JP2001145480A - 連続発酵工程 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛋白質を製造するための連続工程を提供する
ことを課題とする。 【解決手段】 本発明は、微生物を固体担体上に選択的
に固定する、ならびに／または、微生物の増殖および蛋
白質の至適産生のために必要な栄養素および他の作用物
質を個別に一定の希釈率でリアクター内に供給する工程
である、蛋白質産生微生物による蛋白質の製造のための
連続工程を提供する。さらに、本発明は、発酵アセンブ
リを用いた蛋白質の製造のための工程を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は蛋白質の製造のため
の連続工程に関する。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は蛋白質を製造
するための連続工程を提供することを課題とする。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明に従い、連続発酵
工程に用いる培地を分割することにより、微生物の増殖
および代謝産物産生に対する影響を検討し、それによっ
て発酵工程のための至適条件を決定することが可能にな
ることが明らかになった。連続的に送り出される発酵培
地は一般に、それが含む成分と同じ数の部分に分割する
ことができる。このような成分の例には、炭素、窒素、
リンおよびイオウ源のほか、ビタミン、ならびにコーン
スチープ（corn steep）、酵母抽出物および他の天然物
などの複合基質がある。さらに、必要なあらゆるミネラ
ル、微量または痕跡元素を、塩化物、硫酸塩または硝酸
塩などの水溶性塩の溶液として別々に供給することがで
きる。所望の量の成分が（水）溶性であって個々の供給
溶液または発酵培地中で擾乱性相互作用（例えば、沈
殿、反応など）が起こらない限り、このようにして、任
意の望ましい組成を有する発酵培地を得ることができ
る。

【０００４】1つの局面において、本発明は、蛋白質産
生微生物（protein-producing microorganism）による
蛋白質の製造のための連続工程に関する。

【０００５】より詳細には、本発明は、微生物が固体担
体上に選択的に固定される、ならびに／または、微生物
の増殖および蛋白質の至適産生のために必要な栄養素お
よび他の作用物質を個別に一定の希釈率（dilution rat
e）でリアクター内に供給する工程である、蛋白質産生
微生物による蛋白質の製造のための連続工程に関する。

【０００６】本発明に係るアセンブリにおいては、
（１）生細胞に関する反応を行うために適した容器、液
体の供給のために該容器と接続された少なくとも2つの
貯蔵フラスコ（storage flask）、および該液体を該貯
蔵フラスコから該容器に輸送するための手段、該貯蔵フ
ラスコの内容物の該容器への供給を監視する個々の器
具、該容器と接続された回収フラスコ、および発酵液体
培地を該容器から該回収フラスコに輸送するための手
段、ならびに該貯蔵フラスコから該容器への液体の個々
の供給速度を変化させることによって該容器における一
定の希釈率を制御および維持するための装置を含む発酵
アセンブリであることを特徴とする。

【０００７】また、本発明に係るアセンブリにおいて
は、（２）貯蔵フラスコ2からの液体供給のための送込
管2aが備え付けられた発酵槽1、液体を貯蔵フラスコ2か
ら発酵槽1に輸送するためのポンプ3、発酵槽に供給さ
れ、そこから排出される液体の量を監視するための天秤
4、ガス送込管9および排出管10、排出管5aを介して発酵
液体培地を回収フラスコ5に排出するためのポンプ6、工
程全体の監視および方向付けを行うための主調節ユニッ
ト7、温度、pH、ガス圧、発酵槽内容物および消泡剤供
給に関する個々の制御システム17の監視および方向付け
を行うための調節ユニット11、ガス供給および試料採取
のためポンプ13を含む回路12、ガス送込流および排出流
調節器14および15、ならびに選択的に除菌フィルター16
および温度調節ユニット8を含む、上記(1)記載および図
1によるアセンブリであることを特徴とする。

【０００８】また、本発明に係るアセンブリにおいて
は、（３）貯蔵フラスコが、細胞の増殖および望ましい
反応産物の至適形成のために必要な炭素、窒素およびミ
ネラル源の溶液用の個別のフラスコを含む、上記(1)ま
たは(2)記載のアセンブリであることを特徴とする。

【０００９】また、本発明に係るアセンブリにおいて
は、（４）貯蔵フラスコが制御物質（controlling agen
t）を含む個別のフラスコを少なくとも1つ含む、上記
(1)から(3)のいずれか一項記載のアセンブリで有ること
を特徴とする。

【００１０】また、本発明に係るアセンブリにおいて
は、（５）貯蔵フラスコが水を含む個別のフラスコを1
つ含む、上記(1)から(4)のいずれか一項記載のアセンブ
リであることを特徴とする。

【００１１】また、本発明に係るアセンブリにおいて
は、（６）容器が固定化された生細胞の固定層（fixed
bed）および／または流動層（expanded bed）および／
または移動層（moving bed）を含む、上記(1)から(5)の
いずれか一項記載のアセンブリであることを特徴とす
る。

【００１２】また、本発明に係るアセンブリにおいて
は、（７）生細胞が多孔質担体上に固定化された、上記
(6)記載のアセンブリであることを特徴とする。

【００１３】また、本発明に係る工程においては、
（８）生細胞の培養物からの蛋白質を製造するための連
続工程であって、細胞の増殖および所望の蛋白質の至適
産生のために必要な栄養素および他の作用物質が個別に
一定の希釈率でリアクター内に供給される工程であるこ
とを特徴とする。

【００１４】また、本発明に係る工程においては、
（９）蛋白質がカタラーゼ、ラクターゼ、フェノール酸
化酵素、酸化酵素、酸化還元酵素、グルカナーゼ、セル
ラーゼ、キシラナーゼおよび他の多糖類分解酵素、ペル
オキシダーゼ、リパーゼ、加水分解酵素、エステラー
ゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他の蛋白質分解酵
素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フ
ィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン
分解酵素、アミラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダー
ゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラー
ゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼおよびデオキシリボ
ヌクレアーゼからなる群より選択されるか、または蛋白
質が抗体、ワクチン、抗原などの治療的蛋白質の群、も
しくはラクトテルニン（lactoternin）、ラクトペルオ
キシダーゼもしくはリゾチームなどの抗菌性および／も
しくは健康上有益な蛋白質の群から選択される、上記
(8)記載の連続工程であることを特徴とする。

【００１５】また、本発明に係る工程においては、（１
０）蛋白質が抗体、ワクチン、抗原などの治療的蛋白質
の活性を有する蛋白質からなる群より選択される、上記
(8)記載の連続工程であることを特徴とする。

【００１６】また、本発明に係る工程においては、（１
１）細胞が固定化される、上記(8)から(10)のいずれか
一項記載の工程であることを特徴とする。

【００１７】また、本発明に係る工程においては、（１
２）細胞がフィターゼ産生微生物である、上記(8)から
(11)のいずれか一項記載の工程であることを特徴とす
る。

【００１８】また、本発明に係る工程においては、（１
３）フィターゼ産生微生物がハンゼヌラ・ポリモルファ
（Hansenula polymorpha）である、上記（12）記載の工
程であることを特徴とする。

【００１９】また、本発明に係る工程においては、（１
４）フィターゼ産生微生物が、真菌または共通の起源に
由来するフィターゼをコードするDNAによる形質転換を
受けたハンゼヌラ・ポリモルファである、上記(13)記載
の工程であることを特徴とする。

【００２０】また、本発明に係る工程においては、（１
５）細胞または微生物が多孔質担体上の固定層および／
または流動層および／または移動層中にある、上記(8)
から(14)のいずれか一項記載の工程であることを特徴と
する。

【００２１】また、本発明に係る工程においては、（１
６）炭素源がグリセロールまたは糖質様単糖、二糖、も
しくは多糖である、上記(8)から(15)のいずれか一項記
載の工程であることを特徴とする。

【００２２】また、本発明に係る工程においては、（１
７）炭素源がグルコースである、上記(16)記載の工程で
あることを特徴とする。

【００２３】また、本発明に係る工程においては、（１
８）炭素源がメタノールである、上記(8)から(15)のい
ずれか一項記載の工程であることを特徴とする。

【００２４】また、本発明に係る工程においては、（１
９）炭素源がグルコースおよびメタノールである、上記
(8)から(15)のいずれか一項記載の工程であることを特
徴とする。

【００２５】また、本発明に係る工程においては、（２
０）メタノールおよびグルコースの総量がそれぞれ約10
から約500g／lまでの範囲にある、上記(19)記載の工程
であることを特徴とする。

【００２６】

【発明の実施の形態】1つの好ましい局面において、本
発明は、生細胞または不活性化細胞に関する反応を行う
ために適した容器（vessel）、液体の供給のために前記
容器と接続された少なくとも2つの貯蔵フラスコ（stora
ge flask）、および前記液体を前記貯蔵フラスコから前
記容器に輸送するための手段、前記貯蔵フラスコの内容
物の前記容器への供給を監視する個々の器具、前記容器
と接続された回収フラスコ、および発酵液体培地を前記
容器から前記回収フラスコに輸送するための手段、なら
びに前記貯蔵フラスコから前記容器への液体の個々の供
給速度を変化させることによって前記容器における一定
の希釈率を制御および維持するための装置を含む発酵ア
センブリを用いる、蛋白質の製造のための工程に関す
る。

【００２７】従来の発酵容器の任意のものを本発明の目
的に用いることができる。容器はステンレス鋼、ガラス
またはセラミックスなどの材料でできたものでよく、容
量は例えば100ml〜2500m³でよいが、これらの数字は本
発明にとって重要ではない。連続稼働のために、容器の
内部には不死化細胞を取り込むための受け器（receptac
le）または濾板（sieve plate）などが選択的に備えら
れる。さらに、発酵容器は、栄養液、ならびに発酵液体
培地における望ましいpHおよび泡形成、酸化還元電位な
どの他のパラメーターを維持および調節するための溶液
を含む一連の貯蔵フラスコに接続される。発酵に関する
特定の需要に応じて、生細胞に対する炭素または窒素ま
たはミネラル源としての役割を果たす基質を個々に提供
するための別々の貯蔵フラスコを用意してもよい。

【００２８】本発明により、本工程が発酵容器内で一定
の希釈率で行うのが都合がよいことが明らかになった。
本明細書で用いる「希釈率（dilution rate）」という
用語は、1時間当たり［h^-1］に発酵容器に供給される液
体の総容積を発酵容器の容積で割った値を表す。

【００２９】したがって、発酵工程の間に個々の栄養成
分または他の添加物の供給を変化させながら、発酵容器
内で一定の希釈率で発酵工程を行うことは、本発明の1
つの詳細な特徴である。この作業を容易にするために、
液体の供給を補い、それによって液体の全体的供給を一
定に保つことを可能とするような、水などの不活性成分
を含む貯蔵フラスコが選択的に提供される。

【００３０】本発明の工程を行うために用いることが好
ましいアセンブリは、発酵培地の個々の成分を貯蔵フラ
スコから発酵容器に輸送するための手段、および発酵容
器に供給される液体の量を監視するための器具をさらに
含む。この目的には、測定機器（例えば、重力測定、流
体速度、磁気、超音波、ベンチュリ効果（Venturi）、
J、相互関係（cross-relation）、熱、コリオリ効果（C
oriolis）、放射測定のいずれかによる容積測定または
マスフロー速度）および輸送ユニット（例えば、ポンプ
または圧力差）のあらゆる組み合わせを用いることがで
きる。さらに、あらゆる輸送ユニットを計量供給ユニッ
ト（例えば、ギア、蠕動、ピストン、膜または傍心ポン
プ）として利用可能である。小規模での稼働の場合、規
定濃度の栄養分または添加液を含む貯蔵フラスコを秤量
することにより、供給は適切に監視される。

【００３１】発酵容器内で一定の希釈率を調節および維
持するための装置は、貯蔵フラスコからの流れを監視す
る測定機器および例えば、実際のマスフロー速度を算出
し、それを目標値と比較し、それに従ってポンプ設定を
調整するコンピュータソフトウェア調節装置などの調節
ユニットを含むシステムであるのが適切である。適切な
システムは、例えば、シリアルインターフェースボック
ス（Technosoftware AG（Rothackerstrasse 13、5702 N
iederlenz、Switzerland）が代理しているComtrol Euro
pe Ltd（Great Britain）のロケットポート（Rocket Po
rt））を介して種々の動作ユニット（天秤、ポンプ）と
接続されたウィンドウズＮＴ（登録商標）４．０用のプ
ロセスオートメーションシステム（Process Automation
System、National Instruments、Bridge View、USA）
である。

【００３２】本発明の工程に用いることのできるアセン
ブリを図1に示す。

【００３３】発酵容器1（発酵槽）には、塩溶液
（塩）、栄養液（栄養分）、異なる炭素源などを供給す
るための特定の基質（基質1および基質2）、pH調節用物
質（塩基）、一定の希釈率に調節するための水、および
消泡剤を供給するための貯蔵フラスコ2（適切には撹拌
器を備える）からの送込管2aが備え付けられている。ポ
ンプ3は液体を貯蔵フラスコ2から発酵槽1に輸送する。
天秤4は、発酵槽に供給され、そこから排出される液体
の量を監視する。さらに、発酵槽は酸素供給用の送込管
9、ならびにユニット14および15により制御される排出
用の排出管10を有する。ポンプ6は排出管5aを介して発
酵液体培地を回収フラスコ5に排出する。主調節ユニッ
ト7は工程全体の監視および方向付け（steering）を行
う。調節ユニット11は温度、pH、ガス圧、発酵槽内容物
および消泡剤供給に関する個々の制御システム17の監視
および方向付けを行う。ポンプ13を含む回路12は、発酵
液体培地から試料を採取するため、および発酵液体培地
を移動させるための調節ガス流を提供するために用い
る。流入および排出ガス流は流量調節器14および15によ
って調節される。除菌フィルター16は選択的に提供され
る。選択的には、発酵容器1に温度調節ユニット8が備え
付けられる。

【００３４】本発明の工程において、蛋白質産生微生物
は、真菌由来もしくは細菌由来などの天然の微生物また
は蛋白質をコードするDNAによる形質転換を受けた微生
物であり、このような形質転換微生物としては細菌また
は真菌または酵母が可能であるが、好ましくはカワタケ
（Peniophora）、アスペルギルス、ハンゼヌラまたはピ
ヒア属、特に黒色アスペルギルス（Aspergillus nige
r）、アスペルギルス・アワナリ（Aspergillus awanar
i）、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus soja
e）、コウジ菌（Aspergillus oryzae）またはハンゼヌ
ラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）またはピヒ
ア・パストリス（Pichia pastoris）である。

【００３５】これに関連して、当業者は、目標蛋白質の
生産のために有用であることが知られたこの種の蛋白質
産生微生物を選択する。

【００３６】本発明の1つの好ましい態様において、蛋
白質は、カタラーゼ、ラクターゼ、フェノール酸化酵
素、酸化酵素、酸化還元酵素、グルカナーゼ、セルラー
ゼ、キシラナーゼおよび他の多糖類分解酵素、ペルオキ
シダーゼ、リパーゼ、加水分解酵素、エステラーゼ、ク
チナーゼ、プロテアーゼおよび他の蛋白質分解酵素、ア
ミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィター
ゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵
素、アミラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イ
ソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、キチナーゼおよびデオキシリボヌクレ
アーゼなどの酵素の活性を有する蛋白質からなる群より
選択される。さらに、本発明の1つの好ましい態様にお
いて、蛋白質は抗体、ワクチン、抗原などの治療的蛋白
質の群、またはラクトテルニン（lactoternin）、ラク
トペルオキシダーゼもしくはリゾチームなどの抗菌性お
よび／もしくは健康上有益な蛋白質の群から選択され
る。

【００３７】当業者は、「活性」という用語に、天然の
酵素に関係する生来の活性または治療的機能のみでな
く、望ましい活性、または熱安定性、pH耐性および／ま
たはさらなる特性を増強または改変するために作製しう
るアミノ酸の置換、欠失、付加または他の修飾によって
改変された活性または機能も含まれることを理解すると
思われる。

【００３８】本発明の1つの最も好ましい態様におい
て、選択される蛋白質はフィターゼの活性を有する蛋白
質である。

【００３９】フィターゼの活性を有する蛋白質の例は、
欧州特許第684 313号、欧州特許第897 010号、欧州特許
第897 985号、または本発明の実施例6〜16および図2〜4
7に記載されている。

【００４０】本発明に係る発酵工程に用いられる培地は
通常、可消化窒素源および無機物質、ビタミン、微量お
よび痕跡元素ならびに他の増殖促進因子などの、細胞ま
たは微生物に対する栄養分を含む。さらに、培地は炭素
源も含む。本発明に係る発酵工程における窒素源として
は、硝酸塩、アンモニウム塩、酵母抽出物、肉エキス、
ペプトン、カゼイン、コーンスチーブリカー、アミノ酸
および尿素などの種々の有機または無機物質を用いてよ
い。発酵に用いうる典型的な無機物質には、カルシウ
ム、鉄、亜鉛、ニッケル、マンガン、コバルト、銅、モ
リブデン、ならびに塩化物、硫酸塩およびリン酸塩など
のアルカリ塩、さらにホウ酸がある。炭素源としては、
グリセロールまたは例えばグルコース、フルクトース、
スクロース、マルトース、デンプン、グリコーゲン、セ
ルロースなどの糖質様単糖、二糖、オリゴ糖もしくは多
糖、または例えば糖蜜、グルコースシロップおよびフル
クトースシロップなどの物質を含む基質などを用いるこ
とができる。全供給流（total feed stream）における
グルコースおよび／またはメタノールの濃度は各成分に
関して約10から約500g／lまでの範囲であってよく、好
ましくは約200から約300g／lまでの範囲である。発酵培
地が主として水性媒体である場合には、この種の媒体
は、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールと
いったアルコールなどの無機溶媒を含みうる。さらに、
発酵培地は分散系または懸濁液であってもよく、この場
合には発酵を撹拌しながら行うのが適切である。

【００４１】連続稼働のために、細胞は固体多孔質担体
上に選択的に固定される。発酵工程に一般に用いられる
任意の多孔性、サイズおよび形状を備え、固定化しよう
とする特定の細胞または微生物に何ら毒性作用を及ぼさ
ないあらゆる固体多孔質担体を、本発明の目的に用いる
ことができる。このような担体の例は、無機材料から成
っており、孔径が約0.5から約100μmの範囲、好ましく
は約10から約30μmまでの範囲にあるものである。無機
材料の例にはセラミックス、ならびにステアタイト、ゼ
オライト、ベントナイト、シリケート（ガラス）、珪酸
アルミニウム、酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム
・マグネシウムおよび酸化アルミニウム・マグネシウム
などの天然鉱質がある。この種の担体は、例えば、セラ
ムテック社（Ceramtec）（Marktredwitz、Germany）、
ショットエンジニアリング社（Schott Engineering Gmb
H）（Mainz、German）などから市販されている。好まし
くは担体は球形であり、平均直径は約0.2から約20mmま
での範囲である。担体には、担体粒子を適切な細胞培養
物と接触させることによる本質的に公知の様式で、生細
胞を装入することができる。必要に応じて、細胞が装入
された担体粒子にさらに、ドイツ公開公報（German Off
enlegungsschrift）ドイツ特許第3421049号に記載され
たものなどの、膜型コーティング層の塗布による加工を
行うことも可能である。担体は発酵容器内の固相床（fi
xed bed）上にあることが適切である。さらに、自動的
殺菌（例えば、メタノール、エタノール、アンモニアに
よる）が確実に行われない場合には、培地、その成分お
よびそれらの収納容器のそれぞれを使用前に滅菌するこ
とが適切である。蒸気による加熱滅菌（例えば、121℃
および1バールの圧力で20分間）を行い、感受性成分に
対しては濾過（0.2μm）を行うことが好ましい。代替的
な滅菌法を用いてもよい。工程を連続的様式で行う場合
には培地成分の滅菌は必ずしも必要ではない。

【００４２】発酵に用いる特定の細胞または生物体に応
じて、発酵は約2から約11までの間のpHで行うことがで
きる。本発明の1つの好ましい局面において、フィター
ゼの製造のための発酵工程は、欧州特許第897 010号、
欧州特許第897 985号または本明細書の実施例11に記載
されたフィターゼをコードするDNA配列による形質転換
を受けた微生物ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula
polymorpha）を用いて行われる。本発明のその特定の局
面によれば、好ましい炭素源はグルコースとメタノール
との混合物である。さらに、本発明のその特定の局面に
よれば、発酵は約4から5までの間のpH、好ましくは約pH
4.6で行いうる。このような発酵工程を行うための好ま
しい温度の範囲は約10から50℃までの間であり、より好
ましくは発酵温度は約30℃である。通気率（aeration r
ate）は好ましくはガス体積が液体の容積の約0.01から
約1.5倍となるように調節され、溶存酸素濃度（DO）は
0.01から約500％までの範囲である。DOが100％であると
は、溶液中の酸素が大気圧（1バール）およびリアクタ
ー温度での飽和濃度にあることを意味する。発酵は約0.
1から約100バールまでの圧力下で行うことができ、好ま
しくは発酵は大気圧、すなわち約1バールで行われる。
希釈率は1時間当たり約0.001から約0.5までの範囲であ
ってよい。

【００４３】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳しく
例示する。

【００４４】実施例１ 供給培地（feed medium）用の貯蔵溶液を以下の通りに
調製した：1.1 CaCl₂／H₃BO₃溶液 この溶液を121℃で20分間滅菌した。

【００４５】1.2 微量元素溶液 この溶液を121℃で20分間滅菌した。

【００４６】1.3 痕跡元素溶液 この溶液を121℃で20分間滅菌した。

【００４７】1.4 塩＋ビタミン溶液 ビタミン溶液は濾過（0.2μm）によって滅菌し、121℃
で20分間滅菌した塩溶液に加えた。

【００４８】1.5 グルコース溶液 770gのD-グルコース・H₂Oを480gの水に溶解して滅菌し
（121℃、20分間）、D-グルコースを57％（重量比）含
む1リットルの溶液を得た。

【００４９】1.6 メタノール 純メタノールを無菌とみなし、滅菌フラスコに入れた。

【００５０】1.7 消泡剤 必要に応じて泡制御装置（foam-control）から供給する
ために、消泡剤（Struktol J 673、Schill & Seilache
r、Hamburg、Germany）の10％滅菌（121℃、20分間）溶
液を用意した。

【００５１】1.8 塩基 滅菌水中に約12.5％（重量比）のアンモニアを含む溶液
を滅菌フラスコに入れた。

【００５２】実施例２ 固定型バイオリアクター（1リットル）を図1に示す原理
に従って設置し、個々の貯蔵フラスコには実施例1の1.1
から1.8までの溶液を供給した。多孔質ステアタイト球
（直径4mm、孔径10〜30μm、1ml当たりの孔数280個、Ce
ramTec、Marktredwitz、Germany）からなる固相層は、
上部の濾板に囲まれて存在する。リアクターを滅菌し
（121℃、20分間）、その後に欧州特許第897 010号、欧
州特許第897 985号または実施例11などに記載されたフ
ィターゼをコードするDNAによる形質転換を受けたハン
ゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）の接種
培養物を加えた。続いて貯蔵フラスコと接続した。接種
培養物は炭素源としてグルコースの代わりにグリセロー
ルを含む培地で増殖させた。溶存酸素濃度の上昇による
判定でグリセロールがすべて消費されるまでリアクター
のバッチ操作を行った。続いて供給流を投入し、以下の
作業条件下で発酵させた：

【００５３】貯蔵フラスコ1〜8により供給される基質組
成物（供給流における実際の濃度）：

【００５４】分析法：総蛋白質濃度の測定には、バイオ
ラッド蛋白質アッセイキットI（Bio-Rad Protein Assay
Kit I）（Bio-Rad、Glattbrugg、Switzerland）を用い
た。総蛋白質濃度（c_tp）からフィターゼ濃度（c_phyt）
を算出するための係数は、c_phyt＝0.76・c_tpとした。

【００５５】培地中の生物量（biomass）を測定するた
めに、1mlの2つの試料を遠心処理にかけ、水1mlで洗っ
て再び遠心し、2日間85℃で乾燥させた後に秤量した。

【００５６】結果：上記の作業条件における生物量は59
g／lであった。希釈率を1時間当たり0.0067とした場
合、生産性は1リットル・1時間当たりフィターゼ0.078g
であった。

【００５７】バッチ式供給（fed-batch-wise）により行
った発酵では、生物量は125g／lであったが、生産性は1
リットル・1時間当たりフィターゼ0.054gであった。

【００５８】実施例３ ステアタイト球を用いない（すなわち、微生物を固定化
しない）点を除き、実施例2と同様の発酵を行った。以
下の組成の栄養分ならびに塩およびビタミン溶液を別々
にリアクター内に注入した。

【００５９】栄養液：

【００６０】塩＋ビタミン溶液：

【００６１】これらの2種類の溶液の供給は、供給流に
おける栄養液の濃度が51g／lとなり、塩＋ビタミン溶液
の濃度が61g／lとなるように調節した。希釈率は0.009h
^-1に調整した。pHは、12.5重量％の水酸化アンモニウム
の添加によって4.6に保持した。

【００６２】さらに、供給流におけるグルコース濃度が
275g／lとなり、メタノール濃度が260g／lとなるよう
に、実施例1のグルコース溶液およびメタノールをリア
クター内に別々に供給した。

【００６３】この発酵の生産性は、1リットル・1時間当
たりフィターゼ0.088gであった。排出液における生物量
は58g／lであった。

【００６４】実施例４ グルコース濃度を290g／l、メタノール濃度を260g／lに
調節したことを除いて実施例3と同様に行い、希釈率を
0.009h^-1に保った発酵工程における生産性は1リットル
・1時間当たりフィターゼ0.092gであった。排出液にお
ける生物量は60.4g／lであった。

【００６５】実施例５ グルコース濃度を270g／l、メタノール濃度を280g／lに
調節したことを除いて実施例3と同様に行い、希釈率を
0.009h^-1に保った発酵工程における生産性は1リットル
・1時間当たりフィターゼ0.094gであった。排出液にお
ける生物量は56.8g／lであった。

【００６６】実施例６ 共通フィターゼ-1のアミノ酸配列のデザイン アミノ酸配列のアラインメント アラインメントの算出には、GCG配列解析パッケージ（G
CG Sequence AnalysisPackage）リリース9.0（Devereu
x, J.ら、A comprehensive set of sequence analysis
programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 12, 387-3
95 (1984)）中のPILEUPプログラムを、標準的パラメー
ター（ギャップ生成ペナルティ12、ギャップ伸長ペナル
ティ4）で用いた。ギャップの位置はテキストエディタ
ーを用いて精密化した。表1には、そこに記されたアミ
ノ酸（aa）から始めてアラインメントを作製するために
用いた配列（図2〜6参照）を、シグナル配列を除いて示
している。

【００６７】

【表１】 共通フィターゼ-1のデザインのために用いた
フィターゼアミノ酸配列の由来およびボートウェイト
（vote weight） ‐アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）9
A-1株由来のphyA、aa27、ボートウェイト0.5（Mitchel
l, D. B.ら、The phytase subfamily of histidine aci
d phosphatases: isolation of genes for two novel p
hytases from thefungi Aspergillus terreus and Myce
liophthora thermophila, Microbiology143, 245-252
(1997)） ‐アスペルギルス・テレウスcbs116.46株由来のphyA、a
a27、ボートウェイト0.5（欧州特許第897 985号、図1） ‐黒色アスペルギルス・アワモリ株（Aspergillus nige
r var. awamori）由来のphyA、aa27、ボートウェイト0.
33（Piddington, C. S.ら、The cloning and sequencin
g of the genes encoding phytase (phy) and pH 2.5-o
ptimum acid phosphatase (aph) from Aspergillus nig
er var. awamori. Gene 133, 55-62 (1993)） ‐黒色アスペルギルスT213株由来のphyA、aa27、ボート
ウェイト0.33 ‐黒色アスペルギルスNRRL3135株由来のphyA、aa27、ボ
ートウェイト0.33（vanHartingsveldt, W.ら、Cloning,
characterization and overexpression of thephytase
-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene 1
27, 87-94 (1993)） ‐アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumiga
tus）ATCC 13073株由来のphyA、aa26、ボートウェイト
0.2（Pasamontes, L.ら、Cloning, purificationand ch
aracterization of a heat stable phytase from the f
ungus Aspergillus fumigatus, Appl. Environ. Microb
iol. 63, 1696-1700 (1997)） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 32722株由来のph
yA、aa26、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 58128株由来のph
yA、aa26、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 26906株由来のph
yA、aa26、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 32239株由来のph
yA、aa30、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐エメリセラ・ニドゥランス（Emericella nidulans）
由来のphyA 、aa25、ボートウェイト1.0（Pasamontes,
L.ら、Cloning of the phytases from Emericellanidul
ans and the thermophilic fungus Talaromyces thermo
philus. Biochim.Biophys. Acta 1353, 217-223 (1997
a)） ‐タラロマイセス・サーモフィリス（Talaromyces ther
mophilus）ATCC 20186株由来のphyA、aa24、ボートウェ
イト1.0（Pasamontesら、1997a（前記）） ‐ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora the
rmophila）由来のphyA、aa19、ボートウェイト1.0（Mit
chellら、1997（前記））

【００６８】共通フィターゼ-1のアミノ酸配列の算出 精密化されたアラインメントを入力として用い、GCG配
列解析パッケージリリース9.0（Devereuxら、1984（前
記））中のPRETTYプログラムにより共通配列を算出し
た。PRETTYは縦列のアラインメントを作製した上で配列
をプリント出力するものであり、アラインメントに関す
る共通配列を表示することができる。整列化されたフィ
ターゼのアミノ酸配列同士の間の類似性を考慮したボー
トウェイトを全配列に割り当てた。ボートウェイトは、
A.フミガーツス（A. fumigatus）由来の全フィターゼの
アミノ酸配列といった1つの配列サブグループ（同じ種
であるが異なる系統）から選出された全フィターゼに対
する影響（impact）の合計値が1となるように設定した
が、このことは各配列による寄与が1を系統配列数で割
った値であることを意味する（表1参照）。これは、ざ
まざまなA.フミガーツス株由来のフィターゼのような極
めて類似したアミノ酸配列が、算出される共通配列を決
定してしまうことを防止しうることを意味する。

【００６９】PRETTYプログラムは以下のパラメーターに
より開始した：それ未満の値では共通性が存在しないと
みなす複数のボート（vote）の数を定義する値は2.0に
設定した。それ未満の値ではアミノ酸残基の連合性がな
いとみなすスコアリングマトリックス値（scoring matr
ix value）を決定する閾値は2に設定した。PRETTYでは
ペプチド用のPrettyPep.Cmp共通スコアリングマトリッ
クスを用いた。

【００７０】プログラムでは共通残基を決定できなかっ
たアラインメント中の10カ所（46、66、82、138、162、
236、276、279、280、308位、図2〜6）は、以下の規則
に従って手作業で充填した：最も頻度の高い残基が存在
する場合にはこの残基を選択した（138、236、280）；
類似した同等の残基の群が主にみられる場合にはこの群
のうち最も頻度の高い残基を選択し、それが決まらなけ
ればそのうち1つの残基を選択した（46、66、82、162、
276、308）。主要な残基も主要な群も存在しない場合に
は、蛋白質安定性に対する影響に関する一般的な仮定に
従って、そこにみられる残基の1つを選択した（279）。
他の8カ所（132、170、204、211、275、317、384、44
7、図2〜6）は、プログラムによって選択されたアミノ
酸残基による充填は行わず、プログラムにより選択され
た残基と同じ頻度でみられるアミノ酸による一般的な充
填を行った。ほとんどの場合、3種類の黒色アスペルギ
ルス配列（ボートウェイトの合計値：0.99）に関する若
干の過小評価はこの補正によって解消された。

【００７１】共通フィターゼ-1アミノ酸配列のDNA配列
への変換 A.テレウス（A. terreus）cbs116.46株フィターゼの最
初の26アミノ酸残基をシグナルペプチドとして用い、そ
のため、すべての共通フィターゼのN末端に融合させ
た。この連鎖に対応するDNA配列を算出するために、本
発明者らは特別な方法を用いた。パービスら（Purvis,
I. J.ら、The efficiency of folding ofsome proteins
is increased by controlled rates of translation i
n vivo. J. Mol. Biol. 193, 413-417 (1987)）は、遺
伝子中に稀なコドンを組み入れることによって蛋白質の
フォールディング効率が影響されると提唱した。パービ
スら（1987（前記））の手法を用いてシグナル配列のDN
A配列を算出し、S.セレビシエ（S. cerevisiae）におけ
る発現に関して最適化した。蛋白質の残りの部分に関し
て、本発明者らは、算出したアミノ酸配列をDNA配列に
変換するために、GCGプログラムパッケージによって得
られた高発現S.セレビシエ遺伝子のコドン出現頻度表を
用いた。

【００７２】その結果得られたfcp遺伝子の配列を図7〜
9に示す。

【００７３】共通フィターゼ-1遺伝子の構築およびクロ
ーニング センスおよびアンチセンス鎖の配列を交互に用いること
により、算出した共通フィターゼ-1（fcp）のDNA配列を
85bpずつのオリゴヌクレオチドに分割した。オリゴヌク
レオチドはいずれも対合ストランドの前および後のオリ
ゴヌクレオチドと20bpずつ重複している。ミクロシンス
社（Microsynth）（Balgach、Switzerland）から購入
し、PAGE精製を行った形で入手した全プライマーの位置
を図7〜9に示す。

【００７４】PCR反応 3種類のPCR反応において合成されたオリゴヌクレオチド
から遺伝子の全体を構成した。PCRにはベーリンガーマ
ンハイム社（Boehringer Mannheim）の高性能キット（H
igh Fidelity Kit）（Boehringer Mannheim、Germany）
およびAMSバイオテクノロジー社（AMS Biotechnology）
（Europe）Ltd.（Lugano、Switzerland）のプロトコー
ル（The Protokol（登録商標））サーマルサイクラーを
用いた。

【００７５】CP-1からCP-10までのオリゴヌクレオチド
（混合物1、図7〜9）を混合し、各オリゴヌクレオチド
の濃度を0.2pmol／μlとした。CP-9からCP-22までを用
いて（各オリゴヌクレオチドとも0.2pmol／μl）第2の
オリゴヌクレオチド混合物（混合物2）を調製した。さ
らに以下の4種の短いプライマーをPCR反応に用いた：

【００７６】 PCR反応a：10μl 混合物1（2.0pmolの各オリゴヌクレオチド） 2μl ヌクレオチド（10mMの各ヌクレオチド） 2μl プライマーCP-a（10pmol／μl） 2μl プライマーCP-c（10pmol／μl） 10.0μl PCRバッファー 0.75μl ポリメラーゼ混合物（2.6U） 73.25μl H₂O

【００７７】 PCR反応b：10μl 混合物2（2.0pmolの各オリゴヌクレオチド） 2μl ヌクレオチド（10mMの各ヌクレオチド） 2μl プライマーCP-b（10pmol／μl） 2μl プライマーCP-e（10pmol／μl） 10.0μl PCRバッファー 0.75μl ポリメラーゼ混合物（2.6U） 73.25μl H₂O

【００７８】PCR反応aおよびbに関する反応条件： ステップ1 2分間‐45℃ ステップ2 30秒間‐72℃ ステップ3 30秒間‐94℃ ステップ4 30秒間‐52℃ ステップ5 1分間‐72℃ ステップ3から5までを40回繰り返した。

【００７９】PCR産物（670および905bp）をアガロース
ゲル電気泳動（0.9％アガロース）およびそれに続くゲ
ル抽出（QIAEX IIゲル精製キット（Gel Extraction Ki
t）、Qiagen、Hilden、Germany）によって精製した。精
製したDNA断片をPCR反応cに用いた。

【００８０】 PCR反応c：6μl 反応aのPCR産物（約50ng） 6μl 反応bのPCR産物（約50ng） 2μl プライマーCP-a（10pmol／μl） 2μl プライマーCP-e（10pmol／μl） 10.0μl PCRバッファー 0.75μl ポリメラーゼ混合物（2.6U） 73.25μl H₂O

【００８１】PCR反応cに関する反応条件： ステップ1 2分間‐94℃ ステップ2 30秒間‐94℃ ステップ3 30秒間‐55℃ ステップ4 1分間‐72℃ ステップ2から4までを31回繰り返した。

【００８２】この結果得られたPCR産物（1.4kb）を上記
の通りに精製してEcoRIで消化し、EcoRIで消化した脱リ
ン酸pBsk(-)ベクター（Stratagene、La Jolla、CA、US
A）中に連結した。この連結混合物1μlを大腸菌XL-1コ
ンピテント細胞（Stratagene、La Jolla、CA、USA）の
形質転換に用いた。標準的手順はすべてサムブルックら
（Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory, Col
d Spring Harbor, NY (1989)）に記載された通りに行っ
た。構築された共通フィターゼ遺伝子（fcp、図7〜9）
のDNA配列は当業者に公知のシークエンシングによって
検査した。

【００８３】実施例７ 改良型の共通フィターゼ（共通フィターゼ-10）アミノ
酸配列のデザイン GCG配列解析パッケージ（GCG Sequence Analysis Packa
ge）リリース9.0（Devereuxら、1984（前記））中のPIL
EUPプログラムを、標準的パラメーター（ギャップ生成
ペナルティ12、ギャップ伸長ペナルティ4）で用いて、
共通フィターゼ-10のデザインに用いるアラインメント
を算出した。ギャップの位置はテキストエディターを用
いて精密化した。

【００８４】以下の配列を、表2に記したアミノ酸（a
a）から始めて担子菌フィターゼのアラインメントを作
製するために用いた。

【００８５】

【表２】 対応するアミノ酸共通配列（basidio）の算
出のために用いた5種類の担子菌フィターゼの由来およ
びボートウェイト ‐パキシラス・インボルタス（Paxillus involutus）NN
005693株由来のphyA1、aa21、ボートウェイト0.5（国際
公開公報第98／28409号） ‐パキシラス・インボルタスNN005693株由来のphyA2、a
a21、ボートウェイト0.5（国際公開公報第98／28409
号） ‐トラメテス・ピューベセンス（Trametes pubescens）
NN9343株由来のphyA、aa24、ボートウェイト1.0（国際
公開公報第98／28409号） ‐アグロシベ・ペディアデス（Agrocybe pediades）NN0
09289株由来のphyA、aa19、ボートウェイト1.0（国際公
開公報第98／28409号） ‐ペニオフォラ・リシイ（Peniophora lycii）NN006113
株由来のphyA、aa21、ボートウェイト1.0（国際公開公
報第98／28409号）

【００８６】アラインメントを図10〜11に示す。

【００８７】表3には、最終的なアラインメントを作製
するために用いた遺伝子を列挙する。アラインメントの
作製に用いる配列の最初のアミノ酸（aa）を微生物の名
称の後に記した。

【００８８】

【表３】 共通フィターゼ10のデザインに用いたフィタ
ーゼ配列の由来およびボートウェイト ‐アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）9
A-1株由来のphyA、aa27、ボートウェイト0.5（Mitchell
ら、1997（前記）） ‐アスペルギルス・テレウスcbs116.46株由来のphyA、a
a27、ボートウェイト0.5（欧州特許第897 985号、図1） ‐黒色アスペルギルス・アワモリ株（Aspergillus nige
r var. awamori）由来のphyA、aa27、ボートウェイト0.
5（Piddingtonら、1993（前記）） ‐黒色アスペルギルスNRRL3135株由来のphyA、aa27、ボ
ートウェイト0.5（van Hartingsveldtら、1993（前
記）） ‐アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumiga
tus）ATCC 13073株由来のphyA、aa26、ボートウェイト
0.2（Pasamontesら、1997（前記）） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 32722株由来のph
yA、aa26、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 58128株由来のph
yA、aa26、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 26906株由来のph
yA、aa26、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐アスペルギルス・フミガーツスATCC 32239株由来のph
yA、aa30、ボートウェイト0.2（欧州特許第897 985号、
図1） ‐エメリセラ・ニドゥランス（Emericella nidulans）
由来のphyA、aa25、ボートウェイト1.0（Pasamontes
ら、1997a（前記）） ‐タラロマイセス・サーモフィリス（Talaromyces ther
mophilus）ATCC 20186株由来のphyA、aa24、ボートウェ
イト1.0（Pasamontesら、1997a（前記）） ‐ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora the
rmophila）由来のphyA、aa19、ボートウェイト1.0（Mit
chellら、1997（前記）） ‐サーモマイセス・ラヌジノサ（Thermomyces lanugino
sa）由来のphyA、aa36、ボートウェイト1.0（Berka, R.
M.ら、Molecular characterization and expression o
f a phytase gene from the thermophilic fungus Ther
momyces lanuginosus. Appl. Environ. Microbiol. 64,
4423-4427 (1998)） ‐5種類の担子菌フィターゼの共通配列、ボートウェイ
ト1.0（Basidio、図10〜11）

【００８９】対応するアラインメントを図12〜16に示
す。

【００９０】共通フィターゼ-10のアミノ酸配列の算出 アラインメントを改良するために、本発明者らは、未確
定の配列位置を依然として含む（図10〜11参照）4種類
の異なる担子菌に由来する5種類のフィターゼの共通配
列（Basidioと呼ぶ）、最初の共通フィターゼの算出の
ために用いたフィターゼ配列のほぼすべて、および子嚢
菌サーモマイセス・ラヌジノサス（Thermomyces lanugi
nosus）由来の新たな1つのフィターゼ配列を組み合わ
せ、より長い1つのアラインメントとした。

【００９１】本発明者らは複数性を2.0、閾値を3に設定
した。用いたボートウェイトの一覧を表3に示す。アラ
インメントおよび対応する共通配列を図12〜16に示す。
新たな共通フィターゼ-10配列は、最初の共通フィター
ゼと比較して32個のアミノ酸が異なる。PRETTYプログラ
ムでは共通アミノ酸残基を算出できなかった位置は実施
例6で述べた規則に従って充填した。プログラムにより
提示された残基の置換は行わなかった。

【００９２】さらに、本発明者らは、担子菌フィターゼ
のすべてを、アラインメントにおけるボートウェイトを
0.2とする個々のアミノ酸配列として含めた。対応する
アラインメントを図20〜24に示す。算出した共通アミノ
酸配列（共通フィターゼ-11）には共通フィターゼ-10の
配列とは以下の点が異なっていた：D35X、X(K)69K、X
(E)100E、A101R、Q134N、X(K)153N、X(H)190H、X(A)204
S、X(E)220D、E222T、V227A、X(R)271R、H287A、X(D)28
8D、X(K)379K、X(I)389I、E390X、X(E)415E、X(A)416
A、X(R)446L、E463A、なお、以上の番号形式は図17〜19
の通りである。

【００９３】文字Xはプログラムで共通アミノ酸を算出
できなかったことを意味し、括弧内のアミノ酸は共通フ
ィターゼ-10に最終的に含めたアミノ酸に対応する。

【００９４】本発明者らは、改良型フィターゼ共通配列
10および11から推測された単一アミノ酸置換が最初の共
通フィターゼ-1の安定性に及ぼす影響についても検討し
た。その方法については実施例8で説明する。

【００９５】共通フィターゼ-10アミノ酸配列のDNA配列
への変換 A.テレウス（A. terreus）cbs116.46株フィターゼの最
初の26アミノ酸残基をシグナルペプチドとして用い、そ
のため、共通フィターゼ-10のN末端に融合させた。用い
た手順の詳細は実施例6で説明している。

【００９６】この結果得られたfcp10遺伝子の配列を図1
7〜19に示す。

【００９７】共通フィターゼ-10遺伝子（fcp10）の構築
およびクローニング センスおよびアンチセンス鎖の配列を交互に用いること
により、算出したfcp10のDNA配列を85bpずつのオリゴヌ
クレオチドに分割した。オリゴヌクレオチドはいずれも
対合ストランドの前および後のオリゴヌクレオチドと20
bpずつ重複している。ミクロシンス社（Microsynth）
（Balgach、Switzerland）から購入し、PAGE精製を行っ
た形で入手した全プライマーの位置を図17〜19に示す。

【００９８】PCR反応 3種類のPCR反応において合成されたオリゴヌクレオチド
から遺伝子の全体を構成した。PCRにはベーリンガーマ
ンハイム社（Boehringer Mannheim）の高性能キット（H
igh Fidelity Kit）（Boehringer Mannheim、Germany）
およびAMSバイオテクノロジー社（AMS Biotechnology）
（Europe）Ltd.（Lugano、Switzerland）のプロトコー
ル（The Protokol（登録商標））サーマルサイクラーを
用いた。以下のオリゴヌクレオチドを0.2pmol／mlの濃
度で用いた。

【００９９】新たに合成したオリゴヌクレオチドには10
という数字を付した。このフィターゼは最初の共通フィ
ターゼ-1と比較して以下の32カ所に置換があり、図17〜
19ではこれらに下線を施している：Y54F、E58A、D69K、
D70G、A94K、N134Q、I158V、S187A、Q188N、D197N、S20
4A、T214L、D220E、L234V、A238P、D246H、T251N、Y259
N、E267D、E277Q、A283D、R291I、A320V、R329H、S364
T、I366V、A379K、S396A、G404A、Q415E、A437G、A463
E。

【０１００】オリゴヌクレオチドの統合には以下の4種
の短いPCRプライマーを用いた：

【０１０１】 PCR反応a：10μl 混合物1.10（2.0pmolの各オリゴヌクレオチド） 2μl ヌクレオチド（10mMの各ヌクレオチド） 2μl プライマーCP-a（10pmol／ml） 2μl プライマーCP-c.10（10pmol／ml） 10.0μl PCRバッファー 0.75μl ポリメラーゼ混合物（2.6U） 73.25μl H₂O

【０１０２】 PCR反応b：10μl 混合物2.10（2.0pmolの各オリゴヌクレオチド） 2μl ヌクレオチド（10mMの各ヌクレオチド） 2μl プライマーCP-b（10pmol／ml） 2μl プライマーCP-e（10pmol／ml） 10.0μl PCRバッファー 0.75μl ポリメラーゼ混合物（2.6U） 73.25μl H₂O

【０１０３】PCR反応aおよびbに対する反応条件： ステップ1 2分間‐45℃ ステップ2 30秒間‐72℃ ステップ3 30秒間‐94℃ ステップ4 30秒間‐52℃ ステップ5 1分間‐72℃ ステップ3から5までを40回繰り返した。

【０１０４】PCR産物（670および905bp）をアガロース
ゲル電気泳動（0.9％アガロース）およびそれに続くゲ
ル抽出（QIAEX IIゲル精製キット（Gel Extraction Ki
t）、Qiagen、Hilden、Germany）によって精製した。精
製したDNA断片をPCR反応cに用いた。

【０１０５】 PCR反応c：6μl 反応aのPCR産物（約50ng） 6μl 反応bのPCR産物（約50ng） 2μl プライマーCP-a（10pmol／ml） 2μl プライマーCP-e（10pmol／ml） 10.0μl PCRバッファー 0.75μl ポリメラーゼ混合物（2.6U） 73.25μl H₂O

【０１０６】PCR反応cに関する反応条件： ステップ1 2分間‐94℃ ステップ2 30秒間‐94℃ ステップ3 30秒間‐55℃ ステップ4 1分間‐72℃ ステップ2から4までを31回繰り返した。

【０１０７】この結果得られたPCR産物（1.4kb）を上記
の通りに精製してEcoRIで消化し、EcoRIで消化した脱リ
ン酸pBsk(-)ベクター（Stratagene、La Jolla、CA、US
A）中に連結した。この連結混合物1μlを大腸菌XL-1コ
ンピテント細胞（Stratagene、La Jolla、CA、USA）の
形質転換に用いた。標準的手順はすべてサムブルック
（Sambrook）ら（1987（前記））に記載された通りに行
った。構築された遺伝子（fcp10）のDNA配列は当業者に
公知のシークエンシングによって確認した。

【０１０８】実施例８ 共通フィターゼ-10および／または共通フィターゼ-11の
アミノ酸配列によって推測された単一変異の導入による
共通フィターゼ-1の熱安定性の向上 相同遺伝子の熱安定性を高めるために、関心対象の蛋白
質と算出した共通配列との間で異なる各アミノ酸残基の
安定化効果を検討すること、および関心対象の蛋白質に
安定化変異をすべて組み入れることも可能である。本発
明者らは共通フィターゼ-1を関心蛋白質として用い、共
通フィターゼ-1と共通フィターゼ-10および／または-11
との間で異なる34個のアミノ酸が蛋白質安定性に及ぼす
影響を単一変異によって検討した。

【０１０９】黒色アスペルギルス、S.セレビシエ（S. c
erevisiae）またはH.ポリモルファ（H. polymorpha）で
発現させるためのムテイン（mutein）を作製するため
に、それぞれの共通フィターゼ遺伝子を含む発現プラス
ミドを部位特異的変異誘発のためのテンプレートとして
用いた（実施例11〜13参照）。変異の誘導は、ストラタ
ジーン社（Stratagene）（La Jolla、CA、USA）の「ク
イックエクスチェンジ（quick exchange）（登録商標）
部位特異的変異誘発キット」を製造者の手順書に従って
用い、対応するプライマーを用いて行った。作製したす
べての変異およびそれらに対応するプライマーの概要を
表4に示す。目的の変異を有するプラスミドを、当技術
分野で公知のDNA配列解析によって同定した。

【０１１０】

【表４】 共通フィターゼの部位特異的変異誘発のため
に用いたプライマー （置換した塩基は太字で強調した。制限部位の導入部は
配列の上方に表記した。括弧内に制限部位を記している
部分では、表記部位が変異の導入によって破壊され
た。） 他の変異については適宜とした。

【０１１１】サッカロミセスセレビシエ（S. cerevisia
e）で発現させた精製フィターゼ（実施例14）の至適温
度は、実施例14に概説した通りに測定した。表5は、導
入した各変異の共通フィターゼ-1の安定性に対する効果
を示す。

【０１１２】

【表５】 共通フィターゼ-1における個々のアミノ酸置
換の安定性効果 （+または-はそれぞれ蛋白質安定性に対する最大1℃の
正または負の効果を意味し、++および--はそれぞれ蛋白
質安定性に対する1℃から3℃までの正または負の効果を
意味し、10または11の数字はアミノ酸置換が推測された
フィターゼ共通配列に対応する。） ^★：このアミノ酸置換は別の変異誘発時に見いだされ
た。

【０１１３】本発明者らは、本実施例における上記のプ
ライマーおよび技法を用いて、共通フィターゼ-1に8種
類の正の変異（E58A、D197N、E267D、R291I、R329H、S3
64T、A379K、G404A）を組み入れた。さらに、フィター
ゼの触媒特性に主に影響を及ぼす変異Q50TおよびK91Aも
導入した（欧州特許第897 985号のほか、実施例14も参
照のこと）。この結果得られたフィターゼ遺伝子（共通
フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91A）のDNAおよびアミ
ノ酸配列を図25〜27に示す。これにより、共通フィター
ゼの至適温度および融点は7℃上昇した（図41、42、4
3）。

【０１１４】本発明者らは表5の結果を用いて、共通フ
ィターゼ-1の安定性に強力な負の影響を及ぼすことが判
明した変異K94A、V158IおよびA396Sの逆変異を行うこと
により、共通フィターゼ10の熱安定性をさらに改良し
た。この結果得られた蛋白質が共通フィターゼ-10-ther
mo [3]である。さらに、本発明者らは共通フィターゼの
触媒特性に主に影響を及ぼす変異Q50TおよびK91Aも導入
した（欧州特許第897 485号のほか、実施例14ならびに
図40および41も参照のこと）。この結果得られたDNAお
よびアミノ酸配列を図28〜30に示す。この最適化された
フィターゼの至適温度および融点は共通フィターゼ-10
よりも4℃高かった（図38および39）。さらに、このフ
ィターゼはフチン酸を基質とする比活性も著しく高く、
pH 5.5での値は250U／mgであった（図40）。

【０１１５】実施例９ 対応する共通フィターゼ-1および共通フィターゼ10残基
によるアミノ酸残基の置換によるA.フミガーツス（A. f
umigatus）ATCC 13073株のフィターゼの安定化 A.フミガーツス13073株フィターゼが図2〜6のアライン
メントのうちで対応する共通フィターゼのアミノ酸残基
を含まない唯一またはほぼ唯一のフィターゼである6つ
の典型的な位置で、非共通型アミノ酸残基を共通型のも
のに置換した。1回目には、Q51T置換およびA.テレウス
（A. terreus）cbs.116.46フィターゼのシグナル配列を
含むA.フミガーツス13073株フィターゼにおける以下の
アミノ酸を置換した（図31〜33参照）： 括弧内の数字は図2〜6の番号形式を指す。

【０１１６】2回目には、共通フィターゼ-10配列中に認
められ、共通フィターゼ-1（表5）における単一変異と
して検討した7つの安定化アミノ酸置換のうち4つ（E59
A、R329H、S364T、G404A）を、A.フミガーツスα変異体
にさらに導入した。さらに、フィターゼのプロテアーゼ
感受性を低下させることが示されたアミノ酸置換S154N
も導入した。

【０１１７】変異は実施例8（表6参照）の記載の通りに
導入し、実施例11から13までの記載の通りに発現させ
た。この結果得られたA.フミガーツス13073株フィター
ゼ変異体をα変異体およびα変異型-E59A-S154N-R329H-
S364T-G404Aと称した。

【０１１８】A.フミガーツス13073株フィターゼα変異
体の至適温度（60℃、図46）および融点（67.0℃、図4
5）は、野生型の値（至適温度：55℃、T_m：60℃）と比
べて5〜7℃高かった。5つの付加的なアミノ酸置換によ
り、至適温度はさらに3℃上昇した（図46）。

【０１１９】

【表６】 A.フミガーツスATCC 13073株フィターゼの安
定化のための変異誘発プライマー

【０１２０】実施例10 黒色アスペルギルス（A. niger）NRRL 3135株フィター
ゼの活性部位アミノ酸残基の共通フィターゼ-1への導入 本発明者らは、活性部位の全アミノ酸残基を明らかにす
るために、黒色アスペルギルスNRRL 3135株フィターゼ
の結晶構造を用いた（参照実施例および欧州特許第897
010号を参照）。本発明者らは図2〜6のアラインメント
を用いて以下の活性部位残基、およびさらに共通フィタ
ーゼ-1の同一でない隣接残基を黒色アスペルギルスフィ
ターゼのものと置換した：

【０１２１】この新たな共通フィターゼ-7の蛋白質配列
を実施例6で記載した通りにDNA配列に逆翻訳した（図34
〜36）。対応する遺伝子（fcp7）は、以下のオリゴヌク
レオチド混合物を用いて実施例6における記載の通りに
作製した：

【０１２２】オリゴヌクレオチドのDNA配列を図34〜36
に示す。新たに合成したオリゴヌクレオチドには7の数
字をさらに付した。実施例6で述べたものと同じPCRプラ
イマーを用いてオリゴヌクレオチドを統合した後、実施
例11〜13の記載の通りに遺伝子を発現ベクター中にクロ
ーニングした。

【０１２３】ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula po
lymorpha）における発現後に精製した共通フィターゼ-7
のpHプロフィールは、黒色アスペルギルスNRRL 3135株
フィターゼのものと極めて類似していた（図44参照）。

【０１２４】実施例11 ハンゼヌラ・ポリモルファにおける共通フィターゼ遺伝
子の発現 pBsk^-fcpまたはその変異体のEcoRI断片を、S.セレビシ
エ（S. cerevisiae）由来のura3選択マーカー、ギ酸デ
ヒドロゲナーゼ（FMD）プロモーター配列およびH.ポリ
モルファ（H. polymorpha）由来のメタノール酸化酵素
（MO）ターミネーター配列に基づくH.ポリモルファ発現
ベクターpFPMT121のマルチクローニング部位に挿入する
ことにより、H.ポリモルファ（H. polyrnorpha）RB11株
（Gellissenら、1994）の形質転換のために用いるフィ
ターゼ発現ベクターを作製した。fcp遺伝子の5'末端をM
OXターミネーターの3'末端側にあるFMDプロモーターと
融合させた（Gellissenら、1996；欧州特許第0299 108
B号）。この結果得られた発現ベクターをpFPMTfcp、pFP
MTfcp10、pFPMTfcp7と命名した。

【０１２５】作製したプラスミドを大腸菌において増殖
させた。プラスミドDNAは標準的な最新の手順を用いて
精製した。ゲリッセン（Gelissen）ら（1996）に記載さ
れたコンピテント細胞の調製および酵母の形質転換のた
めの手順を用い、オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラ
ーゼ（ura3）に欠損のあるH.ポリモルファRP11株への発
現プラスミドの形質転換導入を行った。それぞれの形質
転換混合物を、2％グルコースおよび1.8％アガーを含む
YNB（0.14％w／v Difco YNBおよび0.5％硫酸アンモニウ
ム）上に播き、37℃でインキュベートした。4〜5日後に
個々の形質転換コロニーを摘出し、上記の液体培地中で
37℃にて2日間増殖させた。続いて、この培養物のアリ
コートを用い、2％グルコースを含むYNB培地を入れた新
しい容器への播種を行った。選択培地中でさらに7回継
代した後、発現ベクターを多量体形式で酵母ゲノム中に
組み込んだ。続いて、3mlの非選択液体培地（YPD、2％
グルコース、10g酵母抽出物および20gのペプトン）中で
さらに2回の継代培養を行うことにより、有糸分裂の面
で安定な形質転換株を得た。遺伝的に均一な組換え株を
得るために、最終的な安定培養物のアリコートを選択平
板培地に播いた。fmdプロモーターの抑制解除のために
グルコースの代わりに2％グリセロールを含むYNB中での
フィターゼ発現を分析するために単一のコロニーを分離
した。共通フィターゼの精製は実施例12の記載の通りに
行った。

【０１２６】実施例12 サッカロミセスセレビシエ（Saccharornyces cerevisia
e）における共通フィターゼ遺伝子の発現および培養上
清からのフィターゼの精製 それぞれ対応するBluescriptプラスミド（pBsk^-fcp、pB
SK^-fcp10、pBsk^-fcp7）から共通フィターゼ遺伝子を単
離して、サッカロミセスセレビシエ発現ベクターpYES2
（Invitrogen、San Diego、CA、USA）の発現カセットの
EcoRI部位に連結するか、またはジェーンズ（Janes）ら
（1990）による記載の通りに短縮型GAPFL（グリセルア
ルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターとp
ho5ターミネーターとの間にサブクローニングした。遺
伝子が正しい配向にあることはPCRによって確認した。I
NVSc1（Invitrogen、San Diego、CA、USA）などのS.セ
レビシエ株の形質転換はヒネン（Hinnen）ら（1978）に
従って行った。GAPFLプロモーターの制御下にあるフィ
ターゼ遺伝子を有する単一のコロニーをそれぞれ摘出
し、5mlの選択培地（SD-ウラシル、Shermanら、1986）
にて30℃で十分に撹拌（250rpm）しながら1日培養し
た。このプレカルチャー物を500mlのYPD培地（Sherman
ら、1986）に添加し、同じ条件下で増殖させた。gal1プ
ロモーターの導入は製造者の指示に従って行った。4日
間インキュベートした後、細胞を除去するために細胞培
地を遠心処理にかけ（7000rpm、GS3ローター、15分、5
℃）、アミコン（Amicon）8400セル（PM30メンブレン）
およびウルトラフリー-15（ultrafree-15）遠心濾過装
置（Biomax-30K、Millipore、Bedford、MA、USA）によ
る限外濾過によって上清を濃縮した。10mM酢酸ナトリウ
ム、pH 5.0を溶出バッファーとして用い、40mlのセファ
デックス（Sephadex）G25超微細カラム（Superfine col
umn）（Pharmacia Biotech、Freiburg、Germany）によ
り濃縮物（10ml）の脱塩を行った。脱塩した試料を2M
(NH₄)₂SO₄に移し、1mlのブチルセファロース4ファース
トフロー（Butyl Sepharose 4 Fast Flow）疎水相互作
用クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech、Fre
iburg、Germany）にかけ、10mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
中2Mから0Mまでの(NH₄)₂SO₄の線形勾配によって溶出さ
せた。漏出物中に溶出したフィターゼを濃縮して、120m
lのセファクリルS-300（Sephacryl S-300）ゲル浸透ク
ロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech、Freibur
g、Germany）にかけた。共通フィターゼ-1および共通フ
ィターゼ-7は均一な対称性ピークを描いて溶出され、SD
S-PAGEにより純度は約95％であることが示された。

【０１２７】実施例13 黒色アスペルギルスにおける共通フィターゼ遺伝子の発
現 遺伝子の開始コドンの上流にBspHI部位、停止コドンの
下流にEcoRV部位を導入するためのテンプレートとしてB
luescriptプラスミドpBsk^-fcp、pBSK^-fcp10およびpBsk^-
fcp7を用いた。エキスパンド（Expand）（登録商標）高
性能PCRキット（High Fidelity PCR Kit）（Boehringer
Mannheim、Mannheim、Germany）を以下のプライマーと
ともに用いた：

【０１２８】反応は供給元による記載の通りに行った。
PCR増幅したfcp遺伝子にはプライマーAsp-1によって導
入された新たなBspHI部位が開始コドンの箇所にあり、
これによって第2のアミノ酸残基がグリシンからセリン
に置換された。続いてDNA断片をBspHIおよびEcoRVで消
化し、黒色アスペルギルスのグルコアミラーゼプロモー
ター（glaA）の下流にあるNcoI部位およびアスペルギル
ス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）トリプトフ
ァンCターミネーター（trpC）（Mullaneyら、1985）の
上流にあるEcoRV部位に連結した。このクローニング手
順の後、PCRによって導入された可能性のある障害を検
出するために遺伝子のシークエンシングを行った。欧州
特許第684 313号の実施例9に記載されたpGLACベクター
に基本的に相当するこの結果得られた発現プラスミド
は、アカパンカビ（Neurospora crassa）のオロチジン-
5'-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyr4）を選択マ
ーカーとして含んでいた。黒色アスペルギルスの形質転
換および共通フィターゼ遺伝子の発現は欧州特許第684
313号に記載された通りに行った。共通フィターゼは実
施例12の記載の通りに精製した。

【０１２９】実施例14 フィターゼ活性および至適温度の測定 フィターゼ活性の測定は、基本的にはミッチェルら（Mi
tchell, D. B.ら、Thephytase subfamily of histidine
acid phosphatases: isolation of genes for two nov
el phytases from the fungi Aspergillus terreus and
Myceliophthora thermophila, Microbiology 143, 245
-252 (1997)）による記載の通りに行った。200mM酢酸ナ
トリウム、pH 5.0中に0.5％フィチン酸（約5mM）を含む
アッセイ混合物における活性を測定した。37℃で15分間
インキュベートした後、等容積の15％トリクロロ酢酸の
添加によって反応を停止させた。100μlのアッセイ混合
物を900μlのH₂Oおよび1mlの0.6M H₂SO₄、2％アスコル
ビン酸および0.5％モリブデン酸アンモニウムと混合す
ることにより、遊離したリン酸を定量した。リン酸カリ
ウム標準溶液を基準として用いた。酵素活性の1単位
は、37℃で1分当たり1μmolのリン酸が遊離する酵素の
量と定義した。蛋白質濃度は、ペース（Pace）ら（199
5）に従って算出した280nmでの酵素吸光係数を用いて求
めた：共通フィターゼ -1、1.101；共通フィターゼ-7、
1.068；共通フィターゼ-10、1.039。

【０１３０】至適pH曲線については、精製した酵素を10
mM酢酸ナトリウム、pH 5.0中に希釈した。希釈した蛋白
質のアリコートを、以下の一連の種々の緩衝液中にある
等容積の1％フィチン酸（約10mM）と混合することによ
ってインキュベーションを開始した：0.4Mグリシン／HC
l、pH 2.5；0.4M酢酸／NaOH、pH 3.0、3.5、4.0、4.5、
5.0、5.5；0.4Mイミダゾール／HCl、pH 6.0、6.5；0.4M
Tris／HCl pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。対照実験に
より、混合手順のpHに対する影響はわずかに過ぎないこ
とが示された。インキュベーションは上記の通りに37℃
で15分間行った。

【０１３１】フィターゼの基質特異性の測定は、アッセ
イ混合物中のフィチン酸を濃度5mMのそれぞれのリン酸
化合物と置換することによって行った。活性試験は上記
の通りに行った。

【０１３２】至適温度を測定するために、酵素（100μ
l）および基質溶液（100μl）を所定温度で5分間プレイ
ンキュベートした。反応は基質溶液を酵素に添加するこ
とによって開始させた。15分間インキュベートした後、
トリクロロ酢酸の添加によって反応を停止させ、遊離し
たリン酸の量を測定した。

【０１３３】最初の共通フィターゼの至適pHは、pH 6.0
〜6.5前後であった（80U／mg）。Q50T変異の導入によ
り、至適pHはpH 6.0に変化した（130U／mg）。K91Aの導
入後には至適pHは酸性pH側に1単位変化し、pH 2.5とpH
6.0との間で高い比活性を示した。これは安定化変異体
および共通フィターゼ-10でともに認められた（図40お
よび41）。

【０１３４】黒色アスペルギルスNRRL 3135株フィター
ゼの触媒特性を共通フィターゼ-1に移入させるために構
築した共通フィターゼ-7のpHプロフィールは、黒色アス
ペルギルスNRRL 3135株フィターゼのものと極めて類似
していた（図44参照）。共通フィターゼ-7の基質特異性
も、共通フィターゼ-1のものよりは黒色アスペルギルス
NRRL 3135フィターゼのものと類似していた。

【０１３５】共通フィターゼ-1の至適温度（71℃）は、
共通配列の算出のために用いた野生型フィターゼの至適
温度（45〜55℃、表7）よりも16〜26℃高かった。改良
型の共通フィターゼ-10では至適温度がさらに80℃に上
昇した（図37）。共通フィターゼ-1-thermo[8]フィター
ゼの至適温度は、過剰産生S.セレビシエ（S. cerevisia
e）株の上清を用いたところ、同じ範囲（78℃）にある
ことが明らかになった。共通フィターゼ-10-thermo[3]-
Q50T-K91Aに関する測定では82℃という最も高い至適温
度に達した。

【０１３６】

【表７】 共通フィターゼならびにA.フミガーツス（A.
fumigatus）、黒色アスペルギルス、E.ニドゥランス
（E. nidulans）およびM.サーモフィラ（M. thermophil
a）由来のフィターゼの至適温度およびT_m値。至適温度
の測定は実施例14における記載の通りに行った。T_m値は
実施例15で説明する示差走査熱量測定法によって測定し
た。

【０１３７】実施例15 示差走査熱量測定（DSC）による融点の測定 フィターゼのアンフォールディング温度を測定するため
に、レーマンら（Lehmann, L.ら、From DNA sequence t
o improved functionality: using protein sequence c
omparisons to rapidly design a thermostable consen
sus phytase, Protein Engineering 13, 49-57 (200
0)）によりすでに発表されている示差走査熱量測定を行
った。試験には50〜60mg／mlの均一なフィターゼ溶液を
用いた。10℃／分という一定の加熱速度で90〜95℃まで
加熱した。

【０１３８】測定された融点は至適温度に関して得られ
た結果を反映するものであった（表7）。デザインした
もののうち最も安定な共通フィターゼは共通フィターゼ
-10-thermo[3]-Q50T-K91Aであり、選択した条件下での
融点は89.3℃であった。これは用いた野生型フィターゼ
の融点より26〜33.6℃高かった。

【０１３９】実施例16 担子菌フィターゼ活性部位の共通フィターゼ-10-thermo
[3]-Q50T-K91Aへの移入 前記の通り（実施例8）、担子菌フィターゼ活性部位に
由来する変異を共通フィターゼ-10に導入した。以下の
a）からe）までの5種類の構築物を調製した： a）この構築物は共通フィターゼ-12と呼ばれ、basidio
共通配列の選択された数の活性部位残基を含む。そのア
ミノ酸配列（consphy12）を図47に示す（最初の26アミ
ノ酸はシグナルペプチドであり、修正された位置には下
線を施している）、 b）以下の変異クラスター（クラスターII）を共通フィ
ターゼ10配列に移入した：S80Q、Y86F、S90G、K91A、S9
2A、K93T、A94R、Y95I、 c）同様に別の変異クラスター（クラスターIII）を移入
した：T129V、E133A、Q143N、M136S、V137S、N138Q、S1
39A、 d）同様にさらに別の変異クラスター（クラスターIV）
を移入した：A168D、E171T、K172N、F173W、 e）最後にこれも別の変異クラスター（クラスターV）を
移入した：Q297G、S298D、G300D、Y305T。

【０１４０】これらの構築物を実施例11〜13の通りに発
現させた。

【０１４１】参考文献 −Akanuma, S.ら、Serial increase in the thermal st
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【０１４２】

【発明の効果】本発明により、微生物を固体担体上に選
択的に固定する、ならびに／または、微生物の増殖およ
び蛋白質の至適産生のために必要な栄養素および他の作
用物質を個別に一定の希釈率でリアクター内に供給する
工程である、蛋白質産生微生物による蛋白質の製造のた
めの連続工程が提供された。さらに、本発明により、発
酵アセンブリを用いた蛋白質の製造のための工程が提供
された。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の工程に用いることのできるアセンブ
リを示す図である。

【図２】 共通フィターゼ配列のデザイン（1位〜100位
まで）を示す図である。各文字は一文字コードによるア
ミノ酸残基を表す。アラインメントの作製には以下の配
列を用いた：アスペルギルス・テレウス（Aspergillus
terreus）9A-1由来のphyA（Mitchellら、1997（前
記）、アミノ酸（aa）27から）、A.テレウス（A. terre
us）cbs116.46由来のphyA（van Loonら、1998、aa27か
ら）、黒色アスペルギルス・アワモリ株（Aspergillus
niger var. awamori）由来のphyA（Piddingtonら、199
3、aa27から）、黒色アスペルギルスT213株由来のphyA
（Mitchellら 1997（前記）、aa27から）、黒色アスペ
ルギルスNRRL3135株由来のphyA（van Hartingsveldt
ら、1993、aa27から）、アスペルギルス・フミガーツス
（Aspergillus fumigatus）ATCC 13073株由来のphyA（P
asamontesら、1997、aa25から）、A.フミガーツス（A.
fumigatus）ATCC 32722株由来のPhyA（欧州特許第897 9
85号、図1、aa27から）、A.フミガーツスATCC 58128株
由来のphyA（欧州特許第897 985号、図1、aa27から）、
A.フミガーツスATCC 26906株由来のphyA（欧州特許第89
7 985号、図1、aa27から）、A.フミガーツスATCC 32239
株由来のphyA（欧州特許第897 985号、図1、aa30か
ら）、エメリセラ・ニドゥランス（Emericella nidulan
s）由来のphyA（Pasamontesら、1997a、aa25から）、タ
ラロマイセス・サーモフィリス（Talaromyces thermoph
ilus）由来のphyA（Pasamontesら、1997a、aa24から）
およびミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora
thermophila）由来のphyA（Mitchellら、1997（前
記）、aa19から）。アラインメントの算出にはPILEUPプ
ログラムを用いた。ギャップの位置の精密化は手作業に
より行った。アラインメントの所与の位置に大文字で表
したアミノ酸残基は、共通残基が確認されたアミノ酸群
に属する。算出した共通配列の下方に、最終的に構築さ
れた共通フィターゼ（Fcp）のアミノ酸配列を太字で示
す。算出した共通配列中のギャップは、実施例6に述べ
る原則に従って手作業で充填した。

【図３】 図2の続きであり、共通フィターゼ配列のデ
ザイン（101位〜200位まで）を示す図である。

【図４】 図2および3の続きであり、共通フィターゼ配
列のデザイン（201位〜300位まで）を示す図である。

【図５】 図2〜4の続きであり、共通フィターゼ配列の
デザイン（301位〜400位まで）を示す図である。

【図６】 図2〜5の続きであり、共通フィターゼ配列の
デザイン（401位〜471位まで）を示す図である。

【図７】 共通フィターゼ-1遺伝子（fcp）および遺伝
子構築に用いたプライマーのDNA配列（1位〜540位ま
で）を示す。算出したアミノ酸配列（図2〜6）を、BACK
TRANSLATEプログラム（Devereuxら、1984（前記））お
よび高発現酵母遺伝子のコドン出現頻度表（GCGプログ
ラムパッケージ9.0）を用いてDNA配列に変換した。A.テ
レウス（A. terreus）cbs.116.46由来のフィターゼのシ
グナルペプチドをN末端と融合させた。太字の塩基は遺
伝子の作製に用いたオリゴヌクレオチドの配列を表す。
各オリゴヌクレオチドの名称は配列の上または下に交互
に記している。下線を付した塩基は遺伝子の開始コドン
および停止コドンを表す。イタリック体で記した塩基
は、2カ所に導入したEcoRI部位を表す。

【図８】 図7の続きであり、共通フィターゼ-1遺伝子
（fcp）および遺伝子構築に用いたプライマーのDNA配列
（541位〜1080位まで）を示す。

【図９】 図7および8の続きであり、共通フィターゼ-1
遺伝子（fcp）および遺伝子構築に用いたプライマーのD
NA配列（1081位〜1426位まで）を示す。

【図１０】 5種類の担子菌フィターゼのアラインメン
トおよび共通配列（1位〜250位まで）を示す。各文字は
一文字コードによるアミノ酸残基を表す。「Basidio」
と称する対応する共通配列のアラインメント作製および
算出には、パキシラス・インボルタス（Paxillus invol
utus）由来のphyA1（aa21）およびphyA2（aa21、国際公
開公報第98／28409号）、トラメテス・ピューベセンス
（Trametes pubescens）（aa24、国際公開公報第98／28
409号）、アグロシベ・ペディアデス（Agrocybe pediad
es）（aa19、国際公開公報第98／28409号）およびペニ
オフォラ・リシイ（Peniophora lycii）（aa21、国際公
開公報第98／28409号）由来のフィターゼの、括弧内に
記したアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列を用いた
（実施例7）。アラインメント作製はPILEPUPプログラム
により行った。ギャップの位置の精密化は手作業により
行った。共通配列はPRETTYプログラムによって算出し
た。共通配列の算出に際して2種類のP.インボルタス
（P. involutus）フィターゼに対するボートウェイト
（vote weight） は0.5とし、他の遺伝子ではいずれも
ボートウェイトを1.0とした。Basidio配列のうち、プロ
グラムで共通残基を決定できなった位置はダッシュで表
した。アラインメントの所与の位置に大文字で表したア
ミノ酸残基は、共通残基が確認されたアミノ酸群に属す
る。

【図１１】 図10の続きであり、5種類の担子菌フィタ
ーゼのアラインメントおよび共通配列（251位〜441位ま
で）を示す。

【図１２】 共通フィターゼ-10のアミノ酸配列のデザ
イン（1位〜100位まで）を示す。PRETTYプログラムによ
り、サーモマイセス・ラヌジノサス（Thermomyces lanu
ginosus）（Berkaら、1998）のフィターゼ配列および5
種類の担子菌由来のフィターゼの共通配列を図2〜6のア
ラインメントに加え、改良型の共通配列を算出した。さ
らに、黒色アスペルギルスT213株のアミノ酸配列は除外
したため、残りの黒色アスペルギルスフィターゼ配列に
対して用いるボートウェイト（vote weight） は0.5と
した。より詳細な情報については実施例8を参照された
い。

【図１３】 図12の続きであり、共通フィターゼ-10の
アミノ酸配列のデザイン（101位〜200位まで）を示す。

【図１４】 図12〜13の続きであり、共通フィターゼ-1
0のアミノ酸配列のデザイン（201位〜300位まで）を示
す。

【図１５】 図12〜14の続きであり、共通フィターゼ-1
0のアミノ酸配列のデザイン（301位〜400位まで）を示
す。

【図１６】 図12〜15の続きであり、共通フィターゼ-1
0のアミノ酸配列のデザイン（401位〜482位まで）を示
す。

【図１７】 共通フィターゼ-10のDNA配列（1位〜540位
まで）およびアミノ酸配列（1位〜177位まで）を示す。
対応するDNA配列の上方に一文字コードを用いてアミノ
酸配列を記した。遺伝子の構築に用いたオリゴヌクレオ
チドの配列は太字で示している。共通フィターゼ-1と比
較して異なるオリゴヌクレオチドおよびアミノ酸は下線
を付して示した。fcp10遺伝子は以下のオリゴヌクレオ
チドを用いて構築した：CP-1、CP-2、CP-3.10、CP-4.1
0、CP-5.10、CP-6、CP-7.10、CP-8.10、CP-9.10、CP-1
0.10、CP-11.10、CP-12.10、CP-13.10、CP-14.10、CP-1
5.10、CP-16.10、CP-17.10、CP18.10、CP-19.10、CP-2
0.10、CP-21.10、CP-22.10。新たに合成したオリゴヌク
レオチドにはさらに10という数字を付した。このフィタ
ーゼは共通フィターゼ-1と対比して以下の32カ所に置換
を有する：Y54F、E58A、D69K、D70G、A94K、N134Q、I15
8V、S187A、Q188N、D197N、S204A、T214L、D220E、L234
V、A238P、D246H、T25S1N、Y259N、E267D、E277Q、A283
D、R291I、A320V、R329H、S364T、I366V、A379K、S396
A、G404A、Q415E、A437G、A463E。下線で強調した変異
は、共通フィターゼ-1における単一変異としての検討で
は共通フィターゼ-1に対する安定効果があることが明ら
かになった。

【図１８】 図17の続きであり、共通フィターゼ-10のD
NA配列（541位〜1080位まで）およびアミノ酸配列（178
位〜357位まで）を示す。

【図１９】 図17および18の続きであり、共通フィター
ゼ-10のDNA配列（1081位〜1426位まで）およびアミノ酸
配列（358位〜467位まで）を示す。

【図２０】 共通フィターゼ-11のデザインのためのア
ラインメント（1位〜100位まで）を示す。共通フィター
ゼ-10のデザインとは異なり、共通フィターゼ-11のアミ
ノ酸配列のデザインのためには、すべての担子菌フィタ
ーゼを独立した配列として用い、それぞれの担子菌配列
に対するボートウェイトを0.2とした。さらに、黒色ア
スペルギルスT213株フィターゼのアミノ酸配列を再びア
ラインメントの作製に用いた。

【図２１】 図20の続きであり、共通フィターゼ-11の
デザインのためのアラインメント（101位〜200位まで）
を示す。

【図２２】 図20および21の続きであり、共通フィター
ゼ-11のデザインのためのアラインメント（201位〜300
位まで）を示す。

【図２３】 図20〜22の続きであり、共通フィターゼ-1
1のデザインのためのアラインメント（301位〜400位ま
で）を示す。

【図２４】 図20〜23の続きであり、共通フィターゼ-1
1のデザインのためのアラインメント（401位〜482位ま
で）を示す。

【図２５】 共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91Aの
DNA配列（1位〜540位まで）およびアミノ酸配列（1位〜
180位まで）を示す。対応するDNA配列の上部に一文字コ
ードを用いてアミノ酸配列を記した。置換されたアミノ
酸残基には下線を施している。遺伝子の停止コドンには
星印（^★）を付している。

【図２６】 図25の続きであり、共通フィターゼ-1-the
rmo[8]-Q50T-K91AのDNA配列（541位〜1080位まで）およ
びアミノ酸配列（181位〜360位まで）を示す。

【図２７】 図25および26の続きであり、共通フィター
ゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91AのDNA配列（1081位〜1410位
まで）およびアミノ酸配列（361位〜467位まで）を示
す。

【図２８】 共通フィターゼ-10-thermo[3]-Q50T-K91A
のDNA配列（1位〜600位まで）およびアミノ酸配列（1位
〜200位まで）を示す。対応するDNA配列の上部に一文字
コードを用いてアミノ酸配列を記した。置換されたアミ
ノ酸残基には下線を施している。遺伝子の停止コドンに
は星印（^★）を付している。

【図２９】 図28の続きであり、共通フィターゼ-10-th
ermo[3]-Q50T-K91AのDNA配列（601位〜1200位まで）お
よびアミノ酸配列（201位〜400位まで）を示す。

【図３０】 図28および29の続きであり、共通フィター
ゼ-10-thermo[3]-Q50T-K91AのDNA配列（1201位〜1404位
まで）およびアミノ酸配列（401位〜467位まで）を示
す。

【図３１】 A.フミガーツスATCC 13073株フィターゼα
変異体のDNA配列（1位〜540位まで）およびアミノ酸配
列（1位〜180位まで）を示す。対応するDNA配列の上部
に一文字コードを用いてアミノ酸配列を記した。置換さ
れたアミノ酸残基には下線を施している。遺伝子の停止
コドンには星印（^★）を付している。

【図３２】 図31の続きであり、A.フミガーツスATCC 1
3073株フィターゼα変異体のDNA配列（541位〜1140位ま
で）およびアミノ酸配列（181位〜380位まで）を示す。

【図３３】 図31および32の続きであり、A.フミガーツ
スATCC 13073株フィターゼα変異体のDNA配列（1141位
〜1404位まで）およびアミノ酸配列（381位〜467位ま
で）を示す。

【図３４】 共通フィターゼ-7のDNA配列（1位〜540位
まで）およびアミノ酸配列を示す。対応するDNA配列の
上部に一文字コードを用いてアミノ酸配列を記した。遺
伝子の構築に用いたオリゴヌクレオチドの配列は太字で
示している。置換されたオリゴヌクレオチドおよびアミ
ノ酸には下線を施し、対応するトリプレットを小文字で
強調した。fcp7遺伝子は以下のオリゴヌクレオチドから
構築した：CP-1、CP-2、CP-3、CP-4.7、CP-5.7、CP-6、
CP-7、CP-8.7、CP-9、CP-10.7、CP-11.7、CP-12.7、CP-
13.7、CP-14.7、CP-15.7、CP-16、CP-17.7、CP-18.7、C
P-19.7、CP-20、CP-21、CP-22。新たに合成したオリゴ
ヌクレオチドにはさらに7という数字を付した。このフ
ィターゼは最初の共通フィターゼ-1と対比して以下の24
カ所に置換を有する：S89D、S92G、A94K、D164S、P201
S、G203A、G205S、H212P、G224A、D226T、E255T、D256
E、V258T、P265S、Q292H、G300K、Y3O5H、A314T、S364
G、M365I、A397S、S398A、G404AおよびA405S。

【図３５】 図34の続きであり、共通フィターゼ-7のDN
A配列（541位〜1080位まで）およびアミノ酸配列を示
す。

【図３６】 図34および35の続きであり、共通フィター
ゼ-7のDNA配列（1081位〜1426位まで）およびアミノ酸
配列を示す。

【図３７】 共通フィターゼ-1および共通フィターゼ-1
0の示差走査熱量測定（DSC）の結果を示すグラフであ
る。蛋白質試料を約50〜60mg／mlに濃縮し、10mM酢酸ナ
トリウム、pH 5.0に対して十分に透析した。10℃／分と
いう一定の加熱速度で95℃まで加熱した。DSCによる共
通フィターゼ-10（上のグラフ）の融点は85.4℃であ
り、これは共通フィターゼ-1の融点（78.1℃、下のグラ
フ）よりも7.3℃高かった。

【図３８】 共通フィターゼ-10-thermo [3]-Q50Tおよ
び共通フィターゼ-10-thermo[3]-Q50T-K91Aの示差走査
熱量測定（DSC）の結果を示すグラフである。蛋白質試
料を約50〜60mg／mlに濃縮し、10mM酢酸ナトリウム、pH
5.0に対して十分に透析した。10℃／分という一定の加
熱速度で95℃まで加熱した。DSCによる共通フィターゼ-
10-thermo-[3]-Q50T（上のグラフ）の融点は88.6℃であ
り、共通フィターゼ-10-thermo[3]-Q50T-K91Aの融点は8
9.3℃であった。

【図３９】 共通フィターゼ-1、共通フィターゼ-10お
よび共通フィターゼ-10-thermo[3]-Q50Tの至適温度の比
較を示すグラフである。至適温度を測定するために、37
℃から86℃までの間の一連の温度でフィターゼ標準アッ
セイ法を行った。測定にはS.セレビシエ（S. cerevisia
e）形質転換株の希釈上清を用いた。上清の他の成分
は、至適温度の測定に何ら影響を及ぼさなかった：白三
角、共通フィターゼ-1；白菱形、共通フィターゼ-10；
黒四角、共通フィターゼ10-thermo[3]-Q50T。

【図４０】 共通フィターゼ-10ならびにその変異体the
rmo[3]-Q50Tおよびthermo[3]-Q50T-K91AのpH依存的活性
プロフィールおよび基質特異性を示すグラフである。グ
ラフa）は共通フィターゼ-10（白四角）、共通フィター
ゼ-10-thermo[3]-Q50T（黒丸）および共通フィターゼ-1
0-thermo[3]-Q50T-K91A（白三角）のpH依存的活性プロ
フィールを示す。フィターゼ活性は、種々のpH値におけ
る適切な緩衝液（実施例15参照）中での標準アッセイ法
を用いて測定した。グラフb）は、標準アッセイにおけ
る表記化合物によるフチン酸置換によって検討したそれ
ぞれの基質特異性を示す；オープンバー、共通フィター
ゼ-10（白のバー、共通フィターゼ-10-thermo-Q50T；黒
のバー、共通フィターゼ-10-thermo-Q50T-K91A）。数字
は以下の化合物に対応する：1、フチン酸；2、p-ニトロ
フェニルリン酸；3、フェニルリン酸；4、フルクトース
-1,6-二リン酸；5、フルクトース-6-リン酸；6、グルコ
ース-6-リン酸；7、リボース-5-リン酸；8、DL-グリセ
ロール-3-リン酸；9、グリセロール-2-リン酸；10、3-
ホスホグリセリン酸；11、ホスホエノールピルビン酸；
12、AMP；13、ADP；14、ATP。

【図４１】 共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50Tおよび
共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91AのpH依存的活性
プロフィールおよび基質特異性を示すグラフである。グ
ラフa）はQ50T（黒四角）およびQ50T-K91A変異体（白三
角）のpH依存的活性プロフィールを示す。フィターゼ活
性は、種々のpH値における適切な緩衝液（実施例15参
照）中での標準アッセイ法を用いて測定した。グラフ
b）は、標準アッセイ法における表記化合物によるフチ
ン酸置換によって検討したそれぞれの基質特異性を示す
（無色のバー、共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T、色
付きバー、共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91A）。
基質の一覧は図40の説明文に記した通りである。

【図４２】 共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50Tおよび
共通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91Aの示差走査熱量
測定（DSC）の結果を示すグラフである。蛋白質試料を
約50〜60mg／mlに濃縮し、10mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
に対して十分に透析した。10℃／分という一定の加熱速
度で95℃まで加熱した。DSCによる共通フィターゼ-1-th
ermo[8]-Q50T（上のグラフ）の融点は84.7℃であり、共
通フィターゼ-1-thermo[8]-Q50T-K91Aの融点は85.7℃で
あった。

【図４３】 共通フィターゼ-1、共通フィターゼ-1-the
rmo[3]および共通フィターゼ-1-thermo[8]の至適温度の
比較を示すグラフである。至適温度を測定するために、
37℃から86℃までの間の一連の温度でフィターゼ標準ア
ッセイ法を行った。測定にはサッカロミセスセレビシエ
（S. cerevisiae）形質転換株の上清から得た精製蛋白
質を用いた。白丸、共通フィターゼ-1；白四角、共通フ
ィターゼ-1-thermo[3]；白三角、共通フィターゼ-1-the
rmo[8]。

【図４４】 共通フィターゼ-1、共通フィターゼ-7およ
び黒色アスペルギルスNRRL 3135株由来のフィターゼのp
H依存的活性プロフィールおよび基質特異性の比較を示
すグラフである。グラフa）は共通フィターゼ-1（黒四
角）、黒色アスペルギルスNRRL 3135株由来のフィター
ゼ（白丸）および共通フィターゼ-7（白三角）のpH依存
的活性プロフィールを示す。フィターゼ活性は、種々の
pH値における適切な緩衝液（実施例15参照）中での標準
アッセイ法を用いて測定した。グラフb）は、標準アッ
セイ法における表記化合物によるフチン酸置換によって
検討したそれぞれの基質特異性を示す（黒のバー、黒色
アスペルギルスNRRL 3135フィターゼ；灰色のバー、共
通フィターゼ-1、斜線付きバー、共通フィターゼ-7）。
基質の一覧は図40の説明文に記した通りである。

【図４５】 A.フミガーツスATCC 13073株、および以下
のアミノ酸置換を含むその安定化α変異体由来のフィタ
ーゼの示差走査熱量測定（DSC）の結果を示すグラフで
ある：F55Y、V100I、F114Y、A243L、S265P、N294D。蛋
白質試料を約50〜60mg／mlに濃縮し、10mM酢酸ナトリウ
ム、pH 5.0に対して十分に透析した。10℃／分という一
定の加熱速度で95℃まで加熱した。DSCによる共通A.フ
ミガーツス13073フィターゼ（下のグラフ）の融点は62.
5℃であり、α-変異体の融点は67.0℃であった。

【図４６】 A.フミガーツス13073野生型フィターゼ、
そのα変異体、およびさらに安定化されたα変異体（E5
9A-S126N-R329H-S364T-G404A）の至適温度の比較を示す
グラフである。至適温度を測定するために、37℃から75
℃までの間の一連の温度でフィターゼ標準アッセイ法を
行った。測定にはサッカロミセスセレビシエ（S. cerev
isiae）形質転換株の希釈上清を用いた。上清の他の成
分は、至適温度の測定に何ら影響を示さなかった。白
丸、A.フミガーツスATCC 13073株フィターゼ；白三角、
A.フミガーツスATCC 13073α変異体；白四角、A.フミガ
ーツスATCC 13073α変異体（E59A-S126N-R329H-S364T-G
404A）-Q27T；黒四角、A.フミガーツスATCC 13073α変
異体-（E59A-S126N-R329H-S364T-G404A）-Q27T-K68A。
A.フミガーツスα変異体における変異Q51TおよびK92Aは
それぞれ共通フィターゼにおけるQ50TおよびK91Aに対応
する。

【図４７】 「basidio」共通配列から共通フィターゼ-
10-thermo[3]-Q50T-K91Aに移入された多数の活性部位残
基を含む共通フィターゼ-12（consphy12）のアミノ酸配
列を示す。

【符号の説明】

１ 発酵槽、２ 貯蔵フラスコ、２ａ 送込管、３ ポ
ンプ、４ 天秤、５回収フラスコ、５ａ 排出管、６
ポンプ、７ 主調節ユニット、８ 温度調節ユニット、
９ ガス送込管、１０ ガス排出管、１１ 調節ユニッ
ト、１２ 回路、１３ ポンプ、１４ ガス送込流調節
器、１５ ガス排出流調節器、１６除菌フィルター、１
７ 制御システム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トールステン ミュー ドイツ国 ルベルクセン アム ブラウエ ン ベルグ ６ (72)発明者 マルカス ルッケル ドイツ国 ペンツブルグ バーケンストラ ッセ 25

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生細胞に関する反応を行うために適した
   容器、 液体の供給のために該容器と接続された少なくとも2つ
   の貯蔵フラスコ（storage flask）、および該液体を該
   貯蔵フラスコから該容器に輸送するための手段、 該貯蔵フラスコの内容物の該容器への供給を監視する個
   々の器具、 該容器と接続された回収フラスコ、および発酵液体培地
   を該容器から該回収フラスコに輸送するための手段、な
   らびに該貯蔵フラスコから該容器への液体の個々の供給
   速度を変化させることによって該容器における一定の希
   釈率を制御および維持するための装置を含む発酵アセン
   ブリ。
2. 【請求項２】 貯蔵フラスコ2からの液体供給のための
   送込管2aが備え付けられた発酵槽1、液体を貯蔵フラス
   コ2から発酵槽1に輸送するためのポンプ3、発酵槽に供
   給され、そこから排出される液体の量を監視するための
   天秤4、ガス送込管9および排出管10、排出管5aを介して
   発酵液体培地を回収フラスコ5に排出するためのポンプ
   6、工程全体の監視および方向付けを行うための主調節
   ユニット7、温度、pH、ガス圧、発酵槽内容物および消
   泡剤供給に関する個々の制御システム17の監視および方
   向付けを行うための調節ユニット11、ガス供給および試
   料採取のためポンプ13を含む回路12、ガス送込流調節器
   14および排出流調節器15、ならびに選択的に除菌フィル
   ター16および温度調節ユニット8を含む、請求項１記載
   および図1によるアセンブリ。
3. 【請求項３】 生細胞の培養物からの蛋白質を製造する
   ための連続工程であって、細胞の増殖および所望の蛋白
   質の至適産生のために必要な栄養素および他の作用物質
   が個別に一定の希釈率でリアクター内に供給される工
   程。
4. 【請求項４】 細胞がフィターゼ産生微生物である、請
   求項３記載の工程。
5. 【請求項５】 炭素源がグリセロールまたは糖質様単
   糖、二糖、もしくは多糖である、請求項３または４記載
   の工程。