BR112021014873A2

BR112021014873A2 - Polipeptídeo, combinação de enzimas, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, e, processo de produção de um produto de fermentação

Info

Publication number: BR112021014873A2
Application number: BR112021014873-6A
Authority: BR
Inventors: Jesper Frickmann; Kenneth Jensen; Elena Vlasenko
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2021-10-05
Also published as: WO2020160126A1; CN113302294A; EP3918060A1

Abstract

polipeptídeo, combinação de enzimas, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, e, processo de produção de um produto de fermentação. a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de xilanase e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. a invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos. a invenção se relaciona adicionalmente com um processo de uso dos polipeptídeos tendo atividade de xilanase em um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (dgs) ou grãos secos destilados com solúveis (ddgs) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, um processo para produção de produtos de fermentação, bem como o uso de combinações de enzimas compreendendo os polipeptídeos tendo atividade de xilanase nos processos.

Description

1 / 169 POLIPEPTÍDEO, COMBINAÇÃO DE ENZIMAS, POLINUCLEOTÍDEO,

CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, E, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

ÁREA DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de xilanase e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. A invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos. A invenção se relaciona adicionalmente com um processo de uso dos polipeptídeos tendo atividade de xilanase em um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, um processo para produção de produtos de fermentação, bem como o uso de combinações de enzimas compreendendo os polipeptídeos tendo atividade de xilanase nos processos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Processos para produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de um material contendo amido ou

[004] lignocelulose são bem conhecidos na técnica. A preparação do material contendo amido tal como milho para utilização em tais processos de fermentação começa tipicamente com trituração do milho em um processo de moagem a seco ou moagem a úmido. Os processos de moagem a úmido envolvem fracionamento do milho em diferentes componentes onde somente

2 / 169 a fração de amido entra no processo de fermentação. Os processos de trituração a seco envolvem trituração dos grãos de milho em farinha e mistura da farinha com água e enzimas. Geralmente são usados dois tipos diferentes de processos de trituração a seco. O processo o mais comummente usado, frequentemente referido como um “processo convencional”, inclui trituração do material contendo amido e depois liquefação de amido gelatinizado a uma elevada temperatura usando tipicamente uma alfa-amilase bacteriana, seguida por sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) levadas a cabo na presença de uma glucoamilase e um organismo de fermentação. Outro processo bem conhecido, frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto” (processo de RSH), inclui trituração do material contendo amido e depois sacarificação e fermentação simultâneas de amido granular abaixo da temperatura de gelatinização inicial tipicamente na presença de uma alfa- amilase fúngica ácida e uma glucoamilase.

[005] Em um processo para produção de etanol a partir de milho, após SFF ou o processo de RSH, os produtos de fermentação líquidos são recuperados a partir do purê fermentado (frequentemente referido como “purê de cerveja”), p. ex., por destilação, que separa o produto de fermentação desejado, p. ex., etanol, a partir de outros líquidos e/ou sólidos. A fração restante é referida como “vinhaça completa”. A vinhaça completa contém tipicamente cerca de 10 a 20% de sólidos. A vinhaça completa é separada em uma fração sólida e uma líquida, p. ex., por centrifugação. A fração sólida separada é referida como “bolo úmido” (ou “grãos úmidos”) e a fração líquida separada é referida como “vinhaça fina”. O bolo úmido e a vinhaça fina contêm cerca de 35 e 7% de sólidos, respectivamente. O bolo úmido, com desidratação adicional opcional, é usado como um componente em ração animal ou é seco para proporcionar “Grãos Secos Destilados” (DDG) usados como um componente em ração animal. A vinhaça fina é tipicamente evaporada para proporcionar condensado do evaporador e xarope ou pode ser

3 / 169 alternativamente reciclada para o tanque de pasta semifluida como “contrafluxo”. O condensado do evaporador pode ser direcionado para um metanador antes de ser descarregado e/ou pode ser reciclado para o tanque de pasta semifluida como “água de cozimento”. O xarope pode ser combinado em DDG ou adicionado ao bolo úmido antes do ou durante o processo de secagem, que pode compreender um ou mais secadores em sequência, para produzir DDGS (Grão Seco Destilado com Solúveis). O xarope contém tipicamente cerca de 25% a 35% de sólidos. O óleo pode ser também extraído a partir da vinhaça fina e/ou xarope como um subproduto para uso na produção de biocombustível, como um aditivo ou produto de ração ou alimentar ou outros produtos biorrenováveis.

[006] Os grãos destilados com solúveis (DGS) e os grãos secos destilados com solúveis (DDGS) são coprodutos da indústria de grãos até etanol, que são usados para ração animal. DGS e DDGS são ricos em fibras e, portanto, a mais elevada taxa de inclusão viável para animais monogástricos, tais como, p. ex., aves domésticas e suínos, é menor do que para ruminantes tais como, p. ex. gado. Enzimas glicoidrolases, tais como, p. ex., endoxilanase, são adicionadas a combinações de ração para aumentar a digestibilidade de combinações de ração ricas em fibras. No entanto existem alguns desafios relacionados com a ação de enzimas adicionadas a combinações de ração; p. ex., mistura homogênea das enzimas na combinação de ração, estabilidade ao calor da proteína enzimática durante a peletização da ração, estabilidade da proteína enzimática durante a passagem gástrica a baixo pH e tempo de residência relativamente curto nos intestinos de algumas espécies animais

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção ultrapassa os desafios acima por adição de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase presentemente divulgado ou uma combinação de enzimas compreendendo o polipeptídeo tendo atividade

4 / 169 de xilanase e/ou composição celulolítica a montante durante o processo de produção de produtos de fermentação, por exemplo durante o passo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), onde existe mistura contínua de uma pasta semifluida de fluxo livre, a temperatura é estável (p. ex., entre 30 e 35ºC), o pH é estável (p. ex., entre cerca de pH 4 e pH 5) e o tempo de residência está tipicamente na gama de 54 a 80 horas.

[008] A presente invenção se relaciona mais particularmente com a adição de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase presentemente divulgado ou combinação de enzimas compreendendo o polipeptídeo tendo atividade de xilanase durante o processo SSF para produzir um produto de DDGS, ou produto de DGS, com digestibilidade mais elevada para animais (p. ex., animais monogástricos). Sem desejar estar limitado à teoria se acredita que, quando a fibra (p. ex., milho) é solubilizada, o aprisionamento de nutrientes tais como proteínas, óleo e amido residual é reduzido, tornando assim estes nutrientes mais acessíveis, e a fibra solubilizada pode ser fermentada pelo microbioma intestinal até produtos metabolizáveis tais como ácidos graxos. Além disso é possível que a fibra solubilizada tenha um efeito positivo na saúde intestinal por atuação como um substrato para flora intestinal benéfica.

[009] Os polipeptídeos tendo atividade de xilanase presentemente divulgados são membros da família G98 (referidos aqui coletivamente como “xilanase(s) GH98”). As xilanases GH98 são conhecidas por produzirem oligossacarídeos maiores em comparação com as xilanases GH30 (Rogowski et al. 2015). Se acredita que o perfil de oligossacarídeos maiores pode ter um efeito positivo na saúde intestinal, valor da ração e na cor de DDGS (p. ex., devido à formação diminuída de caramelização e produtos de Maillard durante a secagem).

[0010] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de xilanase selecionado do grupo

5 / 169 consistindo em:

[0011] um polipeptídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, 5 ou 7;

[0012] um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência muito elevada com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, 6 ou 8 ou (ii) o complemento de comprimento completo de (i) ou (ii);

[0013] um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, 6 ou 8; e

[0014] um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de xilanase.

[0015] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico; vetores de expressão recombinantes; células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção dos polipeptídeos.

[0016] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com uma xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo uma xilanase GH98. Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende adicionalmente uma composição celulolítica. Em uma modalidade, a composição celulolítica está presente na combinação, a razão da xilanase e

6 / 169 composição celulolítica é de cerca de 5:95 a cerca de 95:5. Em uma modalidade, a razão da xilanase e da composição celulolítica na combinação é cerca de 10:90. Em uma modalidade, a razão da xilanase e da composição celulolítica na combinação é cerca de 20:80. Em uma modalidade, a razão da xilanase e da composição celulolítica na combinação é cerca de 50:50.

[0017] Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% de xilanase. Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende pelo menos 5%, pelo menos 10% de xilanase, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de composição celulolítica.

[0018] Em uma modalidade, a xilanase é do gênero Microbacterium ou Paenibacillus. Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH98 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Microbacterium oxydans de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela; (ii) a Paenibacillus glycanilyticus de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

7 / 169 menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela; e (iii) a xilanase de Paenibacillus terrigena de SEQ ID NO: 7 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela.

[0019] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica.

[0020] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[0021] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a

8 / 169 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta- glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e/ou (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[0022] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; e (ii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo

9 / 169 menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 16.

[0023] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[0024] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe selecionada do grupo consistindo em Aspergillus, Penicilium, Talaromyces e Trichoderma, opcionalmente em que: (i) a estirpe de Aspergillus é selecionada do grupo consistindo em Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae; (ii) a estirpe de Penicilium é selecionada do grupo consistindo em Penicilium emersonii e Penicilium oxalicum; (iii) a estirpe de Talaromyces é selecionada do grupo consistindo em Talaromyces aurantiacus e Talaromyces emersonii; e (iv) a estirpe de Trichoderma é Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei.

[0025] Em um outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de fermentação, compreendendo aos seguintes passos: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial com uma alfa- amilase, uma glucoamilase e uma xilanase GH98 ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase GH98; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação.

[0026] Em um outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) com uma glucoamilase e uma xilanase GH98 da presente invenção ou uma combinação ou composição de enzimas

10 / 169 compreendendo a xilanase GH98; e (c) fermentação usando um organismo fermentador.

[0027] Em uma modalidade, a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente. Em uma modalidade, o material contendo amido compreende milho, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, switchgrass, milheto, milheto-pérola, painço. Em uma modalidade, o produto de fermentação é álcool, particularmente etanol. Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura, particularmente Saccharomyces sp., mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[0028] Em um outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, compreendendo o processo realização de um processo para produção de um produto de fermentação da presente invenção e recuperação do produto de fermentação para produzir DGS ou DDGS como um coproduto, em que os DGS ou DDGS produzidos têm qualidade nutricional melhorada.

[0029] Em uma modalidade, a energia metabolizável verdadeira dos DGS ou DDGS é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%, em comparação com a TME de DGS ou DDGS produzidos quando uma xilanase GH98 da presente invenção ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase GH98 não está presente durante o asso de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo para produção de um produto de fermentação da presente invenção.

[0030] Em uma modalidade, o animal é um animal monogástrico.

[0031] Em uma modalidade, os DGS ou DDGS produzidos não são escurecidos após secagem em comparação com DGS ou DDGS produzidos quando uma xilanase GH98 da presente invenção ou uma combinação ou

11 / 169 composição de enzimas compreendendo a xilanase GH98 não está presente durante o passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo da presente invenção.

[0032] Em um outro aspecto, a presente invenção se relaciona com o uso de uma xilanase GH98 da presente invenção ou uma combinação ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98 para melhoria da qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

[0033] Em um outro aspecto, a presente invenção se relaciona com o uso de uma xilanase GH98 da presente invenção ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase GH98 para solubilização de fibras, preferencialmente para solubilização de xilose e arabinose.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] A FIG. 1 mostra o rendimento médio de DP4+ (g/L) para cada uma das combinações de enzimas GH98 em comparação com a composição celulolítica de controle não suplementada com xilanase.

[0035] A FIG. 2 mostra o rendimento médio de glucose (g/L) para cada uma das combinações de enzimas GH98 em comparação com a composição celulolítica de controle não suplementada com xilanase.

VISÃO GLOBAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0036] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase GH98 de Microbacterium oxydans.

[0037] SEQ ID NO: 2 é a sequência de polinucleotídeos codificando a xilanase GH98 de SEQ ID NO: 1.

[0038] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase GH98 de Microbacterium hydrocarbonoxydans.

[0039] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase

12 / 169 GH98 de Microbacterium sp. SA39.

[0040] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase GH98 de Paenibacillus glycanilyticus.

[0041] SEQ ID NO: 6 é a sequência de polinucleotídeos codificando a xilanase GH98 de SEQ ID NO: 5.

[0042] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH98 madura de Paenibacillus terrigena.

[0043] SEQ ID NO: 8 é a sequência de polinucleotídeos codificando a xilanase GH98 de SEQ ID NO: 7.

[0044] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase GH98 de Paenibacillus terrigena.

[0045] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos da GH98 xilanase madura de Paenibacillus sp. DMB20.

[0046] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos da glucoamilase de Talaromyces emersonii.

[0047] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos da glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium.

[0048] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum.

[0049] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger tendo as seguintes substituições G128D+D143N.

[0050] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos da celobioidrolase I de comprimento completo de Aspergillus fumigatus.

[0051] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos da celobioidrolase II de comprimento completo de Aspergillus fumigatus.

[0052] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos da beta- galactosidase de comprimento completo de Aspergillus fumigatus.

13 / 169

[0053] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo GH61 de comprimento completo de Penicillium emersonii.

[0054] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de comprimento completo de Bacillus stearothermophilus.

[0055] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento completo de Dictyogllomus thermophilum.

[0056] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH11 de comprimento completo de Dictyogllomus thermophilum.

[0057] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento completo de Rasomsonia byssochlamydoides.

[0058] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento completo de Talaromyces leycettanus.

[0059] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento completo de Aspergillus fumigatus.

[0060] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase de comprimento completo de Talaromyces leycettanus.

[0061] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase de comprimento completo de Penicillium capsulatum.

[0062] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase de comprimento completo de Trichophaea saccata.

[0063] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase GH45 de comprimento completo de Sordaria fimicola.

[0064] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase GH45 de comprimento completo de Thielavia terrestris.

[0065] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos da glucoamilase de comprimento completo de Penicillium oxalicum.

[0066] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos da protease de comprimento completo de Pyrococcus furiosus.

[0067] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos da protease de

14 / 169 comprimento completo de Thermoascus aurantiacus.

[0068] SEQ ID NO: 33 é a sequência de polinucleotídeos com otimização de códons xilanase GH98 de Microbacterium oxydans.

[0069] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos do sinal de secreção de Bacillus clausii.

[0070] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos da cauda de poli-histidina.

DEFINIÇÕES

[0071] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações gênicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0072] As Alfa-Amilases (alfa-1,4-glucana-4-glucanoidrolases, EC

3.2.1.1) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados.

[0073] Animal: O termo “animal” se refere a todos os animais exceto humanos. Exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes. Os animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras, gado, p. ex., gado de corte, vacas e bezerros, cervo, iaque, camelo, lhama e canguru. Os animais não ruminantes incluem animais monogástricos, p. ex., porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em fase de crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas não se limitando a frangos de corte, galinhas poedeiras); cavalos (incluindo mas não se limitando a de sangue quente, de sangue frio e sangues mistos), bezerros jovens; peixe (incluindo mas não se limitando a

15 / 169 charuteiro, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bocachico, goraz, peixe-gato, cachama, carpa, peixe-lobo, catla, chanos, savelino, ciclídeo, fogueteiro- galego, bacalhau, perca, dourado, calafate, enguia, caboz, peixe-dourado, gurami, garoupa, guapote, alabote, jamelão, labeo, lai, verdemã, cavalinha, peixe-leite, sargo, mudfish, tainha, pacu, pearlspot, peixe-rei, robalo, lúcio, pâmpano, ruivaca, salmão, sampa, picão, robalo-legítimo, panga, shiner, sleeper, cabeça-de-cobra, lutjanídeo, falso robalo, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, sweetfish, tenca, terror, tilápia, truta, atum, areeiro, corégono-branco, picão-verde e peixe-magro); e crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e pitus).

[0074] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequado para a, ou destinado à, ingestão por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, micróbio de alimentação direta, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (tal como em uma pré-mistura) ao passo que a ração animal para ruminantes compreende geralmente forragem (incluindo alimento grosseiro e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, micróbio de alimentação direta, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (tal como em uma pré-mistura).

[0075] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glucose não redutores terminais com a liberação de beta- D-glucose.

[0076] Para propósitos da presente invenção, a atividade de beta- glucosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol.

16 / 169 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 µmole de ânion de p-nitrofenolato produzida por minuto a 25 ºC, pH 4,8 a partir de p- nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo TWEEN® 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitana) a 0,01%.

[0077] Ganho de Peso Corporal: O termo “ganho de peso corporal” significa um aumento no peso vivo de um animal durante um dado período de tempo, p. ex., o aumento no peso do dia 1 ao dia 21.

[0078] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA carece de sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro.

[0079] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glucana celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glucose ligada em beta-1,4, liberando celobiose a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178).

[0080] A atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273- 279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al.

17 / 169 pode ser usado para se determinar a atividade de celobioidrolase.

[0081] Enzima celulolítica, composição celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica”, “composição celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (p. ex., várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta- glucosidase(s) ou suas combinações. As duas abordagens básicas para medição da atividade celulolítica incluem: (1) medição da atividade celulolítica total e (2) medição das atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é usualmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman No 1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum de atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman No 1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[0082] A atividade de enzimas celulolíticas é determinada por medição do aumento na hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulose em Palha de Milho Pré-Tratada (“PCS”) (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3-7 dias a uma temperatura adequada, p. ex., 50 ºC, 55 ºC ou 60 ºC, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína enzimática celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5%, acetato de sódio a 50 mM pH 5, MnSO4 a 1 mM, 50ºC, 55ºC ou 60ºC, 72 horas, análise de açúcares por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

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[0083] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0084] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) do ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró- peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0085] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como celulose de carboximetila e celulose de hidroxietila), liquenina, ligações beta-1,4 em glucanas beta-1,3 mistas tais como beta-D-glucanas ou xiloglucanas de cereais e outro material vegetal contendo componentes celulósicos.

[0086] A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades

19 / 169 redutoras determinado por um teste de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando celulose de carboximetila (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40ºC.

[0087] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

[0088] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão.

[0089] Glicosídeo hidrolase da família 61: O termo “glicosídeo hidrolase da Família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo da Família 61 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas desta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolases com base na medição de atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um membro da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas não são canônicos e não podem ser consideradas glicosidases verdadeiras. No entanto são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de intensificar a degradação de lignocelulose quando usadas em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[0090] Razão de Conversão de Ração: O termo “razão de conversão de ração” significa a quantidade de ração alimentada a um animal para

20 / 169 aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada. Uma razão de conversão de ração melhorada significa uma razão de conversão de ração mais baixa. Por “razão de conversão de ração mais baixa” ou “razão de conversão de ração melhorada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração em ração resulta em uma quantidade mais baixa de ração sendo requerida para ser alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração requerida para aumentar o peso do animal na mesma quantidade quando a ração não compreende a referida composição de aditivo de ração.

[0091] Eficiência alimentar: O termo “eficiência alimentar” significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado ad libitum ou com uma quantidade específica de alimento durante um período de tempo. Por “eficiência de ração aumentada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de consumo de ração em comparação com um animal alimentado sem a referida composição de aditivo de ração estando presente.

[0092] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (p. ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro principal; em que o fragmento tem atividade de enzima. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 85%, p. ex., pelo menos 90% ou pelo menos 95% dos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de uma enzima.

[0093] As glucoamilases (glucana 1,4-alfa-glucosidase, EC 3.2.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de resíduos de alfa-D- glucose ligados a terminal (1→4) sucessivamente de extremidades não redutoras das cadeias com liberação de beta-D-glucose.

[0094] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou

21 / 169 “hemicelulase” significa uma ou mais (p. ex., várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Microbial hemicellulases, Current

[0095] Opinion In Microbiology 6 (3): 219-228. As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloila esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoila esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, as reticulando em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas à lignina, formando em conjunto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização das hemiceluloses requerem a ação concertada de muitas enzimas para sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GH) que hidrolisam ligações glicosídicas ou carboidrato esterases (CE), que hidrolisam ligações de éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser atribuídos a famílias GH e CE marcadas por números. Algumas famílias, com dobragem similar global, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (p. ex., GH-A). Uma classificação informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzima hemicelulolítica podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem 59: 1739-1752, a uma temperatura adequada, p. ex.,

22 / 169 50ºC, 55ºC ou 60ºC.

[0096] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0097] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que está pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p. ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0098] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[0099] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Microbacterium oxydans é os aminoácidos 33 a 884 de SEQ ID NO: 1 e os aminoácidos 1 a 32 de SEQ ID NO: 1 são um peptídeo-sinal. Em um aspecto,

23 / 169 o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Microbacterium hydrocarbonoxydans é os aminoácidos 35 a 890 de SEQ ID NO: 3 e os aminoácidos 1 a 34 de SEQ ID NO: 3 são um peptídeo-sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Microbacterium sp. SA39 é os aminoácidos 35 a 890 de SEQ ID NO: 4 e os aminoácidos 1 a 34 de SEQ ID NO: 4 são um peptídeo-sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Paenibacillus glycanilyticus é os aminoácidos 31 a 826 de SEQ ID NO: 5 e os aminoácidos 1 a 30 de SEQ ID NO: 5 são um peptídeo-sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Paenibacillus terrigena é os aminoácidos 35 a 831 de SEQ ID NO: 7 e os aminoácidos 1 a 34 de SEQ ID NO: 7 são um peptídeo-sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Paenibacillus terrigena é os aminoácidos 35 a 831 de SEQ ID NO: 9 e os aminoácidos 1 a 34 de SEQ ID NO: 9 são um peptídeo-sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma xilanase de Paenibacillus sp. DMB20 é os aminoácidos 1 a 794 de SEQ ID NO: 10. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma celobioidrolase I de A. fumigatus é os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 e os aminoácidos 1 a 26 de SEQ ID NO: 15 são um peptídeo-sinal. Em um outro aspecto, o polipeptídeo maduro de uma celobioidrolase II de A. fumigatus é os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 e os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 16 são um peptídeo-sinal. Em um outro aspeto, o polipeptídeo maduro de uma beta- glucosidase de A. fumigatus é os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 e os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 17 são um peptídeo-sinal. Em um outro aspecto, o polipeptídeo maduro de um polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. é os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 e os aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO: 18 são um peptídeo-sinal.

[00100] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo

24 / 169 mesmo polinucleotídeo. Também é conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (p. ex., tendo um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com uma outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[00101] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro.

[00102] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[00103] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada a partir de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintético, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[00104] Digestibilidade de Nutrientes: O termo “digestibilidade de nutrientes” significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou um segmento especificado do trato gastrointestinal, p. ex., o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao sujeito e o que sai nas fezes no sujeito ou entre o que é administrado ao sujeito e o que permanece no digerido em um segmento especificado do trato gastrointestinal, p. ex., o íleo.

[00105] A digestibilidade de nutrientes como usada aqui pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excreções durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não é absorvido pelo animal e permite que o investigador calcule a quantidade de nutriente que desapareceu no trato

25 / 169 gastrointestinal inteiro ou um segmento do trato gastrointestinal. Um tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma percentagem do nutriente na ração ou como unidades de massa de nutriente digestível por unidades de massa de nutriente na ração. A digestibilidade de nutrientes como usada aqui engloba digestibilidade de amido, digestibilidade de gorduras, digestibilidade de proteínas e digestibilidade de aminoácidos.

[00106] Digestibilidade de energia como usada aqui significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta do digerido restante em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, p. ex., o íleo.

[00107] A energia metabolizável como usada aqui se refere à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e a energia metabolizável podem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou o digerido presente em segmento especificado do trato gastrointestinal usando os mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções apropriadas quanto à excreção de nitrogênio para se calcular a energia metabolizável da ração.

[00108] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[00109] Percentagem de xilana solubilizada: O termo “percentagem de xilana solubilizada” significa a quantidade de xilose medida no sobrenadante após incubação com uma enzima em comparação com a quantidade total de xilose presente no substrato antes da incubação com a

26 / 169 enzima. Para o propósito da presente invenção, a percentagem de xilana solubilizada pode ser calculada usando milho desamidado desengordurado (DFDSM) como substrato. O DFDSM é preparado de acordo com “Preparação de Milho Desamidado Desengordurado (DFDSM)” na seção experimental.

[00110] A percentagem de xilana solubilizada do milho desamidado desengordurado (DFDSM) pode ser determinada usando as condições de reação 20 µg de enzima/g de DFDSM e incubação a 40ºC, pH 5 durante 2,5 horas como descrito no “Ensaio de solubilização de xilose” aqui. Assim, o termo “é realizado sob condições de reação 20 µg de variante de xilanase por grama de milho desamidado desengordurado (DFDSM) e incubação a 40ºC, pH 5 durante 2,5 horas” é para ser entendido que a percentagem de xilana solubilizada é calculada como descrito no “Ensaio de solubilização de xilose” aqui.

[00111] Em uma modalidade mais detalhada, a suspensão de DFDSM a 2% (p/p) foi preparada em acetato de sódio a 100 mM, CaCl2 a 5 mM, pH 5 e deixada a hidratar durante 30 min à temperatura ambiente sob agitação suave. Após hidratação, 200 µL de suspensão de substrato foram pipetados em uma placa com 96 poços e misturados com 20 µL de solução de enzima para se obter uma concentração de enzima final de 20 PPM em relação ao substrato (20 µg de enzima/g de substrato). As misturas enzima/substrato foram deixadas para hidrólise em 2,5 h a 40ºC sob agitação suave (500 RPM) em uma incubadora de placas. Após hidrólise enzimática, as placas de enzima/substrato foram centrifugadas durante 10 min a 3000 RPM e 50 µL de sobrenadante foram misturados com 100 µL de HCl a 1,6 M e transferidos para tubos de PCR de 300 µL e deixados para hidrólise ácida durante 40 min a 90ºC em uma máquina de PCR. As amostras foram neutralizadas com 125 µL de NaOH a 1,4 M após hidrólise ácida e carregadas no HPAE-PAD para análise de monossacarídeos.

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[00112] Polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica: O termo “polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a intensificação da hidrólise de um material celulósico por enzima tendo atividade celulolítica. Para propósitos da presente invenção, a atividade intensificadora celulolítica é determinada por medição do aumento nos açúcares redutores ou pelo aumento do total de celobiose e glucose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida por proteína enzimática celulolítica a 50-99,5% p/p e proteína de um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica a 0,5-50% p/p durante 1-7 dias a uma temperatura adequada, p. ex., 50ºC, 55ºC ou 60ºC, e pH, p. ex., 5,0 ou 5,5, em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade intensificadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto, uma mistura de CELLUCLAST 1.5L (Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) na presença de 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carga de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[00113] O polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora intensifica a hidrólise de um material celulósico catalisada por enzima tendo atividade celulolítica por redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, p. ex., pelo menos 1,05 vezes, pelo menos 1,10 vezes, pelo menos 1,25 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo

28 / 169 menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[00114] Identidade de Sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[00115] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), p. ex., versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[00116] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[00117] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), p. ex., versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[00118] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do

29 / 169 Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[00119] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de enzima ou atividade intensificadora de enzima compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição.

[00120] Xilanase de tipo selvagem: O termo xilanase de “tipo selvagem” significa uma xilanase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza.

[00121] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma glucuronoarabinoxilana endo-1,4-beta-xilanase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2 por cento como substrato em TRITON® X-100 a 0,01 por cento e tampão de fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37 graus centígrados ou AZCL-xilana a 0,2 por cento como substrato em TRITON® X- 100 a 0,01 por cento e tampão de acetato de sódio a 20 mM pH 5,0 a 50 graus centígrados (ver Exemplo 17). Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 micromole de azurina produzida por minuto a 37 graus centígrados, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2 por cento como substrato em fosfato de sódio a 200 mM pH 6 ou a 50 graus centígrados, pH 5 a partir de AZCL-xilana a 0,2 por cento como substrato em acetato de sódio a 20 mM pH 5. Alternativamente, a atividade de xilanase pode ser determinada de acordo com o ensaio descrito na seção Materiais & Métodos.

CONVENÇÕES PARA DESIGNAÇÃO DE VARIANTES

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[00122] Para propósitos da presente invenção, qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 3-5, 7 ou 9-10 pode ser usada para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em uma outra xilanase. A sequência de aminoácidos de uma outra xilanase é alinhada com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 3-5, 7 ou 9-10 e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido em SEQ ID NOs: 1, 3-5, 7 ou 9-10 é determinado usando o algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), p. ex., versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[00123] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em uma outra xilanase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1794), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[00124] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 3-5, 7 ou 9-10 tal que a comparação tradicional à

31 / 169 base de sequências falhe em detectar sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequências par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa com base em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estruturas de proteínas. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por seu turno ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[00125] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteínas podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Bourne,

32 / 169 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a se descobrirem possíveis homólogos estruturais (p. ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566- 567).

[00126] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC aceite.

[00127] Substituições. Para uma substituição de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. As mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p. ex., “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[00128] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. As deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p. ex., “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[00129] Inserções. Para uma inserção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Conformemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após a glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

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[00130] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria assim: Progenitor: Variante: 195 195 195a 195b G G - K - A

[00131] Alterações múltiplas. As variantes compreendendo alterações múltiplas são separadas por um sinal de mais (“+”), p. ex., “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[00132] Alterações diferentes. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, p. ex., “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes:

[00133] "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", e "Tyr167Ala+Arg170Ala".

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00134] A presente invenção se relaciona com novas xilanases GH98, combinações ou composições de enzimas compreendendo as novas xilanases GH98 e o seu uso em um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DDG) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, um processo para produção de produtos de fermentação e para solubilização de fibra, preferencialmente para solubilização de xilose e arabinose.

[00135] O DDGS é tipicamente alimentado a gado porque o elevado teor de fibra limita o valor nutricional para animais monogástricos (p. ex.,

34 / 169 aves domésticas e suínos). Assim existe uma necessidade de uma solução que melhore especificamente o valor nutricional de DDGS para animais monogástricos. Por solubilização de parte da fibra, o valor nutricional para animais monogástricos pode ser aumentado. Um modo de solubilizar fibra é por adição de enzimas à combinação de ração, no entanto, o tempo de residência mais curto e condições in vivo menos do que ideais limitam a eficácia de enzimas adicionadas à ração.

[00136] O trabalho descrito aqui demonstra que a adição de uma xilanase GH98 presentemente divulgada ou uma combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98 a montante durante o processo de produção de produtos de fermentação (p. ex., durante a sacarificação e fermentação simultâneas) aumenta significativamente o grau de solubilização de fibras. Inesperadamente, como um benefício adicionado, a xilanase GH98 presentemente adicionada e combinações ou composições de enzimas compreendendo a xilanase GH98 aumentam o grau de solubilização de fibras sem resultar no escurecimento de DDGS durante o processo de secagem. Polipeptídeos Tendo Atividade de Xilanase

[00137] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID

35 / 169 NO: 1.

[00138] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[00139] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[00140] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro

36 / 169 de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00141] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[00142] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo

37 / 169 menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00143] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[00144] Os polinucleótidos de SEQ ID NO: 2, ou suas subsequências, bem como os polipeptídeos de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento, podem ser usados para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de protease a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p. ex., pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p. ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700

38 / 169 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por 32 exemplo, com P, 3H, 35 S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00145] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. Para identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 2, ou suas subsequências, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[00146] Para propósitos da presente invenção, a hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 2; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (iii) ao seu complemento de comprimento completo; ou (iv) uma sua subsequência; sob condições de estringência muito baixa a muito elevada. As moléculas às quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00147] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 1 a 2655 de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, a sonda de ácido

39 / 169 nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento.

[00148] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de xilanase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00149] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

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[00150] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[00151] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[00152] Os polinucleótidos de SEQ ID NO: 6, ou suas subsequências, bem como os polipeptídeos de SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento, podem ser usados para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de protease a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse,

41 / 169 seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p. ex., pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p. ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por 32 exemplo, com P, 3H, 35 S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00153] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. Para identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 6, ou suas subsequências, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[00154] Para propósitos da presente invenção, a hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 6; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6; (iii) ao seu complemento de comprimento completo; ou (iv) uma sua subsequência; sob condições de estringência muito baixa a muito elevada. As moléculas às quais a sonda de

42 / 169 ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00155] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 1 a 2481 de SEQ ID NO: 6. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 6.

[00156] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de xilanase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00157] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[00158] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro

43 / 169 de SEQ ID NO: 7 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[00159] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9.

[00160] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos

44 / 169 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende o, consiste no ou consiste essencialmente no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10.

[00161] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[00162] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[00163] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%,

45 / 169 pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9.

[00164] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[00165] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10.

[00166] Os polinucleótidos de SEQ ID NO: 8, ou suas subsequências, bem como os polipeptídeos de SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento, podem ser usados para conceber sondas de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos que codificam DNA com atividade de protease de estirpes de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na

46 / 169 técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p. ex., pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p. ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por 32 exemplo, com P, 3H, 35 S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00167] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. Para identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 8, ou suas subsequências, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[00168] Para propósitos da presente invenção, a hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 8; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (iii) ao seu complemento de

47 / 169 comprimento completo; ou (iv) uma sua subsequência; sob condições de estringência muito baixa a muito elevada. As moléculas às quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00169] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 1 a 2496 de SEQ ID NO: 8. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 8. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento.

[00170] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de xilanase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00171] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:

48 / 169 9 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[00172] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina no terminal amino; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00173] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,

49 / 169 Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[00174] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo da molécula, e as moléculas resultantes são testadas quanto à atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver, também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00175] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (p. ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832- 10837; patente dos E.U.A. N.º 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida a regiões (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988,

50 / 169 DNA 7: 127).

[00176] Podem ser combinados métodos de mutagênese/ embaralhamento com métodos de rastreamento automatizados, de elevada produtividade para se detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00177] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de um outro polipeptídeo.

[00178] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual um outro polipeptídeo é fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00179] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de

51 / 169 locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00180] Em um aspecto, o peptídeo-sinal do polipeptídeo tendo atividade de xilanase é substituído por um outro peptídeo-sinal para intensificar a expressão do polipeptídeo. Em uma modalidade, o peptídeo- sinal é do gênero Bacillus, por exemplo o peptídeo-sinal de Bacillus clausii de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 9 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal do polipeptídeo de SEQ ID NO: 10 é substituído pelo peptídeo-sinal de SEQ ID NO: 34.

[00181] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase compreende um caudal, por exemplo, para facilitar a purificação do polipeptídeo. As caudas de purificação são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode incluir uma cauda de poli-histidina. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase tem uma cauda de

52 / 169 poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 ou sua variante tem uma cauda de poli-histidina compreendendo a ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 35. II. Fontes de Polipeptídeos Tendo atividade de Protease

[00182] Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos do gênero Microbacterium. Em um aspecto, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase é um polipeptídeo de Microbacterium oxydans, por exemplo, a xilanase de Microbacterium oxydans de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%,

53 / 169 pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela. Em uma modalidade, a variante é o polipeptídeo de Microbacterium hydrocarbonoxydans de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a variante é o polipeptídeo de Microbacterium sp. SA39 de SEQ ID NO: 4.

[00183] Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos do gênero Paenibacillus. Em um aspecto, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase é um polipeptídeo de Paenibacillus glycanilyticus, por exemplo, a Paenibacillus glycanilyticus de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela. Em um outro aspecto, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase é um polipeptídeo de Paenibacillus terrigena, por exemplo, o polipeptídeo de Paenibacillus terrigena de SEQ ID NO: 7 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela. Em uma modalidade, a variante é o polipeptídeo de Paenibacillus terrigena de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, a variante é o polipeptídeo de Paenibacillus sp. DMB20 de SEQ ID NO: 10.

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[00184] As estirpes destas espécies são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00185] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados a partir da natureza (p. ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p. ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas mencionadas acima. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Logo que um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tenha sido detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, p. ex., Sambrook et al., 1989, supra). III. Polinucleotídeos

[00186] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção, como descrito aqui. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção foi isolado.

[00187] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p. ex., por uso da bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreamento com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com

55 / 169 características estruturais partilhadas. Ver, p. ex., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser também clonados a partir de uma estirpe de Microbacterium oxydans, Microbacterium hydrocarbonoxydans, Microbacterium sp. SA39 ou um organismo relacionado e assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécie da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma estirpe de Paenibacillus, tal como a partir de Paenibacillus glycanilyticus, Paenibacillus terrigena, Paenibacillus sp. DMB20, ou um organismo relacionado e assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécie da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo. IV. Construtos de Ácido Nucleico

[00188] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Em uma modalidade particular, pelo menos uma sequência de controle é heteróloga em relação ao polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Assim, o construto de ácido nucleico não seria encontrado na natureza.

[00189] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

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[00190] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores variantes, truncados e híbridos e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00191] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores em tandem são divulgados em WO 99/43835.

[00192] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do

57 / 169 polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado na presente invenção qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00193] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos a partir dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[00194] A sequência de controle pode também ser uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00195] Exemplos de regiões estabilizantes de mRNA adequadas são obtidas de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[00196] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que seja importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[00197] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo-sinal que codifica um peptídeo-sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5’ da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo-sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo-sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo-sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do

58 / 169 peptídeo-sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo-sinal heteróloga pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo- sinal natural para intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo-sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.

[00198] Sequências codificantes do peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo-sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos- sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Em uma modalidade, o peptídeo-sinal compreende o ou consiste no peptídeo-sinal de Bacillus clausii de SEQ ID NO: 34.

[00199] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00200] Onde estiverem presentes sequências tanto do peptídeo-sinal como do pró-peptídeo, a sequência do pró-peptídeo está posicionada próxima do terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo-sinal está posicionada próxima do terminal N da sequência do pró-peptídeo.

59 / 169 V. Vetores de Expressão

[00201] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As sequências de polinucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Em uma modalidade particular, pelo menos uma sequência de controle é heteróloga em relação ao polinucleotídeo da presente invenção. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada com as sequências de controle apropriadas para expressão.

[00202] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p. ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00203] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, p. ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s)

60 / 169 cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[00204] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores de seleção que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos e similares.

[00205] Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, tais resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina.

[00206] O marcador selecionável pode ser um sistema marcador selecionável duplo como descrito em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema marcador selecionável duplo hph-tk.

[00207] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[00208] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de polinucleotídeos codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases,

61 / 169 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00209] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediador da replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo “origem da replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00210] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184, que permitem replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMß1, que permitem replicação em Bacillus.

[00211] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador de seleção amplificável com o polinucleotídeo, onde as células que contêm cópias amplificadas do gene marcador de seleção, e assim cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente de seleção apropriado.

[00212] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos

62 / 169 acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos do perito na técnica (ver, p. ex., Sambrook et al., 1989, supra). VI. Células Hospedeiras

[00213] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas em relação ao polinucleotídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.

[00214] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p. ex., um procariota ou um eucariota.

[00215] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer Gram- positiva. As bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00216] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de

63 / 169 Bacillus incluindo, mas não se limitando a, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis cells.

[00217] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p. ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, p. ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p. ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, p. ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p. ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p. ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, p. ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p. ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (ver, p. ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p. ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391- 397) ou conjugação (ver, p. ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p. ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, p. ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p. ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (ver, p. ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No

64 / 169 entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira. VII. Métodos de Produção

[00218] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.

[00219] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.

[00220] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultura em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p. ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutritivo, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado a partir de lisados celulares.

[00221] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos

65 / 169 conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutritivo por procedimentos convencionais, incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.

[00222] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p. ex., troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (p. ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p. ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p. ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.

[00223] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo. VIII. Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células

[00224] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou composições de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[00225] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a

66 / 169 uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir síntese de proteínas (p. ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p. ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p. ex., por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00226] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[00227] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que esteja isenta destes componentes.

[00228] As formulações de caldo de fermentação ou composições de

67 / 169 células podem compreender adicionalmente um agente conservante e/ou antimicrobiano (p. ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[00229] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p. ex., células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[00230] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.

[00231] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673. IX. Composições de Enzimas

[00232] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. As composições podem compreender uma xilanase GH98 da presente invenção como o principal componente enzimático, p. ex., uma composição monocomponente.

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[00233] Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p. ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase ou transferase, p. ex., uma alfa-galactosidase, alfa- glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

[00234] Em uma modalidade, a composição compreende uma xilanase da invenção e uma glucoamilase. Em uma modalidade, a composição compreende uma xilanase da invenção e uma glucoamilase derivada de Talaromyces emersonii (p. ex., SEQ ID NO: 11). Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção e uma glucoamilase derivada de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium (p. ex., SEQ ID NO: 12) ou G. trabeum (p. ex., SEQ ID NO: 13). Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase e uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase e uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante (p. ex., de Aspergillus niger) e domínio de ligação ao amido (p. ex., de Aspergillus niger). Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma composição de enzimas celulolíticas. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma composição de enzimas celulolíticas, em que a composição celulolítica é derivada de Trichoderma

69 / 169 reesei. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma protease. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma protease. A protease pode ser derivada de Thermoascus aurantiacus. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase, uma composição de enzimas celulolíticas e uma protease. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, p. ex., derivada de Talaromyces emersonii, Gloeophyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum, uma alfa-amilase, p. ex., derivada de Rhizomucor pusillus, em particular uma tendo um ligante e domínio de ligação ao amido, em particular derivados de Aspergillus niger, em particular uma tendo as seguintes substituições: G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 14 para numeração); uma composição de enzimas celulolíticas derivada de Trichoderma reesei e uma protease, p. ex., derivada de Thermoascus aurantiacus ou Meripilus giganteus.

[00235] Exemplos de enzimas secundárias especificamente contempladas, p. ex., uma glucoamilase de Talaromyces emersonii mostrada em SEQ ID NO: 11 aqui ou uma glucoamilase tendo, p. ex., pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 11 aqui podem ser encontrados na seção “Enzimas” abaixo.

[00236] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00237] São dados abaixo exemplos de uso preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras

70 / 169 condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica. X. COMBINAÇÕES DE ENZIMAS

[00238] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com combinações de enzimas compreendendo uma xilanase e/ou uma composição celulolítica. As combinações de enzimas podem ser usadas para solubilização de fibra (p. ex., fibra de milho, p. ex., arabinose, xilose, etc.), por exemplo, durante o passo de SSF (ou passo de pré-sacarificação) de um processo de produção de produtos de fermentação (p. ex., etanol), preferencialmente sem resultar em escurecimento de DDG ou DDGS produzidos como um coproduto do processo de produção de produtos de fermentação. Quando a composição celulolítica é incluída na combinação, a razão da xilanase e da composição celulolítica pode ser otimizada para aumentar a solubilização de fibras de qualquer substrato particular (p. ex., fibra de milho) e minimizar ou prevenir o escurecimento de DDG ou DDGS a jusante.

[00239] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase. Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase e uma composição celulolítica, em que a razão da xilanase e composição celulolítica na combinação é de cerca de 5:95 a cerca de 95:5. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 10:90. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 15:85. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 20:80. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 25:75. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 30:70. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 35:65. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 40:60. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 45:55. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição

71 / 169 celulolítica é 50:50. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 55:45. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 60:40. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 65:35. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 70:30. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 75:25. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 80:20. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 85:15. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 90:10. Xilanase

[00240] A presente invenção contempla o uso de qualquer xilanase que, quando opcionalmente combinada em conjunto com uma composição celulolítica em várias razões, é capaz de solubilizar a fibra (p. ex., arabinose, xilose, etc.) em um processo de produção de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDGS após secagem.

[00241] Em uma modalidade, a xilanase é da ordem taxonômica Micrococcales ou Bacillales ou, preferencialmente, da família taxonômica Microbacteriaceae, Bacillaceae ou Paenibacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Microbacterium, Bacillus ou Paenibacillus ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Microbacterium oxydans, Microbacterium hydrocarbonoxydans, ou Microbacterium sp. SA39, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus glycanilyticus, Paenibacillus pabuli, ou Paenibacillus terrigena. Em uma modalidade, a xilanase tem pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

72 / 169 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 e é obtida ou obtenível da ordem taxonômica Micrococcales ou, preferencialmente, da família taxonômica Microbacteriaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Microbacterium ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Microbacterium oxydans, Microbacterium hydrocarbonoxydans, ou Microbacterium sp. SA39. Em uma modalidade, a xilanase tem pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 e é obtida da ordem taxonômica Bacillales ou, preferencialmente, da família taxonômica Bacillaceae ou Paenibacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus ou Paenibacillus ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus glycanilyticus, Paenibacillus pabuli, ou Paenibacillus terrigena. Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase da família GH98 (aqui referida como xilanases GH98).

[00242] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm

73 / 169 atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é um fragmento de SEQ ID NO: 1 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e uma extensão ou deleção N- e/ou C- terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00243] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, é um fragmento de SEQ ID NO: 2 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma extensão ou deleção N- e/ou C- terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00244] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%,

74 / 169 pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, é um fragmento de SEQ ID NO: 4 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma extensão ou deleção N- e/ou C- terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00245] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, é um fragmento de SEQ ID NO: 5 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma extensão ou deleção N- e/ou C- terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00246] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos

75 / 169 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, é um fragmento de SEQ ID NO: 7 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma extensão ou deleção N- e/ou C- terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00247] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 9, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, é um fragmento de SEQ ID NO: 9 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e uma extensão ou deleção N- e/ou C- terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00248] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 10, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo

76 / 169 menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, é um fragmento de SEQ ID NO: 10 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma extensão ou deleção N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00249] Em uma modalidade, a xilanase compreende uma xilanase variante tendo uma ou mais substituições descritas no Pedido EP N.º

17177304.7 (incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[00250] Em uma modalidade, a xilanase compreende uma xilanase variante tendo uma ou mais substituições descritas no Pedido de Patente Internacional N.º PCT/EP2017/065336 (incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[00251] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de um outro polipeptídeo.

[00252] A xilanase pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual um outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob o

77 / 169 controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00253] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00254] A xilanase pode ser obtida de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deverá significar que o progenitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o progenitor é secretado extracelularmente.

[00255] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Em uma modalidade, o polipeptídeo é de uma bactéria da classe Bacilli, tal como da ordem Bacillales ou, preferencialmente, da família taxonômica Bacillaceae ou Paenibacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus ou Paenibacillus ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Paenibacillus glycanilyticus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus pabuli ou Paenibacillus terrigena.

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[00256] Em uma modalidade, o polipeptídeo é de uma bactéria da classe Actinobacteria, tal como da ordem Micrococcales ou, preferencialmente, da família taxonômica Microbacteriaceae ou Micrococcaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Microbacterium, Micrococcus ou Micrococoides ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Microbacterium oxydans, Microbacterium hydrocarbonoxydans, ou Microbacterium sp. SA39.

[00257] Em um aspecto, a xilanase é uma xilanase de Paenibacillus glycanilyticus, Paenibacillus pabuli ou Paenibacillus terrigena.

[00258] Em um aspecto, a xilanase é uma xilanase de Microbacterium oxydans, Microbacterium hydrocarbonoxydans ou Microbacterium sp. SA39.

[00259] Em um aspecto preferencial, a xilanase é uma xilanase de Microbacterium oxydans, p. ex., a xilanase tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00260] Em um aspecto preferencial, a xilanase é uma xilanase de Paenibacillus glycanilyticus, p. ex., a xilanase tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID: 5.

[00261] Em um aspecto preferencial, a xilanase é uma xilanase de Paenibacillus terrigena, p. ex., a xilanase tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID: 7.

[00262] Será entendido que, para as espécies mencionadas acima, a invenção engloba os estados tanto perfeitos como imperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, p. ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[00263] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)

79 / 169 e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00264] A xilanase pode ser identificada e obtida de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p. ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p. ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas mencionadas acima. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando um progenitor pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Logo que um polinucleotídeo codificando um progenitor tenha sido detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, p. ex., Sambrook et al., 1989, supra).

[00265] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH98 de Paenibacillus. Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH98 de Microbacterium. Xilanases GH98 exemplificativas de uso nas combinações de enzimas e processos da presente invenção incluem aquelas dos gêneros taxonômicos de Bacteroides, Cellvibrio, Clostridium, Cystobacter, Bacillus, Dickeya, Fibrobacter, Geobacillus, Meloidogyne, Microbacterium, Micromonospora, Mucilaginibacter, Paenibacillus, Paludibacter, Radopholus, Ruminococcus, Serratia, Streptomyces, Verrucosispora, e Xanthomonas.

[00266] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH98 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Microbacterium oxydans de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo

80 / 169 menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com ela; (ii) a xilanase de Microbacterium hydrocarbonoxydans de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com ela; (iii) a xilanase de Microbacterium sp.

SA39 de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com ela; (iv) a xilanase de Paenibacillus glycanilyticus de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com ela; (v) a xilanase de Paenibacillus terrigena de SEQ ID NO: 7 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos

81 / 169 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com ela; (vi) a xilanase de Paenibacillus terrigena de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com ela; e (vii) a xilanase de Paenibacillus sp. DMB20 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com ela.

[00267] Em uma modalidade, a xilanase, p. ex., xilanase GH98, por exemplo de SEQ NOs: 1, 3-5, 7, 8-10, ou suas variantes, é doseada na pré- sacarificação, sacarificação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas em uma concentração de entre 0,0001-1 mg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, p. ex., 0,0005-0,5 mg de EP/g de DS, tal como 0,001-0,1 mg de EP/g de DS. Composição Celulolítica

[00268] A presente invenção contempla o uso de qualquer composição celulolítica que, quando combinada com uma xilanase em várias razões, é capaz de solubilizar a fibra (p. ex., arabinose, xilose, etc.) em um processo de produção de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, sem resultando em um escurecimento dos DDGS após secagem. A composição celulolítica usada em uma combinação de enzimas ou processo da invenção

82 / 169 para produção de produtos de fermentação pode ser derivada de qualquer microrganismo. Como usado aqui, “derivada de qualquer microrganismo” significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas no microrganismo. Por exemplo, uma composição celulolítica derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas em Trichoderma reesei.

[00269] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae.

[00270] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Chrysosporium, tal como uma estirpe de Chrysosporium lucknowense.

[00271] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Humicola, tal como uma estirpe de Humicola insolens.

[00272] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium, tal como uma estirpe de Penicilium emersonii ou Penicilium oxalicum.

[00273] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces aurantiacus ou Talaromyces emersonii.

[00274] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00275] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo

83 / 169 GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00276] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I ou uma celobioidrolase II; (ii) uma beta- glucosidase; e (iii) uma endoglucanase. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iii) uma endoglucanase.

[00277] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo

84 / 169 menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00278] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00279] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus aurantiacus. Em uma modalidade

85 / 169 preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00280] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo

86 / 169 menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta- glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00281] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00282] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus niger. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61

87 / 169 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00283] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e

88 / 169 F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00284] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00285] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus oryzae. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus;

89 / 169 (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00286] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%,

90 / 169 pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00287] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00288] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium emersonii. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00289] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do

91 / 169 grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta- glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo

92 / 169 menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00290] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00291] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium oxalicum. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00292] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo

93 / 169 menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de

94 / 169 sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00293] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00294] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces aurantiacus. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00295] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II

95 / 169 compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta- glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00296] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00297] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é

96 / 169 derivada de uma estirpe de Talaromyces emersonii. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00298] Ainda em uma outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo

97 / 169 menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; (iii) uma beta- glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00299] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00300] A composição celulolítica pode compreender adicionalmente múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p. ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobioidrolases, celulase, feruloila esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta-glucosidase, glucana 1,4-a-

98 / 169 glucosidase, glucana 1,4-alfa-maltoidrolase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa-maltoidrolase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer sua combinação.

[00301] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um ou mais agentes de formulação como divulgado aqui, preferencialmente um ou mais dos compostos selecionados da lista consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose.

[00302] Em uma modalidade, a composição celulolítica, p. ex., derivada de uma estirpe de Aspergillus, Penicilium, Talaromyces ou Trichoderma, tal como uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, é doseada na pré-sacarificação, sacarificação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas em uma concentração de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,0005-2 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,001-1 mg/g de DS, mais preferencial de 0,005-0,5 mg de EP/g de DS, ainda mais preferencial 0,01-0,1 mg de EP/g de DS. XI. PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE

FERMENTAÇÃO

[00303] A invenção se relaciona também com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido usando um organismo fermentador, em que um polipeptídeo tendo atividade de xilanase (xilanase GH98) ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo uma xilanase e uma composição celulolítica (p. ex., de Trichoderma reesei) é adicionado antes da e/ou durante a fermentação. Os peritos na técnica apreciarão que qualquer um dos polipeptídeos tendo

99 / 169 atividade de xilanase descritos na Seção I acima, as composições descritas na Seção IX acima e/ou as combinações de enzimas descritas na Seção X acima, ou de outro modo descritos aqui, pode ser usado nos processos da invenção, incluindo nos processos da Seção XI. Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido não gelatinizado

[00304] Em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização (i.e., sem cozimento) do material contendo amido (frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto”), em que uma xilanase GH98 presentemente divulgada, ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase e uma composição celulolítica, é adicionada. O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser produzido sem liquefação da pasta semifluida aquosa contendo o material contendo amido e água. Em uma modalidade, um processo da invenção inclui sacarificação de material contendo amido (p. ex., moído), p. ex., amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente na presença de alfa-amilase e/ou enzima(s) geradora(s) de fonte de carboidratos para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação por um organismo fermentador adequado. Em esta modalidade, o produto de fermentação desejado, p. ex., etanol, é produzido a partir de grãos de cereais não gelatinizados (i.e., não cozidos), preferencialmente moídos, tais como milho.

[00305] Conformemente, em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo sacarificação e fermentação simultâneas do material contendo amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos e um organismo fermentador a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na

100 / 169 presença de uma xilanase GH98 da invenção ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase.

[00306] Combinações de enzimas exemplificativas de uso nos processos são descritas na Seção X acima intitulada “Combinações de Enzimas”. A sacarificação e a fermentação podem ser também separadas. Assim, em um outro aspecto, a invenção se relaciona com processos de produção de produtos de fermentação, compreendendo os seguintes passos: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos, p. ex., uma glucoamilase; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em o passo (i) e/ou (ii) é levado a cabo usando pelo menos uma glucoamilase e uma xilanase GH98 da invenção ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase.

[00307] Em uma modalidade, a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante o passo de sacarificação (i). Em uma modalidade, a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante o passo de fermentação (ii).

[00308] Em uma modalidade, uma alfa-amilase, em particular uma alfa-amilase fúngica, é também adicionada no passo (i). Os passos (i) e (ii) podem ser realizados simultaneamente. Em uma modalidade, a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura e a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante a propagação da levedura.

101 / 169 Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado

[00309] Em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, processo esse que inclui um passo de liquefação e passos de sacarificação e fermentação realizados sequencialmente ou simultaneamente. Consequentemente, a invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase para formar um mosto liquefeito; sacarificação do mosto liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos para produzir um açúcar fermentável; e fermentação do açúcar usando um organismo fermentador sob condições adequadas para produzir o produto de fermentação; em que a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada antes do ou durante o passo (c).

[00310] A pasta semifluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e uma variante de alfa-amilase pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita a alfa-amilase no passo (a). A liquefação pode em uma modalidade ser levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três passos. A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95ºC, preferencialmente, entre 70- 90ºC, tal como preferencialmente entre 80-85ºC a um pH de 4-6, em particular a um pH de 4,5-5,5, e variante de alfa-amilase, opcionalmente em conjunto com uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, tal como uma glucoamilase, uma fosfolipase, uma fitase e/ou pululanase, são

102 / 169 adicionadas para iniciar a liquefação (diluição). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a um pH de 4-6, em particular a um pH de 4,5 a 5,5. O passo de sacarificação (b) pode ser levado a cabo usando condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um processo de sacarificação total pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é comum fazer somente uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65ºC, tipicamente cerca de 60ºC, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (processo SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 20-75ºC, em particular, 40- 70ºC, tipicamente em torno de 60ºC, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5. O processo mais amplamente usado para produzir um produto de fermentação, especialmente etanol, é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe uma fase de retenção para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto. A SSF pode ser tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 25ºC a 40ºC, tal como de 28ºC a 35ºC, tal como de 30ºC a 34ºC, preferencialmente em torno de cerca de 32ºC. Em uma modalidade, a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[00311] Em uma modalidade, a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante o passo de sacarificação (b). Em uma modalidade, a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante o passo de fermentação (c). Os passos (b) e (c) podem ser realizados simultaneamente. Em uma modalidade, a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Em uma modalidade, o

103 / 169 organismo fermentador é levedura e a xilanase GH98 da presente invenção ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase é adicionada durante a propagação da levedura. Materiais Contendo Amido

[00312] Qualquer material de partida adequado contendo amido pode ser usado em um processo da presente invenção. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais de partida contendo amido, adequados para uso nos processos da presente invenção, incluem cevada, feijões, mandioca, cereais, milho, milo, ervilhas, batatas, arroz, centeio, sagu, sorgo, batatas-doces, tapioca, trigo e grãos inteiros ou qualquer mistura dos mesmos. O material contendo amido também pode ser um tipo ceroso ou não ceroso de milho e cevada. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido é milho. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido é trigo. Produtos de Fermentação

[00313] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um método ou processo incluindo fermentação usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação incluem álcoois (p. ex., etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (p. ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (p. ex., acetona); aminoácidos (p. ex., ácido glutâmico); gases (p. ex., H2 e CO2); antibióticos (p. ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p. ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, p. ex., etanol combustível; etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p. ex., cerveja e vinho), indústria dos lacticínios (p. ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com

104 / 169 muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Em uma modalidade, o produto de fermentação é etanol. Organismos Fermentadores

[00314] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura e fungos filamentosos, adequado para produção de um produto de fermentação desejado. Os organismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, i.e., converter, açúcares fermentáveis, tais como arabinose, frutose, glucose, maltose, manose ou xilose, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[00315] Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces, em particular Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum; estirpes de Pichia, em particular Pichia stipitis tal como Pichia stipitis CBS 5773 ou Pichia pastoris; estirpes de Candida, em particular Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis, ou Candida utilis. Outros organismos fermentadores incluem estirpes de Hansenula, em particular Hansenula anomala ou Hansenula polymorpha; estirpes de Kluyveromyces, em particular Kluyveromyces fragilis ou Kluyveromyces marxianus; e estirpes de Schizosaccharomyces, em particular Schizosaccharomyces pombe.

[00316] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organismo fermentador de açúcares C6, tal como uma estirpe de, p. ex., Saccharomyces cerevisiae.

[00317] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organismo fermentador de açúcares C5, tal como uma estirpe de, p. ex., Saccharomyces cerevisiae. Fermentação

[00318] As condições de fermentação são determinadas com base, p.

105 / 169 ex., no tipo de material vegetal, nos açúcares fermentáveis disponíveis, no(s) organismo(s) fermentador(es) e/ou no produto de fermentação desejado. Um perito na técnica pode facilmente determinar condições de fermentação adequadas. A fermentação pode ser levada a cabo em condições convencionalmente usadas. Processos de fermentação preferenciais são processos anaeróbicos.

[00319] Por exemplo, as fermentações podem ser levadas a cabo a temperaturas tão elevadas como 75ºC, p. ex., entre 40-70ºC, tal como entre 50-60ºC. No entanto são também conhecidas bactérias com uma temperatura ótima significativamente mais baixa até em torno da temperatura ambiente (em torno de 20ºC). Exemplos de organismos fermentadores adequados podem ser encontrados na seção “Organismos Fermentadores” acima.

[00320] Para produção de etanol usado levedura, a fermentação pode continuar durante 24 a 96 horas, em particular durante 35 a 60 horas. Em uma modalidade, a fermentação é levada a cabo a uma temperatura entre 20 e 40ºC, preferencialmente 26 a 34ºC, em particular em torno de 32ºC. Em uma modalidade, o pH é de pH 3 a 6, preferencialmente em torno de pH 4 a 5. Recuperação de Produtos de Fermentação

[00321] Subsequente à fermentação ou SSF, o produto de fermentação pode ser separado a partir do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para extrair o produto de fermentação desejado (p. ex., etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado pode ser extraído a partir do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica. Tipicamente, o produto de fermentação, p. ex., etanol, com uma pureza de até, p. ex., cerca de 96 por cento por vol. de etanol é obtido.

[00322] Assim, em uma modalidade, o método da invenção adicionalmente compreende destilação para obter o produto de fermentação,

106 / 169 p. ex., etanol. A fermentação e a destilação podem ser levadas a cabo simultaneamente e/ou separadamente/sequencialmente; opcionalmente seguidas por um ou mais passos do processo para refinamento adicional do produto de fermentação.

[00323] Após a completação do processo de destilação, o material restante é considerado a vinhaça completa. Como usado aqui, o termo “vinhaça completa” inclui o material que permanece no final do processo de destilação após recuperação do produto de fermentação, p. ex., etanol. O produto de fermentação pode ser opcionalmente recuperado por qualquer método conhecido na técnica. Separação (Desidratação) de Vinhaça Completa em Vinhaça Fina e Bolo Úmido

[00324] Em uma modalidade, a vinhaça completa é separada ou dividida em uma fase sólida e líquida por um ou mais métodos para separação da vinhaça fina do bolo úmido.

[00325] A separação de vinhaça completa em vinhaça fina e bolo úmido de modo a se remover uma porção significativa do líquido/água pode ser feita usando qualquer técnica de separação adequada, incluindo centrifugação, compressão e filtração. Em uma modalidade preferencial, a separação/desidratação é levada a cabo por centrifugação. Centrífugas preferenciais na indústria são centrífugas tipo decantadoras, preferencialmente centrífugas tipo decantadoras de elevada velocidade. Um exemplo de uma centrífuga adequada é a séria de cones íngremes NX 400 da Alfa Laval que é uma decantadora de elevado desempenho. Em uma outra modalidade preferencial, a separação é levada a cabo usando outro equipamento de separação convencional tal como uma prensa de filtração de placa/grelha, prensas de filtro de correia, prensas de parafuso, espessadores de gravidade e andares ou equipamento similar. Processamento de Vinhaça Fina

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[00326] Vinhaça fina é o termo usado para o sobrenadante da centrifugação da vinhaça completa. Tipicamente, a vinhaça fina contém 4-6 por cento de sólidos secos (DS) (maioritariamente proteínas, fibra solúvel, fibras finas e componentes da parede celular) e tem uma temperatura de cerca de 60-90 graus centígrados. O fluxo de vinhaça fina pode ser condensada por evaporação de forma a proporcionar dois fluxos de processo incluindo: (i) um fluxo de condensado do evaporador compreendendo água condensada removida a partir da vinhaça fina durante a evaporação e (ii) um fluxo de xarope, compreendendo um fluxo mais concentrado dos sólidos dissolvidos e não dissolvidos não voláteis, tais como açúcares não fermentáveis e óleo, permanecendo presentes a partir da vinhaça fina como o resultado da remoção da água evaporada. Opcionalmente, o óleo pode ser removido a partir da vinhaça fina ou pode ser removido como um passo intermediário ao processo de evaporação, que é tipicamente levado a cabo usando uma série de várias fases de evaporação. O xarope e/ou o xarope sem óleo podem ser introduzidos em um secador em conjunto com os grãos úmidos (a partir do passo de separação da vinhaça completa) de modo a proporcionar um produto referido como grão seco destilado com solúveis, que também pode ser usado como ração animal.

[00327] Em uma modalidade, o xarope e/ou o xarope sem óleo são pulverizados em um ou mais secadores de modo a combinar o xarope e/ou o xarope sem óleo com a vinhaça completa para produzir grão seco destilado com solúveis.

[00328] Entre 5-90% em vol., tal como entre 10-80%, tal como entre 15-70%, tal como entre 20-60%, da vinhaça fina (por exemplo, opcionalmente hidrolisada) pode ser reciclada (como contrafluxo) para o passo (a). A vinhaça fina reciclada (i.e., contrafluxo) pode constituir de cerca de 1-70% em vol., preferencialmente 15-60% em vol., especialmente de cerca de 30 a 50% em vol. da pasta semifluida formada no passo (a).

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[00329] Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente reciclagem de pelo menos uma porção da corrente de vinhaça fina para a pasta semifluida, opcionalmente após o óleo ter sido extraído a partir da corrente de vinhaça fina. Secagem de Bolo Úmido e Produção de Grãos Secos Destilados e Grãos Secos Destilados com Solúveis

[00330] Após o bolo úmido, contendo cerca de 25-40% em peso, preferencialmente 30-38% em peso, de sólidos secos, ter sido separado da vinhaça fina (p. ex., desidratado), ele pode ser seco em um secador de tambor, secador pulverizador, secador de anel, secador de leito fluido ou similar de modo a produzir “Grãos Secos Destilados” (DDG). O DDG é um ingrediente valorizável de ração para animais, tais como gado, aves domésticas e peixes. É preferencial proporcionar DDG com um teor de menos do que cerca de 10- 12% em peso de umidade de forma a evitar bolor e desagregação microbiana e aumentar a vida útil. Adicionalmente, o elevado teor de umidade também torna mais caro transportar o DDG. O bolo úmido é preferencialmente seco sob condições que não desnaturam as proteínas no bolo úmido. O bolo úmido pode ser combinado com xarope separado da vinhaça fina e seco em DDG com Solúveis (DDGS). Produtos intermediários parcialmente secos, tal como são por vezes referidos como grãos destilados úmidos modificados, podem ser produzidos por secagem parcial do bolo úmido, opcionalmente com a adição de xarope antes, durante ou após o processo de secagem III. PROCESSOS PARA MELHORIA DA QUALIDADE

NUTRICIONAL DE DDG OU DDGS

[00331] Em um outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação.

[00332] Em uma modalidade, um processo para melhoria da qualidade

109 / 169 nutricional de DGS ou DDGS produzidos como coproduto de um processo de produção de fermentação compreende realização de um processo para produção de um produto de fermentação descrito acima na Seção XI (p. ex., um processo de RSH ou um processo de cozimento convencional incluindo um passo de liquefação) ou Exemplos aqui e recuperação do produto de fermentação para produzir DGS ou DDGS como um coproduto, em que os DGS ou DDGS produzidos têm qualidade nutricional melhorada. O passo de recuperação do produto de fermentação para produzir DGS ou DDGS como o coproduto pode incluir qualquer um ou combinação dos passos descritos acima de recuperação de produto(s) de fermentação, por exemplo por destilação, para produzir vinhaça completa, separação da vinhaça completa em bolo úmido e vinhaça fina, processamento de vinhaça fina, secagem de bolo úmido e produção de DDG ou DDGS, etc.

[00333] Como usado aqui, “qualidade nutricional melhorada” significa um aumento na energia metabolizável verdadeira (TME) dos DDG ou DDGS em pelo menos 5% em comparação com os DDG ou DDGS produzidos em um processo de produção de produtos de fermentação (p. ex., um processo de RSH ou processo de cozimento convencional, incluindo um passo de liquefação como apresentado na Seção II ou nos Exemplos aqui) no qual uma xilanase GH98 presentemente divulgada ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase não foi adicionada durante a pré- sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00334] Em uma modalidade, a xilanase GH98 ou combinações ou composições de enzimas compreendendo a xilanase e processos da presente invenção aumentam a TME dos DDG ou DDGS em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos

110 / 169 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29% ou pelo menos 30% em comparação com DDG ou DDGS produzidos em um processo de produção de produtos de fermentação (p. ex., um processo de RSH ou processo de cozimento convencional, incluindo um passo de liquefação como apresentado na Seção II ou nos Exemplos aqui) no qual uma xilanase GH98 presentemente divulgada ou combinação ou composição de enzimas compreendendo a xilanase não foi adicionada durante a pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00335] Em uma modalidade, a xilanase GH98 ou combinações ou composições de enzimas compreendendo a xilanase e processos da presente invenção melhoram a qualidade nutricional dos DDG ou DDGS sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS após secagem. Os peritos na técnica apreciarão que a extensão do escurecimento dos DDG ou DDGS após secagem após adição de uma xilanase GH98 da presente invenção, ou uma combinação ou composição de enzimas compreendendo uma xilanase, durante um processo de produção de produtos de fermentação (p. ex., durante SSF enquanto se produz etanol usando um substrato de purê de milho) pode ser prontamente avaliada, por exemplo, por medição da cor de DDG ou DDGS usando a escala de Cor de Hunter (ver Exemplos aqui). XII. Enzimas

[00336] A(s) enzima(s) e polipeptídeos descritos abaixo são para serem usados em uma “quantidade eficaz” em combinações ou processos da presente invenção. O texto abaixo deve ser lido no contexto da divulgação de enzimas na seção “Definições” acima. Composições Celulolíticas Usadas em uma Combinação de Enzimas ou Processo e Método da Invenção

[00337] A composição celulolítica usada em um processo da invenção para produção de produtos de fermentação pode ser derivada de qualquer

111 / 169 microrganismo. Como usado aqui, “derivada de qualquer microrganismo” significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas no microrganismo. Por exemplo, uma composição celulolítica derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas em Trichoderma reesei.

[00338] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae.

[00339] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Chrysosporium, tal como uma estirpe de Chrysosporium lucknowense.

[00340] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Humicola, tal como uma estirpe de Humicola insolens.

[00341] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium, tal como uma estirpe de Penicilium emersonii ou Penicilium oxalicum.

[00342] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces aurantiacus ou Talaromyces emersonii.

[00343] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00344] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00345] A composição celulolítica pode compreender um ou mais dos seguintes polipeptídeos, incluindo enzimas: polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, beta-glucosidase, CBHI, CBHII ou uma mistura de dois, três ou quatro das mesmas.

[00346] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica

112 / 169 compreendendo uma beta-glucosidase tem um valor de carga de ED50 Relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1-0,9, tal como entre 0,2-0,8, tal como 0,30-0,70.

[00347] A composição celulolítica pode compreender alguma hemicelulase, tal como, p. ex., xilanase e/ou beta-xilosidase. A hemicelulase pode vir a partir do organismo produtor de composição celulolítica ou a partir de outras fontes, p. ex., a hemicelulase pode ser estranha ao organismo produtor de composição celulolítica, tal como, p. ex., Trichoderma reesei.

[00348] Em uma modalidade preferencial, o teor de hemicelulase na composição celulolítica constitui menos do que 10% em peso, tal como menos do que 5% em peso, da composição celulolítica.

[00349] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase.

[00350] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica e uma beta-glucosidase.

[00351] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase e uma CBH.

[00352] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma beta-glucosidase e uma CBHI.

[00353] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase e uma CBHI.

[00354] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma beta-glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

[00355] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

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[00356] A composição celulolítica pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00357] Em uma modalidade, a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

[00358] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase I.

[00359] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase II. Celobioidrolase I

[00360] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender uma ou mais CBH I (celobioidrolase I). Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma celobioidrolase I (CBHI), tal como uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a CBHI Cel7A divulgada em SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 15 aqui, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00361] Em uma modalidade, a celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus ou seu homólogo é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 aqui; (ii) uma celobioidrolase I compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 aqui;

114 / 169 (iii) uma celobioidrolase I codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 em WO 2013/148993; e (iv) uma celobioidrolase I codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência pelo menos elevada, p. ex., condições de estringência muito elevada, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento completo. Celobioidrolase II

[00362] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender uma ou mais CBHII (celobioidrolase II). Em uma modalidade, a celobioidrolase II (CBHII), tal como uma derivada de uma estirpe do gênero de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como aquela em SEQ ID NO: 16 aqui ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma estirpe do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como celobioidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.

[00363] Em uma modalidade, a celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus ou seu homólogo é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase II compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 aqui; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 aqui;

115 / 169 (iii) uma celobioidrolase II codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 em WO 2013/148993; e (iv) uma celobioidrolase II codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência pelo menos elevada, p. ex., condições de estringência muito elevada, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento completo. Beta-Glucosidase

[00364] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender uma ou mais beta-glucosidases. A beta-glucosidase pode em uma modalidade ser uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como aquela divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 17 aqui ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada em WO 2012/044915 ou pedido PCT copendente PCT/US11/054185 (ou pedido provisório dos EUA # 61/388,997), tal como uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[00365] Em uma outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de uma estirpe do gênero Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium brasilianum divulgada em WO 2007/019442, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00366] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus ou seu homólogo selecionado do grupo

116 / 169 consistindo em: (i) uma beta-glucosidase compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17; (ii) uma beta-glucosidase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 aqui; (iii) uma beta-glucosidase codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993; e (iv) uma beta-glucosidase codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência pelo menos elevada, p. ex., condições de estringência muito elevada, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento completo.

[00367] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma variante compreendendo uma substituição em uma ou mais (várias) posições correspondendo às posições 100, 283, 456 e 512 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 aqui, em que a variante tem atividade de beta-glucosidase.

[00368] Em uma modalidade, a beta-glucosidase progenitora da variante é (a) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 aqui; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 aqui; (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência elevada ou muito elevada com (i) a sequência codificante do

117 / 169 polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou (iii) a fita complementar de comprimento completo de (i) ou (ii); (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou a sua sequência de cDNA; ou (e) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 aqui, que tem atividade beta-glucosidase.

[00369] Em uma modalidade, a variante de beta-glucosidase tem pelo menos 80%, p. ex., pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da beta- glucosidase progenitora.

[00370] Em uma modalidade, a variante tem pelo menos 80%, p. ex., pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17 aqui.

[00371] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 17 aqui), que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E e F512Y; tal como uma sua variante com as seguintes substituições:

118 / 169 - F100D + S283G + N456E + F512Y; - L89M + G91L + I186V + I140V; - I186V + L89M + G91L + I140V + F100D + S283G + N456E + F512Y.

[00372] Em uma modalidade, o número de substituições é entre 1 e 4, tal como 1, 2, 3 ou 4 substituições.

[00373] Em uma modalidade, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 100, uma substituição em uma posição correspondendo à posição 283, uma substituição em uma posição correspondendo à posição 456 e/ou uma substituição em uma posição correspondendo à posição 512.

[00374] Em uma modalidade preferencial, a variante de beta- glucosidase compreende as seguintes substituições: Phe100Asp, Ser283Gly, Asn456Glu, Phe512Tyr em SEQ ID NO: 17 aqui.

[00375] Em uma modalidade preferencial, a beta-glucosidase tem um valor de carga de ED50 Relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1-0,9, tal como entre 0,2-0,8, tal como 0,30-0,70. Polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora

[00376] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender um ou mais polipeptídeos GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, tal como um derivado do gênero Thermoascus, tal como uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, tal como aquele descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como aquele descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; ou um derivado de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal

119 / 169 como aquele descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado de uma estirpe derivada de Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium emersonii, tal como aquele divulgado em WO 2011/041397 como SEQ ID NO: 18 aqui.

[00377] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium sp. ou seu homólogo é selecionado do grupo consistindo em: (i) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 18 aqui; (ii) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 18 aqui; (iii) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, p. ex., 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 em WO 2013/148993; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência pelo menos elevada, p. ex., condições de estringência muito elevada, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento completo. Composições Celulolíticas

[00378] Como mencionado acima, a composição celulolítica pode compreender um número de polipeptídeos diferentes, tais como enzimas.

[00379] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende

120 / 169 uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656) e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[00380] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499).

[00381] Em uma outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii divulgado em WO 2011/041397, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499) ou uma sua variante com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[00382] A composição de enzimas da presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, um caldo de fermentação em bruto com ou sem células removidas, um lisado celular com ou sem detritos celulares, uma composição de enzimas semipurificada ou purificada ou uma célula hospedeira, p. ex., célula hospedeira de Trichoderma, como uma fonte das enzimas.

[00383] A composição de enzimas pode ser um pó ou granulado seco, um granulado sem formação de poeiras, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida estabilizada. As composições de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

121 / 169

[00384] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica compreendendo uma beta-glucosidase tem um valor de carga de ED50 Relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1-0,9, tal como entre 0,2-0,8, tal como 0,30-0,70.

[00385] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolítica é doseada (i.e., durante o passo de sacarificação no passo ii) e/ou fermentação no passo iii) ou SSF) de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,0005-2 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,001-1 mg/g de DS, mais preferencial de 0,005-0,5 mg de EP/g de DS, ainda mais preferencial 0,01-0,1 mg de EP/g de DS. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00386] De acordo com a invenção, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na liquefação opcionalmente em conjunto com uma hemicelulase, uma endoglucanase, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, tal como uma glucoamilase, uma fosfolipase, uma fitase e/ou pululanase.

[00387] A alfa-amilase adicionada durante o passo de liquefação i) pode ser qualquer alfa-amilase. São preferenciais alfa-amilases, tais como especialmente alfa-amilases de Bacillus, tais como alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, que são estáveis à temperatura usada durante a liquefação. Alfa-Amilase Bacteriana

[00388] O termo “alfa-amilase bacteriana” significa qualquer alfa- amilase bacteriana classificada sob EC 3.2.1.1. Uma alfa-amilase bacteriana usada de acordo com a invenção pode, p. ex., ser derivada de uma estirpe do gênero Bacillus, que é por vezes também referido como o gênero Geobacillus. Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus é derivada de uma estirpe de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus

122 / 169 stearothermophilus, Bacillus sp. TS-23 ou Bacillus subtilis, mas pode ser também derivada de outra Bacillus sp.

[00389] Exemplos específicos de alfa-amilases bacterianas incluem a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467 e a alfa-amilase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 e a alfa-amilase de Bacillus sp. TS-23 divulgada como SEQ ID NO: 1 em WO 2009/061380 (todas as sequências são deste modo incorporadas por referência).

[00390] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, p. ex., pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NOS: 3, 4 ou 5, respectivamente, em WO 99/19467 e SEQ ID NO: 1 em WO 2009/061380.

[00391] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, p. ex., pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui.

[00392] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada de Bacillus stearothermophilus. A alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus

123 / 169 pode ser um tipo selvagem maduro ou uma sua variante madura. As alfa- amilases maduras de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, podem ser naturalmente truncadas durante a produção recombinante. Por exemplo, a alfa-amilase madura de Bacillus stearothermophilus pode ser truncada no terminal C tal que tenha em torno de 491 aminoácidos em comprimento (em comparação com SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui), tal como de 480-495 aminoácidos em comprimento.

[00393] A alfa-amilase de Bacillus pode ser também uma variante e/ou híbrido. Exemplos de uma tal variante podem ser encontrados em qualquer uma de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, WO 02/10355 e WO2009/061380 (todos os documentos são deste modo incorporados por referência). Variantes de alfa-amilase específicas são divulgadas nas Patentes dos E.U.A. Nos 6,093,562, 6,187,576, 6,297,038 e 7,713,723 (deste modo incorporadas por referência) e incluem variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (frequentemente referidas como alfa-amilase BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos em qualquer uma das posições R179, G180, I181 e/ou G182, preferencialmente a deleção dupla divulgada em WO 96/23873 – ver, p. ex., página 20, linhas 1- 10 (deste modo incorporada por referência), correspondendo preferencialmente à deleção das posições I181 e G182 em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui ou à deleção dos aminoácidos R179 e G180 usando SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui. São ainda mais preferenciais alfa- amilases de Bacillus, especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus (BSG), que têm pelo uma ou duas deleções de aminoácidos correspondendo às posições R179, G180, I181 e G182, preferencialmente que têm uma deleção dupla correspondendo a R179 e G180 ou, preferencialmente, uma deleção das posições 181 e 182 (denotada I181* +

124 / 169 G182*) e, opcionalmente, compreendem adicionalmente uma substituição N193F (denotada I181* + G182* + N193F) em comparação com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase BSG de tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui. A alfa- amilase bacteriana pode ter também uma substituição em uma posição correspondendo a S239 na alfa-amilase de Bacillus licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 ou uma variante S242 na alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui.

[00394] Em uma modalidade, a variante é uma variante S242A, E ou Q, preferencialmente uma variante S242Q ou A, da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 19 aqui para numeração).

[00395] Em uma modalidade, a variante é uma variante da posição E188, preferencialmente uma variante E188P da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 19 aqui para numeração).

[00396] Outra variante contemplada é a variante de Bacillus sp. TS-23 divulgada em WO2009/061380, especialmente variantes definidas na reivindicação 1 de WO2009/061380 (deste modo incorporada por referência). Alfa-Amilases Híbridas Bacterianas

[00397] A alfa-amilase bacteriana pode ser também uma alfa-amilase bacteriana híbrida, p. ex., uma alfa-amilase compreendendo 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N- terminais da alfa-amilase derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada em SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467). Em uma modalidade preferencial, este híbrido tem uma ou mais das, especialmente todas as, seguintes substituições:

[00398] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V +Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467). São também preferenciais variantes tendo uma ou mais das

125 / 169 seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras alfa-amilases de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou a deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferencialmente a deleção de E178 e G179 (usando SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467 para numeração das posições).

[00399] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana é a parte madura da alfa-amilase quimérica divulgada em Richardson et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry 277(29):. 267501-26507, referida como BD5088 ou uma sua variante. Esta alfa-amilase é a mesma que aquela mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2007134207. A sequência da enzima madura começa após o aminoácido “Met” inicial na posição 1. Alfa-Amilase Termoestável

[00400] De acordo com a invenção, a alfa-amilase é opcionalmente usada em combinação com uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80ºC. Opcionalmente, uma endoglucanase tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70ºC, tal como acima de 75 ºC, em particular acima de 80 ºC, pode ser incluída. A alfa- amilase termoestável, tal como uma alfa-amilase bacteriana, é preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus ou Bacillus sp. TS-23. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 15. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 20. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 25. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 30. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 40. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12

126 / 169 mM, de pelo menos 50. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 60. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 10-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 15-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 20-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 25-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 30-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 40-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 50-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85ºC, CaCl2 a 0,12 mM, entre 60-70.

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

127 / 169 - A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+S242Q; - E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - K220P+N224L+S242Q+Q254S; - M284V; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V.

[00401] Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana, preferencialmente derivada do gênero Bacillus, especialmente uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular a Bacillus stearothermophilus como divulgada em WO 99/19467 como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 19 aqui com um ou dois aminoácidos deletados nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, em particular com R179 e G180 deletados ou com I181 e G182 deletados, com mutações na lista de mutações abaixo. Em modalidades preferenciais, as alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus têm a deleção dupla I181 + G182 e a substituição opcional N193F, opcionalmente compreendendo adicionalmente mutações selecionadas da lista abaixo:

[00402] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus: - I181*+G182*; - I181*+G182*+N193F; preferencialmente

128 / 169 - I181*+G182*+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; -181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+ R179E+ H208Y+K220P+N224L+Q254S; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+ R179E+ Q254S+M284V; e -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+ S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 19 aqui para numeração).

[00403] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase bacteriana, tal como alfa-amilase de Bacillus, tal como alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19 aqui.

[00404] Em uma modalidade preferencial, a variante de alfa-amilase bacteriana, tal como variante de alfa-amilase de Bacillus, tal como variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de

129 / 169 identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19 aqui.

[00405] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus e suas variantes elas são normalmente produzidas naturalmente na forma truncada. Em particular, a truncação pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 19 aqui, ou suas variantes, seja truncada no terminal C e tenha tipicamente em torno de 491 aminoácidos em comprimento, tal como de 480-495 aminoácidos em comprimento. Hemicelulase Termoestável Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00406] De acordo com a invenção, uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80ºC está presente e/ou é adicionada ao passo de liquefação i) em combinação com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase bacteriana (descrita acima).

[00407] A termoestabilidade de uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, pode ser determinada como descrito na seção “Materiais & Métodos” sob “Determinação de Td por Calorimetria Diferencial de Varrimento para Endoglucanases e Hemicelulases”.

[00408] Em uma modalidade, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10 ou GH11, tem um Ponto de Fusão (DSC) acima de 82ºC, tal como acima de 84ºC, tal como acima de 86ºC, tal como acima de 88ºC, tal como acima de 90ºC, tal como acima de 92ºC, tal como acima de 94ºC, tal como acima de 96ºC, tal como acima de 98ºC, tal como acima de 100ºC, tal como entre 80ºC e 110ºC, tal como entre 82ºC e 110ºC e tal como entre 84ºC e 110ºC.

[00409] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo

130 / 169 menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 20 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Dictyoglomus, tal como uma estirpe de Dictyogllomus thermophilum.

[00410] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH11, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 21 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Dictyoglomus, tal como uma estirpe de Dictyogllomus thermophilum.

[00411] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo

131 / 169 menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 22 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rasamsonia, tal como uma estirpe de Rasomsonia byssochlamydoides.

[00412] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 23 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces leycettanus.

[00413] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 24 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus. Endoglucanase Termoestável Presente e/ou Adicionada Durante a

132 / 169 Liquefação

[00414] De acordo com a invenção, uma endoglucanase (“E”) opcional tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70ºC, tal como entre 70ºC e 95ºC, pode estar presente e/ou ser adicionada na passo de liquefação i) em combinação com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase bacteriana termoestável, e uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80ºC.

[00415] A termoestabilidade de uma endoglucanase pode ser determinada como descrito na seção “Materiais & Métodos” de WO 2017/112540 (incorporado na sua totalidade aqui por referência) sob o cabeçalho “Determinação de Td por Calorimetria Diferencial de Varrimento para Endoglucanases e Hemicelulases”.

[00416] Em uma modalidade, a endoglucanase tem um Ponto de Fusão (DSC) acima de 72ºC, tal como acima de 74ºC, tal como acima de 76ºC, tal como acima de 78ºC, tal como acima de 80ºC, tal como acima de 82ºC, tal como acima de 84ºC, tal como acima de 86ºC, tal como acima de 88ºC, tal como entre 70ºC e 95ºC, tal como entre 76ºC e 94ºC, tal como entre 78ºC e 93ºC, tal como entre 80ºC e 92ºC, tal como entre 82ºC e 91ºC, tal como entre 84ºC e 90ºC.

[00417] Em uma modalidade preferencial, a endogluconase usada em um processo da invenção ou compreendida em uma composição da invenção é uma endoglucanase da Família de Glicosídeo Hidrolases 5 ou endoglucanase GH5 (ver a base de dados CAZy na página da internet “www.cazy.org”).

[00418] Em uma modalidade, a endoglucanase GH5 é da família EG II, tal como a endoglucanase de Talaromyces leycettanus mostrada em SEQ ID NO: 25 aqui; endoglucanase de Penicillium capsulatum mostrada em SEQ ID NO: 26 aqui e endoglucanase de Trichophaea saccata mostrada em SEQ ID NO: 27 aqui.

133 / 169

[00419] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase da família GH45. Em uma modalidade, a endoglucanase GH45 é da família EG V, tal como a Sordaria fimicola mostrada em SEQ ID NO: 28 aqui ou a endoglucanase de Thielavia terrestris mostrada em SEQ ID NO: 29 aqui.

[00420] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 25 aqui. Em uma modalidade, a endoglucanase é derivada de uma estirpe do gênero Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces leycettanus.

[00421] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 26 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium capsulatum.

[00422] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%,

134 / 169 mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 27 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Trichophaea, tal como uma estirpe de Trichophaea saccata.

[00423] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 28 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Sordaria, tal como uma estirpe de Sordaria fimicola.

[00424] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 29 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thielavia, tal como uma

135 / 169 estirpe de Thielavia terrestris.

[00425] Em uma modalidade, a endoglucanase é adicionada no passo de liquefação i) a uma dose de 1-10.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, tal como 10-1.000 µg de EP/g de DS. Enzima Geradora de Fonte de Carboidratos Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00426] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidratos opcional, em particular uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase termoestável, pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em conjunto com uma alfa-amilase e hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80ºC, e uma endoglucanase opcional tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70ºC e uma pululanase opcional e/ou fitase opcional.

[00427] O termo “enzima geradora de fonte de carboidratos” inclui quaisquer enzimas gerando açúcares fermentáveis. Uma enzima geradora de fonte de carboidratos é capaz de produzir um carboidrato que pode ser usado como uma fonte de energia pelo(s) organismo(s) fermentador(es) em questão, por exemplo, quando usada em um processo da invenção para produção de um produto de fermentação, tal como etanol. Os carboidratos gerados podem ser convertidos diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado, preferencialmente etanol. De acordo com a invenção pode ser usada uma mistura de enzimas geradoras de fonte de carboidratos. Exemplos específicos incluem glucoamilase (sendo geradoras de glucose), beta-amilase e amilase maltogênica (sendo geradoras de maltose).

[00428] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é termoestável. A enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular glucoamilase termoestável, pode ser adicionada em conjunto ou separadamente da alfa-amilase e protease termoestável.

[00429] Em uma modalidade específica e preferencial, a enzima

136 / 169 geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase termoestável, preferencialmente de origem fúngica, preferencialmente de um fungo filamentoso, tal como de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum, em particular a glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 (que é deste modo incorporada por referência) e mostrada em SEQ ID NO: 30 aqui.

[00430] Em uma modalidade, a glucoamilase termoestável tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 30 aqui.

[00431] Em uma modalidade, a enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular glucoamilase termoestável, é a glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 30 aqui.

[00432] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 30 aqui, tendo uma substituição K79V (referida como “PE001”) (usando a sequência madura mostrada em SEQ ID NO: 14 aí para numeração). A variante de glucoamilase K79V tem sensibilidade reduzida à degradação por protease em relação ao progenitor como divulgado em WO 2013/036526 (que é deste modo incorporada por referência).

[00433] Variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum contempladas são divulgadas em WO 2013/053801 (que é deste modo

137 / 169 incorporada por referência).

[00434] Em uma modalidade, estas variantes têm uma sensibilidade reduzida à degradação por proteases.

[00435] Em uma modalidade, estas variantes têm termoestabilidade melhorada em comparação com o progenitor.

[00436] Mais especificamente, em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 30 aqui para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente pelo menos uma das seguintes substituições ou combinação de substituições: T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F + Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F;

[00437] R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P + Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A +

138 / 169

Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + V79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S

139 / 169 + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N +Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[00438] Em uma modalidade preferencial, a variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V usando SEQ ID NO: 23 aqui para numeração (variante PE001) e compreende adicionalmente uma das seguintes mutações: P11F + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T.

[00439] Em uma modalidade, a variante de glucoamilase, tal como variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%,

140 / 169 mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 30 aqui.

[00440] A enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular glucoamilase, pode ser adicionada em quantidades de 0,1-100 microgramas de EP/g de DS, tais como 0,5-50 microgramas de EP/g de DS, tais como 1-25 microgramas de EP/g de DS, tais como 2-12 microgramas de EP/g de DS. Pululanase Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00441] Opcionalmente, uma pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante o passo de liquefação i) em conjunto com uma alfa- amilase e uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80ºC. Como mencionado acima, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, preferencialmente uma glucoamilase termoestável, podem estar também opcionalmente presentes e/ou ser adicionadas durante o passo de liquefação i).

[00442] A pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante o passo de liquefação i) e/ou passo de sacarificação ii) ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[00443] As pululanases (E.C. 3.2.1.41, pululana 6-glucanoidrolase), são enzimas desramificadoras caracterizadas pela sua capacidade de hidrolisarem as ligações alfa-1,6-glicosídicas em, por exemplo, amilopectina e pululana.

[00444] As pululanases contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Bacillus amyloderamificans divulgadas na Patente dos E.U.A. N.º 4,560,651 (deste modo incorporada como referência), a pululanase divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 01/151620

141 / 169 (deste modo incorporada por referência), a Bacillus deramificans divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 01/151620 (deste modo incorporada por referência) e a pululanase de Bacillus acidopullulyticus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 01/151620 (deste modo incorporada por referência) e também descrita em FEMS Mic. Let. (1994), 115, 97-106.

[00445] Pululanases adicionais contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Pyrococcus woesei, especificamente de Pyrococcus woesei DSM N.º 3773 divulgada em WO 92/02614.

[00446] Em uma modalidade, a pululanase é uma pululanase da família GH57. Em uma modalidade, a pululanase inclui um domínio X47 como divulgado em WO 2011/087836 (que é deste modo incorporada por referência). Mais especificamente, a pululanase pode ser derivada de uma estirpe do gênero Thermococcus, incluindo Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis, tal como a pululanase de Thermococcus hydrothermalis mostrada em WO 2011/087836 truncada no local X4 após o domínio X47. A pululanase pode ser também um híbrido das pululanases de Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis ou uma enzima híbrida de T. hydrothermalis/T. litoralis com o local de truncação X4 divulgado em WO 2011/087836 (que é deste modo incorporada por referência).

[00447] Em uma outra modalidade, a pululanase é uma compreendendo um domínio X46 divulgada em WO 2011/076123 (Novozymes).

[00448] A pululanase pode de acordo com a invenção ser adicionada em uma quantidade eficaz que inclui a quantidade preferencial de cerca de 0,0001-10 mg de proteína enzimática por grama de DS, preferencialmente 0,0001-0,10 mg de proteína enzimática por grama de DS, mais preferencialmente 0,0001-0,010 mg de proteína enzimática por grama de DS. A atividade de pululanase pode ser determinada como NPUN. Um Ensaio

142 / 169 para determinação de NPUN é descrito na seção ”Materiais & Métodos” abaixo.

[00449] Produtos de pululanase comercialmente disponíveis adequados incluem PROMOZYME 400L, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EUA) e AMANO 8 (Amano, Japão). Fitase Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00450] Opcionalmente, uma fitase pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em combinação com uma alfa-amilase e hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80ºC.

[00451] Uma fitase usada de acordo com a invenção pode ser qualquer enzima capaz de efetuar a liberação de fosfato inorgânico a partir de ácido fítico (hexacifosfato de mio-inositol) ou de qualquer seu sal (fitatos). As fitases podem ser classificadas de acordo com sua especificidade no passo de hidrólise inicial, viz. de acordo com o qual o grupo éster de fosfato é hidrolisado em primeiro lugar. A fitase a ser usada na invenção pode ter qualquer especificidade, p. ex., ser uma 3-fitase (EC 3.1.3.8), uma 6-fitase (EC 3.1.3.26) ou uma 5-fitase (sem número EC). Em uma modalidade, a fitase tem uma temperatura ótima acima de 50ºC, tal como na gama de 50- 90ºC.

[00452] A fitase pode ser derivada de plantas ou microrganismos, tais como bactérias ou fungos, p. ex., levedura ou fungos filamentosos.

[00453] Uma fitase vegetal pode ser de farelo de trigo, milho, soja ou pólen de lírio. Fitases vegetais adequadas são descritas em Thomlinson et al., Biochemistry, 1 (1962), 166-171; Barrientos et al., Plant. Physiol., 106 (1994), 1489-1495; WO 98/05785; WO 98/20139.

[00454] Uma fitase bacteriana pode ser do gênero Bacillus, Citrobacter, Hafnia, Pseudomonas, Buttiauxella ou Escherichia,

143 / 169 especificamente a espécie Bacillus subtilis, Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis, Buttiauxella noackies e E. coli. Fitases bacterianas adequadas são descritas em Paver e Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102-1108; Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207-1220; Greiner et al., Arch. Biochem. Biophys., 303, 107-113, 1993; WO 1997/33976; WO 1997/48812, WO 1998/06856, WO 1998/028408, WO 2004/085638, WO 2006/037327, WO 2006/038062, WO 2006/063588, WO 2008/092901, WO 2008/116878 e WO 2010/034835.

[00455] Uma fitase de levedura pode ser derivada do gênero Saccharomyces ou Schwanniomyces, especificamente as espécies Saccharomyces cerevisiae ou Schwanniomyces occidentalis. A enzima anterior foi descrita como uma Fitase de levedura adequada são descritas em Nayini et al., 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24-26; Wodzinski et al., Adv. Appl. Microbiol., 42, 263-303; AU-A-24840/95;

[00456] As fitases de fundos filamentosos podem ser derivadas do filo fúngico de Ascomycota (ascomicetos) ou do filo Basidiomycota, p. ex., o gênero Aspergillus, Thermomyces (também chamado Humicola), Myceliophthora, Manascus, Penicillium, Peniophora, Agrocybe, Paxillus, ou Trametes, especificamente a espécie Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, T. lanuginosus (também conhecida como H. lanuginosa), Myceliophthora thermophila, Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Manascus anka, Paxillus involtus, ou Trametes pubescens. Fitases fúngicas adequadas são descritas em Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322: 1275-1282; Piddington et al., 1993, Gene 133: 55-62; EP 684,313; EP 0 420 358; EP 0 684 313; WO 1998/28408; WO 1998/28409; JP 7-67635; WO 1998/44125; WO 1997/38096; WO 1998/13480.

[00457] Em uma modalidade preferencial, a fitase é derivada de

144 / 169 Buttiauxella, tal como Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis ou Buttiauxella noackies, tal como aquelas divulgadas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6, respectivamente, em WO 2008/092901 (deste modo incorporada por referência).

[00458] Em uma modalidade preferencial, a fitase é derivada de Citrobacter, tal como Citrobacter braakii, tal como uma divulgada em WO 2006/037328 (deste modo incorporada por referência).

[00459] Fitases modificadas ou variantes de fitase são obteníveis por métodos conhecidos na técnica, em particular pelos métodos divulgados em EP 897010; EP 897985; WO 99/49022; WO 99/48330, WO 2003/066847, WO 2007/112739, WO 2009/129489 e WO 2010/034835.

[00460] Produtos contendo fitase comercialmente disponíveis incluem BIO-FEED PHYTASE™, PHYTASE NOVO™ CT ou L (todos da Novozymes), LIQMAX (DuPont) ou RONOZYME™ NP, RONOZYME® HiPhos, RONOZYME® P5000 (CT), NATUPHOS™ NG 5000 (da DSM). Enzima Geradora de Fonte de Carboidratos presente e/ou adicionada durante a Sacarificação e/ou a Fermentação.

[00461] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, preferencialmente uma glucoamilase, está presente e/ou é adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação.

[00462] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase, de origem fúngica, preferencialmente de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii. Glucoamilase

[00463] De acordo com a invenção, a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação pode ser derivada de qualquer fonte adequada, p. ex., derivada de um microrganismo ou uma planta. As

145 / 169 glucoamilases preferenciais têm origem fúngica ou bacteriana, selecionadas do grupo consistindo em glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilases G1 ou G2 de Aspergillus niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), ou suas variantes, tais como aquelas divulgadas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921, glucoamilase de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949) ou suas variantes ou fragmentos. Outras variantes de glucoamilases de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); ligações de dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); e introdução de resíduos de Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204).

[00464] Outras glucoamilases incluem glucoamilase de Athelia rolfsii (previamente denotada Corticium rolfsii) (ver patente dos EUA no. 4,727,026 e (Nagasaka et al. (1998) “Purification and properties of the raw-starch- degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”, Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente dos EUA no. Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente dos EUA no. 4,587,215). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase usada durante a sacarificação e/ou a fermentação é a glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448.

[00465] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

[00466] Glucoamilases fúngicas contempladas incluem Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea; e Leucopaxillus giganteus, todas

146 / 169 divulgadas em WO 2006/069289; e Peniophora rufomarginata divulgada em WO2007/124285; ou uma sua mistura. São também contempladas glucoamilases híbridas de acordo com a invenção. Exemplos incluem as glucoamilases híbridas divulgadas em WO 2005/045018. Exemplos específicos incluem a glucoamilase híbrida divulgada nas Tabelas 1 e 4 do Exemplo 1 (híbridos esses que são deste modo incorporados por referência).

[00467] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus como descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), ou de uma estirpe do gênero Gloephyllum, em particular uma estirpe de Gloephyllum como descrita em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16) ou uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351 (SEQ ID NO: 2) (todas as referências deste modo incorporadas por referência). São também contempladas glucoamilases que exibem uma elevada identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, i.e., pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100% de identidade com qualquer uma das partes maduras das sequências de enzimas mencionadas acima.

[00468] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS.

[00469] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME™ ACHIEVE e AMG™ E (da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480,

147 / 169 GC417 (da Genencor Int.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (da Danisco US). Amilase Maltogênica

[00470] A enzima geradora de fonte de carboidratos presente e/ou adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação pode ser também uma alfa-amilase maltogênica. Uma “alfa-amilase maltogênica” (glucana 1,4-alfa- maltoidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa. Uma amilase maltogênica da estirpe de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponível a partir da Novozymes A/S. Alfa-amilases maltogênicas são descritas nas Patentes dos EUA nos. 4,598,048, 4,604,355 e 6,162,628, que são deste modo incorporadas por referência. A amilase maltogênica pode em uma modalidade preferencial ser adicionada em uma quantidade de 0,05-5 mg de proteína total/grama de DS ou 0,05-5 MANU/g de DS. Protease Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00471] Em uma modalidade da invenção, uma protease opcional, tal como uma protease termoestável, pode estar presente e/ou ser adicionada em liquefação em conjunto com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase termoestável, e uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80ºC e, opcionalmente, uma endoglucanase, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma glucoamilase, opcionalmente uma pululanase e/ou opcionalmente uma fitase.

[00472] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas ou ainda não classificadas, (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

[00473] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável

148 / 169 usada de acordo com a invenção é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).

[00474] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não é feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima e aos princípios indicados aí. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[00475] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio são do mesmo modo para ser adaptados à protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80ºC.

[00476] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease são descritos abaixo na seção “Materiais & Métodos” de WO 2017/112540 (incorporada aqui por referência), dos quais o assim chamado “Ensaio de AZCL-Caseína” é o ensaio preferencial.

[00477] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100%, da atividade de protease da variante JTP196 (Exemplo 2 de WO 2017/112540) ou Protease Pfu (SEQ ID NO: 31 aqui) determinada pelo ensaio de AZCL-caseína descrito na seção “Materiais & Métodos” em WO 2017/112540.

[00478] Não existem quaisquer limitações quanto à origem da protease

149 / 169 termoestável usada em um processo ou composição da invenção desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas abaixo.

[00479] Em uma modalidade, a protease tem origem fúngica.

[00480] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo ou composição da invenção é de origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670 (classificada como EC

3.4.24.39).

[00481] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada em SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou da parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 e mostrada como SEQ ID NO: 32 aqui adicionalmente com mutações selecionadas da lista abaixo: - S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; - N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; - T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; - D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

150 / 169 D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; - D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; - S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; - A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+D142L.

[00482] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 32 aqui com as seguintes mutações: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; ou

151 / 169 A27K+D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[00483] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 32 aqui.

[00484] A protease termoestável pode ser também derivada de qualquer bactéria desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas de acordo com a invenção.

[00485] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada de uma estirpe da bactéria Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus (protease pfu).

[00486] Em uma modalidade, a protease é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA N.º 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) e SEQ ID NO: 31 aqui.

[00487] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma divulgada em SEQ ID NO: 31 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, de identidade com a SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA no. 6,358,726-B1 ou SEQ ID NO: 31 aqui. A protease de Pyrococcus furiosus pode ser adquirida a partir da Takara Bio, Japão.

152 / 169

[00488] A protease de Pyrococcus furiosus é uma protease termoestável de acordo com a invenção. Foi descoberto que o produto comercial protease de Pyrococcus furiosus (Pfu S) (ver Exemplo 5) tinha uma termoestabilidade de 110% (80ºC/70ºC) e 103% (90ºC/70ºC) a pH 4,5 determinada como descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[00489] Em uma modalidade, uma protease termoestável tem um valor de termoestabilidade de mais do que 20% determinada como Atividade Relativa a 80ºC/70ºC determinada como descrito no Exemplo 2.

[00490] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, tal como mais do que 105%, tal como mais do que 110%, tal como mais do que 115%, tal como mais do que 120% determinada como Atividade Relativa a 80ºC/70ºC.

[00491] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30% determinada como Atividade Relativa a 80ºC/70ºC.

[00492] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115% determinada como Atividade Relativa a 80ºC/70ºC.

[00493] Em uma modalidade, a protease tem um valor de termoestabilidade de mais do que 10% determinada como Atividade Relativa a 85ºC/70ºC determinada como descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[00494] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 10%, tal como mais do que 12%, mais do que 14%, mais do que 16%, mais do que 18%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, mais do que 110% determinada

153 / 169 como Atividade Relativa a 85ºC/70ºC.

[00495] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 10 e 50%, tal como entre 10 e 30%, tal como entre 10 e 25% determinada como Atividade Relativa a 85ºC/70ºC.

[00496] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Relativa a 80ºC; e/ou Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Relativa a 84ºC.

[00497] A determinação da “Atividade Relativa” e “Atividade Restante” é feita como descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[00498] Em uma modalidade, a protease pode ter uma termoestabilidade para acima de 90, tal como acima de 100 a 85ºC como determinada usando o teste de Zeína-BCA como divulgado no Exemplo 3 de WO 2017/112540.

[00499] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85ºC como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[00500] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60-120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80-120%, tal como entre 90-120%, tal como entre 100-120%, tal como 110-120% a 85ºC como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[00501] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal

154 / 169 como pelo menos 100% da atividade da variante de protease JTP196 ou Protease Pfu determinada pelo ensaio de AZCL-caseína descrito na seção “Materiais & Métodos” de WO 2017/112540. IV. Aspectos Adicionais da Invenção

[00502] Em um aspecto adicional da invenção, ela se relaciona com o uso de uma combinação de enzimas da presente invenção para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação da presente invenção, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

[00503] Uma combinação de enzimas divulgada na Seção I aqui pode ser usada desta maneira. Em várias modalidades deste aspecto, uma enzima adicional, tal como uma enzima ou composição de enzimas descrita sob a seção “Enzimas”, pode ser usada em combinação em conjunto com uma combinação de enzimas da presente invenção.

[00504] Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para melhorar a qualidade nutricional de DGS ou DDGS por aumento da TME dos DDG ou DDGS quando administrados a um animal (p. ex., não ruminante, p. ex., monogástrico, p. ex., aves domésticas ou suínos, etc.) em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19% ou pelo menos 20% em comparação com a TME dos DDG ou DDGS produzidos como um coproduto quando uma combinação de enzimas da presente invenção não está presente durante o(s) passo(s) de sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de produtos de fermentação usado para produzir DDG ou DDGS como o coproduto. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para melhorar a qualidade nutricional de DGS ou DDGS por aumento da

155 / 169 TME dos DDG ou DDGS em um animal (p. ex., não ruminante, p. ex., monogástrico, por exemplo, aves domésticas ou suínos, etc.) em pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 31%, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49% ou pelo menos 50% em comparação com a TME dos DDG ou DDGS produzidos como um coproduto quando uma combinação de enzimas da presente invenção não está presente durante o(s) passo(s) de sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de produtos de fermentação usado para produzir o coproduto de DDG ou DDGS.

[00505] Ainda em um aspecto adicional da invenção, ela se relaciona com o uso de uma combinação de enzimas da presente invenção para aumento da solubilização da fibra presente em um purê de fermentação durante um processo de produção de produtos de fermentação da presente invenção, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização de fibras durante a produção de álcool (p. ex., etanol) a partir de um material contendo amido. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização da fibra de milho em um processo de produção de etanol, como um processo de RSH ou cozimento convencional incluindo um passo de liquefação. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização de arabinose. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização de xilose.

[00506] Uma combinação de enzimas divulgada na Seção I aqui pode ser usada desta maneira. Em várias modalidades deste aspecto, uma enzima adicional, tal como uma enzima ou composição de enzimas descrita sob a

156 / 169 seção “Enzimas”, pode ser usada em combinação em conjunto com uma combinação de enzimas da presente invenção.

[00507] Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização da fibra (p. ex., arabinose, xilose, etc.) contatada com a combinação de enzimas em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19% ou pelo menos 20% em comparação com a solubilização da fibra não contatada com uma combinação de enzimas da presente invenção. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização da fibra (p. ex., arabinose, xilose, etc.) contatada com a combinação de enzimas em pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 31%, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49% ou pelo menos 50% em comparação com fibra não contatada com a combinação de enzimas.

[00508] A invenção é adicionalmente definida pelos seguintes parágrafos numerados:

[00509] Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, selecionado do grupo consistindo em: um polipeptídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, 5 ou 7; um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência muito elevada com a sequência

157 / 169 codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, 6 ou 8, ou o complemento de comprimento completo de qualquer uma das mesmas; um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, 6 ou 8; um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c), que tem atividade de xilanase.

[00510] O polipeptídeo do parágrafo 1, em que: o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 33 a 884 de SEQ ID NO: 1; o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 31 a 826 de SEQ ID NO: 5; e o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 35 a 831 de SEQ ID NO: 7.

[00511] Uma combinação de enzimas compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-2.

[00512] A combinação de enzimas do parágrafo 3, compreendendo adicionalmente uma composição celulolítica.

[00513] A combinação de enzimas do parágrafo 4, em que a composição celulolítica está presente na combinação em uma razão de xilanase e composição celulolítica de cerca de 5:95 a cerca de 95:5, tal como de 5:95, 10:90, 20:80, 50:50, 80:20, 90:10 e 95:5.

[00514] Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-2.

[00515] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 6 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas

158 / 169 que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[00516] Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 6 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que dirigem a produção do polipeptídeo.

[00517] Um método de produção de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, compreendendo (a) cultivo da célula hospedeira do parágrafo 8 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo e (b) opcionalmente, recuperação do polipeptídeo.

[00518] Um processo de produção de um produto de fermentação, compreendendo os seguintes passos: sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial com uma alfa- amilase, uma glucoamilase e uma xilanase GH98 ou uma combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98; fermentação usando um organismo de fermentação para produzir o produto de fermentação; e opcionalmente, recuperação de um coproduto.

[00519] Um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: liquefação de um material contendo amido com uma alfa- amilase; sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) com uma glucoamilase e uma xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98; fermentação usando um organismo fermentador; e opcionalmente, recuperação de um coproduto.

[00520] O processo do parágrafo 10 ou 11, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente.

[00521] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-12, em que o

159 / 169 material contendo amido compreende milho, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, switchgrass, milheto, milheto-pérola, painço.

[00522] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-13, em que o produto de fermentação é álcool, particularmente etanol.

[00523] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-14, em que o coproduto é grãos secos destilados (DDG) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS).

[00524] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-15, em que os DDG ou DDGS têm uma qualidade nutricional melhorada em comparação com DDG ou DDGS recuperados como um coproduto de um processo para produção de um produto de fermentação no qual a xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98 não está presente ou não é adicionada.

[00525] O processo do parágrafo 16, em que os DDG ou DDGS têm conteúdo de gordura aumentado.

[00526] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-17, em que a energia metabolizável verdadeira dos DGS ou DDGS é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%, em comparação com a TME de DGS ou DDGS produzidos quando uma xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98 não está presente durante o passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas do processo.

[00527] O processo do parágrafo 18, em que a TME é para um animal monogástrico.

[00528] O processo dos parágrafos 15 ou 16, em que os DGS ou DDGS produzidos não são escurecidos após secagem em comparação com DGS ou DDGS produzidos quando um polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-2 ou combinação de enzimas de acordo com qualquer um dos parágrafos 3-5 não está presente

160 / 169 durante o passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 19.

[00529] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-20, em que o organismo fermentador é levedura, particularmente Saccharomyces sp., mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[00530] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-21, em que a combinação de enzimas compreende uma composição celulolítica.

[00531] O processo de qualquer um dos parágrafos 10-22, em que a composição celulolítica está presente na combinação em uma razão de xilanase e composição celulolítica de cerca de 5:95 a cerca de 95:5, tal como de 5:95, 10:90, 20:80, 50:50, 80:20, 90:10 e 95:5.

[00532] A combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou o processo de qualquer um dos parágrafos 10-23, em que a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: uma celobioidrolase I; uma celobioidrolase II; uma beta-glucosidase; e um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica.

[00533] A combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou o processo de qualquer um dos parágrafos 10-24, em que a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora

161 / 169 celulolítica de Penicillium emersonii.

[00534] A combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou o processo de qualquer um dos parágrafos 10-25, em que a composição celulolítica compreende: uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 15; uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 16; uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 17; e/ou um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo

162 / 169 menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 18.

[00535] A combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou o processo de qualquer um dos parágrafos 10-26, em que a composição celulolítica compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00536] A combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou o processo de qualquer um dos parágrafos 10-27, em que a composição celulolítica é derivada de uma estirpe selecionada do grupo consistindo em Aspergillus, Penicilium, Talaromyces e Trichoderma, opcionalmente em que: (i) a estirpe de Aspergillus é selecionada do grupo consistindo em Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae; (ii) a estirpe de Penicilium é selecionada do grupo consistindo em Penicilium emersonii e Penicilium oxalicum; (iii) a estirpe de Talaromyces é selecionada do grupo consistindo em Talaromyces aurantiacus e Talaromyces emersonii; e (iv) a estirpe de Trichoderma é Trichoderma reesei.

[00537] A combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou o processo de qualquer um dos parágrafos 10-28, em que a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei.

[00538] O polipeptídeo dos parágrafos 1 ou 2, a combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 3-5 ou os parágrafos de qualquer um dos parágrafos 10 a 29, em que a xilanase é uma xilanase da família GH98 do gênero Microbacterium ou do gênero Paenibacillus.

[00539] O processo de qualquer um dos parágrafos 10 a 30, em que a xilanase é uma xilanase GH98 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Microbacterium oxydans de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%,

163 / 169 pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela; (ii) a Paenibacillus glycanilyticus de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela; e a xilanase de Paenibacillus terrigena de SEQ ID NO: 7 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela.

[00540] 32. Uso de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-2, ou combinação de enzimas de acordo com qualquer um dos parágrafos 3-5, para melhoria da qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos como um coproduto do processo de produção de produtos de fermentação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 31, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

[00541] 33. Uso de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-2 ou uma combinação de enzimas de acordo com qualquer um dos parágrafos 3-5 para solubilização de fibra,

164 / 169 preferencialmente para solubilização de xilose e arabinose.

[00542] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada no escopo pelas modalidades específicas aqui divulgadas,1 uma vez que estas modalidades se destinam como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer modalidades equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a se enquadrarem dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições prevalecerá. Várias referências são citadas aqui, as divulgações das quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção. Materiais & Métodos

[00543] Alfa-Amilase 369 (AA369): Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações: I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+ E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V (SEQ ID NO: 19 aqui) truncada até 491 aminoácidos.

[00544] Composição celulolítica: Composição celulolítica derivada de Trichoderma reesei compreendendo: CBH1 de Aspergillus fumigatus Cel7A divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 15 aqui; CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 16 aqui; variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 17 aqui) variante F100D, S283G, N456E, F512Y) divulgada em WO 2012/044915 ou pedido PCT copendente PCT/US11/054185; e polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica derivada de uma estirpe de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID

165 / 169 NO: 18 aqui).

[00545] E-SEP: Combinação compreendendo xilanase GH10 transgênica expressando e uma estirpe de celulose de Trichoderma reesei expressando arabinofuranosidase GH62.

[00546] Glucoamilase SA (GSA): Combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO99/28448, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada em SEQ ID NO: 14 aqui tendo as seguintes substituições G128D+D143N (a razão de atividades em AGU:AGU:FAU-F é cerca de 20:5:1).

[00547] Protease Pfu: Protease derivada de Pyrococcus furiosus mostrada em SEQ ID NO: 31 aqui.

[00548] GH98#1: Xilanase GH98 derivada de Paenibacillus terrigena tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[00549] GH98#2: Xilanase GH98 derivada de Paenibacillus glycanilyticus tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[00550] GH98#3: Xilanase GH98 derivada de Microbacterium oxydans tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00551] Levedura: ETHANOL RED™ disponível a partir da Red Star/Lesaffre, EUA. Ensaio de solubilização de xilose

[00552] A atividade de uma variante de xilanase na direção de Milho desamidado desengordurado (DFDSM) pode ser medida por Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAE-PAD). Suspensão de DFDSM a 2% (p/p) pode ser preparada em acetato de sódio a 100 mM, CaCl2 a 5 mM, pH 5 e deixada a hidratar durante 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave. Após

166 / 169 hidratação, 200 µL de suspensão de substrato podem ser pipetados em uma placa com 96 poços e misturados com 20 µL de solução de enzimas para obter uma concentração de enzima final de 20 PPM em relação ao substrato (20 µg de enzima/g de substrato). As misturas enzima/substrato podem ser depois deixadas para hidrólise em 2,5 horas a 40ºC sob agitação suave (500 RPM) em uma incubadora de placa (Biosan PST-100 HL). Após hidrólise enzimática, as placas de enzima/substrato podem ser centrifugadas durante 10 minutos a 3000 RPM e 50 µL de sobrenadante (hidrolisado) são misturados com 100 µL de HCl a 1,6 M e transferidos para tubos de PCR de 300 µL e deixados para hidrólise ácida durante 40 minutos a 90ºC em uma máquina de PCR. O propósito da hidrólise ácida é converter polissacarídeos solúveis, liberados pela variante de xilanase, em monossacarídeos, que podem ser quantificados usando HPAE-PAD. As amostras são neutralizadas com 125 µL de NAOH a 1,4 M após hidrólise ácida e montadas no HPAE-PAD para análise de monossacarídeo (xilose, arabinose e glucose) (Dionex ICS-3000 usando uma coluna CarboPac PA1). Curvas de calibração apropriadas são feitas usando soluções de estoque de monossacarídeos que são sujeitas ao mesmo procedimento de hidrólise ácida que as amostras. A percentagem de xilose solubilizada é calculada de acordo com a equação: em que [xilose] denota a concentração de xilose no sobrenadante medida por HPAE-PAD, V o volume da amostra, MW, o peso molecular da xilose interna em arabino-xilana (132 g/mol), Xxil, a fração de xilose em DFDSM (0,102) e Msub, a massa de DFDSM na amostra.

EXEMPLOS

[00553] Exemplo 1 Clonagem e expressão de endo-beta-1,4-xilanases GH98 bacterianas

[00554] As endo-beta-1,4-xilanases GH98 bacterianas foram derivadas

167 / 169 de estirpes bacterianas isoladas a partir de amostra ambiental por técnicas de isolamento microbiológico padrão. As estirpes puras isoladas foram identificadas, e a taxonomia foi atribuída com base no sequenciamento de DNA dos genes ribossômicos 16S (Tabela 1). Tabela 1: Estirpe ou comunidade País de Origem Proteína madura Microbacterium oxydans EUA SEQ: 1 Paenibacillus glycanilyticus EUA SEQ: 5 Paenibacillus terrigena EUA SEQ: 7

[00555] O DNA cromossômico foi isolado a partir das culturas puras e sujeito ao sequenciamento completo do genoma usando tecnologia ILLUMINA®. O sequenciamento do genoma, a montagem subsequente das leituras e a descoberta de genes (i.e., anotação de funções dos genes) são conhecidos do perito na técnica e o serviço pode ser comprado comercialmente.

[00556] As sequências do genoma foram analisadas quanto a endo- beta-1,4-xilanases putativas da família GH98 da base de dados CAZY (Lombard V, Golaconda Ramulu H, Drula E, Coutinho PM, Henrissat B (2014). The Carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res 42: D490–D495.). Esta análise identificou 3 genes codificando endo-beta-1,4-xilanases GH98 putativas, que foram subsequentemente pedidos como fragmentos de DNA linear à GeneArt® e recombinantemente expressos em Bacillus subtilis. O DNA codificando a endo-beta-1,4-xilanase GH98 putativa de Microbacterium oxydans foi sujeito a otimização de códons (SEQ ID NO: 33) para Bacillus subtilis antes do pedido.

[00557] Os construtos de integração usados foram produtos à base de plasmídeo preparados por fusão do gene de interesse entre duas regiões cromossômicas de B. subtilis em conjunto com promotores fortes e um marcador de resistência ao cloranfenicol. Os genes da endo-beta-1,4- xilanase GH98 foram expressos sob o controle de um sistema de promotor triplo (como descrito em WO 99/43835), consistindo nos promotores de gene

168 / 169 de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) e do promotor de cryIIIA de Bacillus thuringiensis incluindo sequência estabilizante.

[00558] Os genes foram fundidos com DNA codificando um sinal de secreção de Bacillus clausii (codificando a seguinte sequência de aminoácidos: MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA (SEQ ID NO: 34), substituindo o sinal de secreção nativo. Além do mais, o construto de expressão resulta na adição de uma cauda de poli-histidina amino-terminal consistindo na sequência de aminoácidos HHHHHHPR (SEQ ID NO: 35) às endo-beta-1,4-xilanases GH98 maduras para facilitar a purificação fácil por cromatografia de afinidade de metal imobilizado.

[00559] O plasmídeo resultante foi transformado em Bacillus subtilis e integrado no cromossomo por recombinação homóloga no lócus da pectato liase. Subsequentemente, um clone de Bacillus subtilis recombinante contendo o construto de expressão integrado foi cultivado em cultura líquida. O caldo de cultura foi centrifugado (20.000 x g, 20 min) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado a partir do precipitado e usado para purificação da enzima ou alternativamente o sobrenadante filtrado estéril foi usado diretamente para ensaios. Purificação da enzima recombinante por cromatografia de afinidade de metal imobilizado

[00560] O pH do sobrenadante clarificado foi ajustado até pH 8, filtrado através de um filtro de 0,2 µM, e o sobrenadante aplicado a uma coluna HisTrap™ excel de 5 mL. Antes da carga, a coluna foi equilibrada em 5 volumes de coluna (CV) de Tris/HCl a 50 mM a pH 8. De modo a remover o material não ligado, a coluna foi lavada com 8 CV de Tris/HCl a 50 mM pH 8, e a eluição do alvo foi obtida com HEPES a 50 mM pH 7 + imidazol a 10 mM. A proteína eluída foi dessalinizada em uma coluna de dessalinização HiPrep™ 26/10, equilibrada usando 3 CV de HEPES a 50 mM pH 7 + NaCl a

169 / 169 100 mM. Este tampão foi também usado para eluição do alvo, e o caudal foi 10 mL/min. As frações relevantes foram selecionadas e agrupadas com base no cromatograma e análise de SDS-PAGE. Exemplo 2

[00561] O Exemplo 2 demonstra a eficácia de várias xilanases GH98 da presente invenção e combinações de enzimas compreendendo razões 10:90 de xilanases GH98 e a composição celulolítica listada na seção Materiais & Métodos em fibra de milho. Os ensaios de sacarificação foram realizados em fibra de milho rica em sólidos a DS a 15%, pH 5 e 32ºC durante 3 dias. Cada xilanase foi testada como uma substituição de 10% (por proteína) na composição celulolítica (“VD”) para uma carga de proteína total de 0,25 mg de EP/g de Sólidos Secos (DS) (a concentração de proteína para cada uma das xilanases no ensaio foi 0,00375 mg/mL). As incubações foram suplementadas com GSA (0,6 AGU/g de DS).

[00562] A FIG. 1 mostra o rendimento médio de DP4+ (g/L) para cada uma das combinações de enzimas GH98 em comparação com a composição celulolítica de controle não suplementada com xilanase. A FIG. 2 mostra o rendimento médio de glucose (g/L) para cada uma das combinações de enzimas GH98 em comparação com a composição celulolítica de controle não suplementada com xilanase. As FIG. 1 e FIG. 2 mostram que uma xilanase GH98 de Microbacterium oxydans (#3; SEQ ID NO: 1) se desempenhou melhor que as xilanases GH98 de Paenibacillus.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo tendo atividade de xilanase, caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, 5 ou 7; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência muito elevada com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, 6 ou 8, ou o complemento de comprimento completo de qualquer uma das mesmas; (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, 6 ou 8; (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c), que tem atividade de xilanase.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: (i) o polipeptídeo maduro ser os aminoácidos 33 a 884 de SEQ ID NO: 1; (ii) o polipeptídeo maduro ser os aminoácidos 31 a 826 de SEQ ID NO: 5; e (iii) o polipeptídeo maduro ser os aminoácidos 35 a 831 de SEQ ID NO: 7.

3. Combinação de enzimas caracterizada por compreender o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

4. Combinação de enzimas de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender adicionalmente uma composição celulolítica.

5. Combinação de enzimas de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a composição celulolítica estar presente na combinação em uma razão de xilanase e composição celulolítica de cerca de 5:95 a cerca de 95:5, tal como de 5:95, 10:90, 20:80, 50:50, 80:20, 90:10 e 95:5.

6. Polinucleotídeo caracterizado por codificar o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

7. Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 6, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

8. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 6, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que dirigem a produção do polipeptídeo.

9. Método de produção de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, caracterizado por compreender (a) o cultivo da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 8, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo e (b) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo.

10. Processo de produção de um produto de fermentação, caracterizado por compreender os seguintes passos: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial com uma alfa- amilase, uma glucoamilase e uma xilanase GH98 ou uma combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98; (b) fermentação usando um organismo de fermentação para produzir o produto de fermentação; e

(c) opcionalmente, recuperação de um coproduto.

11. Processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado por compreender os passos de: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa- amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) com uma glucoamilase e uma xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98; (c) fermentação usando um organismo fermentador; e (d) opcionalmente, recuperação de um coproduto.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado por a sacarificação e a fermentação serem realizadas simultaneamente.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado por o material contendo amido compreender milho, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, switchgrass, milheto, milheto-pérola, painço.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por o produto de fermentação ser álcool, particularmente etanol, mais particularmente etanol combustível.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado por o coproduto ser grãos secos destilados (DDG) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS).

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado por os DDG ou DDGS terem uma qualidade nutricional melhorada em comparação com DDG ou DDGS recuperados como um coproduto de um processo para produção de um produto de fermentação no qual a xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase

GH98 não está presente ou não é adicionada.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por os DDG ou DDGS terem um teor de gordura aumentado.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado por a energia metabolizável verdadeira dos DGS ou DDGS ser aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%, em comparação com a TME de DGS ou DDGS produzidos quando uma xilanase GH98 ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase GH98 não está presente durante o passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas do processo.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a TME ser para um animal monogástrico.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado por os DGS ou DDGS produzidos não serem escurecidos após secagem em comparação com DGS ou DDGS produzidos quando um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, ou uma combinação de enzimas, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, não está presente durante o passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 19.