JP2001292789A

JP2001292789A - 耐熱性フィターゼをコードするｄｎａを得る方法

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Publication number: JP2001292789A
Application number: JP2001074974A
Authority: JP
Inventors: Loon Adolphus Van; ファンルーンアドルファス; David Mitchell; ミッチェルデイヴィッド
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 2001-03-15
Publication date: 2001-10-23
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: DE69535097D1; JP3382228B2; EP0684313B1; ATE332378T1; DK0684313T3; EP0684313A2; EP0684313A3; ES2268687T3; CN1058524C; CN1277207A; DE69535097T2; JPH0856676A; CN1126243A; JP3281508B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】耐熱性フィターゼをコードするＤＮＡを得る
方法の提供。【解決手段】ミセリオフトラ・サーモフィラ；アスペ
ルギルス・ニードランス・アスペルギルス・フミガツ
ス；アスペルギルス・テレウス９Ａ１；もしくはタラロ
ミセス・サーモフィルスからのＤＮＡ由来の特定のプロ
ーブを使用するハイブリダイゼーションによって、特定
の１２種類の耐熱性真菌から、フィターゼ活性を有する
耐熱性ポリペプチドをコードするＤＮＡあるいはフィタ
ーゼ活性をなおも有する該ポリペプチドの断片をコード
するＤＮＡを得る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明は、フィターゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする特定の真菌由来のＤＮＡを得
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フィターゼ（ｍｙｏ−イノシトールヘキ
サキスリン酸ホスホヒドロラーゼ；EC3.1.3.8）はフィ
チン酸（ｍｙｏ−イノシトールヘキサキスリン酸）を加
水分解してｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸にする酵
素であり、有用な飼料の添加剤であることが知られてい
る。

【０００３】フィターゼは、最初、１９０７年に米ぬか
中に存在することが記載されており〔Suzukiら, Bull.
Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907) 〕、そし
て１９１１年にはアスペルギルス種から得られている
〔Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (191
1) 〕。さらに、フィターゼは小麦のふすま、植物の種
子、動物の腸に、そして微生物にも見いだされている
〔Howsen and Davis, EnzymeMicrob. Technol. 5, 377-
382 (1983); Lambrechts ら, Biotech. Lett. 14, 61-6
6 (1992); Shieh and Ware, Appl. Microbiol. 16, 134
8-1351 (1968)〕。

【０００４】アスペルギルス・ニガー〔フィクウム (fi
cuum) 〕由来のフィターゼのクローニングおよび発現
は、VanHartingsveldtらによって Gene, 127, 87-94 (1
993)およびヨーロッパ特許出願公開第420 358 号に記載
されており、また、アスペルギルス・ニガーのアワモリ
変種 (Aspergillus niger var awamori)由来のフィター
ゼのクローニングおよび発現は、Piddingtonらによって
Gene 133, 55-62 (1993) に記載されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】農業の分野でこれまで
用いられてきたフィターゼはいくつかの欠点を有するの
で、本発明の目的は、改良された性質を有する新規なフ
ィターゼ、もっと一般的に言えば、フィターゼ（「フィ
ターゼ活性」）を含めて、イノシトールリン酸に対して
フィターゼ活性を有するポリペプチドを大量に提供する
ことである。これまで使用されてきたフィターゼは、熱
処理のために飼料ペレット製造工程の間に活性を失うこ
とが知られていることから、改良された耐熱性がこのよ
うな性質となろう。

【０００６】現在までのところ、アスペルギルス・フミ
ガツス〔Dox and Golden, J. Biol.Chem. 10, 183-186
(1911) 〕およびリゾプス・オリザ (Rhizopus oryzae)
〔Howson and Davies, Enzyme Microb. Technol. 5, 37
7-382 (1993)〕を除いて、耐熱真菌類においてフィター
ゼ類は報告されていない。耐熱性のフィターゼとして
は、アスペルギルス・テレウス9A-1株由来のもの〔最適
温度７０℃；Yamadaら,Agr. Biol. Chem. 32, 1275-128
2 (1968) 〕およびシュワニオミセス・カステリイ (Sch
wanniomyces castellii) 由来のもの〔最適温度７７
℃；Segueilha ら,Bioeng. 74, 7-11 (1992) 〕が開示
されている。ところが、農業の分野で商業的に使用する
には、こうしたフィターゼが大量に入手できなければな
らない。従って、本発明の目的は、耐熱性フィターゼを
コードするＤＮＡ配列を提供することにある。かかるＤ
ＮＡ配列によってコードされるフィターゼの改良された
耐熱性は、当技術分野で知られたアッセイを用いて、例
えば飼料のペレット製造に用いられる方法または Yamad
a ら（前掲）によって記載されるような酵素活性そのも
のの熱依存性を測定するアッセイを用いて、測定するこ
とが可能である。

【０００７】さらに、本発明の目的は、フィターゼ産生
においてある程度の耐熱性を示す真菌をスクリーニング
することである。こうしたスクリーニングは、例えば実
施例１に記載するごとく行うことができる。この方法
で、フィターゼを産生する耐熱真菌株（実施例１に挙げ
たもの）が初めて同定された。

【０００８】耐熱真菌株（例えば、実施例１に挙げたも
のを参照）は、当技術分野で知られているように、例え
ば、こうした菌株を入手することのできる American Ti
ssueType Culture Collection (ATCC) 、Deutsche Samm
lung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH (DS
M) 、Agricultural Research Service Culture Collect
ion (NRRL) および Centralbureau voor Schimmelcultu
res (CBS)などの寄託当局によって指定されたとおり
に、あるいは、例えば実施例２に記載するように、その
後生育させることができる。

【０００９】さらに改良された性質としては、例えば植
物や種子におけるリンの主要貯蔵物質であるフィチン酸
〔ｍｙｏ−イノシトール（1,2,3,4,5,6,）ヘキサキスリ
ン酸〕に対する改良された基質特異性が挙げられる。フ
ィチン酸から６個のリン酸基を完全に放出させるために
は、フィチン酸および他のすべてのイノシトールリン酸
分子に対して十分な活性を有する酵素が必要である。例
えば、アスペルギルス・ニガーのフィターゼを用いる場
合には、リン酸基を完全に放出させるために、ｐＨ２．
５の酸性ホスファターゼを添加する必要がある。必要な
活性を有する、たった１種類の酵素があれば、明らかに
有利であるだろう。例えば、国際特許出願公開第94/030
72号は、フィチン酸分解酵素の混合物を所望の比率で発
現させる発現系を開示している。しかし、単一のポリペ
プチドがこのような両酵素の活性を示すことがより一層
望ましいだろう。かくして、本発明の目的は、さらに、
こうしたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供す
ることにある。フィターゼおよびホスファターゼ活性
は、当技術分野で知られたアッセイにより、または実施
例９に記載するように測定することが可能である。

【００１０】別の改良された性質としては、例えば、い
わゆる改良されたｐＨプロフィールが挙げられる。これ
は、例えば、２つの最大フィチン酸分解活性を指す。例
えば、１つの最大フィチン酸分解活性は動物の胃の中の
ｐＨでありうる約ｐＨ２．５にあり、もう１つは動物の
胃以後のｐＨでありうる約ｐＨ５．５にある。このよう
なｐＨプロフィールは当技術分野で知られたアッセイに
より、または実施例９に記載するごとく測定することが
可能である。従って、本発明の目的は、さらに、このよ
うな改良されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】一般的に、本発明は、ア
クロフィアロホラ・レービス、アスペルギルス・テレウ
ス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニ
ードランス、アスペルギルス・ソヤ、カルカリスポリエ
ラ・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コ
リナスクス・サーモフィルス、フミコラ sp.、ミセリア
・ステリリア、ミロコッカム・サーモフィルム、ミセリ
オフトラ・サーモフィラ、リゾムコール・ミエヘイ、ス
ポロトリクム・セルロフィルム、スポロトリクム・サー
モフィレ、スキタリジウム・インドネシクムおよびタラ
ロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる真菌
に由来する、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列、またはフィターゼ活性をなおも有
する該ポリペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列、ま
たは、特に、真菌がアクロフィアロホラ・レービス、ア
スペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードラ
ンス、アスペルギルス・テレウス、カルカリスポリエラ
・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コリ
ナスクス・サーモフィルス、スポロトリクム・セルロフ
ィルム、スポロトリクム・サーモフィレ、ミセリア・ス
テリリア、ミセリオフトラ・サーモフィラおよびタラロ
ミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる上記の
ＤＮＡ配列、または、中でも、真菌がアスペルギルス・
テレウス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、アスペルギ
ルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードランスおよ
びタラロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれ
る上記のＤＮＡ配列を提供するものである。本発明のポ
リペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列は、ヌクレオ
チドの長さが、例えば１３５０と９００の間、好ましく
は９００と４５０の間、最も好ましくは４５０と１５０
の間であり得、完全なポリペプチドのＤＮＡ配列に基づ
いて当業者によく知られた組換え法または化学合成法に
よって作製することができる。具体的には、上記のＤＮ
Ａは以下の方法、すなわち、アクロフィアロホラ・レー
ビス (Acrophialophora levis)、アスペルギルス・テレ
ウス (Aspergillus terreus)、アスペルギルス・フミガ
ツス (Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニー
ドランス (Aspergillus nidulans) 、アスペルギルス・
ソヤ (Aspergillus sojae)、カルカリスポリエラ・サー
モフィラ (Calcarisporiella thermophila) 、カエトミ
ウム・レクトピリウム (Chaetomium rectopilium) 、コ
リナスクス・サーモフィルス (Corynascus thermophilu
s)、フミコラ sp. (Humicola sp.) 、ミセリア・ステリ
リア (Mycelia sterilia) 、ミロコッカム・サーモフィ
ルム (Myrococcum thermophilum)、ミセリオフトラ・サ
ーモフィラ (Myceliophthora thermophila) 、リゾムコ
ール・ミエヘイ (Rhizomucor miehei)、スポロトリクム
・セルロフィルム (Sporotrichum cellulophilum)、ス
ポロトリクム・サーモフィレ (Sporotrichum thermophi
le) 、スキタリジウム・インドネシクム (Scytalidium
indonesicum)およびタラロミセス・サーモフィルス (Ta
laromyces thermophilus) より成る群から選ばれる耐熱
性真菌由来のＤＮＡまたはその断片を、（i）ミセリオ
フトラ・サーモフィラ (Mycelio. Thermo.)；アスペル
ギルス・ニードランス (Asperg. Nidul.)；アスペルギ
ルス・フミガツス (Asperg. Fumig.)；アスペルギルス
・テレウス9A1 (Asperg. Terreus 9A1)；もしくはタラ
ロミセス・サーモフィルス (Talarom. Thermo.)のゲノ
ムＤＮＡを用いて次のプライマー：センスプライマーと
しての“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”および
アンチセンスプライマーとしての“TT(A/G)CC(A/G)GC(A
/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”により生成されたＰＣＲ産
物、(ii) ミセリオフトラ・サーモフィラ (Mycelio. Th
ermo.)フィターゼ遺伝子のＮ末端の上流のBspEI部位か
らＣ末端のPvuII部位までの1410bp（図３−図４の2068-
3478位）にわたるプローブ、（iii）アスペルギルス・
テレウス9A1 (Asperg. Terreus 9A1)フィターゼ遺伝子
のApaI部位からNdeI部位までの1365bp（図１−図２の49
1-1856位）にわたるプローブ、または、(iv) アスペル
ギルス・テレウス (CBS 220.95) から単離されたＤＮＡ
および次の２つのＰＣＲプライマー対：(a) センスプラ
イマーとしての“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)G
A”およびアンチセンスプライマーとしての“TT(A/G)CC
(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”、ならびに、(b)
センスプライマーとしての“TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C
/T)TC(N)CA(C/T)GA”およびアンチセンスプライマーと
しての“CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C ”を用
いるＰＣＲ反応の産物であるプローブ、とストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズす
るＤＮＡまたはその断片を得、必要に応じてＤＮＡクロ
ーニングまたはポリメラーゼ連鎖反応により該ＤＮＡま
たはその断片を増幅することを含む方法によって得るこ
とができる。さらに、本発明は、次のＤＮＡ配列： (a) 図１および２のＤＮＡ配列またはその相補鎖、(b)
標準条件下で(a) に規定した配列と、好ましくは該配列
のコーディング領域と、より好ましくは該ＤＮＡ配列の
４９１−１８５６位の領域と、より一層好ましくは実施
例１２に記載するようなアスペルギルス・テレウス 9A1
のＤＮＡを用いるランダムプライミングにより得られた
ゲノムプローブとハイブリダイズするＤＮＡ配列、(c)
遺伝暗号の縮重のため(a) または(b) の配列とハイブリ
ダイズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコードさ
れるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列、および(d) (a) 、
(b) または(c) に規定したＤＮＡ配列の断片であるＤＮ
Ａ配列、より成る群から選ばれる、フィターゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供するも
のである。

【００１２】ハイブリダイゼーションのための「標準条
件」とは、本明細書中では、特定のハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを検出するために当業者が一般的に用いて
いる条件であって、例えば Sambrook ら, “Molecular
Cloning ”第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess 1989, New Yorkに記載される条件、好ましくは、い
わゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
と非ストリンジェントな洗浄条件、より好ましくは、当
業者によく知られた、例えば Sambrook ら（前掲）に記
載されるような、いわゆるストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件、よ
り一層好ましくは、実施例１２に示すようなストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件と非ストリンジェ
ントまたはストリンジェントな洗浄条件を意味する。本
明細書中で用いる「ＤＮＡ配列の断片」とは、上述した
フィターゼ活性をなおも有するポリペプチドをコードす
る断片のことである。

【００１３】本発明は、さらに、次のＤＮＡ配列： (a) 図３および４のＤＮＡ配列またはその相補鎖、(b)
標準条件下で(a) に規定した配列と、好ましくは該ＤＮ
Ａ配列の５’末端の約１００〜１５０ヌクレオチドの非
コーディング領域を含んでいてもよい少なくとも約８０
％のコーディング領域にわたる領域と、より好ましくは
該ＤＮＡ配列の２０６８−３４７８位の領域と、より一
層好ましくは実施例１２に記載するようなミセリオフト
ラ・サーモフィラのＤＮＡを用いるランダムプライミン
グにより得られたゲノミックプローブとハイブリダイズ
するＤＮＡ配列、(c) 遺伝暗号の縮重のため(a) または
(b) の配列とハイブリダイズしないが、これらのＤＮＡ
配列によってコードされるポリペプチドと正確に同じア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定したＤＮＡ
配列の断片であるＤＮＡ配列、より成る群から選ばれ
る、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を提供するものである。

【００１４】「断片」および「標準条件」は上記の意味
を有する。

【００１５】また、本発明は、次のＤＮＡ配列： (a) 図６、図７、図８および図１４（“aterr21 ”；
“aterr58 ”）のＤＮＡ配列のうちの１つを含むＤＮＡ
配列またはその相補鎖、(b) 標準条件下で(a) に規定し
た配列と、好ましくはタラロミセス・サーモフィルスか
ら単離可能な図６の、またはアスペルギルス・フミガツ
スから単離可能な図７の、またはアスペルギルス・ニー
ドランスから単離可能な図８の、またはアスペルギルス
・テレウス (CBS 220.95) から単離可能な図１４（“at
err21 ”；“aterr58 ”）に示した配列の一方または両
方の、ＤＮＡ配列を含む該配列と、より好ましくは少な
くとも８０％のコーディング領域にわたる該ＤＮＡ配列
の領域と、最も好ましくは実施例１２に記載するような
タラロミセス・サーモフィルス、アスペルギルス・フミ
ガツス、アスペルギルス・ニードランスまたはアスペル
ギルス・テレウス (CBS 220.95) のＤＮＡを用いるラン
ダムプライミングにより得られたゲノムプローブとハイ
ブリダイズするＤＮＡ配列、(c) 遺伝暗号の縮重のため
(a) または(b) の配列とハイブリダイズしないが、これ
らのＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドと正
確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定
したＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列、より成る群か
ら選ばれる、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を提供するものである。

【００１６】さらに、本発明は、タラロミセス・サーモ
フィルスから単離可能な図６の、アスペルギルス・フミ
ガツスから単離可能な図７の、アスペルギルス・ニード
ランスから単離可能な図８の、またはアスペルギルス・
テレウス (CBS 220.95) から単離可能な図１４（“ater
r21 ”；“aterr58 ”）のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列
より成る群から選ばれる、フィターゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはその縮重変異
体もしくは均等物を提供するものである。

【００１７】「断片」および「標準条件」は上記の意味
を有する。「縮重変異体」とは、本明細書中では、遺伝
暗号の縮重のため、記載した配列と異なるヌクレオチド
配列を有するが、同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードしているＤＮＡ配列を指す。「均等物」と
は、本明細書中では、１個以上のアミノ酸、好ましくは
５０個まで、より好ましくは２０個まで、より一層好ま
しくは１０個まで、最も好ましくは５、４、３または２
個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加のため
に、ＤＮＡ配列（均等な配列の元になる配列）によって
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミ
ノ酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を言う。一般に特異的活性
を変えることのないアミノ酸置換は当技術分野で知られ
ており、例えば、H. NeurathおよびR.L. Hill,“The Pr
oteins”(Academic Press, New York, 1979 、特に図
６、14頁を参照) に記載されている。最も普通に行われ
る交換は Ala/Ser、Val/Ile 、Asp/Glu 、Thr/Ser 、Al
a/Gly 、Ala/Thr 、Ser/Asn 、Ala/Val 、Ser/Gly 、Ty
r/Phe 、Ala/Pro 、Lys/Arg 、Asp/Asn 、Leu/Ile 、Le
u/Val 、Ala/Glu 、Asp/Gly およびこれらの逆の交換で
ある（アミノ酸のために、当分野で公知の標準的な三文
字表記を用いる）。

【００１８】こうした均等物は、当技術分野で公知の方
法、例えば Sambrook ら（前掲）に記載されている方法
により作ることができる。均等な配列によってコードさ
れるポリペプチドがなおもフィターゼ活性を有するかど
うかは、当技術分野で知られたアッセイの１つ、例えば
実施例９に記載する活性試験を用いて調べることができ
る。

【００１９】本発明は、また、真菌、特に上記した特定
の真菌群の１つから選ばれる真菌に由来する、フィター
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記ＤＮＡ配
列の１つを提供するものである。

【００２０】さらに、本発明は、上記した真菌群の１つ
の真菌から単離されたＤＮＡおよび次のＰＣＲプライマ
ー対：センスプライマーとしての“ATGGA(C/T)ATGTG(C/
T)TC(N)TT(C/T)GA” およびアンチセンスプライマーと
しての“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)T
A”を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブと標準条
件下でハイブリダイズする、フィターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供するものであ
る。

【００２１】「標準条件」は上記の意味を有する。「Ｐ
ＣＲ反応の産物」は、好ましくは実施例１１に関係する
実施例１２に記載される反応によって得ることができる
産物、より好ましくは該反応によって得られた産物を意
味する。

【００２２】本発明は、さらに、アスペルギルス・テレ
ウス (CBS 220.95) から単離されたＤＮＡおよび次の２
つのＰＣＲプライマー対： (a) センスプライマーとしての“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)
TC(N)TT(C/T)GA” およびアンチセンスプライマーとし
ての“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)T
A”、ならびに(b) センスプライマーとしての“TA(C/T)
GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA” およびアンチ
センスプライマーとしての“CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)
AG(N)AC(N)C ”を用いるＰＣＲ反応の産物であるプロー
ブと標準条件下でハイブリダイズする、フィターゼ活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供す
るものである。

【００２３】「標準条件」は先に定義したとおりであ
り、「ＰＣＲ反応の産物」という用語は、好ましくは実
施例１１に記載される反応によって得ることができる産
物、より好ましくは該反応によって得られた産物を意味
する。

【００２４】本発明は、また、先に規定したＤＮＡ配列
の断片を含有する、フィターゼ活性を有するキメラ構築
物をコードするＤＮＡ配列、好ましくはキメラ構築物が
アスペルギルス・ニガーフィターゼの断片をそのＮ末端
でアスペルギルス・テレウスフィターゼの断片のＣ末端
に融合させたものからなる該ＤＮＡ配列、より好ましく
は図９、１０および１１に示した特定のヌクレオチド配
列を有する該ＤＮＡ配列およびその縮重変異体または均
等物（ここで、「縮重変異体」および「均等物」は上記
の意味を有する）を提供するものである。

【００２５】さらに、本発明は、コードされるポリペプ
チドがフィターゼである、先に規定したＤＮＡ配列を提
供するものである。

【００２６】真菌株由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
は、当技術分野で公知の方法により〔例えば、Yelton
ら, Procd. Natl. Acad. Sci. USA, 1470-1474 (1984)
またはSambrook ら, 前掲を参照〕、または、特に実施
例２に記載するごとく調製することができる。

【００２７】かかるゲノムＤＮＡからの本発明のＤＮＡ
配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことができる。この方法
の原理は、例えば Whiteら (1989) に概説されている
が、その改良法が例えば Innisら〔PCR Protocols: A g
uide to Methods and Applications, Academic Press社
(1990) 〕によって記載されている。ＰＣＲは異なるＤ
ＮＡ配列の混合物から明確に定められた長さおよび配列
の特定のＤＮＡを大量に生産するためのin vitro法であ
る。こうして、ＰＣＲは、２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマー（該配列に特異的で、標的配列の反対の鎖にハ
イブリダイズする）によって挟まれる特定のＤＮＡ断片
の酵素的増幅に基づいている。プライマーはそれらの
３’末端が互いの方に向くように位置づけられる。鋳型
の熱変性、相補配列へのプライマーのアニーリング、お
よびアニールしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長からなる反復サイクルが、ＰＣＲプライマー間の
セグメントの増幅をもたらす。各プライマーの伸長産物
は他方の鋳型として役立ち、各サイクルは本質的に前の
サイクルで生産されたＤＮＡ断片の量を２倍にする。好
熱性バクテリアのテルムス・アクアチクス(Thermus aqu
aticus) から単離された熱安定性のTaq DNA ポリメラー
ゼを利用することによって、それぞれの熱変性段階の後
に酵素の添加を必要としたポリメラーゼの変性を回避で
きるようになった。この進展により、各種の簡便な温度
循環装置によるＰＣＲの自動化が可能となった。さら
に、プライマーのアニーリングおよび伸長に比較的高い
温度を使用できるため、増幅反応の特異性も高まる。高
められた特異性は、酵素およびプライマーに対する非標
的断片による競合を最小限に抑えて、増幅産物の総収量
を引き上げる。対象の特定配列がこの方法で高度に増幅
されると、当技術分野で知られた方法（例えば、アガロ
ースゲルでの分離）により非特定配列から簡単に分離し
て、例えば Holten および Graham, Nucleic Acid Res.
19, 1156 (1991)、Kovalic ら, Nucleic Acid Res. 1
9, 4560 (1991) 、Marchuk ら, Nucleic Acid Res. 19,
1154 (1991) または Mead ら, Bio/Technology 9, 657
-663 (1991)に記載されるようなベクターを使って当技
術分野で知られた方法によりクローニングすることがで
きる。

【００２８】ＰＣＲ法で用いるオリゴヌクレオチドプラ
イマーは当技術分野で知られた方法により、例えば Sam
brook ら (1989, “Molecular cloning ”第２版，Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r ）に記載されるようにして作製することができる。

【００２９】本発明の実施に際して用いる特定のプライ
マーは、アスペルギルス・ニガーのフィターゼ、アスペ
ルギルス・ニガーの酸性ホスファターゼ、サッカロミセ
ス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) の酸性ホ
スファターゼ、およびシゾサッカロミセス・ポンベ (Sc
hizosaccharomyces pombe)の酸性ホスファターゼの既知
配列のＤＮＡ配列比較に基づいて、縮重プライマーとし
て設計された（配列情報については、例えば European
Bioinformatics Institute (Hinxton Hall, Cambridge,
GB)を参照のこと）。アスペルギルス・ニガー由来の既
知配列に基づいて作製したアスペルギルス・ニガーのコ
ドン利用表に従っていくつかのコドンを選択することに
より、プライマーの縮重を減らした。さらに、特定のプ
ローブを規定するのに用いたアミノ酸配列のＣ末端のア
ミノ酸は、上記のフィターゼを含む全ての酸性ホスファ
ターゼにおいて保存されていたアミノ酸であるが、残り
のアミノ酸はホスファターゼよりもフィターゼに特異的
であることが見いだされた。

【００３０】このような増幅ＤＮＡ配列は、その後、当
技術分野で知られた方法により（Sambrookら, 前掲）、
特に実施例５〜７に記載するようにして、例えば真菌由
来のＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするために
用いることができる。

【００３１】ひとたび本発明の完全なＤＮＡ配列が得ら
れたら、それらを当技術分野で知られた方法、例えばSa
mbrookら（前掲）に記載された方法でベクターに組み込
み、コードされたポリペプチドを適当な宿主系において
過剰発現させることができる。しかし、当業者であれ
ば、ＤＮＡ配列それ自体を用いて本発明の適当な宿主系
を形質転換することにより、コードされたポリペプチド
の過剰発現が得られることも分かるだろう。適当な宿主
系は、例えば、アスペルギルス属菌〔例、アスペルギル
ス・ニガー (ATCC 9142)またはアスペルギルス・フィク
ウム (Aspergillus ficuum) (NRRL 3135) 〕またはトリ
コデルマ属菌〔例、トリコデルマ・リーセイ (Trichode
rma reesei) 〕のような真菌類、あるいはサッカロミセ
ス属菌〔例、サッカロミセス・セレビシエ (Saccharomy
ces cerevisiae）またはピヒア属菌（例、ピヒア・パス
トリス (Pichia pastoris)〕（すべてＡＴＣＣから入手
可能）のような酵母である。使用できる細菌は、例え
ば、大腸菌 (E. coli)、バシラス属菌〔例、バシラス・
ズブチリス (Bacillus subtilis)〕またはストレプトミ
セス属菌〔例、ストレプトミセス・リビダンス (Strept
omyces lividans)〕である（AnneおよびMallaert, FEMS
Microbiol. Letters 114, 121 (1993) を参照のこ
と）。用いることのできる大腸菌は大腸菌 K12株、例え
ばM15 〔Villarejo ら, J. Bacteriol. 120, 466-474
(1974) にDZ 291として記載されるもの〕、HB 101 (ATC
C 33694) または大腸菌 SG13009〔Gottesman ら, J. Ba
cteriol. 148, 265-273 (1981) 〕である。

【００３２】真菌による発現に用いられるベクターは当
技術分野で知られており、例えば、EP 420 358に、ある
いはCullenら〔Bio/Technology 5, 369-376 (1987)〕、
Ward, Molecular Industrial Mycology, Systems and A
pplications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker,
New York (1991) 、Upshall ら〔Bio/Technology 5,130
1-1304 (1987)〕、Gwynneら〔Bio/Technology 5, 71-79
(1987)〕、Puntら〔J. of Biotechnology 17, 19-34
(1991)〕によって記載されている。酵母用のベクターは
Sreekrishnaら〔J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1
988); Biochem.28, 4117-4125 (1989) 〕、Hitzemann
ら〔Nature 293, 717-722 (1981)〕によって、またはEP
183 070、EP 183 071、EP 248 227、EP 263 311に記載
されている。大腸菌発現用の適当なベクターとしては、
例えば Sambrook ら（前掲）、Fiers ら, Procd. 8th I
nt. Biotechnology Symposium 〔Soc. Franc. de Micro
biol., Paris (Durandら編集), pp. 680-697 (1988)
〕、Bujardら, Methods in Enzymology, Wu および Gr
ossmann編集, Academic Press社, 第155 巻, 416-433(1
987)、および Stuber ら, Immunological Methods, Lef
kovitsおよび Pernis編集, Academic Press社, 第IV巻,
121-152 (1990)に記載されるものを挙げることができ
る。バシラス発現用のベクターは当技術分野で知られて
おり、例えば、EP405 370、Yansura および Henner, Pr
ocd. Nat. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)、Meth. Enz
ym. 185, 199-228 (1990)、または EP 207 459 に記載
されている。

【００３３】こうしたベクターはプロモーターのような
調節要素をすでに含んでいるか、または、かかる要素を
含むように本発明のＤＮＡ配列を遺伝子操作することが
できる。用いることのできる適当なプロモーター要素は
当技術分野で知られており、例えば、トリコデルマ・リ
ーセイについては cbh1 プロモーター〔Haarkiら, Biot
echnology 7, 596-600 (1989) 〕または pki1 プロモー
ター〔Schindler ら,Gene 130, 271-275 (1993)〕、ア
スペルギルス・オリザについては amyプロモーター〔Ch
ristensen ら, Abstr. 19th Lunteren Lectures on Mol
ecular Genetics F23 (1987)、Christensen ら,Biotech
nology 6, 1419-1422 (1988)、Tadaら,Mol. Gen. Gene
t. 229, 301 (1991)〕、アスペルギルス・ニガーについ
ては glaAプロモーター〔Cullenら, Bio/Technology 5,
369-376 (1987)、Gwynneら, Bio/Technology 5, 713-7
19 (1987)、Ward, Molecular Industrial Mycology, Sy
stems and Applications for Filamentous Fungi, Marc
el Dekker, New York, 83-106 (1991) 〕、alcAプロモ
ーター〔Gwynneら, Bio/Technology 5, 713-719 (198
7)〕、suc1プロモーター〔Boddy ら, Current Genetics
24, 60-66 (1993) 〕、aphAプロモーター〔MacRaeら,
Gene 71, 339-348 (1988) 、MacRaeら, Gene 132, 193-
198 (1993)〕、tpiAプロモーター〔McKnightら, Cell 4
6, 143-147 (1986) 、Upshall ら, Bio/Technology 5,
1301-1304 (1987)〕、gpdAプロモーター〔Puntら, Gene
69, 49-57 (1988) 、Puntら, J. of Biotechnology 1
7, 19-37(1991)〕および pkiA プロモーター〔de Graaf
f ら, Curr. Genet. 22, 21-27 (1992) 〕である。酵母
発現用の適当なプロモーター要素は当技術分野で知られ
ており、例えば、pho5プロモーター〔Vogel ら, Molecu
lar and Cellular Biology, 2050-2057 (1989)、Rudolf
and Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340-1344
(1987)〕またはサッカロミセス・セレビシエ発現用の g
apプロモーター、およびピヒア・パストリス発現用の a
ox1 プロモーター〔Koutz ら, Yeast 5, 167-177 (198
9) 、Sreekrishna ら, J. Basic Microbiol. 28, 265-2
78 (1988)〕である。

【００３４】従って、好ましくは細菌、真菌または酵母
宿主で本発明のＤＮＡ配列を発現させるための、該ＤＮ
Ａ配列を含有するベクターおよび形質転換された細菌、
真菌または酵母宿主も本発明の対象となる。

【００３５】こうしたＤＮＡ配列が適当な培地で適切な
宿主細胞により発現されたら、コード化されるフィター
ゼを、フィターゼが培地に分泌される場合には培地か
ら、また、フィターゼが細胞内に存在する場合には宿主
生物から、タンパク質精製の分野で知られた方法または
例えば EP 420 358 に記載された方法により単離するこ
とができる。従って、上記のような形質転換細菌または
宿主細胞を適当な培養条件下で培養し、そしてそこから
ポリペプチドを回収することを特徴とする本発明のポリ
ペプチドの生産方法、およびこのような方法によって生
産されたポリペプチドまたは本発明のＤＮＡ配列によっ
てコードされるポリペプチドも本発明の対象となる。

【００３６】本発明のポリペプチドが得られたら、その
活性に関して、当技術分野で知られたアッセイ、例えば
Engelenら〔J. AOAC Intern. 77, 760-764 (1994)〕に
よりまたは実施例９に記載されるようにして該ポリペプ
チドを特性付けることができる。本発明のポリペプチド
を農業の分野で有用なものにするそれらの性質に関して
は、例えば Simons ら〔British Journal of Nutrition
64, 525-540 (1990)〕、Schoner ら〔J. Anim. Physio
l. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991) 〕、Vogt〔Arc
h. Geflugelk. 56, 93-98 (1992) 〕、Jongbloed ら
〔J. Anim. Sci.,70, 1159-1168 (1992) 〕、Perneyら
〔Poultry Science 72, 2106-2114 (1993)〕、Farrell
ら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278-283
(1993) 〕、Brozら〔British Poultry Science 35, 273
-280 (1994)〕および Dungelhoef ら〔Animal Feed Sci
ence and Technology 49, 1-10 (1994)〕により記載さ
れるような、当技術分野で知られた任意のアッセイを用
いることができる。それらの耐熱性に関しては、例えば
Yamada ら〔前掲〕により記載されるような、当技術分
野で知られた任意のアッセイを、そしてそれらのｐＨお
よび基質特異性のプロフィールに関しては、例えば実施
例９または Yamada ら〔前掲〕に記載されるような、当
技術分野で知られた任意のアッセイを使用することがで
きる。

【００３７】一般に、本発明のポリペプチドは、フィチ
ン酸をイノシトールと無機リン酸に変換する特定の応用
分野に限られることなく用いられるものである。

【００３８】さらに、本発明のポリペプチドは、複合食
品または飼料の製造方法において用いられ、かかる組成
物の諸成分と１種以上の本発明のポリペプチドとが一緒
に混合される。従って、１種以上の本発明のポリペプチ
ドを含有する複合食品または飼料も本発明の対象とな
る。当業者であれば、その製造方法について熟知してい
るだろう。こうした複合食品または飼料は、この目的の
ために常用される公知の添加剤または成分をさらに含ん
でいてもよい。

【００３９】さらに、動物に、こうした飼料組成物を、
該飼料中に含まれるフィチン酸 (phytate)をイノシトー
ルと無機リン酸に変換するのに有効な量で与えることを
特徴とする、動物肥料中のフィチン酸のレベルを低下さ
せる方法を提供することも本発明の対象となる。

【００４０】

【発明の実施の形態】本発明を、下記の実施例によって
さらに具体的に説明する。

【００４１】

【実施例】用いる特定の培地および溶液完全培地 (Clutterbuck) グルコース 10 g/l -CN 溶液 10 ml/l 硝酸ナトリウム 6 g/l バクトペプトン (Difco Lab., Detroit, MI, USA) 2 g/l 酵母エキス (Difco) 1 g/l カザミノ酸 (Difco) 1.5 g/l 調製微量元素溶液 1 ml/l ビタミン溶液 1 ml/l Ｍ３培地グルコース 10 g/l -CN 溶液 10 ml/l 調製微量元素溶液 1 ml/l 硝酸アンモニウム 2 g/l Ｍ３培地−リン酸塩 -CN を-CNPで置き換えたＭ３培地Ｍ３培地−リン酸塩＋フィチン酸塩 5 g/l のフィチン酸 Na１２ (Sigma #P-3168; Sigma, St. Louis, MO, USA)を添加したＭ３培地−リン酸塩調製微量元素溶液 CuSO４ 0.04％ FeSO４.7H２O 0.08％ Na２MoO４.2H２O 0.08％ ZnSO４.7H２O 0.8 ％ B４Na２O７.10H２O 0.004 ％ MnSO４.H２O 0.08％ビタミン溶液リボフラビン 0.1 ％ニコチンアミド 0.1 ％ p-アミノ安息香酸 0.01％ピリドキシン/HCl 0.05％アノイリン/HCl 0.05％ビオチン 0.001 ％ -CN 溶液 KH２PO４ 140 g/l K２PO４.3H２O 90 g/l KCl 10 g/l MgSO４.7H２O 10 g/l -CNP溶液 HEPES 47.6 g/200 ml KCl 2 g/200 ml MgSO４.7H２O 2 g/200 ml 実施例１フィターゼ活性についての真菌のスクリーニング真菌は、次の３種類の培地を用いて、３プレート系でス
クリーニングした。

【００４２】「Ｍ３」（リン酸塩を含有する規定培地）、「Ｍ３−Ｐ」（リン酸塩を除いたＭ３培地）および「Ｍ３−Ｐ＋フィチン酸塩」（リン酸塩を除いてあるが、唯一のリン源としてフィチン酸塩を含有するＭ３培地）このプレートはアガロースから作られていて、リン酸の
バックグラウンドレベルを低下させてある。

【００４３】真菌を培地上で、供給会社が推奨する温度
で生育させた。胞子または菌糸を検査プレートに移し、
生育が観察されるまで推奨される温度で培養した。

【００４４】次の耐熱菌株はこうした生育を示すことが
分かった。

【００４５】ミセリオフトラ・サーモフィラ (ATCC 48 102) タラロミセス・サーモフィルス (ATCC 20 186) アスペルギルス・フミガツス (ATCC 34 625)実施例２真菌の生育およびゲノムＤＮＡの調製ミセリオフトラ・サーモフィラ、タラロミセス・サーモ
フィルス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギル
ス・ニードランス、アスペルギルス・テレウス9A-1およ
びアスペルギルス・テレウス CBS 220.95 の菌株をポテ
ト・デキストロース・ブロス (Potato Dextrose Broth;
Difco Lab., Detroit, MI, USA)または完全培地 (Clut
terbuck)にて生育させた。アスペルギルス・テレウス9A
-1およびアスペルギルス・ニードランスは、特許手続上
のブダペスト条約に基づいて、DSM (Braunschweig, BR
D) に、それぞれ1994年３月17日に受託番号 DSM 9076
および1995年２月17日に受託番号 DSM 9743 として寄託
された。

【００４６】ゲノムＤＮＡは次のようにして調製した。
培地に高密度で胞子を植えつけ、振とうしながら一晩生
育させた。菌糸を濾過により回収し、ブロットし、乾燥
させ、そして重さを量った。１回の調製につき最高２．
０ｇを使用した。菌糸を液体窒素中で砕いて微細な粉末
となし、すぐに１０ｍｌの抽出緩衝液（200mM Tris/HC
l, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 8.5)に加え
てよく混合した。このスラリーにフェノール（７ｍｌ）
を加えて混合し、さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加え
て十分に混合した。この混合物を遠心 (20,000 g) にか
け、水相を回収した。ＲＮアーゼＡを加えて最終濃度を
250μg/mlとなし、３７℃で１５分間インキュベートし
た。次に、この混合物を１容量のクロロホルムで抽出
し、遠心 (10,000 g, 10分) した。水相を回収し、０．
５４容量のイソプロパノールを用いて室温で１時間にわ
たりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを巻きつけて回収し、
水に再懸濁させた。

【００４７】得られたＤＮＡは次のようにしてさらに精
製した。ＤＮＡの一部をプロテイナーゼＫを用いて３７
℃で２時間消化し、次いで等容量のフェノール／クロロ
ホルムで繰り返し（２〜３回）抽出し、エタノール沈殿
させ、その後水に再懸濁させて約１μｇ／μｌの濃度と
した。実施例３縮重ＰＣＲＰＣＲは、本質的にパーキン・エルマー・シータス〔(P
erkin Elmer Cetus: PEC); Norwalk, CT, USA 〕のプロ
トコールに従って行った。次の２つのプライマーを用い
た（括弧内に示した塩基はいずれか一方／又はを意味す
る）。 Phyt8: 5'ATG GA(CT) ATG TG(CT) TCN TT(CT) GA 3' 縮重＝３２高温＝６０℃／低温５２℃ Phyt9: 5'TT(AG) CC(AG) GC(AG) CC(GA) TGN CC(GA) T
A 3' 高温＝７０℃／低温５８℃ 典型的な反応は次のように実施した。

【００４８】 H２O 24.5 μl 10 X PEC GeneAmp緩衝液 5 μl GeneAmp dNTP (10 mM) 8 μl プライマー１ (Phyt8, 100μM) 5 μl プライマー２ (Phyt9, 100μM) 5 μl DNA (約１μg/μl) 1 μl Taq ポリメラーゼ (PEC) 0.5 μl 50 μl Taq ポリメラーゼを除く全成分を９５℃で１０分、次に
５０℃で１０分インキュベートし、その後反応混合物を
氷上に置いた。続いて、Taq ポリメラーゼ (Amplitaq,
Hoffmann-La Roche, Basel, CH) を加え、トリオサーモ
ブロック（Triothermoblock; Biometra, Gottingen, D
E) で次のサイクルプロフィールに従って３５回のＰＣ
Ｒを実施した。

【００４９】95℃／60秒 50℃／90秒 72℃／120 秒この反応混合物のアリコートを１．５％アガロースゲル
上で分析した。実施例４ＰＣＲ断片のサブクローニングおよび配列決定予期された大きさ（アスペルギルス・ニガーＤＮＡ配列
からは約１４６ｂｐが予測される）のＰＣＲ産物を低融
点アガロースから切りだし、NACS-PREPAC カラム (BRL
Life Technologies 社, Gaithersburg, MD, USA)から製
造会社のプロトコールに従って精製した。この断片を５
０μｌの100mM カコジル酸ナトリウム pH 6.6, 12.5mM
Tris/HCl pH 7.0, 0.1mMジチオトレイトール, 125 μg/
mlウシ血清アルブミン, 1mM CoCl２, 20 μm dATP, 10
単位のターミナルデオキシトランスフェラーゼ (Boehri
nger Mannheim, Mannheim, DE)中で３７℃にて５分間ポ
リアデニル化し、p123T ベクター〔Mitchellら, PCR Me
th. App. 2, 81-82 (1992)〕にクローニングした。

【００５０】また、ＰＣＲ断片は、精製後に、“Sure C
lone”ライゲーションキット (Pharmacia)を用いて製造
会社の説明書どおりにクローニングした。

【００５１】配列決定は、Quiagen カラム (Diagen Gmb
H, Hilden, DE)で精製したｄｓＤＮＡに対して、ジデオ
キシ法およびファルマシアＴ７キット (Pharmacia, LKB
Biotechnology AB, Uppsala, SE) を用いて、製造会社
のプロトコールに従って実施した。実施例５ラムダ Fix II ライブラリーの構築およびスクリーニン
グアスペルギルス・テレウス9A-1株およびミセリオフトラ
・サーモフィラに由来する断片を用いて BamHIおよびBg
lII サザンを釣り上げ、ラムダ Fix II ベクター (Stra
tagene, La Jolla, CA, USA)へのゲノムライブラリーの
構築に用いるのに適した制限酵素を調べた。ラムダ Fix
II は９〜２３ｋｂの挿入配列を受け入れるにすぎな
い。サザンは次のプロトコールに従って実施した。ゲノ
ムＤＮＡ (10μg)を最終容量 200μl にて消化した。酵
素を含まない反応混合物を調製し、氷上で２時間インキ
ュベートした。酵素（50単位）を加え、反応混合物を適
温で３時間インキュベートした。次に、等容量のフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた。
負荷緩衝液中に懸濁したＤＮＡを６５℃に１５分間加熱
し、その後０．７％アガロースゲル（一晩、30Ｖ）で分
離した。移行に先立って、ゲルを0.2M HCl中で室温にて
１０分間ずつ２回、続いて 1M NaCl／0.4M NaOH 中で室
温にて１５分間ずつ２回洗浄した。ＤＮＡを0.4M NaOH
にて毛細管移行によりニトラン (Nytran) 13N ナイロン
膜 (Schleicher and Schuell AG, Feldbach, Zurich, C
H)に４時間かけて移行させた。移行の後、膜をＵＶに露
光した〔Auto cross-link, UV Stratalinker 2400, Str
atagene (La Jolla, CA, USA) 〕。

【００５２】膜はハイブリダイゼーション緩衝液〔50％
ホルムアミド、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、10％デキストラン硫酸、４ｘＳＳＰＥ（180mM Na
Cl, 10mMNaH２PO４, 1mM EDTA, pH 7.4) 〕中で４２℃
にて４時間プレハイブリダイズさせ、変性プローブの添
加後は４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。ブロットを
次のように洗浄した：１ｘＳＳＰＥ／0.5 ％ＳＤＳ／室温／３０分 0.1 ｘＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ／室温／３０分 0.1 ｘＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ／６５℃／３０分結果は、BamHI で消化したアスペルギルス・テレウス9A
-1株のゲノムＤＮＡおよびBglII で消化したミセリオフ
トラ・サーモフィラのゲノムＤＮＡがラムダ Fix II ベ
クターへのクローニングに適する断片をもたらすことを
示した。

【００５３】ラムダ Fix II ベクターへのアスペルギル
ス・テレウス9A-1株およびミセリオフトラ・サーモフィ
ラのゲノムライブラリーの構築は、製造会社のプロトコ
ール(Stratagene) に従って実施した。

【００５４】ラムダライブラリーは各ライブラリーにつ
いて１０枚の137mm プレートにまく。プラークをニトラ
ン13N 丸形フィルターに移し取り、0.5M NaOH/1.5M NaC
l 中で１分間、次いで0.5M Tris-HCl pH8.0/1.5M NaCl
中で５分間処理した。その後、フィルターを２ｘＳＳＣ
で５分間処理し、自然乾燥させた。続いて、それらをＵ
Ｖ（１分、UV Stratalinker 2400, Stratagene）で固定
した。フィルターをハイブリダイズさせ、上記のように
洗浄した。推定上の陽性プラークを採取し、ファージを
ＳＭ緩衝液（180mM NaCl, 8mM MgSO４.7H２O, 20mM Tri
s-HCl pH7.5, 0.01 ％ゼラチン）中に浸した。このスト
ックを希釈し、137mm プレートにまいた。２枚ずつのフ
ィルターに移し取り、上記のように処理した。各プレー
トから透明な単一の陽性プラークを取り上げ、ＳＭ緩衝
液で希釈した。アスペルギルス・テレウス9A-1株から２
個（9A1 λ17および9A1 λ22）、そしてミセリオフトラ
・サーモフィラから１個（ＭＴλ27）、全部で３個の陽
性プラークが得られた。実施例６ラムダＤＮＡの調製およびクローンの確認陽性プラークからラムダＤＮＡを調製した。これは“Ma
gic Lambda Prep ”システム (Promega 社, Madison, W
I, USA) を使って行い、製造会社の説明書に従った。ク
ローンの本性を確かめるため、ラムダＤＮＡをPstIおよ
びSalIで消化し、得られたブロットをＰＣＲ産物で釣り
上げた。全ての場合に、クローンはプローブに相補的な
配列を含むことが確認された。実施例７フィターゼ遺伝子のサブクローニングおよび配列決定 9A1 λ17から得られたＤＮＡをPstIで消化し、得られた
断片の混合物を、PstIで切断した pBluescript II SK+
(Stratagene)に連結し、そしてエビアルカリ性ホスファ
ターゼ (United States Biochemical 社, Cleaveland,
OH, USA)で処理した。連結反応は１６℃で一夜行った。
この連結混合物でXL-1 Blue Supercompetent細胞 (Stra
tagene) を形質転換し、0.5mM イソプロピル- β-D- チ
オガラクトピラノシド (IPTG) 、40μg/ml 5- ブロモ-4
- クロロ-3- インドイル- β-D-ガラクトピラノシド (X
gal) 、50μg/mlアンピシリンを含有するＬＢプレート
にまいた。

【００５５】9A1 λ17から得られたＤＮＡをBglII およ
びXbaIで消化し、得られた断片の混合物を、BamHI/XbaI
で消化した pBluescript II SK+ に連結した。連結反
応、形質転換およびスクリーニングを上記のように行っ
た。

【００５６】ＭＴλ27から得られたＤＮＡをSalIで消化
し、得られた断片の混合物を、SalIで消化した pBluesc
ript II SK+ に連結し、そしてエビアルカリ性ホスファ
ターゼで処理した。連結反応は１６℃で一夜行った。こ
の連結混合物でXL-1 Blue Supercompetent細胞を形質転
換し、Xgal/IPTG およびアンピシリンを含有するＬＢプ
レートにまいた。

【００５７】上記の形質転換からのコロニーを採取し、
約７５を単一のプレートに“グリッド (gridded)”し
た。３７℃で一夜インキュベーションした後、コロニー
をナイロンフィルター（“Hybond-N”, Amersham社, Ar
lington Heights, IL, USA）に移し取り、フィルターを
0.5M NaOH で３分間、1M Tris-HCl pH7.5 で１分間ずつ
２回、その後0.5M Tris-HCl pH7.5/1.5M NaCl で５分間
処理した。フィルターを自然乾燥させ、ＵＶ（２分間、
UV Stratalinker 2400, Stratagene）で固定した。フィ
ルターを実施例５のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ
た。陽性コロニーを選択してＤＮＡを調製した。実施例
４に記載したごとく、サブクローンの配列決定を行っ
た。決定された配列は、アスペルギルス・テレウス9A-1
株由来のフィターゼおよびそのコーディングＤＮＡ配列
については図１および２に、ミセリオフトラ・サーモフ
ィラ由来のフィターゼおよびそのコーディングＤＮＡ配
列については図３および４に示してある。図５のＡはア
スペルギルス・テレウスのＤＮＡの制限地図（矢印はコ
ーディング領域を、裁断された線はコーディング領域に
加えて配列決定された領域を示す）を示し、図５のＢは
ミセリオフトラ・サーモフィラのＤＮＡの制限地図を示
す。図６はタラロミセス・サーモフィルス由来のフィタ
ーゼの一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示し、
図７はアスペルギルス・フミガツス由来のフィターゼの
一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示し、そして
図８はアスペルギルス・ニードランス由来のフィターゼ
の一部およびそのコーディングＤＮＡ配列を示す。タラ
ロミセス・サーモフィルス、アスペルギルス・フミガツ
スおよびアスペルギルス・ニードランス由来のフィター
ゼの一部ならびにそれらのコーディングＤＮＡ配列は、
実施例２〜７にアスペルギルス・テレウス9A-1株とミセ
リオフトラ・サーモフィラについて記載した方法と同じ
方法で得られた。塩基は常用される一文字表記により小
文字で両鎖について示してある。誘導されたフィターゼ
のアミノ酸配列は、常用される一文字表記により大文字
で、対応するＤＮＡ配列の下に示してある。実施例８Ａ．ニガーフィターゼのＤＮＡ配列とＡ．テレウスフィ
ターゼのＤＮＡ配列とのキメラ構築物の作製すべての構築は、Sambrookら (1989) (Molecular cloni
ng, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, NY) によって記載されるような標準的分子
生物学的手法を用いて行った。

【００５８】EP 420 358に記載されるアスペルギルス・
ニガーフィターゼの最初の１４６アミノ酸をアスペルギ
ルス・テレウス 9A1遺伝子の３２０Ｃ末端アミノ酸に融
合させた。Ａ．ニガーのフィターゼ遺伝子をＰＣＲでク
ローン化したとき、ＡＴＧ開始コドンにNcoI部位を導入
した。Ａ．ニガーフィターゼに存在するイントロンは、
次のプライマー（ここで、斜線はその左側の配列が第１
エクソンの3'末端にハイブリダイズし、その右側の配列
が第２エクソンの5'末端にハイブリダイズすることを示
す）： 5'-AGTCCGGAGGTGACT/CCAGCTAGGAGATAC-3' を用いる部位特異的突然変異誘発（Bio-Rad キット、カ
タログ番号170-3581; Bio-Rad, Richmond, CA, USA）に
より除いた。

【００５９】Ａ．ニガーフィターゼとＡ．テレウスフィ
ターゼとのキメラ構築物を作製するにあたって、クロー
ニングに役立つようにＡ．ニガーのコーディング配列に
Eco47III部位を導入した。Ｔ３プライマーとともに突然
変異誘発プライマー (5'CGATTC GTA gCG CTG GTA G 3')
を用いるＰＣＲにより、BamHI とEco47IIIで切断した
ＤＮＡ断片を生成した。このBamHI/Eco47III断片を、Ba
mHI/Eco47IIIで切断したp9A1Pst （実施例７）に挿入し
た。図９、１０および１１は、融合構築物のアミノ酸配
列およびそのコーディングＤＮＡ配列を示す。実施例９フィターゼの発現発現ベクターの構築Ａ．ニガーにおいて融合構築物を発現させるために、融
合遺伝子がＡ．ニガーの誘導性のグルコアミラーゼ（gl
aA）プロモーターの制御下に置かれる発現カセットを選
んだ。

【００６０】完全なＡ．テレウス 9A1遺伝子の場合は、
Ａ．ニードランスの構成性のグリセルアルデヒド-3- ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（gpdA）プロモーターを含
む発現カセットを選んだ。

【００６１】Ａ．ニガー発現用の遺伝子はすべて、分泌
のためのそれら自身のシグナル配列を持っていた。ベクター pFPAN1 の構築Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ（glaA）プロモーター
を、プラスミド pDH33〔Smith ら (1990), Gene 88: 25
9-262 〕から 1960 bpの XhoI/ClaI断片として単離し、
Ａ．ニードランスのtrpCターミネーターの710 bp BamHI
/XbaI 断片を含むpBluescript SK＋ベクター (pBS)〔S
tratagene, La Jolla, CA, USA 〕にクローニングし
た。このカセットを含むプラスミドをpGLAC と名づけ
た。実施例８に記載される融合遺伝子を、平滑末端化Nc
oI/EcoRI断片をプラスミドpGLAC の平滑末端化ClaI部位
およびEcoRV 部位に連結させることにより、Ａ．ニガー
のglaAプロモーターの制御下に置いた。制限酵素消化に
より正しい方向を確認した。全カセットをKpnI/XbaI 断
片として、ウリジン栄養要求性アスペルギルス属におけ
る選択マーカーであるニューロスポラ・クラサ (Neuros
pora crassa)のpyr4遺伝子を持つpUC19 (pUC19-pyr4)
(New England Biolabs, GmbH, Schwalbach, BRD) に移
し、ベクターpFPAN1を得た（図１２を参照；制限部位お
よびコーディング領域を示してある；横線で消されてい
る制限部位は平滑末端連結部位を示す）。ベクター pPAT1の構築Ａ．ニードランスのグリセルアルデヒド-3- ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（gpdA）プロモーターを、プラスミ
ド pAN52-1〔Puntら (1987), Gene 56: 117-124 〕から
約2.3 kbのEcoRI/NcoI断片として単離し、pUC19-NcoI
（SmaI部位をNcoI部位で置き換えたpUC19 ）にクローニ
ングし、EcoRI/BamHI 断片として再単離し、そして上記
のtrpCターミネーターを含むpBS にクローニングした。
得られたカセットをpGPDN と名づけた。Ａ．テレウス遺
伝子をNcoI/EcoRI断片として単離し、EcoRI 部位を修復
して平滑末端とした。プラスミドpGPDN をBamHI とNcoI
で切断した。BamHI 部位を修復して平滑末端とした。
Ａ．テレウス遺伝子のNcoI/EcoRI（平滑）断片をgpdAプ
ロモーターとtrpCターミネーターの間にクローニングし
た。発現カセットをKpnI/XbaI 断片として単離し、pUC1
9-pyr4にクローニングしてプラスミドpPAT1 を得た（図
１３を参照；記号の説明については図１２の説明を参照
のこと）。アスペルギルス・ニガーにおける融合タンパク質の発現Ａ）形質転換若干の変更を伴う、Ballanceら〔(1983), Biochem. Bio
phys. Res. Commun 112, 284-289〕によって記載される
形質転換プロトコールを使用して、プラスミドpFPAN1で
Ａ．ニガーを形質転換した。

【００６２】− ＹＰＤ培地（1%酵母エキス、2%ペプト
ン、2%デキストロース）に１mlあたり10６の胞子を植
えつけ、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間生育させた； − Wero-Lene N ティッシュ (No. 8011.0600 Wernli A
G Verbandstoffabrik,4852 Rothrist, CH) を使って細
胞を回収し、緩衝液 (0.01M スクシネート緩衝液中の0.
8M KCl, 0.05M CaCl２; pH 5.5)で１回洗った； − プロトプラスト調製のため、溶解酵素 (SIGMA L-22
65, St. Louis, MO, USA) のみを使用した； − 細胞を３０℃、１００ｒｐｍで９０分間インキュベ
ートし、濾過 (Wero-Lene N ティッシュ) によりプロト
プラストを分離した； − プロトプラストをＳＴＣ（1Mソルビトール, 0.05M
CaCl２, 0.01M Tris/HCl pH 7.5) で１回洗い、同じ緩
衝液に再懸濁した； − １５０μｌのプロトプラスト（約10８/ml）を１０
〜１５μｇのプラスミドＤＮＡと穏やかに混合し、室温
で２５分間インキュベートした； − ポリエチレングリコール (60% PEG 4000, 50mM CaC
l２, 10mM Tris/HCl pH 7.5) を３段階（150 μl 、200
μl および900 μl ）で加え、サンプルを室温で２５
分間さらにインキュベートした； − ５mlのＳＴＣを加え、遠心し、プロトプラストを2.
5 mlのＹＧＳ（0.5%酵母エキス、2%グルコース、1.2Mソ
ルビトール）に再懸濁した； − サンプルを３０℃、１００ｒｐｍで２時間インキュ
ベートし、遠心し、プロトプラストを１mlの1.2Mソルビ
トールに再懸濁した； − 形質転換プロトプラストを２０mlの最小再生培地
(１リットルあたり0.2gのアルギニンおよび10mgのニコ
チンアミドを補充した、0.7%アミノ酸不含酵母窒素原基
礎培地、2%グルコース、1Mソルビトール、1.5%寒天、20
mM Tris/HCl pH 7.5) と混合した； − プレートを３０℃で３〜５日間インキュベートし
た。Ｂ）発現単一の形質転換体を単離し、精製し、そして融合タンパ
ク質の過剰生産について調べた。１００mlのＭ２５培地
〔１リットルあたり70g マルトデキストリン (Glucidex
17D, Sugro Basel, CH), 12.5g 酵母エキス, 25g カゼ
イン加水分解産物, 2g KH２PO４, 2g K２SO４, 0.5g Mg
SO４.7H２O, 0.03g ZnCl２, 0.02g CaCl２, 0.05g MnSO
４.4H２O, 0.05g FeSO４; pH 5.6 〕に形質転換体FPAN1
#11, #13, #16, #E25, #E30, #E31のそれぞれからの10
６/mlの胞子を植えつけ、３０℃、２７０ｒｐｍで５日
間インキュベートした。上澄み液を集め、活性を測定し
た。融合タンパク質はｐＨ２．５で基質としてのフィチ
ン酸に対して最大活性を示し、一方、基質として4-ニト
ロフェニルホスフェートを用いた場合は、ｐＨ２．５お
よび５．０において最大活性を示した（表１）。Ｃ）活性試験ａ）フィチン酸１mlの酵素反応液は0.5ml の透析上澄み液（必要に応じ
て希釈）と5.4mM のフィチン酸 (SIGMA P-3168) を含ん
でいた。酵素反応はそれぞれ0.2M酢酸ナトリウム緩衝液
pH 5.0および0.2Mグリシン緩衝液pH 2.5中で行った。サ
ンプルを３７℃で１５分間インキュベートした。１mlの
15％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を加えることにより反応
を停止させた。

【００６３】呈色反応のために、反応を停止させた0.1
mlのサンプルを0.9 mlの蒸留水で希釈し、１mlの試薬溶
液（３容量の1M H２SO４, １容量の2.5% (NH４)６Mo７O
２４,１容量の10% アスコルビン酸）と混合した。サン
プルを５０℃で２０分間インキュベートし、青色を８２
０ｎｍで分光光度分析により測定した。この試験はホス
フェートの放出に基づくので、ホスフェート標準曲線
（１１〜４５nmol／ml）を用いてサンプルの活性を測定
した。ｂ）4-ニトロフェニルホスフェート１mlの酵素反応液は100 μl の透析上澄み液（必要に応
じて希釈）と1.7mM の4-ニトロフェニルホスフェート
(Merck, 6850, Darmstadt, BRD)を含んでいた。酵素反
応はそれぞれ0.2M酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0および0.
2Mグリシン緩衝液pH 2.5中で行った。サンプルを３７℃
で１５分間インキュベートした。１mlの15％ＴＣＡを加
えて反応を停止させた。

【００６４】酵素活性の測定には、上記のプロトコール
を使用した。

【００６５】

【表１】

【００６６】アスペルギルス・ニガーにおけるアスペル
ギルス・テレウス 9A1遺伝子の発現Ａ．ニガーNW205 を上記のようにプラスミドpPAT1 で形
質転換した。単一の形質転換体を単離し、精製し、Ａ．
テレウスタンパク質の過剰発現についてスクリーニング
した。５０mlのＹＰＤ培地に、形質転換体 PAT1#3, #1
0, #11, #13, #16 のそれぞれからの10６/mlの胞子を植
えつけ、３０℃、２７０ｒｐｍで３日間インキュベート
した。上澄み液を集め、活性を上記のように測定した。
ただし、酵素反応のｐＨが違っていた。この酵素は、基
質としてフィチン酸を用いた場合はｐＨ５．５で、基質
として4-ニトロフェニルホスフェートを用いた場合はｐ
Ｈ３．５でその主要活性を示した（表２）。

【００６７】

【表２】

【００６８】実施例１０アスペルギルス・ニガーNW205 形質転換体の発酵Ａ）形質転換体 FPAN1#11 振とうフラスコ中の前培養培地〔１リットルあたり30g
マルトデキストリン (Glucidex 17D), 10g酵母エキス,
10g カゼイン加水分解産物, 1g KH２PO４, 0.5gMgSO４.
7H２O, 3g Tween 80; pH 5.5 〕に10６/mlの胞子を植え
つけ、３４℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベート
した。

【００６９】１０リットルの発酵槽に前培養物を１：１
００の最終希釈で植えつけた。バッチ式発酵は最低２５
％の自動制御溶存酸素濃度（ｐＯ２ ≧２５％）でもっ
て３０℃で行った。ｐＨは5M NaOH による自動滴定で
３．０に維持した。

【００７０】発酵用の培地は、１リットルあたり35g マ
ルトデキストリン, 9.4g酵母エキス, 18.7g カゼイン加
水分解産物, 2g KH２PO４, 2g K２SO４, 0.5g MgSO４.7
H２O, 0.03g ZnCl２, 0.02g CaCl２, 0.05g MnSO４.4H
２O, 0.05g FeSO４; pH 5.6であった。

【００７１】これらの条件下で３日後に得られた酵素活
性は、基質としてフィチン酸を用いた場合がｐＨ２．５
およびｐＨ５．０でそれぞれ３５単位／mlおよび１６単
位／mlであり、基質として4-ニトロフェニルホスフェー
トを用いた場合がｐＨ２．５およびｐＨ５．０でそれぞ
れ２９５単位／mlおよび９０単位／mlであった。Ｂ）形質転換体 PAT1#11 前培養、発酵槽の植えつけ、および発酵培地は上記のと
おりであったが、ｐＨを5M NaOH による自動滴定で４．
５に保持した。

【００７２】これらの条件下で４日後に得られた酵素活
性は、基質としてフィチン酸を用いた場合がｐＨ５．５
で１７．５単位／mlであり、基質として4-ニトロフェニ
ルホスフェートを用いた場合がｐＨ３．５で２単位／ml
であった。実施例１１アスペルギルス・テレウス (CBS 220.95) のフィターゼ
遺伝子のＰＣＲ断片の単離アスペルギルス・テレウス (CBS 220.95) のＤＮＡを用
いて、断片のＰＣＲ増幅のために２つの異なるプライマ
ー対を使用した。用いたプライマーを下記の表に示す。

【００７３】プライマー８および１０はセンスプライマ
ーであり、プライマー９および１１はアンチセンスプラ
イマーである。これらのプライマーはアスペルギルス・
ニガー遺伝子のコーディング配列の表示した部分に相当
する。用いた組合せはプライマー８プラス９および１０
プラス１１である。Clontech (Palo Alto, CA, USA)か
らのTaq-Start 抗体キットを製造会社のプロトコールに
従って使用した。８プラス９のプライマー濃度は０．２
ｍＭとし、１０プラス１１のプライマー濃度は１ｍＭと
した。増幅のためにタッチ−ダウン (touch-down) ＰＣ
Ｒを採用した〔Don, R.H. ら(1991), Nucleic Acids Re
s. 19, 4008 〕。初めに、ＤＮＡを９５℃で３分間変性
した。その後、次のアニーリング温度：６０℃、５９
℃、５８℃、５７℃、５６℃、５５℃、５４℃、５３
℃、５２℃および５１℃のそれぞれで１分のアニーリン
グ時間で２サイクルを実施した。アニーリング前にイン
キュベーションを９５℃で１分間行い、アニーリング後
に伸長反応を７２℃で３０秒間行った。サイクル２１か
ら３５は次のように行った。すなわち、９５℃で１分の
変性、５０℃で１分のアニーリング、および７２℃で３
０秒の伸長反応。

【００７４】２つの異なるＰＣＲ断片が得られた。これ
らのＤＮＡ配列およびこれらとアスペルギルス・テレウ
ス 9A1のフィターゼ遺伝子の関連部分との比較を図１４
に示す。アスペルギルス・テレウス 9A1のフィターゼ遺
伝子の関連部分は“9a1 ”（上線）に、そしてアスペル
ギルス・テレウス CBS 220.95 のＰＣＲ断片は“aterr2
1 ”（下線）に示してある。パネルＡ：プライマー対８
プラス９により得られた断片（aterr21 ）。パネルＢ：
プライマー対１０プラス１１により得られた断片（ater
r58 ）。アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 のＤＮ
Ａ配列（上線）がアスペルギルス・テレウス 9A1のＤＮ
Ａ配列（下線）と比較される。パネルＡ：aterr21 断片
中の太字のｇｃ配列（塩基１６および１７）はおそらく
ｃｇであるだろう（ＤＮＡ配列決定が不確定）。パネル
Ｂ：aterr58 ＰＣＲ断片の２６位のｘは４種のヌクレオ
チドのいずれかを表す。実施例１２非ストリンジェントおよびストリンジェント洗浄条件下
での交差ハイブリダイゼーション表３に示した各菌株のゲノムＤＮＡ５μｇを、ＤＮＡ１
μｇにつき４単位のHindIII またはPstIとともに３７℃
で４時間インキュベートした。消化後、混合物をフェノ
ールで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。次い
で、サンプルを０．８％アガロースゲルで分析した。移
行溶液として1M NaCl を含有する0.4M NaOH を用いてＤ
ＮＡをニトラン膜 (Schleicher & Schuell, Keene, NH,
USA) に移行させた。ハイブリダイゼーションは４２℃
で１８時間行った。ハイブリダイゼーション溶液は、50
% ホルムアミド、１％ＳＤＳ、10% デキストラン硫酸、
４ｘＳＳＰＥ (１ｘＳＳＰＥ＝0.18M NaCl, 1mM EDTA,
10mM NaH２PO４, pH7.4)、0.5% blotto (H２O中の粉ミ
ルク) および0.5mg/mlサケ精子ＤＮＡを含んでいた。膜
を非ストリンジェント条件下で洗い、最後の最もストリ
ンジェントな条件としては、0.1%ＳＤＳを含有する 0.1
ｘＳＳＰＥ中、室温で３０分のインキュベーションを採
用した。用いたプローブ（約10９dpm／μg DNA の比活
性で標識したもの）は、ミセリオフトラ・サーモフィラ
(Mycelio. thermo.) ；アスペルギルス・ニードランス
(Asperg. nidul.) ；アスペルギルス・フミガツス (As
perg. fumig.)；アスペルギルス・テレウス 9A1 (Asper
g. terreus 9A1)；タラロミセス・サーモフィルス (Tal
arom. thermo.) のゲノムＤＮＡを用いてプライマー８
プラス９（実施例１１参照）により生成されたＰＣＲ断
片であった。MT2 ゲノムプローブはランダムプライミン
グ（Pharmacia 社によって提供されたプロトコールに従
う）により得られたもので、Mycelio. thermo.フィター
ゼ遺伝子のＮ末端の上流のBspEI 部位からＣ末端のPvuI
I 部位までの1410bp (2068−3478位) にわたる。AT2 ゲ
ノムプローブはランダムプライミングにより得られたも
ので、Asperg. terreus 9A1 フィターゼ遺伝子のApaI部
位からNdeI部位までの1365bp (491 −1856位) にわた
る。AN2 DNA プローブはランダムプライミングにより得
られ、Asperg.niger 遺伝子 (EP 420 358) の完全なコ
ーディング配列 (1404bp) にわたる。結果を表３に示す
〔“＊”は非特異的２０ｋｂ断片に相当する弱いシグナ
ルを除外；タラロミセス・サーモフィルスからのＰＣＲ
断片を用いてアスペルギルス・ニガー由来のＤＮＡにお
いて見られた２０ｋｂにおける非常に弱い交差ハイブリ
ダイゼーションシグナルの場合、このシグナルは、フィ
ターゼ遺伝子を含むと予期される１０ｋｂのHindIII 断
片と著しく異なるから、非特異的である；“**”はＤＮ
Ａの部分消化産物によるシグナル〕。

【００７５】ストリンジェント洗浄条件による交差ハイ
ブリダイゼーションのために、膜を0.1%ＳＤＳを含有す
る 0.1ｘＳＳＰＥ中で６５℃、３０分間さらに洗浄し
た。結果を表４に示す〔（１） 10.5kbのHindIII 断片
だけが依然として検出され、6.5kbのHindIII 断片は消
失する（表３を参照）〕。

【００７６】

【表３】

【００７７】no：検出されない

【００７８】

【表４】

【００７９】yes ：検出された

【００８０】

【配列表】 <110> F. HOFFMAN-LA ROCHE AG <120> Method for obtaining DNA encoding heat torelant phytases <130> PA01-063 <140> <141> <150> CH 94810228:0 <151> 1994-04-25 <160> 21 <170> Windows MS Word <210> 1 <211> 2327 <212> DNA <213> Aspergilus terreus <220> <221> CDS <222> join(374..420, 469..1819) <400> 1 tctagaacaa taacaggtac tccctaggta cccgaaggac cttgtggaaa atgtatggag 60 gtggacacgg caccaaccac cacccgcgat ggcgcacgtg gtgccctaac cccttgctcc 120 ctcaggatgg aatccatgtc gactctttac cctcaccatc gcctggatga aacctccccg 180 ctaagctcac gacgatcgct atttccgacc gatttgaccg tcatggtgga gggctgattc 240 ggtcgatgct cctgccttca tttcggagtt cggagacatg aaaggcttat atgaggacgt 300 cccaggtcgg ggacgaaatc cgccctgggc tgtgctcctt cgtcggaaac atctgctgtc 360 cgtgatggct acc atg ggc ttt ctt gcc att gtg ctc tcc gtc gcc ttg 409 Met Gly Phe Leu Ala Ile Val Leu Ser Val Ala Leu 1 5 10 ctc ttt aga ag gtatgcaccc ctctacgtcc aattctctgg gcactgacaa 460 Leu Phe Arg Ser 15 cggcgcag c aca tcg ggc acc ccg ttg ggc ccc cgg ggc aaa cat agc 508 Thr Ser Gly Thr Pro Leu Gly Pro Arg Gly Lys His Ser 20 25 gac tgc aac tca gtc gat cac ggc tat caa tgc ttt cct gaa ctc tct 556 Asp Cys Asn Ser Val Asp His Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu Leu Ser 30 35 40 45 cat aaa tgg gga ctc tac gcg ccc tac ttc tcc ctc cag gac gag tct 604 His Lys Trp Gly Leu Tyr Ala Pro Tyr Phe Ser Leu Gln Asp Glu Ser 50 55 60 ccg ttt cct ctg gac gtc cca gag gac tgt cac atc acc ttc gtg cag 652 Pro Phe Pro Leu Asp Val Pro Glu Asp Cys His Ile Thr Phe Val Gln 65 70 75 gtg ctg gcc cgc cac ggc gcg cgg agc cca acc cat agc aag acc aag 700 Val Leu Ala Arg His Gly Ala Arg Ser Pro Thr His Ser Lys Thr Lys 80 85 90 gcg tac gcg gcg acc att gcg gcc atc cag aag agt gcc act gcg ttt 748 Ala Tyr Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ile Gln Lys Ser Ala Thr Ala Phe 95 100 105 ccg ggc aaa tac gcg ttc ctg cag tca tat aac tac tcc ttg gac tct 796 Pro Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Gln Ser Tyr Asn Tyr Ser Leu Asp Ser 110 115 120 125 gag gag ctg act ccc ttc ggg cgg aac cag ctg cga gat ctg ggc gcc 844 Glu Glu Leu Thr Pro Phe Gly Arg Asn Gln Leu Arg Asp Leu Gly Ala 130 135 140 cag ttc tac gag cgc tac aac gcc ctc acc cga cac atc aac ccc ttc 892 Gln Phe Tyr Glu Arg Tyr Asn Ala Leu Thr Arg His Ile Asn Pro Phe 145 150 155 gtc cgc gcc acc gat gca tcc cgc gtc cac gaa tcc gcc gag aag ttc 940 Val Arg Ala Thr Asp Ala Ser Arg Val His Glu Ser Ala Glu Lys Phe 160 165 170 gtc gag ggc ttc caa acc gct cga cag gac gat cat cac gcc aat ccc 988 Val Glu Gly Phe Gln Thr Ala Arg Gln Asp Asp His His Ala Asn Pro 175 180 185 cac cag cct tcg cct cgc gtg gac gtg gcc atc ccc gaa ggc agc gcc 1036 His Gln Pro Ser Pro Arg Val Asp Val Ala Ile Pro Glu Gly Ser Ala 190 195 200 205 tac aac aac acg ctg gag cac agc ctc tgc acc gcc ttc gaa tcc agc 1084 Tyr Asn Asn Thr Leu Glu His Ser Leu Cys Thr Ala Phe Glu Ser Ser 210 215 220 acc gtc ggc gac gac gcg gtc gcc aac ttc acc gcc gtg ttc gcg ccg 1132 Thr Val Gly Asp Asp Ala Val Ala Asn Phe Thr Ala Val Phe Ala Pro 225 230 235 gcg atc gcc cag cgc ctg gag gcc gat ctt ccc ggc gtg cag ctg tcc 1180 Ala Ile Ala Gln Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Gln Leu Ser 240 245 250 acc gac gac gtg gtc aac ctg atg gcc atg tgt ccg ttc gag acg gtc 1228 Thr Asp Asp Val Val Asn Leu Met Ala Met Cys Pro Phe Glu Thr Val 255 260 265 agc ctg acc gac gac gcg cac acg ctg tcg ccg ttc tgc gac ctc ttc 1276 Ser Leu Thr Asp Asp Ala His Thr Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe 270 275 280 285 acg gcc act gag tgg acg cag tac aac tac ctg ctc tcg ctg gac aag 1324 Thr Ala Thr Glu Trp Thr Gln Tyr Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Asp Lys 290 295 300 tac tac ggc tac ggc ggg ggc aat ccg ctg ggt ccg gtg cag ggg gtc 1372 Tyr Tyr Gly Tyr Gly Gly Gly Asn Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly Val 305 310 315 ggc tgg gcg aac gag ctg atg gcg cgg cta acg cgc gcc ccc gtg cac 1420 Gly Trp Ala Asn Glu Leu Met Ala Arg Leu Thr Arg Ala Pro Val His 320 325 330 gac cac acc tgc gtc aac aac acc ctc gac gcg agt ccg gcc acc ttc 1468 Asp His Thr Cys Val Asn Asn Thr Leu Asp Ala Ser Pro Ala Thr Phe 335 340 345 ccg ctg aac gcc acc ctc tac gcc gac ttc tcc cac gac agc aac ctg 1516 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gatagatagg tagtacatat 1859 Trp Ala Asp Cys Phe 465 ggattgctcg gctctgggtc gttgcccaca atgcatatta cgcccgtcaa ctgccttgcg 1919 ccatccacct ctcaccctgg acgcaaccga gcggtctacc ctgcacacgg cttccaccgc 1979 gacgcgcacg gataaggcgc ttttgttacg gggttggggc tgggggcagc cggagccgga 2039 gagagagacc agcgtgaaaa acgacagaac atagatatca attcgacgcc aattcatgca 2099 gagtagtata cagacgaact gaaacaaaca catcacttcc ctcgctcctc tcctgtagaa 2159 gacgctccca ccagccgctt ctggccctta ttcccgtacg ctaggtagac cagtcagcca 2219 gacgcatgcc tcacaagaac gggggcgggg gacacactcc gctcgtacag cacccacgac 2279 gtgtacagga aaaccggcag cgccacaatc gtcgagagcc atctgcag 2327 <210> 2 <211> 466 <212> PRT <213> Aspergilus terreus <400> 2 Met Gly Phe Leu Ala Ile Val Leu Ser Val Ala Leu Leu Phe Arg Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Thr Pro Leu Gly Pro Arg Gly Lys His Ser Asp Cys Asn 20 25 30 Ser Val Asp His Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu Leu Ser His Lys Trp 35 40 45 Gly Leu Tyr Ala Pro Tyr Phe Ser Leu Gln Asp Glu Ser Pro Phe Pro 50 55 60 Leu Asp Val Pro Glu Asp Cys His Ile Thr 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attaatacca cgcgcctgcg taaattagct agccgccgcc ctgtttcact 900 cggttagaga cggacaggtg agacgggtct cggttaagca agcaaattgg aatgcaaggt 960 tgaaggtgta atctgcatag cgtggaaatg agagggctct gtgggcagcc aggaaggtga 1020 gacgaaatga ggaaagaggc accagaagct gttgttctga agtgcccgtg gtcatagctc 1080 caggattaag tacggatgtc ccatgccaag ctgctggctt cgaaagcgag tacggagtag 1140 tgtccattgt tcacgaggga tccccaatgt gttagacatg cctgaatcaa ttttgtccta 1200 tttttggatt tcaactgttt ctctcgactg tgctcggtag cgactatgcc gcaaggtaca 1260 ctacatgttg tacaataatc atacatcgac cttccgtagg agtgctgaaa tacccgacct 1320 gctctctcta gcaggtgcct aatggctttc gtgtaactcg atcgaaacgg atcagcaagt 1380 ccatttgctg ttggttgaga tgtacgattt acaaacacgt ggagaggtga gccacagcga 1440 taggcttctg gaaggattct ggcgtctcgg aaagagggcc actcgcccca ctaaccggcg 1500 ccgatcttga catggggctc gcagggggtt taagtgcaca ctacggagta cggattacac 1560 agtagtgtat gggtgggggc gagtttgggt ggccttgtgt ggggctcacc ggctgcctgt 1620 tctcggggag tcttggcggg ccgattggac ccacctaacc acgggtagtc ttggcccggc 1680 caactcacac cgccctcatg tttcggagcc agtcagggag gcaggcacta ctcagtcagg 1740 tacacacgtc gggctcctcg atgctgggtg acatcgaggc gatactgcat tccaactacg 1800 gttggcatag gaggtatcct attctagagc tgttctacgc cggaacgtaa cccgggataa 1860 cccgggatat cgcttccctg agcgagcgcg ctgctgagga tcatacaacc caacaaccga 1920 cgacggtgca agaaggttgg gggaaggaag aaatcaagga aaaaaaaata gggggggtgg 1980 ggaccaagag agaaagaaag gagaaaaggg tggggggagg gaagagaaaa aaaaaacgga 2040 ggaatatggc gtcgctcttc gactggttcc ggaagggggc atctgggtac acatatgcac 2100 ctcttccgca cggcagggat ataaaccggg agtgcagtcc caccgatcat gctgagtccg 2160 cccgtctcca gacttcacgg tcgcagagga ctagacgcgc ggtgaag atg act ggc 2216 Met Thr Gly 1 ctc gga gtg atg gtg gtg atg gtc ggc ttc ctg gcg atc gcc tct ct 2263 Leu Gly Val Met Val Val Met Val Gly Phe Leu Ala Ile Ala Ser Leu 5 10 15 gtaagcagcg attccagggg tccggtgtgc gttaaaagaa aaagctaacg ccaccag a 2321 caa tcc gag tcc cgg cca tgc gac acc cca gac ttg ggc ttc cag tgt 2369 Gln Ser Glu Ser Arg Pro Cys Asp Thr Pro Asp Leu Gly Phe Gln Cys 20 25 30 35 ggt acg gcc att tcc cac ttc tgg ggc cag tac tcg ccc tac ttc tcc 2417 Gly Thr Ala Ile Ser His Phe Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser 40 45 50 gtg ccc tcg gag ctg gat gct tcg atc ccc gac gac tgc gag gtg acg 2465 Val Pro Ser Glu Leu Asp Ala Ser Ile Pro Asp Asp Cys Glu Val Thr 55 60 65 ttt gcc caa gtc ctc tcc cgc cac ggc gcg agg gcg ccg acg ctc aaa 2513 Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Ala Pro Thr Leu Lys 70 75 80 cgg gcc gcg agc tac gtc gat ctc atc gac agg atc cac cat ggc gcc 2561 Arg Ala Ala Ser Tyr Val Asp Leu Ile Asp Arg Ile His His Gly Ala 85 90 95 atc tcc tac ggg ccg ggc tac gag ttc ctc agg acg tat gac tac acc 2609 Ile Ser Tyr Gly Pro Gly Tyr Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Asp Tyr Thr 100 105 110 115 ctg ggc gcc gac gag ctc acc cgg acg ggc cag cag cag atg gtc aac 2657 Leu Gly Ala Asp Glu Leu Thr Arg Thr Gly Gln Gln Gln Met Val Asn 120 125 130 tcg ggc atc aag ttt tac cgc cgc tac cgc gct ctc gcc cgc aag tcg 2705 Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Arg Ala Leu Ala Arg Lys Ser 135 140 145 atc ccc ttc gtc cgc acc gcc ggc cag gac cgc gtc gtc cac tcg gcc 2753 Ile Pro Phe Val Arg Thr Ala Gly Gln Asp Arg Val Val His Ser Ala 150 155 160 gag aac ttc acc cag ggc ttc cac tct gcc ctg ctc gcc gac cgc ggg 2801 Glu Asn Phe Thr Gln Gly Phe His Ser Ala Leu Leu Ala Asp Arg Gly 165 170 175 tcc acc gtc cgg ccc acc ctc ccc tat gac atg gtc gtc atc ccg gaa 2849 Ser Thr Val Arg Pro Thr Leu Pro Tyr Asp Met Val Val Ile Pro Glu 180 185 190 195 acc gcc ggc gcc aac aac acg ctc cac aac gac ctc tgc acc gcc ttc 2897 Thr Ala Gly Ala Asn Asn Thr Leu His Asn Asp Leu Cys Thr Ala Phe 200 205 210 gag gaa ggc ccg tac tcg acc atc ggc gac gac gcc caa gac acc tac 2945 Glu Glu Gly Pro Tyr Ser Thr Ile Gly Asp Asp Ala Gln Asp Thr Tyr 215 220 225 ctc tcc acc ttc gcc gga ccc atc acc gcc cgg gtc aac gcc aac ctg 2993 Leu Ser Thr Phe Ala Gly Pro Ile Thr Ala Arg Val Asn Ala Asn Leu 230 235 240 ccg ggc gcc aac ctg acc gac gcc gac acg gtc gcg ctg atg gac ctc 3041 Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Ala Asp Thr Val Ala Leu 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２０５ＴｈｒＡｌａＰｈｅＧｌｕＧｌｕＧｌｙＰｒｏＴｙｒＳｅｒ
ＴｈｒＩｌｅＧｌｙＡｓｐＡｓｐＡｌａＧｌｎ２１０２１５
２２０ＡｓｐＴｈｒＴｙｒＬｅｕＳｅｒＴｈｒＰｈｅＡｌａＧｌｙ
ＰｒｏＩｌｅＴｈｒＡｌａＡｒｇＶａｌＡｓｎ２２５２３０
２３５２４０ＡｌａＡｓｎＬｅｕＰｒｏＧｌｙＡｌａＡｓｎＬｅｕＴｈｒ
ＡｓｐＡｌａＡｓｐＴｈｒＶａｌＡｌａＬｅｕ２４５
２５０２５５ＭｅｔＡｓｐＬｅｕＣｙｓＰｒｏＰｈｅＧｌｕＴｈｒＶａｌ
ＡｌａＳｅｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｓｐＰｒｏ２６０２６５
２７０ＡｌａＴｈｒＡｌａＡｓｐＡｌａＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｓｎ
ＧｌｙＡｒｇＰｒｏＬｅｕＳｅｒＰｒｏＰｈｅ２７５２８０
２８５ＣｙｓＡｒｇＬｅｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＳｅｒＧｌｕＴｒｐ
ＡｒｇＡｌａＴｙｒＡｓｐＴｙｒＬｅｕＧｌｎ２９０２９５
３００ＳｅｒＶａｌＧｌｙＬｙｓＴｒｐＴｙｒＧｌｙＴｙｒＧｌｙ
ＰｒｏＧｌｙＡｓｎＰｒｏＬｅｕＧｌｙＰｒｏ３０５３１０
３１５３２０ＴｈｒＧｌｎＧｌｙＶａｌＧｌｙＰｈｅＶａｌＡｓｎＧｌｕ
ＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＬｅｕＡｌａＧｌｙ３２５
３３０３３５ＶａｌＰｒｏＶａｌＡｒｇＡｓｐＧｌｙＴｈｒＳｅｒＴｈｒ
ＡｓｎＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｓｐ３４０３４５
３５０ＰｒｏＡｒｇＴｈｒＰｈｅＰｒｏＬｅｕＧｌｙＡｒｇＰｒｏ
ＬｅｕＴｙｒＡｌａＡｓｐＰｈｅＳｅｒＨｉｓ３５５３６０
３６５ＡｓｐＡｓｎＡｓｐＭｅｔＭｅｔＧｌｙＶａｌＬｅｕＧｌｙ
ＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｌａＴｙｒＡｓｐＧｌｙ３７０３７５
３８０ＶａｌＰｒｏＰｒｏＬｅｕＡｓｐＬｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇ
ＡｒｇＡｓｐＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｙ３８５３９０
３９５４００ＧｌｙＴｙｒＡｌａＡｌａＳｅｒＴｒｐＡｌａＶａｌＰｒｏ
ＰｈｅＡｌａＡｌａＡｒｇＩｌｅＴｙｒＶａｌ４０５
４１０４１５ＧｌｕＬｙｓＭｅｔＡｒｇＣｙｓＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｕ４２０４２５
４３０ＧｌｙＡｒｇＧｌｎＧｌｕＬｙｓＡｓｐＧｌｕＧｌｕＭｅｔ
ＶａｌＡｒｇＶａｌＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｓｐ４３５４４０
４４５ＡｒｇＶａｌＭｅｔＴｈｒＬｅｕＬｙｓＧｌｙＣｙｓＧｌｙ
ＡｌａＡｓｐＧｌｕＡｒｇＧｌｙＭｅｔＣｙｓ４５０４５５
４６０ＴｈｒＬｅｕＧｌｕＡｒｇＰｈｅＩｌｅＧｌｕＳｅｒＭｅｔ
ＡｌａＰｈｅＡｌａＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙ４６５４７０
４７５４８０ＬｙｓＴｒｐＡｓｐＬｅｕＣｙｓＰｈｅＡｌａ４８５＜２１０＞５ <211> 100 <212> DNA <213> Talaromyces thermophilus <220> <221> CDS <222> 2..100 <400> 5 gaccttggct cgcaaccaca cagacacgct gtctccgttc tgcgctcttt ccacgcaaga 60 ggagtggcaa gcatatgact actaccaaag tctggggaat 100 <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Talaromyces thermophilus <400> 6 Thr Leu Ala Arg Asn His Thr Asp Thr Leu Ser Pro Phe Cys Ala Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gln Glu Glu Trp Gln Ala Tyr Asp Tyr Tyr Gln Ser Leu Gly 20 25 30 Asn <210> 7 <211> 106 <212> DNA <213> Aspergillus fumigatus <220> <221> CDS <222> 2..106 <400> 7 tacggtagcg cgcaccagcg acgcaagtca gctgtcaccg ttctgtcaac tcttcactca 60 caatgagtgg aagaagtaca actaccttca gtccttgggc aagtac 106 <210> 8 <211> 35 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus <400> Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Ser Gln Leu Ser Pro Phe Cys Gln 1 5 10 15 Leu Phe Thr His Asn Glu Trp Lys Lys Tyr Asn Tyr Leu Gln Ser Leu 20 25 30 Gly Lys Tyr 35 <210> 9 <211> 109 <212> DNA <213> Aspergillus nidulans <220> <221> CDS <222> 2..109 <400> 9 caccatggcg cgcaccgcca ctcggaaccg tagtctgtct ccattttgtg ccatcttcac 60 tgaaaaggag tggctgcagt acgactacct tcaatctcta tcaaagtac 109 <210> 10 <211> 36 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> Thr Met Ala Arg Thr Ala Thr Arg Asn Arg Ser Leu Ser Pro Phe Cys 1 5 10 15 Ala Ile Phe Thr Glu Lys Glu Trp Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Ser Lys Tyr 35 <210> 11 <211> 1912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> 1..1396 <223> Description of Artificial Sequence: DNA encoding chimeric phytase <220> <221> CDS <222> 1..1398 <400> 11 atg ggc gtc tct gct gtt cta ctt cct ttg tat ctc cta gct gga gtc 48 Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ala Gly Val 1 5 10 15 acc tcc gga ctg gca gtc ccc gcc tcg aga aat caa tcc act tgc gat 96 Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp 20 25 30 acg gtc gat caa ggg tat caa tgc ttc tcc gag act tcg cat ctt tgg 144 Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp 35 40 45 ggt caa tac gcg ccg ttc ttc tct ctg gca aac gaa tcg gtc atc tcc 192 Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser 50 55 60 cct gat gtg ccc gcc ggt tgc aga gtc act ttc gct cag gtc ctc tcc 240 Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 cgt cat gga gcg cgg tat ccg acc gag tcc aag ggc aag aaa tac tcc 288 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Glu Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser 85 90 95 gct ctc att gag gag atc cag cag aac gtg acc acc ttt gat gga aaa 336 Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Val Thr Thr Phe Asp Gly Lys 100 105 110 tat gcc ttc ctg aag aca tac aac tac agc ttg ggt gca gat gac ctg 384 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 act ccc ttc gga gag cag gag cta gtc aac tcc ggc atc aag ttc tac 432 Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 cag cgc tac aac gcc ctc acc cga cac atc aac ccc ttc gtc cgc gcc 480 Gln Arg Tyr Asn Ala Leu Thr Arg His Ile Asn Pro Phe Val Arg Ala 145 150 155 160 acc gat gca tcc cgc gtc cac gaa tcc gcc gag aag ttc gtc gag ggc 528 Thr Asp Ala Ser Arg Val His Glu Ser Ala Glu Lys Phe Val Glu Gly 165 170 175 ttc caa acc gct cga cag gac gat cat cac gcc aat ccc cac cag cct 576 Phe Gln Thr Ala Arg Gln Asp Asp His His Ala Asn Pro His Gln Pro 180 185 190 tcg cct cgc gtg gac gtg gcc atc ccc gaa ggc agc gcc tac aac aac 624 Ser Pro Arg Val Asp Val Ala Ile Pro Glu Gly Ser Ala Tyr Asn Asn 195 200 205 acg ctg gag cac agc ctc tgc acc gcc ttc gaa tcc agc acc gtc ggc 672 Thr Leu Glu His Ser Leu Cys Thr Ala Phe Glu Ser Ser Thr Val Gly 210 215 220 gac gac gcg gtc gcc aac ttc acc gcc gtg ttc gcg ccg gcg atc gcc 720 Asp Asp Ala Val Ala Asn Phe Thr Ala Val Phe Ala Pro Ala Ile Ala 225 230 235 240 cag cgc ctg gag gcc gat ctt ccc ggc gtg cag ctg tcc acc gac gac 768 Gln Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Gln Leu Ser Thr Asp Asp 245 250 255 gtg gtc aac ctg atg gcc atg tgt ccg ttc gag acg gtc agc ctg acc 816 Val Val Asn Leu Met Ala Met Cys Pro Phe Glu Thr Val Ser Leu Thr 260 265 270 gac gac gcg cac acg ctg tcg ccg ttc tgc gac ctc ttc acg gcc act 864 Asp Asp Ala His Thr Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr Ala Thr 275 280 285 gag tgg acg cag tac aac tac ctg ctc tcg ctg gac aag tac tac ggc 912 Glu Trp Thr Gln Tyr Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Asp Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 tac ggc ggg ggc aat ccg ctg ggt ccg gtg cag ggg gtc ggc tgg gcg 960 Tyr Gly Gly Gly Asn Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Trp Ala 305 310 315 320 aac gag ctg atg gcg cgg cta acg cgc gcc ccc gtg cac gac cac acc 1008 Asn Glu Leu Met Ala Arg Leu Thr Arg Ala Pro Val His Asp His Thr 325 330 335 tgc gtc aac aac acc ctc gac gcg agt ccg gcc acc ttc ccg ctg aac 1056 Cys Val Asn Asn Thr Leu Asp Ala Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 gcc acc ctc tac gcc gac ttc tcc cac gac agc aac ctg gtg tcg atc 1104 Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Ser Asn Leu Val Ser Ile 355 360 365 ttc tgg gcg ctg ggc ctg tac aac ggc acc gcg ccg ctg tcg cag acc 1152 Phe Trp Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Pro Leu Ser Gln Thr 370 375 380 tcc gtc gag agc gtc tcc cag acg gac ggg tac gcc gcc gcc tgg acg 1200 Ser Val Glu Ser Val Ser Gln Thr Asp Gly Tyr Ala Ala Ala Trp Thr 385 390 395 400 gtg ccg ttc gcc gct cgc gcg tac gtc gag atg atg cag tgt cgc gcc 1248 Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Arg Ala 405 410 415 gag aag gag ccg ctg gtg cgc gtg ctg gtc aac gac cgg gtc atg ccg 1296 Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Met Pro 420 425 430 ctg cat ggc tgc cct acg gac aag ctg ggg cgg tgc aag cgg gac gct 1344 Leu His Gly Cys Pro Thr Asp Lys Leu Gly Arg Cys Lys Arg Asp Ala 435 440 445 ttc gtc gcg ggg ctg agc ttt gcg cag gcg ggc ggg aac tgg gcg gat 1392 Phe Val Ala Gly Leu Ser Phe Ala Gln Ala Gly Gly Asn Trp Ala Asp 450 455 460 tgt ttc tgatgttgag aagaaaggta gatagatagg tagtacatat ggattgctcg 1448 Cys Phe 465 gctctgggtc gttgcccaca atgcatatta cgcccgtcaa ctgccttgcg ccatccacct 1508 ctcaccctgg acgcaaccga gcggtctacc ctgcacacgg cttccaccgc gacgcgcacg 1568 gataaggcgc ttttgttacg gggttggggc tgggggcagc cggagccgga gagagagacc 1628 agcgtgaaaa acgacagaac atagatatca attcgacgcc aattcatgca gagtagtata 1688 cagacgaact gaaacaaaca catcacttcc ctcgctcctc tcctgtagaa gacgctccca 1748 ccagccgctt ctggccctta ttcccgtacg ctaggtagac cagtcagcca gacgcatgcc 1808 tcacaagaac gggggcgggg gacacactcc gctcgtacag cacccacgac gtgtacagga 1868 aaaccggcag cgccacaatc gtcgagagcc atctgcagga attc 1912 <210> 12 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: chimeric phytase Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ala Gly Val 1 5 10 15 Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp 20 25 30 Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp 35 40 45 Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser 50 55 60 Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Glu Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser 85 90 95 Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Val Thr Thr Phe Asp Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 Gln Arg Tyr Asn Ala Leu Thr Arg His Ile Asn Pro Phe Val Arg Ala 145 150 155 160 Thr Asp Ala Ser Arg Val His Glu Ser Ala Glu Lys Phe Val Glu Gly 165 170 175 Phe Gln Thr Ala Arg Gln Asp Asp His His Ala Asn Pro His Gln Pro 180 185 190 Ser Pro Arg Val Asp Val Ala Ile Pro Glu Gly Ser Ala Tyr Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Glu His Ser Leu Cys Thr Ala Phe Glu Ser Ser Thr Val Gly 210 215 220 Asp Asp Ala Val Ala Asn Phe Thr Ala Val Phe Ala Pro Ala Ile Ala 225 230 235 240 Gln Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Gln Leu Ser Thr Asp Asp 245 250 255 Val Val Asn Leu Met Ala Met Cys Pro Phe Glu Thr Val Ser Leu Thr 260 265 270 Asp Asp Ala His Thr Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr Ala Thr 275 280 285 Glu Trp Thr Gln Tyr Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Asp Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 Tyr Gly Gly Gly Asn Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Trp Ala 305 310 315 320 Asn Glu Leu Met Ala Arg Leu Thr Arg Ala Pro Val His Asp His Thr 325 330 335 Cys Val Asn Asn Thr Leu Asp Ala Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Ser Asn Leu Val Ser Ile 355 360 365 Phe Trp Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Pro Leu Ser Gln Thr 370 375 380 Ser Val Glu Ser Val Ser Gln Thr Asp Gly Tyr Ala Ala Ala Trp Thr 385 390 395 400 Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Arg Ala 405 410 415 Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Met Pro 420 425 430 Leu His Gly Cys Pro Thr Asp Lys Leu Gly Arg Cys Lys Arg Asp Ala 435 440 445 Phe Val Ala Gly Leu Ser Phe Ala Gln Ala Gly Gly Asn Trp Ala Asp 450 455 460 Cys Phe 465 <210> 13 <211> 112 <212> DNA <213> Aspergillus terreus <400> 13 gacggtcagc ctgaccgacg acgcgcacac gctgtcgccg ttctgcgacc tcttcaccgc 60 cgccgagtgg acgcagtaca actacctgct ctcgctggac aagtactacg tc 112 <210> 14 <211> 91 <212> DNA <213> Aspergillus terreus <400> 14 cagtaacctg gtgtcgatct tctggncgct gggtctgtac aacggcacca agcccctgtc 60 gcagaccacc gtggaggata tcacccggac g 91 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 15 atggayatgt gytcnttyga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 16 ttrccrgcrc crtgnccrta 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 17 taygcngayt tytcncayga 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 18 cgrtcrttna cnagnacnc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 19 atggayatgt gytcnttyga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 20 ttrccrgcrc crtgnccrta 20 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artifical Sequence: primer <400> 21 agtccggagg tgactccagc taggagatac 30

【００８１】

【配列表フリーテキスト】配列番号11−人工配列の説
明：キメラフィターゼをコードするＤＮＡ配列番号12−人工配列の説明：キメラフィターゼ配列番号15−人工配列の説明：プライマー配列番号16−人工配列の説明：プライマー配列番号17−人工配列の説明：プライマー配列番号18−人工配列の説明：プライマー配列番号19−人工配列の説明：プライマー配列番号20−人工配列の説明：プライマー配列番号21−人工配列の説明：プライマー

【図面の簡単な説明】

【図１】アスペルギルス・テレウス9A-1株由来のフィタ
ーゼのアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配列
を示す。

【図２】図１に示したアミノ酸配列およびそのコーディ
ングＤＮＡ配列の続きを示す。

【図３】ミセリオフトラ・サーモフィラ由来のフィター
ゼのアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配列を
示す。

【図４】図３に示したアミノ酸配列およびそのコーディ
ングＤＮＡ配列の続きを示す。

【図５】Ａ．アスペルギルス・テレウスのＤＮＡの制限
地図を示す。Ｂ．ミセリオフトラ・サーモフィラのＤＮＡの制限地図
を示す。

【図６】タラロミセス・サーモフィルス由来のフィター
ゼの一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ
配列を示す。

【図７】アスペルギルス・フミガツス由来のフィターゼ
の一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ配
列を示す。

【図８】アスペルギルス・ニードランス由来のフィター
ゼの一部のアミノ酸配列およびそのコーディングＤＮＡ
配列を示す。

【図９】Ａ．ニガーフィターゼとＡ．テレウスフィター
ゼとの融合構築物のアミノ酸配列およびそのコーディン
グＤＮＡ配列を示す。

【図１０】図９に示したアミノ酸配列およびそのコーデ
ィングＤＮＡ配列の続きを示す。

【図１１】図10に示したアミノ酸配列およびそのコーデ
ィングＤＮＡ配列の続きを示す。

【図１２】ベクター pFPAN1 の模式図である。

【図１３】ベクター pPAT1の模式図である。

【図１４】Ａ．アスペルギルス・テレウス CBS 220.95
のフィターゼ遺伝子のＰＣＲ断片(aterr21)とアスペル
ギルス・テレウス 9A1の関連部分 (9a1)との比較を示
す。Ｂ．アスペルギルス・テレウス CBS 220.95 のフィター
ゼ遺伝子のＰＣＲ断片(aterr58)とアスペルギルス・テ
レウス 9A1の関連部分 (9a1)との比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 9/16 ＢＣ１２Ｒ 1:68）Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/16 1:68）Ｃ１２Ｒ 1:685） 1:66） (72)発明者デイヴィッドミッチェルスイス国シーエイチ−4147 アエシュクントマンヴェーク２エイ番地

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フィターゼ活性を有する耐熱性ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、あるいはフィターゼ活性をなお
も有する該ポリペプチドの断片をコードするＤＮＡ、を
得る方法であって、アクロフィアロホラ・レービス (Ac
rophialophora levis)、アスペルギルス・テレウス (As
pergillus terreus)、アスペルギルス・フミガツス (As
pergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニードランス
(Aspergillus nidulans) 、アスペルギルス・ソヤ (As
pergillus sojae)、カルカリスポリエラ・サーモフィラ
(Calcarisporiella thermophila) 、カエトミウム・レ
クトピリウム (Chaetomium rectopilium) 、コリナスク
ス・サーモフィルス (Corynascus thermophilus)、フミ
コラ sp. (Humicola sp.) 、ミセリア・ステリリア (My
celia sterilia) 、ミロコッカム・サーモフィルム (My
rococcum thermophilum)、ミセリオフトラ・サーモフィ
ラ (Myceliophthora thermophila) 、リゾムコール・ミ
エヘイ (Rhizomucor miehei)、スポロトリクム・セルロ
フィルム (Sporotrichum cellulophilum)、スポロトリ
クム・サーモフィレ (Sporotrichum thermophile) 、ス
キタリジウム・インドネシクム (Scytalidium indonesi
cum)およびタラロミセス・サーモフィルス (Talaromyce
s thermophilus) より成る群から選ばれる耐熱性真菌由
来のＤＮＡまたはその断片を、（i）ミセリオフトラ・
サーモフィラ (Mycelio. Thermo.)；アスペルギルス・
ニードランス (Asperg. Nidul.)；アスペルギルス・フ
ミガツス (Asperg. Fumig.)；アスペルギルス・テレウ
ス9A1 (Asperg. Terreus 9A1)；もしくはタラロミセス
・サーモフィルス (Talarom. Thermo.)のゲノムＤＮＡ
を用いて次のプライマー：センスプライマーとしての
“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”およびアンチ
センスプライマーとしての“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC
(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”により生成されたＰＣＲ産物、
(ii) ミセリオフトラ・サーモフィラ (Mycelio. Therm
o.)フィターゼ遺伝子のＮ末端の上流のBspEI部位からＣ
末端のPvuII部位までの1410bp（明細書記載の図３−図
４の2068-3478位）にわたるプローブ、（iii）アスペル
ギルス・テレウス9A1 (Asperg. Terreus 9A1)フィター
ゼ遺伝子のApaI部位からNdeI部位までの1365bp（明細書
記載の図１−図２の491-1856位）にわたるプローブ、ま
たは、(iv) アスペルギルス・テレウス (CBS 220.95)
から単離されたＤＮＡおよび次の２つのＰＣＲプライマ
ー対：(a) センスプライマーとしての“ATGGA(C/T)ATGT
G(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”およびアンチセンスプライマー
としての“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)
TA”、ならびに、(b) センスプライマーとしての“TA(C
/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA”およびアンチ
センスプライマーとしての“CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)
AG(N)AC(N)C ”を用いるＰＣＲ反応の産物であるプロー
ブ、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさ
せ、ハイブリダイズするＤＮＡまたはその断片を得、必
要に応じてＤＮＡクローニングまたはポリメラーゼ連鎖
反応により該ＤＮＡまたはその断片を増幅することを含
む、上記方法。
【請求項２】真菌がアクロフィアロホラ・レービス、
アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニード
ランス、アスペルギルス・テレウス、カルカリスポリエ
ラ・サーモフィラ、カエトミウム・レクトピリウム、コ
リナスクス・サーモフィルス、スポロトリクム・セルロ
フィルム、スポロトリクム・サーモフィレ、ミセリア・
ステリリア、ミセリオフトラ・サーモフィラおよびタラ
ロミセス・サーモフィルスより成る群から選ばれる、請
求項１に記載の方法。
【請求項３】真菌がアスペルギルス・テレウス、ミセ
リオフトラ・サーモフィラ、アスペルギルス・フミガツ
ス、アスペルギルス・ニードランスおよびタラロミセス
・サーモフィルスより成る群から選ばれる、請求項２に
記載の方法。
【請求項４】前記のフィターゼ活性を有する耐熱性ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、あるいはフィターゼ活
性をなおも有する該ポリペプチドの断片をコードするＤ
ＮＡが、(a) 明細書記載の図１および２のＤＮＡまたは
その相補鎖、(b) ストリンジェントな条件下で(a) に規
定した配列とハイブリダイズするＤＮＡ、(c) 遺伝暗号
の縮重のため(a) または(b) のＤＮＡとハイブリダイズ
しないが、これらのＤＮＡによってコードされるポリペ
プチドと正確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、および(d) (a) 、(b) または(c)
に規定したＤＮＡの断片であるＤＮＡ、より成る群から
選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記のフィターゼ活性を有する耐熱性ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、あるいはフィターゼ活
性をなおも有する該ポリペプチドの断片をコードするＤ
ＮＡが、(a) 明細書記載の図３および４のＤＮＡまたは
その相補鎖、(b) ストリンジェントな条件下で(a) に規
定した配列とハイブリダイズするＤＮＡ、(c) 遺伝暗号
の縮重のため(a) または(b) のＤＮＡとハイブリダイズ
しないが、これらのＤＮＡによってコードされるポリペ
プチドと正確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、および(d) (a) 、(b) または(c)
に規定したＤＮＡの断片であるＤＮＡ、より成る群から
選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記のフィターゼ活性を有する耐熱性ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、あるいはフィターゼ活
性をなおも有する該ポリペプチドの断片をコードするＤ
ＮＡが、(a) 明細書記載の図６、図７、図８および図１
４のＤＮＡ配列のうちの１つを含むＤＮＡまたはその相
補鎖、(b) ストリンジェントな条件下で(a) に規定した
配列とハイブリダイズするＤＮＡ、(c) 遺伝暗号の縮重
のため(a) または(b) のＤＮＡとハイブリダイズしない
が、これらのＤＮＡによってコードされるポリペプチド
と正確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、および(d) (a) 、(b) または(c) に規定
したＤＮＡの断片であるＤＮＡ、より成る群から選ばれ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記のフィターゼ活性を有する耐熱性ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、あるいはフィターゼ活
性をなおも有する該ポリペプチドの断片をコードするＤ
ＮＡが、タラロミセス・サーモフィルスから単離可能な
明細書記載の図６のＤＮＡ配列、アスペルギルス・フミ
ガツスから単離可能な明細書記載の図７のＤＮＡ配列、
アスペルギルス・ニードランスから単離可能な明細書記
載の図８のＤＮＡ配列、およびアスペルギルス・テレウ
ス (CBS 220.95) から単離可能な明細書記載の図１４の
ＤＮＡ配列を含むＤＮＡより成る群から選ばれる、請求
項１に記載の方法。
【請求項８】前記ハイブリダイゼーションにおいて、
前記の単離された真菌ＤＮＡおよび次のＰＣＲプライマ
ー対：センスプライマーとしての“ATGGA(C/T)ATGTG(C/
T)TC(N)TT(C/T)GA” およびアンチセンスプライマーと
しての“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)T
A”を用いるＰＣＲ反応の産物であるプローブをさらに
使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記の異なる耐熱性真菌に由来するフィ
ターゼ活性を有するポリペプチドをコードする複数のＤ
ＮＡの断片を結合して、フィターゼ活性を有するキメラ
構築物をコードするＤＮＡを得ることをさらに含む、請
求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記キメラ構築物が、アスペルギルス
・ニガー (Aspergillus niger)フィターゼの断片をその
Ｎ末端でアスペルギルス・テレウスフィターゼの断片の
Ｃ末端に融合させたものであり、かつ、明細書記載の図
９、１０および１１に示した特定のヌクレオチド配列を
有するものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記ハイブリダイゼーションを0．1％
ＳＤＳ含有の0.1×ＳＳＰＥ中、室温で30分行い、つい
で、洗浄を0．1％ＳＤＳ含有の0.1×ＳＳＰＥ中、65℃
で30分行う、請求項1〜１０のいずれか１項に記載の方
法。