JPH0856676A - 耐熱性フィターゼ - Google Patents
耐熱性フィターゼInfo
- Publication number
- JPH0856676A JPH0856676A JP7101413A JP10141395A JPH0856676A JP H0856676 A JPH0856676 A JP H0856676A JP 7101413 A JP7101413 A JP 7101413A JP 10141395 A JP10141395 A JP 10141395A JP H0856676 A JPH0856676 A JP H0856676A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna sequence
- dna
- polypeptide
- aspergillus
- phytase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、フィターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする特定の真菌由来のＤＮＡ配列、該ＤＮ
Ａ配列によりコードされるポリペプチド、該ＤＮＡ配列
を含有するベクター、該ＤＮＡ配列または該ベクターに
より形質転換された細菌、真菌または酵母宿主、かかる
形質転換宿主を培養することによる該ポリペプチドの生
産方法、ならびに１種以上の該ポリペプチドを含有する
複合飼料を提供する。 【効果】 改良された耐熱性、基質特異性およびｐＨプ
ロフィールを有するフィターゼ活性を有するポリペプチ
ドが大量に得られる。
チドをコードする特定の真菌由来のＤＮＡ配列、該ＤＮ
Ａ配列によりコードされるポリペプチド、該ＤＮＡ配列
を含有するベクター、該ＤＮＡ配列または該ベクターに
より形質転換された細菌、真菌または酵母宿主、かかる
形質転換宿主を培養することによる該ポリペプチドの生
産方法、ならびに１種以上の該ポリペプチドを含有する
複合飼料を提供する。 【効果】 改良された耐熱性、基質特異性およびｐＨプ
ロフィールを有するフィターゼ活性を有するポリペプチ
ドが大量に得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フィターゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする特定の真菌由来のＤＮＡ配
列、該ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド、該
ＤＮＡ配列を含有するベクター、該ＤＮＡ配列または該
ベクターにより形質転換された細菌、真菌または酵母宿
主、かかる形質転換宿主を培養することによる該ポリペ
プチドの生産方法、ならびに１種以上の該ポリペプチド
を含有する複合飼料に関するものである。
るポリペプチドをコードする特定の真菌由来のＤＮＡ配
列、該ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド、該
ＤＮＡ配列を含有するベクター、該ＤＮＡ配列または該
ベクターにより形質転換された細菌、真菌または酵母宿
主、かかる形質転換宿主を培養することによる該ポリペ
プチドの生産方法、ならびに１種以上の該ポリペプチド
を含有する複合飼料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】フィターゼ（ｍｙｏ−イノシトールヘキ
サキスリン酸ホスホヒドロラーゼ；EC3.1.3.8）はフィ
チン酸（ｍｙｏ−イノシトールヘキサキスリン酸）を加
水分解してｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸にする酵
素であり、有用な飼料の添加剤であることが知られてい
る。
サキスリン酸ホスホヒドロラーゼ；EC3.1.3.8）はフィ
チン酸（ｍｙｏ−イノシトールヘキサキスリン酸）を加
水分解してｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸にする酵
素であり、有用な飼料の添加剤であることが知られてい
る。
【０００３】フィターゼは、最初、１９０７年に米ぬか
中に存在することが記載されており〔Suzukiら, Bull.
Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907) 〕、そし
て１９１１年にはアスペルギルス種から得られている
〔Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (191
1) 〕。さらに、フィターゼは小麦のふすま、植物の種
子、動物の腸に、そして微生物にも見いだされている
〔Howsen and Davis, EnzymeMicrob. Technol. 5, 377-
382 (1983); Lambrechts ら, Biotech. Lett. 14, 61-6
6 (1992); Shieh and Ware, Appl. Microbiol. 16, 134
8-1351 (1968)〕。
中に存在することが記載されており〔Suzukiら, Bull.
Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907) 〕、そし
て１９１１年にはアスペルギルス種から得られている
〔Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (191
1) 〕。さらに、フィターゼは小麦のふすま、植物の種
子、動物の腸に、そして微生物にも見いだされている
〔Howsen and Davis, EnzymeMicrob. Technol. 5, 377-
382 (1983); Lambrechts ら, Biotech. Lett. 14, 61-6
6 (1992); Shieh and Ware, Appl. Microbiol. 16, 134
8-1351 (1968)〕。
【０００４】アスペルギルス・ニガー〔フィクウム (fi
cuum) 〕由来のフィターゼのクローニングおよび発現
は、VanHartingsveldtらによって Gene, 127, 87-94 (1
993)およびヨーロッパ特許出願公開第420 358 号に記載
されており、また、アスペルギルス・ニガーのアワモリ
変種 (Aspergillus niger var awamori)由来のフィター
ゼのクローニングおよび発現は、Piddingtonらによって
Gene 133, 55-62 (1993) に記載されている。
cuum) 〕由来のフィターゼのクローニングおよび発現
は、VanHartingsveldtらによって Gene, 127, 87-94 (1
993)およびヨーロッパ特許出願公開第420 358 号に記載
されており、また、アスペルギルス・ニガーのアワモリ
変種 (Aspergillus niger var awamori)由来のフィター
ゼのクローニングおよび発現は、Piddingtonらによって
Gene 133, 55-62 (1993) に記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】農業の分野でこれまで
用いられてきたフィターゼはいくつかの欠点を有するの
で、本発明の目的は、改良された性質を有する新規なフ
ィターゼ、もっと一般的に言えば、フィターゼ（「フィ
ターゼ活性」）を含めて、イノシトールリン酸に対して
フィターゼ活性を有するポリペプチドを大量に提供する
ことである。これまで使用されてきたフィターゼは、熱
処理のために飼料ペレット製造工程の間に活性を失うこ
とが知られていることから、改良された耐熱性がこのよ
うな性質となろう。
用いられてきたフィターゼはいくつかの欠点を有するの
で、本発明の目的は、改良された性質を有する新規なフ
ィターゼ、もっと一般的に言えば、フィターゼ（「フィ
ターゼ活性」）を含めて、イノシトールリン酸に対して
フィターゼ活性を有するポリペプチドを大量に提供する
ことである。これまで使用されてきたフィターゼは、熱
処理のために飼料ペレット製造工程の間に活性を失うこ
とが知られていることから、改良された耐熱性がこのよ
うな性質となろう。
【０００６】現在までのところ、アスペルギルス・フミ
ガツス〔Dox and Golden, J. Biol.Chem. 10, 183-186
(1911) 〕およびリゾプス・オリザ (Rhizopus oryzae)
〔Howson and Davies, Enzyme Microb. Technol. 5, 37
7-382 (1993)〕を除いて、耐熱真菌類においてフィター
ゼ類は報告されていない。耐熱性のフィターゼとして
は、アスペルギルス・テレウス9A-1株由来のもの〔最適
温度７０℃；Yamadaら,Agr. Biol. Chem. 32, 1275-128
2 (1968) 〕およびシュワニオミセス・カステリイ (Sch
wanniomyces castellii) 由来のもの〔最適温度７７
℃；Segueilha ら,Bioeng. 74, 7-11 (1992) 〕が開示
されている。ところが、農業の分野で商業的に使用する
には、こうしたフィターゼが大量に入手できなければな
らない。従って、本発明の目的は、耐熱性フィターゼを
コードするＤＮＡ配列を提供することにある。かかるＤ
ＮＡ配列によってコードされるフィターゼの改良された
耐熱性は、当技術分野で知られたアッセイを用いて、例
えば飼料のペレット製造に用いられる方法または Yamad
a ら（前掲）によって記載されるような酵素活性そのも
のの熱依存性を測定するアッセイを用いて、測定するこ
とが可能である。
ガツス〔Dox and Golden, J. Biol.Chem. 10, 183-186
(1911) 〕およびリゾプス・オリザ (Rhizopus oryzae)
〔Howson and Davies, Enzyme Microb. Technol. 5, 37
7-382 (1993)〕を除いて、耐熱真菌類においてフィター
ゼ類は報告されていない。耐熱性のフィターゼとして
は、アスペルギルス・テレウス9A-1株由来のもの〔最適
温度７０℃；Yamadaら,Agr. Biol. Chem. 32, 1275-128
2 (1968) 〕およびシュワニオミセス・カステリイ (Sch
wanniomyces castellii) 由来のもの〔最適温度７７
℃；Segueilha ら,Bioeng. 74, 7-11 (1992) 〕が開示
されている。ところが、農業の分野で商業的に使用する
には、こうしたフィターゼが大量に入手できなければな
らない。従って、本発明の目的は、耐熱性フィターゼを
コードするＤＮＡ配列を提供することにある。かかるＤ
ＮＡ配列によってコードされるフィターゼの改良された
耐熱性は、当技術分野で知られたアッセイを用いて、例
えば飼料のペレット製造に用いられる方法または Yamad
a ら（前掲）によって記載されるような酵素活性そのも
のの熱依存性を測定するアッセイを用いて、測定するこ
とが可能である。
【０００７】さらに、本発明の目的は、フィターゼ産生
においてある程度の耐熱性を示す真菌をスクリーニング
することである。こうしたスクリーニングは、例えば実
施例１に記載するごとく行うことができる。この方法
で、フィターゼを産生する耐熱真菌株（実施例１に挙げ
たもの）が初めて同定された。耐熱真菌株（例えば、実
施例１に挙げたものを参照）は、当技術分野で知られて
いるように、例えば、こうした菌株を入手することので
きる American TissueType Culture Collection (ATCC)
、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellku
lturen GmbH (DSM) 、Agricultural Research Service
Culture Collection (NRRL) および Centralbureau voo
r Schimmelcultures (CBS)などの寄託当局によって指定
されたとおりに、あるいは、例えば実施例２に記載する
ように、その後生育させることができる。
においてある程度の耐熱性を示す真菌をスクリーニング
することである。こうしたスクリーニングは、例えば実
施例１に記載するごとく行うことができる。この方法
で、フィターゼを産生する耐熱真菌株（実施例１に挙げ
たもの）が初めて同定された。耐熱真菌株（例えば、実
施例１に挙げたものを参照）は、当技術分野で知られて
いるように、例えば、こうした菌株を入手することので
きる American TissueType Culture Collection (ATCC)
、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellku
lturen GmbH (DSM) 、Agricultural Research Service
Culture Collection (NRRL) および Centralbureau voo
r Schimmelcultures (CBS)などの寄託当局によって指定
されたとおりに、あるいは、例えば実施例２に記載する
ように、その後生育させることができる。
【０００８】さらに改良された性質としては、例えば植
物や種子におけるリンの主要貯蔵物質であるフィチン酸
〔ｍｙｏ−イノシトール（1,2,3,4,5,6,）ヘキサキスリ
ン酸〕に対する改良された基質特異性が挙げられる。フ
ィチン酸から６個のリン酸基を完全に放出させるために
は、フィチン酸および他のすべてのイノシトールリン酸
分子に対して十分な活性を有する酵素が必要である。例
えば、アスペルギルス・ニガーのフィターゼを用いる場
合には、リン酸基を完全に放出させるために、ｐＨ２．
５の酸性ホスファターゼを添加する必要がある。必要な
活性を有する、たった１種類の酵素があれば、明らかに
有利であるだろう。例えば、国際特許出願公開第94/030
72号は、フィチン酸分解酵素の混合物を所望の比率で発
現させる発現系を開示している。しかし、単一のポリペ
プチドがこのような両酵素の活性を示すことがより一層
望ましいだろう。かくして、本発明の目的は、さらに、
こうしたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供す
ることにある。フィターゼおよびホスファターゼ活性
は、当技術分野で知られたアッセイにより、または実施
例９に記載するように測定することが可能である。
物や種子におけるリンの主要貯蔵物質であるフィチン酸
〔ｍｙｏ−イノシトール（1,2,3,4,5,6,）ヘキサキスリ
ン酸〕に対する改良された基質特異性が挙げられる。フ
ィチン酸から６個のリン酸基を完全に放出させるために
は、フィチン酸および他のすべてのイノシトールリン酸
分子に対して十分な活性を有する酵素が必要である。例
えば、アスペルギルス・ニガーのフィターゼを用いる場
合には、リン酸基を完全に放出させるために、ｐＨ２．
５の酸性ホスファターゼを添加する必要がある。必要な
活性を有する、たった１種類の酵素があれば、明らかに
有利であるだろう。例えば、国際特許出願公開第94/030
72号は、フィチン酸分解酵素の混合物を所望の比率で発
現させる発現系を開示している。しかし、単一のポリペ
プチドがこのような両酵素の活性を示すことがより一層
望ましいだろう。かくして、本発明の目的は、さらに、
こうしたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供す
ることにある。フィターゼおよびホスファターゼ活性
は、当技術分野で知られたアッセイにより、または実施
例９に記載するように測定することが可能である。
【０００９】別の改良された性質としては、例えば、い
わゆる改良されたｐＨプロフィールが挙げられる。これ
は、例えば、２つの最大フィチン酸分解活性を指す。例
えば、１つの最大フィチン酸分解活性は動物の胃の中の
ｐＨでありうる約ｐＨ２．５にあり、もう１つは動物の
胃以後のｐＨでありうる約ｐＨ５．５にある。このよう
なｐＨプロフィールは当技術分野で知られたアッセイに
より、または実施例９に記載するごとく測定することが
可能である。従って、本発明の目的は、さらに、このよ
うな改良されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
提供することである。
わゆる改良されたｐＨプロフィールが挙げられる。これ
は、例えば、２つの最大フィチン酸分解活性を指す。例
えば、１つの最大フィチン酸分解活性は動物の胃の中の
ｐＨでありうる約ｐＨ２．５にあり、もう１つは動物の
胃以後のｐＨでありうる約ｐＨ５．５にある。このよう
なｐＨプロフィールは当技術分野で知られたアッセイに
より、または実施例９に記載するごとく測定することが
可能である。従って、本発明の目的は、さらに、このよ
うな改良されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】一般的に、本発明は、ア
クロフィアロホラ・レービス、アスペルギルス・テレウ
ス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニ
ードランス、アスペルギルス・ソヤ、カルカリスポリエ
ラ・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コ
リナスクス・サーモフィルス、フミコラ sp.、ミセリア
・ステリリア、ミロコッカム・サーモフィルム、ミセリ
オフトラ・サーモフィラ、リゾムコール・ミエヘイ、ス
ポロトリクム・セルロフィルム、スポロトリクム・サー
モフィレ、スキタリジウム・インドネシクムおよびタラ
ロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる真菌
に由来する、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列、またはフィターゼ活性をなおも有
する該ポリペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列、ま
たは、特に、真菌がアクロフィアロホラ・レービス、ア
スペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードラ
ンス、アスペルギルス・テレウス、カルカリスポリエラ
・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コリ
ナスクス・サーモフィルス、スポロトリクム・セルロフ
ィルム、スポロトリクム・サーモフィレ、ミセリア・ス
テリリア、ミセリオフトラ・サーモフィラおよびタラロ
ミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる上記の
ＤＮＡ配列、または、中でも、真菌がアスペルギルス・
テレウス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、アスペルギ
ルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードランスおよ
びタラロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれ
る上記のＤＮＡ配列を提供するものである。本発明のポ
リペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列は、ヌクレオ
チドの長さが、例えば１３５０と９００の間、好ましく
は９００と４５０の間、最も好ましくは４５０と１５０
の間であり得、完全なポリペプチドのＤＮＡ配列に基づ
いて当業者によく知られた組換え法または化学合成法に
よって作製することができる。
クロフィアロホラ・レービス、アスペルギルス・テレウ
ス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニ
ードランス、アスペルギルス・ソヤ、カルカリスポリエ
ラ・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コ
リナスクス・サーモフィルス、フミコラ sp.、ミセリア
・ステリリア、ミロコッカム・サーモフィルム、ミセリ
オフトラ・サーモフィラ、リゾムコール・ミエヘイ、ス
ポロトリクム・セルロフィルム、スポロトリクム・サー
モフィレ、スキタリジウム・インドネシクムおよびタラ
ロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる真菌
に由来する、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列、またはフィターゼ活性をなおも有
する該ポリペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列、ま
たは、特に、真菌がアクロフィアロホラ・レービス、ア
スペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードラ
ンス、アスペルギルス・テレウス、カルカリスポリエラ
・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コリ
ナスクス・サーモフィルス、スポロトリクム・セルロフ
ィルム、スポロトリクム・サーモフィレ、ミセリア・ス
テリリア、ミセリオフトラ・サーモフィラおよびタラロ
ミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる上記の
ＤＮＡ配列、または、中でも、真菌がアスペルギルス・
テレウス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、アスペルギ
ルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードランスおよ
びタラロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれ
る上記のＤＮＡ配列を提供するものである。本発明のポ
リペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列は、ヌクレオ
チドの長さが、例えば１３５０と９００の間、好ましく
は９００と４５０の間、最も好ましくは４５０と１５０
の間であり得、完全なポリペプチドのＤＮＡ配列に基づ
いて当業者によく知られた組換え法または化学合成法に
よって作製することができる。
【００１１】さらに、本発明は、次のＤＮＡ配列： (a) 図１および２のＤＮＡ配列またはその相補鎖、(b)
標準条件下で(a) に規定した配列と、好ましくは該配列
のコーディング領域と、より好ましくは該ＤＮＡ配列の
４９１−１８５６位の領域と、より一層好ましくは実施
例１２に記載するようなアスペルギルス・テレウス 9A1
のＤＮＡを用いるランダムプライミングにより得られた
ゲノムプローブとハイブリダイズするＤＮＡ配列、(c)
遺伝暗号の縮重のため(a) または(b) の配列とハイブリ
ダイズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコードさ
れるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列、および(d) (a) 、
(b) または(c) に規定したＤＮＡ配列の断片であるＤＮ
Ａ配列、より成る群から選ばれる、フィターゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供するも
のである。
標準条件下で(a) に規定した配列と、好ましくは該配列
のコーディング領域と、より好ましくは該ＤＮＡ配列の
４９１−１８５６位の領域と、より一層好ましくは実施
例１２に記載するようなアスペルギルス・テレウス 9A1
のＤＮＡを用いるランダムプライミングにより得られた
ゲノムプローブとハイブリダイズするＤＮＡ配列、(c)
遺伝暗号の縮重のため(a) または(b) の配列とハイブリ
ダイズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコードさ
れるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列、および(d) (a) 、
(b) または(c) に規定したＤＮＡ配列の断片であるＤＮ
Ａ配列、より成る群から選ばれる、フィターゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供するも
のである。
【００１２】ハイブリダイゼーションのための「標準条
件」とは、本明細書中では、特定のハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを検出するために当業者が一般的に用いて
いる条件であって、例えば Sambrook ら, “Molecular
Cloning ”第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess 1989, New Yorkに記載される条件、好ましくは、い
わゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
と非ストリンジェントな洗浄条件、より好ましくは、当
業者によく知られた、例えば Sambrook ら（前掲）に記
載されるような、いわゆるストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件、よ
り一層好ましくは、実施例１２に示すようなストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件と非ストリンジェ
ントまたはストリンジェントな洗浄条件を意味する。本
明細書中で用いる「ＤＮＡ配列の断片」とは、上述した
フィターゼ活性をなおも有するポリペプチドをコードす
る断片のことである。
件」とは、本明細書中では、特定のハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを検出するために当業者が一般的に用いて
いる条件であって、例えば Sambrook ら, “Molecular
Cloning ”第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess 1989, New Yorkに記載される条件、好ましくは、い
わゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
と非ストリンジェントな洗浄条件、より好ましくは、当
業者によく知られた、例えば Sambrook ら（前掲）に記
載されるような、いわゆるストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件、よ
り一層好ましくは、実施例１２に示すようなストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件と非ストリンジェ
ントまたはストリンジェントな洗浄条件を意味する。本
明細書中で用いる「ＤＮＡ配列の断片」とは、上述した
フィターゼ活性をなおも有するポリペプチドをコードす
る断片のことである。
【００１３】本発明は、さらに、次のＤＮＡ配列： (a) 図３および４のＤＮＡ配列またはその相補鎖、(b)
標準条件下で(a) に規定した配列と、好ましくは該ＤＮ
Ａ配列の５’末端の約１００〜１５０ヌクレオチドの非
コーディング領域を含んでいてもよい少なくとも約８０
％のコーディング領域にわたる領域と、より好ましくは
該ＤＮＡ配列の２０６８−３４７８位の領域と、より一
層好ましくは実施例１２に記載するようなミセリオフト
ラ・サーモフィラのＤＮＡを用いるランダムプライミン
グにより得られたゲノミックプローブとハイブリダイズ
するＤＮＡ配列、(c) 遺伝暗号の縮重のため(a) または
(b) の配列とハイブリダイズしないが、これらのＤＮＡ
配列によってコードされるポリペプチドと正確に同じア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定したＤＮＡ
配列の断片であるＤＮＡ配列、より成る群から選ばれ
る、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を提供するものである。
標準条件下で(a) に規定した配列と、好ましくは該ＤＮ
Ａ配列の５’末端の約１００〜１５０ヌクレオチドの非
コーディング領域を含んでいてもよい少なくとも約８０
％のコーディング領域にわたる領域と、より好ましくは
該ＤＮＡ配列の２０６８−３４７８位の領域と、より一
層好ましくは実施例１２に記載するようなミセリオフト
ラ・サーモフィラのＤＮＡを用いるランダムプライミン
グにより得られたゲノミックプローブとハイブリダイズ
するＤＮＡ配列、(c) 遺伝暗号の縮重のため(a) または
(b) の配列とハイブリダイズしないが、これらのＤＮＡ
配列によってコードされるポリペプチドと正確に同じア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定したＤＮＡ
配列の断片であるＤＮＡ配列、より成る群から選ばれ
る、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を提供するものである。
【００１４】「断片」および「標準条件」は上記の意味
を有する。また、本発明は、次のＤＮＡ配列： (a) 図６、図７、図８および図１４（“aterr21 ”；
“aterr58 ”）のＤＮＡ配列のうちの１つを含むＤＮＡ
配列またはその相補鎖、(b) 標準条件下で(a) に規定し
た配列と、好ましくはタラロミセス・サーモフィルスか
ら単離可能な図６の、またはアスペルギルス・フミガツ
スから単離可能な図７の、またはアスペルギルス・ニー
ドランスから単離可能な図８の、またはアスペルギルス
・テレウス (CBS 220.95) から単離可能な図１４（“at
err21 ”；“aterr58 ”）に示した配列の一方または両
方の、ＤＮＡ配列を含む該配列と、より好ましくは少な
くとも８０％のコーディング領域にわたる該ＤＮＡ配列
の領域と、最も好ましくは実施例１２に記載するような
タラロミセス・サーモフィルス、アスペルギルス・フミ
ガツス、アスペルギルス・ニードランスまたはアスペル
ギルス・テレウス (CBS 220.95) のＤＮＡを用いるラン
ダムプライミングにより得られたゲノムプローブとハイ
ブリダイズするＤＮＡ配列、(c) 遺伝暗号の縮重のため
(a) または(b) の配列とハイブリダイズしないが、これ
らのＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドと正
確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定
したＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列、より成る群か
ら選ばれる、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を提供するものである。
を有する。また、本発明は、次のＤＮＡ配列： (a) 図６、図７、図８および図１４（“aterr21 ”；
“aterr58 ”）のＤＮＡ配列のうちの１つを含むＤＮＡ
配列またはその相補鎖、(b) 標準条件下で(a) に規定し
た配列と、好ましくはタラロミセス・サーモフィルスか
ら単離可能な図６の、またはアスペルギルス・フミガツ
スから単離可能な図７の、またはアスペルギルス・ニー
ドランスから単離可能な図８の、またはアスペルギルス
・テレウス (CBS 220.95) から単離可能な図１４（“at
err21 ”；“aterr58 ”）に示した配列の一方または両
方の、ＤＮＡ配列を含む該配列と、より好ましくは少な
くとも８０％のコーディング領域にわたる該ＤＮＡ配列
の領域と、最も好ましくは実施例１２に記載するような
タラロミセス・サーモフィルス、アスペルギルス・フミ
ガツス、アスペルギルス・ニードランスまたはアスペル
ギルス・テレウス (CBS 220.95) のＤＮＡを用いるラン
ダムプライミングにより得られたゲノムプローブとハイ
ブリダイズするＤＮＡ配列、(c) 遺伝暗号の縮重のため
(a) または(b) の配列とハイブリダイズしないが、これ
らのＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドと正
確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定
したＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列、より成る群か
ら選ばれる、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を提供するものである。
【００１５】さらに、本発明は、タラロミセス・サーモ
フィルスから単離可能な図６の、アスペルギルス・フミ
ガツスから単離可能な図７の、アスペルギルス・ニード
ランスから単離可能な図８の、またはアスペルギルス・
テレウス (CBS 220.95) から単離可能な図１４（“ater
r21 ”；“aterr58 ”）のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列
より成る群から選ばれる、フィターゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはその縮重変異
体もしくは均等物を提供するものである。
フィルスから単離可能な図６の、アスペルギルス・フミ
ガツスから単離可能な図７の、アスペルギルス・ニード
ランスから単離可能な図８の、またはアスペルギルス・
テレウス (CBS 220.95) から単離可能な図１４（“ater
r21 ”；“aterr58 ”）のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列
より成る群から選ばれる、フィターゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはその縮重変異
体もしくは均等物を提供するものである。
【００１６】「断片」および「標準条件」は上記の意味
を有する。「縮重変異体」とは、本明細書中では、遺伝
暗号の縮重のため、記載した配列と異なるヌクレオチド
配列を有するが、同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードしているＤＮＡ配列を指す。「均等物」と
は、本明細書中では、１個以上のアミノ酸、好ましくは
５０個まで、より好ましくは２０個まで、より一層好ま
しくは１０個まで、最も好ましくは５、４、３または２
個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加のため
に、ＤＮＡ配列（均等な配列の元になる配列）によって
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミ
ノ酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を言う。一般に特異的活性
を変えることのないアミノ酸置換は当技術分野で知られ
ており、例えば、H. NeurathおよびR.L. Hill,“The Pr
oteins”(Academic Press, New York, 1979 、特に図
６、14頁を参照) に記載されている。最も普通に行われ
る交換は Ala/Ser、Val/Ile 、Asp/Glu 、Thr/Ser 、Al
a/Gly 、Ala/Thr 、Ser/Asn 、Ala/Val 、Ser/Gly 、Ty
r/Phe 、Ala/Pro 、Lys/Arg 、Asp/Asn 、Leu/Ile 、Le
u/Val 、Ala/Glu 、Asp/Gly およびこれらの逆の交換で
ある（アミノ酸のために、当分野で公知の標準的な三文
字表記を用いる）。
を有する。「縮重変異体」とは、本明細書中では、遺伝
暗号の縮重のため、記載した配列と異なるヌクレオチド
配列を有するが、同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードしているＤＮＡ配列を指す。「均等物」と
は、本明細書中では、１個以上のアミノ酸、好ましくは
５０個まで、より好ましくは２０個まで、より一層好ま
しくは１０個まで、最も好ましくは５、４、３または２
個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加のため
に、ＤＮＡ配列（均等な配列の元になる配列）によって
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミ
ノ酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を言う。一般に特異的活性
を変えることのないアミノ酸置換は当技術分野で知られ
ており、例えば、H. NeurathおよびR.L. Hill,“The Pr
oteins”(Academic Press, New York, 1979 、特に図
６、14頁を参照) に記載されている。最も普通に行われ
る交換は Ala/Ser、Val/Ile 、Asp/Glu 、Thr/Ser 、Al
a/Gly 、Ala/Thr 、Ser/Asn 、Ala/Val 、Ser/Gly 、Ty
r/Phe 、Ala/Pro 、Lys/Arg 、Asp/Asn 、Leu/Ile 、Le
u/Val 、Ala/Glu 、Asp/Gly およびこれらの逆の交換で
ある（アミノ酸のために、当分野で公知の標準的な三文
字表記を用いる）。
【００１７】こうした均等物は、当技術分野で公知の方
法、例えば Sambrook ら（前掲）に記載されている方法
により作ることができる。均等な配列によってコードさ
れるポリペプチドがなおもフィターゼ活性を有するかど
うかは、当技術分野で知られたアッセイの１つ、例えば
実施例９に記載する活性試験を用いて調べることができ
る。
法、例えば Sambrook ら（前掲）に記載されている方法
により作ることができる。均等な配列によってコードさ
れるポリペプチドがなおもフィターゼ活性を有するかど
うかは、当技術分野で知られたアッセイの１つ、例えば
実施例９に記載する活性試験を用いて調べることができ
る。
【００１８】本発明は、また、真菌、特に上記した特定
の真菌群の１つから選ばれる真菌に由来する、フィター
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記ＤＮＡ配
列の１つを提供するものである。さらに、本発明は、上
記した真菌群の１つの真菌から単離されたＤＮＡおよび
次のＰＣＲプライマー対：センスプライマーとしての “ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA” および アンチセンスプライマーとしての “TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA” を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条件下
でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を提供するものである。
の真菌群の１つから選ばれる真菌に由来する、フィター
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記ＤＮＡ配
列の１つを提供するものである。さらに、本発明は、上
記した真菌群の１つの真菌から単離されたＤＮＡおよび
次のＰＣＲプライマー対：センスプライマーとしての “ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA” および アンチセンスプライマーとしての “TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA” を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条件下
でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を提供するものである。
【００１９】「標準条件」は上記の意味を有する。「Ｐ
ＣＲ反応の産物」は、好ましくは実施例１１に関係する
実施例１２に記載される反応によって得ることができる
産物、より好ましくは該反応によって得られた産物を意
味する。本発明は、さらに、アスペルギルス・テレウス
(CBS 220.95) から単離されたＤＮＡおよび次の２つの
ＰＣＲプライマー対： (a) センスプライマーとしての “ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA” および アンチセンスプライマーとしての “TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”、な
らびに (b) センスプライマーとしての “TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA” およ
び アンチセンスプライマーとしての “CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C ” を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条件下
でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を提供するものである。
ＣＲ反応の産物」は、好ましくは実施例１１に関係する
実施例１２に記載される反応によって得ることができる
産物、より好ましくは該反応によって得られた産物を意
味する。本発明は、さらに、アスペルギルス・テレウス
(CBS 220.95) から単離されたＤＮＡおよび次の２つの
ＰＣＲプライマー対： (a) センスプライマーとしての “ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA” および アンチセンスプライマーとしての “TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”、な
らびに (b) センスプライマーとしての “TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA” およ
び アンチセンスプライマーとしての “CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C ” を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条件下
でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を提供するものである。
【００２０】「標準条件」は先に定義したとおりであ
り、「ＰＣＲ反応の産物」という用語は、好ましくは実
施例１１に記載される反応によって得ることができる産
物、より好ましくは該反応によって得られた産物を意味
する。本発明は、また、先に規定したＤＮＡ配列の断片
を含有する、フィターゼ活性を有するキメラ構築物をコ
ードするＤＮＡ配列、好ましくはキメラ構築物がアスペ
ルギルス・ニガーフィターゼの断片をそのＮ末端でアス
ペルギルス・テレウスフィターゼの断片のＣ末端に融合
させたものからなる該ＤＮＡ配列、より好ましくは図
９、１０および１１に示した特定のヌクレオチド配列を
有する該ＤＮＡ配列およびその縮重変異体または均等物
（ここで、「縮重変異体」および「均等物」は上記の意
味を有する）を提供するものである。
り、「ＰＣＲ反応の産物」という用語は、好ましくは実
施例１１に記載される反応によって得ることができる産
物、より好ましくは該反応によって得られた産物を意味
する。本発明は、また、先に規定したＤＮＡ配列の断片
を含有する、フィターゼ活性を有するキメラ構築物をコ
ードするＤＮＡ配列、好ましくはキメラ構築物がアスペ
ルギルス・ニガーフィターゼの断片をそのＮ末端でアス
ペルギルス・テレウスフィターゼの断片のＣ末端に融合
させたものからなる該ＤＮＡ配列、より好ましくは図
９、１０および１１に示した特定のヌクレオチド配列を
有する該ＤＮＡ配列およびその縮重変異体または均等物
（ここで、「縮重変異体」および「均等物」は上記の意
味を有する）を提供するものである。
【００２１】さらに、本発明は、コードされるポリペプ
チドがフィターゼである、先に規定したＤＮＡ配列を提
供するものである。真菌株由来のゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡは、当技術分野で公知の方法により〔例えば、Ye
ltonら, Procd. Natl. Acad. Sci. USA, 1470-1474 (19
84) またはSambrook ら, 前掲を参照〕、または、特に
実施例２に記載するごとく調製することができる。
チドがフィターゼである、先に規定したＤＮＡ配列を提
供するものである。真菌株由来のゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡは、当技術分野で公知の方法により〔例えば、Ye
ltonら, Procd. Natl. Acad. Sci. USA, 1470-1474 (19
84) またはSambrook ら, 前掲を参照〕、または、特に
実施例２に記載するごとく調製することができる。
【００２２】かかるゲノムＤＮＡからの本発明のＤＮＡ
配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことができる。この方法
の原理は、例えば Whiteら (1989) に概説されている
が、その改良法が例えば Innisら〔PCR Protocols: A g
uide to Methods and Applications, Academic Press社
(1990) 〕によって記載されている。ＰＣＲは異なるＤ
ＮＡ配列の混合物から明確に定められた長さおよび配列
の特定のＤＮＡを大量に生産するためのin vitro法であ
る。こうして、ＰＣＲは、２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマー（該配列に特異的で、標的配列の反対の鎖にハ
イブリダイズする）によって挟まれる特定のＤＮＡ断片
の酵素的増幅に基づいている。プライマーはそれらの
３’末端が互いの方に向くように位置づけられる。鋳型
の熱変性、相補配列へのプライマーのアニーリング、お
よびアニールしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長からなる反復サイクルが、ＰＣＲプライマー間の
セグメントの増幅をもたらす。各プライマーの伸長産物
は他方の鋳型として役立ち、各サイクルは本質的に前の
サイクルで生産されたＤＮＡ断片の量を２倍にする。好
熱性バクテリアのテルムス・アクアチクス(Thermus aqu
aticus) から単離された熱安定性のTaq DNA ポリメラー
ゼを利用することによって、それぞれの熱変性段階の後
に酵素の添加を必要としたポリメラーゼの変性を回避で
きるようになった。この進展により、各種の簡便な温度
循環装置によるＰＣＲの自動化が可能となった。さら
に、プライマーのアニーリングおよび伸長に比較的高い
温度を使用できるため、増幅反応の特異性も高まる。高
められた特異性は、酵素およびプライマーに対する非標
的断片による競合を最小限に抑えて、増幅産物の総収量
を引き上げる。対象の特定配列がこの方法で高度に増幅
されると、当技術分野で知られた方法（例えば、アガロ
ースゲルでの分離）により非特定配列から簡単に分離し
て、例えば Holten および Graham, Nucleic Acid Res.
19, 1156 (1991)、Kovalic ら, Nucleic Acid Res. 1
9, 4560 (1991) 、Marchuk ら, Nucleic Acid Res. 19,
1154 (1991) または Mead ら, Bio/Technology 9, 657
-663 (1991)に記載されるようなベクターを使って当技
術分野で知られた方法によりクローニングすることがで
きる。
配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことができる。この方法
の原理は、例えば Whiteら (1989) に概説されている
が、その改良法が例えば Innisら〔PCR Protocols: A g
uide to Methods and Applications, Academic Press社
(1990) 〕によって記載されている。ＰＣＲは異なるＤ
ＮＡ配列の混合物から明確に定められた長さおよび配列
の特定のＤＮＡを大量に生産するためのin vitro法であ
る。こうして、ＰＣＲは、２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマー（該配列に特異的で、標的配列の反対の鎖にハ
イブリダイズする）によって挟まれる特定のＤＮＡ断片
の酵素的増幅に基づいている。プライマーはそれらの
３’末端が互いの方に向くように位置づけられる。鋳型
の熱変性、相補配列へのプライマーのアニーリング、お
よびアニールしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長からなる反復サイクルが、ＰＣＲプライマー間の
セグメントの増幅をもたらす。各プライマーの伸長産物
は他方の鋳型として役立ち、各サイクルは本質的に前の
サイクルで生産されたＤＮＡ断片の量を２倍にする。好
熱性バクテリアのテルムス・アクアチクス(Thermus aqu
aticus) から単離された熱安定性のTaq DNA ポリメラー
ゼを利用することによって、それぞれの熱変性段階の後
に酵素の添加を必要としたポリメラーゼの変性を回避で
きるようになった。この進展により、各種の簡便な温度
循環装置によるＰＣＲの自動化が可能となった。さら
に、プライマーのアニーリングおよび伸長に比較的高い
温度を使用できるため、増幅反応の特異性も高まる。高
められた特異性は、酵素およびプライマーに対する非標
的断片による競合を最小限に抑えて、増幅産物の総収量
を引き上げる。対象の特定配列がこの方法で高度に増幅
されると、当技術分野で知られた方法（例えば、アガロ
ースゲルでの分離）により非特定配列から簡単に分離し
て、例えば Holten および Graham, Nucleic Acid Res.
19, 1156 (1991)、Kovalic ら, Nucleic Acid Res. 1
9, 4560 (1991) 、Marchuk ら, Nucleic Acid Res. 19,
1154 (1991) または Mead ら, Bio/Technology 9, 657
-663 (1991)に記載されるようなベクターを使って当技
術分野で知られた方法によりクローニングすることがで
きる。
【００２３】ＰＣＲ法で用いるオリゴヌクレオチドプラ
イマーは当技術分野で知られた方法により、例えば Sam
brook ら (1989, “Molecular cloning ”第２版，Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r ）に記載されるようにして作製することができる。本
発明の実施に際して用いる特定のプライマーは、アスペ
ルギルス・ニガーのフィターゼ、アスペルギルス・ニガ
ーの酸性ホスファターゼ、サッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae) の酸性ホスファターゼ、
およびシゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomy
ces pombe)の酸性ホスファターゼの既知配列のＤＮＡ配
列比較に基づいて、縮重プライマーとして設計された
（配列情報については、例えば European Bioinformati
cs Institute (Hinxton Hall, Cambridge, GB)を参照の
こと）。アスペルギルス・ニガー由来の既知配列に基づ
いて作製したアスペルギルス・ニガーのコドン利用表に
従っていくつかのコドンを選択することにより、プライ
マーの縮重を減らした。さらに、特定のプローブを規定
するのに用いたアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸は、上
記のフィターゼを含む全ての酸性ホスファターゼにおい
て保存されていたアミノ酸であるが、残りのアミノ酸は
ホスファターゼよりもフィターゼに特異的であることが
見いだされた。
イマーは当技術分野で知られた方法により、例えば Sam
brook ら (1989, “Molecular cloning ”第２版，Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r ）に記載されるようにして作製することができる。本
発明の実施に際して用いる特定のプライマーは、アスペ
ルギルス・ニガーのフィターゼ、アスペルギルス・ニガ
ーの酸性ホスファターゼ、サッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae) の酸性ホスファターゼ、
およびシゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomy
ces pombe)の酸性ホスファターゼの既知配列のＤＮＡ配
列比較に基づいて、縮重プライマーとして設計された
（配列情報については、例えば European Bioinformati
cs Institute (Hinxton Hall, Cambridge, GB)を参照の
こと）。アスペルギルス・ニガー由来の既知配列に基づ
いて作製したアスペルギルス・ニガーのコドン利用表に
従っていくつかのコドンを選択することにより、プライ
マーの縮重を減らした。さらに、特定のプローブを規定
するのに用いたアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸は、上
記のフィターゼを含む全ての酸性ホスファターゼにおい
て保存されていたアミノ酸であるが、残りのアミノ酸は
ホスファターゼよりもフィターゼに特異的であることが
見いだされた。
【００２４】このような増幅ＤＮＡ配列は、その後、当
技術分野で知られた方法により（Sambrookら, 前掲）、
特に実施例５〜７に記載するようにして、例えば真菌由
来のＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするために
用いることができる。ひとたび本発明の完全なＤＮＡ配
列が得られたら、それらを当技術分野で知られた方法、
例えばSambrookら（前掲）に記載された方法でベクター
に組み込み、コードされたポリペプチドを適当な宿主系
において過剰発現させることができる。しかし、当業者
であれば、ＤＮＡ配列それ自体を用いて本発明の適当な
宿主系を形質転換することにより、コードされたポリペ
プチドの過剰発現が得られることも分かるだろう。適当
な宿主系は、例えば、アスペルギルス属菌〔例、アスペ
ルギルス・ニガー (ATCC 9142)またはアスペルギルス・
フィクウム (Aspergillus ficuum) (NRRL 3135) 〕また
はトリコデルマ属菌〔例、トリコデルマ・リーセイ (Tr
ichoderma reesei) 〕のような真菌類、あるいはサッカ
ロミセス属菌〔例、サッカロミセス・セレビシエ (Sacc
haromyces cerevisiae）またはピヒア属菌（例、ピヒア
・パストリス (Pichia pastoris)〕（すべてＡＴＣＣか
ら入手可能）のような酵母である。使用できる細菌は、
例えば、大腸菌 (E. coli)、バシラス属菌〔例、バシラ
ス・ズブチリス (Bacillus subtilis)〕またはストレプ
トミセス属菌〔例、ストレプトミセス・リビダンス (St
reptomyces lividans)〕である（AnneおよびMallaert,
FEMS Microbiol. Letters 114, 121 (1993) を参照のこ
と）。用いることのできる大腸菌は大腸菌 K12株、例え
ばM15 〔Villarejo ら, J. Bacteriol. 120, 466-474
(1974) にDZ 291として記載されるもの〕、HB 101 (ATC
C 33694) または大腸菌 SG13009〔Gottesman ら, J. Ba
cteriol. 148, 265-273 (1981) 〕である。
技術分野で知られた方法により（Sambrookら, 前掲）、
特に実施例５〜７に記載するようにして、例えば真菌由
来のＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするために
用いることができる。ひとたび本発明の完全なＤＮＡ配
列が得られたら、それらを当技術分野で知られた方法、
例えばSambrookら（前掲）に記載された方法でベクター
に組み込み、コードされたポリペプチドを適当な宿主系
において過剰発現させることができる。しかし、当業者
であれば、ＤＮＡ配列それ自体を用いて本発明の適当な
宿主系を形質転換することにより、コードされたポリペ
プチドの過剰発現が得られることも分かるだろう。適当
な宿主系は、例えば、アスペルギルス属菌〔例、アスペ
ルギルス・ニガー (ATCC 9142)またはアスペルギルス・
フィクウム (Aspergillus ficuum) (NRRL 3135) 〕また
はトリコデルマ属菌〔例、トリコデルマ・リーセイ (Tr
ichoderma reesei) 〕のような真菌類、あるいはサッカ
ロミセス属菌〔例、サッカロミセス・セレビシエ (Sacc
haromyces cerevisiae）またはピヒア属菌（例、ピヒア
・パストリス (Pichia pastoris)〕（すべてＡＴＣＣか
ら入手可能）のような酵母である。使用できる細菌は、
例えば、大腸菌 (E. coli)、バシラス属菌〔例、バシラ
ス・ズブチリス (Bacillus subtilis)〕またはストレプ
トミセス属菌〔例、ストレプトミセス・リビダンス (St
reptomyces lividans)〕である（AnneおよびMallaert,
FEMS Microbiol. Letters 114, 121 (1993) を参照のこ
と）。用いることのできる大腸菌は大腸菌 K12株、例え
ばM15 〔Villarejo ら, J. Bacteriol. 120, 466-474
(1974) にDZ 291として記載されるもの〕、HB 101 (ATC
C 33694) または大腸菌 SG13009〔Gottesman ら, J. Ba
cteriol. 148, 265-273 (1981) 〕である。
【００２５】真菌による発現に用いられるベクターは当
技術分野で知られており、例えば、EP 420 358に、ある
いはCullenら〔Bio/Technology 5, 369-376 (1987)〕、
Ward, Molecular Industrial Mycology, Systems and A
pplications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker,
New York (1991) 、Upshall ら〔Bio/Technology 5,130
1-1304 (1987)〕、Gwynneら〔Bio/Technology 5, 71-79
(1987)〕、Puntら〔J. of Biotechnology 17, 19-34
(1991)〕によって記載されている。酵母用のベクターは
Sreekrishnaら〔J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1
988); Biochem.28, 4117-4125 (1989) 〕、Hitzemann
ら〔Nature 293, 717-722 (1981)〕によって、またはEP
183 070、EP 183 071、EP 248 227、EP 263 311に記載
されている。大腸菌発現用の適当なベクターとしては、
例えば Sambrook ら（前掲）、Fiers ら, Procd. 8th I
nt. Biotechnology Symposium 〔Soc. Franc. de Micro
biol., Paris (Durandら編集), pp. 680-697 (1988)
〕、Bujardら, Methods in Enzymology, Wu および Gr
ossmann編集, Academic Press社, 第155 巻, 416-433(1
987)、および Stuber ら, Immunological Methods, Lef
kovitsおよび Pernis編集, Academic Press社, 第IV巻,
121-152 (1990)に記載されるものを挙げることができ
る。バシラス発現用のベクターは当技術分野で知られて
おり、例えば、EP 405 370、Yansura および Henner, P
rocd. Nat. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)、Meth. En
zym. 185, 199-228 (1990)、または EP 207 459 に記載
されている。
技術分野で知られており、例えば、EP 420 358に、ある
いはCullenら〔Bio/Technology 5, 369-376 (1987)〕、
Ward, Molecular Industrial Mycology, Systems and A
pplications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker,
New York (1991) 、Upshall ら〔Bio/Technology 5,130
1-1304 (1987)〕、Gwynneら〔Bio/Technology 5, 71-79
(1987)〕、Puntら〔J. of Biotechnology 17, 19-34
(1991)〕によって記載されている。酵母用のベクターは
Sreekrishnaら〔J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1
988); Biochem.28, 4117-4125 (1989) 〕、Hitzemann
ら〔Nature 293, 717-722 (1981)〕によって、またはEP
183 070、EP 183 071、EP 248 227、EP 263 311に記載
されている。大腸菌発現用の適当なベクターとしては、
例えば Sambrook ら（前掲）、Fiers ら, Procd. 8th I
nt. Biotechnology Symposium 〔Soc. Franc. de Micro
biol., Paris (Durandら編集), pp. 680-697 (1988)
〕、Bujardら, Methods in Enzymology, Wu および Gr
ossmann編集, Academic Press社, 第155 巻, 416-433(1
987)、および Stuber ら, Immunological Methods, Lef
kovitsおよび Pernis編集, Academic Press社, 第IV巻,
121-152 (1990)に記載されるものを挙げることができ
る。バシラス発現用のベクターは当技術分野で知られて
おり、例えば、EP 405 370、Yansura および Henner, P
rocd. Nat. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)、Meth. En
zym. 185, 199-228 (1990)、または EP 207 459 に記載
されている。
【００２６】こうしたベクターはプロモーターのような
調節要素をすでに含んでいるか、または、かかる要素を
含むように本発明のＤＮＡ配列を遺伝子操作することが
できる。用いることのできる適当なプロモーター要素は
当技術分野で知られており、例えば、トリコデルマ・リ
ーセイについては cbh1 プロモーター〔Haarkiら, Biot
echnology 7, 596-600 (1989) 〕または pki1 プロモー
ター〔Schindler ら,Gene 130, 271-275 (1993)〕、ア
スペルギルス・オリザについては amyプロモーター〔Ch
ristensen ら, Abstr. 19th Lunteren Lectures on Mol
ecular Genetics F23 (1987)、Christensen ら,Biotech
nology 6, 1419-1422 (1988)、Tadaら,Mol. Gen. Gene
t. 229, 301 (1991)〕、アスペルギルス・ニガーについ
ては glaA プロモーター〔Cullenら, Bio/Technology
5, 369-376 (1987)、Gwynneら, Bio/Technology 5, 713
-719 (1987)、Ward, Molecular Industrial Mycology,
Systems and Applications for Filamentous Fungi, Ma
rcel Dekker, New York, 83-106 (1991) 〕、alcAプロ
モーター〔Gwynneら, Bio/Technology 5, 713-719 (198
7)〕、suc1プロモーター〔Boddy ら, Current Genetics
24, 60-66 (1993) 〕、aphAプロモーター〔MacRaeら,
Gene 71, 339-348 (1988) 、MacRaeら, Gene 132, 193-
198 (1993)〕、tpiAプロモーター〔McKnightら, Cell 4
6, 143-147 (1986) 、Upshall ら, Bio/Technology 5,
1301-1304 (1987)〕、gpdAプロモーター〔Puntら, Gene
69, 49-57 (1988) 、Puntら, J. of Biotechnology 1
7, 19-37(1991)〕および pkiA プロモーター〔de Graaf
f ら, Curr. Genet. 22, 21-27 (1992) 〕である。酵母
発現用の適当なプロモーター要素は当技術分野で知られ
ており、例えば、pho5プロモーター〔Vogel ら, Molecu
lar and Cellular Biology, 2050-2057 (1989)、Rudolf
and Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340-1344
(1987)〕またはサッカロミセス・セレビシエ発現用の g
apプロモーター、およびピヒア・パストリス発現用の a
ox1 プロモーター〔Koutz ら, Yeast 5, 167-177 (198
9) 、Sreekrishna ら, J. Basic Microbiol. 28, 265-2
78 (1988)〕である。
調節要素をすでに含んでいるか、または、かかる要素を
含むように本発明のＤＮＡ配列を遺伝子操作することが
できる。用いることのできる適当なプロモーター要素は
当技術分野で知られており、例えば、トリコデルマ・リ
ーセイについては cbh1 プロモーター〔Haarkiら, Biot
echnology 7, 596-600 (1989) 〕または pki1 プロモー
ター〔Schindler ら,Gene 130, 271-275 (1993)〕、ア
スペルギルス・オリザについては amyプロモーター〔Ch
ristensen ら, Abstr. 19th Lunteren Lectures on Mol
ecular Genetics F23 (1987)、Christensen ら,Biotech
nology 6, 1419-1422 (1988)、Tadaら,Mol. Gen. Gene
t. 229, 301 (1991)〕、アスペルギルス・ニガーについ
ては glaA プロモーター〔Cullenら, Bio/Technology
5, 369-376 (1987)、Gwynneら, Bio/Technology 5, 713
-719 (1987)、Ward, Molecular Industrial Mycology,
Systems and Applications for Filamentous Fungi, Ma
rcel Dekker, New York, 83-106 (1991) 〕、alcAプロ
モーター〔Gwynneら, Bio/Technology 5, 713-719 (198
7)〕、suc1プロモーター〔Boddy ら, Current Genetics
24, 60-66 (1993) 〕、aphAプロモーター〔MacRaeら,
Gene 71, 339-348 (1988) 、MacRaeら, Gene 132, 193-
198 (1993)〕、tpiAプロモーター〔McKnightら, Cell 4
6, 143-147 (1986) 、Upshall ら, Bio/Technology 5,
1301-1304 (1987)〕、gpdAプロモーター〔Puntら, Gene
69, 49-57 (1988) 、Puntら, J. of Biotechnology 1
7, 19-37(1991)〕および pkiA プロモーター〔de Graaf
f ら, Curr. Genet. 22, 21-27 (1992) 〕である。酵母
発現用の適当なプロモーター要素は当技術分野で知られ
ており、例えば、pho5プロモーター〔Vogel ら, Molecu
lar and Cellular Biology, 2050-2057 (1989)、Rudolf
and Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340-1344
(1987)〕またはサッカロミセス・セレビシエ発現用の g
apプロモーター、およびピヒア・パストリス発現用の a
ox1 プロモーター〔Koutz ら, Yeast 5, 167-177 (198
9) 、Sreekrishna ら, J. Basic Microbiol. 28, 265-2
78 (1988)〕である。
【００２７】従って、好ましくは細菌、真菌または酵母
宿主で本発明のＤＮＡ配列を発現させるための、該ＤＮ
Ａ配列を含有するベクターおよび形質転換された細菌、
真菌または酵母宿主も本発明の対象となる。こうしたＤ
ＮＡ配列が適当な培地で適切な宿主細胞により発現され
たら、コード化されるフィターゼを、フィターゼが培地
に分泌される場合には培地から、また、フィターゼが細
胞内に存在する場合には宿主生物から、タンパク質精製
の分野で知られた方法または例えば EP 420 358 に記載
された方法により単離することができる。従って、上記
のような形質転換細菌または宿主細胞を適当な培養条件
下で培養し、そしてそこからポリペプチドを回収するこ
とを特徴とする本発明のポリペプチドの生産方法、およ
びこのような方法によって生産されたポリペプチドまた
は本発明のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチ
ドも本発明の対象となる。
宿主で本発明のＤＮＡ配列を発現させるための、該ＤＮ
Ａ配列を含有するベクターおよび形質転換された細菌、
真菌または酵母宿主も本発明の対象となる。こうしたＤ
ＮＡ配列が適当な培地で適切な宿主細胞により発現され
たら、コード化されるフィターゼを、フィターゼが培地
に分泌される場合には培地から、また、フィターゼが細
胞内に存在する場合には宿主生物から、タンパク質精製
の分野で知られた方法または例えば EP 420 358 に記載
された方法により単離することができる。従って、上記
のような形質転換細菌または宿主細胞を適当な培養条件
下で培養し、そしてそこからポリペプチドを回収するこ
とを特徴とする本発明のポリペプチドの生産方法、およ
びこのような方法によって生産されたポリペプチドまた
は本発明のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチ
ドも本発明の対象となる。
【００２８】本発明のポリペプチドが得られたら、その
活性に関して、当技術分野で知られたアッセイ、例えば
Engelenら〔J. AOAC Intern. 77, 760-764 (1994)〕に
よりまたは実施例９に記載されるようにして該ポリペプ
チドを特性付けることができる。本発明のポリペプチド
を農業の分野で有用なものにするそれらの性質に関して
は、例えば Simons ら〔British Journal of Nutrition
64, 525-540 (1990)〕、Schoner ら〔J. Anim. Physio
l. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991) 〕、Vogt〔Arc
h. Geflugelk. 56, 93-98 (1992) 〕、Jongbloed ら
〔J. Anim. Sci.,70, 1159-1168 (1992) 〕、Perneyら
〔Poultry Science 72, 2106-2114 (1993)〕、Farrell
ら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278-283
(1993) 〕、Brozら〔British Poultry Science 35, 273
-280 (1994)〕および Dungelhoef ら〔Animal Feed Sci
ence and Technology 49, 1-10 (1994)〕により記載さ
れるような、当技術分野で知られた任意のアッセイを用
いることができる。それらの耐熱性に関しては、例えば
Yamada ら〔前掲〕により記載されるような、当技術分
野で知られた任意のアッセイを、そしてそれらのｐＨお
よび基質特異性のプロフィールに関しては、例えば実施
例９または Yamada ら〔前掲〕に記載されるような、当
技術分野で知られた任意のアッセイを使用することがで
きる。
活性に関して、当技術分野で知られたアッセイ、例えば
Engelenら〔J. AOAC Intern. 77, 760-764 (1994)〕に
よりまたは実施例９に記載されるようにして該ポリペプ
チドを特性付けることができる。本発明のポリペプチド
を農業の分野で有用なものにするそれらの性質に関して
は、例えば Simons ら〔British Journal of Nutrition
64, 525-540 (1990)〕、Schoner ら〔J. Anim. Physio
l. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991) 〕、Vogt〔Arc
h. Geflugelk. 56, 93-98 (1992) 〕、Jongbloed ら
〔J. Anim. Sci.,70, 1159-1168 (1992) 〕、Perneyら
〔Poultry Science 72, 2106-2114 (1993)〕、Farrell
ら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278-283
(1993) 〕、Brozら〔British Poultry Science 35, 273
-280 (1994)〕および Dungelhoef ら〔Animal Feed Sci
ence and Technology 49, 1-10 (1994)〕により記載さ
れるような、当技術分野で知られた任意のアッセイを用
いることができる。それらの耐熱性に関しては、例えば
Yamada ら〔前掲〕により記載されるような、当技術分
野で知られた任意のアッセイを、そしてそれらのｐＨお
よび基質特異性のプロフィールに関しては、例えば実施
例９または Yamada ら〔前掲〕に記載されるような、当
技術分野で知られた任意のアッセイを使用することがで
きる。
【００２９】一般に、本発明のポリペプチドは、フィチ
ン酸をイノシトールと無機リン酸に変換する特定の応用
分野に限られることなく用いられるものである。さら
に、本発明のポリペプチドは、複合食品または飼料の製
造方法において用いられ、かかる組成物の諸成分と１種
以上の本発明のポリペプチドとが一緒に混合される。従
って、１種以上の本発明のポリペプチドを含有する複合
食品または飼料も本発明の対象となる。当業者であれ
ば、その製造方法について熟知しているだろう。こうし
た複合食品または飼料は、この目的のために常用される
公知の添加剤または成分をさらに含んでいてもよい。
ン酸をイノシトールと無機リン酸に変換する特定の応用
分野に限られることなく用いられるものである。さら
に、本発明のポリペプチドは、複合食品または飼料の製
造方法において用いられ、かかる組成物の諸成分と１種
以上の本発明のポリペプチドとが一緒に混合される。従
って、１種以上の本発明のポリペプチドを含有する複合
食品または飼料も本発明の対象となる。当業者であれ
ば、その製造方法について熟知しているだろう。こうし
た複合食品または飼料は、この目的のために常用される
公知の添加剤または成分をさらに含んでいてもよい。
【００３０】さらに、動物に、こうした飼料組成物を、
該飼料中に含まれるフィチン酸 (phytate)をイノシトー
ルと無機リン酸に変換するのに有効な量で与えることを
特徴とする、動物肥料中のフィチン酸のレベルを低下さ
せる方法を提供することも本発明の対象となる。
該飼料中に含まれるフィチン酸 (phytate)をイノシトー
ルと無機リン酸に変換するのに有効な量で与えることを
特徴とする、動物肥料中のフィチン酸のレベルを低下さ
せる方法を提供することも本発明の対象となる。
【００３１】
【実施例】用いる特定の培地および溶液 完全培地 (Clutterbuck) グルコース 10 g/l -CN 溶液 10 ml/l 硝酸ナトリウム 6 g/l バクトペプトン (Difco Lab., Detroit, MI, USA) 2 g/l 酵母エキス (Difco) 1 g/l カザミノ酸 (Difco) 1.5 g/l 調製微量元素溶液 1 ml/l ビタミン溶液 1 ml/l Ｍ３培地 グルコース 10 g/l -CN 溶液 10 ml/l 調製微量元素溶液 1 ml/l 硝酸アンモニウム 2 g/l Ｍ３培地−リン酸塩 -CN を-CNPで置き換えたＭ３培地 Ｍ３培地−リン酸塩＋フィチン酸塩 5 g/l のフィチン酸 Na12 (Sigma #P-3168; Sigma, St. Louis, MO, USA)を 添加したＭ３培地−リン酸塩調製微量元素溶液 CuSO4 0.04％ FeSO4.7H2O 0.08％ Na2MoO4.2H2O 0.08％ ZnSO4.7H2O 0.8 ％ B4Na2O7.10H2O 0.004 ％ MnSO4.H2O 0.08％ビタミン溶液 リボフラビン 0.1 ％ ニコチンアミド 0.1 ％ p-アミノ安息香酸 0.01％ ピリドキシン/HCl 0.05％ アノイリン/HCl 0.05％ ビオチン 0.001 ％-CN 溶液 KH2PO4 140 g/l K2PO4.3H2O 90 g/l KCl 10 g/l MgSO4.7H2O 10 g/l-CNP溶液 HEPES 47.6 g/200 ml KCl 2 g/200 ml MgSO4.7H2O 2 g/200 ml
【００３２】実施例１ フィターゼ活性についての真菌のスクリーニング 真菌は、次の３種類の培地を用いて、３プレート系でス
クリーニングした。 「Ｍ３」 （リン酸塩を含有する規定培地）、 「Ｍ３−Ｐ」 （リン酸塩を除いたＭ３培地）および 「Ｍ３−Ｐ＋フィチン酸塩」（リン酸塩を除いてあるが、唯一のリン源とし てフィチン酸塩を含有するＭ３培地） このプレートはアガロースから作られていて、リン酸の
バックグラウンドレベルを低下させてある。
クリーニングした。 「Ｍ３」 （リン酸塩を含有する規定培地）、 「Ｍ３−Ｐ」 （リン酸塩を除いたＭ３培地）および 「Ｍ３−Ｐ＋フィチン酸塩」（リン酸塩を除いてあるが、唯一のリン源とし てフィチン酸塩を含有するＭ３培地） このプレートはアガロースから作られていて、リン酸の
バックグラウンドレベルを低下させてある。
【００３３】真菌を培地上で、供給会社が推奨する温度
で生育させた。胞子または菌糸を検査プレートに移し、
生育が観察されるまで推奨される温度で培養した。次の
耐熱菌株はこうした生育を示すことが分かった。 ミセリオフトラ・サーモフィラ (ATCC 48 102) タラロミセス・サーモフィルス (ATCC 20 186) アスペルギルス・フミガツス (ATCC 34 625)
で生育させた。胞子または菌糸を検査プレートに移し、
生育が観察されるまで推奨される温度で培養した。次の
耐熱菌株はこうした生育を示すことが分かった。 ミセリオフトラ・サーモフィラ (ATCC 48 102) タラロミセス・サーモフィルス (ATCC 20 186) アスペルギルス・フミガツス (ATCC 34 625)
【００３４】実施例２ 真菌の生育およびゲノムＤＮＡの調製 ミセリオフトラ・サーモフィラ、タラロミセス・サーモ
フィルス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギル
ス・ニードランス、アスペルギルス・テレウス9A-1およ
びアスペルギルス・テレウス CBS 220.95 の菌株をポテ
ト・デキストロース・ブロス (Potato Dextrose Broth;
Difco Lab., Detroit, MI, USA)または完全培地 (Clut
terbuck)にて生育させた。アスペルギルス・テレウス9A
-1およびアスペルギルス・ニードランスは、特許手続上
のブダペスト条約に基づいて、DSM (Braunschweig, BR
D) に、それぞれ1994年３月17日に受託番号 DSM 9076
および1995年２月17日に受託番号 DSM 9743 として寄託
された。
フィルス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギル
ス・ニードランス、アスペルギルス・テレウス9A-1およ
びアスペルギルス・テレウス CBS 220.95 の菌株をポテ
ト・デキストロース・ブロス (Potato Dextrose Broth;
Difco Lab., Detroit, MI, USA)または完全培地 (Clut
terbuck)にて生育させた。アスペルギルス・テレウス9A
-1およびアスペルギルス・ニードランスは、特許手続上
のブダペスト条約に基づいて、DSM (Braunschweig, BR
D) に、それぞれ1994年３月17日に受託番号 DSM 9076
および1995年２月17日に受託番号 DSM 9743 として寄託
された。
【００３５】ゲノムＤＮＡは次のようにして調製した。
培地に高密度で胞子を植えつけ、振とうしながら一晩生
育させた。菌糸を濾過により回収し、ブロットし、乾燥
させ、そして重さを量った。１回の調製につき最高２．
０ｇを使用した。菌糸を液体窒素中で砕いて微細な粉末
となし、すぐに１０ｍｌの抽出緩衝液（200mM Tris/HC
l, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 8.5)に加え
てよく混合した。このスラリーにフェノール（７ｍｌ）
を加えて混合し、さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加え
て十分に混合した。この混合物を遠心 (20,000 g) にか
け、水相を回収した。ＲＮアーゼＡを加えて最終濃度を
250μg/mlとなし、３７℃で１５分間インキュベートし
た。次に、この混合物を１容量のクロロホルムで抽出
し、遠心 (10,000 g, 10分) した。水相を回収し、０．
５４容量のイソプロパノールを用いて室温で１時間にわ
たりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを巻きつけて回収し、
水に再懸濁させた。
培地に高密度で胞子を植えつけ、振とうしながら一晩生
育させた。菌糸を濾過により回収し、ブロットし、乾燥
させ、そして重さを量った。１回の調製につき最高２．
０ｇを使用した。菌糸を液体窒素中で砕いて微細な粉末
となし、すぐに１０ｍｌの抽出緩衝液（200mM Tris/HC
l, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 8.5)に加え
てよく混合した。このスラリーにフェノール（７ｍｌ）
を加えて混合し、さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加え
て十分に混合した。この混合物を遠心 (20,000 g) にか
け、水相を回収した。ＲＮアーゼＡを加えて最終濃度を
250μg/mlとなし、３７℃で１５分間インキュベートし
た。次に、この混合物を１容量のクロロホルムで抽出
し、遠心 (10,000 g, 10分) した。水相を回収し、０．
５４容量のイソプロパノールを用いて室温で１時間にわ
たりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを巻きつけて回収し、
水に再懸濁させた。
【００３６】得られたＤＮＡは次のようにしてさらに精
製した。ＤＮＡの一部をプロテイナーゼＫを用いて３７
℃で２時間消化し、次いで等容量のフェノール／クロロ
ホルムで繰り返し（２〜３回）抽出し、エタノール沈殿
させ、その後水に再懸濁させて約１μｇ／μｌの濃度と
した。
製した。ＤＮＡの一部をプロテイナーゼＫを用いて３７
℃で２時間消化し、次いで等容量のフェノール／クロロ
ホルムで繰り返し（２〜３回）抽出し、エタノール沈殿
させ、その後水に再懸濁させて約１μｇ／μｌの濃度と
した。
【００３７】実施例３ 縮重ＰＣＲ ＰＣＲは、本質的にパーキン・エルマー・シータス〔(P
erkin Elmer Cetus: PEC); Norwalk, CT, USA 〕のプロ
トコールに従って行った。次の２つのプライマーを用い
た（括弧内に示した塩基はいずれか一方／又はを意味す
る）。 Phyt8: 5'ATG GA(CT) ATG TG(CT) TCN TT(CT) GA 3' 縮重＝３２ 高温＝６０℃／低温５２℃ Phyt9: 5'TT(AG) CC(AG) GC(AG) CC(GA) TGN CC(GA) TA 3' 高温＝７０℃／低温５８℃ 典型的な反応は次のように実施した。
erkin Elmer Cetus: PEC); Norwalk, CT, USA 〕のプロ
トコールに従って行った。次の２つのプライマーを用い
た（括弧内に示した塩基はいずれか一方／又はを意味す
る）。 Phyt8: 5'ATG GA(CT) ATG TG(CT) TCN TT(CT) GA 3' 縮重＝３２ 高温＝６０℃／低温５２℃ Phyt9: 5'TT(AG) CC(AG) GC(AG) CC(GA) TGN CC(GA) TA 3' 高温＝７０℃／低温５８℃ 典型的な反応は次のように実施した。
【００３８】 H2O 24.5 μl 10 X PEC GeneAmp緩衝液 5 μl GeneAmp dNTP (10 mM) 8 μl プライマー１ (Phyt8, 100μM) 5 μl プライマー２ (Phyt9, 100μM) 5 μl DNA (約１μg/μl) 1 μl Taq ポリメラーゼ (PEC) 0.5 μl 50 μl Taq ポリメラーゼを除く全成分を９５℃で１０分、次に
５０℃で１０分インキュベートし、その後反応混合物を
氷上に置いた。続いて、Taq ポリメラーゼ (Amplitaq,
Hoffmann-La Roche, Basel, CH) を加え、トリオサーモ
ブロック（Triothermoblock; Biometra, Gottingen, D
E) で次のサイクルプロフィールに従って３５回のＰＣ
Ｒを実施した。
５０℃で１０分インキュベートし、その後反応混合物を
氷上に置いた。続いて、Taq ポリメラーゼ (Amplitaq,
Hoffmann-La Roche, Basel, CH) を加え、トリオサーモ
ブロック（Triothermoblock; Biometra, Gottingen, D
E) で次のサイクルプロフィールに従って３５回のＰＣ
Ｒを実施した。
【００３９】95℃／60秒 50℃／90秒 72℃／120 秒 この反応混合物のアリコートを１．５％アガロースゲル
上で分析した。
上で分析した。
【００４０】実施例４ ＰＣＲ断片のサブクローニングおよび配列決定 予期された大きさ（アスペルギルス・ニガーＤＮＡ配列
からは約１４６ｂｐが予測される）のＰＣＲ産物を低融
点アガロースから切りだし、NACS-PREPAC カラム (BRL
Life Technologies 社, Gaithersburg, MD, USA)から製
造会社のプロトコールに従って精製した。この断片を５
０μｌの100mM カコジル酸ナトリウム pH 6.6, 12.5mM
Tris/HCl pH 7.0, 0.1mMジチオトレイトール, 125 μg/
mlウシ血清アルブミン, 1mM CoCl2, 20 μm dATP, 10単
位のターミナルデオキシトランスフェラーゼ (Boehring
er Mannheim, Mannheim, DE)中で３７℃にて５分間ポリ
アデニル化し、p123T ベクター〔Mitchellら, PCR Met
h. App. 2, 81-82 (1992)〕にクローニングした。
からは約１４６ｂｐが予測される）のＰＣＲ産物を低融
点アガロースから切りだし、NACS-PREPAC カラム (BRL
Life Technologies 社, Gaithersburg, MD, USA)から製
造会社のプロトコールに従って精製した。この断片を５
０μｌの100mM カコジル酸ナトリウム pH 6.6, 12.5mM
Tris/HCl pH 7.0, 0.1mMジチオトレイトール, 125 μg/
mlウシ血清アルブミン, 1mM CoCl2, 20 μm dATP, 10単
位のターミナルデオキシトランスフェラーゼ (Boehring
er Mannheim, Mannheim, DE)中で３７℃にて５分間ポリ
アデニル化し、p123T ベクター〔Mitchellら, PCR Met
h. App. 2, 81-82 (1992)〕にクローニングした。
【００４１】また、ＰＣＲ断片は、精製後に、“Sure C
lone”ライゲーションキット (Pharmacia)を用いて製造
会社の説明書どおりにクローニングした。配列決定は、
Quiagen カラム (Diagen GmbH, Hilden, DE)で精製した
ｄｓＤＮＡに対して、ジデオキシ法およびファルマシア
Ｔ７キット (Pharmacia, LKB Biotechnology AB, Uppsa
la, SE) を用いて、製造会社のプロトコールに従って実
施した。
lone”ライゲーションキット (Pharmacia)を用いて製造
会社の説明書どおりにクローニングした。配列決定は、
Quiagen カラム (Diagen GmbH, Hilden, DE)で精製した
ｄｓＤＮＡに対して、ジデオキシ法およびファルマシア
Ｔ７キット (Pharmacia, LKB Biotechnology AB, Uppsa
la, SE) を用いて、製造会社のプロトコールに従って実
施した。
【００４２】実施例５ ラムダ Fix II ライブラリーの構築およびスクリーニン
グ アスペルギルス・テレウス9A-1株およびミセリオフトラ
・サーモフィラに由来する断片を用いて BamHIおよびBg
lII サザンを釣り上げ、ラムダ Fix II ベクター (Stra
tagene, La Jolla, CA, USA)へのゲノムライブラリーの
構築に用いるのに適した制限酵素を調べた。ラムダ Fix
II は９〜２３ｋｂの挿入配列を受け入れるにすぎな
い。サザンは次のプロトコールに従って実施した。ゲノ
ムＤＮＡ (10μg)を最終容量 200μl にて消化した。酵
素を含まない反応混合物を調製し、氷上で２時間インキ
ュベートした。酵素（50単位）を加え、反応混合物を適
温で３時間インキュベートした。次に、等容量のフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた。
負荷緩衝液中に懸濁したＤＮＡを６５℃に１５分間加熱
し、その後０．７％アガロースゲル（一晩、30Ｖ）で分
離した。移行に先立って、ゲルを0.2M HCl中で室温にて
１０分間ずつ２回、続いて 1M NaCl／0.4M NaOH 中で室
温にて１５分間ずつ２回洗浄した。ＤＮＡを0.4M NaOH
にて毛細管移行によりニトラン (Nytran) 13N ナイロン
膜 (Schleicher and Schuell AG, Feldbach, Zurich, C
H)に４時間かけて移行させた。移行の後、膜をＵＶに露
光した〔Auto cross-link, UV Stratalinker 2400, Str
atagene (La Jolla, CA, USA) 〕。
グ アスペルギルス・テレウス9A-1株およびミセリオフトラ
・サーモフィラに由来する断片を用いて BamHIおよびBg
lII サザンを釣り上げ、ラムダ Fix II ベクター (Stra
tagene, La Jolla, CA, USA)へのゲノムライブラリーの
構築に用いるのに適した制限酵素を調べた。ラムダ Fix
II は９〜２３ｋｂの挿入配列を受け入れるにすぎな
い。サザンは次のプロトコールに従って実施した。ゲノ
ムＤＮＡ (10μg)を最終容量 200μl にて消化した。酵
素を含まない反応混合物を調製し、氷上で２時間インキ
ュベートした。酵素（50単位）を加え、反応混合物を適
温で３時間インキュベートした。次に、等容量のフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた。
負荷緩衝液中に懸濁したＤＮＡを６５℃に１５分間加熱
し、その後０．７％アガロースゲル（一晩、30Ｖ）で分
離した。移行に先立って、ゲルを0.2M HCl中で室温にて
１０分間ずつ２回、続いて 1M NaCl／0.4M NaOH 中で室
温にて１５分間ずつ２回洗浄した。ＤＮＡを0.4M NaOH
にて毛細管移行によりニトラン (Nytran) 13N ナイロン
膜 (Schleicher and Schuell AG, Feldbach, Zurich, C
H)に４時間かけて移行させた。移行の後、膜をＵＶに露
光した〔Auto cross-link, UV Stratalinker 2400, Str
atagene (La Jolla, CA, USA) 〕。
【００４３】膜はハイブリダイゼーション緩衝液〔50％
ホルムアミド、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、10％デキストラン硫酸、４ｘＳＳＰＥ（180mM Na
Cl, 10mMNaH2PO4, 1mM EDTA, pH 7.4) 〕中で４２℃に
て４時間プレハイブリダイズさせ、変性プローブの添加
後は４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。ブロットを次
のように洗浄した： １ｘＳＳＰＥ／0.5 ％ＳＤＳ／室温／３０分 0.1 ｘＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ／室温／３０分 0.1 ｘＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ／６５℃／３０分 結果は、BamHI で消化したアスペルギルス・テレウス9A
-1株のゲノムＤＮＡおよびBglII で消化したミセリオフ
トラ・サーモフィラのゲノムＤＮＡがラムダ Fix II ベ
クターへのクローニングに適する断片をもたらすことを
示した。
ホルムアミド、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、10％デキストラン硫酸、４ｘＳＳＰＥ（180mM Na
Cl, 10mMNaH2PO4, 1mM EDTA, pH 7.4) 〕中で４２℃に
て４時間プレハイブリダイズさせ、変性プローブの添加
後は４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。ブロットを次
のように洗浄した： １ｘＳＳＰＥ／0.5 ％ＳＤＳ／室温／３０分 0.1 ｘＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ／室温／３０分 0.1 ｘＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ／６５℃／３０分 結果は、BamHI で消化したアスペルギルス・テレウス9A
-1株のゲノムＤＮＡおよびBglII で消化したミセリオフ
トラ・サーモフィラのゲノムＤＮＡがラムダ Fix II ベ
クターへのクローニングに適する断片をもたらすことを
示した。
【００４４】ラムダ Fix II ベクターへのアスペルギル
ス・テレウス9A-1株およびミセリオフトラ・サーモフィ
ラのゲノムライブラリーの構築は、製造会社のプロトコ
ール(Stratagene) に従って実施した。ラムダライブラ
リーは各ライブラリーについて１０枚の137mm プレート
にまく。プラークをニトラン13N 丸形フィルターに移し
取り、0.5M NaOH/1.5M NaCl 中で１分間、次いで0.5M T
ris-HCl pH8.0/1.5M NaCl 中で５分間処理した。その
後、フィルターを２ｘＳＳＣで５分間処理し、自然乾燥
させた。続いて、それらをＵＶ（１分、UV Stratalinke
r 2400, Stratagene）で固定した。フィルターをハイブ
リダイズさせ、上記のように洗浄した。推定上の陽性プ
ラークを採取し、ファージをＳＭ緩衝液（180mM NaCl,
8mM MgSO4.7H2O, 20mM Tris-HCl pH7.5, 0.01 ％ゼラチ
ン）中に浸した。このストックを希釈し、137mm プレー
トにまいた。２枚ずつのフィルターに移し取り、上記の
ように処理した。各プレートから透明な単一の陽性プラ
ークを取り上げ、ＳＭ緩衝液で希釈した。アスペルギル
ス・テレウス9A-1株から２個（9A1 λ17および9A1 λ2
2）、そしてミセリオフトラ・サーモフィラから１個
（ＭＴλ27）、全部で３個の陽性プラークが得られた。
ス・テレウス9A-1株およびミセリオフトラ・サーモフィ
ラのゲノムライブラリーの構築は、製造会社のプロトコ
ール(Stratagene) に従って実施した。ラムダライブラ
リーは各ライブラリーについて１０枚の137mm プレート
にまく。プラークをニトラン13N 丸形フィルターに移し
取り、0.5M NaOH/1.5M NaCl 中で１分間、次いで0.5M T
ris-HCl pH8.0/1.5M NaCl 中で５分間処理した。その
後、フィルターを２ｘＳＳＣで５分間処理し、自然乾燥
させた。続いて、それらをＵＶ（１分、UV Stratalinke
r 2400, Stratagene）で固定した。フィルターをハイブ
リダイズさせ、上記のように洗浄した。推定上の陽性プ
ラークを採取し、ファージをＳＭ緩衝液（180mM NaCl,
8mM MgSO4.7H2O, 20mM Tris-HCl pH7.5, 0.01 ％ゼラチ
ン）中に浸した。このストックを希釈し、137mm プレー
トにまいた。２枚ずつのフィルターに移し取り、上記の
ように処理した。各プレートから透明な単一の陽性プラ
ークを取り上げ、ＳＭ緩衝液で希釈した。アスペルギル
ス・テレウス9A-1株から２個（9A1 λ17および9A1 λ2
2）、そしてミセリオフトラ・サーモフィラから１個
（ＭＴλ27）、全部で３個の陽性プラークが得られた。
【００４５】実施例６ ラムダＤＮＡの調製およびクローンの確認 陽性プラークからラムダＤＮＡを調製した。これは“Ma
gic Lambda Prep ”システム (Promega 社, Madison, W
I, USA) を使って行い、製造会社の説明書に従った。ク
ローンの本性を確かめるため、ラムダＤＮＡをPstIおよ
びSalIで消化し、得られたブロットをＰＣＲ産物で釣り
上げた。全ての場合に、クローンはプローブに相補的な
配列を含むことが確認された。
gic Lambda Prep ”システム (Promega 社, Madison, W
I, USA) を使って行い、製造会社の説明書に従った。ク
ローンの本性を確かめるため、ラムダＤＮＡをPstIおよ
びSalIで消化し、得られたブロットをＰＣＲ産物で釣り
上げた。全ての場合に、クローンはプローブに相補的な
配列を含むことが確認された。
【００４６】実施例７ フィターゼ遺伝子のサブクローニングおよび配列決定 9A1 λ17から得られたＤＮＡをPstIで消化し、得られた
断片の混合物を、PstIで切断した pBluescript II SK+
(Stratagene)に連結し、そしてエビアルカリ性ホスファ
ターゼ (United States Biochemical 社, Cleaveland,
OH, USA)で処理した。連結反応は１６℃で一夜行った。
この連結混合物でXL-1 Blue Supercompetent細胞 (Stra
tagene) を形質転換し、0.5mM イソプロピル- β-D- チ
オガラクトピラノシド (IPTG) 、40μg/ml 5- ブロモ-4
- クロロ-3- インドイル- β-D-ガラクトピラノシド (X
gal) 、50μg/mlアンピシリンを含有するＬＢプレート
にまいた。
断片の混合物を、PstIで切断した pBluescript II SK+
(Stratagene)に連結し、そしてエビアルカリ性ホスファ
ターゼ (United States Biochemical 社, Cleaveland,
OH, USA)で処理した。連結反応は１６℃で一夜行った。
この連結混合物でXL-1 Blue Supercompetent細胞 (Stra
tagene) を形質転換し、0.5mM イソプロピル- β-D- チ
オガラクトピラノシド (IPTG) 、40μg/ml 5- ブロモ-4
- クロロ-3- インドイル- β-D-ガラクトピラノシド (X
gal) 、50μg/mlアンピシリンを含有するＬＢプレート
にまいた。
【００４７】9A1 λ17から得られたＤＮＡをBglII およ
びXbaIで消化し、得られた断片の混合物を、BamHI/XbaI
で消化した pBluescript II SK+ に連結した。連結反
応、形質転換およびスクリーニングを上記のように行っ
た。ＭＴλ27から得られたＤＮＡをSalIで消化し、得ら
れた断片の混合物を、SalIで消化した pBluescript II
SK+ に連結し、そしてエビアルカリ性ホスファターゼで
処理した。連結反応は１６℃で一夜行った。この連結混
合物でXL-1 Blue Supercompetent細胞を形質転換し、Xg
al/IPTG およびアンピシリンを含有するＬＢプレートに
まいた。
びXbaIで消化し、得られた断片の混合物を、BamHI/XbaI
で消化した pBluescript II SK+ に連結した。連結反
応、形質転換およびスクリーニングを上記のように行っ
た。ＭＴλ27から得られたＤＮＡをSalIで消化し、得ら
れた断片の混合物を、SalIで消化した pBluescript II
SK+ に連結し、そしてエビアルカリ性ホスファターゼで
処理した。連結反応は１６℃で一夜行った。この連結混
合物でXL-1 Blue Supercompetent細胞を形質転換し、Xg
al/IPTG およびアンピシリンを含有するＬＢプレートに
まいた。
【００４８】上記の形質転換からのコロニーを採取し、
約７５を単一のプレートに“グリッド (gridded)”し
た。３７℃で一夜インキュベーションした後、コロニー
をナイロンフィルター（“Hybond-N”, Amersham社, Ar
lington Heights, IL, USA）に移し取り、フィルターを
0.5M NaOH で３分間、1M Tris-HCl pH7.5 で１分間ずつ
２回、その後0.5M Tris-HCl pH7.5/1.5M NaCl で５分間
処理した。フィルターを自然乾燥させ、ＵＶ（２分間、
UV Stratalinker 2400, Stratagene）で固定した。フィ
ルターを実施例５のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ
た。陽性コロニーを選択してＤＮＡを調製した。実施例
４に記載したごとく、サブクローンの配列決定を行っ
た。決定された配列は、アスペルギルス・テレウス9A-1
株由来のフィターゼおよびそのコーディングＤＮＡ配列
については図１および２に、ミセリオフトラ・サーモフ
ィラ由来のフィターゼおよびそのコーディングＤＮＡ配
列については図３および４に示してある。図５のＡはア
スペルギルス・テレウスのＤＮＡの制限地図（矢印はコ
ーディング領域を、裁断された線はコーディング領域に
加えて配列決定された領域を示す）を示し、図５のＢは
ミセリオフトラ・サーモフィラのＤＮＡの制限地図を示
す。図６はタラロミセス・サーモフィルス由来のフィタ
ーゼの一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示し、
図７はアスペルギルス・フミガツス由来のフィターゼの
一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示し、そして
図８はアスペルギルス・ニードランス由来のフィターゼ
の一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示す。タラ
ロミセス・サーモフィルス、アスペルギルス・フミガツ
スおよびアスペルギルス・ニードランス由来のフィター
ゼの一部ならびにそれらのコーディングＤＮＡ配列は、
実施例２〜７にアスペルギルス・テレウス9A-1株とミセ
リオフトラ・サーモフィラについて記載した方法と同じ
方法で得られた。塩基は常用される一文字表記により小
文字で両鎖について示してある。誘導されたフィターゼ
のアミノ酸配列は、常用される一文字表記により大文字
で、対応するＤＮＡ配列の下に示してある。
約７５を単一のプレートに“グリッド (gridded)”し
た。３７℃で一夜インキュベーションした後、コロニー
をナイロンフィルター（“Hybond-N”, Amersham社, Ar
lington Heights, IL, USA）に移し取り、フィルターを
0.5M NaOH で３分間、1M Tris-HCl pH7.5 で１分間ずつ
２回、その後0.5M Tris-HCl pH7.5/1.5M NaCl で５分間
処理した。フィルターを自然乾燥させ、ＵＶ（２分間、
UV Stratalinker 2400, Stratagene）で固定した。フィ
ルターを実施例５のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ
た。陽性コロニーを選択してＤＮＡを調製した。実施例
４に記載したごとく、サブクローンの配列決定を行っ
た。決定された配列は、アスペルギルス・テレウス9A-1
株由来のフィターゼおよびそのコーディングＤＮＡ配列
については図１および２に、ミセリオフトラ・サーモフ
ィラ由来のフィターゼおよびそのコーディングＤＮＡ配
列については図３および４に示してある。図５のＡはア
スペルギルス・テレウスのＤＮＡの制限地図（矢印はコ
ーディング領域を、裁断された線はコーディング領域に
加えて配列決定された領域を示す）を示し、図５のＢは
ミセリオフトラ・サーモフィラのＤＮＡの制限地図を示
す。図６はタラロミセス・サーモフィルス由来のフィタ
ーゼの一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示し、
図７はアスペルギルス・フミガツス由来のフィターゼの
一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示し、そして
図８はアスペルギルス・ニードランス由来のフィターゼ
の一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示す。タラ
ロミセス・サーモフィルス、アスペルギルス・フミガツ
スおよびアスペルギルス・ニードランス由来のフィター
ゼの一部ならびにそれらのコーディングＤＮＡ配列は、
実施例２〜７にアスペルギルス・テレウス9A-1株とミセ
リオフトラ・サーモフィラについて記載した方法と同じ
方法で得られた。塩基は常用される一文字表記により小
文字で両鎖について示してある。誘導されたフィターゼ
のアミノ酸配列は、常用される一文字表記により大文字
で、対応するＤＮＡ配列の下に示してある。
【００４９】実施例８ Ａ．ニガーフィターゼのＤＮＡ配列とＡ．テレウスフィ
ターゼのＤＮＡ配列とのキメラ構築物の作製 すべての構築は、Sambrookら (1989) (Molecular cloni
ng, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, NY) によって記載されるような標準的分子
生物学的手法を用いて行った。
ターゼのＤＮＡ配列とのキメラ構築物の作製 すべての構築は、Sambrookら (1989) (Molecular cloni
ng, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, NY) によって記載されるような標準的分子
生物学的手法を用いて行った。
【００５０】EP 420 358に記載されるアスペルギルス・
ニガーフィターゼの最初の１４６アミノ酸をアスペルギ
ルス・テレウス 9A1遺伝子の３２０Ｃ末端アミノ酸に融
合させた。Ａ．ニガーのフィターゼ遺伝子をＰＣＲでク
ローン化したとき、ＡＴＧ開始コドンにNcoI部位を導入
した。Ａ．ニガーフィターゼに存在するイントロンは、
次のプライマー（ここで、斜線はその左側の配列が第１
エクソンの3'末端にハイブリダイズし、その右側の配列
が第２エクソンの5'末端にハイブリダイズすることを示
す）： 5'-AGTCCGGAGGTGACT/CCAGCTAGGAGATAC-3' を用いる部位特異的突然変異誘発（Bio-Rad キット、カ
タログ番号170-3581; Bio-Rad, Richmond, CA, USA）に
より除いた。
ニガーフィターゼの最初の１４６アミノ酸をアスペルギ
ルス・テレウス 9A1遺伝子の３２０Ｃ末端アミノ酸に融
合させた。Ａ．ニガーのフィターゼ遺伝子をＰＣＲでク
ローン化したとき、ＡＴＧ開始コドンにNcoI部位を導入
した。Ａ．ニガーフィターゼに存在するイントロンは、
次のプライマー（ここで、斜線はその左側の配列が第１
エクソンの3'末端にハイブリダイズし、その右側の配列
が第２エクソンの5'末端にハイブリダイズすることを示
す）： 5'-AGTCCGGAGGTGACT/CCAGCTAGGAGATAC-3' を用いる部位特異的突然変異誘発（Bio-Rad キット、カ
タログ番号170-3581; Bio-Rad, Richmond, CA, USA）に
より除いた。
【００５１】Ａ．ニガーフィターゼとＡ．テレウスフィ
ターゼとのキメラ構築物を作製するにあたって、クロー
ニングに役立つようにＡ．ニガーのコーディング配列に
Eco47III部位を導入した。Ｔ３プライマーとともに突然
変異誘発プライマー (5'CGATTC GTA gCG CTG GTA G 3')
を用いるＰＣＲにより、BamHI とEco47IIIで切断した
ＤＮＡ断片を生成した。このBamHI/Eco47III断片を、Ba
mHI/Eco47IIIで切断したp9A1Pst （実施例７）に挿入し
た。図９、１０および１１は、融合構築物のアミノ酸配
列およびそのコーディングＤＮＡ配列を示す。
ターゼとのキメラ構築物を作製するにあたって、クロー
ニングに役立つようにＡ．ニガーのコーディング配列に
Eco47III部位を導入した。Ｔ３プライマーとともに突然
変異誘発プライマー (5'CGATTC GTA gCG CTG GTA G 3')
を用いるＰＣＲにより、BamHI とEco47IIIで切断した
ＤＮＡ断片を生成した。このBamHI/Eco47III断片を、Ba
mHI/Eco47IIIで切断したp9A1Pst （実施例７）に挿入し
た。図９、１０および１１は、融合構築物のアミノ酸配
列およびそのコーディングＤＮＡ配列を示す。
【００５２】実施例９ フィターゼの発現 発現ベクターの構築 Ａ．ニガーにおいて融合構築物を発現させるために、融
合遺伝子がＡ．ニガーの誘導性のグルコアミラーゼ（gl
aA）プロモーターの制御下に置かれる発現カセットを選
んだ。完全なＡ．テレウス 9A1遺伝子の場合は、Ａ．ニ
ードランスの構成性のグリセルアルデヒド-3- ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（gpdA）プロモーターを含む発現
カセットを選んだ。Ａ．ニガー発現用の遺伝子はすべ
て、分泌のためのそれら自身のシグナル配列を持ってい
た。
合遺伝子がＡ．ニガーの誘導性のグルコアミラーゼ（gl
aA）プロモーターの制御下に置かれる発現カセットを選
んだ。完全なＡ．テレウス 9A1遺伝子の場合は、Ａ．ニ
ードランスの構成性のグリセルアルデヒド-3- ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（gpdA）プロモーターを含む発現
カセットを選んだ。Ａ．ニガー発現用の遺伝子はすべ
て、分泌のためのそれら自身のシグナル配列を持ってい
た。
【００５３】ベクター pFPAN1 の構築 Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ（glaA）プロモーター
を、プラスミド pDH33〔Smith ら (1990), Gene 88: 25
9-262 〕から 1960 bpの XhoI/ClaI断片として単離し、
Ａ．ニードランスのtrpCターミネーターの710 bp BamHI
/XbaI 断片を含むpBluescript SK+ ベクター (pBS)〔St
ratagene, La Jolla, CA, USA 〕にクローニングした。
このカセットを含むプラスミドをpGLAC と名づけた。実
施例８に記載される融合遺伝子を、平滑末端化NcoI/Eco
RI断片をプラスミドpGLAC の平滑末端化ClaI部位および
EcoRV 部位に連結させることにより、Ａ．ニガーのglaA
プロモーターの制御下に置いた。制限酵素消化により正
しい方向を確認した。全カセットをKpnI/XbaI 断片とし
て、ウリジン栄養要求性アスペルギルス属における選択
マーカーであるニューロスポラ・クラサ (Neurospora c
rassa)のpyr4遺伝子を持つpUC19 (pUC19-pyr4) (New En
gland Biolabs, GmbH, Schwalbach, BRD) に移し、ベク
ターpFPAN1を得た（図１２を参照；制限部位およびコー
ディング領域を示してある；横線で消されている制限部
位は平滑末端連結部位を示す）。
を、プラスミド pDH33〔Smith ら (1990), Gene 88: 25
9-262 〕から 1960 bpの XhoI/ClaI断片として単離し、
Ａ．ニードランスのtrpCターミネーターの710 bp BamHI
/XbaI 断片を含むpBluescript SK+ ベクター (pBS)〔St
ratagene, La Jolla, CA, USA 〕にクローニングした。
このカセットを含むプラスミドをpGLAC と名づけた。実
施例８に記載される融合遺伝子を、平滑末端化NcoI/Eco
RI断片をプラスミドpGLAC の平滑末端化ClaI部位および
EcoRV 部位に連結させることにより、Ａ．ニガーのglaA
プロモーターの制御下に置いた。制限酵素消化により正
しい方向を確認した。全カセットをKpnI/XbaI 断片とし
て、ウリジン栄養要求性アスペルギルス属における選択
マーカーであるニューロスポラ・クラサ (Neurospora c
rassa)のpyr4遺伝子を持つpUC19 (pUC19-pyr4) (New En
gland Biolabs, GmbH, Schwalbach, BRD) に移し、ベク
ターpFPAN1を得た（図１２を参照；制限部位およびコー
ディング領域を示してある；横線で消されている制限部
位は平滑末端連結部位を示す）。
【００５４】ベクター pPAT1の構築 Ａ．ニードランスのグリセルアルデヒド-3- ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（gpdA）プロモーターを、プラスミ
ド pAN52-1〔Puntら (1987), Gene 56: 117-124 〕から
約2.3 kbのEcoRI/NcoI断片として単離し、pUC19-NcoI
（SmaI部位をNcoI部位で置き換えたpUC19 ）にクローニ
ングし、EcoRI/BamHI 断片として再単離し、そして上記
のtrpCターミネーターを含むpBS にクローニングした。
得られたカセットをpGPDN と名づけた。Ａ．テレウス遺
伝子をNcoI/EcoRI断片として単離し、EcoRI 部位を修復
して平滑末端とした。プラスミドpGPDN をBamHI とNcoI
で切断した。BamHI 部位を修復して平滑末端とした。
Ａ．テレウス遺伝子のNcoI/EcoRI（平滑）断片をgpdAプ
ロモーターとtrpCターミネーターの間にクローニングし
た。発現カセットをKpnI/XbaI 断片として単離し、pUC1
9-pyr4にクローニングしてプラスミドpPAT1 を得た（図
１３を参照；記号の説明については図１２の説明を参照
のこと）。
トデヒドロゲナーゼ（gpdA）プロモーターを、プラスミ
ド pAN52-1〔Puntら (1987), Gene 56: 117-124 〕から
約2.3 kbのEcoRI/NcoI断片として単離し、pUC19-NcoI
（SmaI部位をNcoI部位で置き換えたpUC19 ）にクローニ
ングし、EcoRI/BamHI 断片として再単離し、そして上記
のtrpCターミネーターを含むpBS にクローニングした。
得られたカセットをpGPDN と名づけた。Ａ．テレウス遺
伝子をNcoI/EcoRI断片として単離し、EcoRI 部位を修復
して平滑末端とした。プラスミドpGPDN をBamHI とNcoI
で切断した。BamHI 部位を修復して平滑末端とした。
Ａ．テレウス遺伝子のNcoI/EcoRI（平滑）断片をgpdAプ
ロモーターとtrpCターミネーターの間にクローニングし
た。発現カセットをKpnI/XbaI 断片として単離し、pUC1
9-pyr4にクローニングしてプラスミドpPAT1 を得た（図
１３を参照；記号の説明については図１２の説明を参照
のこと）。
【００５５】アスペルギルス・ニガーにおける融合タン
パク質の発現 Ａ）形質転換 若干の変更を伴う、Ballanceら〔(1983), Biochem. Bio
phys. Res. Commun 112, 284-289〕によって記載される
形質転換プロトコールを使用して、プラスミドpFPAN1で
Ａ．ニガーを形質転換した。
パク質の発現 Ａ）形質転換 若干の変更を伴う、Ballanceら〔(1983), Biochem. Bio
phys. Res. Commun 112, 284-289〕によって記載される
形質転換プロトコールを使用して、プラスミドpFPAN1で
Ａ．ニガーを形質転換した。
【００５６】− ＹＰＤ培地（1%酵母エキス、2%ペプト
ン、2%デキストロース）に１mlあたり106 の胞子を植え
つけ、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間生育させた； − Wero-Lene N ティッシュ (No. 8011.0600 Wernli A
G Verbandstoffabrik,4852 Rothrist, CH) を使って細
胞を回収し、緩衝液 (0.01M スクシネート緩衝液中の0.
8M KCl, 0.05M CaCl2; pH 5.5)で１回洗った； − プロトプラスト調製のため、溶解酵素 (SIGMA L-22
65, St. Louis, MO, USA) のみを使用した； − 細胞を３０℃、１００ｒｐｍで９０分間インキュベ
ートし、濾過 (Wero-Lene N ティッシュ) によりプロト
プラストを分離した； − プロトプラストをＳＴＣ（1Mソルビトール, 0.05M
CaCl2, 0.01M Tris/HCl pH 7.5) で１回洗い、同じ緩衝
液に再懸濁した； − １５０μｌのプロトプラスト（約108/ml）を１０〜
１５μｇのプラスミドＤＮＡと穏やかに混合し、室温で
２５分間インキュベートした； − ポリエチレングリコール (60% PEG 4000, 50mM CaC
l2, 10mM Tris/HCl pH7.5) を３段階（150 μl 、200
μl および900 μl ）で加え、サンプルを室温で２５分
間さらにインキュベートした； − ５mlのＳＴＣを加え、遠心し、プロトプラストを2.
5 mlのＹＧＳ（0.5%酵母エキス、2%グルコース、1.2Mソ
ルビトール）に再懸濁した； − サンプルを３０℃、１００ｒｐｍで２時間インキュ
ベートし、遠心し、プロトプラストを１mlの1.2Mソルビ
トールに再懸濁した； − 形質転換プロトプラストを２０mlの最小再生培地
(１リットルあたり0.2gのアルギニンおよび10mgのニコ
チンアミドを補充した、0.7%アミノ酸不含酵母窒素原基
礎培地、2%グルコース、1Mソルビトール、1.5%寒天、20
mM Tris/HCl pH 7.5) と混合した； − プレートを３０℃で３〜５日間インキュベートし
た。
ン、2%デキストロース）に１mlあたり106 の胞子を植え
つけ、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間生育させた； − Wero-Lene N ティッシュ (No. 8011.0600 Wernli A
G Verbandstoffabrik,4852 Rothrist, CH) を使って細
胞を回収し、緩衝液 (0.01M スクシネート緩衝液中の0.
8M KCl, 0.05M CaCl2; pH 5.5)で１回洗った； − プロトプラスト調製のため、溶解酵素 (SIGMA L-22
65, St. Louis, MO, USA) のみを使用した； − 細胞を３０℃、１００ｒｐｍで９０分間インキュベ
ートし、濾過 (Wero-Lene N ティッシュ) によりプロト
プラストを分離した； − プロトプラストをＳＴＣ（1Mソルビトール, 0.05M
CaCl2, 0.01M Tris/HCl pH 7.5) で１回洗い、同じ緩衝
液に再懸濁した； − １５０μｌのプロトプラスト（約108/ml）を１０〜
１５μｇのプラスミドＤＮＡと穏やかに混合し、室温で
２５分間インキュベートした； − ポリエチレングリコール (60% PEG 4000, 50mM CaC
l2, 10mM Tris/HCl pH7.5) を３段階（150 μl 、200
μl および900 μl ）で加え、サンプルを室温で２５分
間さらにインキュベートした； − ５mlのＳＴＣを加え、遠心し、プロトプラストを2.
5 mlのＹＧＳ（0.5%酵母エキス、2%グルコース、1.2Mソ
ルビトール）に再懸濁した； − サンプルを３０℃、１００ｒｐｍで２時間インキュ
ベートし、遠心し、プロトプラストを１mlの1.2Mソルビ
トールに再懸濁した； − 形質転換プロトプラストを２０mlの最小再生培地
(１リットルあたり0.2gのアルギニンおよび10mgのニコ
チンアミドを補充した、0.7%アミノ酸不含酵母窒素原基
礎培地、2%グルコース、1Mソルビトール、1.5%寒天、20
mM Tris/HCl pH 7.5) と混合した； − プレートを３０℃で３〜５日間インキュベートし
た。
【００５７】Ｂ）発現 単一の形質転換体を単離し、精製し、そして融合タンパ
ク質の過剰生産について調べた。１００mlのＭ２５培地
〔１リットルあたり70g マルトデキストリン (Glucidex
17D, Sugro Basel, CH), 12.5g 酵母エキス, 25g カゼ
イン加水分解産物, 2g KH2PO4, 2g K2SO4, 0.5g MgSO4.
7H2O, 0.03g ZnCl2, 0.02g CaCl2, 0.05g MnSO4.4H2O,
0.05g FeSO4; pH 5.6 〕に形質転換体FPAN1#11, #13, #
16, #E25, #E30, #E31のそれぞれからの106/mlの胞子を
植えつけ、３０℃、２７０ｒｐｍで５日間インキュベー
トした。上澄み液を集め、活性を測定した。融合タンパ
ク質はｐＨ２．５で基質としてのフィチン酸に対して最
大活性を示し、一方、基質として4-ニトロフェニルホス
フェートを用いた場合は、ｐＨ２．５および５．０にお
いて最大活性を示した（表１）。
ク質の過剰生産について調べた。１００mlのＭ２５培地
〔１リットルあたり70g マルトデキストリン (Glucidex
17D, Sugro Basel, CH), 12.5g 酵母エキス, 25g カゼ
イン加水分解産物, 2g KH2PO4, 2g K2SO4, 0.5g MgSO4.
7H2O, 0.03g ZnCl2, 0.02g CaCl2, 0.05g MnSO4.4H2O,
0.05g FeSO4; pH 5.6 〕に形質転換体FPAN1#11, #13, #
16, #E25, #E30, #E31のそれぞれからの106/mlの胞子を
植えつけ、３０℃、２７０ｒｐｍで５日間インキュベー
トした。上澄み液を集め、活性を測定した。融合タンパ
ク質はｐＨ２．５で基質としてのフィチン酸に対して最
大活性を示し、一方、基質として4-ニトロフェニルホス
フェートを用いた場合は、ｐＨ２．５および５．０にお
いて最大活性を示した（表１）。
【００５８】Ｃ）活性試験 ａ）フィチン酸 １mlの酵素反応液は0.5ml の透析上澄み液（必要に応じ
て希釈）と5.4mM のフィチン酸 (SIGMA P-3168) を含ん
でいた。酵素反応はそれぞれ0.2M酢酸ナトリウム緩衝液
pH 5.0および0.2Mグリシン緩衝液pH 2.5中で行った。サ
ンプルを３７℃で１５分間インキュベートした。１mlの
15％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を加えることにより反応
を停止させた。
て希釈）と5.4mM のフィチン酸 (SIGMA P-3168) を含ん
でいた。酵素反応はそれぞれ0.2M酢酸ナトリウム緩衝液
pH 5.0および0.2Mグリシン緩衝液pH 2.5中で行った。サ
ンプルを３７℃で１５分間インキュベートした。１mlの
15％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を加えることにより反応
を停止させた。
【００５９】呈色反応のために、反応を停止させた0.1
mlのサンプルを0.9 mlの蒸留水で希釈し、１mlの試薬溶
液（３容量の1M H2SO4, １容量の2.5% (NH4)6Mo7O24,１
容量の10% アスコルビン酸）と混合した。サンプルを５
０℃で２０分間インキュベートし、青色を８２０ｎｍで
分光光度分析により測定した。この試験はホスフェート
の放出に基づくので、ホスフェート標準曲線（１１〜４
５nmol／ml）を用いてサンプルの活性を測定した。
mlのサンプルを0.9 mlの蒸留水で希釈し、１mlの試薬溶
液（３容量の1M H2SO4, １容量の2.5% (NH4)6Mo7O24,１
容量の10% アスコルビン酸）と混合した。サンプルを５
０℃で２０分間インキュベートし、青色を８２０ｎｍで
分光光度分析により測定した。この試験はホスフェート
の放出に基づくので、ホスフェート標準曲線（１１〜４
５nmol／ml）を用いてサンプルの活性を測定した。
【００６０】ｂ）4-ニトロフェニルホスフェート １mlの酵素反応液は100 μl の透析上澄み液（必要に応
じて希釈）と1.7mM の4-ニトロフェニルホスフェート
(Merck, 6850, Darmstadt, BRD)を含んでいた。酵素反
応はそれぞれ0.2M酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0および0.
2Mグリシン緩衝液pH 2.5中で行った。サンプルを３７℃
で１５分間インキュベートした。１mlの15％ＴＣＡを加
えて反応を停止させた。酵素活性の測定には、上記のプ
ロトコールを使用した。
じて希釈）と1.7mM の4-ニトロフェニルホスフェート
(Merck, 6850, Darmstadt, BRD)を含んでいた。酵素反
応はそれぞれ0.2M酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0および0.
2Mグリシン緩衝液pH 2.5中で行った。サンプルを３７℃
で１５分間インキュベートした。１mlの15％ＴＣＡを加
えて反応を停止させた。酵素活性の測定には、上記のプ
ロトコールを使用した。
【００６１】
【表１】 表１ 基 質 フィチン酸 *4-ニトロフェニルホスフェート形質転換体 pH 5.0 pH 2.5 pH 5.0 pH 2.5 A.ニガー1) 0.2 1 1 2 FPAN1 #11 6 49 173 399 FPAN1 #13 2 21 60 228 FPAN1 #16 1 16 46 153 FPAN1 #E25 3 26 74 228 FPAN1 #E30 3 43 157 347 FPAN1 #E31 3 39 154 271 * 単位／ml：１単位＝１μmol 放出ホスフェート／分（３７℃）1) 非形質転換体
【００６２】アスペルギルス・ニガーにおけるアスペル
ギルス・テレウス 9A1遺伝子の発現 Ａ．ニガーNW205 を上記のようにプラスミドpPAT1 で形
質転換した。単一の形質転換体を単離し、精製し、Ａ．
テレウスタンパク質の過剰発現についてスクリーニング
した。５０mlのＹＰＤ培地に、形質転換体 PAT1#3, #1
0, #11, #13, #16 のそれぞれからの106/mlの胞子を植
えつけ、３０℃、２７０ｒｐｍで３日間インキュベート
した。上澄み液を集め、活性を上記のように測定した。
ただし、酵素反応のｐＨが違っていた。この酵素は、基
質としてフィチン酸を用いた場合はｐＨ５．５で、基質
として4-ニトロフェニルホスフェートを用いた場合はｐ
Ｈ３．５でその主要活性を示した（表２）。
ギルス・テレウス 9A1遺伝子の発現 Ａ．ニガーNW205 を上記のようにプラスミドpPAT1 で形
質転換した。単一の形質転換体を単離し、精製し、Ａ．
テレウスタンパク質の過剰発現についてスクリーニング
した。５０mlのＹＰＤ培地に、形質転換体 PAT1#3, #1
0, #11, #13, #16 のそれぞれからの106/mlの胞子を植
えつけ、３０℃、２７０ｒｐｍで３日間インキュベート
した。上澄み液を集め、活性を上記のように測定した。
ただし、酵素反応のｐＨが違っていた。この酵素は、基
質としてフィチン酸を用いた場合はｐＨ５．５で、基質
として4-ニトロフェニルホスフェートを用いた場合はｐ
Ｈ３．５でその主要活性を示した（表２）。
【００６３】
【表２】 表２ 基 質 フィチン酸 *4-ニトロフェニルホスフェート形質転換体 pH 5.5 pH 3.5 pH 5.5 pH 3.5 A.ニガー1) 0 0 0 0.1 PAT1 #3 10 0 0.2 0.7 PAT1 #10 9 0 0.2 0.8 PAT1 #11 5 0 0.1 0.5 PAT1 #13 9 0 0.2 0.7 PAT1 #16 5 0 0.1 0.5 * 単位／ml：１単位＝１μmol 放出ホスフェート／分（３７℃）1) 非形質転換体
【００６４】実施例１０ アスペルギルス・ニガーNW205 形質転換体の発酵 Ａ）形質転換体 FPAN1#11 振とうフラスコ中の前培養培地〔１リットルあたり30g
マルトデキストリン (Glucidex 17D), 10g酵母エキス,
10g カゼイン加水分解産物, 1g KH2PO4, 0.5gMgSO4.7H2
O, 3g Tween 80; pH 5.5 〕に106/mlの胞子を植えつ
け、３４℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートし
た。
マルトデキストリン (Glucidex 17D), 10g酵母エキス,
10g カゼイン加水分解産物, 1g KH2PO4, 0.5gMgSO4.7H2
O, 3g Tween 80; pH 5.5 〕に106/mlの胞子を植えつ
け、３４℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートし
た。
【００６５】１０リットルの発酵槽に前培養物を１：１
００の最終希釈で植えつけた。バッチ式発酵は最低２５
％の自動制御溶存酸素濃度（ｐＯ2 ≧２５％）でもって
３０℃で行った。ｐＨは5M NaOH による自動滴定で３．
０に維持した。発酵用の培地は、１リットルあたり35g
マルトデキストリン, 9.4g酵母エキス, 18.7g カゼイン
加水分解産物, 2g KH2PO4, 2g K2SO4, 0.5g MgSO4.7H
2O, 0.03g ZnCl2, 0.02g CaCl2, 0.05g MnSO4.4H2O, 0.
05g FeSO4; pH 5.6 であった。
００の最終希釈で植えつけた。バッチ式発酵は最低２５
％の自動制御溶存酸素濃度（ｐＯ2 ≧２５％）でもって
３０℃で行った。ｐＨは5M NaOH による自動滴定で３．
０に維持した。発酵用の培地は、１リットルあたり35g
マルトデキストリン, 9.4g酵母エキス, 18.7g カゼイン
加水分解産物, 2g KH2PO4, 2g K2SO4, 0.5g MgSO4.7H
2O, 0.03g ZnCl2, 0.02g CaCl2, 0.05g MnSO4.4H2O, 0.
05g FeSO4; pH 5.6 であった。
【００６６】これらの条件下で３日後に得られた酵素活
性は、基質としてフィチン酸を用いた場合がｐＨ２．５
およびｐＨ５．０でそれぞれ３５単位／mlおよび１６単
位／mlであり、基質として4-ニトロフェニルホスフェー
トを用いた場合がｐＨ２．５およびｐＨ５．０でそれぞ
れ２９５単位／mlおよび９０単位／mlであった。
性は、基質としてフィチン酸を用いた場合がｐＨ２．５
およびｐＨ５．０でそれぞれ３５単位／mlおよび１６単
位／mlであり、基質として4-ニトロフェニルホスフェー
トを用いた場合がｐＨ２．５およびｐＨ５．０でそれぞ
れ２９５単位／mlおよび９０単位／mlであった。
【００６７】Ｂ）形質転換体 PAT1#11 前培養、発酵槽の植えつけ、および発酵培地は上記のと
おりであったが、ｐＨを5M NaOH による自動滴定で４．
５に保持した。これらの条件下で４日後に得られた酵素
活性は、基質としてフィチン酸を用いた場合がｐＨ５．
５で１７．５単位／mlであり、基質として4-ニトロフェ
ニルホスフェートを用いた場合がｐＨ３．５で２単位／
mlであった。
おりであったが、ｐＨを5M NaOH による自動滴定で４．
５に保持した。これらの条件下で４日後に得られた酵素
活性は、基質としてフィチン酸を用いた場合がｐＨ５．
５で１７．５単位／mlであり、基質として4-ニトロフェ
ニルホスフェートを用いた場合がｐＨ３．５で２単位／
mlであった。
【００６８】実施例１１ アスペルギルス・テレウス (CBS 220.95) のフィターゼ
遺伝子のＰＣＲ断片の単離 アスペルギルス・テレウス (CBS 220.95) のＤＮＡを用
いて、断片のＰＣＲ増幅のために２つの異なるプライマ
ー対を使用した。用いたプライマーを下記の表に示す。 増幅断片 プライマー オリゴヌクレオチド配列 (5'から3') ─────────────────────────────────── ８プラス９ ８ ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA ───────────────────────────── アミノ酸 254-259：MDMCSF ───────────────────────────── 約150 bp ９ TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA ────────────────────────────── アミノ酸 296-301：YGHGAG ─────────────────────────────────── 10プラス11 10 TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA ───────────────────────────── アミノ酸 349-354：YADFSH ───────────────────────────── 約250 bp 11 CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C ───────────────────────────── アミノ酸 416-422：RVLVNDR ──────────────────────────────────
遺伝子のＰＣＲ断片の単離 アスペルギルス・テレウス (CBS 220.95) のＤＮＡを用
いて、断片のＰＣＲ増幅のために２つの異なるプライマ
ー対を使用した。用いたプライマーを下記の表に示す。 増幅断片 プライマー オリゴヌクレオチド配列 (5'から3') ─────────────────────────────────── ８プラス９ ８ ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA ───────────────────────────── アミノ酸 254-259：MDMCSF ───────────────────────────── 約150 bp ９ TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA ────────────────────────────── アミノ酸 296-301：YGHGAG ─────────────────────────────────── 10プラス11 10 TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA ───────────────────────────── アミノ酸 349-354：YADFSH ───────────────────────────── 約250 bp 11 CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C ───────────────────────────── アミノ酸 416-422：RVLVNDR ──────────────────────────────────
【００６９】プライマー８および１０はセンスプライマ
ーであり、プライマー９および１１はアンチセンスプラ
イマーである。これらのプライマーはアスペルギルス・
ニガー遺伝子のコーディング配列の表示した部分に相当
する。用いた組合せはプライマー８プラス９および１０
プラス１１である。Clontech (Palo Alto, CA, USA)か
らのTaq-Start 抗体キットを製造会社のプロトコールに
従って使用した。８プラス９のプライマー濃度は０．２
ｍＭとし、１０プラス１１のプライマー濃度は１ｍＭと
した。増幅のためにタッチ−ダウン (touch-down) ＰＣ
Ｒを採用した〔Don, R.H. ら(1991), Nucleic Acids Re
s. 19, 4008 〕。初めに、ＤＮＡを９５℃で３分間変性
した。その後、次のアニーリング温度：６０℃、５９
℃、５８℃、５７℃、５６℃、５５℃、５４℃、５３
℃、５２℃および５１℃のそれぞれで１分のアニーリン
グ時間で２サイクルを実施した。アニーリング前にイン
キュベーションを９５℃で１分間行い、アニーリング後
に伸長反応を７２℃で３０秒間行った。サイクル２１か
ら３５は次のように行った。すなわち、９５℃で１分の
変性、５０℃で１分のアニーリング、および７２℃で３
０秒の伸長反応。
ーであり、プライマー９および１１はアンチセンスプラ
イマーである。これらのプライマーはアスペルギルス・
ニガー遺伝子のコーディング配列の表示した部分に相当
する。用いた組合せはプライマー８プラス９および１０
プラス１１である。Clontech (Palo Alto, CA, USA)か
らのTaq-Start 抗体キットを製造会社のプロトコールに
従って使用した。８プラス９のプライマー濃度は０．２
ｍＭとし、１０プラス１１のプライマー濃度は１ｍＭと
した。増幅のためにタッチ−ダウン (touch-down) ＰＣ
Ｒを採用した〔Don, R.H. ら(1991), Nucleic Acids Re
s. 19, 4008 〕。初めに、ＤＮＡを９５℃で３分間変性
した。その後、次のアニーリング温度：６０℃、５９
℃、５８℃、５７℃、５６℃、５５℃、５４℃、５３
℃、５２℃および５１℃のそれぞれで１分のアニーリン
グ時間で２サイクルを実施した。アニーリング前にイン
キュベーションを９５℃で１分間行い、アニーリング後
に伸長反応を７２℃で３０秒間行った。サイクル２１か
ら３５は次のように行った。すなわち、９５℃で１分の
変性、５０℃で１分のアニーリング、および７２℃で３
０秒の伸長反応。
【００７０】２つの異なるＰＣＲ断片が得られた。これ
らのＤＮＡ配列およびこれらとアスペルギルス・テレウ
ス 9A1のフィターゼ遺伝子の関連部分との比較を図１４
に示す。アスペルギルス・テレウス 9A1のフィターゼ遺
伝子の関連部分は“9a1 ”（上線）に、そしてアスペル
ギルス・テレウス CBS 220.95 のＰＣＲ断片は“aterr2
1 ”（下線）に示してある。パネルＡ：プライマー対８
プラス９により得られた断片（aterr21 ）。パネルＢ：
プライマー対１０プラス１１により得られた断片（ater
r58 ）。アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 のＤＮ
Ａ配列（上線）がアスペルギルス・テレウス 9A1のＤＮ
Ａ配列（下線）と比較される。パネルＡ：aterr21 断片
中の太字のｇｃ配列（塩基１６および１７）はおそらく
ｃｇであるだろう（ＤＮＡ配列決定が不確定）。パネル
Ｂ：aterr58 ＰＣＲ断片の２６位のｘは４種のヌクレオ
チドのいずれかを表す。
らのＤＮＡ配列およびこれらとアスペルギルス・テレウ
ス 9A1のフィターゼ遺伝子の関連部分との比較を図１４
に示す。アスペルギルス・テレウス 9A1のフィターゼ遺
伝子の関連部分は“9a1 ”（上線）に、そしてアスペル
ギルス・テレウス CBS 220.95 のＰＣＲ断片は“aterr2
1 ”（下線）に示してある。パネルＡ：プライマー対８
プラス９により得られた断片（aterr21 ）。パネルＢ：
プライマー対１０プラス１１により得られた断片（ater
r58 ）。アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 のＤＮ
Ａ配列（上線）がアスペルギルス・テレウス 9A1のＤＮ
Ａ配列（下線）と比較される。パネルＡ：aterr21 断片
中の太字のｇｃ配列（塩基１６および１７）はおそらく
ｃｇであるだろう（ＤＮＡ配列決定が不確定）。パネル
Ｂ：aterr58 ＰＣＲ断片の２６位のｘは４種のヌクレオ
チドのいずれかを表す。
【００７１】実施例１２ 非ストリンジェントおよびストリンジェント洗浄条件下
での交差ハイブリダイゼーション 表３に示した各菌株のゲノムＤＮＡ５μｇを、ＤＮＡ１
μｇにつき４単位のHindIII またはPstIとともに３７℃
で４時間インキュベートした。消化後、混合物をフェノ
ールで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。次い
で、サンプルを０．８％アガロースゲルで分析した。移
行溶液として1M NaCl を含有する0.4M NaOH を用いてＤ
ＮＡをニトラン膜 (Schleicher & Schuell, Keene, NH,
USA) に移行させた。ハイブリダイゼーションは４２℃
で１８時間行った。ハイブリダイゼーション溶液は、50
% ホルムアミド、１％ＳＤＳ、10% デキストラン硫酸、
４ｘＳＳＰＥ (１ｘＳＳＰＥ＝0.18M NaCl, 1mM EDTA,
10mM NaH2PO4, pH7.4)、0.5%blotto (H2O中の粉ミルク)
および0.5mg/mlサケ精子ＤＮＡを含んでいた。膜を非
ストリンジェント条件下で洗い、最後の最もストリンジ
ェントな条件としては、0.1%ＳＤＳを含有する 0.1ｘＳ
ＳＰＥ中、室温で３０分のインキュベーションを採用し
た。用いたプローブ（約109dpm／μg DNA の比活性で標
識したもの）は、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myce
lio. thermo.) ；アスペルギルス・ニードランス (Aspe
rg. nidul.) ；アスペルギルス・フミガツス (Asperg.
fumig.)；アスペルギルス・テレウス 9A1 (Asperg. ter
reus 9A1)；タラロミセス・サーモフィルス (Talarom.
thermo.) のゲノムＤＮＡを用いてプライマー８プラス
９（実施例１１参照）により生成されたＰＣＲ断片であ
った。MT2 ゲノムプローブはランダムプライミング（Ph
armacia 社によって提供されたプロトコールに従う）に
より得られたもので、Mycelio. thermo.フィターゼ遺伝
子のＮ末端の上流のBspEI 部位からＣ末端のPvuII 部位
までの1410bp (2068−3478位) にわたる。AT2 ゲノムプ
ローブはランダムプライミングにより得られたもので、
Asperg. terreus 9A1 フィターゼ遺伝子のApaI部位から
NdeI部位までの1365bp (491 −1856位) にわたる。AN2
DNA プローブはランダムプライミングにより得られ、As
perg.niger 遺伝子 (EP 420 358) の完全なコーディン
グ配列 (1404bp) にわたる。結果を表３に示す〔“＊”
は非特異的２０ｋｂ断片に相当する弱いシグナルを除
外；タラロミセス・サーモフィルスからのＰＣＲ断片を
用いてアスペルギルス・ニガー由来のＤＮＡにおいて見
られた２０ｋｂにおける非常に弱い交差ハイブリダイゼ
ーションシグナルの場合、このシグナルは、フィターゼ
遺伝子を含むと予期される１０ｋｂのHindIII 断片と著
しく異なるから、非特異的である；“**”はＤＮＡの部
分消化産物によるシグナル〕。
での交差ハイブリダイゼーション 表３に示した各菌株のゲノムＤＮＡ５μｇを、ＤＮＡ１
μｇにつき４単位のHindIII またはPstIとともに３７℃
で４時間インキュベートした。消化後、混合物をフェノ
ールで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。次い
で、サンプルを０．８％アガロースゲルで分析した。移
行溶液として1M NaCl を含有する0.4M NaOH を用いてＤ
ＮＡをニトラン膜 (Schleicher & Schuell, Keene, NH,
USA) に移行させた。ハイブリダイゼーションは４２℃
で１８時間行った。ハイブリダイゼーション溶液は、50
% ホルムアミド、１％ＳＤＳ、10% デキストラン硫酸、
４ｘＳＳＰＥ (１ｘＳＳＰＥ＝0.18M NaCl, 1mM EDTA,
10mM NaH2PO4, pH7.4)、0.5%blotto (H2O中の粉ミルク)
および0.5mg/mlサケ精子ＤＮＡを含んでいた。膜を非
ストリンジェント条件下で洗い、最後の最もストリンジ
ェントな条件としては、0.1%ＳＤＳを含有する 0.1ｘＳ
ＳＰＥ中、室温で３０分のインキュベーションを採用し
た。用いたプローブ（約109dpm／μg DNA の比活性で標
識したもの）は、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myce
lio. thermo.) ；アスペルギルス・ニードランス (Aspe
rg. nidul.) ；アスペルギルス・フミガツス (Asperg.
fumig.)；アスペルギルス・テレウス 9A1 (Asperg. ter
reus 9A1)；タラロミセス・サーモフィルス (Talarom.
thermo.) のゲノムＤＮＡを用いてプライマー８プラス
９（実施例１１参照）により生成されたＰＣＲ断片であ
った。MT2 ゲノムプローブはランダムプライミング（Ph
armacia 社によって提供されたプロトコールに従う）に
より得られたもので、Mycelio. thermo.フィターゼ遺伝
子のＮ末端の上流のBspEI 部位からＣ末端のPvuII 部位
までの1410bp (2068−3478位) にわたる。AT2 ゲノムプ
ローブはランダムプライミングにより得られたもので、
Asperg. terreus 9A1 フィターゼ遺伝子のApaI部位から
NdeI部位までの1365bp (491 −1856位) にわたる。AN2
DNA プローブはランダムプライミングにより得られ、As
perg.niger 遺伝子 (EP 420 358) の完全なコーディン
グ配列 (1404bp) にわたる。結果を表３に示す〔“＊”
は非特異的２０ｋｂ断片に相当する弱いシグナルを除
外；タラロミセス・サーモフィルスからのＰＣＲ断片を
用いてアスペルギルス・ニガー由来のＤＮＡにおいて見
られた２０ｋｂにおける非常に弱い交差ハイブリダイゼ
ーションシグナルの場合、このシグナルは、フィターゼ
遺伝子を含むと予期される１０ｋｂのHindIII 断片と著
しく異なるから、非特異的である；“**”はＤＮＡの部
分消化産物によるシグナル〕。
【００７２】ストリンジェント洗浄条件による交差ハイ
ブリダイゼーションのために、膜を0.1%ＳＤＳを含有す
る 0.1ｘＳＳＰＥ中で６５℃、３０分間さらに洗浄し
た。結果を表４に示す〔(1) 10.5kbのHindIII 断片だけ
が依然として検出され、6.5kbのHindIII 断片は消失す
る（表３を参照）〕。
ブリダイゼーションのために、膜を0.1%ＳＤＳを含有す
る 0.1ｘＳＳＰＥ中で６５℃、３０分間さらに洗浄し
た。結果を表４に示す〔(1) 10.5kbのHindIII 断片だけ
が依然として検出され、6.5kbのHindIII 断片は消失す
る（表３を参照）〕。
【００７３】
【表３】
【００７４】
【００７５】no：検出されない
【００７６】
【表４】
【００７７】yes ：検出された
【図１】アスペルギルス・テレウス9A-1株由来のフィタ
ーゼのアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配列
を示す。
ーゼのアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配列
を示す。
【図２】図１に示したアミノ酸配列およびそのコーディ
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
【図３】ミセリオフトラ・サーモフィラ由来のフィター
ゼのアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配列を
示す。
ゼのアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配列を
示す。
【図４】図３に示したアミノ酸配列およびそのコーディ
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
【図５】Ａ．アスペルギルス・テレウスのＤＮＡの制限
地図を示す。Ｂ．ミセリオフトラ・サーモフィラのＤＮ
Ａの制限地図を示す。
地図を示す。Ｂ．ミセリオフトラ・サーモフィラのＤＮ
Ａの制限地図を示す。
【図６】タラロミセス・サーモフィルス由来のフィター
ゼの一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ
配列を示す。
ゼの一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ
配列を示す。
【図７】アスペルギルス・フミガツス由来のフィターゼ
の一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配
列を示す。
の一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配
列を示す。
【図８】アスペルギルス・ニードランス由来のフィター
ゼの一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ
配列を示す。
ゼの一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ
配列を示す。
【図９】Ａ．ニガーフィターゼとＡ．テレウスフィター
ゼとの融合構築物のアミノ酸配列およびそのコーディン
グＤＮＡ配列を示す。
ゼとの融合構築物のアミノ酸配列およびそのコーディン
グＤＮＡ配列を示す。
【図10】図９に示したアミノ酸配列およびそのコーディ
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
【図11】図10に示したアミノ酸配列およびそのコーディ
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
ングＤＮＡ配列の続きを示す。
【図12】ベクター pFPAN1 の模式図である。
【図13】ベクター pPAT1の模式図である。
【図14】Ａ．アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 の
フィターゼ遺伝子のＰＣＲ断片(aterr21)とアスペルギ
ルス・テレウス 9A1の関連部分 (9a1)との比較を示す。 Ｂ．アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 のフィター
ゼ遺伝子のＰＣＲ断片(aterr58)とアスペルギルス・テ
レウス 9A1の関連部分 (9a1)との比較を示す。
フィターゼ遺伝子のＰＣＲ断片(aterr21)とアスペルギ
ルス・テレウス 9A1の関連部分 (9a1)との比較を示す。 Ｂ．アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 のフィター
ゼ遺伝子のＰＣＲ断片(aterr58)とアスペルギルス・テ
レウス 9A1の関連部分 (9a1)との比較を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/15 8828−4Ｂ 9/16 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:685） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 デイヴィッド ミッチェル スイス国 シーエイチ−4147 アエシュ クントマンヴェーク ２エイ番地
Claims (25)
- 【請求項１】 アクロフィアロホラ・レービス (Acroph
ialophora levis)、アスペルギルス・テレウス (Asperg
illus terreus)、アスペルギルス・フミガツス (Asperg
illus fumigatus)、アスペルギルス・ニードランス (As
pergillus nidulans) 、アスペルギルス・ソヤ (Asperg
illus sojae)、カルカリスポリエラ・サーモフィラ (Ca
lcarisporiella thermophila) 、カエトミウム・レクト
ピリウム (Chaetomium rectopilium) 、コリナスクス・
サーモフィルス (Corynascus thermophilus)、フミコラ
sp. (Humicola sp.) 、ミセリア・ステリリア (Myceli
a sterilia) 、ミロコッカム・サーモフィルム (Myroco
ccum thermophilum)、ミセリオフトラ・サーモフィラ
(Myceliophthora thermophila) 、リゾムコール・ミエ
ヘイ (Rhizomucor miehei)、スポロトリクム・セルロフ
ィルム (Sporotrichum cellulophilum) 、スポロトリク
ム・サーモフィレ (Sporotrichum thermophile) 、スキ
タリジウム・インドネシクム (Scytalidium indonesicu
m)およびタラロミセス・サーモフィルス (Talaromyces
thermophilus) より成る群から選ばれる真菌に由来す
る、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、またはフィターゼ活性をなおも有する該ポ
リペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 真菌がアクロフィアロホラ・レービス、
アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニード
ランス、アスペルギルス・テレウス、カルカリスポリエ
ラ・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コ
リナスクス・サーモフィルス、スポロトリクム・セルロ
フィルム、スポロトリクム・サーモフィレ、ミセリア・
ステリリア、ミセリオフトラ・サーモフィラおよびタラ
ロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる、請
求項１に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 真菌がアスペルギルス・テレウス、ミセ
リオフトラ・サーモフィラ、アスペルギルス・フミガツ
ス、アスペルギルス・ニードランスおよびタラロミセス
・サーモフィルスより成る群から選ばれる、請求項２に
記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 次のＤＮＡ配列： (a) 図１および２のＤＮＡ配列またはその相補鎖、 (b) 標準条件下で(a) に規定した配列とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列、 (c) 遺伝暗号の縮重のため(a) または(b) の配列とハイ
ブリダイズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコー
ドされるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および (d) (a) 、(b) または(c) に規定したＤＮＡ配列の断片
であるＤＮＡ配列、より成る群から選ばれる、フィター
ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 次のＤＮＡ配列： (a) 図３および４のＤＮＡ配列またはその相補鎖、 (b) 標準条件下で(a) に規定した配列とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列、 (c) 遺伝暗号の縮重のため(a) または(b) の配列とハイ
ブリダイズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコー
ドされるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および (d) (a) 、(b) または(c) に規定したＤＮＡ配列の断片
であるＤＮＡ配列、より成る群から選ばれる、フィター
ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 次のＤＮＡ配列： (a) 図６、図７、図８および図１４のＤＮＡ配列のうち
の１つを含むＤＮＡ配列またはその相補鎖、 (b) 標準条件下で(a) に規定した配列とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列、 (c) 遺伝暗号の縮重のため(a) または(b) の配列とハイ
ブリダイズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコー
ドされるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および (d) (a) 、(b) または(c) に規定したＤＮＡ配列の断片
であるＤＮＡ配列、より成る群から選ばれる、フィター
ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項７】 タラロミセス・サーモフィルスから単離
可能な図６のＤＮＡ配列、アスペルギルス・フミガツス
から単離可能な図７のＤＮＡ配列、アスペルギルス・ニ
ードランスから単離可能な図８のＤＮＡ配列、およびア
スペルギルス・テレウス (CBS 220.95) から単離可能な
図１４のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列より成る群から選
ばれる、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列、またはその縮重変異体もしくは均等物
であるＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 フィターゼ活性を有するポリペプチドを
コードし、かつ真菌に由来する、請求項４〜６のいずれ
か１つに記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項９】 真菌が請求項１、２または３に規定した
群から選ばれるものである、請求項８に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項10】 請求項１〜３のいずれか１つに規定した
真菌から単離されたＤＮＡおよび次のＰＣＲプライマー
対：センスプライマーとしての “ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA” および アンチセンスプライマーとしての “TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA” を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条件下
でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項11】 アスペルギルス・テレウス (CBS 220.9
5) から単離されたＤＮＡおよび次の２つのＰＣＲプラ
イマー対： (a) センスプライマーとしての “ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA” および アンチセンスプライマーとしての “TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”、な
らびに (b) センスプライマーとしての “TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA” およ
び アンチセンスプライマーとしての “CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C ” を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条件下
でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項12】 請求項１〜１１のいずれか１つに記載の
ＤＮＡ配列の断片を含有する、フィターゼ活性を有する
キメラ構築物をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項13】 キメラ構築物がアスペルギルス・ニガー
(Aspergillus niger)フィターゼの断片をそのＮ末端で
アスペルギルス・テレウスフィターゼの断片のＣ末端に
融合させたものである、請求項１２に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項14】 図９、１０および１１に示した特定のヌ
クレオチド配列を有する請求項１３に記載のＤＮＡ配列
およびその縮重変異体または均等物。 - 【請求項15】 コードされるポリペプチドがフィターゼ
である、請求項１〜１４のいずれか１つに記載のＤＮＡ
配列。 - 【請求項16】 請求項１〜１５のいずれか１つに記載の
ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。 - 【請求項17】 請求項１〜１５のいずれか１つに記載の
ＤＮＡ配列を含有するベクター。 - 【請求項18】 前記のＤＮＡ配列を細菌、真菌または酵
母宿主において発現させるのに適している、請求項１７
に記載のベクター。 - 【請求項19】 請求項１〜１５のいずれか１つに記載の
ＤＮＡ配列または請求項１７もしくは１８に記載のベク
ターにより形質転換された細菌、真菌または酵母宿主。 - 【請求項20】 １種以上の請求項１６に記載のポリペプ
チドを含有する複合食品または飼料。 - 【請求項21】 請求項１９に記載の形質転換した細菌ま
たは宿主細胞を適当な培養条件下で培養し、そして請求
項１６に記載のポリペプチドをそこから回収することを
特徴とする、請求項１６に記載のポリペプチドの生産方
法。 - 【請求項22】 請求項２１に記載の方法によって生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項23】 複合食品または飼料の諸成分を１種以上
の請求項１６に記載のポリペプチドと混合することから
なる、複合食品または飼料の調製方法。 - 【請求項24】 動物に、請求項２０に記載の複合飼料
を、該飼料中に含まれるフィチン酸 (phytate)をイノシ
トールと無機リン酸に変換するのに有効な量で与えるこ
とを特徴とする、動物肥料中のフィチン酸のレベルを低
下させる方法。 - 【請求項25】 フィチン酸をイノシトールリン酸、イノ
シトールおよび無機リン酸に変換するための請求項１６
に記載のポリペプチドの使用方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH94810228:0 | 1994-04-25 | ||
| EP94810228 | 1994-04-25 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001074974A Division JP3382228B2 (ja) | 1994-04-25 | 2001-03-15 | 耐熱性フィターゼをコードするｄｎａを得る方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856676A true JPH0856676A (ja) | 1996-03-05 |
| JP3281508B2 JP3281508B2 (ja) | 2002-05-13 |
Family
ID=8218243
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10141395A Expired - Lifetime JP3281508B2 (ja) | 1994-04-25 | 1995-04-25 | 耐熱性フィターゼ |
| JP2001074974A Expired - Lifetime JP3382228B2 (ja) | 1994-04-25 | 2001-03-15 | 耐熱性フィターゼをコードするｄｎａを得る方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001074974A Expired - Lifetime JP3382228B2 (ja) | 1994-04-25 | 2001-03-15 | 耐熱性フィターゼをコードするｄｎａを得る方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0684313B1 (ja) |
| JP (2) | JP3281508B2 (ja) |
| CN (2) | CN1058524C (ja) |
| AT (1) | ATE332378T1 (ja) |
| DE (1) | DE69535097T2 (ja) |
| DK (1) | DK0684313T3 (ja) |
| ES (1) | ES2268687T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001145480A (ja) * | 1999-10-11 | 2001-05-29 | F Hoffmann La Roche Ag | 連続発酵工程 |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6699704B1 (en) | 1994-04-25 | 2004-03-02 | Roche Vitamins Inc. | Heat tolerant phytases |
| US6358722B1 (en) | 1994-04-25 | 2002-03-19 | Roche Vitamins, Inc. | Heat tolerant phytases |
| WO1997035016A1 (en) * | 1996-03-18 | 1997-09-25 | Novo Nordisk Biotech Inc | Polypeptides having phytase activity and nucleic acids encoding same |
| US5985605A (en) * | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms |
| US5939303A (en) * | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | Phytases of ruminal microorganisms |
| ES2323440T3 (es) * | 1996-12-20 | 2009-07-15 | Novozymes A/S | Polieptidos con actividad fitasa. |
| US6039942A (en) | 1996-12-20 | 2000-03-21 | Novo Nordick A/S | Phytase polypeptides |
| US6060298A (en) * | 1996-12-20 | 2000-05-09 | Novo Nordisk A/S | Peniophora phytase |
| CA2231948C (en) | 1997-03-25 | 2010-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified phytases |
| KR100206453B1 (ko) | 1997-03-27 | 1999-07-01 | 박원훈 | 신규한플라즈미드를이용하여형질전환시킨균주 이.채씨오엘아이.피와이로부터생산된피타제 |
| TW409035B (en) | 1997-06-04 | 2000-10-21 | Gist Brocades Bv | Starch-based enzyme granulates |
| NZ330940A (en) | 1997-07-24 | 2000-02-28 | F | Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes |
| ES2264181T3 (es) | 1997-10-01 | 2006-12-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Procedimiento para la produccion de proteinas. |
| US6514495B1 (en) | 1998-03-23 | 2003-02-04 | Novozymes A/S | Phytase varinats |
| US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| AU760737B2 (en) * | 1998-06-29 | 2003-05-22 | Dsm Ip Assets B.V. | Phytase formulation |
| US6720174B1 (en) | 1999-01-28 | 2004-04-13 | Novozymes A/S | Phytases |
| DK1165806T3 (da) | 1999-03-31 | 2005-12-05 | Cornell Res Foundation Inc | Phosphataser med forbedret phytaseaktivitet |
| US6303766B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-10-16 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Soybean phytase and nucleic acid encoding the same |
| AU7405200A (en) | 1999-10-01 | 2001-05-10 | Novozymes A/S | Spray dried enzyme product |
| US6841370B1 (en) | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| WO2002048332A2 (en) * | 2000-12-12 | 2002-06-20 | Diversa Corporation | Recombinant phytases and uses thereof |
| AU2002356855A1 (en) | 2001-10-26 | 2003-05-12 | Genencor International, Inc. | Phytase enzymes, nucleic acid sequences encoding phytase enzymes and vectors and host cells incorporating same |
| EP1444246B1 (en) | 2001-10-26 | 2015-12-30 | Danisco US Inc. | Trichoderma reesei phytase enzymes, nucleic acids encoding such phytase enzymes, vectors and host cells incorporating same and methods of making and using same |
| BRPI0213813B1 (pt) | 2001-10-31 | 2018-11-21 | Cornell Res Foundation Inc | método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico e ração |
| TWI262083B (en) * | 2001-12-28 | 2006-09-21 | Syngenta Participations Ag | Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed |
| JP4426307B2 (ja) | 2002-02-08 | 2010-03-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | フィターゼ変異体 |
| AU2003258157A1 (en) | 2002-08-12 | 2004-02-25 | Genencor International, Inc. | Mutant e. coli appa phytase enzymes |
| US7309505B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve Aspergillus phytases |
| US20040063184A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| US20040253696A1 (en) | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| PL1804592T3 (pl) | 2004-09-27 | 2010-04-30 | Novozymes As | Granulki z enzymem |
| CN100340662C (zh) * | 2004-11-15 | 2007-10-03 | 刘大庆 | 高比活植酸酶基因及其高效表达 |
| US7658922B2 (en) | 2005-06-24 | 2010-02-09 | Ab Enzymes Gmbh | Monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, methods and kits for detecting phytase |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| CN101426907B (zh) * | 2006-04-30 | 2011-04-27 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种植酸酶的克隆和表达 |
| US8540984B2 (en) | 2006-08-03 | 2013-09-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| CN101505611B (zh) | 2006-08-07 | 2013-03-27 | 诺维信公司 | 用于动物饲料的酶团粒 |
| CN101500430B (zh) | 2006-08-07 | 2014-02-19 | 诺维信公司 | 用于动物饲料的酶团粒 |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
| CN101496636B (zh) * | 2008-01-30 | 2012-02-29 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 造纸法薄片原料用功能性植物填料的制备和应用方法 |
| CN101564201B (zh) * | 2008-04-21 | 2013-05-22 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 在烟草制丝加工工艺中进行酶处理改善烟叶质量的方法 |
| EP2116136A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | Novel phytases |
| CN101766327B (zh) * | 2008-12-26 | 2012-07-18 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 造纸法烟草薄片生产的萃取方法 |
| GB201308828D0 (en) * | 2013-03-12 | 2013-07-03 | Verenium Corp | Phytase |
| EP3063282B1 (en) | 2013-09-11 | 2020-03-25 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| WO2015197871A1 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Dsm Ip Assets B.V. | A method for improving the nutritional value of animal feed |
| WO2017112533A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
| CN111164214A (zh) | 2017-09-15 | 2020-05-15 | 诺维信公司 | 用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法 |
| CA3075907A1 (en) | 2017-10-23 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | Processes for reducing lactic acid in a biofuel fermentation system |
| EP3810785A2 (en) | 2018-05-31 | 2021-04-28 | Novozymes A/S | Processes for enhancing yeast growth and productivity |
| WO2020160126A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed |
| BR112022002203A2 (pt) | 2019-08-05 | 2022-09-06 | Novozymes As | Misturas de enzimas e processos para produção de um ingrediente alimentar com alto teor de proteína a partir de um subproduto de vinhaça completa |
| AR120775A1 (es) | 2019-12-16 | 2022-03-16 | Novozymes As | Procesos para obtener productos de fermentación |
| CN115605094A (zh) | 2020-05-15 | 2023-01-13 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司（Nl） | 用于改善动物饲料的营养价值的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ289014B6 (cs) * | 1989-09-27 | 2001-10-17 | Dsm N. V. | Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy |
-
1995
- 1995-04-15 ES ES95105693T patent/ES2268687T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-15 EP EP95105693A patent/EP0684313B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-15 DE DE69535097T patent/DE69535097T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-15 AT AT95105693T patent/ATE332378T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-15 DK DK95105693T patent/DK0684313T3/da active
- 1995-04-24 CN CN95104559A patent/CN1058524C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-25 JP JP10141395A patent/JP3281508B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-03-02 CN CN00103804A patent/CN1277207A/zh active Pending
-
2001
- 2001-03-15 JP JP2001074974A patent/JP3382228B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001145480A (ja) * | 1999-10-11 | 2001-05-29 | F Hoffmann La Roche Ag | 連続発酵工程 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69535097T2 (de) | 2006-12-28 |
| EP0684313A2 (en) | 1995-11-29 |
| ATE332378T1 (de) | 2006-07-15 |
| DE69535097D1 (de) | 2006-08-17 |
| EP0684313B1 (en) | 2006-07-05 |
| JP3382228B2 (ja) | 2003-03-04 |
| ES2268687T3 (es) | 2007-03-16 |
| DK0684313T3 (da) | 2006-11-06 |
| EP0684313A3 (en) | 1999-05-19 |
| CN1126243A (zh) | 1996-07-10 |
| JP2001292789A (ja) | 2001-10-23 |
| CN1277207A (zh) | 2000-12-20 |
| JP3281508B2 (ja) | 2002-05-13 |
| CN1058524C (zh) | 2000-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3281508B2 (ja) | 耐熱性フィターゼ | |
| AU746874B2 (en) | Modified phytases | |
| CN100406561C (zh) | 微生物表达的用于动物饲料的耐热植酸酶 | |
| DE69738483T2 (de) | Polypeptide mit phytase-aktivität und sie kodierende nukleinsäuren | |
| CN102224245B (zh) | 在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法 | |
| RU2113468C1 (ru) | Днк, кодирующая фитазу aspergillus niger, рекомбинантная плазмидная днк для экспрессии фитазы (варианты), штаммы-продуценты фитазы (варианты), способ получения фитазы и рекомбинантная фитаза aspergillus niger | |
| CA2257101C (en) | Dna sequences encoding phytases of ruminal microorganisms | |
| JPH08501685A (ja) | トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）におけるフィチン酸塩分解酵素の産生 | |
| AU2092800A (en) | Improved phytases | |
| JPH0438394B2 (ja) | ||
| KR20010042138A (ko) | 피타제 변이체 | |
| US6291221B1 (en) | Heat tolerant phytases | |
| KR102152138B1 (ko) | 활성이 개선된 자일라나제 변이체 및 이의 생산방법 | |
| US6358722B1 (en) | Heat tolerant phytases | |
| AU2007304532B2 (en) | Clonation, expression and use of acid lysophospholipases | |
| JP2003516112A (ja) | 相同又は非相同タンパク質生産のための組換えペニシリウム フニクロスム | |
| KR0157411B1 (ko) | 폴리펩티드의 제조방법 | |
| US6699704B1 (en) | Heat tolerant phytases | |
| JP4149260B2 (ja) | 新規細菌性フィターゼとその製造方法 | |
| NZ303969A (en) | Endo beta 1,4-glucanase from aspergillus | |
| WO2003102174A2 (en) | Modified phytases | |
| AU7446198A (en) | Cloning of udp-galactose epimerase | |
| EP2116136A1 (en) | Novel phytases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090222 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090222 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100222 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100222 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110222 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140222 Year of fee payment: 12 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |