TW200401033A - Modified phytases - Google Patents

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200401033 (1) 玫、發明說明 ί胃明所屬之技術領域】 本:發明係關於改質之植酸酶。 【先前技術】 植物含有大量之植酸鹽作爲磷酸鹽之儲藏形式。單胃 動物不能從植酸鹽中釋出磷酸鹽，因此需要在飼料中補充 磷酸鹽。如今可在動物飼料中補充植酸酶以自植酸鹽中釋 出磷酸鹽。 植酸酶一般是在製作飼料的過程中添加動物飼料。在 某些動物飼料製造過程的階段中，植酸酶會逢及較高溫及 較高溼度。此類條件對於不穩定型化合物（例如酵素）之 活性上有負面影響。源自黑曲霉的植酸酶，由於植酸酶的 有利性質而常用於飼料用途。例如，在酸性的範圍中其具 有較大的最適酸鹼度、寬廣的專一性、對植酸有相對的高 比活性以及高親和性，即使在低植酸濃度下該酵素亦可有 效地降解植酸。彼可從植酸鹽中順利地移除6個磷酸鹽中 的5個磷酸鹽，而不會顯著的堆積中間物，彼之活性或穩 定性不需要輔助因子加以維持，彼對飼料成份及金屬離子 之抑制並不敏感。 然而，黑曲霉植酸酶的耐熱性較低。因此，植酸酶須 要具有與黑曲霉植酸酶相等的有利性質且在高溫下具有高 穩定性及活性。 本發明揭示具有有利性質的改質之植酸酶’例如對高 (2) (2) 200401033 溫及溼度具有抗性。 【發明內容】 本發明中’植酸酶是酵素，其可催化植酸鹽（肌纖維 醇六憐酸鹽）水解形成一種或多種下列化合物：肌纖維醇 五一 '四一、三一、二一以及單—磷酸鹽及/或肌纖維 醇。一般已知某些植酸酶不能將肌纖維醇單磷酸鹽大量水 解成肌纖維醇。植酸酶酵素可爲3 -植酸酶或6 -植酸酶 C分別爲EC 3.1.3.8或EC 3.1.3.26)，代表第一個水解 的酯鍵位置。 本發明之第一特色係關於改質之植酸酶的多肽。相較 於模型植酸酶，依據本發明之多肽係經修飾，當彼排列至 模型植酸酶後’含有之修改係選自：取代存在於模型植酸 酶之胺基酸成爲不同之胺基酸、刪除存在於模型植酸酶之 胺基酸、或插入胺基酸。將依據本發明多肽排列至模型植 酸酶後可取得依據本發明之多肽與模型植酸酶之間最大量 的同源殘基。 本發明較佳的具體實施例中，該修改爲取代。 修飾數目可至少爲一個，較佳者至少〗〇個，更佳者 至少2 0個，更佳者至少3 0個，更佳者至少4 〇個，更佳 者至少50個’更佳者至少70個，更佳者至少8〇個。 在本發明中’例如、' 5 QS 〃的表示法意指，模型植酸 酶中位置5之胺基酸經Q或s取代。原本的胺基酸殘基 的本質取決於使用之模型植酸酶。例如、q 5 s 〃的表示 (3) (3)200401033 法意指，存在於模型植酸酶之專一性胺基酸殘基（例如 Q )經不同胺基酸例如S取代。 優於模型植酸酶之改質植酸酶至少有一個下列位置係 經修 飾： 5，6，1 3，1 9，2 1 ，29 ，3 1， 36 ， 39 ， 43 ，5 3 69， 78， 81，85 ，87 ，99， 112 ，113 ，122, 125， 126 12 8 ，13 7 ，14 7, 14 8 ，1 57， 1 60 ，163 ，1 6 5， 169, 172 1 76 ，178 ，18 0, 18 1， ‘182, 1 83 ，1 89 ，194, 197, 20 1 203 ，2 1 1 ，2 1 3， 2 1 5丨 '218' 222 ，223 ，22 5， 23 2， 23 3 242 ，246 ，24 7， 24 8 ， | 249， 25 0 ，25 1 ，2 5 2， 2 54， 269 29 1 ，296 ，3 1 0， 3 12, 315' 322 ，330 ，3 42， 346， 362 365 > 367 ，3 6 8， 3 72， ，3 74， 375 ，3 82 ，3 84， 3 95， 4 14 4 17 ，42 5 ，42 8， 43 8 ，440 :或 較佳 者至少 一個下列 置： 13， 19，21 ，29 >31- 36， 39， 43，5 3 ，6 9 ，78 8 1， 85， 87 ， 99 ， 1 1 2，1 13， 122, 125， 126, 128 13 7 ，1 47 ，148， 15 7, 160, 163 ，165 ，169, 172, 176 1 78 -180 >18 1' 182’ 183, 189 ，194 ，197, 20 1， 203 2 11 -213 > 2 1 5 > 2 18’ 222， 223 ，225 ，23 2， 23 3， 242 246 ，247 ，24 8， 249 ’ 250， 25 1 ，252 ，2 54， 269， 29 1 296 >310 ，3 1 2， 3 15, 3 22， 330 ，342 ，346， 3 62， 365 367 ，368 ，3 72， 3 74 ’ 3 7 5， 382 ，384 ，3 95， 4 14, 4 17 425 ，428 ，43 8， 440 ； 或較佳者至少- -個下列位置 ：13 19, 2 1， 29，36 ，39 ，43， 53， 69， 81，85 ，87 ，99 112 ，113 ^ 122 ^ 125, 126, 128 ，137 ，147, 148， 15 7 1 60 ，165 ，169, 172, 176, 1 78 ，18 1 .183' 189, 197 -6- (4) (4)200401033 201 ， 203 ， 213 ， 218 ， 222 ， 223 ， 225 ， 232 ， 233 ， 246 ， 247， 248， 249’ 250， 251 ， 252， 291 ， 296， 310， 312’ 315 ， 322 ， 330 ， 342 ， 346 ， 362 ， 365 ， 367 ， 368 ， 372 ， 374， 375， 382， 384， 395， 417， 425， 438， 440。更佳 者’改質之植酸酶係於至少一個相較於該模型植酸酶之下 列位置上修飾：3 1，7 8，] 6 3，1 8 0，1 8 2，】9 4，2 1 1， 215， 242， 254， 269， 414， 428， 440° 特定言之，相較於模型植酸酶，改質之植酸酶含有至 少一個下列修飾：5 Q S，6 S Η，1 3 G，1 9 P，2 1 1，2 9 S， 31FY，36D，39Α，43D，53V > 69S，78ΕΑ，81Κ，85Α， 87Κ ， 99Τ ， 112Q ， 113Μ ， 122R ， 125Κ ， 126Α ， 128Α ， 1 3 7 A ，1 47A ， 1 48E ， 1 5 7 A ，1 60A ，1 63G ，1 65N ， 1 69 A > 172V- 1 7 6 1 , 1 7 8P， 1 80AG， 1 8 1 A， 1 82STG， 1 83 Y， 1 89H， 1 94 V A， 1 97E， 20 1 G ，203 D ，211TL ， 2 1 3 A ，2 1 5SA ，2 1 8 A ，222 A ，223H ，22 5 P ，232E ， 23 3 D ， 242SP ， 246V ， 247A ， 24 8R ， 249T ， 25 OS ， 25 1 D，252Α，254ΚΕ，2 69NQ，291Α，296F，310Q，312Η， 315Τ - 322Ν ， 330Α ， 342Μ ， 346F ， 362S ， 365S ， 367Ε ， 3 6 8Ε ， 3 72Υ ， 3 74Α ， 3 7 5 5 ， 3 82Α ， 3 84Α ， 3 95 Κ ， 414ΡΑ ， 417Κ ， 425D ， 428RKE ， 438Ν ， 440ΑΕ ；或更佳 者，當相較於模型植酸酶至少有一個下列修飾：5 Q S， 6SH，13 G，19Ρ，21]，29S，31Υ，36D，39Α，43D， 53V，69S，78Α，8 1 Κ > 85Α，87Κ > 99Τ，112Q，113Μ， 122R，125Κ， 126Α，128Α，137Α，147Α，148Ε，1 57Α > (5) (5)200401033 160A > 163G > 165N， 169A， 172V， 1761， 178P， 180G， 181 A ， 182G ， 183 Y ， 189H ， 194 A ， 197E ，20 1 G ， 203D， 211L > 213A， 215A， 2]8A， 222A， 223H， 225P， 23 2E，2 3 3 D > 242P，24 6V，247A，24 8 R，249T，2 5 0S， 251D ， 252A ， 254E ， 269Q ， 291A ， 296F ， 310Q ， 312H ， 315T ， 322N > 330A ， 342M > 346F ， 362S ， 365S ， 367E ， 368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414 A > 4]7K， 425D， 428E， 438N， 440E。 最佳地，相較於模型植酸酶，改質之植酸酶含有至少 —個下列之修飾： 3 1 Y，7 8 A，1 6 3 G，1 8 0 G，1 8 2 G， 194 A，211 L，215 A，242P，2 5 4E，269Q，414A， 428E ， 440E 。 本發明使用之位置編號係依據序列確認號碼：1之位 置編號。 本發明中使用之模型植酸酶是得自曲霉屬絲狀真菌之 植酸酶，較佳者是得自黑曲霉，或源自任何此類植酸酶之 變異體植酸酶。已知在黑曲霉個別品系內的植酸酶顯示低 程度之變化，即此類植酸酶之同源現象至少爲9 0 %。已 知黑曲霉菌種包含習知的無花果曲霉以及泡盛曲霉。最佳 之模型植酸酶是得自黑曲霉NRRL 3 1 3 5的植酸酶，如序 列確認號碼：1。 尤佳的模型植酸酶是內含專一性胺基酸殘基組合之植 酸酶，其係獨特地存在於黑曲霉植酸酶。 尤佳者，模型植酸酶之活性部位的胺基酸與在黑曲霉 -8- (6) (6)200401033 植酸酶對應位置上的胺基酸殘基相同。因此，本發明揭示 一種方法，藉以定義一些位於黑曲霉植酸酶活性部位上' 出現在距結合植酸鹽一段距離內之殘基。 形成黑曲霉植酸酶活性部位以及黑曲霉植酸酶降解植 酸相關的催化性質的胺基酸殘基係使用黑曲霉植酸酶3 D 結構加以確認，該結構可來自蛋白質資料庫（P D B )之入 口 1IHP ( Kostrewa et a!_Nature Structural Biology’ 1 9 9 7，4，] 8 5 )。黑曲霱3 D結構不含反應受質植酸（肌 肌醇六磷酸鹽）。然而，是可得到與植酸複合的大腸桿菌 植酸酶之 3D結構的（PDB入口 1 DKQ，Lim et al·， Nature Structural Biology，2000，7，108)。雖然序列同 源現象低，此二植酸酶均顯示實質構造的類似性。開始時 僅使用展示相似的摺疊模式之黑曲霉植酸酶（1 IHP )以及 大腸桿菌植酸酶的α碳原子之重疊的原子座標。其後，延 伸疊加的殘基，反複延伸直到疊加數目不再增加爲止。使 用疊加原子的均方根差判斷疊加品質。於最終疊加後，胺 基酸片段 1 DKQ: 6 — 2 2 ' 46 — 66’ 83 - 106’ 24 6 — 257， 268 — 278，296— 313，328338，346- 351，375- 381， 3 92 — 3 9 8 可重疊上 1 ΙΗΡ ： 4 8 — 64，1 04 — 1 24，1 3 3 1 5 6， 270— 281，293- 303，331- 348，379— 389，397- 402， 4 06 - 4 1 2，422 - 428。 疊加大腸桿菌植酸酶活性部位之受質植酸之後，轉移 至黑曲霉植酸酶的對應位點。接著將複合植酸的黑曲霉植 酸酶之能量最小化，使受質與活性部位殘基位移而仍使其 -9- (7) (7)200401033 苣余的結構保持固定。用 I n s i g h t & D i s c 〇 v e r程式 (Accelrys，San Diego CA)，使用 SGI Octane 工作站之 力場CVFF進行能量最小化。產生的複合植酸與黑曲霉植 酸酶的模型編碼爲丨Η P - S。計算胺基酸殘基溶劑易接近 白勺表面後發現受質植酸任何原子之距離7埃內至少有一個 原子·’可勾劃出內含植酸袋幾近理想之光滑的連續表面。 促成此活性部位袋之殘基的原子座標給定於圖1。此外， ΙΗΡ — S模型可用以確認受質周圍殘基的不同區域。結果 如圖2。 因此，在本發明中，黑曲霉植酸酶之活性部位的胺基 酸殘基係與在活性部位結合的植酸相距某段距離內。較佳 者相距6埃，更佳者7埃。 因此，尤佳的模型植酸酶含有胺基酸 Q 2 7，Υ 2 8， R58 ’ Η59 ， R62 ， Ρ64 ， Τ65 ， S67 ， Κ68 ， Υ72 ， D103 ， S140 ’ R1 42，V 1 43，Ε1 7 9，D 1 8 8，F243，ΚΝ2 7 7， Κ278 ， Η282 ， S337 ， Η338 ， D339 ， Ν340 > F380 (距離 6 埃以內），較佳之胺基酸爲 Q27，Υ28，R58，Η59， G60 ’ R62 ， Υ63 ， Ρ64 ， Τ65 ， DE66 ， S67 ， Κ68 ， Κ71 ， Υ72 ’ D103 - S140 > R142 ， V143 > Ε179 ， D188 ， Ε196 ， D239 ， F243 ， Q274 ， ΚΝ277 > Κ278 ’ Η282 ， S337 ， Η338 > D339， Ν340， G341 ， V378 ' F380(距離 7 埃以 內）。 尤佳的模型植酸酶尙含有存在於黑曲霉植酸酶之下列 胺基酸：A35， A46 > N130， S141 ， G167， Q168， D174， (8) (8)200401033 T191 > Ε199 ， Ε205 > L220 ， Τ235 ， D244 ， 1268 ， Η306 ， G341 ， Κ356 ， Α381 ο 對於本發明而言，非特定位置上具有何種胺基酸殘基 並不具關鍵性。該非特定位置是不在黑曲霉植酸酶活性部 位內之位置，而且不是以上黑曲霉額外地特定胺基酸，而 且不是用在以上特定的專一性修飾。使用習知的排列程式 排列植酸酶將可瞭解那一個胺基酸會典型地發生在那些位 置上。任何該胺基酸均可存在於本發明多肽對應的非特定 位置。 因此，依據本發明較佳的多肽是與存在於黑曲霉植酸 酶活性部位對應位置的胺基酸含有相同胺基酸殘基，以及 額外地特定的黑曲霉胺基酸（即 A 3 5，A 4 6，Ν 1 3 0， S141，G167，Q168，D174，ΤΙ 9 1，E199，E205 , L220， T23 5，D244,1 2 68，H3 06，G341，K3 5 6，A3 8 1 ) ' 而且 進一步的含有以上特定修飾之植酸酶。 依據本發明的尤佳多肽是另外含有至少一個下列胺基 酸殘基之植酸酶：31Y， 78A， 163G， 180G， 182G， 1 94 A > 211L > 215 A > 242P，254E，269Q，414 A - 428E 及 /或44 0E。依據本發明的另一尤佳多肽含有至少—個下 列胺基酸殘基：180G，182G，242P及/或440E;或較佳 者至少爲180G，182G及/或242P。 特定言之’本發明揭示之多肽是依據序列確認號碼： 3 '序列確認號碼：5或序列確認號碼：7的改質之植酸 酶。 -11 - (9)200401033 明多 響多 即非 經相 碼： 有9 更佳 至少 高耐 及/ /或 的宿 多黑 生化 或二 /或 熱性 性增 的溫 本發明多肽可包含所有以上設定之修飾。此外’本發 肽可包含額外的修飾，其中該多肽之修飾位置不會影 肽之摺疊或活性。典型地，該修飾可爲保守的取代， 極性、極性不帶電的、極性帶電價的或芳系胺基酸可 同類型之不同胺基酸取代。 具體實施例之一中，本發明多肽可包含與序列確認號 J、序列確認號碼：5或序列確認號碼：7之序列至少 [’較佳者至少9 2，更佳者至少9 3，更佳者至少9 4， 者至少95，更佳者至少96，更佳者至少97，更佳者 9 8或最佳者至少9 9 %同源現象（相同性）。 相較於模型植酸酶’依據本發明之多肽係經修飾以提 熱性及/或修改比活性及/或修改某些受質之專一性 或修改酵素之最適酸鹼度；及/或改良成錠穩定性及 改良生物功效，及/或改良在用於產生改質之植酸酶 主生物體內之表現、運輸、成熟、及其類似者。 在較佳的具體實施例中’依據本發明之多肽仍保留許 曲霉植酸酶（尤其是黑曲霉NRRL 3135植酸酶）的 學性質。保留的生化學性質是生理溫度的Km値及/ 個pH値約5 · 5及2 · 5之最適酸鹼度及/或比活性及 高活性。 在較佳的具體實施例中’依據本發明之多肽可提高耐 。相較於模型植酸酶’依據本發明改質之植酸酶耐熱 加，可在升高的溫度下有更長的生命期及/或在較高 度下改良重新摺疊/再活化之特性及/或反摺疊之特 -12- (10) (10)200401033 性。 出人意外地，依據本發明之多肽在提高耐熱性後有許 多黑曲霉植酸酶的有利性質。 因此對本發明多肽之（例如）耐熱性或活性重要的胺 基酸，可依據技藝上已知的方法，例如定點突變或丙胺酸 -掃描誘變確認及經修飾加以取代。後一技術中係在分子 的每一個殘基引入突變，測試產生突變分子之生物活性 (例如植酸酶活性）以確認明分子活性關鍵的胺基酸殘 基。亦可用核磁共振、結晶學或光親合力、標記或分子模 型測定之晶體結構分析測定酵素受質交互作用位點。 本發明多胜肽通常是在適當宿主生物體中表現編碼多 肽之聚核甘酸序列重組製作，但亦可用合成方法製作。 使用預期可提供後轉譯修飾作用（例如蛋白質水解加 工、十六烷基化作用 '糖基化作用、截斷以及酪胺酸、絲 胺酸或蘇胺酸磷酸化作用）的酵母菌及真菌宿主細胞，在 重組表現本發明產物時可賦予彼最佳的生物活性。 本發明多肽可提供其天然細胞環境以外的形式。因 此，彼實質上可被分離或純化（討論如上）、或製作自天 然上不含此肽之細胞’例如其它真菌、動物細胞' 酵母菌 細菌。 相較於技藝上已知的模型植酸酶，本發明多肽可用熟 悉此技藝的專業人士習知的任何適當的分析以測量其改進 之處。 於第二特色中，本發明提供（例如分離及/或純化 -13- (11) (11)200401033 的）多核苷酸，其係包含編碼第一特色多肽之聚核苷酸序 列。特定言之，本發明提供多一種核苷酸，其係包含編碼 序列確認號碼：3、序列確認號碼：5或序列確認號碼：7 胺基酸序列之聚核苷酸序列或包含序列確認號碼：2、序 列確認號碼：4或序列確認號碼：6之多核苷酸。 第二特色之多核苷酸進一步的包含編碼第一特色多肽 任何退化版本之聚核苷酸序列。例如，熟悉此技藝的專業 人士可使用常規地技藝’反映任何表現本發明多肽特定的 宿主生物體密碼子選擇進行核苷酸取代而不影響本發明多 核苷酸編碼之蛋白質序列。 第二特色之聚核苷酸序列可爲RNA或DNA以及包括 基因體DNA、合成的DNA或互補DNA。較佳者，多核苷 酸是DNA序列。 本發明之多核苷酸可依據技藝上已知的方法合成。彼 之製作可合倂依據以及沿著本發明多核苷酸之核苷酸序列 合成的寡核苷酸。 此外’彼在母系多核苷酸之任何所要求的位置可經爲 誘變後加以合成。 例如，本發明多核苷酸可構築自一系列具有約2〇個 核苷酸重疊長度爲80個核苷酸的合成寡核昔酸。用具有 校對活性之聚合酶進行P C R (典型的1 〇個步驟），將所 有80體之寡核苷酸退火並延長寡核苷酸。用具有校對活 性之聚合酶以位於所要求的片段之5，以及3，端的p C r引 子進行進一步的PCR，合成完整的片段。將完整的片段選 -14 - (12) (12)200401033 殖入適當的載體並加以定序檢驗是否得到正確的序列。可 視需要，校正序列誤差’例如使用來自Stratagene的 QuickChange組套，依據製造者之說明。 可使用本發明之多核苷酸取得編碼進一步修飾之多肽 的多核苷酸，例如以誘變技藝將本發明之多核苷酸誘變。 可使用定點突變在本發明多核苷酸的一個或多個專一性位 置加以改變。可使用基因置換技藝（例如如揭示於 W0 9 5 / 22 62 5、W098 / 2723 0、W098 / 0] 581 及 / 或 W Ο 0 0 / 4 6 3 4 4 )取得於任何成員之多核苷酸起始族群位置 具有隨機組合之任何多核苷酸變異體，該起始族群包括依 據本發明之多核苷酸。 本發明亦提供包含本發明多核苷酸之載體，包括選殖 及表現載體。 插入表現卡式盒或本發明多核苷酸的載體可爲任何可 方便地使用在重組DN A方法之載體，載體之選擇經常取 決於引入之宿主細胞。因此，載體是可獨立自主複製的載 體’即載體爲外染色體的實體物，其複製係與染色體的複 製無關’例如爲提供複製起始點之質體、黏接質體、病毒 或噬菌體載體。此外，當載體引入宿主細胞後可插入宿主 細胞的染色體’且與彼插入的染色體共同複製。載體可爲 圓形（例如質體）或線性（例如表現卡式盒）的多核苷 酸。 較佳者’本發明多核苷酸可插入表現卡式盒。在表現 卡式盒中’本發明多核苷酸係操作性聯結至能提供宿主細 -15 - (13) (13)200401033 胞自其編碼序列表現多肽的調控序列，即該載體是表現載 體。本文術語之”操作性聯結"意指並置，其中所描述成份 之關係爲可以其預期方式作用。調控的序列例如啓動子' 強化子或其他的表現調控信號，係”操作性聯結’’至編碼序 列’其置入方法係足以使調控的序列在相容之條件下表現 其編碼序列。 給定的宿主細胞之表現卡式盒係包容相互以連續的次 序從5 ' -端至3 ’ -端（相對於編碼第一特色多肽序列之密 碼股）操作性聯結的下列元件：能在給定的宿主細胞內直 接地轉錄編碼多肽之D N A序列的啓動子序列；可視需要 能直接地從給定的宿主細胞分泌多肽至培養基信號序列； 編碼成熟的以及較佳者活性形式多肽之D N A序列；以及 較佳者亦包含在編碼多肽之DNA序列下游能終止DNA序 列轉錄的轉錄終止區域（終止子）。 除了編碼本發明多肽之基因的天然啓動子以外，可使 用其它啓動子表現本發明之多肽。可選擇在表現宿主中可 有效表現本發明多肽之啓動子。 可選擇表現卡式盒或載體其設計係具有能和宿主細胞 相容共存之啓動子/增強子以及其它表現調控的訊息。較 佳者’啓動子序列係源自高度表現的基因。本發明中高度 表現的基因是指傳訊RN A佔總細胞傳訊RN a的至少〇 〇 ] % ( w / w )之基因（例如在誘發的條件下），或基因產 物佔總細胞蛋白質至少〇 · 2 % ( w / w )的基因，或所分_ 的基因產物其分泌量至少爲〇.〇5克/升。用以衍生較佳 -16- (14) (14)200401033 啓動子及/或其包含可表現卡式盒嵌入作用的較佳預定目 標基因座之較佳高度表現基因的實施例包含（但非限於） 編碼糖解酵素，例如丙糖一磷酸鹽異構酶（T PI )、甘油 醛磷酸鹽去氫酶（GAPD )、磷酸甘油酸激酶（PGK )、 丙酮酸激酶（PYK)、乙醇脫氫酶（ADH)之基因，與編 碼澱粉酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、細胞生物水 解酶、/5 -半乳糖苷酶、酒精（甲醇）氧化酶、延伸因子 以及核糖體的蛋白質之基因。適當的高度表現基因的特定 實施例包含例如：克魯維酵母之LA C 4基因、漢遜酵母以 及畢赤酵母之甲醇氧化基因（分別地爲 AOX以及 MOX ) '黑曲霉以及泡盛曲霉之葡糖澱粉酶（glaA )基 因、米曲霉之TAKA澱粉基因、構巢曲菌之gpdA基因以 及裡氏木黴之細胞生物水解酶基因。 爲了要在細菌中有效進行表現’尤其可使用適用於大 腸桿菌品系之啓動子。有力的細菌啓動子的實施例是a — 澱粉酶以及 SP〇2啓動子，與細胞外蛋白質基因之啓動 子。 酵母菌啓動子包含釀酒酵母菌之GAL4以及ADH啓 動子、粟酒裂殖酵母之nmt 1以及adh啓動子。有力的酵 母菌啓動子之實施例係來自乙醇脫氫酶、乳糖酶、3 -磷 酸甘油酸激酶以及丙糖磷酸異構酶基因。 應用於真菌表現宿主的強力構成型及/或可誘發的較 佳啓動子之實施例可取自真菌基因木聚糖酶（xlnA )、植 酸酶、ATP _合成酶、次單體9 ( oliC )、丙糖磷酸鹽異 (15) (15)200401033 構酶（tpi )、乙醇脫氫酶（AdhA ) 、a —澱粉（amy ) ' 戊基匍掃糖苷酶（AG —來自glaA基因） ' 乙醯胺酶 (a m d S )以及甘油醛_ 3 —磷酸鹽去氫酶（g p d )的啓動 一 ° 適用於植物細胞之啓動子包含胭脂鹼合成酶 (nos )、章魚鹼合成酶（〇cs )、甘露鹼合成酶 (mas )、核酮糖小次單體（rubico ssu ) '組織蛋白、稻 米肌動蛋白、菜豆蛋白、花椰菜鑲嵌病毒（CMV ) 35S以 及1 9 S以及環狀病毒之啓動子。在此技藝中可立即提供所 有的此類啓動子。 若要將多肽製作成分泌型蛋白質，則卡式盒中表現編 碼成熟多肽形式的聚核苷酸序列可操作性聯結至編碼信號 的聚核苷酸序列。 較佳者，該信號序列是編碼多肽的天然（同源的）聚 核苷酸序列。本發明的較佳具體實施例中信號序列係得自 黑曲霉植酸酶基因，尤其是如揭示於EP 0 420 3 5 8之信號 序列。此外，信號序列可爲編碼多肽的聚核苷酸序列之外 來的（異性的）聚核苷酸序列，在此案例中，較佳之信號 序列是表現D N A序列的宿主細胞之內生性序列。信號序 列可結合驅動信號序列編碼序列之啓動子共同使用，例如 可結合（黑）麴黴戊基葡萄糖苷酶（亦稱爲（gluco )澱 粉酶）啓動子與戊基葡萄糖苷酶（AG )基因之信號序列 (1 8以及24個胺基酸之版本均可）’以及可與其它啓動 子結合。 -18- (16) (16)200401033 本發明中亦可使用混合的信號序列。適當的酵母菌侣 主細胞信號序列之實施例是源自酵母菌α 一因子基因之信 _ 號序列。適當的細菌信號序列是來自α -源粉基因（桿 菌）。 在一些案例中，多肽經由分泌的路徑可在—個以上的 位置發生信號肽的裂解，此意味著可產生多種可變的Ν 一 端之成熟多肽。本發明包含該可變的Ν 一端之多0太。 編碼多肽之聚核苷酸序列下游可爲內含一個或多個轉 · 錄終止位點（例如終止子）之3 1未轉譯的區域。終止子的 起點較不重要。終止子可爲例如天然的編碼多肽之聚核苷 酸序列。然而，較佳者是在酵母菌宿主細胞中使用酵母菌 終止子以及在絲狀真菌的宿主細胞中使用絲狀真菌的終止 子。更佳者，是宿主細胞（其中表現編碼多肽之聚核苷酸 序列）之內生的終止子。 載體可含有一個或多個選擇性標記基因，以在多數的 未轉形細胞中選出轉形細胞。 · 較佳的選擇性標識包含（但非限於）那些可互補宿主 細胞缺點或賦予藥物抗性的標識。彼包含例如可作爲轉型 大多數絲狀真菌以及酵母菌之各種標記基因，例如乙醯胺 酶基因或cDNA (構巢曲菌、米曲霉、或黑曲霉之anids、 niaD、facA基因或cDNA ) ’或提供抗生素如G4 18、潮 黴素、博來霉素、康黴素、腐草黴素或免賴得抗性 (benA )之抗性基因。此外，可使用需要對應的突變宿主 品系之專一性選擇標識（例如營養缺陷的標識）：例如 -19- (17) (17)200401033 URA3 (來自啤酒酵母或其它酵母菌的同功基因） 或pyrA (來自構巢曲菌或黑曲霉）、argB (來自構巢曲 菌或黑曲霉）或trpC。在較佳的具體實施例中，自轉形的 宿主細胞刪除選擇標記之後引入表現建構體以便取得能產 生不含選擇標記基因之多肽的轉形宿主細胞。 其它標識包含A T P合成酶、次單體9 ( 〇丨丨c )、乳淸 嘧啶一 5’ -磷酸鹽脫羧酶（pvrA )、細菌的G4 1 8抗性基 因（此亦可爲用於酵母菌’但非真菌）、抗氨比西林基因 (大腸桿菌）、新黴素抗性基因（桿菌）以及大腸桿菌 uidA基因，編碼R—葡萄糖醛酸苷酶（Gus )之基因。可 在活體外使用載體’例如産生R* N A或用以轉染或;轉形宿 主細胞。 編碼肽之DNA序列，較佳者係以表現卡式盒之一部 份引入適當的宿主。轉型表現卡式盒引入適當的宿主時， 可使用熟悉此技藝的專業人士熟知的轉型方法。轉型宿主 之表現卡式盒可爲攜帶可選擇標記的載體之一部份，或表 現卡式盒可與攜帶可選擇標記的載體之分開分子共同進行 共轉形的作用。載體可包含一種或多種可選擇的標記基 因。 對大多數的絲狀真菌及酵母菌而言，載體或表現建構 體較佳者係插入宿主細胞染色體以取得穩定轉形株。然 而，對某些酵母菌而言適當的基因附體載體亦可提供穩定 及高度表現之倂入性表現建構體。包含此類載體之實施例 分別爲源自酵母菌及克魯維酵母之2μ及pKDl質體，或內 -20- (18) (18)200401033 含A Μ A序列（例如曲霉屬之A M A 1 )的載體。在表現構 築體插入宿主細胞基因組的案例中，構築體可使用同源重 組作用隨機插入基因組中之基因座，或預定目標的基因 座，在後一案例中，較佳之目標基因座係包含高度表現的 基因。稍早已提供許多高度表現基因的適當實施例。 亦提供包含多核苷酸或本發明載體之宿主細胞。多核 苷酸對宿主細胞染色體而言可爲異生性。本文術語之 ''異 生性〃意指非天然發生在宿主細胞染色體的多核苷酸或非 該細胞天然製作的多肽。 適當的較佳宿主細胞爲原核的微生物例如：細菌，或 更佳者爲真核的生物體，例如：真菌例如酵母菌或絲狀真 菌，或植物細胞。 來自桿菌屬之細菌爲非常適當的異生性宿主，因爲其 可分泌蛋白質至培養基。其它適當的細菌宿主是來自鏈黴 菌以及假單胞菌屬。 表現編碼本發明多肽D N A序列之較佳的酵母菌宿主 細胞爲酵母菌、克魯維酵母、漢遜酵母、畢赤酵母、蓍草 酵母、以及裂殖酵母。更佳之酵母菌宿主細胞，係選自： 釀酒酵母 '乳酸克魯維酵母（亦爲習知的克魯維酵母乳酸 亞種）、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂蓍草酵母 菌、及粟酒裂殖酵母。 最佳者是絲狀真菌的宿主細胞。較佳的絲狀真菌宿主 細胞係選自：曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬、雙側孢黴屬、青 霉屬、頂孢菌屬、脈孢囷屬、嗜熱子囊菌屬、毀絲霉屬、 -21 - (19) (19)200401033 孢子絲菌屬、梭孢殻屬、以及塔拉霉屬 (Talaromyces )。更佳的絲狀真菌宿主細胞是稻米麴 黴、大豆麹黴、構巢曲霉，或黑曲霉群之菌種（經Raper and Fennell，The Genus Aspergillus ’ The Williams &

Wilkins Company，Baltimore，pp 293 — 344，1965 定 義）。此類菌種包含（但非限於）：黑曲霉、泡盛曲霉、 塔賓曲霉、棘孢曲霉、臭曲霉、構巢曲霉、日本麴菌、麴 菌以及無花果曲霉，並含有品種：菌種裡氏木黴、禾穀鐮 刀菌、產黃青黴、阿拉巴馬頂孢黴、粗糙脈孢菌、嗜熱毀 絲霉屬、嗜纖維側孢黴、雙形孢雙側孢黴以及陸生梭孢 殼。 本發明範圍內較佳表現宿主的實施例是：真菌，例如 麴黴反木霉屬；細菌，例如桿菌例如枯草芽孢桿菌、地衣 芽胞杆菌活菌制劑、解澱粉芽孢桿菌、假單胞菌；以及酵 母菌例如克魯維酵母，例如：乳酸克魯維酵母以及酵母 菌，例如釀酒酵母。 依據本發明的宿主細胞並包含植物細胞，因此本發明 包含含有一種或多種本發明細胞之基因轉殖生物體，例如 植物以及部份。因此導入外來基因的（或基因經修飾之） 植物是在染色體插入（例如穩定地）編碼一個或多個本發 明多胜肽之序列。可使用已知的技藝，例如使用土壤根瘤 桿菌之T i或R丨質體轉型植物細胞。如此，質體（或載 體）可含有感染植物之必要的序列，以及可使用Ti及/ 或Ri質體衍生物。 -22- (20) (20)200401033 此外可直接侵染植物的一部份，例如葉、根或莖。在 此技術中可感染創傷的植物，例如用剃毛刀，保險刀切割 植物或用針穿刺植物或用磨蝕物磨擦植物。然後在創口引 入土壤桿菌。 然後植物或植物部份可生長在適當的培養基並發展成 成熟的植物。可使用已知技藝將轉形細胞再生成基因經修 飾之植物，例如使用抗生素選擇轉形的芽以及在內含適當 的營養物、植物荷爾蒙等之培養基中次培養芽。 如此本發明進一步的特色是提供轉形的或轉染包含本 發明之多核苷酸或載體的宿主細胞。較佳之多核苷酸內含 複製多核苷酸以及表現多肽之載體。可選擇與該載體能相 容共存之細胞，例如原核的（例如細菌的）、真菌、酵母 菌或植物細胞。 亦可選擇異性的宿主，其中本發明之肽被製作成不含 本發明多肽活性之其它多胜肽。可選擇通常不產生該多胜 肽相似活性的宿主達成此目的。 若本發明多核苷酸係倂入重組可複製的載體，則M _ 體可在相容的宿主細胞中複製多核苷酸。 如此本發明進一步的特色是提供產生依據本發乡丰亥 苷酸之方法，其係將依據本發明之多核苷酸引入可複製白勺 載體，將載體引入相容的宿主細胞，以及生長宿主細胞之 條件下複製載體。內含依據本發明多核苷酸之載體可回收 自宿主細胞。適當的宿主細胞包含細菌例如大腸桿菌。 本發明進一步的特色是提供製備依據本發明多_ $方- -23- (21) (21)200401033 法，其係在表現（以載體）依據本發明之多肽之條件下培 養宿主細胞（例如轉形或轉染說明如上之表現載體）以及 可視需要回收表現的多肚。較佳之多肽係製作成分泌型蛋 白質’此案例中表現建構體中編碼成熟多肽形式的聚核苷 酸序列可操作性聯結至編碼信號肽的聚核苷酸序列。 依據本發明之重組宿主細胞可用技藝上已知的方法培 養。在各啓動子以及宿主細胞之組合中，可提供有助於表 現本發明多肽之培養條件。達成所要求的細胞密度或多肽 滴度之後’可停止培養，並用習知的方法回收多肽。 發酵培養基可包含習知的培養基，其中內含碳源（例 如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜）、氮源（例如硫酸銨、硝酸 銨' 氯化銨、有機氮源，例如酵母菌抽出物、麥芽抽出 物、蛋白腺）、以及其它無機的營養來源（例如磷酸鹽、 鎂、鉀、鋅、鐵、等）。可視需要包括誘導物。 適當培養基的選擇可基於表現宿主及/或基於表現建 築體的調控需求。該培養液爲熟悉此技藝的專業人士習知 的培養液。培養基可視需要含有附加成份使轉形的表現宿 主比其它可能地污染微生物更具生長優勢。 發酵可進行〇 · 5 - 3 0天。發酵可爲整批次、連續或進 料分批法，適當地溫度介於0至4 5 t之間，酸鹼度介於 例如2至1 0之間。較佳的發酵溫度介於20至3 7°C之間 及/或酸鹼度介於3至9之間。通常是基於選擇之表現宿 主以及表現的蛋白質選擇適當條件。 發酵之後，若必要，可使用離心或過濾自發酵培養液 -24- (22) (22)200401033 中移除細胞。發酵停止之後或去除細胞之後，然後可回收 本發明之多肽’視需要用習見的方法純化的及分離。 一般而言’本發明之多肽可合倂適當的載體（固態或 液體）或包括產生多肽成分緩衝溶液之稀釋劑。多肽可附 者至或與載體混合，例如固定於固態載體。如此本發明進 一步的特色提供含本發明多肽之成分。彼可爲適用於包 裝、運送及/或儲藏之形成，較佳者仍保留多肽之活性。 組成物可爲糊狀醬料、液體、乳膠、感光乳劑、粉劑、薄 片、顆粒、片或其它押出的形式。 成分可進一步的包含額外成分，例如一種或多種額外 的酵素。 一般多肽可穩定地調製成液體或乾燥形式。一般產物 成分可視需要包括例如穩定化緩衝劑及/或防腐劑。 本發明額外地係關於食品或動物飼料成份或包含一種 或多種本發明多胜肽之添加物。多肽可存在於飼料，其濃 度可不同於天然的濃度。較佳的量是0· 1至1 00 ,例如 〇 . 5至5 0，較佳者爲1至1 0毫克/公斤飼料。 本發明亦關於製備動物飼料成份之方法，該方法包含 添加入一種或多種可食用的飼料物質或成分（本發明之多 肽）。多胜肽可分別與飼料物質或成分，單獨的或結合其 它飼料添加劑添加入動物飼料成份中。多肽可爲飼料物質 或成分之整體的一部份。 本發明多胜肽亦可添加入動物飼料中以改良植物組 份（例如植酸鹽）之分解，改良植物營養物被動物的利 -25- (23) (23)200401033 用。有利地，本發明多胜呔可在生物體內中繼續降解植酸 鹽。本發明的真菌多胜肽’特別而言具較低的酸驗度最大 活性範圍以及能在動物胃中該酸性的環境中釋放重要的營 養物。 本發明多胜肽亦可用於自大豆產生牛奶取代物（或替 代品）。此類牛奶取代物供應人類及/或動物。 成分可額外地包含（尤其是當其係調製成應用於動物 飼料）一種或多種離子載體、氧化劑、表面活性劑、保護 瘤胃的胺基酸'酵素增強子或可在進食動物胃腸道爲製作 的天然酵素。當添加至反芻動物或單胃動物（例如家禽或 緒）飼料（包括青貯飼料）中時，飼料可包含穀類植物， 例如大麥、小麥、玉米、黑麥或燕麥或穀類植物副產品’ 例如麩皮或玉米糠，或其它植物材料，例如大豆以及其它 夾果。酵素可顯著的改良植物材料的降解，使動物更能利 用植物營養物。結果可改良成長率及/或飼料轉化。 本發明多胜肽在局度酸性的條件下（例如在動物胃 中）仍有活性’尤其是可採用動物飼料。 外生性添加本發明多肽之方法是以導入外來基因的植 物材料及/或（例如導入外來基因的）種子的形式加入多 肚。如此多肽可經由異性的基因表現合成，例如編碼所要 求酵素的基因可選殖入植物表現載體，並由適當的植物表 現訊息加以控制’例如組織一專一性啓動子，例如種子一 專一性啓動子。內含編碼多肽基因之表現載體可接著轉形 入植物細胞’轉形的細胞可選擇性的再生成整個植物。如 •26- (24) (24)200401033 此得到的導入外來基因植物可生長及收穫，以及內含異性 (對植物而言）多肽的植物部份可直接或經進一步的加工 之後包括於組成物之一。異性的多肽可內含於導入外來基 因植物的種子或可內含於其它植物部份，例如根、莖、 葉、木材、花、樹皮及/或水果。適當的植物包含穀類植 物，例如：燕麥、大麥、小麥、玉米以及稻米。 添加導入外來基因植物材料形式的多肽，例如導入外 來基因的種子，需要對植物材料加工以得到多肽，或至少 改良其利用率。該加工技藝可包含各式各樣機械性（例如 磨碎及/或硏磨）的技藝或熱機械性的處理例如擠壓成形 或擴張。 如此本發明亦關於促進單胃或非反蕩型動物之生長及 /或飼料轉化之方法，該方法包含用本發明之多肽飼育動 物。適當的動物包含農場之單胃及/或非反芻動物，例如 豬隻（或小豬）、家禽（例如雞、火雞）、小牛或犢牛或 水產（例如海產類）動物（例如魚類）。 【實施方式】 實施例1 構築產生植酸酶之品系 合成具有依據序列確認號碼：2、序列確認號碼：4 及序列確認號碼：6序列之DNA片段。證實dnA序列之 後，將此類合成的基因片段使用PCR融合至黑曲霉植酸 酶信號序列，以及在葡糖澱粉酶啓動子的控制下選殖。將 -27 - (25) (25)200401033 描述於國際性的專利申請案W Ο 9 8 / 4 6 7 7 2中內含p h y A基 因之p G B T Ο P F Y TI表現載體用說明如上之改質之植酸酶 基因取代，產生的載體分別稱爲pTHFYT2、PTHFYT4及 PTHFYT6。 將表現載體pTHFYT2、pTHFYT4及pTHFYT6弓|入黑 曲霉 CBS 646.97(描述於 W098/46772)。使用 PCR 選 擇內含PTHFYT2、pTHFYT4及pTHFYT6的轉形株。爲了 測定此類轉形株是否能分泌活性的植酸酶，將轉形株生長 在內含植酸鹽的平板如描述於Chen ( 1998，Biotechnol. Technique：!〗，759 — 761)。在此分析中，若分泌出活性 植酸酶，則由於植酸鹽降解而在麹黴菌落的附近可看見燦 爛的光環。使用此分析展示所有表現載體可使轉形株分泌 活性的植酸酶F Y T 2、F Y T 4或F Y T 6至培養液。 將顯示燦爛光環的轉形株生長於搖動燒瓶中。將1 〇7 個選擇轉形株及對照組的孢子接種入動燒瓶中燒瓶，燒瓶 中內含20毫升之培養液，每公升培養液內含：30克麥芽 糖· Η2 Ο ; 5克酵母菌抽出物；]〇克水解的酪蛋白；1克 ΚΗ2Ρ〇4 ； 0.5 克 MgS04 · 7Η20 ; 0.03 克 ZnCl2 ; 0.02 克 CaCl2; 0.0 1 克 MnS04· 4H20; 0.3 克 FeS04· 7H20; 3 克Tween 80; 10毫升青黴素（5000 IU /毫升）/鏈黴素 (5 0 0 0 U G /毫升）；酸鹼度5 . 5。此類培養物在3 4 t下 生長2 0 — 24小時。將1 〇毫升之培養菌種接種至1 〇〇毫升 黑曲霉發酵培養液，每公升培養液中含：70克麥芽糊 精；2 5克水解的酪蛋白；1 2.5克酵母菌抽出物；1克 -28 - (26) (26)200401033 KH2P〇4 ； 2 克 K2S 04 . 0 5 克 MgS04 . 7H20 ; 0.03 克 ZnCl2 ； 0.02 克 CaCl2; 0.0 1 克 MnS04. 4H20; 0.3 克 FeS04 · 7 H 2 O ; 1 0毫升青黴素（5 0 0 0 I U /毫升）/鏈黴 素（5 0 0 0 U G /毫升）；用4 N Η 2 S ◦ 4調至酸鹼度5 · 6。此 類培養物在34°C下生長約6天。將發酵培養液之樣品離 心（1 〇 分鐘，5 . 0 0 0 r p m，s w i n g i n g b u c k e t 離心機）以及 收集懸浮液。 實施例2 FYT2、FYT4及FYT6之熱穩定性。 依據實施例1在搖動燒瓶中製作FYT2、FYT4、FYT6 以及野生型A. ficuum植酸酶（EP 0 42 0 3 5 8 )。在適當 時間間隔取樣並依據描述於 v a n . E n g e 1 e n e t a ]. ( J 〇 u r n a 1 of AOAC International 1994，77 : 760— 764)之方法測定 上淸液中植酸酶之活性以追蹤植酸酶之產生。活性用F T U 表示’ 1 FTU之酵素量是在測驗條件下（ΡΗ = 5·5，溫度37 °C，5毫莫耳濃度植酸鈉）每分鐘釋出1 4莫耳之無機正 磷酸鹽。測量懸浮液中酵素之耐熱性。視需要，植酸酶懸 浮液可用超濾法進一步濃縮。 用三種不同方法測量耐熱性。首先，測定植酸酶之 T 5 0。T 5 Q ( °C )是樣品加熱2 0分鐘後具有5 0 %活性之溫 度。實驗條件：壓力測驗在2 5 0毫莫耳濃度HAc/NaAc / T w e e η 2 0 ’ p Η = 4.0下進行。植酸酶之劑量約〇 . 6 F T U / 毫升。樣品加熱之後立刻在冰中冷卻。接著在2 5 0毫莫耳 -29 - (27) 200401033 濃度HAc/ NaAc/ Tween20，ρΗ = 4·0下測量殘餘的植酸 酶活性。結果如表1。FYT2及FYT4更穩定的耐受約8 — 9〇C 。 表1 :各種> 暄酸酶的耐熱性 植酸酶 T5 0 ( °C ) Topt ( °C ) DSC Td ( °C ) F YT2 74 75 79 FYT4 73 75 79 野生型 65 64 70

其次，於加熱期間測定植酸酶之活性。從實驗的加熱 溫度函數中，可從生產力得到酵素之最適溫度。反應係統 一進行3 0分鐘時間。受質轉換量取決於酵素的活性與去 活化。因此較佳者是用生產力取代活性。實驗條件：25 0 毫旲耳濃度 HAc/NaAc/Tween20 pH = 4.0，植酸酶劑量 約0.012 FTU/毫升。釋出之磷酸鹽可依上述之標準檢測 方法測量。結果如圖3。F Y T 2與F Y T 4在7 5 t下仍有催 化性生產力’而野生型對照組則已完全喪失其催化活性。 雖然在75°C以上活性開始減少，圖3顯示FYT2與FYT4 在高達約8 5 °C下仍有催化能力。F Y T 6之行爲介於野生型 及FYT2或FYT4之間。 第三’除了經由適當的活性分析測量耐熱性之外，植 酸酶之耐熱性亦可藉由測定植酸酶酵素三維結構去摺疊溫 度而直接測定。伴隨去摺疊的加熱效應可用微差掃描熱分 -30- (28) 200401033 析儀（D S C )測量。D S C之實驗條件：2 5 0毫莫耳濟p HAc/ NaAc PH = 4.0，約5毫克/毫升植酸酶，加熱速宠 爲2.5 °C /分鐘。結果如圖1。圖1顯示在維持天然酵素 結構的溫度上改質之植酸酶F Y T 2及F Y T 4比野生型植―@ 酶高出約91。 實施例3 FYT2、FYT4及FYT6製錠之穩定性 測試二種錠片受質，及以FYT2、FYT4及fyT6菌種 培養濾液設定溫度。 將培養過濾物及需要量的玉米澱粉（C -凝膠，$自 C e r e s t a r )及水攪拌/捏合製成所有顆粒。參閱表2及3 之溼混合成分。攪拌及捏合之後，混合物用Nica E — 220 押出機押出以及用 Fuji Paudal QJ- 4000 δρ1ιει.οηί5Μ s p h e r ο n i s e d。得到的顆粒用G 1 a 11 G P C G 1 · 1流床乾燥器乾 燥。顆粒活性介於25 00至3 000 FTU/克。 表2 ： RDS 05顆粒混合物之成分 植酸酶 酵素液體（克） 澱粉質（克） 水（克） FYT2 176 748 123 F YT4 23 8 113 7 1 94 野生型 1 27 1300 352 -31 - (29) (29)200401033 表3 : RD S A1顆粒混合物之成分 植酸酶 酵素液體（克） 澱粉質（克） 水（克） F YT2 24 1 13 00 274 F YT4 27 1 13 00 2 5 9 野生型 109 】3 00 363 將 2 5公斤進料（成分依據表 4 )混合成 2 5 0克顆 粒，以及在測試之前混合2 2 5公斤的相同成分。2 5公斤 的進料是用Collete MP90 planetary混合器混合10分鐘。 25公斤以及22 5公斤進料係於1 2 00公升Nauta混合器中 混合。用混合物樣品決定製銳之穩定性。2 5 0公斤混合物 在混合螺杆之 600公斤/小時速度、蒸汽注入加熱至8 0 °C下用混合器混合。駐留時間約1 〇 - 1 5秒，此時將熱混 合物擠壓至製錠擠壓器。測試使用之受質爲5/45毫米 (寬度/長度；RDS05)或3/65毫米（寬度/長度； RDS A1 )。碇片離開擠壓器之溫度爲 8 2 — 8 3 °C ( RDS 0 5 )或 9 1 — 9 3 °C ( RD S A1 )。將碇片擠壓至冷卻帶之 後，將樣品進行穩定性測試。 -32- (30) (30)200401033 表4 :用於RDS 05以及RDS A1製錠試驗之家禽飼料成分 原料 含量（％ ) RDS 05 RDS A] 玉米 4 5 5 0 Peas ( 20.7% cp ) 5 — 油菜粉 4.5 葵花子粉 4.5 玉米麵筋花 2,5 全部大豆（烘焙） 10 6 大豆粉（46.7% cp ) 27.50 2 1 木馨（ 62,5— 67,5灑粉） 4.7 2 3.85 大豆油（植物油） 3.50 1.0 動物脂肪 — 3 . 7 維生素預調混合物Mervit 100 1.00 0.5 石灰石 1.35 1.3 5 單磷酸鈣 1.30 0.2 鹽 0.3 5 0.18 NaHC03 0.25 L 一離氨酸 0.05 0.26 D L —甲硫胺酸 0.23 0.18 L -蘇胺酸 0.03 -33- (31) 200401033 表 5 :製錠產生耐熱的植酸酶（RD S 0 5 )。熱磨溫度爲 8 0 °C。碇片溫度約達到8 2 — 8 3 °C。產品製錠前後之活性 係使用標准植酸酶分析（v a n . E n g e 1 e n e t a 1.，J 〇 u r η a 1 〇 f AO AC International 1994，77. 760— 764)測量。 植酸酶 製錠產率％ F YT2 79 F YT4 8 1 野生型 3 6 表 6 :製錠產生耐熱的植酸酶（RDS 0 1 )。熱磨溫度爲 8 0 °C。碇片溫度約達到9 2 — 9 3 °C。產率測定結果如表5。 植酸酶 製錠產率％ F YT2 3 9 F YT4 3 7 野生型 12

製錠測試顯示在 82 °C下，相較於野生型，FYT2、 FYT4以及FYT6之耐熱性均增加，在92 — 93 °C下FYT2、 FYT4的穩定性高於FYT6。 實施例4 植酸酶之生化特性 -34 - (32) (32)200401033 過濾發酵培養液之後，從濾液純化植酸酶，接著測定 植酸酶比活性。用離子交換層析法或親和層析法或此二方 法之組合純化植酸酶。 使用 C ο η A (刀豆素）親和性受質（η i 丁 r a p c ο η A， AmeTsham Pharmacia Biotech)進行糖基化植酸酶的親和 層析法。將植酸酶結合至2 0毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲 烷/ 0.5莫耳濃度NaCl/ΐ毫莫耳濃度MnCl2/l毫莫耳 濃度C a C 12 / p Η = 7.4之管柱。在徹底淸洗管柱之後用2 0 毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲烷/ 0.5莫耳濃度NaCl/0.5 莫耳濃度甲基一 α—呋喃葡萄醣苷/ pH = 7.4溶析植酸酶。 用20毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲烷 ρΗ = 8·5再生管柱。 緩衝溶液酸鹼度用4 N H C 1設定。 使用陰離子交換劑（R e s 〇 u r c e Q，A m e r s h a m Pharmacia Biotech)進行離子交換色譜分析。使用 PD-1 〇凝膠過濾管柱去鹽漬及改變緩衝液。用5 0毫莫耳濃度 三羥甲基胺基甲烷，pH = 7.5平衡管柱。負載植酸酶樣本 之後，使用梯度〇至1莫耳濃度NaCl之50毫莫耳濃度三 羥甲基胺基甲烷P Η = 7 · 5溶析植酸酶。 經Ε2 8 0測量測定純化植酸酶的蛋白質含量，1毫克 /毫升植酸酶相當於〇 D 2 8 〇，丨S分=〇 . 9 3 8。1毫克/毫升 FYT2、FYT4及FYT6之〇 D 2 8 〇，！公分分別相當於0.99 5、 0.99 5及 0·96 3。測定之活性爲 FTU，如描述於 van Engelen et a 1. ( Journal of A0 A C International 1 994， 77:760-764 )。 (33) 200401033 用起始反應速率作爲反應受質濃度之函數測量植酸之 K m値。分析混合物內含1 . 〇 ' 〇 . 5、〇 . 2 ' 0，1，〇 . 〇 5、 〇 . 〇 2 5、〇 · 〇 1 5毫莫耳濃度植酸之2 5 0毫莫耳濃度N a A c緩 衝液p Η = 5 · 5。以1 5 % T C A ( 1 :])終止酵素反應。攪拌 含〇·6莫耳濃度H2S04-2%抗壞血酸〇·5%鉬酸銨（1: 1 )之停止反應混合物測定釋出的無機磷酸鹽，混合物在 5 0 °C下反應2 0分鐘以及測量8 2 0毫微米之吸收（W y s s e t al.Appl Env Microbiol 1999，65 : 367373)。結果如表 Ί。 表7 ·植酸酶使用植酸作爲受質之催化性質 生化性質 野生型 FYT2 F ΥΤ4 比活性F T U /毫克 1 00 1 02 1 03 Km(微莫耳濃度，ρη = 5·5) 12 8 5 表7比較野生型之比活性與植酸之高親和性顯示修飾 之酵素不受影響。 在不同ρ Η値下測量從植酸釋放磷酸鹽之速率，測定 酸鹼度依存的植酸酶活性。基本上除了各種酸鹼度之外使 用標準植酸酶分析。以P Η = 5.6下之活性定爲1 〇 〇 %活 性。使用下列緩衝溶液設定實驗之酸鹼度：2 5 0毫莫耳濃 度甘胺酸，酸鹼度範圍爲2.8至3.2 ; 25 0毫莫耳濃度 NaAc之酸鹼度範圍爲3.6至5.6; 250毫莫耳濃度咪唑’ 酸鹼度範圍爲6至7以及25 0毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲 -36- (34) 200401033 烷，酸鹼度範圍爲7.5至9。此結果如圖8。 表8 :植酸酶活性之酸鹼度依賴性。給定的活性是以酸鹼 度=5 6下觀察到最大的活性設定爲1 〇 〇 %之百分比表 71^ ° 相對於在pH = 5.6下活性的活性％ F YT2 F YT4 野生型 pH値 2,8 77,7 78,7 70,4 3,2 77,0 79,7 5 9,3 3,6 52,9 54,1 4 6,1 4,0 3 9,9 43,2 3 9,3 4,4 77,9 76,6 7 0,6 4,8 85,5 84,8 90,0 5,2 90,0 93,7 99,8 5,6 100,0 100,0 100,0 6,0 92,2 9 1,8 80,5 6,5 6 5,6 67,8 5 5,6 7,0 46,5 50,7 27,6 7,5 22,3 23,7 4,2 7,9 1,6 1,7 0,4 8,5 0,2 0,2 0,8 9,0 0,4 0,3 0,3

-37- (35) 200401033 改質植酸酶之酸鹼度依賴的活性與野生型非常相似。 尤其特別的是野生型植酸酶維持二個最適pH。其中一個 最適酸鹼度約爲 pH = 2.5，而第二個最適酸鹼度約爲 p Η = 5。表8顯示此野生型黑曲霉植酸酶的特定特色在修 飾的FYT2、FYT4及FYT6中不受影響。 在2 5 0毫莫耳濃度NaAc、ρΗ=5·5、37°C下，植酸酶 降解植酸的進展曲線是時間的函數。反應受質濃度爲〇.2 毫莫耳濃度植酸下，植酸酶之劑量爲〇.〇 5 FTU/毫升。 以15%TCA(1:1)終止酵素反應。攪拌MOO微升0.3 莫耳濃度H2S04 — 1%抗壞血酸—0.27鉬酸鞍與100微升 之反應混合物測定釋出的無機磷酸鹽’接著混合物在5 0 。(：下反應2 0分鐘以及測量8 2 0毫微米之吸收。結果如表 9 °

表9 :植酸酶降解植 酸之進展曲額 ——— 820nmX^_〇 D FYT2 FYJLi— 野生型 反應時間（分鐘） ---- 0 0 ...-__—--—---1 "" 0 10 0.3 1 o.li__ 0.38 20 0.59 〇ιΙ1— 0.65 45 0.84 〇·ϋ__ ____—丨丨丨…-— 0.83 90 0.87 〇._9〇__ 0.86 -38- (36) (36)200401033 結果顯示改質之植酸酶在自植酸釋出磷酸鹽方面與里予 生型植酸酶非常相似。一小時之後進展曲線到達平緩區約 釋出8 0 - 8 5 %之磷酸鹽。所有植酸酶到達此平緩區之速 率相似，顯示野生型植酸酶自植酸釋放磷酸鹽之功效在改 質之植酸酶中不受修飾影響。 結論：結果顯示，相較於野生型植酸酶，修飾之 FYT2、FYT4及FYT6的催化效能不受影響。結果顯示避 免任何展示於圖1胺基酸之突變化（在受質7埃內的殘 基）以及進一步的保留額外的黑曲霉胺基酸即可保持野生 型黑曲霉植酸酶的功能性質。 實施例5 改質植酸酶之生物功效 液體植酸酶之試驗 使用彼之液體調配物製錠成片後進行生物效性測驗比 較新近產生的耐熱植酸酶。加入該劑量植酸酶酵素其活性 將爲100、2 00或3 00 FTU /公斤飼料。進行測驗是用 br oiler s(5— 33天）餵食以玉米一大豆爲基礎的膳食（前 14天餵食試驗膳食，後14天餵食稍微不同的膳食）。基 礎飲食中可吸收的磷含量爲2.2克/公斤飼第料（第5 ~ 1 9天）以及1 · 7克/公斤飼料（第1 9 一 3 3天）。此類數 値遠低於動物估計的需求量。每種處理的動物居於六層的 鳥籠，各鳥籠內含14隻鳥類。使用 Finney ( 1 9 64 :

Statistical method in biological assay.Charles Griffin - -39 - (37) (37)200401033

London.)之方法。基於分析植酸酶內含物（FTU/公 斤）計算結果。體重結果如表1 〇。 表1 0。根據植酸酶的分析活性計算在全部實驗期間 (5 — 3 3天），不同型之植酸酶與野生型（=丨〇 〇 % )對體 重的相對功效（於液體製錠之後）。 表10 測驗產物 B W FYT2 98 F ΥΤ4 68 野生型 1 00 所有產物迴歸線的斜率顯著的與零不同。表1 0顯示 除F Y T 4以外’產物之間沒有差異。韻食此酵素與鎖食其 他植酸酶之動物雖然不同，但在統計上並不顯著。 顆粒狀植酸酶之試驗 在製錠成片前，進行測驗比較顆粒狀調配物中的耐熱 植酸酶。意即在製錠過程中置入植酸酶。此試驗製錠中以 大約92 °C之高溫進行製錠。因爲該目標是在提供動物之 飼料中加入100、20 0或3 00FTU/公斤，進行前製錠試驗 以估計此方法中活性之流失間，以及過多荷載產物以達成 該活性。用相似液體試驗產物的方法進行測驗，使用 broilers ( 5 - 33天）餵食玉米大爲基礎的膳食（全部時 -40- (38) 200401033 期僅用一種膳食），其可吸收 計需要量（1 .9克/公斤飼料 層的鳥籠，各鳥籠內含]4隻 對斜率如表Π。 的磷含量遠低於此類動物估 )。每種處理的動物居於六 鳥類。體重增量迴歸線的相 表]1。根據植酸酶之分析活性計算在全部實驗期間 (5 — 33天）’比較不同型之植酸酶與野生型（=；[〇〇%) 對體重增量的相對功效（除了野生型是以液體調配物於製 錠後施用之外，其它均係以顆粒施用）。 測驗產物 B WG FYT2 147 F YT4 126 野生型 100

此試驗中以植酸酶FYT2最好’其次是FYT6、FYT4 以及野生型。 實施例6植酸酶FYT2以及FYT6的單一突變體 製備以下植酸酶 FYT2的單一突變體：Y31F， A78E ， G163R ， G180A ’ G182S ， A194V ， L211T ， A215S ， P242S ， E254K ’ Q269N ’ A414P ， E428R 及 E440A，以及植酸酶FYT6的單一突變體：E440A。 在此方面係將編碼F YT - 2 (序列確認號碼：2 )或 FYT6 (序列確認號碼：6 )之基因用PCR放大’其總 體積爲50微升、使用2.5 U Pwo聚合酶（Roche -41" (39) (39)200401033 diagnostics，GmbH，Mannheim，Germany) 、100 毫微克 DNA模版、0.5毫莫耳濃度dNTP、i x Pwo緩衝液、l〇 微微莫耳DSM—l F以及1010微微莫耳dSM— 1 R ，下 列之條件 5，9 4 °C 、3 0 x ( 3 0 " 9 4 cC Γ1 60 °C 2' 72 °C ) 、5 1 7 2 °C 。將放大的片段選殖入 p C R ® — B 1 u n t — TOP O ( Invitrogen life technologies，Carlsbad，CA， USA)載體並使用 Stratagene ( Stratagene，La Jolla， CA，USA)之 QuickC h an ge kit，依據供應商之建議引入 突變。 DSM—l F以及DSM — 1 R引子之序列如下： DSM - 1 F 5' GGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT 3" DSM- 1 R 5' GTCATCGCGATTAATTAATCTAAGC AAAACACTCCTCCCAGTT 3' 使用下列引子進行突變，其中突變的密碼子用粗字體 反白。 -42 - (40) 200401033 突變 引子組 Y31F 5'- GGTCAATACTCCCCGTTCTTCTCTCTGGCAGAC - 3' 5’- GTCTGCCAGAGAGAAGAACGGGGAGTATTGACC - 3’ A78E 5' - TCCGCTCTCATTGAGGAGATCCAGAAGAACGCG - 3' 5’ - CGCGTTCTTCTGGATCTCCTCMTGAGAGCGGA - 3’ G163R 5' - AAGCTGGCCGATCCTCGTGCCAACCCCGGCCAA - 3' 5’ - TTGGCCGGGGTTGGCACGAGGATCGGCCAGCTT - 3, G180A 5' - GTGATCATTCCCGAGGCCGCCGGCTACAACAAC - 3' 5 - GTTGTTGTAGCCGGCGGCCTCGGGAATGATCAC - 3' G182S 5' - ATTCCCGAGGGCGCCTCATACAACAACACTCTC - 3' 5' - GAGAGTGTTGTTGTATGAGGCGCCCTCGGGAAT - 3' A194V 5' - CACGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAGAGCGAA - 3' 5, - TTCGCTCTCTTCGAAGACAGTGCAGGTGCCGTG - 3’ L211T 5, - GCCAATTTCACCGCCACGTTCGCCCCCGCCATT - 3， 5' - AATGGCGGGGGCGAACGTGGCGGTGAAATTGGC - 3' A215S 5, - GCCCTGTTCGCCCCCTCCATTCGTGCCCGTCGT 3’ 5' - ACGACGGGCACGAATGGAGGGGGCGAACAGGGC - 3 P242S 5, - CTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCGTCGCC - 3’ 5' - GGCGACGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG - 3, E254K 5, - ACCTCCGACGCCACCAAGCTGTCCCCCTTCTGT - 3， 5’ - ACAGAAGGGGGACAGCTTGGTGGCGTCGGAGGT - 3’ Q269N 5' - CATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAG - 3' 5' - CTGGAGGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTCATG - 3' A414P 5' - CCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATAAGTTGGGG - 3' 5' - CCCCAACTTATCAACCGGACACCCATGCAGCGG - 3* -43- (41) (41)200401033 E428R 5' -CGGGATGACTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCT - 3' 5' - AGCAAAGCTCAACCCCCTCACAAAGTCATCCCG - 3' E440A 5' - TCCGGGGGTAACTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG - 3 5' - CTAAGCAAAACACTCCGCCCAGTTACCCCCGGA - 3' 用序列分析檢查產生的植酸酶dna片段之序列。植 酸酶序列係選殖入pGBTOPFYTI以及如描述於實施例1 製備菌種培養懸浮液。 測定各FYT2 、FYT6以及單一突變株的T50値（參 閱實施例 2 )。此結果如圖1 2。

-44 - (42) 200401033 表1 2 :植酸酶突變體之T5 0値 植酸酶 T5 0°C F ΥΤ2 - Υ3 1 F 74 FYT2 — Α78Ε 74 F ΥΤ2 — G 1 63R 74 F ΥΤ2 — GI80A 7 1 FYT2— G182S 73 FYT2- A194V 74 F ΥΤ2 - L2 1 1 Τ 74 FYT2- A215S 74 F ΥΤ2 - Ρ242 S 73 F ΥΤ2 - Ε25 4Κ 73 F ΥΤ2 - Q269N 74 F ΥΤ2 - Α4 1 4Ρ 74 FYT2 — E42 8 R 74 F ΥΤ2 — Ε440 A 74 FYT6- E440A 65 FYT2 74 F YT6 65

得到的大部份突變體顯示其Τ50値與植酸酶 FYT2 相當。出人意外地，內含所有單一突變組合之FYT6的 Τ50値遠低於個別突變體。 -45 (43) (43)200401033 【圖式簡單說明】 圖1 .黑曲霉活性部位殘基。 圖2.黑曲霉植酸酶活性部位殘基與植酸複合的IHP -S模型樣品座標（I Η P 5 5 0 Η ) 。 t 圖3 .植酸酶生產力相對於溫度之圖。

-46 - 200401033 序歹0表 <110> DSM IP Assets B.V.

<120> 改質之植酸酶 <130> 20720WO <160> 7 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 444

<212> PRT <213> ASPERGILLUS NIGER MATURE PHYTASE <400> 1

Ala Ser Arg Asn Gin Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gin Gly Tyr Gin 15 10 15

Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ala Pro Phe Phe 20 25 30

Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val lie Ser Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys 35 40 45

Arg Val Thr Phe Ala Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro 50 55 60

Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu He Glu Glu lie Gin 65 70 75 80

Gin Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr 85 90 95

Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gin Glu 100 105 110

Leu Val Asn Ser Gly lie Lys Phe Tyr Gin Arg Tyr Glu Ser Leu Thr 115 120 125

Arg Asn lie Val Pro Phe lie Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val lie 130 135 140

Ala Ser Gly Lys Lys Phe lie Glu Gly Phe Gin Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160

Asp Pro Arg Ala Gin Pro Gly Gin Ser Ser Pro Lys lie Asp Val Val 165 170 175 lie Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys 180 185 190

Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe 195 200 205

Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser lie Arg Gin Arg Leu Glu Asn Asp Leu 210 215 220

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Tyr Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg 385 390 395 400

Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp 405 410 415 -15- 200401033

Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe 420 425 430

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 435 440

16-

Claims (1)

1. (1)200401033 拾、申請專利範圍 1 . ~ 種多肽 ，當與模型 :植酸 :酶排列時， s m /、 /〜 該模型 植酸 酶相比較係於至少 1個下列之位置 上經修 飾： 5，6 , | ] 3，1 9，2 ] ，29 : ，3 ]， 36， 39，4: 3，53 ，69， 78 - 81， 85， 87: ,99， 112, 113, 122 ，125， 126 ，128, 13 7 ，147 . 丨 1 4 8， 157， 160， 163， 165 ’16 9, 1 72 ，176' 1 78 ，180: 18]， 182, 183, 189, 194 ，1 97， 20 1 ，203， 2 11 ，2 1 3， '215- 2 18, 222， 22 3， 22 5 '232 > 23 3 ，242， 246 ，24 7 : '24 8， 249， 2 5 0， 25 1 > 25 2， '254， 269 ，29 1， 296 ，3 1 0， '3 1 2 > 3 15, 3 22， 3 3 0， 3 42 ^ _ 346， 3 62 ，3 6 5， 3 67 ，3 6 8 : '3 72， 3 74， 3 75， 3 8 2, 3 84 : ，3 95， 4 14 ，4 1 7， 425 ，42 8， 4 3 8， 440。 2.如 申請專 利範圍第1 項5 L多肽 ’其包 含至 少一個 下歹lj 之修飾： 5QS ，6SH ，1 3 G ，1 9P 1 > 2 11， 29S ， 3 1 Y ， 3 6D ，

   39A > 43D ， 53V ， 69S ， 78EA， 81K， 85A ， 87K ，99T 1 1 2Q ，1 1 3Μ ，1 2 2 R， 125K， 1 26A ，128 A > 1 3 7 A 1 47 A ’ 148Ε ， 1 57A， 1 60 A， 1 63RG ，165N ， 1 69A 1 72V ，1761, 178Ρ ， 1 80AG， 1 8 1 A ， 182STG ， 1 83 Y 1 89H ，194VA ，197E ， 20 1 G， 2 03 D ，211TL ， 2 1 3 A 2 1 5 S A ，2 1 8 A ，222 A _ ，223 H ，22 5 P ，232E ， 23 3 D 242SP ，246V ，247 A ， 248R ，249T ，250S ， 25 1 D 2 52 A ’ 254KE ，269NQ ，29 1 A ，296F ，310Q ， 3 1 2H 3 1 5T， 3 22N， 330A ， 342M ， 346F ， 362S ， 365S ， 3 6 7E

   -47- (2) (2)200401033 3 6 8E，3 72Y，3 74A，3 7 5S，3 8 2 A，3 84A，3 9 5 K， 414PA， 417K， 425D， 428RKE > 438N > 440AE。 3.如申請專利範圍第1項之多肽，其包含至少一個 下列之修飾： 5 QS，6SH，1 3 G，19P，21I，2 95，3 1 Y，36D， 3 9A ， 43D ， 53V ， 69S ， 78A ， 8]K， 85Α， 87Κ， 99Τ ， 1 12Q, 1 1 3Μ， 1 22R， 125K， 1 26 A， 1 2 8 A ，1 3 7 A， 147A， 148Ε， 1 5 7 A， 1 60 A > 1 63 G ，1 65N ，1 69 A ，172 V ，1761， 1 7 8Ρ， 1 8 0G， 1 8 1 A ，1 82G : '1 8 3 Y - 1 8 9H ，1 94 A ’ 1 97E， 20 1 G ，2 03 D ，2 11 L， 213A， 215A， 2 1 8 A ， 22 2 A， 223 Η， 22 5 P， 2 3 2E ，233D. 242P - 246 V ，247A ， 24 8R - 249Τ， 2 5 0 S， 2 5 1 D ’ 252A ， ，254E ， 269Q ，2 9 1 A， 296F， 3 1 0Q， 3 1 2H > 3 1 5T ，322N ' ’ 330A : '3 42M ，346F ， 3 6 2S， 3 6 5 S， 3 6 7 E， 3 6 8 E ’ '372Y > 3 74A， 3 75 S ，382A ， 3 84A， 3 9 5 Κ， 4 1 4 A， 4 1 7K ，425D ，428E ， 43 8N ，4 4 0 E ° 4. 一種多肽，當與模型植酸酶排列時，其與該模型 植酸酶相比較係於至少1個下列之位置上經修飾： 3 1-78' 163，180，1 82，194，211，215，242， 254， 269， 414， 428， 440° 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多肽，其 中該模型植酸酶包含下述之胺基酸： Q 2 7，Υ 2 8 > R58，Η 5 9，R62，Ρ64，Τ65，S 6 7， Κ68 ， Υ72 ， D103 ， S140 ， R142 ， V143 ， Ε179 ， D188 ， F243 ， ΚΝ277 ， Κ278 ’ Η282 ， S337 ， Η338 , D339 > -48- (3) 200401033 N3 4 0，F 3 8 0，A35，A46，N130，S14 1，G167，Q168， D174，ΤΙ 91，E]99，E2 0 5，L22 0 > T2 3 5，D244 > 126 8， H3 0 6，G341，K3 5 6，A3 81。 6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多肽，其 中該模型植酸酶包含下述之胺基酸：

   Q27，Y28，R58，H59，G60，R62，Y63，P64， T65 ，DE66，S67，K68，K71 ，Y72，D1 03，S 1 40， R142，V143，E179，D]88，El 96 > D2 3 9，F243，G2 74， KN2 77，K2 78，H2 82， S 3 3 7，H 3 3 8，D 3 3 9，N3 40， G341，V3 7 8，F 3 8 0，A3 5，A46，N130，S14 1，G167， Q168 ， D174 > T191 ， E199 > E205 ， L220 ， T235 ， D244 ， 12 6 8，H3 06，G341，K3 5 6，A3 81。 7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多肽，其 中該多肽含有至少一個下列之突變： 3 1 Y，7 8 A，163G，180G，，182G,，1 94 A > 21 1 L，

   215 A ' 242P，254E，269Q，414A > 428E，440E。 8. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多肽，其 中該模型植酸酶具有SEQ ID NO : 1之胺基酸序列。 9. 如申請專利範圍第1項之多肽，其爲 SEQ ID NO ： 3 ' SEQ ID NO : 5 或 SEQ IN NO : 7。 1 0 .—種多肽，其與申請專利範圍第9項之多肽具有 至少9 1 %，較佳者至少9 2 %，更佳者至少9 3 %，更佳者 至少94%，更佳者至少95%，更佳者至少96%，更佳者 至少9 7 %，更佳者至少9 8 %或最佳者至少9 9 %之序列同 -49- (4) (4)200401033 質性（相同性）。 11. 一種多核苷酸，其包含編碼申請專利範圍第1至 1 0項中任一項之多肽之多核苷酸序列。 1.2.如申請專利範圍第11項之多核苷酸，其爲 DNA。 13.如申請專利範圍第11項之多核苷酸，其包含 SEQ ID NO ： 2、SEQ ID NO : 4 或 SEQ ID NO : 6。 1 4 . 一種載體，其包含申請專利範圍第1 1至1 3項中 任一項之多核苷酸序列。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之載體，其爲表現載 體，諸如其中編碼多肽之多核苷酸序列係操作性連接至調 控序列。 16. 一種宿主細胞，其係表現作爲異源性蛋白質之申 請專利範圍第1至1 0項中任一項之多肽。 17. 一種宿主細胞，其係經申請專利範圍第1 1至1 3 項中任一項之多核苷酸或申請專利範圍第1 4或1 5項之載 體轉形。 1 8 . —種製造申請專利範圍第1至1 0項中任一項之 多肽之方法，該方法包含在表現該多肽之條件下培養申請 專利範圍第1 6或1 7項之宿主細胞。 1 9 . 一種組成物，其包含申請專利範圍第1至1 0項 中任一項之多肽。 -50-