑量約 -28- (26) (26)200403341 0.6FTU/毫升。樣品加熱之後立刻在冰中冷卻。接著在 250毫莫耳濃度HAc/NaAc/Tween20，pH = 4.0下測量殘餘 的植酸酶活性。結果如表1。FYT2及FYT4更穩定的耐 受約8 - 9 °C。 表1 :各種植酸酶的耐熱性 植酸酶 T5 0 ( °C ) Topt ( °C ) DSC Td ( °C ) F YT2 74 75 79 F YT4 73 75 79 野生型 65 64 70 其次，於加熱期間測定植酸酶之活性。從實驗的加 熱溫度函數中，可從生產力得到酵素之最適溫度。反應 係統一進行3 0分鐘時間。受質轉換量取決於酵素的活性 與去活化。因此較佳者是用生產力取代活性。實驗條件 :250毫莫耳濃度HAc/NaAc/Tween20 ρΗ = 4·0，植酸酶劑 量約 0.012 FTU /毫升。釋出之磷酸鹽可依上述之標準檢 測方法測量。結果如圖3。FYT2與FYT4在75°C下仍有 催化性生產力，而野生型對照組則已完全喪失其催化活 性。雖然在75 °C以上活性開始減少，圖3顯示FYT2與 F Y T 4在高達約8 5 °C下仍有催化能力。 第三，除了經由適當的活性分析測量耐熱性之外’ 植酸酶之耐熱性亦可藉由測定植酸酶酵素三維結構去摺 疊溫度而直接測定。伴隨去摺疊的加熱效應可用微差掃 -29- (27) 200403341 描熱分析儀（D s C )測量。d S C之實驗條件：2 5 0毫莫耳 濃度HAc/NaAc ρΗ = 4·0，約5毫克/毫升植酸酶，加熱速 率爲2 · 5 °C /分鐘。結果如圖1。圖1顯示在維持天然酵素 結構的溫度上改貿之植酸酶F Y T 2及F Y T 4比野生型植酸 酶高出約9 °C。 實施例3 FYT2及FYT4製錠之穩定性 測試二種錠片受質，以及以FYT2及FYT4菌種培養 濾液設定溫度。 將培養過濾物及需要量的玉米澱粉（C _凝膠，來自 Cere star )及水攪拌/捏合製成所有顆粒。參閱表2及3 之淫混合成分。攪拌及捏合之後，混合物用N i c a E - 2 2 0 押出機押出以及用 Fuji Paudal QJ-4000 spheroniser spheronised。得到的顆粒用Glatt GPCG 1.1流床乾燥器 乾燥。顆粒活性介於2 5 00至3 000 FTU/克。 表2 : RDS 05顆粒混合物之成分 植酸酶 酵素液體（克） 澱粉質（克） 水（克） F YT2 1 76 748 123 F YT4 23 8 113 7 1 94 野生型 127 1300 3 52 (28) 200403341 表3 : RDS A1顆粒混合物之成分 植酸酶 酵素液體（克） 澱粉質（克） 水（克） F YT2 24 1 13〇〇 274 F YT4 27 1 13〇〇 259 野生型 109 13〇〇 363 將2 5公斤進料（成分依據表4 )混合成2 5 0克顆粒 ，以及在測試之前混合2 2 5公斤的相同成分。2 5公斤的 進料是用Collete MP90 planetary混合器混合1〇分鐘。 25 kg以及225公斤進料係於12〇〇公升Nauta混合器中 混合。用混合物樣品決定製錠之穩定性。2 5 0公斤混合物 在混合螺杆之6 00 kg/h速度、蒸汽注入加熱至80°C下用 混合器混合。駐留時間約1 0 -1 5秒，此時將熱混合物擠 壓至製錠擠壓器。測試使用之受質爲5/45毫米（寬度/長 度；RDS05)或3/65毫米（寬度/長度；RDS A1)。碇片 離開擠壓器之溫度爲82-83 °C (RDS 05)或91-93 °C ( RDS A1)。將碇片擠壓至冷卻帶之後，將樣品進行穩定 性測試。 -31 - (29) (29)200403341 表4 :用於RDS 05以及RDS A1製錠試驗之家禽飼料成 分 原料 含量（％ ) RDS 05 RDS A1 玉米 45 50 Peas ( 2 0.7 % c p ) 5 油菜粉 4.5 葵花子粉 4.5 玉米麵筋花 2.5 全部大豆（烘焙） 10 6 大豆粉（46.7%cp ) 27.50 2 1 木薯（62,5 - 6 7,5 澱粉） 4.72 3.85 大豆油（植物油） 3.50 1 . 0 動物脂肪 3.7 維生素預調混合物Mervit 100 1.00 0.5 石灰石 1.35 1.35 單磷酸鈣 1.30 0.2 鹽 0.3 5 0.18 NaHC03 0.25 L-離氨酸 0.05 0.26 DL-甲硫胺酸 0.23 0.18 L-蘇胺酸 0.03 (30) 200403341 表5 ··製錠產生耐熱的植酸酶（rD S 〇 5 )。熱磨溫度爲 8 0 °C。碗片溫度約達到82-8 3它。產品製錠前後之活性係 使用標准植酸酶分析（v a η · E n g e 1 e n e t a 1 ， A 0 A C Intel national 1 9 9 4，77:760-764 )測量。 植酸酶 ./ 側里 〇 製錠產率％ F YT2 7 9 F YT4 8 1 野生型 36 表6 :製錠產生耐熱的植酸酶（rD S 0 1 )。熱磨溫度爲 植酸酶 製錠產率％ F ΥΤ2 39 F ΥΤ4 3 7 野生型 12 製錠試驗顯示，相較於野生型，FYT2及FYT4之耐 熱性在8 2 °C與9 2 °C下均提高。 實施例4 植酸酶之生化特性 過濾發酵培養液之後，從濾液純化植酸酶，接著測 定植酸酶比活性。用離子交換層析法或親和層析法或此 二方法之組合純化植酸酶。 使用ConA (刀豆素）親和性受質（HiTrap Con A， r r r.y :m^·· -33- (31) (31)200403341 A m e r s h a m P h a r m a c 1 a B i 〇 t e c h )進行糖基化植酸酶的親和 層析法。將植酸酶結合至20毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲 院/ 0.5莫耳濃度NaCl/1毫莫耳濃度MnCl2/1毫莫耳濃度 C a C 12 / p Η = 7 · 4之管柱。在徹底淸洗管柱之後用2 〇毫莫耳 濃度三羥甲基胺基甲烷/0.5莫耳濃度NaCl/0.5莫耳濃度 甲基-α-呋喃葡萄醣苷/pH = 7.4溶析植酸酶。用20毫莫耳 濃度三羥甲基胺基甲烷p Η = 8 . 5再生管柱。緩衝溶液酸 鹼度用4Ν HC1設定。 使用陰離子父換劑 （Resource Q，Am ersham

Pharmacia Biotech)進行離子交換色譜分析。使用pd-10 凝膠過濾管柱去鹽漬及改變緩衝液。用5 0毫莫耳濃度三 羥甲基胺基甲烷，ρΗ = 7·5平衡管柱。負載植酸酶樣本之 後，使用梯度〇至1莫耳濃度NaCl之50毫莫耳濃度三 羥甲基胺基甲烷ρΗ = 7·5溶析植酸酶。 經Ε28 0測量測定純化植酸酶的蛋白質含量，1毫克/ 毫升植酸酶相當於〇D 2 8 0，]公* = 0.9 3 8 〇 1毫克/毫升FYT2 及FYT4之OD 2 8 0，】公分分別相當於0.9 9 5以及0.9 9 5。測 定之活性爲FTU，如描述於van Engelen et al. ( Journal of AOAC International 1994，77:760-764) o 用起始反應速率作爲反應受質濃度之函數測量植酸之Km 値。分析混合物內含 1·〇、〇·5、0·2、0，1，0·05、0·0 2 5、 0.015毫莫耳濃度植酸之25〇毫莫耳濃度NaAc緩衝液 p Η = 5 · 5。以1 5 % T C A ( 1 : 1 )終止酵素反應。攪拌含0 · 6 莫耳濃度Η 2 S 0 4 - 2 %抗壞血酸〇 · 5 %鉬酸銨（1 : 1 )之停止 - 34- (32) (32)200403341 反應混合物測定釋出的無機磷酸鹽，混合物在5 0°C下反 應20分鐘以及測量8 2 0毫微米之吸收（Wyss et al.Appl Env Microbiol 1999，6 5:3 6 7 3 7 3 )。結果如表 Ί。 表7 :植酸酶使用植酸作爲受質之催化1竺 匕質 生化性質 野生型 F YT2 F YT4 比活性FTU/毫克 1 00 1 02 1 03 Km (微莫耳濃度，pH = 5.5 ) 12 8 5 表 7比較野生型之比活性與植酸之高親和性顯示修 飾之酵素不受影響。 在不同pH値下測量從植酸釋放磷酸鹽之速率，測定 酸鹼度依存的植酸酶活性。基本上除了各種酸鹼度之外 使用標準植酸酶分析。以pH = 5.6下之活性定爲100 %活 性。使用下列緩衝溶液設定實驗之酸鹼度：2 5 0毫莫耳濃 度甘胺酸，酸鹼度範圍爲 2.8至3.2 ; 2 5 0毫莫耳濃度 NaAc之酸鹼度範圍爲3.6至5.6; 250毫莫耳濃度咪唑， 酸鹼度範圍爲6至7以及2 5 0毫莫耳濃度三羥甲基胺基 甲院，酸鹼度範圍爲7.5至9。此結果如圖8。 (33) 200403341 表8 :植酸酶活性之酸鹼度依賴性。給定的活性是以 酸鹼度=5 . 6下觀察到最大的活性設定爲1 0 0 %之百分比 表不。 相對於在pH = 5.6下活性的活性％ F YT2 F YT4 野生型 pH値 2,8 77,7 78,7 70,4 3,2 77,0 79,7 59,3 3,6 52,9 54,1 46,1 4,〇 39,9 43,2 3 9,3 4,4 77,9 76,6 70,6 4,8 85,5 84,8 90,0 5,2 90,0 93,7 99,8 5,6 100,0 100,0 100,0 6,0 92,2 9 1,8 80,5 6,5 65,6 67,8 5 5,6 7,〇 46,5 50,7 27,6 7,5 22,3 23，7 4,2 7,9 1,6 1,7 〇,4 8,5 0,2 〇,2 0,8 9?〇 〇,4 0,3 0,3

改質植酸酶之酸鹼度依賴的活性與野生型非常相似 。尤其特別的是野生型植酸酶維持二個最適pH。其中一 個最適酸鹼度約爲 pH = 2.5，而第二個最適酸鹼度約爲 -36- (34) 200403341 ρ Η = 5。表8顯示此野生型黑曲霉植酸酶的特定特色在修 飾的FYT2及FYT4中不受影響。 在250毫莫耳濃度NaAc、pH = 5.5、37°C下，植酸酶 降解植酸的進展曲線是時間的函數。反應受質濃度爲0.2 毫莫耳濃度植酸下，植酸酶之劑量爲〇·〇5 FTU/毫升。以 1 5 % T C A ( 1 : 1 )終止酵素反應。攪拌1 4 0 0微升〇 . 3莫耳 濃度H2S04-1%抗壞血酸-0.27鉬酸銨與100微升之反應 混合物測定釋出的無機磷酸鹽，接著混合物在5 0 °C下反 應20分鐘以及測量8 20毫微米之吸收。結果如表9。 表9 :植酸酶降解植酸之進展曲線 820nm 下之 OD F YT2 F YT4 野生型 反應時間（分鐘） 0 0 0 0 10 0.3 1 0.35 0.38 20 0.59 0.72 0.65 45 0.84 0.84 0.83 90 0.87 0.90 0.86 結果顯示改質之植酸酶在自植酸釋出磷酸鹽方面與 野生型植酸酶非常相似。一小時之後進展曲線到達平緩 區約釋出8 0 - 8 5 %之磷酸鹽。所有植酸酶到達此平緩區之 速率相似，顯示野生型植酸酶自植酸釋放磷酸鹽之功效 在改質之植酸酶中不受修飾影響。 r 7 -37- (35) 200403341 生型植酸酶，修飾之 a結果顯示避免任何展 結論：結果顯不，相較於野 FYT2及FYT的催化效能不受影響 示於Η "安基酸之突變化（在受質7埃內的殘基）以及 進一步的保留額外的黑曲霉胺基酸即可保持野生型黑曲 霉植酸酶的功能性質。 實施例5 改質植酸酶之生物功效 液體植酸酶之試驗 使用彼之彳忟體ρ周配物衣fc成片後進行生物效性測驗 比較新近產生的耐熱植酸酶。加入該劑量植酸酶酵素其 活性將爲100、200或300 FTU/公斤飼料。進行測驗是用 broilers (5-33天）餵食以玉米-大豆爲基礎的膳食（前 14天餵食試驗膳食，後14天餵食稍微不同的膳食）。基 礎飲食中可吸收的磷含量爲2.2克/公斤飼第料（第5-19 天）以及1 · 7克/公斤飼料（第1 9 · 3 3天）。此類數値遠 低於動物估計的需求量。每種處理的動物居於六層的鳥 籠，各鳥籠內含 14 隻鳥類。使用 Finney ( 1964 .-Statistical method in biological assay.Charles Griffin , London.)之方法。基於分析植酸酶內含物（ FTU/公斤）計算結果。體重結果如表1〇。 -38- (36) (36)200403341 表1 〇根據植酸酶的分析活性計算在全部實驗期間（5_32 天），不同型之植酸酶與野生型（=1 00% )對體重的相 對功效（於液體製錠之後）。 表10 測驗產物 B W F YT2 98 F YT4 68 野生型 1 00 所有產物迴歸線的斜率顯著的與零不同。表1 0顯示 除FYT4以外，產物之間沒有差異。餵食此酵素與餵食其 他植酸酶之動物雖然不同，但在統計上並不顯著。 顆粒狀植酸酶之試驗 在製錠成片前，進行測驗比較顆粒狀調配物中的耐 熱植酸酶。意即在製錠過程中置入植酸酶。此試驗製錠 中以大約9 2 °C之高溫進行製錠。因爲該目標是在提供動 物之飼料中加入100、20 0或3 00FTU/公斤，進行前製錠 試驗以估計此方法中活性之流失間，以及過多荷載產物 以達成該活性。用相似液體試驗產物的方法進行測驗， 使用broilers (5-33天）餵食玉米大豆爲基礎的膳食（全 部時期僅用一種膳食），其可吸收的磷含量遠低於此類 動物估δ十需要重（1 · 9克/公斤飼料）。每種處理的動物 居於六層的鳥籠’各鳥籠內含；[4隻鳥類。體重增量迴歸 r (37) 200403341 線的相對斜率如表！ i。 表1 1 °根據植酸酶之分析活性計算在全部實驗期間（5 -3 3天）’比較不同型之植酸酶與野生型i 〇 〇% )對體 重增量的相對功效（除了野生型是以液體調配物於製錠 後施用之外，其它均係以顆粒施用）。 產物 B WG 1 47 ^_FYT4 1 26 __野生5LJ 1 00

此試驗中以植酸酶F Y T 2最好，其次是F Y T 4以及野 生型。 【圖式簡單說明】 圖1 ·黑曲霉活性部位殘基。 ® 2·黑曲霉植酸酶活性部位殘基與植酸複合的IHP_S 丰莫型樣品座標（IΗ P 5 5 0 Η )。 ® 3 ·植酸酶生產力相對於溫度。 -40- 200403341 序列表 <n〇> DSM IP Assets B.V. <120>改質之植酸酶 <130> 21619WO <160〉 5 <170〉專利版本3.1

<210> 1 <211〉 444 <212〉 PRT <213>黑曲霉成熟植酸酶 <400> 1

Ala Ser Arg Asn Gin Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gin Gly Tyr Gin 15 10 15

Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ala Pro Phe Phe 20 . 25 . 30

Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val lie Ser Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45

Arg Val Thr Phe Ala Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60

Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Glu lie Gin 65 70 75 80

Gin Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95

Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gin Glu 100 105 110

Leu Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Gin Arg Tyr Glu Ser Leu Thr 115 120 125

Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140

Ala Ser Gly Lys Lys Phe lie Glu Gly Phe Gin Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160 200403341

Asp Pro Arg Ala Gin Pro Gly Gin Ser Ser Pro Lys lie Asp Val Val 165 170 175 lie Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys 180 185 190

Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205

Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser lie Arg Gin Arg Leu Glu Asn Asp Leu 210 215 220

Ser Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240

Cys Ser Phe Asp Thr lie Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser 245 250 255

Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Asn Tyr Asp Tyr 260 265 270

Leu Gin Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285

Gly Pro Thr Gin Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300

Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320

Ser Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335

Ser His Asp Asn Gly lie lie Ser lie Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350

Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu Asn lie Thr Gin 355 360 365

Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Leu 370 375 380

Tyr Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Gin Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400

Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp 405 410 415

Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe 420 425 430

Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Ala Glu Cys Phe Ala 435 440 <210> 2 200403341

<211> 1335 <212> DNA <213>黑曲霉成熟植酸酶 <220> <221> CDS <222> (1)..(1335) <223> <400〉 2 gcc teg aga aat tee cac agt tgc gat aeg gtc gat ggc ggg tat caa 48

Ala Ser Arg Asn Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gin 15 10 15 tgc ttc ccc gag ate teg cat ett tgg ggt caa tac tee ccg tac ttc 96

Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 tet ctg gca gac gaa teg gcc ate tee cct gac gtg ccc gcc gga tgc 144

Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 aga gtc act ttc gtc cag gtc etc tee cgt cat gga geg egg tat ccg 192

Arg Val Thr Phe Val Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 acc gac tee aag tee aag aaa tac tee get etc att gag gcc ate cag 240

Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala lie Gin 65 70 75 80 aag aac geg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag aca tac 288

Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 aac tac acc ttg ggt gca gat gac ctg act ccc ttc gga gaa cag cag 336

Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gin Gin 100 105 110 atg gtc aac tee ggc ate aag ttc tac ege egg tac aag gcc etc gcc 384

Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala

115 120 125 agg aac ate gtt cca ttc ate ega gcc tet ggc tee age ege gtg ate 432

Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140 gcc tee gcc gag aaa ttc ate gag ggc ttc cag age gcc aag ctg gcc 480

Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gin Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 160 gat cct ggc gcc aac ccc ggc caa gcc teg ccc gtc ate gac gtg ate 528

Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gin Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 att ccc gag ggc gcc ggc tac aac aac act etc gac cac ggc acc tgc 576 lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 act gcc ttc gaa gag age gaa ttg ggc gat gac gtc gaa gcc aat ttc 624

Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205 acc gcc ctg ttc gcc ccc gcc att cgt gcc cgt ctg gag gcc cac ctg 672

Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220 -3- 720 200403341 ccc ggt gtg act etc aca gac gag gac gtg acc tac etc atg gac atg

Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 tgc ccc ttc gac acc gtc gcc ege acc tee gac gee acc gag ctg tee

Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255 ccc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gaa tgg ate cag tac gac tac

Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gin Tyr Asp Tyr 260 265 270 etc cag tee ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac ccg etc

Leu Gin Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285 ggc ccg gee cag ggc gtc ggc ttc get aac gag etc ate gee cgt ctg

Gly Pro Ala Gin Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300 acc cac teg cct gtc cag gat cac acc agt acc aac cac act ttg gac

Thr His Ser Pro Val Gin Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320 teg aac ccg get acc ttt ccg etc aac gee act etc tac geg gac ttt

Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335 teg cat gac aac ggc atg ate tee att ttc ttt get tta ggt ctg tac

Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser He Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350 aac ggc act aag ccg eta tet acc aeg tee gtg gag tee ate gag gag

Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365 aca gat gga tac teg gee tee tgg aeg gtt ccg ttt get gee cgt gee

Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380 tac gtc gag atg atg cag tgt cag geg gag aag gag ccg ctg gtc cgt

Tyr Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400 gtc ttg gtt aat gat ege gtt gtc ccg ctg cat ggg tgt gee gtt gat

Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415 aag ttg ggg aga tgt acc egg gat gac ttt gtg gag ggg ttg age ttt

Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430 get aga tee ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt get tag

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440

<210〉 3 <211> 444 <212> PRT <213>合成型DNA <400〉 3

Ala Ser Arg Asn Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gin 15 10 15

Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1335 4- 200403341

Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45

Arg Val Thr Phe Val Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60

Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala He Gin 65 70 75 80

Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95

Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gin Gin 100 105 110

Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125

Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140

Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gin Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 160

Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gin Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190

Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205

Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220

Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240

Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255

Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gin Tyr Asp Tyr 260 265 270

Leu Gin Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285

Gly Pro Ala Gin Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu lie Ala Arg Leu 290 295 300

Thr His Ser Pro Val Gin Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320

Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe -5- 200403341 325 330 335

Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350

Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365

Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380

Tyr Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400

Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415

Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440

<210> 4 <211> 1335 <212> DNA <213>合成型DNA <220>

<221> CDS <222〉 （1)..(1335) <223>

<400〉 4 gcc teg aga aat caa tcc agt tgc gat aeg gtc gat ggc ggg tat caa 48

Ala Ser Arg Asn Gin Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gin 15 10 15 tgc ttc ccc gag ate teg cat ett tgg ggt caa tac tcc ccg tac ttc 96

Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30 tet ctg gca gac gaa teg gcc ate tcc cct gac gtg ccc gcc gga tgc 144

Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45 aga gtc act ttc gtc cag gtc etc tcc cgt cat gga geg egg tat ccg 192

Arg Val Thr Phe Val Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60 acc gac tcc aag tcc aag aaa tac tcc get etc att gag gcc ate cag 240

Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala lie Gin 65 70 75 80 aag aac geg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag aca tac 288

Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95 -6 - 200403341 aac tac acc ttg ggt gca gat gac ctg act ccc ttc gga gaa

Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu 100 105 110 atg gtc aac tcc ggc ate aag ttc tac ege egg tac aag gee

Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala 115 120 125 agg aac ate gtt cca ttc ate ega gee tet ggc tec age ege

Arg Asn He Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg 130 135 140 gee tec gee gag aaa ttc ate gag ggc ttc cag age gee aag

Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gin Ser Ala Lys 145 150 155 gat cct ggc gee aac ccc ggc caa gee teg ccc gtc ate gac

Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gin Ala Ser Pro Val lie Asp 165 170 att ccc gag ggc gee ggc tac aac aac act etc gac cac ggc lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly 180 185 190 act gee ttc gaa gag age gaa ttg ggc gat gac gtc gaa gee

Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala 195 200 205 acc gee ctg ttc gee ccc gee att cgt gee cgt ctg gag gee

Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala 210 215 220 ccc ggt gtg act etc aca gac gag gac gtg acc tac etc atg

Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met 225 230 235 tgc ccc ttc gac acc gtc gee ege acc tec gac gee acc gag

Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu 245 * 250 ccc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gaa tgg ate cag tac

Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gin Tyr 260 265 270 etc cag tec ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac

Leu Gin Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn 275 280 285 ggc ccg gee cag ggc gtc ggc ttc get aac gag etc ate gee

Gly Pro Ala Gin Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu He Ala 290 295 300 acc cac teg cct gtc cag gat cac acc agt acc aac cac act

Thr His Ser Pro Val Gin Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr 305 310 315 teg aac ccg get acc ttt ccg etc aac gee act etc tac geg

Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala 325 330 teg cat gac aac ggc atg ate tec att ttc ttt get tta ggt

Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly 340 345 350 aac ggc act aag ccg eta tet acc aeg tec gtg gag tec ate

Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie 355 360 365 aca gat gga tac teg gee tec tgg aeg gtt ccg ttt get gee

Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala 370 375 380 tac gtc gag atg atg cag tgt cag geg gag aag gag ccg ctg

Tyr Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Lys Glu Pro Leu cag cag Gin Gin 336 etc gee Leu Ala 384 < gtg ate Val lie 432 ♦ ctg gee Leu Ala 160 480 gtg ate Val lie 175 528 acc tgc Thr Cys 576 aat ttc Asn Phe 624 • cac ctg His Leu 672 gac atg Asp Met 240 720 ctg tec Leu Ser 255 768 gac tac Asp Tyr 816 ccg etc Pro Leu 864 cgt ctg Arg. Leu 912 • ttg gac Leu Asp 320 960 gac ttt Asp Phe 335 1008 - ctg tac Leu Tyr 1056 gag gag Glu Glu 1104 cgt gee Arg Ala 1152 gtc cgt Val Arg 1200 1248 200403341 385 390 395 400 gtc ttg gtt aat gat cgc gtt gtc ccg ctg cat ggg tgt gcc gtt gat

Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415 1296 1335 aag ttg g£g aga tgt acc egg gat gac ttt gtg gag ggg ttg age ttt

Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430 get aga tcc ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt get tag

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440

<210〉 5 <211> 444 <212> PRT <213> *SEQID2製作之蛋白質 <400〉 5

Ala Ser Arg Asn Gin Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gin 1 5 10 15

Cys Phe Pro Glu lie Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ser Pro Tyr Phe 20 25 30

Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45

Arg Val Thr Phe Val Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60

Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Ala lie Gin 65 70 75 80

Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95

Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gin Gin 100 105 110

Met Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 115 120 125

Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ala Ser Gly Ser Ser.Arg Val lie 130 135 140

Ala Ser Ala Glu Lys Phe lie Glu Gly Phe Gin Ser Ala Lys Leu Ala 145 150 155 160

Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gin Ala Ser Pro Val lie Asp Val lie 165 170 175 lie Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys 180 185 190 200403341

Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205

Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala lie Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu 210 215 220

Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met 225 230 235 240

Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser 245 250 255

Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp lie Gin Tyr Asp Tyr 260 265 270

Leu Gin Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu 275 280 285

Gly Pro Ala Gin Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu He Ala Arg Leu 290 295 300

Thr His Ser Pro Val Gin Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp 305 310 315 320

Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe 325 330 335

Ser His Asp Asn Gly Met lie Ser lie Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr 340 345 350

Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser lie Glu Glu 355 360 365

Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala 370 375 380

Tyr Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400

Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp 405 410 415

Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe 420 425 430

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440

-9-

Claims (1)

1. (1) (1)200403341 拾、申請專利範圍 1 . 一種多肽，當與模型植酸酶排列時，其與係於至 少一個相較於該模型植酸酶之下列位置上修飾： 5 ，6， 1 3，1 9，2 1， 29，3 1，36 ，39， 43，5 3，6 9 ，78， 8 1， 85 ， 87 ， 99 ， 112, 113， 122， 125， 126， 12 8， 13 7， 147， 148， 15 7 ， 160， 163 ，165 ，169 ，1 72 ，1 76 ，1 78 ，180， 181， 182, 183， 189， 194， 197， 201， 20 3， 2 1 1，2 1 3，2 1 5，21 8，222 ，223 ，225 ，232 ，233 ，242 ，246 ， 247 ， 24 8， 249， 2 5 0， 25 1， 2 5 2， 2 5 4， 269， 291 ， 296 ， 31 0，3 1 2，3 1 5 ，322 ，330 ，342 ，346 ，362 ，365 ， 367 ， 368， 3 72， 3 74， 3 7 5， 3 82， 3 8 4， 395 ， 414 ， 417 ， 425 ，428 ，4 3 8， 44 0 〇 2 .如申請專利範圍第 1項之多肽 ，其中包含至少一 個下列修飾 ： 5QS，6SH，13G，19P，21] [，29S ，3 1 Y ，36D ，39A ，43D ，53 V ，69S ， 78A ， 8 1 K ，85A， 87K， 99T， 1 1 2Q ，113M，1 22R，1 25K，1 26 A，1 28 A，1 3 7 A，1 47 A， 148E ， 1 5 7 A ， 1 60 A， 1 63 G， 1 65N ， 1 69 A ， 172V ， 176I，178P，180G，181A，182G，183Y，1 89H，1 94 A， 197E ， 201G ， 203D ， 211L ， 213A ， 215A ， 218A ， 222A ，223 H，22 5 P，2 3 2 E，23 3 D，242P，246 V，24 7 A， 24 8R，249T，2 5 0 S，251D，2 5 2A，2 5 4E，269Q，291 A ，296F，3 1 0Q，3 1 2H，3 1 5T，3 22N，3 3 0 A，3 42M， 3 4 6F，3 62 S，3 6 5 S，3 6 7E，3 6 8E，3 72 Y，3 7 4A，3 7 5 S， -41 - (2) (2)200403341 3 8 2 A ’ 3 8 4A，3 9 5 K，414A，417K，42 5 D，42 8 E，43 8N ，4 4 0 Ε 〇 3 ·如申請專利範圍第1或2項之多肽，其中模型植 酸酶包含以下之胺基酸： Q27 ’ Y28 ， R58 ， H59 ， R62 ， P64 ， T65 ， S67 ， K68 ’ Y72 ’ D1〇3 ， S140 ， R142 ， V143 ， E179 ， D]88 ， F243 ’ KN2 7 7，K2 7 8，H2 8 2，S 3 3 7，H 3 3 8，D 3 3 9，N3 40， F380’ 以及 A35，A46，N130，S141，G167，Q168， D174 ’ T191，E199，E205，L220，T23 5，D244，1268， H 3 0 6，G341，K3 5 6，A38 1 〇 4. 如申請專利範圍第1或2項之多肽，其中模型植 酸酶包含下列胺基酸： Q27，Y28，R58，H59，G60，R62，Y63，P64，T65 ，DE66 ， S67 ， K68 ， K71 ， Y72 ， D103 ， S140 ， R142 ， V143，E179，D188，E196，D23 9，F243，G274，KN277 ，K2 7 8，H2 8 2，S 3 3 7，H 3 3 8，D 3 3 9，N340，G34 1， V378， F380，以及 A35， A46， N130， S141， G167， Q168， D174， T191， E199， E205， L220， T235， D244， 1268 ， H306 ， G341 ， K356 ， A381 。 5. 如申請專利範圍第1或2項之多肽，其中該模型 植酸酶之胺基酸序列如序列確認號碼：1。 6. 如申請專利範圍第1項之多肽，其爲序列確認號 碼：3、序歹U確認號碼：5。 7. 一種多肽，其係與如申請專利範圍第6項多肽的 -42 - (3) (3)200403341 序列有至少9 ]，較佳者至少92，更佳者至少93，更佳者 至少 94，更佳者至少 95，更佳者至少 96，更佳者至少 9 7，更佳者至少9 8或最佳者至少9 9 %同源現象（相同性 )° 8. 一種多核苷酸，其係包含編碼上述申請專利範圍 第1至7項任一項多肽之聚核苷酸序列。 9. 如申請專利範圍第8項之多核苷酸，其爲DN A。 10. 如申請專利範圍第8項之多核苷酸，其係包含 序列確認號碼：2或序列確認號碼：4。 11. 一種載體，其包含如申請專利範圍第8至1 0項 任一項聚核苷酸序列。 12. 如申請專利範圍第1 1項之載體，其中編碼多肽 之聚核苷酸序列係操作性聯結至調控序列。 13. —種宿主細胞，其係以異性蛋白質的方式表現 如申請專利範圍第1至7項任一項多肽。 14. 一種宿主細胞，其係轉形入如申請專利範圍第8 至1 〇項之多核苷酸或如申請專利範圍第1 1或1 2項之載 體。 15. 一種製造如申請專利範圍第1至7項任一項多 肽之方法，該方法包含在表現多肽之條件下培養如申請 專利範圍第1 3或1 4項之宿主細胞。 16. 一種成分，其包含如申請專利範圍第1至7項任 一項多肽。