MX2012006176A

MX2012006176A - Polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleotidos que codifican los mismos.

Info

Publication number: MX2012006176A
Application number: MX2012006176A
Authority: MX
Inventors: Sara Landvik; Guillermo Coward-Kelly; Marc Dominique Morant; Keiichi Ayabe
Original assignee: Novozymes North America Inc
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-06-25
Also published as: US8557541B2; US9873869B2; CA2782036A1; US20160053245A1; US20120214196A1; WO2011068803A1; EP2507371A1; US9752134B2; CN104169417B; CA2782036C; AU2010276471B2; US20150299681A1; AU2010276471A1; CN111593035A; EP2507371B1; US9102928B2; ES2534067T3; US20130267002A1; DK2507371T3; CN104169417A

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos así como métodos para producir y usar los polipéptidos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE GLUCOAMILASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos así como métodos para producir y usar los polipéptidos, y al uso de glucoamilasas de la invención para conversión de almidón para producir productos de fermentación, tales como etanol, y jarabes, tales como glucosa. La invención también se refiere a una composición que comprende una glucoamilasa de la invención.

Antecedentes de la Invención La glucoamilasa (1, -alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima, que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores de almidón o moléculas de deoligosacáridos y polisacáridos relacionadas. Las glucoamilasas son producidas por varios hongos filamentosos y levaduras, los más comercialmente importantes de los cuales son Aspergillus .

Desde el punto de vista comercial, las glucoamilasas se usan para convertir material de almidón, que Ref. 229795 ya está parcialmente hidrolizado por una alfa-amilasa, a glucosa. La glucosa entonces puede ser convertida directamente o indirectamente a un producto de fermentación mediante el uso de un organismo fermentador. Ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (v.gr., etanol, metanol, butanol, 1, 3-propanodiol) ; ácidos orgánicos (v.gr., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2 , 5-diceto-D-glucónico) ; cetonas (v.gr., acetona); aminoácidos (v.gr., ácido glutámico) ; gases (v.gr., H2 y C02) , y compuestos más complejos, que incluyen, por ejemplo, antibióticos (v.gr., penicilina y tetraciclina) ; enzimas; vitaminas (v.gr., riboflavina, B12, beta-caroteno) ; hormonas, y otros compuestos que son difíciles de producir sintéticamente. Los procesos de fermentación también se usan comúnmente en las industrias de alcohol consumible (v.gr., cerveza y vino) , lácteos (v.gr., en la producción de yogurt y queso) .

El producto final también puede ser un jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa, pero también puede ser convertido, v.gr., por una glucosa isomerasa a fructosa o una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o una mezcla enriquecida adicionalmente con fructosa, es el jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (HFCS) más comúnmente usado comercializado en todo el mundo.

Un objeto de la presente invención es proveer polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y que proveen u alto rendimiento en los procesos de producción de producto de fermentación, tales como procesos de producción de etanol, que incluyen procesos de fermentación de etanol de un paso a partir de material de almidón no gelatinizado (o no cocinado) .

Uniprot : B0CVJ1 describe un polipéptido de Lacearía bicolor y O 2006/069289 describe una glucoamilasa de Trametes cingulata .

Sumario de la Invención Los polipéptidos producidos por el hongo Gloeophyllum y que tienen actividad de glucoamilasa han sido identificados y caracterizados. Muy particularmente, la Gloeophillum sp. se selecciona del grupo que consiste de G. abietinum, G. sepiarium y G. trabeum.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91 %, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad al dominio catalítico mostrado como aminoácidos 19 a 474 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 19 a 471 de SEQ ID NO: 16 o de SEQ ID NO: 18; c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida preferiblemente por lo menos bajo condiciones de astringencia media-alta, y muy preferiblemente todavía por lo menos condiciones de astringencia alta con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO : 17, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO : 17, o (iii) una hebra complementaria de longitud completa de (i) o (ii) ; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad a la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17; y (e) una variante que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ I D NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, O SEQ ID NO: 18.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a un constructo de ácido nucleico, un vector de expresión recombinante , una célula hospedera recombinante , una planta transgénica, una parte de una planta o célula vegetal que comprende el polinucleótido del segundo aspecto.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a un método para producir el polipéptido, usos del polipéptido y una composición que comprende una alfa-amilasa y el polipéptido.

Definiciones Glucoamilasa : El término glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) se define como una enzima, que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores de almidón o moléculas de oligosacárido y polisacárido relacionadas. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de glucoamilasa se determina de conformidad con el procedimiento descrito en la sección de 'Materiales y Métodos' más adelante.

Los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, preferiblemente por lo menos 40%, preferiblemente por lo menos 45%, muy preferiblemente por lo menos 50%, muy preferiblemente por lo menos 55%, muy preferiblemente por lo menos 60%, muy preferiblemente por lo menos 65%, muy preferiblemente por lo menos 70%, muy preferiblemente por lo menos 75%, muy preferiblemente por lo menos 80%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente aún por lo menos 90%, muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 100% de la actividad de glucoamilasa del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 4 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 6 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 8 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 10 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 12 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 14 o una secuencia homologa del mismo, SEQ ID NO: 16 o una secuencia homologa del mismo, o SEQ ID NO: 18 o una secuencia homologa del mismo.

Polipéptido aislado: El término "polipéptido aislado", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que es aislado de una fuente. Preferiblemente, el polipéptido es por lo menos 1 % puro, preferiblemente por lo menos 5% puro, muy preferiblemente por lo menos 10% puro, muy preferiblemente por lo menos 20% puro, muy preferiblemente por lo menos 40% puro, muy preferiblemente por lo menos 60% puro, muy preferiblemente aún por lo menos 80% puro, y muy preferiblemente todavía por lo menos 90% puro, como se determina por SDS-PAGE.

Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido sustancialmente puro" denota aquí un polipéptido preparación que contiene cuando mucho 10%, preferiblemente cuando mucho 8%, muy preferiblemente cuando mucho 6%, muy preferiblemente cuando mucho 5%, muy preferiblemente cuando mucho 4%, muy preferiblemente cuando mucho 3%, muy preferiblemente aún cuando mucho 2%, muy preferiblemente todavía cuando mucho 1%, e incluso muy preferiblemente todavía cuando mucho 0.5% en peso de otro material de polipéptido con el cual está nativamente o recombinantemente asociado. Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea por lo menos 92% puro, preferiblemente por lo menos 94% puro, muy preferiblemente por lo menos 95% puro, muy preferiblemente por lo menos 96% puro, muy preferiblemente por lo menos 96% puro, muy preferiblemente por lo menos 97% puro, muy preferiblemente por lo menos 98% puro, muy preferiblemente aún por lo menos 99%, muy preferiblemente todavía por lo menos 99.5% puro, e incluso muy preferiblemente todavía 100% puro en peso del material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura, es decir, que la preparación del polipéptido sea esencialmente libre de otro material de polipéptido con el cual está nativamente o recombinantemente asociado. Esto se puede lograr, por ejemplo, al preparar el polipéptido por métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación clásicos.

Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de traducción y cualesquiera modificaciones post-traduccionales, tales como procesamiento N-terminal, truncación C-terminal, glicosilación, foaforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 18 a 573 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 18 a 576 de SEQ ID NO: 16, o de SEQ ID NO: 18 con base en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18 son un péptido de señal. La secuencia definida por los aminoácidos 19 a 474 (particularmente 19 a 471) de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 19 a 471 de SEQ ID NO: 16 o de SEQ ID NO: 18 es el dominio catalítico. La secuencia definida por aminoácidos 480 a 573 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 483 a 576 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 es un dominio de unión a almidón.

Secuencia codificante de polipéptido maduro: El término "secuencia codificante de polipéptido maduro" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que codifica a polipéptido maduro que tiene actividad de glucoamilasa . Preferiblemente, la secuencia codificante de polipéptido maduro es nucleótidos 52 a 1719 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, o nucleótidos 52 a 1728 de SEQ ID NO: 15 o de SEQ ID NO: 17.

Identidad: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad".

Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del algoritmo Needleman- unsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son sanción por apertura de espacio de 10, sanción por extensión de espacio de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . El resultado de "identidad más larga" marcada por Needle (obtenida al usar la porción no abreviada) se usa como el por ciento de identidad y se calcula como sigue: (Residuos idénticos x 100) / (longitud de alineación - número total de espacios en alineación) Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina mediante el uso del algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, antes citado) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, antes citado), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son sanción por apertura de espacio de 10, sanción por extensión de espacio de 0.5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4 ) . El resultado de "identidad más larga" marcada por Needle (obtenida al usar la porción no abreviada) se usa como el por ciento de identidad y se calcula como sigue: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/ (longitud de alineación - número total de espacios en alineación) Secuencia homologa: El término "secuencia homologa" se define aquí como una secuencia de nucleótidos/secuencia de polipéptido que tiene un % de identidad al polipéptido maduro que codifica parte de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17 o al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, O SEQ ID NO: 18, respectivamente, de por lo menos 82%, preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o incluso por lo menos 99%.

Fragmento de polipéptido: El término "fragmento de polipéptido" se define aquí como un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos suprimidos del amino-terminal y/o carboxilo-terminal del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; o una secuencia homologa del mismo; en donde el fragmento tiene actividad de glucoamilasa . Preferiblemente, un fragmento contiene por lo menos 500 residuos de aminoácidos, muy preferiblemente por lo menos 450 aminoácido, y muy preferiblemente todavía por lo menos 400 residuos de aminoácidos, del polipéptido maduro de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18, o una secuencia homologa del mismo. Un fragmento particular es la secuencia definida por los aminoácidos 19 a 474 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, o SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 19 a 471 de SEQ ID NO: 16 o de SEQ ID NO: 18 que comprende el dominio catalítico del polipéptido de la invención.

Subsecuencia : El término "subsecuencia" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que tiene uno o más (varios) nucleótidos suprimidos del extremo 5' y/o 3' de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ I D NO : 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17; o una secuencia homologa del mismo; en donde la subsecuencia codifica un fragmento de polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . Preferiblemente, una subsecuencia contiene por lo menos 1500 nucleótidos, muy preferiblemente por lo menos 1400 nucleótidos, y muy preferiblemente todavía por lo menos 1200 nucleótidos de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 o una secuencia homologa del mismo.

Variante alélica: El término "variante alélica" denota aquí cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica se produce en forma natural por mutación, y puede dar por resultado polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Polinucleótido aislado: El término "polinucleótido aislado", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido que es aislado de una fuente. Preferiblemente, el polinucleótido es por lo menos 1% puro, preferiblemente por lo menos 5% puro, muy preferiblemente por lo menos 10% puro, muy preferiblemente por lo menos 20% puro, muy preferiblemente por lo menos 40% puro, muy preferiblemente por lo menos 60% puro, muy preferiblemente aún por lo menos 80% puro, y muy preferiblemente todavía por lo menos 90% puro, como se determina por electroforesis de agarosa.

Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" como se usa en la presente se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para usarse dentro de sistemas de producción de proteíná genéticamente manipulados. Por lo tanto, un polinucleótido sustancialmente puro contiene cuando mucho 10%, preferiblemente cuando mucho 8%, muy preferiblemente cuando mucho 6%, muy preferiblemente cuando mucho 5%, muy preferiblemente cuando mucho 4%, muy preferiblemente cuando mucho 3%, muy preferiblemente aún cuando mucho 2%, muy preferiblemente todavía cuando mucho 1%, e incluso muy preferiblemente todavía cuando mucho 0.5% en peso de otro material de polinucleótido con el cual está nativamente o recombinantemente asociado. Un polinucleótido sustancialmente puro, sin embargo, puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' que ocurren naturalmente, tales como promotores y terminadores . Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea por lo menos 90% puro, preferiblemente por lo menos 92% puro, muy preferiblemente por lo menos 94% puro, muy preferiblemente por lo menos 95% puro, muy preferiblemente por lo menos 96% puro, muy preferiblemente por lo menos 97% puro, muy preferiblemente aún por lo menos 98% puro, muy preferiblemente todavía por lo menos 99%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura, es decir, que la preparación de polinucleótido es esencialmente libre de otro material de polinucleótido con el cual está nativamente o recombinantemente asociado. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, ADNc, AR , semisintético, sintético, o cualesquiera combinaciones de los mismos.

Secuencia codificante: Cuando se usa aquí, el término "secuencia codificante" significa una secuencia de nucleótidos, que directamente especifica la secuencia de aminoácidos de su producto de proteína. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que usualmente empieza con el codón de inicio de ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de detención tal como TAA, TAG, y TGA. La secuencia codificante puede ser una secuencia de nucleótido de ADN, ADNc, sintético o recombinante .

ADNc : El término "ADNc" se define aquí como una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de AR m madura, cortada y empalmada, obtenida de una célula eucariótica. El ADNc carece de secuencias de intrón que usualmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial, es un precursor para ARNm que es procesado a través de una serie de pasos antes de parecer como ARNm cortado y empalmado maduro. Estos pasos incluyen la remoción de secuencias de intrón por un procedimiento llamado corte y empalme. El ADNc derivado de ARNm carece, por lo tanto, de cualesquiera secuencias de intrón.

Constructo de ácido nucleico: El término "constructo de ácido nucleico", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra sencilla o doble hebra, que es aislada de un gen que ocurre naturalmente o que es modificada para contener segmentos de ácido nucleicos de una manera que de otra manera no existiría en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo del término "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

Secuencias de control : El término "secuencias de control" se define aquí para incluir todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de nucleotido que codifica el polipéptido o nativa o extraña una a otra. Esas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido de señal, y terminador de transcripción. A un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención transcripcionales y traduccionales . Las secuencias de control se pueden proveer con enlazadores para el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Operablemente enlazada: El término "operablemente enlazada" denota aquí una configuración en la cual una secuencia de control es colocada en una posición apropiada en relación con la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótido de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido .

Expresión : El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de un polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional , traducción, modificación post-traduccional y secreción.

Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define aquí como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención y está operablemente enlazada a nucleótidos adicionales que proveen su expresión.

Célula hospedera: El término "célula hospedera" significa cualquier tipo de célula que es susceptible a la transformación, transíección, transducción y similares con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención.

Modificación : El término "modificación" significa aquí cualquier modificación química del polipéptido que consiste del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18; o una secuencia homologa del mismo; así como manipulación genética del ADN que codifica el polipéptido. La modificación puede ser una sustitución, una supresión y/o una inserción de uno o más (varios) aminoácidos así como reemplazos de una o más (varias) cadenas laterales de aminoácidos.

Variante : Cuando se usa aquí, el término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o supresión de uno o más (varios) residuos de aminoácidos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una supresión significa remoción de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.

Descripción Detallada de la Invención Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa En un primer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 preferiblemente de por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84% , muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91 %, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad, que tiene actividad de glucoamilasa (de aquí en adelante "polipéptidos homólogos"). Preferiblemente, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por diez aminoácidos, preferiblemente por cinco aminoácidos, muy preferiblemente por cuatro aminoácidos, muy preferiblemente aún por tres aminoácidos, muy preferiblemente todavía por dos aminoácidos, e incluso muy preferiblemente todavía por un aminoácido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.

Un polipéptido de la presente invención preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18 o una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene actividad de glucoamilasa. Preferiblemente, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 18. En otro aspecto preferido, el polipéptido comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 18 o una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene actividad de glucoamilasa . En otro aspecto preferido, el polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18 O una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene actividad de glucoamilasa. En otro aspecto preferido, el polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de glucoamilasa que son codificados por polinucleótidos que " hibridan bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy baja, muy preferiblemente condiciones de astringencia baja, muy preferiblemente condiciones de astringencia media, muy preferiblemente condiciones de astringencia media-alta, muy preferiblemente aún condiciones de astringencia alta, y muy preferiblemente todavía condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, O SEQ ID NO: 17, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) , o (iv) una hebra complementaria de longitud completa de (i) , (ii) o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York) . Una subsecuencia de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17 contiene por lo menos 100 nucleótidos contiguos o preferiblemente por lo menos 200 nucleótidos contiguos. Más aún, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . Preferiblemente, la hebra complementaria es la la hebra complementaria de longitud completa de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17.

La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17; o una subsecuencia de las mismas; así como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; o un fragmento del mismo; se puede usar para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifica polipéptidos que tiene actividad de glucoamilasa a partir de cepas de diferentes géneros o especies de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las sondas se pueden usar para hibridar con el ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, de acuerdo con los procedimientos de Southern blot estándares, a fin de identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Esas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deben ser por lo menos 14, preferiblemente por lo menos 25, muy preferiblemente por lo menos 35, y muy preferiblemente todavía por lo menos 70 nucleótidos de longitud. Sin embargo, se prefiere que la sonda de ácido nucleico sea por lo menos 100 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser por lo menos 200 nucleótidos, preferiblemente por lo menos 300 nucleótidos, muy preferiblemente por lo menos 400 nucleótidos, o muy preferiblemente todavía por lo menos 500 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas aún más largas, v.gr., sondas de ácido nucleico que son preferiblemente de por lo menos 600 nucleótidos, muy preferiblemente por lo menos 700 nucleótidos, muy preferiblemente aún por lo menos 800 nucleótidos o muy preferiblemente todavía por lo menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas son típicamente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 33P, 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . Esas sondas son abarcadas por la presente invención.

Una biblioteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otras cepas, por lo tanto, pueden ser determinadas selectivamente para ADN que híbrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . El ADN genómico u otro ADN de esas otras cepas puede ser separado por electroforesis de gel de agarosa o poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede ser transferido a e inmovilizado sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. A fin de identificar un clon o ADN que es homólogo con SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ I D NO : 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; o una subsecuencia de las mismas; el material de vehículo preferiblemente se usa en un procedimiento de Southern blot .

Para los propósitos de la presente invención, hibridación indica que la secuencia de nucleótidos híbrida a una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17; la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; su hebra complementaria de longitud completa; o una subsecuencia de las mismas; bajo condiciones de astringencia muy baja a muy alta. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico hibrida bajo estas condiciones pueden ser detectadas mediante el uso de, por ejemplo, películas de rayos X.

Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO : 2, o una subsecuencia de la misma. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es SEQ ID NO: 1. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la secuencia de polinucleótido contenida en el plásmido en la cepa DSM 23222 de E. coli, en donde el secuencia de polinucleótido de la misma codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la región codificante de polipéptido maduro contenida en el plásmido en la cepa DSM 23222 de E. coli.

Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18 o una subsecuencia de las mismas. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17.

Para sondas largas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia muy baja a muy alta se definen como prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado, y ya sea formamida al 25% para astringencias muy baja y baja, formamida al 35% para astringencias media y media-alta, o formamida al 50% para astringencias alta y muy alta, de acuerdo con los procedimientos de Southern blot estándares durante 12 a 24 horas de manera óptima.

Para sondas largas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, el material de vehículo es finalmente lavado tres veces cada una durante 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% de SDS preferiblemente a 45°C (astringencia muy baja) , muy preferiblemente a 50 °C (astringencia baja) , muy preferiblemente a 55°C (astringencia media) , muy preferiblemente a 60°C (astringencia media-alta) , muy preferiblemente aún a 65°C (astringencia alta) , y muy preferiblemente todavía a 70°C (astringencia muy alta) .

Para sondas cortas que son aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia se definen como prehibridación, hibridación, y lavado post-hibridación a aproximadamente 5°C a aproximadamente 10°C por abajo de la Tm calculada mediante el uso del cálculo de conformidad con Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, 0.09 M Tris-HCI pH 7.6, EDTA 6 m , NP-40 0.5%, IX solución de Denhardt, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de AR de levadura por mi de acuerdo con los procedimientos de Southern blot estándares durante 12 a 24 horas de manera óptima .

Para sondas cortas que son aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material de vehículo se lava una vez en 6X SCC más SDS 0.1% durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos mediante el uso de 6X SSC a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada .

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tiene actividad de glucoamilasa codificada por polinucleótidos que comprenden o que consisten de secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad a la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17 de por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91 %, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, que codifican un polipéptido activo. Véase sección de polinucleótido en la presente.

La presente invención también se refiere a variantes artificiales que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (o varios) aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 18; o una secuencia homologa del mismo. Preferiblemente, los cambios de aminoácido son de una naturaleza menor, es decir sustituciones o inserciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente el doblamiento y/o actividad de la proteína; supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones pequeñas amino-terminales o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal ; un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilitara la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones conservativas están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos ( fenilalanina, triptofano y tirosina) , y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, LeuA al, Ala/Glu y Asp/Gly.

Además de los 20 aminoácidos estándares, aminoácidos no estándares (tales como 4-hidroxiprolina, 6-/V-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, y alfa-metil serina) pueden sustituir a residuos de aminoácidos de un polipéptido de tipo silvestre. Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no son codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales pueden sustituir a residuos de aminoácidos. "Aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de proteína, y/o tienen una estructura química en su cadena (s) lateral (es) diferente de la de los aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales pueden ser químicamente sintetizados, y preferiblemente, están comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3 , 3 -dimetilprolina .

Alternativamente, los cambios de aminoácido son de naturaleza tal que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácido pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.

Los aminoácidos esenciales en el polipéptido progenitor pueden ser identificados de conformidad con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escudriñamiento de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, mutaciones solo de alanina son introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad de glucoamilasa para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones, o mareaje de fotoafinidad, junto con mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativos. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J". Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett . 309: 59-64. Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas del análisis de identidades con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido de conformidad con la invención .

Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos individuales o múltiples se pueden hacer y probar mediante el uso de métodos de mutagénesis, recombinación y/o transposicione conocidos, seguido por un procedimiento de determinación selectiva relevante, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR sujeta a error, despliegue de fagos (v.gr., Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; patente de E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988 , DNA 7 : 127) .

Los métodos de mutagénesis/transposición se pueden combinar con métodos de determinación selectiva automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados , clonados, expresados por células hospederas (Ness et al., 1999, Wature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden ser recuperadas de las células hospederas y secuenciadas rápidamente mediante el uso de métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura conocida.

El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos del polipéptido maduro, tales como los aminoácidos 18 a 573 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, o los aminoácidos 18 a 576 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18, o el catalítico dominio, tales como los aminoácidos 19 a 474 de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, o los aminoácidos 19 a 471 de SEQ ID NO: 16 o de SEQ ID NO: 18, es 10, preferiblemente 9, muy preferiblemente 8, muy preferiblemente 7, muy preferiblemente cuando mucho 6, muy preferiblemente 5, muy preferiblemente 4, muy preferiblemente aún 3, muy preferiblemente todavía 2, e incluso muy preferiblemente todavía 1.

Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa Un polipéptido de la presente invención se puede obtener de microorganismos de cualquier género. Para los propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" como se usa en la presente en conexión con una fuente dada significará que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos sea producido por la fuente o por un a cepa en la cual la secuencia de nucleótidos de la fuente ha sido insertada. Preferiblemente, el polipéptido obtenido de una fuente dada es secretado extracelularmente .

Un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención también puede ser polipéptido de bacterias o un polipéptido de levadura, o muy preferiblemente un polipéptido de hongo filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Agaricus, Alternaría, Artomyces, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Gloeophyllum, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria que tiene actividad de glucoamilasa .

En un aspecto más preferido, el polipéptido es un polipéptido de Gloeophyllum sp.; tal como un polipéptido de Gloeophyllum sepiariu , Gloeophyllum trabeum o Gloeophyllum abietinum que tiene actividad de glucoamilasa. Se entenderá que par alas especies antes mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfecto como imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, v.gr., anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el cual se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en un número de recolecciones de cultivo, tales como Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .

Además, esos polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados del ambiente natural (v.gr. , suelo, compostas, agua, etc.) mediante el uso de las sondas antes mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales son bien conocidos en la técnica. El polinucleótido entonces se puede obtener al determinar selectivamente de manera similar una biblioteca de ADN genómico o ADNc de ese microorganismo. Una vez que una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido ha sido detectado con la sonda(s), el polinucleótido puede ser aislado o clonado al utilizar técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, v.gr., Sambrook et al., 1989, antes citado) .

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de función escindible en los cuales otro polipéptido es fusionado en el N-terminal o el C-terminal del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido al fusionar una secuencia de nucleótidos (o una porción del mismo) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o a porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de manera que están en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado está bajo control del mismo promotor (s) y terminador.

Un polipéptido de fusión además puede comprender un sitio de escición. Al secretar la proteína de fusión, el sitio es escindido para liberar el polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la proteína de fusión. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a, un sitio Kex2 que codifica el dipéptido Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-76; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen- ilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381 ), un sitio lie- (Glu o Asp) -Gly-Arg, que es escindido por una Factor Xa proteasa después del residuo de arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512) ; un sitio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys , que es escindido por una enterocinasa después de la lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); un sitio His-Tyr-Glu o sitio His-Tyr-Asp, que es escindido por Genenasa I (Cárter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248) ; un sitio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Se , que es escindido por trombina después de la Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48); un sitio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que es escindido por TEV proteasa después de la Gln (Stevens, 2003, antes citado) ; y un sitio Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que es escindido por una forma genéticamente manipulada de rinovirus 3C proteasa humana después de la Gln (Stevens, 2003, antes citado).

Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de la presente invención.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste de la secuencia contenida en plásmido que está contenido en E. coli DSM 23222. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto más preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste de la secuencia codificante de polipéptido maduro contenida en plásmido contenido en E. coli DSM 23222. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o consisten de la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO; 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18 o los polipéptidos maduros de los mismos, que difieren de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17 o la secuencia codificante de polipéptido maduro de los mismos en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17 que codifica fragmentos de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 18 que tienen actividad de glucoamilasa .

La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprenden o consisten de por lo menos una mutación en la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17, en la cual la secuencia de nucleótidos mutante codifica el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.

Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación a partir de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención a partir de ese ADN genómico se puede efectuar, v.gr., mediante el uso de la bien conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o determinación selectiva de anticuerpo de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, v.gr., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como reacción en cadena de ligasa (LCR) , transcripción activada ligada (LAT) y amplificación a base de secuencia de nucleótidos (NASBA) se pueden usar. Los polinucleótidos puede clonarse a partir de una cepa de Penicillium, u otro organismo o uno relacionado y por lo tanto, por ejemplo, pueden ser una variante alélica o de especies de la región codificante de polipéptido de la secuencia de nucleótidos.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o que consisten de secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad a la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17 preferiblemente de por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad, que codifican un polipéptido activo .

Modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similar al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido que no ocurren naturalmente. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna forma de diseño del polipéptido aislado de su fuente nativa, v.gr., variantes artificiales que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, o similares. La secuencia de la variante puede ser construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos presentada como la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, O SEQ ID NO: 17, v.gr., una subsecuencia de las mismas, y/o por introducción de sustituciones de nucleótido que no dan origen a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponden al uso de codón del organismo hospedero destinado para la producción de la enzima, o mediante la introducción de sustituciones de nucleótido que puede dar origen a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de sustitución de nucleótido, véase, v.gr., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Será evidente para los expertos en la técnica que esas sustituciones se pueden hacer fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y sin embargo dan por resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, y por lo tanto preferiblemente no sujetos a sustitución, pueden ser identificados de conformidad con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escudriñamiento de alanina (véase, v.gr., Cunningham y Wells, 1989, antes citado) . En la última técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad de glucoamilasa para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción sustrato-enzima también se pueden determinar por análisis de la estructura tridimensional como se determina por técnicas tales como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o mareaje de fotoafinidad (véase, v.gr., de Vos et al., 1992, antes citado; Smith et al., 1992, antes citado; Wlodaver et al., 1992, antes citado).

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de la presente invención que hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, preferiblemente condiciones de astringencia baja, muy preferiblemente condiciones de astringencia media muy preferiblemente condiciones de astringencia media-alta, muy preferiblemente aún condiciones de astringencia alta, y muy preferiblemente todavía condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO : 17, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO : 17, o (Üi) una hebra complementaria de longitud completa de (i) o (ii) ; o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al., 1989, antes citado), como se define en la presente. Preferiblemente, la hebra complementaria es la hebra complementaria de longitud completa de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados obtenidos al (a) hibridar una población de ADN bajo condiciones de astringencia muy baja, baja, media, media-alta, alta o muy alta con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO : 17, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17, o (iii) una hebra complementaria de longitud completa de (i) o (ii) ,- y (b) aislar el polinucleót ido hibridante, que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . Preferiblemente, la hebra complementaria es la hebra complementaria de longitud completa de la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 O SEQ ID NO: 17.

Enzimas híbridas La presente invención también se refiere a enzimas híbridas que comprenden un dominio catalítico que tiene actividad de enzima (v.gr., actividad de enzima degradadora de almidón, tal como actividad de alfa-amilasa, amilopululanasa, beta-amilasa, CGTasa, glucoamilasa, isoamilasa, amilasa maltogénica o pululanasa) , y un módulo de unión a carbohidrato (CBM) . La enzima híbrida además puede comprender un enlazador.

El híbrido puede ser producido al fusionar una primera secuencia de ADN que codifica un dominio catalítico y una segunda secuencia de ADN que codifica un módulo de unión a carbohidrato, o el híbrido puede ser producido como un gen completamente sintético con base en el conocimiento de las secuencias de aminoácidos de CBMs adecuados, enlazadores y dominio catalíticos.

El término "enzima híbrida" (también referida como "proteína de fusión", "híbrido", polipéptido híbrido" o "proteína híbrida") se usa aquí para caracterizar los polipéptidos híbridos de la invención que comprenden un módulo catalítico que tiene actividad de enzima (v.gr., actividad de degradadora de almidón, tal como actividad de alfa-amilasa, amilopululanasa, beta-amilasa, CGTasa, glucoamilasa, isoamilasa, amilasa maltogénica o pululanasa) y un módulo de unión a carbohidrato en donde el dominio catalítico y el módulo de unión a carbohidrato se derivan de diferentes fuentes. El término "fuente" incluye, pero no se limita a, una enzima progenitora o una variante de la misma, v.gr., una amilasa o glucoamilasa, u otra actividad catalítica que comprende un módulo catalítico adecuado y/o un CBM adecuado y/o u enlazador adecuado. Sin embargo, el CBM también se puede derivar de un polipéptido que no tiene actividad catalítica. El dominio catalítico y el módulo de unión a carbohidrato se pueden derivar de la misma cepa microbiana, de cepas dentro de la misma especie, de especies estrechamente relacionadas u organismos menos relacionados. Preferiblemente, el dominio catalítico y el módulo de unión a carbohidrato de los híbridos se derivan de diferentes fuentes, v.gr., de diferentes enzimas de la misma cepa y/o especie, o v.gr., de cepas dentro de diferentes especies.

En un aspecto, la enzima híbrida comprende el CBM (también conocido como un dominio de unión a carbohidrato o CBD) de conformidad con la invención y un dominio catalítico. El dominio catalítico es en una modalidad particular un dominio catalítico de glucoamilasa .

Constructos de ácido nucleico La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleicos que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención operablemente enlazado a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedera adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulado en una variedad de formas para proveer la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polisecuencias de nucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica .

La secuencia de control puede ser una secuencia de promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula hospedera para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia de promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera de elección con la inclusión de promotores imitantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterologos a la célula hospedera.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera de hongo filamentoso son promotores obtenidos de los genes para alíaamilasa naturales de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable al ácido de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus awamori o Aspergillus niger, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidas de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Daría (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) , proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), proteinasa aspártica de Rhizo ucor miehei, lipasa de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae) ; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos .

En un hospedero de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) , y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospederas de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de terminador de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula hospedera para terminar la transcripción. La secuencia de terminador está operablemente enlazada al extremo terminal 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula hospedera de elección se puede usar en la presente invención.

Los terminadores preferidos para células hospederas de hongos filamentosos se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células hospederas de levadura se describen por Romanos et al., 1992, antes citado.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de líder adecuada, una región no traducida de un AR m que es importante para traducción por la célula hospedera. La secuencia de líder es operablemente enlazada al extremo terminal 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia de líder que es funcional en la célula hospedera de elección se puede usar en la presente invención.

Los líderes preferidos para células hospederas de hongos filamentosos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Los líderes adecuados para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3 - fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) .

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operablemente enlazada al extremo terminal 3' de la secuencia de nucleótidos y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedera como una señal para añadir residuos de poliadenosina a AR m transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula hospedera de elección se puede usar en la presente invención.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospederas de hongos filamentosos se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospederas de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de péptido de señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al amino terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener inherentemente una secuencia codificante de péptido de señal naturalmente enlazada en marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de péptido de señal que es extraña a la secuencia codificante. La secuencia codificante de péptido de señal extraña puede ser requerida donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una secuencia codificante de péptido de señal. Alternativamente, la secuencia codificante de péptido de señal extraña simplemente puede reemplazar la secuencia codificante de péptido de señal natural a fin de incrementar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier secuencia codificante de péptido de señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula hospedera de elección, es decir, secretado en un medio de cultivo, se puede usar en la presente invención.

Las secuencias codificantes de péptido de señal efectivas para células hospederas de hongos filamentosos son las secuencias codificantes de péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteasa aspártica de Rhizomucor iehei.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula hospedera. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan la expresión del gen que ha de ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac, xyl y trp. En levadura, se puede usar el sistema ADH2 o sistema GAL1. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa , promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y de promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden usar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En sistemas eucarióticos , estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido sería operablemente enlazada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de detención de transcripción y traducción. Los diversos ácido nucleicos y secuencias de control descritos aquí puede ser unidos entre sí para producir un vector de expresión recombinante que pueda incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en esos sitios. Alternativamente, una secuencia de polinucleótido de la presente invención puede ser expresada al insertar la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante es operablemente enlazada con las secuencias de control apropiadas para expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (v.gr., un plásmido o virus) que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinantes y puede llevar a cabo la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual el vector ha de ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o plásmidos circulares cerrados .

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de replicación cromosómica , v.gr., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en la célula hospedera, es integrado en el genoma y replicado junto con el cromosoma (s) en el cual ha sido integrado. Además, se puede usar un vector o plásmido individual o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que ha de ser introducido en el genoma de la célula hospedera, o un transposón.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas , transducidas , o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto provee resistencia a biocidas o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos y similares.

Los marcadores seleccionables para usarse en una célula hospedera de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar ( fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa) (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-decarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) , y trpC (antranilato sintasa) , así como equivalentes de las mismas. Preferidos para usarse en una célula de Aspergillus son los genes de amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen de bar de Streptomyces hygroscopicus .

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento (s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula hospedera o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para integración al genoma de la célula hospedera, el vector se puede basar en la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración al genoma por recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en un lugar (es) preciso (s) en el cromosoma (s) . Para incrementar la probabilidad de integración en el lugar preciso, los elementos preferiblemente deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10,000 pares de base, preferiblemente 400 a 10,000 pares de bases, y muy preferiblemente todavía 800 a 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad a la secuencia objetivo correspondiente para incrementar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homologas con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula hospedera por recombinación no homologa.

Para replicación autónoma, el vector además puede comprender un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier plásmido replicador que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMAl y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleico Acids Research 15: 9163-9175; O 00/24883). El aislamiento del gen de AMAl y construcción de plásmidos o vectores que comprende el gen se puede lograr de conformidad con los métodos descritos en WO 00/24883.

Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención puede ser insertada en una célula hospedera para incrementar la producción del producto de gen. Un incremento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener al integrar por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o al incluir un gen de marcador selecciónatele amplificable con el polinucleótido en donde las células que contienen copias amplificadas del gen de marcador seleccionable , y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar al cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la técnica (véase, v.gr., Sambrook et al., 1989, antes citado).

Células hospederas La presente invención también se refiere a células hospederas recombinantes, que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención, que se usan ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos . Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención es introducido en una célula hospedera por lo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico auto-replicable como se describió en un principio. El término "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedera dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, v.gr., un procariota o un eucariota.

La célula hospedera procariótica puede ser cualquier bacteria grampositiva o bacteria gramnegativa . Las bacterias Grampositivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces . Las bacterias Gramnegativas incluyen, pero no se limitan a, E. coli, Campylobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.

La célula hospedera también puede ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo.

Preferiblemente, la célula hospedera es una célula fúngica. "Fungi" (hongos) , como se usa en la presente, incluye los phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se define en Hawksworth et al, en, Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungí, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, R.U.) así como el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, antes citado, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, antes citado).

En un aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo es una célula de levadura. "Levadura", como se usa en la presente, incluye levadura ascoesporogena (Endomycetales) , levadura basidioesporógena, y levadura que pertenece a los hongos imperfectos (Blastomycetes) . Puesto que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc . App. Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980) .

En un aspecto aún más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

En un aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo es una célula de hongo filamentoso. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define en Hawksworth et al, 1995, antes citado) . Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosán, manan, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo del carbono es obligadamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

En un aspecto aún más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

En un aspecto todavía más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queensiandicum, Chrysosporium tropicu , Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii , Thielavia terrestris, Trametes versicolor, Trametes villosa, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

Las células de hongos pueden ser transformadas por un proceso que implica formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida como tal. Los procedimientos adecuados para transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 0238023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada mediante el uso de los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194: 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, JOurnal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo silvestre produce el polipéptido, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la célula es del género Gloeophyllum. En un aspecto mas preferido, la célula es de la especie Gloeophyllum sepiarium, Gloeophyllum trabeum o Gloeophyllum abietinum.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula hospedera recombinante , como se describe en la presente, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido .

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula hospedera recombinante bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido, en donde la célula hospedera comprende una secuencia de nucleótidos mutante que tiene por lo menos una mutación en la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO: 17, en donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica un polipéptido que comprende o consiste del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 18, y (b) recuperar el polipéptido .

En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción del polipéptido mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en matraz de agitación, y fermentación a escala pequeña y gran escala (que incluyen fermentaciones continua, intermitente, intermitente con alimentación o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de conformidad con composiciones publicadas (v.gr., en catálogos del American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en el medio de nutrientes, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado al medio, puede ser recuperado de lisados de células.

Los polipéptidos pueden ser detectados mediante el uso de métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos . Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto de enzima, o desaparición de un sustrato de enzima. Por ejemplo, una prueba de enzima se puede usar para determinar la actividad del polipéptido como se describe aquí .

El polipéptido resultante puede ser recuperado mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio de nutrientes por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipi ación .

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a, cromatografía (v.gr. , intercambio de iones, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque , y exclusión de tamaño) , procedimientos electroforáticos (v.gr. , enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (v.gr., precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, v.gr., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

Plantas La presente invención también se refiere a plantas, v.gr., una planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal, que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido puede ser recuperado de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante se puede usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o material alimenticio, v.gr., mejorar el valor nutricional, palatabilidad y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo .

La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot.) o monocotiledónea (una monocot . ) . Ejemplos de plantas monocotiledóneas son pastos, tales como pasto de pradera (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como Festuca, Lolium, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, v.gr., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.

Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosas, tales como lupinos, papa, remolacha azucarera, guisante, frijol y soya, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo de modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana .

Ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hojas, raíz, frutas, semillas y tubérculos así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, v.gr., epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los compartimientos de células vegetales específicos, tales como cloroplastos , apoplastos, mitocondrias , vacuolas, peroxisomas y citoplasma también se considera que son una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea su origen de tejido, se considera que es una parte de la planta. Asimismo, las partes de la planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran parte de la planta, v.gr., embriones, endospermos, aleurona y cubiertas de la semilla.

También dentro del alcance de la presente invención se incluye la progenie de esas plantas, partes de la planta, y células vegetales.

La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir de conformidad con métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o parte de la planta se construye al incorporar uno o más (varios) constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma hospedero de la planta o genoma de cloroplasto y al propagar la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta o célula vegetal transgénica .

El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención operablemente enlazado con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células hospederas en las cuales el constructo de expresión ha sido integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (la última depende del método de introducción de ADN que se ha de usar) .

La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y terminador y opcionalmente secuencias de señal o tránsito se determina, por ejemplo, sobre la base de cuándo, dónde y cómo se desea expresar el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gene que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutivo o inducible, o puede ser específico de desarrollo, estadio o tejido, y el producto de gen puede ser dirigido a tejido específico o parte de la planta específica tal como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para expresión constitutiva, se puede usar el 35S-CaMV, la ubiquitina 1 de maíz, y el promotor de actina 1 de arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo . Biol . 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165) . Los promotores específicos de órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos consumidores de almacenamiento tal como semillas, tubérculos de papa y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o de tejidos consumidores metabólicos tales como meristemos (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878) , un promotor específico de semillas tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo oleoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, v.gr., como se describe en O 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor de gen de adenina metiltransferasa de virus de clórela (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor de gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de papa (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducida por sustancias exógenamente aplicadas que activan el promotor, v.gr., etanol, estrégenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico, y ácido giberélico, y metales pesados .

Un elemento incrementador de promotor también se puede usar para lograr expresión más alta de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento incrementador de promotor puede ser un intrón que se coloque entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, antes citado, describe el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para incrementar la expresión.

El gen de marcador seleccionable y cualesquiera otras partes del constructo de expresión se pueden escoger de aquellos disponibles en la técnica.

El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de conformidad con técnicas convencionales conocidas en el campo, que incluyen transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Actualmente, la transferencia de gen mediada por Agrojacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort , 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y también se puede usar para transformar monocotiledóneas , aunque a menudo se usan otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno revestidas con el ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplasto como lo describe Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Después de la transformación, los transformantes que tienen incorporado el constructo de expresión son seleccionados y regenerados en plantas enteras de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica. A menudo, el procedimiento de transformación está diseñado para la eliminación selectiva de genes de selección ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones al usar, por ejemplo, la co-transformación con dos constructos de T-ADN separados o excisión específica del sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención que comprenden: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones son enriquecidas en un polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad de glucoamilasa de la composición ha sido incrementado, v.gr., con un factor de enriquecimiento de por lo menos 1.1.

La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el principal componente enzimático, v.gr., una composición de monocomponente . Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas , tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa , beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa. La enzima (s) adicional puede ser producida, por ejemplo, por un microorganismo que pertenece al género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awa ori , Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, preferiblemente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, preferiblemente Humicola insolens o Humicola lanuginosa] o Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

Las composiciones de polipéptido se pueden preparar de conformidad con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que ha de ser incluido en la composición puede ser estabilizado de conformidad con métodos conocidos en la técnica.

Más adelante se dan ejemplos de usos preferidos de composiciones de polipéptido de la invención. La dosis de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición se pueden determinar con base en métodos conocidos en la técnica.

Combinación de glucoamilasa y alfa-amilasa acida De conformidad con este aspecto de la invención, una glucoamilasa de la invención se puede combinar con una alfa-amilasa, preferiblemente alfa-amilasa ácida en una relación de entre 0.3 y 5.0 AFAU/AGU. Muy preferiblemente, la relación entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa es por lo menos 0.35, por lo menos 0.40, por lo menos 0.50, por lo menos 0.60, por lo menos 0.7, por lo menos 0.8, por lo menos 0.9, por lo menos 1.0, por lo menos 1.1, por lo menos 1.2, por lo menos 1.3, por lo menos 1.4, por lo menos 1.5, por lo menos 1.6, por lo menos 1.7, por lo menos 1.8, por lo menos 1 .85, o incluso por lo menos 1.9 AFAU/AGU. Sin embargo, la relación entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa debe ser preferiblemente menor que 4.5, menor que 4.0, menor que 3.5, menor que 3.0, menor que 2.5 o incluso menor que 2.25 AFAU/AGU. En AUU/AGI , las actividades de alfa-amilasa ácida y glucoamilasa están presentes preferiblemente en una relación de entre 0.4 y 6.5 AUU/AGI. Muy preferiblemente la relación entre actividad de alfa-amilasa ácida and actividad de glucoamilasa es por lo menos 0.45, por lo menos 0.50, por lo menos 0.60, por lo menos 0.7, por lo menos 0.8, por lo menos 0.9, por lo menos 1.0, por lo menos 1.1, por lo menos 1.2, por lo menos 1.3, por lo menos 1.4, por lo menos 1.5, por lo menos 1.6, por lo menos 1.7, por lo menos 1.8, por lo menos 1.9, por lo menos 2.0, por lo menos 2.1, por lo menos 2.2, por lo menos 2.3, por lo menos 2.4, o incluso por lo menos 2.5 AUU/AGI. Sin embargo, la relación entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa es preferiblemente menor que 6.0, menor que 5.5, menor que 4.5, menor que 4.0, menor que 3.5, o incluso menor que 3.0 AUU/AGI .

La composición anterior es adecuada para usarse en un proceso de conversión de almidón mencionado más adelante para producir jarabe y productos de fermentación, tales como etanol .

Usos La presente invención también está dirigida a procesos/métodos para usar los polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de la invención.

Usos de conformidad con la invención incluyen la conversión de almidón a, v.gr., jarabe y productos de fermentación, que incluyen etanol y bebidas. Ejemplos de procesos en donde se puede usar una glucoamilasa de la invención incluyen aquellos descritos en los documentos WO 92/20777, WO 03/066816, WO 03/066826, WO 2004/080923 y WO 2004/081193, todos los cuales se incorporan aquí por referencia .

Producción de productos de fermentación Proceso para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón gelatinizado En este aspecto la presente invención se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, el proceso incluye un paso de licuefacción y pasos de sacarificación y fermentación realizados secuencialmente o simultáneamente .

La invención se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón que comprende los pasos de : (a) licuar material que contiene almidón; preferiblemente mediante el uso de una alfa-amilasa; (b) sacarificar el material licuado obtenido en el paso (a) mediante el uso de una glucoamilasa de la invención; y (c) fermentar el material sacarificado mediante el uso de un organismo termentador.

El producto de fermentación, tal como especialmente etanol, puede ser opcionalmente recuperado después de la fermentación, v.gr . , por destilación. Los materiales que contienen almidón adecuados se listan en la sección "materiales que contienen almidón" - más adelante. Las enzimas contempladas se listan en la sección de "Enzimas" -más adelante. La licuefacción preferiblemente se lleva a cabo en presencia de una alfa-amilasa . La fermentación preferiblemente se lleva a cabo en presencia de levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces . Los organismos termentadores adecuados se listan en la sección "Organismos fermentadores" - más adelante. En modalidades preferidas, los pasos (b) y (c) se llevan a cabo secuencialmente o simultáneamente (es decir, como proceso SSF) .

En una modalidad particular, el proceso de la invención además comprende, antes del paso (a), los pasos de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente mediante molienda; y y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

La suspensión acuosa puede contener de 10-40% en peso, preferiblemente 25-35% en peso material que contiene almidón. La suspensión se calienta a una temperatura por arriba de la temperatura de gelatinización y alfa-amilasa, preferiblemente alfa-amilasa bacteriana y/o fúngica ácida, puede ser añadida para iniciar la licuefacción (adelgazamiento) . En una modalidad la suspensión puede ser cocinada a chorro para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes de ser sometida a una alfa-amilasa en el paso (a) de la invención.

De manera más específica, la licuefacción se puede llevar a cabo como un proceso de suspensión en caliente de tres pasos. La suspensión se calienta a una temperatura entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y la alfa-amilasa se añade para iniciar la licuefacción (adelgazamiento) . Entonces, la suspensión puede ser cocinada a chorro a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, durante 1-15 minutos, preferiblemente durante 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. La suspensión se enfría a 60-95°C y se añade más alfa-amilasa para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria) . El proceso de licuefacción usualmente se lleva a cabo a pH 4.5-6.5, en particular a un pH entre 5 y 6. Los granos enteros molidos y licuados se conocen como malta.

La sacarificación en el paso (b) se puede llevar a cabo mediante el uso de condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completa puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es común hacer sólo una pre-sacarificación típicamente de 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C, típicamente aproximadamente 60°C, seguido por sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso SSF) . La sacarificación típicamente se lleva a cabo a temperaturas de 30-65°C, típicamente de alrededor de 60°C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4.5.

El proceso más ampliamente usado en producto de fermentación, especialmente etanol, la producción es el proceso de sacarificación y fermentación (SSF) simultáneas, en el cual no hay etapa de mantenimiento para la sacarificación, lo que significa que el organismo termentador, tal como levadura, y la enzima (s) se pueden ser añadir juntos. SSF típicamente se puede llevar a cabo a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 29°C y 35°C, tal como entre 30°C y 34°C, tal como de alrededor de 32°C.

De conformidad con la invención, la temperatura se puede ajustar ascendentemente o descendentemente durante la fermentación .

De conformidad con la presente invención, el paso de fermentación (c) incluye, sin limitación, procesos de fermentación usados para producir alcoholes (v.gr., etanol, metanol, butanol) ; ácidos orgánicos (v.gr., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico) ; cetonas (v.gr., acetona); aminoácidos (v.gr., ácido glutámico) ; gases (v.gr., H2 y C02) ; antibióticos (v.gr., penicilina y tetraciclina) ; enzimas; vitaminas (v.gr., riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas.

Los procesos de fermentación preferidos incluyen procesos de fermentación de alcohol, como se conocen en la técnica. Los procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación anaeróbicos, como se conocen bien en la técnica .

Procesos para producir productos de fermentación a partir de un material que contiene almidón gelatinizado En este aspecto, la invención se refiere a procesos para producir un producto de fermentación de material que contiene almidón sin gelatinización del material que contiene almidón (es decir, material no cocido que contiene almidón) . En una modalidad, sólo una glucoamilasa de la invención se usa durante la sacarificación y fermentación. De conformidad con la invención, el producto de fermentación deseado, tal como etanol, se puede producir sin licuar la suspensión acuosa que contiene el material que contiene almidón. En una modalidad, un proceso de la invención incluye sacarificar (moler) material que contiene almidón, v.gr., almidón granulado, por debajo de la temperatura de gelatinización en presencia de una glucoamilasa de la invención para producir azúcares que pueden ser fermentados en el producto de fermentación deseado por un organismo termentador adecuado.

Por consiguiente, en este aspecto, la invención se refiere a un proceso para producir a producto de fermentación de material que contiene almidón que comprende : (a) sacarificar material que contiene almidón con una glucoamilasa madura de conformidad con la invención, que tiene preferiblemente la secuencia mostrada como los aminoácidos 18 a 573 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 18 a 576 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18, o una glucoamilasa que tiene por lo menos 82% de identidad a la misma, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón, (b) fermentar mediante el uso de un organismo termentador.

Los pasos (a) y (b) del proceso de la invención se puede llevar a cabo secuencialmente o simultáneamente. En una modalidad, una suspensión que comprende agua y material que contiene almidón se prepara antes del paso (a) .

El proceso de fermentación se puede llevar a cabo durante un período de 1 a 250 horas, preferiblemente es de 25 a 190 horas, muy preferiblemente de 30 a 180 horas, muy preferiblemente de 40 a 170 horas, muy preferiblemente aún de 50 a 160 horas, muy preferiblemente aún de 60 a 150 horas, incluso muy preferiblemente aún de 70 a 140 horas, y muy preferiblemente todavía de 80 a 130 horas.

El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la cual la gelatinización del almidón comienza. El almidón calentado en agua empieza a gelatinizarse entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico, y puede ser fácilmente determinado por el experto en la técnica. Por lo tanto, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de conformidad con la especie vegetal, a la variedad particular de la especie vegetal así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material dado que contiene almidón es la temperatura a la cual la birefringencia se pierde en 5% de los gránulos de almidón mediante el uso del método descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Stárke 44 (12) : 461-466 (1992).

Antes del paso (a) , se puede preparar una suspensión de material que contiene almidón, tal como granular almidón, que tiene 10-55% en peso de sólidos secos, preferiblemente 25-40% en peso de sólidos secos, muy preferiblemente 30-35% en peso de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o agua de proceso, tal como residuos de destilado (líquido no alcohólico) , agua del depurador, condensado del evaporador o destilado, agua del separador lateral de la destilación, u otra agua de proceso de planta de producto de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se lleva a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización y por lo tanto no tiene lugar un incremento de viscosidad significativo, altos niveles de residuo de destilación se pueden usar si se desea. En una modalidad, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% en volumen de residuo de destilación, preferiblemente 15-60% en volumen de residuo de destilación, especialmente de aproximadamente 30 a 50% en volumen de residuo de destilación.

El material que contiene almidón se puede preparar al reducir el tamaño de partícula, preferiblemente por molienda en seco o en húmedo, a 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm. Después de someterse a un proceso de la invención, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o preferiblemente por lo menos 99% de los sólidos secos del material que contiene almidón es convertido a un hidrolizado de almidón soluble.

El proceso de la invención es conducido a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Preferiblemente, la temperatura a la cual el paso (a) se lleva a cabo es entre 30-75°C, preferiblemente entre 45-60°C.

En una modalidad preferida, el paso (a) y el paso (b) se llevan a cabo como un proceso de sacarificación y fermentación secuenciales o simultáneas. En esa modalidad preferida, el proceso es típicamente llevado a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 29°C y 35°C, tal como entre 30 °C y 34 °C, tal como de alrededor de 32 °C. De conformidad con la invención, la temperatura puede ser ajustada ascendentemente o descendentemente durante fermentación.

En una modalidad, la sacarificación y fermentación simultáneas se llevan a cabo de manera que el nivel de azúcar, tal como nivel de glucosa, se mantenga a un nivel bajo tal como por abajo de 6% en peso, preferiblemente por abajo de aproximadamente 3% en peso, preferiblemente por abajo de aproximadamente 2% en peso, más preferido por abajo de aproximadamente 1% en peso, aún más preferido por abajo de aproximadamente 0.5% en peso, o incluso más preferido 0.25% en peso, tal como por abajo de aproximadamente 0.1% en peso. Esos niveles bajos de azúcar se pueden lograr al utilizar simplemente cantidades ajustadas de enzima y organismo termentador. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué cantidades de enzima y organismo termentador usar. Las cantidades utilizadas de enzima y organismo termentador también se pueden seleccionar para mantener concentraciones bajas de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener por abajo de aproximadamente 0.5% en peso o por abajo de aproximadamente 0.2% en peso.

El proceso de la invención se puede llevar a cabo a un pH en el intervalo entre 3 y 7, preferiblemente de pH 3.5 a 6, o muy preferiblemente de pH 4 a 5.

Materiales que contienen almidón Cualquier material de partida que contiene almidón adecuado, que incluye almidón granulado, se puede usar de conformidad con la presente invención. El material de partida es generalmente seleccionado con base en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de materiales que contienen almidón, adecuados para usarse en un proceso de la presente invención, incluyen tubérculos, raíces, tallos, granos enteros, granos de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, mijo, sago, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, frijoles o camotes, o mezclas de los mismos, o cereales, materias primas que contienen azúcar, tales como melasas, materiales de frutas, caña de azúcar o remolacha azucarera, papas y materiales que contienen celulosa, tales como madera o residuos de plantas, o mezclas de los mismos. Se contemplan los tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada.

El término "almidón granulado" significa almidón no cocido en bruto, es decir, almidón en su forma natural encontrada en cereales, tubérculos o granos. El almidón se forma dentro de las células vegetales como gránulos delgados insolubles en agua. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos de almidón pueden absorber una pequeña cantidad del líquido e hincharse. A temperaturas de hasta 50°C a 75°C, la hinchazón puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas, empieza una hinchazón irreversible llamada "gelatinización" . El almidón granulado que ha de ser procesado puede ser una calidad de almidón altamente refinado, preferiblemente por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97% o por lo menos 99.5% puro o puede ser un material que contiene almidón más crudo, que comprende grano entero molido que incluye fracciones que no son almidón tales como residuos de germen y fibras. El material de partida, tal como grano entero, se muele para abrir la estructura y permitir el procesamiento posterior. Dos procesos de molienda son preferidos de conformidad con la invención: molienda en húmedo y en seco. En la molienda en seco, granos enteros son molidos y usados. La molienda en húmedo da una buena separación del germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y a menudo se aplica en lugares en donde el hidrolizado de almidón se usa en la producción de jarabes. Tanto la molienda en seco como la molienda en húmedo son bien conocidas en la técnica de procesamiento de almidón y se contempla igualmente para el proceso de la invención.

El material que contiene almidón es reducido en tamaño de partícula, preferiblemente por molienda en seco o en húmedo, a fin de exponer más área de superficie. En una modalidad, el tamaño de partícula es entre 0.05 y 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm, o de modo que por lo menos 30%, preferiblemente por lo menos 50%, muy preferiblemente por lo menos 70%, muy preferiblemente aún por lo menos 90% del material que contiene almidón quepa a través de un tamiz con una malla de 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente una malla de 0.1-0.5 mm.

Productos de fermentación El término "producto de fermentación" significa un producto producido por un proceso que incluye un paso de fermentación mediante el uso de un organismo termentador. Los productos de fermentación contemplados de conformidad con la invención incluyen alcoholes (v.gr., etanol, metanol, butanol) ; ácidos orgánicos (v.gr., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico) ; cetonas (v.gr., acetona); aminoácidos (v.gr., ácido glutámico) ; gases (v.gr., H2 y C02) ; antibióticos (v.gr., penicilina y tetraciclina) ; enzimas; vitaminas (v.gr., riboflavina, B12, beta-caroteno); hormonas. En una modalidad preferida, el producto de fermentación es etanol, v.gr., etanol de combustible; etanol para beber, es decir, espíritus neutros potables; o etanol industrial o productos usados en la industria de alcohol consumible (v.gr., cerveza y vino), industria de lácteos (v.gr., productos lácteos fermentados), industria de la piel e industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malta, happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza ligera. Los procesos de fermentación preferidos usados incluyen procesos de fermentación de alcohol, como se conocen bien en la técnica. Los procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación anaeróbicos, como se conocen bien en la técnica.

Organismos fermentadores "Organismo termentador" se refiere a cualquier organismo, que incluye organismos bacterianos o fúngicos, adecuados para usarse en un proceso de fermentación y capaces de producir un producto de fermentación deseado. Los organismos termentadores especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directamente o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos termentadores incluyen organismos fúngicos, tales como levadura. Las levaduras preferidas incluyen cepas de Saccharomyces spp. , en particular, Saccharomyces cerevisiae. La levadura comercialmente disponible incluye, v.gr., Red Star™/Lesaffre Ethanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre , E.U.A.) FALI (disponible de Fleischmann' s Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., E.U.A. ), SUPERSTART (disponible de Alltech) , GERT STRADN (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties) .

Enzimas Glucoamilasa La glucoamilasa es preferiblemente una glucoamilasa de la invención. Sin embargo, como se mencionó antes, una glucoamilasa de la invención también se puede combinar con otras glucoamilasas . El término "glucoamilasa" (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa , EC 3.2.1.3) es una enzima, que cataliza la liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores de almidón o moléculas de oligosacáridos y polisacáridos relacionadas.

La glucoamilasa se puede añadir en una cantidad de 0.001 a 10 AGU/g DS, preferiblemente de 0.01 a 5 AGU/g DS, tal como de alrededor de 0.1, 0.3, 0.5, 1 ó 2 AGU/g DS, especialmente 0.1 a 0.5 AGU/g DS o 0.02-20 AGU/g DS, preferiblemente 0.1-10 AGU/g DS .

Alfa-Amilasa La alfa-amilasa, de conformidad con la invención, puede ser de cualquier origen. Son preferidas de alfa-amilasas de origen fúngico o bacteriano.

En una modalidad preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, v.gr., alfa-amilasa ácida fúngiva o alfa-amilasa ácida bacteriana. El término "al a-amilasa ácida" significa una alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) que se añade en una cantidad efectiva tiene actividad óptima a un pH en el intervalo de 3 a 7, preferiblemente de 3.5 a 6, o muy preferiblemente de 4-5.

Alfa-amilasas bacterianas De conformidad con la invención, una alfa-amilasa bacteriana preferiblemente se puede derivar del género Bacillus .

En una modalidad preferida, la alfa-amilasa de Bacillus se deriva de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis o B. stearothermophilus, pero también se puede derivar de otras Bacillus sp. Ejemplos específicos de alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (BLA) mostrada en SEQ ID NO: 4 en WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (BA ) mostrada en SEQ ID NO: 5 en el documento WO 99/19467, y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467. En una modalidad de la invención, la alfa-amilasa es una enzima que tiene un grado de identidad de por lo menos 60%, preferiblemente por lo menos 70%, más preferido por lo menos 80%, aún más preferido por lo menos 90%, tal como por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad. a cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 ó 5, respectivamente, en el documento WO 99/19467.

La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de los documentos WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355 (todos los documentos incorporados aquí por referencia) . Las variantes de alfa-amilasa específicamente contempladas se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,093,562, 6,187,576 y 6,297,038 (incorporadas aquí por referencia) e incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa BSG) que tienen una supresión de uno o dos aminoácidos en la posición 179 a 182, preferiblemente una doble supresión descrita en el documento WO 96/23873 - véase, v.gr., página 20, líneas 1-10 (incorporada aquí por referencia) , preferiblemente correspondiente a delta (181-182) comparada con la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa BSG de tipo silvestre expuesta en SEQ ID NO: 3 descrita en el documento O 99/19467 o supresión de aminoácidos 179 y 180 mediante el uso de SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 para numeración (cuya referencia es incorporada aquí por referencia) . Aún más preferidas son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, que tienen una doble supresión correspondiente a delta (181-182) y además comprenden una sustitución N193F (también denotada 1181* + G182* + N193F) comparada con la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa BSG de tipo silvestre expuesta en SEQ ID NO: 3 descrita en el documento WO 99/19467.

La alfa-amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, EC 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina a maltosa en la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus cepa NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S, Dinamarca. La alfa-amilasa maltogénica se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628, que son incorporadas aquí por referencia.

Alfa-amilasas híbridas bacterianas Una alfa-amilasa híbrida contemplada específicamente comprende 445 residuos de aminoácidos extermínales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada como SEQ ID NO: 4 en O 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada como SEQ ID NO: 3 en WO 99/19467) , con uno o más, especialmente todas, las siguientes sustituciones: G48A+T49I+G107A+H156Y+A181 T+N190F+I201 F+A209V+Q264S (mediante el uso de la numeración de Bacillus licheniformis) . También son preferidas las variantes que tienen una o más de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otros esqueletos de alfa-amilasa de Bacillus) : H154Y, A181 T, N190F, A209V y Q264S y/o supresión de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente supresión de E178 y G179 (mediante el uso de la numeración de SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467) .

La alfa-amilasa bacteriana se puede añadir en cantidades como se conoce en la técnica. Cuando se mide en unidades KNU (descrita más adelante en la sección de "Materiales y Métodos") la actividad de la alfa-amilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 0.5-5,000 NU/g de DS, en una cantidad de 1-500 NU/g de DS, o muy preferiblemente en una cantidad de 5-1,000 NU/g de DS, tal como 10-100 NU/g DS .

Alfa-amilasas fúngicas Las alfa-amilasa ácidas fúngicas incluyen alfa-amilasa ácidas derivadas de una cepa del género Aspergillus, tales como alfa-amilasas de Aspergillus kawachii, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

Una alfa-amilasa ácida fúngica preferida es una alfa-amilasa similar a Fungamyl que es preferiblemente derivada de una cepa de Aspergillus oryzae. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa similar a Fungamyl" indica una alfa-amilasa que presenta una alta identidad, es decir, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85% más de 90%, más de 95%, más de 96%, más de 97%, más de 98%, más de 99% o incluso 100% de identidad a la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10 en WO 96/23874.

Otra alfa-amilasa ácida preferida es derivada de una cepa de Aspergillus niger. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa ácida fúngica es una de A. niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el acceso primario no. P56271 y descrito con más detalle en WO 89/01969 (ejemplo 3). La alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger también se muestra como SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2004/080923 (Novozymes) que es incorporada aquí por referencia. También, variantes de esa amilasa ácida fúngica que tienen por lo menos 70% de identidad, tal como por lo menos 80% o incluso por lo menos 90% de identidad, tal como por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad a SEQ ID NO: 1 en el documento O 2004/080923 se contemplan. Una alfa-amilasa ácida fúngica comercialmente disponible adecuada derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) .

En una modalidad preferida, la alfa-amilasa es derivada de Aspergillus kawachii y descrita por Kaneko et al., 1996, J. Ferment . Bioeng. 81: 292-298, "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alfa-amilasa from Aspergillus kawachii"; y además como EMBL : #AB008370.

La alfa-amilasa ácida fúngica también puede ser una enzima de tipo silvestre que comprende un módulo de unión a carbohidrato (CBM) y un dominio catalítico de alfa-amilasa (es decir, un no híbrido) , o una variante del mismo. En una modalidad, la alfa-amilasa ácida de tipo silvestre se deriva de una cepa de Aspergillus kawachii.

Alfa-amilasas híbridas fúngicas En una modalidad preferida, la alfa-amilasa ácida fúngica es una alfa-amilasa híbrida.

Ejemplos preferidos de alfa-amilasas híbridas fúngicas incluyen aquellas descritas en el documento WO 2005/003311 o publicación de solicitud de E.U.A. No. 2005/0054071 (Novozymes) o solicitud de E.U.A. No. 60/638,614 (Novozymes) que es incorporada aquí por referencia. Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico (CD) de alfa-amilasa y un dominio/módulo de unión a carbohidrato (CBM) y opcionalmente un enlazador.

Ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la solicitud de E.U.A. No. 60/638,614 que incluyen variante de Fungamyl con dominio catalítico JAI 18 y SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 100 en la solicitud de E.U.A. No. 60/638,614), alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador AMG y SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 101 en la solicitud de E.U.A. No. 60/638,614) y alfa-amilasa de Meripilus giganteus con enlazador de glucoamilasa y SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 102 en la solicitud de E.U.A. No. 60/638,614).

Otros ejemplos específicos de alfa-amilasa híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la publicación de solicitud de E.U.A. no. 2005/0054071, que incluye aquellas descritas en la tabla 3 en la página 15, tal como alfa-amilasa de Aspergillus niger con enlazador y dominio de unión a almidón de Aspergillus kawachii.

Productos de alfa-amilasa comerciales Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE de DSM (Gist Brocades) , BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ Ethyl , GC358, GC980, SPEZY E™ RSL, y SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.), y la alfa-amilasa ácida fúngica vendida bajo el nombre comercial SP288 (disponible de Novozymes A S, Dinamarca) .

Una alfa-amilasa ácida, de conformidad con la invención, se puede añadir en una cantidad de 0.1 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente 0.10 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0.3 a 2 AFAU/g DS.

Producción de jarabe La presente invención también provee un proceso de usar una glucoamilasa de la invención para producir jarabe, tal como glucosa y similares, a partir de material que contiene almidón. Los materiales de partida adecuados se ilustran en la sección de "Materiales que contienen almidón" anterior. Generalmente, el proceso comprende los pasos de hidrolizar parcialmente material que contiene almidón (licuefacción) en presencia de alfa-amilasa y después sacarificar adicionalmente la liberación de glucosa de los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligosacárido y polisacárido relacionadas en presencia de glucoamilasa de la invención.

La licuefacción y sacarificación se pueden llevar a cabo como se describió antes para producción de producto de fermentación .

La glucoamilasa de la invención también se puede usar en forma inmovilizada. Esto es adecuado y a menudo usado para producir jarabes especiales, tales como jarabes de maltosa, y además para la corriente de rafinato de oligosacáridos en conexión con la producción de jarabes de fructosa, v.gr., jarabe alto en fructosa (HFS) .

Consecuentemente, este aspecto de la invención se refiere a un proceso de producir jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa , y (b) sacarificar el material obtenido en el paso (a) mediante el uso de una glucoamilasa de la invención.

Un jarabe puede ser recuperado del material sacarificado obtenido en el paso (b) .

Detalles acerca de las condiciones se pueden encontrar en lo anterior.

Elaboración de cerveza Una glucoamilasa de la invención también se puede usar en un proceso de elaboración de cerveza. La glucoamilasa de la invención se añade en cantidades efectivas que pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la técnica.

La invención descrita y reivindicada aquí no está limitada en en alcance por las modalidades específicas descritas aquí, ya que se pretende que estas modalidades se consideren como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualesquiera modalidades equivalentes estén dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas aquí sean evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. También se pretende que esas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo definiciones, tendrá control .

En la presente se citan varias referencias, cuyas descripciones son incorporadas por referencia en su totalidad. La presente invención además se describe por los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

Materiales y métodos Levadura: RED STAR™ disponible de Red Star/Lesaff e, E.U.A.

Medios y reactivos: Compuestos químicos usados como amortiguadores de pH y sustratos fueron productos comerciales de por lo menos grado de reactivo.

PDA: 39 g/L de agar de dextrosa de papa, 20 g/L de agar, 50 ml/L de glicerol.

Métodos A menos que se indique otra cosa, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron mediante el uso de métodos estándares de bilogía molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. , y Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus" . John Wiley and Sons, 1990.

Actividad de glucoamilasa La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades AGI o en unidades de glucoamilasa (AGU) .

Actividad de glucoamilasa (AGI) La glucoamilasa (equivalente a amiloglucosidasa) convierte el almidón en glucosa. La cantidad de glucosa se determina aquí por el método de glucosa oxidasa para la determinación de la actividad. El método descrito en la sección 76-1 1 Método de almidón—glucoamilasa con medición subsecuente de glucosa con glucosa Oxidasa en "Approved methods of the American Association of Cereal Chemists" . Vol .1 -2 AACC, de la American Association of Cereal Chemists, (2000); ISBN: 1-891 127-12-8.

Una unidad de glucoamilasa (AGI) es la cantidad de enzima que formará 1 micromol de glucosa por minuto ajo las condiciones estándares del método.

Condiciones estándares/condiciones de reacción: Sustrato: Almidón soluble, concentración aproximada 16 g de materia seca/L.

Amortiguador de pH: Acetato, aproximadamente 0.04 M, pH=4.3 pH : 4.3 Temperatura de incubación: 60 °C Tiempo de reacción: 15 minutos Terminación de la reacción: NaOH a una concentración de aproximadamente 0.2 g/L (pH~9) Concentración de enzima: 0.15-0.55 AAU/mL. El almidón debe ser almidón Lintner, que es un almidón de ebullición baja usado en el laboratorio como indicador colorimétrico . El almidón Lintner se obtiene por tratamiento con ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo que retenga la capacidad para teñirse de azul con yodo.

Actividad de glucoamilasa (AGU) La unidad de glucoamilasa (AGU) Novo se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándares 37°C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, amortiguador de pH: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

Se puede usar un sistema de autoanalizador . Se añade Mutarotase al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente es convertido a beta-D-glucosa . La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, y forma NADH que se determina mediante el uso de un fotómetro a 340 nm como una medición de la concentración de glucosa original .

Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible por petición a Novozymes A/S, Dinamarca, la carpeta es incluida aquí por referencia .

Actividad de alfa-amilasa (K U) La actividad de alfa-amilasa se puede determinar mediante el uso de almidón de papa como sustrato. Este método es con base en el rompimiento de almidón de papa modificado por la enzima, y la reacción es seguida por el mezclado de muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente , se forma un color azul negrusco, pero durante el rompimiento del almidón, el color azul se debilita y gradualmente se torna café rojizo, que se compara con un estándar de vidrio coloreado.

Una unidad de alfa amilasa Kilo Novo (KNU) se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándares (es decir, a 37°C +/- 0.05; 0.0003 M Ca2+; y pH 5.6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum solubile.

Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible por petición a Novozymes A/S, Dinamarca, la carpeta es incluida aquí por referencia .

Actividad de alfa-amilasa ácida Cuando se usa de conformidad con la presente invención, la actividad de cualquier alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa ácida fúngica) . Alternativamente, la actividad de alfa-amilasa ácida se puede medir en AAU (unidades de alfa-amilasa ácida) .

Unidades de alfa-amilasa ácida (AAU) La actividad de alfa-amilasa ácida se puede medir en AAU (unidades de alfa-amilasa ácida) , que es un método absoluto. Una unidad de alfa-amilasa ácida (AAU) es la cantidad de enzima que convierte 1 g de almidón (100% de materia seca) por hora bajo condiciones estandarizadas en un producto que tiene una transmisión a 620 nm después de reacción con una solución de yodo de resistencia conocida igual a uno de referencia de color.

Condiciones estándares/condiciones de reacción: Sustrato: Almidón soluble. Concentración aproximadamente 20 g DS/L.

Amortiguador de pH: Citrato, aproximadamente 0.13 M, pH=4.2 Solución de yodo: 40.176 g de yoduro de potasio + 0.088 g de yodo/L Agua municipal: 15°-20°dH (dureza de grado alemán) pH : 4.2 Temperatura de incubación: 30°C Tiempo de reacción: 11 minutos Longitud de onda: 620 nm Concentración de enzima: 0.13-0.19 AAU/mL Intervalo de trabajo de enzima: 0.13-0.19 AAU/mL El almidón debe ser almidón Lintner, que es un almidón de ebullición baja usado en el laboratorio como indicador colorimétrico . El almidón Lintner se obtiene por tratamiento con ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo que retenga la capacidad para teñirse de azul con yodo. Detalles adicionales se pueden encontrar en EP 0140410 B2 , cuya descripción se incluye aquí por referencia .

Actividad de alfa-amilasa ácida (AFAU) La actividad de alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa ácida fúngica) , que se determinan en relación con un estándar de enzima. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora bajo las condiciones estándares mencionadas a continuación.

La alfa-amilasa ácida, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucan-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) hidroliza enlaces alfa-1 , 4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad de color formado con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de amilasa se determina mediante el uso de colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo las condiciones analíticas especializadas.

ALFA-AMILASA ALMIDÓN + YODO > DEXTRINAS + OLIGOSACÁRIDOS 40°, pH 2.5 A=590nm azul/violeta t = 23 seg cambio de color Condiciones estándares/condiciones de reacción: Sustrato: Almidón soluble, aproximadamente 0.17 g/L Amortiguador de pH: Citrato, aproximadamente 0.03 M Yodo (12) : 0.03 g/L CaCl2: 1.85 mM H: 2.50 + 0.05 Temperatura de incubación: 40°C Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: 590 nm Concentración de enzima: 0.025 AFAU/mL Intervalo de trabajo de enzima: 0.01 -0.04 AFAU/mL Una carpeta EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible por petición a Novozymes A/S, Dinamarca, la carpeta es incluida aquí por referencia .

Ejemplo 1 Sacarificación y Fermentación Simultáneas (SSF) con AMG de Gloeophyllum sepiarium El rendimiento de SSF de glucoamilasas de Gloeophyllum sp. Se probó a diferentes dosis de enzima. La fermentación se realizó bajo las siguientes condiciones: Sustrato: Maíz molido se puso en suspensión con contracorriente y ajustó su sustancia seca a aproximadamente 32% (p/p) . Después se licuó a 85°C y pH 5.8. La malta licuada tuvo un DE de 13.4.

Temperatura: 32 °C pH inicial : 5.0 Dosis de enzima: AMG de Gloeophyllum sp . producida en Aspergillus niger a 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS . Las enzimas se compararon con una muestra purificada de la AMG de Talaromyces emersonii comercial dosificada a las misma dosis. La dosis más alta de AMG de Talaromyces emersonii es equivalente a una cantidad relevante de la industria de 0.56 AGU/g DS . Un control para sacarificación obtenible máxima se preparó con el uso de cantidades excesivas de AMG comercial y alfa-amilasa .

Fermentación Al sustrato para SSF, 1000 ppm de urea como fuente de nitrógeno y 3 ppm de penicilina para control de bacterias se añadió; el pH se ajustó a 5.0 con H2S04. Alícuotas de 5 g de malta fueron transferidas a tubos de centrífuga de 15 mi con un agujero perforado en la parte superior para liberación de C02. Las enzimas y levadura se añadieron y los tubos se colocaron en un baño de agua sin agitar a 32 °C durante 54 hr. Las muestras se analizaron en HPLC para la determinación de etanol producido durante la fermentación. Los resultados se muestran en las siguientes tablas.

Tabla 1: Etanol, g/L, producido durante SSF con AMG de Gloeophyllum sepiarium a 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS comparado con AMG de Talaromyces emersonii. El control dio por resultado 133.08 g/L de etanol Tabla 2: Etanol, g/L, producido durante SSF con AMG de Gloeophyllum sepiariu a 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS comparado con AMG de Talaromyces emersonii. El control dio por resultado 131.9 g/L de etanol Tabla 3 : Rendimiento de etanol producido durante SSF con AMG de Gloeophyllum sp . a 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS comparado con AMG de Talaromyces emersonii y AMG de Trvame es cingulata . El control dio por resultado 100% de rendimiento Ejemplo 2 Actividad específica de AMGs de Gloeophyllum s . comparada con AMG de Trametes cingulata La actividad específica se calculó al dividir la actividad de la glucoamilasa AGU (de conformidad con el procedimiento descrito anteriormente) y proteína de enzima de cada preparación (análisis de AA) . La tabla siguiente muestra los resultados para las diferentes AMGs de Gloeophyllum sp . s . comparada con AMG de Trametes cingulata.

Depósito de material biológico El siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Alemania, y se ha dado el siguiente número de acceso: Depósito: cepa NN059223 de E. coli con plásmido que comprende la secuencia D7279 (SEQ ID NO: 1) Número de acceso: DSM 23222 Fecha de depósito: 13 de enero de 2010 La cepa ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente a una determinada por las leyes de patente extranjeras para tener derecho a la misma. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible como es requerido por las leyes de patente extranjeras en países en donde las contrapartes de la presente solicitud o su progenie son presentadas. Sin embargo, cabe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la presente invención en derogación de derechos de patente concedidos por acción gubernamental .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91 %, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad al dominio catalítico mostrado como aminoácidos 19 a 474 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 19 a 471 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida preferiblemente por lo menos bajo condiciones de astringencia media-alta, y muy preferiblemente todavía por lo menos condiciones de astringencia alta con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, o SEQ ID NO : 17, (Ü) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ I D NO: 5, SEQ I D NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO : 17, o (iii) una hebra complementaria de longitud completa de (i) o (ii) ; (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad a la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 17; y (e) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 4, o de SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, o SEQ ID NO: 18; del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO : 4, o de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 18; o un fragmento del mismo que tiene actividad de glucoamilasa .

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque es codificado popr un polinucleótido que comprende o que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, o SEQ I D NO : 17; o una subsecuencia de las mismas que codifica un fragmento que tiene actividad de glucoamilasa.

4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque es codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido contenido en DSM 23222.

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el polipéptido maduro es los aminoácidos 18 a 573 de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ I D NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 18 a 576 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.

6. Un polipéptido aislado que tiene actividad de unión a carbohidrato, caracterizado porque comprende una molécula de unión a carbohidrato que tiene preferiblemente por lo menos 80%, muy preferiblemente por lo menos 81 %, muy preferiblemente por lo menos 82%, muy preferiblemente por lo menos 83%, muy preferiblemente por lo menos 84%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 86%, muy preferiblemente por lo menos 87%, muy preferiblemente por lo menos 88%, muy preferiblemente por lo menos 89%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91%, muy preferiblemente por lo menos 92%, muy preferiblemente aún por lo menos 93%, muy preferiblemente todavía por lo menos 94%, e incluso muy preferiblemente todavía por lo menos 95%, tal como por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% de identidad al dominio de unión a carbohidrato mostrado como aminoácidos 480 a 573 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14 o aminoácidos 483 a 576 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.

7. Una enzima híbrida, caracterizada porque comprende un dominio catalítico y un dominio de unión a carbohidrato de conformidad con la reivindicación 6.

8. La enzima híbrida de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el dominio catalítico tiene una actividad de enzima seleccionada del grupo que consiste de alfa-amilasa, amilopululanasa, beta-amilasa, CGTasa, glucoamilasa, isoamilasa, amilasa maltogénica y pululanasa .

9. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Un constructo de ácido nucleico, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9 operablemente enlazado a uno o más (varios) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedero de expresión.

11. Un vector de expresión recombinante , caracterizado porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.

12. Una célula hospedera recombinante caracterizada porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.

13. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula hospedera que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

14. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

15. Una planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal, caracterizada porque es transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

16. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para la producción de jarabe y/o a producto de fermentación.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el material de partida es material gelatinizado o no gelatinizado que contiene almidón.

18. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para elaboración de cerveza .

19. Una composición caracterizada porque comprende una alfa-amilasa y un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

20. Un proceso para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) licuar material que contiene almidón; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentar con un organismo termentador; en donde el paso (b) se lleva a cabo mediante al usar por lo menos una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

21. Un proceso para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) sacarificar material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de ese mate-rial que contiene almidón; y (b) fermentar con un organismo termentador, en donde el paso (a) se lleva a cabo al usar por lo menos una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.