CN111148840A - 改进的无甘油乙醇生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组的重组酵母，所述重组酵母包含允许表达葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.20或EC 3.2.1.3)的核苷酸序列。这种细胞可用于生产乙醇，并且有利地几乎不产生甘油或不产生甘油。

Description

改进的无甘油乙醇生产
技术领域
本发明涉及一种适用于乙醇生产的重组细胞，该细胞用于制备乙醇和/或琥珀酸的用途，以及一种使用所述重组细胞制备发酵产物的方法。
背景技术
由含淀粉材料生产乙醇是本领域中众所周知的。作为第一步骤，通常使用淀粉酶将淀粉转化为糊精。随后使用葡糖淀粉酶将糊精水解成D-葡萄糖。将葡萄糖发酵成乙醇。方便地将淀粉酶和葡糖淀粉酶添加到淀粉介质中。或者，可以用葡糖淀粉酶基因转化酵母。具有葡糖淀粉酶基因的重组酵母仍有改进的空间。
表1.序列的简短描述
Figure BDA0002421169420000011
Figure BDA0002421169420000021
Figure BDA0002421169420000031
发明详述
除非另有说明，否则本文不使用数量词修饰时定义为“至少一个(种)”。
当不使用数量词提及名词(例如化合物、添加剂等)时，意味着包括复数。因此，除非另有说明，否则当提及特定部分例如“基因”或“核苷酸序列”时，这意味着该基因或核苷酸序列中的“至少一种”，例如“至少一种基因”或“至少一种核苷酸序列”。如本文所用的术语“或”应理解为“和/或”。
当提及存在几种异构体(例如D对映异构体和L对映异构体)的化合物时，该化合物原则上包括该化合物的所有可用于本发明的特定方法的对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体；特别地当提及诸如化合物时，该化合物包括天然异构体。
术语“发酵”、“发酵的”等在本文中以经典意义使用，即表示工艺在厌氧条件下进行或已经在厌氧条件下进行。厌氧条件在本文中被定义为没有任何氧的条件或细胞(特别是酵母细胞)基本上不消耗氧的条件，并且往往对应于小于5mmol/l.h-1的氧消耗，特别是小于2.5mmol/l.h-1或小于1mmol/l.h-1的氧消耗。更优选地，消耗0mmol/L/h(即，氧消耗为不可检测的)。这往往对应于培养物发酵液中的溶氧浓度小于空气饱和度的5％，特别地溶氧浓度小于空气饱和度的1％或小于空气饱和度的0.2％。
术语“酵母”或“酵母细胞”是指一组系统发生上不同的单细胞真菌，其中大多数为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。芽殖酵母(“真酵母”)被分类为酵母(Saccharomycetales)目，其中酿酒酵母是最众所周知的物种。
如本文所用的术语“重组酵母”是指含有这样的核酸的酵母菌株，所述核酸是使用重组DNA技术和/或另一种诱变技术进行一种或多种遗传修饰的结果。特别地，重组酵母可包含不存在于对应野生型细胞中的核酸，该核酸已经使用重组DNA技术引入到该菌株(细胞)中(转基因细胞)，或者不存在于所述野生型中的该核酸是在所述野生型中存在的核酸序列(诸如编码野生型多肽的基因)中—例如使用重组DNA技术或另一种诱变技术(诸如UV辐射)—进行一种或多种突变的结果，或者其中基因的核酸序列已被修饰以将多肽产物(编码所述多肽产物)靶向另一个细胞区室。此外，术语“重组”特别地涉及这样的菌株(细胞)，已经使用重组DNA技术从所述菌株(细胞)中去除了DNA序列。
如本文所用的术语“转基因(酵母)细胞”是指含有非天然存在于该菌株(细胞)中并且已经使用重组DNA技术引入该菌株(细胞)中的核酸的菌株(细胞)(即重组细胞)。
如本文所用的关于蛋白质或多肽的术语“突变的”是指野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列中的至少一个氨基酸已经经由对编码这些氨基酸的核酸进行诱变而被不同的氨基酸取代、插入，或从该序列中缺失。诱变是本领域中众所周知的方法，并且包括例如借助于PCR或经由寡核苷酸介导的诱变进行的定点诱变，如在Sambrook等人，MolecularCloning-A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷(1989)中所述。如本文所用的关于基因的术语“突变的”是指该基因或该基因的调控序列的核酸序列中至少一个核苷酸已经经由诱变被不同的核苷酸取代，或者已经从该序列中缺失，从而导致功能定性或定量改变的蛋白质序列的转录或对该基因的敲除。
在本发明的上下文中，“改变的基因”具有与突变的基因相同的含义。
如本文所用，术语“基因”是指含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。将基因转录成mRNA，然后将mRNA翻译为蛋白质。
如本文所用的术语“核酸”包括对单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物(即多核苷酸)的提及，并且除非另有限制，否则涵盖具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物，即所述已知类似物以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构或调控基因的全长序列或子序列。除非另有说明，否则该术语包括对指定序列及其互补序列的提及。因此，具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，正如该术语在本文中所用的。此外，仅举两个示例，包含不常见碱基(诸如肌苷)或经修饰的碱基(诸如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA是如本文所使用的术语的多核苷酸。应当理解，已经对DNA和RNA进行了多种修饰，该多种修饰用于本领域技术人员已知的许多有用目的。本文采用的术语多核苷酸包括这些化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这些类似物的基本性质是，当结合入蛋白质时，该蛋白质对针对相同但完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质激发的抗体为特异性反应的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包含修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化。
当参照酶分类(EC)提及酶时，该酶分类是基于由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology,NC-IUBMB)提供的酶命名法，酶被分类为或可分类为的类别，该命名法可在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/处找到。还意于包括没有(尚未)被分类为特定类别但可如此分类的其他合适的酶。
如果在本文中通过引用登录号来提及蛋白质或核酸序列(诸如基因)，则除非另有说明，否则该数字特别地用于指代具有可经由www.ncbi.nlm.nih.gov/(在2016年6月14日可得的)找到的序列的蛋白质或核酸序列(基因)。
通过参照遗传密码子，本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变异。术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指由于遗传密码子的简并性而编码氨基酸序列的相同或保守修饰的变体的那些核酸。术语“遗传密码子的简并性”是指大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定的丙氨酸位置处，可以在不改变编码的多肽的情况下将密码子改变为任何所述的对应密码子。这种核酸变异是“沉默变异”并且代表一种保守修饰的变异。
如本文所用，具有特定序列(例如“SEQ ID NO:X”)的多肽的术语“功能同源物”(或简称“同源物”)是指包含所述特定序列的多肽，前提条件是一个或多个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入，并且该多肽具有(定性地)用于底物转化的相同酶功能。该功能可以通过使用包含重组细胞的测定系统来测试，该重组细胞包含用于在酵母中表达同源物的表达载体，所述表达载体包含可操作地连接到酵母中的功能性启动子的异源核酸序列，并且所述异源核酸序列编码酶促活性为在待测试的细胞中将乙酰辅酶A转化为乙醛的同源多肽，以及评定所述转化是否发生在所述细胞中。候选同源物可以通过使用计算机相似性分析来鉴定。在WO2009/013159的实施例2中描述了这种分析的详细示例。技术人员将能够由此推导出如何可以找到合适的候选同源物，并且任选地在密码子(对)优化后，将能够使用如上所述的合适的测定系统来测试此类候选同源物所需的功能。合适的同源物代表与特定多肽具有大于50％，优选60％或更高，特别地至少70％，更特别地至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列相似性并具有所需的酶功能的多肽。对于核酸序列，术语功能同源物意于包括由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同但编码相同多肽序列的核酸序列。
序列同一性在本文中定义为通过比较序列所确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在所比较的序列的全长上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还意指通过所述序列的链(string)之间的匹配所确定的氨基酸或核酸序列(视情况而定)之间的序列相关性程度。
氨基酸或核苷酸序列当表现出一定的相似性水平时，被认为是同源的。同源的两个序列表示共同的进化起源。两个同源序列是密切相关还是更远距离相关由“百分比同一性”或“百分比相似性”表示，“百分比同一性”或“百分比相似性”分别为相关高或低。尽管存在争议，但为了表示“百分比同一性”或“百分比相似性”，“同源性水平”或“百分比同源性”经常互换使用。可以使用数学算法来完成序列的比较和对两个序列之间的百分比同一性的确定。本领域技术人员将意识到以下事实：几种不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequencecomparison，在D.Sankoff和J.B.Kruskal(编辑)，Time warps,string edits andmacromolecules:the theory and practice of sequence comparison，第1-44页，Addison Wesley中)。两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于替换矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可以指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选参数是空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将理解，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是当使用不同的算法时两个序列的总体百分比同一性不会显著改变。
同源性或同一性是在包括任何空位或延伸的整个比对区域上两个完整序列之间相同匹配的百分比。两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸的对应位置的数目除以包括空位的总比对长度。如本文所定义的同一性可以从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“同一性(IDENTITY)”。
两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸的对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的总比对长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。
本文所公开的核苷酸或氨基酸序列的变体还可以定义为与(例如，在序列表中)本文特别公开的核苷酸或氨基酸序列相比具有一个或若干个替换、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸序列。
本发明的核苷酸序列还可以按照它们分别在中等杂交条件下或优选在严格杂交条件下与本文公开的特定核苷酸序列的部分杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中被定义为这样的条件：其允许具有至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75个或100个核苷酸，以及最优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃的温度下在包含约1M盐(优选6×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中进行杂交，并在65℃下以包含约0.1M或更少的盐(优选0.2×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液洗涤。优选地，执行杂交过夜，即至少10小时，并且优选地执行洗涤至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件将通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列的特异性杂交。
中等条件在本文中定义为这样的条件：其允许具有至少50个核苷酸，优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约45℃的温度下在包含约1M盐(优选6×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温下以包含约1M盐(优选6×SSC)或具有相当离子强度的任何其他溶液洗涤。优选地，执行杂交过夜，即至少10小时，并且优选地执行洗涤至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件将通常允许具有高达50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件，以特异性地鉴定同一性在50％和90％之间变化的序列。
“表达”是指将基因转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)，随后翻译成蛋白质。
如本文所用，关于核酸或蛋白质的“异源”是源自外来物种的核酸或蛋白质，或者如果来自相同物种，则为通过刻意的人为干预而在组成和/或基因组基因座方面被从其天然形式实质性修饰的。例如，与异源结构基因可操作地连接的启动子来自与该结构基因所来源于的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则它们中的一者或两者被从其原始形式实质性修饰。异源蛋白质可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则为通过刻意的人为干预而被从其原始形式实质性修饰。
术语“异源表达”是指异源核酸在宿主细胞中的表达。异源蛋白质在诸如酵母的真核宿主细胞系统中的表达是本领域技术人员熟知的。包含编码具有特定活性的酶的基因的核酸序列的多核苷酸可以在这种真核系统中表达。在一些实施方式中，转化/转染的细胞可以用作用于表达酶的表达系统。异源蛋白质在酵母中的表达是众所周知的。Sherman,F.等人，Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是描述了可用于在酵母中表达蛋白质的多种方法的公知著作。两种被广泛利用的酵母是酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母菌属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域中已知的，并且可从商业供应商(例如，Invitrogen)获得。合适的载体通常具有表达控制序列，根据期望诸如启动子，包括3-磷酸甘油激酶或醇氧化酶，以及复制起点、终止序列等。
如本文所用，“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5'区域中，靠近(结构)基因的转录起始位点。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或阻抑型的。在一个实施方式中，不需要(外部)诱导物。
如本文所用的术语“载体”包括对常染色体表达载体和对用于整合到染色体中的整合载体的提及。
术语“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，该线性或环状的DNA分子包含编码感兴趣的多肽的区段，该区段在提供其转录的附加核酸区段的控制下(即可操作地连接到所述附加核酸区段)。此类附加区段可包括启动子序列和终止子序列，并且可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。特别地，表达载体包含这样的核酸序列，该核酸序列包含在5'至3'方向上并可操作地连接的以下项：(a)酵母识别的转录和翻译起始区，(b)感兴趣的多肽的编码序列，以及(c)酵母识别的转录和翻译终止区。“质粒”是指自主复制的染色体外DNA，其未整合到微生物的基因组中并且通常自然状态下是环状的。
“整合载体”是指线性或环状的DNA分子，该线性或环状的DNA分子可以整合到微生物的基因组中并提供编码感兴趣的多肽的基因的稳定遗传。整合载体通常包含一个或多个区段，该一个或多个区段包含基因序列，所述基因序列编码在提供其转录的附加核酸区段的控制下(即可操作地连接到所述附加核酸区段)的感兴趣的多肽。所述附加区段可包括启动子序列和终止子序列，以及通常通过同源重组过程来驱动将感兴趣的基因整合到靶细胞基因组中的一个或多个区段。通常，整合载体将为可转移到靶细胞中的载体，而其具有在该生物体中无功能的复制子。如果在包含感兴趣的基因的区段内包含适当的标记物，则可以选择该区段的整合。
“宿主细胞”是指含有载体并支持载体的复制和/或表达的细胞。
如本文所用，“转化”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而不管用于该插入的是何种方法(例如，直接摄取、转导、f-接合(f-mating)或电穿孔)。外源多核苷酸可以保持为非整合载体，例如质粒，或者可以整合到宿主细胞基因组中。
“破坏”是指(或包括)影响对应多肽的翻译或转录和/或影响酶促(比)活性、其底物特异性和/或稳定性的所有核酸修饰，诸如核苷酸缺失或替换、基因敲除(等等)。所述修饰可以靶向编码序列或基因的启动子。
在一个方面中，本发明提供了一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含允许表达葡糖淀粉酶的核苷酸序列，所述葡糖淀粉酶具有根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或所述葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO:17有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.20或EC 3.2.1.3)也称为淀粉葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α葡糖苷酶、麦芽糖酶葡糖淀粉酶和麦芽糖酶-葡糖淀粉酶，其至少催化来自直链淀粉链非还原端的末端1,4-连接的α-D-葡萄糖残基的水解以释放游离的D-葡萄糖。
SEQ ID NO:17的多肽编码“成熟葡糖淀粉酶”，所述“成熟葡糖淀粉酶”是指处于翻译和任何翻译后修饰(诸如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)后的最终形式的酶。
在一个实施方式中，允许表达葡糖淀粉酶的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽或其具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的变体。SEQ ID NO:18的第1-17位氨基酸可编码信号序列。
信号序列(也称为信号肽、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)可以存在于多肽(在此是葡糖淀粉酶)的N末端处，其信号为多肽要被分泌，例如到细胞外并进入培养基。
本发明人发现具有SEQ ID NO:17的葡糖淀粉酶或其功能同源物提供了比具有其他葡糖淀粉酶的酵母更好的酵母。例如，具有SEQ ID NO:17的葡糖淀粉酶或其功能同源物可具有有益的副活性，或增加的副活性，诸如普拉南酶(pullananase)活性。而且，酵母可更稳健(robust)。
在另一个实施方式中，允许表达葡糖淀粉酶的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽或其具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的变体。SEQ ID NO:19的第1-19位氨基酸可编码信号序列。
在一个实施方式中，重组酵母还包含编码甘油脱氢酶的核苷酸序列。
在一个实施方式中，甘油脱氢酶是NAD+连接的甘油脱氢酶(NAD+ linked glyceroldehydrogenase)(EC 1.1.1.6)。所述酶可以来自细菌来源或例如来自真菌来源。一个示例是来自大肠杆菌的gldA。
或者，具有甘油脱氢酶活性的酶是NADP+连接的甘油脱氢酶(NADP+ linkedglycerol dehydrogenase)(EC 1.1.1.72)。
当重组酵母用于乙醇生产时，所述生产通常在厌氧条件下进行，NAD+连接的甘油脱氢酶为优选的。
在一个实施方式中，所述重组酵母包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码由氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:13表示的异源甘油脱氢酶或其具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的功能同源物。
应当理解的是，重组酵母具有编码二羟基丙酮激酶的内源核苷酸序列，诸如DAK1基因。优选地将这种核苷酸序列置于组成型启动子的控制之下。在一个实施方式中，重组酵母包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码由根据SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:14的氨基酸序列表示的二羟基丙酮激酶或其具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的功能同源物，所述核苷酸序列优选地被置于组成型启动子的控制下。二羟基丙酮激酶也可具有甘油醛激酶活性。
在一个实施方式中，重组酵母包含编码甘油转运体的核苷酸序列。在该实施方式中，在培养基中的可外部获得的(例如来自玉米醪中的回流物(backset))或在内部细胞合成后分泌的任何甘油都可以运输到细胞中并转化为乙醇。在一个实施方式中，重组酵母包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码由氨基酸序列SEQ ID NO:7表示的异源甘油转运体或其具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的功能同源物。
在一个实施方式中，重组酵母还包含对编码甘油输出蛋白(例如FPS1)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。在一个实施方式中，重组酵母包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码由氨基酸序列SEQ ID NO:8表示的异源甘油转运体或其具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的功能同源物。
在另一个实施方式中，重组酵母还包含对编码甘油激酶(EC 2.7.1.30)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。这种酶的一个示例是Gut1p。
在另一个实施方式中，与其相应的野生型酵母相比，重组酵母天然缺乏NADH依赖性甘油合成所需的酶促活性，或具有降低的NADH依赖性甘油合成所需的酶促活性，例如属于间型酒香酵母(Brettanomyces intermedius)物种的酵母。
在一个实施方式中，重组酵母包含对一种或多种编码甘油-3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油-3-磷酸脱氢酶的内源核苷酸序列的缺失或破坏。这种缺失或破坏可导致酶促活性的降低或去除。被缺失或破坏的甘油-3-磷酸脱氢酶优选地可属于EC 1.1.5.3，诸如GUT2，或属于EC 1.1.1.8，诸如PDP1和/或PDP2。
在一个实施方式中，重组酵母不含编码NADH依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的核苷酸序列。
可以通过修饰一种或多种编码NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶活性(GPD)的核苷酸序列或一种或多种编码甘油磷酸磷酸酶活性(GPP)的核苷酸序列，使得酶表达显著低于野生型中的酶表达或者使得核苷酸序列编码具有降低活性的多肽，来实现降低的酶促活性。此类修饰可以使用公知的生物技术进行，并且可以特别包括编码GPD和/或GPP的结构基因的启动子区或编码区的一种或多种敲除突变或定点诱变。或者，可以通过随机诱变然后选择具有降低的GPD和/或GPP活性或没有GPD和/或GPP活性的菌株来获得甘油生产缺陷的菌株。酿酒酵母中编码GPD活性的基因的示例是GPD1、GPD2，GPP活性的基因的示例是GPP1和GPP2。
可以使GPD和/或GPP完全缺失，或者缺失至少一部分，该至少一部分编码对酶活性必不可少的酶部分。特别地，用酿酒酵母细胞已经实现了良好的结果，其中GPD1基因和GPD2基因的开放阅读框已被失活。本领域技术人员可以通过合成地合成或以其他方式构建下述DNA片段来实现结构基因(靶基因)的失活，该DNA片段由侧翼为与宿主细胞基因组的待缺失区域侧翼的序列相同的DNA序列的选择性标记基因组成。特别地，通过对标记基因kanMX和hphMX4的整合，对酿酒酵母中GPD1和GPD2基因的失活已经获得了良好的结果。随后将该DNA片段转化到宿主细胞中。检查表达显性标记基因的转化细胞中对被设计为要缺失的区域的正确置换，例如通过诊断性聚合酶链式反应或Southern杂交。
在一个实施方式中，重组酵母还包含：
-编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(EC 4.1.1.39，RuBisCO)的核苷酸序列；以及
-编码磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19，PRK)的核苷酸序列；
Rubisco可以是单亚基Rubisco或具有多于一个亚基的Rubisco。特别地，已经使用单亚基Rubisco实现了良好的结果。特别地，已经使用II型Rubisco，更特别地CbbM实现了良好的结果。SEQ ID NO:11显示了合适的Rubisco的合适序列。其由来自脱氮硫杆菌的cbbM基因编码。该Rubisco的替代物是该Rubisco的功能同源物，特别是包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性的氨基酸序列的这种功能同源物。合适的天然Rubisco多肽在WO2014/129898的表1中给出。至少在用于制备感兴趣的化合物的工业过程中使用时，Rubisco优选在微生物中功能性地表达。
在一个实施方式中，功能性表达的Rubisco具有的活性为由通过细胞提取物进行核酮糖-1,5-二磷酸依赖性14C-碳酸氢盐并入的速率定义的至少1nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，特别地为至少2nmol.min-1.(mg蛋白质)-1的活性，更特别地为至少4nmol.min-1.(mg蛋白质)-1的活性。活性的上限并不重要。在实践中，活性可以是约200nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，特别地25nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，更特别地15nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，例如约10nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低。用于测定该Rubisco活性的测定条件如WO2014/129898的实施例4中所见。
在一个实施方式中，重组酵母还包含一种或多种编码分子伴侣的核苷酸序列，优选异源核苷酸序列，所述分子伴侣优选源自原核生物，更优选细菌，甚至更优选大肠杆菌。
分子伴侣—当表达时—优选能够与微生物中的酶功能性相互作用，特别是与Rubisco和PRK中的至少一种相互作用。分子伴侣是为正确折叠其他蛋白质提供有利条件，从而防止聚集的蛋白质。新制备的蛋白质通常必须从氨基酸的线性链折叠成三维形式。伴侣蛋白属于一大类有助于蛋白质折叠的分子，被称为分子伴侣。用于折叠蛋白质的能量由三磷酸腺苷(ATP)供应。Yébenes(2001)撰写了一篇关于伴侣蛋白的综述文章；“Chaperonins:two rings for folding”；Hugo Yébenes等人，Trends in BiochemicalSciences，2011年8月，第36卷，第8期。
在一个实施方式中，所述一种或多种伴侣蛋白来自细菌，更优选来自埃希氏杆菌属(Escherichia)，特别是来自大肠杆菌的大肠杆菌GroEL和GroES尤其可以在根据本发明的微生物中被编码。另一些优选的伴侣蛋白是来自酵母菌属(Saccharomyces)的伴侣蛋白，特别地酿酒酵母Hsp10和Hsp60。如果伴侣蛋白在诸如线粒体的细胞器中天然表达(示例为酿酒酵母的Hsp60和Hsp10)，则可以例如通过修饰伴侣蛋白的天然信号序列来实现向细胞溶质的重定位。
在真核生物中，蛋白质Hsp60和Hsp10在结构上和功能上分别与GroEL和GroES几乎相同。因此，考虑来自任何真核细胞的Hsp60和Hsp10可以充当Rubisco的伴侣蛋白。参见Zeilstra-Ryalls J,Fayet O,Georgopoulos C(1991).“The universally conservedGroE(Hsp60)chaperonins”.Annu Rev Microbiol.45:301-25.doi:10.1146/annurev.mi.45.100191.001505.PMID 1683763和Horwich AL,Fenton WA,Chapman E,Farr GW(2007).“Two Families of Chaperonin:Physiology and Mechanism”.Annu Rev Cell DevBiol.23:115-45.doi:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555.PMID 17489689。
作为GroEL的替代，可以存在GroEL的功能同源物，特别是包含与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的功能同源物。与SEQID NO:10同源的合适的天然伴侣蛋白多肽在WO2014/129898的表4中给出。
作为GroES的替代，可以存在GroES的功能同源物，特别是包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的功能同源物。与SEQ IDNO:9同源的合适的天然伴侣蛋白多肽在WO2014/129898的表3中给出。
在一个实施方式中，来自WO2014/129898的表3的10kDa伴侣蛋白与来自相同生物体属或物种的WO2014/129898的表4的匹配的60kDa伴侣蛋白组合，以在宿主中表达。例如：>gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 10kDa伴侣蛋白[Pyrenophora tritici-repentis]与匹配的>gi|189190432|ref|XP_001931555.1|热休克蛋白60，线粒体前体[Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP]一起表达。
用相同生物来源类似地制备的来自WO2014/129898的表3和表4的所有其他组合也可由技术人员用于表达。
在一个实施方式中，PRK源自选自以下的植物：石竹目(Caryophyllales)，特别地苋科(Amaranthaceae)，特别地菠菜属(Spinacia)。
在一个实施方式中，重组酵母包含一种或多种编码PRK的核酸序列，所述PRK由用SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列表示或由该氨基酸序列的具有至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的功能同源物表示。
功能性表达的磷酸核酮糖激酶(PRK，EC 2.7.1.19)能够催化以下化学反应：
ATP+D-核酮糖5-磷酸ADP+D-核酮糖1,5-二磷酸(I)
因此，该酶的两种底物是ATP和D-核酮糖5-磷酸，而其两种产物是ADP和D-核酮糖1,5-二磷酸。
PRK属于转移酶家族，特别是那些使用醇基团作为受体来转移含磷基团的转移酶(磷酸转移酶)。该酶分类的系统名称是ATP:D-核酮糖-5-磷酸1-磷酸转移酶。其他常用的名称包括磷酸戊糖激酶、核酮糖-5-磷酸激酶、磷酸戊糖激酶、磷酸核酮糖激酶(磷酸化)、5-磷酸核酮糖激酶、核酮糖磷酸激酶、PKK、PRuK，以及PRK。该酶参与碳固定。
PRK可以来自原核生物或真核生物。已经使用源自真核生物的PRK取得了良好的结果。优选地，真核PRK源自选自以下的植物：石竹目，特别地苋科，更特别地菠菜属。
作为来自菠菜属的PRK的替代物，可以存在来自菠菜属的PRK的功能同源物，特别是包含与来自菠菜属的PRK具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性的序列的功能同源物。
一个或多个PRK核苷酸序列可以处于启动子(“PRK启动子”)控制下，该启动子使得能够在厌氧条件下比在有氧条件下实现更高的表达。
在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻抑的。ROX1在本文是缺氧基因的血红素依赖性阻遏物(haeme-dependent repressor)；介导对缺氧诱导基因如COX5b和CYC7的有氧转录阻抑；通过响应于氧化应激减少启动子占据来调控阻遏物功能；并且含有负责DNA弯曲活性的HMG结构域；参与高渗应激抗性。ROX1受氧调控。
根据Kwast等人(在：Genomic Analysis of Anaerobically induced genes inSaccharomyces cerevisiae:Functional roles of ROX1 and other factors inmediating the anoxic response,2002,Journal of bacteriology第184卷，第1期，第250-265页中)：“虽然Rox1以O2不依赖性方式作用，但其表达是氧(血红素)依赖性，由血红素依赖性转录因子Hap1激活[Keng,T.1992.HAP1 and ROX1 form a regulatory pathwayin the repression of HEM13 transcription in Saccharomycescerevisiae.Mol.Cell.Biol.12:2616-2623]。因此，当氧水平下降到限制血红素生物合成的水平[Labbe-Bois,R.和P.Labbe.1990.Tetrapyrrole and heme biosynthesis in theyeast Saccharomyces cerevisiae，第235-285页，在H.A.Dailey(编辑)，Biosynthesis ofheme and chlorophylls.McGraw-Hill,New York,N.Y中]，R0X1不再被转录[Zitomer，RS和C.V.Lowry.1992.Regulation of gene expression by oxygen in Saccharomycescerevisiae.Microbiol.Rev.56:1-11]，其蛋白质水平下降[Zitomer,R.S.,P.Carrico和J.Decked.1997.Regulation of hypoxic gene expression in yeast.Kidney Int.51:507-513]，并且其调控的基因被去阻遏。”
在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻抑的。在一个实施方式中，PRK启动子具有一个或多个ROX1结合基序。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个根据SEQ ID NO:15的基序。
在一个实施方式中，PRK启动子是选自由以下项组成的列表的核苷酸序列的天然启动子：FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5、HEM13、YNR014W、YAR028W、FUN 57、COX5B、OYE2、SUR2、FRDS1、PIS1、LAC1、YGR035C、YAL028W、EUG1、HEM14、ISU2、ERG26、YMR252C和SML1，特别是FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5和HEM13。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个根据TCGTTYAG和/或根据SEQ ID NO:16的基序。
特别地，这种PRK启动子是DAN、TIR或PAU基因的天然启动子。在一个实施方式中，PRK启动子是选自由以下项组成的列表的基因的天然启动子：TIR2、DAN1、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3、YLL025W、YOR394W、YHL046C、YMR325W、YAL068C、YPL282C、PAU2、PAU4，特别地，该PRK启动子是选自由以下项组成的列表的基因的天然启动子：TIR2、DAN1、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3、YLL025W。
在一个实施方式中，该启动子的厌氧/有氧PRK表达比为2或更高、3或更高、4或更高、5或更高、6或更高、7或更高、8或更高、9或更高、10或更高、20或更高，或50或更高。
如本文所用，“启动子”是指导(结构)基因(在本文中特别是一种或多种磷酸核酮糖激酶基因)转录的DNA序列。启动子能够在厌氧条件期间比在有氧条件下实现更高的表达。
在一个实施方式中，PRK启动子可以是合成的寡核苷酸。其可以是人工寡核苷酸合成的产物。人工寡核苷酸合成是合成生物学中用于在实验室中产生人工寡核苷酸(诸如基因)的方法。商业基因合成服务现在可以从世界各地的许多公司获得，这些公司中一些公司已经围绕这项任务建立了他们的商业模式。目前的基因合成方法最常见地基于有机化学和分子生物学技术的组合，并且可在不需要前体模板DNA的情况下“从头”合成整个基因。
在一个实施方式中，启动子位于PRK基因的5'区域，在一个实施方式中，其位于PRK基因的转录起始位点附近。
PRK启动子的厌氧/有氧PRK表达比可以为2或更高，3或更高，4或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，20或更高或50或更高。
在一个实施方式中，PRK启动子是合成的寡核苷酸。PRK启动子优选仅在厌氧条件下实现表达。
合适的PRK启动子是EP16174382.8中提到的ANB1和/或DAN1。
重组酵母可含有对细胞非天然的戊糖代谢途径的基因和/或允许重组细胞转化戊糖的基因。在一个实施方式中，重组酵母可包含一种或多种木糖异构酶基因的一个或两个或更多个拷贝和/或一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的一个或两个或更多个拷贝，从而允许重组酵母转化木糖。在其一个实施方式中，这些基因可以整合到重组细胞基因组中。在另一个实施方式中，重组酵母包含基因araA、araB和araD。然后它能够发酵阿拉伯糖。在一个实施方式中，重组酵母包含xylA基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1基因，以允许重组酵母发酵木糖；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达一种或多种PPP基因(例如TAL1、TAL2、TKL1、TKL2、RPE1和RKI1)以允许通过细胞中的戊糖磷酸途径来增加通量，和/或过表达GAL2和/或缺失GAL80。因此，通过包含上述基因，可以在重组酵母中引入在(野生型)重组酵母中是非天然的合适的戊糖代谢途径或其他代谢途径。
在一个实施方式中，重组酵母包含：
-编码甘油脱氢酶的核苷酸序列，
-编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(EC 4.1.1.39)的核苷酸序列；
-编码磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19)的核苷酸序列；
-编码葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.20或EC 3.2.1.3)的核苷酸序列；以及
-编码甘油转运体的核苷酸序列。
在一个实施方式中，可以通过引入到宿主细胞中来将以下基因引入重组酵母中：
1)由任选地在强组成型启动子的控制下的PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1组成的组；
2)由在强组成型启动子控制下的xylA基因组成的组；
3)包含在强组成型启动子控制下的XKS1基因的组，
4)由在强组成型启动子控制下的细菌基因araA、araB和araD组成的组，
5)缺失醛糖还原酶基因。
可以使用已知的重组表达技术来构建上述细胞。辅因子修饰可以在上述修饰1-5中的任一者之前、同时或之后进行。
重组酵母可选自酵母科(Saccharomycetaceae)，特别地选自以下项的组：酵母属，诸如酿酒酵母；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，诸如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)；毕赤酵母(Pichia)，诸如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)或安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)；接合酵母(Zygosaccharomyces)，诸如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)；以及酒香酵母(Brettanomyces)，诸如间型酒香酵母；伊萨酵母(Issatchenkia)，诸如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，以及汉逊酵母(Hansenula)。
可以对重组酵母进行进化工程以改善其性质。进化工程过程是已知的过程。进化工程是这样的过程，其中微生物(本文中的重组酵母)的工业相关表型可以通过合理设置的自然选择过程而与特定生长速率和/或对营养物的亲和力相偶联。例如，在Kuijper,M等人，FEMS,Eukaryotic cell Research 5(2005)925-934,WO2008041840和WO2009112472中详细描述了进化工程。在进化工程化后，分离得到的戊糖发酵重组细胞。分离可以以任何已知的方式进行，例如通过从进化工程中使用的重组细胞液中分离细胞，例如通过采集细胞样品或通过过滤或离心。
在一个实施方式中，重组酵母不含标记物。如本文所用，术语“标记物”是指编码允许选择或筛选含有标记物的宿主细胞的性状或表型的基因。不含标记物意指重组酵母中基本上不存在标记物。当抗生素标记物已用于构建重组酵母并随后去除时，不含标记物是特别有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如分子内重组)来去除标记物。
在一个实施方式中，基于抑制剂耐受性宿主细胞来构建重组酵母，其中构建如下文所述进行。可以通过筛选在含抑制剂的材料上生长的菌株来选择抑制剂耐受性宿主细胞，诸如在Kadar等人，Appl.Biochem.Biotechnol.(2007)，第136-140卷，847-858中所说明的，其中选择了抑制剂耐受性酿酒酵母菌株ATCC 26602。
为了增加酶活性在重组酵母中以足够的水平和活性形式表达的可能性，优选地调适编码这些酶以及Rubisco酶和本公开的其他酶的核苷酸序列，以针对所讨论的重组酵母的密码子使用来优化它们的密码子使用。
编码酶的核苷酸序列对细胞的密码子使用的适应性可以表示为密码子适应指数(CAI)。密码子适应指数在本文中被定义为基因的密码子使用相对特定细胞或生物中高表达基因的密码子使用的相对适应性的度量。每个密码子的相对适应性(w)是每个密码子的使用与相同氨基酸的最丰富密码子使用的比率。CAI指数被定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码子)。CAI值的范围为0到1，其中越高的值表明最丰富的密码子的比例越高(参见Sharp和Li，1987,Nucleic AcidsResearch 15:1281-1295；还参见：Jansen等人，2003,Nucleic Acids Res.31(8):2242-51)。经适应的核苷酸序列优选具有为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的CAI。最优选的是已经针对在所讨论的宿主细胞(例如酿酒酵母细胞)中表达进行了密码子优化的序列。
本发明还提供了根据本发明的重组酵母用于制备乙醇的用途。
本发明还提供了一种生产乙醇的方法，所述方法包括：
-在根据本发明的重组酵母存在下在厌氧条件下发酵组合物，所述组合物包含可发酵碳水化合物，所述可发酵碳水化合物特别地选自以下项的组：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖；以及
-回收乙醇。
在一个实施方式中，一种此类组合物是生物质水解产物。此类生物质水解产物可以是木质纤维素生物质水解产物。本文的木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可在以下列表中找到：果园底料(orchard primings)、树丛(chaparral)、磨坊废弃物(mill waste)、城市木材废弃物、市政废弃物、伐木废弃物、森林疏伐废弃物、短期轮种木本作物、工业废弃物、小麦秸、燕麦秸、水稻秸、大麦秸、黑麦秸、亚麻秸、大豆壳、稻壳、水稻秸、玉米谷蛋白饲料、燕麦壳、甘蔗、玉米秸秆、玉米杆、玉米芯、玉米壳、柳枝稷、芒草、甜高粱、芸苔茎、大豆茎、草原禾草、鸭茅状摩擦禾、狐尾草；甜菜粕、柑橘果实浆、种子壳、纤维素动物粪便、草坪修剪废弃物、棉花、海藻、树木、软木材、硬木材、白杨、松树、灌木丛、草、小麦、小麦秸、甘蔗渣、玉米、玉米壳、玉米棒、玉米粒、来自玉米粒的纤维、来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物、城市固体废弃物、废纸、庭院废弃物、草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废弃物、废纸、纸浆、造纸厂残余物、树枝、灌木、甘蔗、玉米、玉米壳、能源作物、森林、水果、花、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、灌木丛、柳枝稷，树木、蔬菜、水果皮、藤蔓、甜菜粕、小麦麸皮、燕麦壳、硬木材或软木材、由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或它们中的任意两种或更多种的组合。木质纤维素可被认为是潜在的可再生原料，其通常包括多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖和木葡聚糖)。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖存在，例如在木材来源的原料中。这些多糖成为可溶性糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用的不同酶的作用下。此外，果胶和诸如阿拉伯聚糖的其他果胶物质可占来自非木本植物组织的典型细胞壁干物质的可观的比例(干物质的约四分之一到一半可为果胶)。可以预处理木质纤维素材料。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械粉碎、碾磨、研磨或快速卸压，或它们中的任意两种或更多种的组合。化学预处理通常与热预处理(例如在150-220℃之间1到30分钟)组合。
在另一个实施方式中，此类组合物是经预处理的玉米秸秆水解产物。另一优选的组合物是任选经预处理的玉米纤维水解产物。
在另一个实施方式中，此类组合物是淀粉水解产物，诸如玉米淀粉水解产物。
在本发明的上下文中，“水解产物”是指多糖已经通过加入水而解聚形成单糖和寡糖。水解产物可以通过含多糖材料的酶促水解或酸水解来产生。
在一个实施方式中，可发酵的碳水化合物获自淀粉、木质纤维素和/或果胶。
可以将淀粉、木质纤维素和/或果胶与酶组合物接触，其中产生一种或多种糖，并且其中产生的糖被发酵以产生发酵产物，其中用本发明的重组酵母进行发酵。
当甘油从外部进料到该方法中，然后甘油由所要求保护的重组酵母摄入并转化为乙醇时，该方法是特别有用的。
在一个实施方式中，组合物包含10mM或更小的量的未离解(undissociated)的乙酸。
发明人已经发现，与非重组细胞相比，本发明的重组酵母，特别是酿酒酵母细胞，对乙酸特别敏感。他们已经令人惊讶地发现，当组合物包含大于10mM的未离解的乙酸时，乙醇产率迅速降低，并且为了避免或减轻乙酸的负面影响，该方法应该用具有10mM或更少，优选9mM或更少、8mM或更少、7mM或更少、6mM或更少、5mM或更少、4mM或更少、3mM或更少、2mM或更少、1mM或更少的量的未离解的乙酸的组合物执行。
在一个实施方式中，该组合物具有10mM或更少的初始未离解的乙酸。在另一个实施方式中，整个方法中未离解的乙酸的量为10mM或更少。
较少量的未离解的乙酸是不太重要的。在一个实施方式中，该组合物不含未离解的乙酸。
在一个实施方式中，未解离的乙酸的量的下限为50μM或更高、55μM或更高、60μM或更高、70μM或更高，80μM或更高、90μM或更高、100μM或更高。
技术人员理解的是，未离解的乙酸的量尤其取决于组合物中乙酸的总量(质子化和离解的)以及pH。
在一个实施方式中，通过调节pH，例如通过添加碱，将未离解的乙酸的量保持在10mM的值。
该方法可以包括监测pH的步骤。将组合物的pH优选地保持在介于4.2与5.2之间，优选地介于4.5与5.0之间。较低的pH优选使得未离解的乙酸的量为10mM或更少，这尤其取决于组合物中乙酸的总量。
技术人员知道如何提供或选择具有10mM或更少的量的未离解的乙酸的组合物。例如，他/她可以测量组合物中未离解的乙酸的量，并且仅选择未离解的乙酸的量为10mM或更少的那些组合物。
或者，如果组合物中未离解的乙酸的量超过10mM，则该方法可包括在发酵步骤之前添加碱(诸如NaOH或KOH)，直到组合物中未离解的乙酸的量达到10mM或更小的值。
未离解的乙酸的量可以通过HPLC分析。HPLC通常测量所有的乙酸(即未离解(即质子化)形式和离解形式的乙酸两者)，因为流动相通常是酸化的。为了测量组合物中未离解的乙酸的量，合适的方法是测量原样组合物的乙酸的(总)量，测量组合物的pH，并使用乙酸的pKa计算未离解的乙酸的量。
在一个实施方式中，本发明的方法包括以0.05g/L或更少的浓度投入葡糖淀粉酶，所述浓度表示为每升玉米浆中的葡糖淀粉酶的总量的克数。
术语“投入(dosing)”应理解为是指添加GA，所述GA并非是可经由功能性表达葡糖淀粉酶的酵母加入的任何GA或者所述GA作为可以经由功能性表达葡糖淀粉酶的酵母加入的任何GA的补充。
葡糖淀粉酶的量可以例如通过蛋白质组学或通过蛋白质印迹法确定。这些技术是本领域中已知的。葡糖淀粉酶可以以0.04g/L或更少、或0.03g/L或更少、或0.02g/L或更少、或0.01g/L或更少、或0.005g/L或更少的浓度投入。在一个实施方式中，以介于0g/kg与0.08g/kg之间(即，介于无GA与0.08g/kg之间)、或介于0g/kg与0.04g/kg之间、介于0g/kg与0.02g/kg之间的浓度投入葡糖淀粉酶。
在一个实施方式中，以介于0.005g/L与0.05g/L之间、介于0.01g/L与0.05g/L之间、介于0.02g/L与0.05g/L之间、介于0.03g/L与0.05g/L之间、或介于0.04g/L与0.05g/L之间的浓度投入葡糖淀粉酶。在一个实施方式中，以介于0.005g/L与0.04g/L之间、介于0.01g/L与0.04g/L之间、介于0.02g/L与0.04g/L之间、或介于0.03g/L与0.04g/L之间的浓度投入葡糖淀粉酶。在一个实施方式中，以介于0.005g/L与0.04g/L之间、介于0.005g/L与0.03g/L之间、介于0.005g/L与0.02g/L之间、或介于0.005g/L与0.01g/L之间的浓度投入葡糖淀粉酶。
在一个实施方式中，在不添加任何葡糖淀粉酶的情况下进行本发明的方法。
技术人员知道如何投入GA。可投入GA以进行发酵。在添加酵母之前或之后，可以单独投入GA。可以将GA作为干产品(例如作为粉末或颗粒、或作为液体)投入。可以将GA与诸如抗生素的其他组分一起投入。还可以将GA作为逆流物(back set)的一部分，逆流物即其中一部分稀釜馏物再循环到例如发酵物中的液流。也可以使用这些方法的组合来投入GA。
实施例
实施例1
本实施例涉及用来自以下十一种不同来源的葡糖淀粉酶转化的酿酒酵母菌株的性能：
-树脂枝胞菌菌株DAOM194228
-瘤孢棒囊孢壳菌ATCC9787
-黑曲霉
-里氏木霉
-灰葡萄孢菌BcDW1
-皱木耳TFB-10046SS5
-柄篮状菌ATCC 10500
-印度梨形孢菌DSM 11827
-皱革菌HHB-11173SS5
-扣囊复膜孢酵母
-糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)
使用乙醇红(Ethanol Red)作为起始菌株来制备菌株。乙醇红是可购自Lesaffre的商业酿酒酵母菌菌株。通过使整个ORF缺失，在乙醇红中进行HIS 3缺失。
根据表1，每个GA都被放置在其天然前导序列以及酿酒酵母α交配信号(Sc_Mfalfa.sig)的后面。所有表达盒都是作为启动子-ORF-终止子盒在DNA2.0订购的。所有信号序列-成熟ORF组合均在Sc_PGK1启动子的下游和Sc_ENO1终止子的上游。
所有表达盒均以与pRS313(具有HIS3标记的单拷贝载体)的50bp同源性扩增。pRS313质粒也被扩增。对于DNA扩增，根据制造商的说明使用Phusion高保真DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)。使用4ng模板和60℃的Tm进行DNA扩增。引物浓度范围从0.5μM的常规引物至0.05μM的较长引物(>50bp)。为了去除可能的污染物和残留的引物，使用NucleoSpin96PCR纯化试剂盒来纯化反应。具有GA表达盒的pRS313质粒是在体内装配的。
分两个阶段测试GA的性能。首先，在微量滴定板上测试菌株的微需氧生长。将每个转化的八个单菌落在30℃下在含有在J.Bacteriol.，2000年12月，第182卷，第24号，7007-7013中使用和描述的在pH 4.5和32℃下含有240g/L麦芽糖糊精和0.05％葡萄糖的培养基的孔中厌氧地孵育48h。结果在表2中。根据该第一筛选，决定选择来自里氏木霉、柄篮状菌、印度梨形孢菌、皱革菌、扣囊复膜孢酵母和糖化酵母的葡糖淀粉酶，因为只有这些葡糖淀粉酶是导致足够的GA表达以促进在含有淀粉作为唯一碳源的合成培养基上的厌氧生长的葡糖淀粉酶。
表2.微量滴定板中的微需氧生长
Figure BDA0002421169420000271
Figure BDA0002421169420000281
接下来，在pH 4.5和30℃下在微需氧条件下在含有240g/L麦芽糖糊精+0.05％葡萄糖+100倍稀释的GibcoTM青霉素-链霉素(10,000U/mL)的Verduyn培养基中进行摇瓶(SF)实验72h，以测试来自在微需氧MTP测试中选择的菌株的菌落在麦芽糖糊精上的生长。通过NMR光谱法通过测量α1→4键的量来测试麦芽糖糊精的降解能力，所述α1→4键的量指示完整(即未转化的)麦芽糖糊精的量。
为了定量残留的麦芽糊精，将100μl上清液样品准确转移到合适的小瓶中。随后加入100μl D2O中的含有马来酸(20g/l)、EDTA(40g/l)、DSS(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)(0.5g/L)和氢氧化钠(直到pH为6.40)的内标溶液。将该混合物冻干并在600μl D2O中重构。
在以400MHz的质子频率运行、配备有prodigy探头的Bruker Avance III HD光谱仪上，使用不带水压制的脉冲程序(ZG)在295K的温度下采用90度的激励脉冲、2.0秒的采集时间和40秒的弛豫延迟记录澄清溶液的1D 1H NMR谱图。将扫描次数设置为8，不使用虚拟扫描。
基于以下信号(相对于DSS的δ)计算分析物浓度[g/L]：麦芽糖糊精：α-H1多聚葡萄糖信号(m，5.56-5.25ppm)，计算为n＝1，并且MW为162克/摩尔。标准品使用的信号：马来酸峰6.4ppm(S，2H)左右。结果在表3中。
表3.通过α(1→4)键的量(任意单位)判定的麦芽糖降解
Figure BDA0002421169420000291
可以看出，在天然和酿酒酵母α交配信号序列两种情况下，皱革菌GA均表现出最佳性能。
实施例2
使用CRISPR-CAS9将四拷贝的含有天然前导序列(SEQ ID NO:37)的皱革菌葡糖淀粉酶(GA；SEQ ID NO:17)引入乙醇红中，乙醇红是可从LeSaffre购得的商业酿酒酵母。在开放阅读框(ORF)的前面放置有酿酒酵母PGK1启动子，在ORF后面放置有酿酒酵母ENO1终止子。除启动子-ORF-终止子序列外，GA表达盒5'端侧翼含有根据SEQ ID NO:50的2.J接头序列和3'端侧翼的根据SEQ ID NO:51的2.K接头序列。
为了实现正确的靶向整合，从乙醇红酵母基因组扩增长度从360bp到520bp不等的侧翼，所述侧翼包含与GA表达盒相同的接头序列。GA表达盒靶向整合位点INT59(根据SEQID NO:52的靶序列)和YPRcTAU3(根据SEQ ID NO:53的靶序列)，其中通过诊断PCR确认，这两个等位基因均被靶向。为了获得无标记物的菌株，通过在非选择性培养基上生长数轮，迫使细胞失去其包含标记物的质粒。最终，将无标记物的菌株贮存，并命名为FS0209。
通过将333g玉米粉(Limagrain,Belgium)/克醪液与300ml/kg稀釜馏物和367ml/kg的脱矿质水混合，来制备玉米醪液(30％(w/w)的固体)。用2M KOH溶液将pH调节至5.5。通过添加0.02g/kg的商业α-淀粉酶(Termamyl,Novozymes)而将混合物中的淀粉液化，并在旋转摇床上于80℃孵育4小时。液化后，用2M H2SO4溶液将pH调节至4.5。
通过从冷冻小瓶中接种200ml补充有2％w/v葡萄糖的YepH(20g/l植物蛋白胨、10g/l酵母提取物)来预培养乙醇红和FS0209，并在500ml摇瓶中孵育20h。为了确定酵母的接种量，通过过滤并经由CEM-SMART微波干燥来确定培养物的干细胞重量(DCW)含量。将对应于增殖所需的接种量的一定量的预培养物离心(3分钟，4500x g)，用无菌脱矿质水洗涤一次，再离心一次，重悬于增殖培养基中，并转移至增殖瓶中。
在32℃、150rpm下在带有泡沫塞的100ml锥形摇瓶(Erlenmeyer shake flask)中执行增殖6h，从而形成有氧环境。将增殖培养基稀释成70％溶液，检查到pH为4.5，并向所述溶液中供应1.25g/l尿素和抗生素(新霉素和PenG)。对于乙醇红，添加0.088g/l的商业淀粉葡糖苷酶(Spirizyme Excel,novozymes)。
在AFM装置(Applikon,Schiedam,the Netherlands)中使用装有360ml玉米醪液的500ml schott瓶，以同时糖化发酵(simultaneous saccharification fermentation,SSF)模式执行发酵。将玉米醪液原样使用，加入1g/l尿素和抗生素，pH为4.5。将不同浓度的商业淀粉葡糖苷酶(Spirizyme Excel,Novozymes)添加到发酵瓶中。发酵器的接种是通过将10％的增殖培养基转移到发酵器中，达到400ml的体积而完成的。发酵期间不控制pH，同时将温度控制在32℃。在整个运行过程中采集发酵样品，并通过使用具有柱温箱TCC-3400和自动进样器WPS-3000、配备有保护柱(Bio-Rad H柱)和Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm；Bio-Rad,Hercules,USA)的Dionex Ultimate 3000HPLC系统进行HPLC分析来测量不同的组分；用5mM H2SO4以0.55ml/min在65℃下进行洗脱；使用折射率检测器RefractoMax 521监测洗脱液。在发酵期间在线测量CO2。结果示于表4中。
表4.乙醇产率
菌株 GA剂量(g/kg) 46h 53h 72h
乙醇红 0.16 103.4 113.4 128.7
乙醇红 0 15.5 15.7 16.0
FS0209 0.08 113.8 121.9 130.4
FS0209 0.04 122.3 125.7 136.5
FS0209 0.02 107.4 113.2 122.9
FS0209 0 119.2 122.1 123.9
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120> 改进的无甘油乙醇生产
<130> 32596-WO-PCT
<160> 53
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 365
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<220>
<223> 肺炎克雷伯氏菌甘油脱氢酶(Kpne_gldA)的氨基酸
序列
<400> 1
Met Leu Lys Val Ile Gln Ser Pro Ala Lys Tyr Leu Gln Gly Pro Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Leu Phe Gly Gln Tyr Ala Lys Asn Leu Ala Glu Ser Phe
20 25 30
Phe Val Ile Ala Asp Asp Phe Val Met Lys Leu Ala Gly Glu Lys Val
35 40 45
Val Asn Gly Leu Gln Ser His Asp Ile Arg Cys His Ala Glu Arg Phe
50 55 60
Asn Gly Glu Cys Ser His Ala Glu Ile Asn Arg Leu Met Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gln Lys Gln Gly Cys Arg Gly Val Val Gly Ile Gly Gly Gly Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Lys Ala Ile Gly Tyr Tyr Gln Lys Leu Pro Val Val
100 105 110
Val Ile Pro Thr Ile Ala Ser Thr Asp Ala Pro Thr Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Val Ile Tyr Thr Glu Ala Gly Glu Phe Glu Glu Tyr Leu Ile Tyr Pro
130 135 140
Lys Asn Pro Asp Met Val Val Met Asp Thr Ala Ile Ile Ala Lys Ala
145 150 155 160
Pro Val Arg Leu Leu Val Ser Gly Met Gly Asp Ala Leu Ser Thr Trp
165 170 175
Phe Glu Ala Lys Ala Cys Tyr Asp Ala Arg Ala Thr Ser Met Ala Gly
180 185 190
Gly Gln Ser Thr Glu Ala Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Cys Tyr Asp
195 200 205
Thr Leu Leu Ala Glu Gly Glu Lys Ala Arg Leu Ala Ala Gln Ala Gly
210 215 220
Val Val Thr Glu Ala Leu Glu Arg Ile Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Ile Gly Phe Glu Ser Ser Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Ile
245 250 255
His Asn Gly Phe Thr Ile Leu Glu Glu Cys His His Leu Tyr His Gly
260 265 270
Glu Lys Val Ala Phe Gly Thr Leu Ala Gln Leu Val Leu Gln Asn Ser
275 280 285
Pro Met Asp Glu Ile Glu Thr Val Leu Gly Phe Cys Gln Arg Val Gly
290 295 300
Leu Pro Val Thr Leu Ala Gln Met Gly Val Lys Glu Gly Ile Asp Ala
305 310 315 320
Lys Ile Ala Ala Val Ala Lys Ala Thr Cys Ala Glu Gly Glu Thr Ile
325 330 335
His Asn Met Pro Phe Ala Val Thr Pro Glu Ser Val His Ala Ala Ile
340 345 350
Leu Thr Ala Asp Leu Leu Gly Gln Gln Trp Leu Ala Arg
355 360 365
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> 产气肠杆菌(Enterococcus aerogenes)
<220>
<223> 产气肠杆菌甘油脱氢酶(Eaer_gldA)的氨基酸
序列
<400> 2
Met Asp Arg Ile Ile Gln Ser Pro Gly Lys Tyr Ile Gln Gly Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ile Lys Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Lys Pro Leu Ala Glu Arg Trp
20 25 30
Leu Ile Ile Gly Asp Lys Phe Val Leu Gly Phe Ala Glu Glu Gln Leu
35 40 45
Arg Thr Ser Leu Gly Gly Ala Gly Leu Val Ala Glu Ile Ala Pro Phe
50 55 60
Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Glu Ile Asn Arg Leu Arg Asp Ile Ala
65 70 75 80
Ser Ser Ala Gln Cys His Ala Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala His Tyr Met His Leu Pro Val Val
100 105 110
Val Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Asp Ala Pro Cys Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Val Ile Tyr Thr Asp Asp Gly Glu Phe Glu Ser Tyr Leu Met Leu Pro
130 135 140
His Asn Pro Asn Met Val Val Val Asp Thr Gln Ile Val Ala Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ala Arg Leu Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asp Ala Leu Ala Thr Trp
165 170 175
Phe Glu Ala Arg Ala Cys Ser Arg Ser Gly Ala Thr Thr Met Ala Gly
180 185 190
Gly Lys Cys Thr Gln Ala Ala Leu Ala Leu Ala Glu Leu Cys Tyr Asn
195 200 205
Thr Leu Val Glu Glu Gly Glu Lys Ala Met Leu Ala Ala Glu Gln His
210 215 220
Val Val Thr Pro Ala Leu Glu Arg Val Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Val Gly Phe Glu Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Ile
245 250 255
His Asn Gly Leu Thr Ala Ile Pro Asp Ala His His Phe Tyr His Gly
260 265 270
Glu Lys Val Ala Phe Gly Thr Leu Thr Gln Leu Val Leu Glu Asn Ala
275 280 285
Pro Val Glu Glu Ile Glu Thr Ala Ala Ala Leu Cys His Ser Val Gly
290 295 300
Leu Pro Ile Thr Leu Ala Gln Leu Asp Ile Lys Gly Asp Ile Pro Ala
305 310 315 320
Lys Met Arg Thr Val Ala Glu Ala Ala Cys Ala Glu Gly Glu Thr Ile
325 330 335
His Asn Met Pro Gly Gly Ala Cys Ala Asp Gln Val Tyr Ala Ala Leu
340 345 350
Leu Val Ala Asp Gln Tyr Gly Gln Arg Phe Leu Gln Glu Trp Glu
355 360 365
<210> 3
<211> 364
<212> PRT
<213> 阿氏耶尔森氏菌(Yersinia aldovae)
<220>
<223> 阿氏耶尔森氏菌甘油脱氢酶(Eaer_gldA)的氨基酸序列
<400> 3
Met Leu Lys Val Ile Gln Ser Pro Ser Lys Tyr Ile Gln Gly Ala Asn
1 5 10 15
Ala Leu Gln Ser Ile Gly Glu Phe Ala Lys Leu Leu Ala Asn Asn Tyr
20 25 30
Phe Ile Ile Ala Asp Asp Phe Val Met Lys Leu Thr Ala Asp Thr Val
35 40 45
Gly Thr Ser Leu Gln Thr Cys Glu Leu Lys Ser His Phe Ser Arg Phe
50 55 60
Asn Gly Glu Cys Ser Arg Gln Glu Ile Glu Arg Leu Thr Val Glu Leu
65 70 75 80
Lys Lys Tyr Gly Cys Asn Gly Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Lys Ala Ile Ala His Tyr Gln His Ile Pro Val Val
100 105 110
Val Val Pro Thr Ile Ala Ser Thr Asp Ala Pro Thr Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Val Ile Tyr Thr Glu Gln Gly Glu Phe Ala Glu Tyr Leu Ile Tyr Pro
130 135 140
Lys Asn Pro Asp Ile Val Leu Met Asp Thr Thr Ile Ile Ala Lys Ala
145 150 155 160
Pro Val Arg Leu Leu Val Ala Gly Met Gly Asp Ala Leu Ser Thr Tyr
165 170 175
Phe Glu Ala Gln Ala Cys Phe Asp Ala Lys Ala Ile Ser Met Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ala Ile Thr Leu Ala Arg Leu Cys Tyr Glu
195 200 205
Thr Leu Leu Ala Glu Gly Tyr Lys Ala Lys Leu Ala Val Glu Ala Gly
210 215 220
Val Val Thr Glu Ala Val Glu Arg Ile Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Ile Gly Phe Glu Ser Ser Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Ile
245 250 255
His Asn Gly Phe Thr Val Leu Glu Glu Cys His His Leu Tyr His Gly
260 265 270
Glu Lys Val Ala Phe Gly Thr Leu Thr Gln Leu Val Leu Gln Asn Ser
275 280 285
Ser Met Glu Glu Ile Glu Thr Val Leu Ser Phe Cys Gln Gln Leu Gly
290 295 300
Leu Pro Ile Thr Leu Ala Glu Met Gly Val Thr Gln Asp Leu Glu Cys
305 310 315 320
Lys Ile Arg Ala Val Ala Gln Ala Ser Cys Ala Glu Gly Glu Thr Ile
325 330 335
His Asn Met Pro Phe Lys Val Thr Ala Asp Ser Val Tyr Ala Ala Ile
340 345 350
Ile Val Ala Asp Arg Leu Gly Gln Ala Phe Leu Asn
355 360
<210> 4
<211> 572
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<220>
<223> 肺炎克雷伯氏菌二羟基丙酮激酶(Kpne_dhaK)的氨基酸
序列
<400> 4
Met Thr Thr Lys Gln Phe Gln Phe Asp Ser Asp Pro Leu Asn Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ser Gly Leu Ala Tyr Leu Pro Lys Ser
20 25 30
Lys Val Ile Tyr Tyr Pro Leu Thr Asn Asp Lys Val Thr Leu Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ala Gly His Glu Pro Ala Gln Thr Gly Phe Val Gly Pro
50 55 60
Gly Leu Leu Asp Ala Ala Val Ser Gly Gln Ile Phe Ala Ser Pro Ser
65 70 75 80
Thr Lys Gln Ile Ile Ala Gly Val Asn Ala Val Lys Ser Gln Arg Gly
85 90 95
Ser Ile Ile Ile Val Met Asn Tyr Thr Gly Asp Val Ile His Phe Gly
100 105 110
Met Ala Ala Glu Gln Leu Arg Ser Arg Tyr Asp Tyr His Ala Glu Leu
115 120 125
Val Ser Ile Gly Asp Asp Ile Ser Val Asn Lys Lys Ala Gly Arg Arg
130 135 140
Gly Leu Ala Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile Ala Gly His Leu Ala
145 150 155 160
Arg Asp Gly Trp Asp Val Gly Val Leu Ala Glu Ala Leu Arg Thr Thr
165 170 175
Ala Ala Asn Leu Ala Thr Val Ala Ala Ser Leu Glu His Cys Thr Val
180 185 190
Pro Gly Arg Lys Phe Glu Thr Glu Leu Ala Ala Asp Glu Met Glu Ile
195 200 205
Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro Gly Val Lys Thr Ile Lys Ile Gly
210 215 220
Lys Val Glu Ser Leu Leu Asp Glu Leu Val Asp Lys Phe Glu Pro Ser
225 230 235 240
Lys Gln Asp Phe Val Pro Phe Asn Lys Gly Asp Glu Val Val Leu Leu
245 250 255
Val Asn Ser Leu Gly Gly Val Ser Ser Leu Glu Leu His Ala Ile Ala
260 265 270
Asn Ile Ala Gln Thr Lys Phe Glu Lys Val Leu Gly Val Lys Thr Val
275 280 285
Arg Leu Ile Val Gly Asn Phe Met Ala Ala Phe Asn Gly Pro Gly Phe
290 295 300
Ser Leu Thr Leu Leu Asn Val Thr Thr Thr Ala Lys Lys Gly Asn Phe
305 310 315 320
Asp Val Leu Gly Ala Leu Asp Ala Pro Val Ser Thr Ala Ala Trp Pro
325 330 335
Ser Leu Gln Gln Lys Asp Lys Pro Ala Asn Gly Gly Val Gln Glu Glu
340 345 350
Lys Glu Thr Asp Ser Asp Lys Pro Ala Glu Pro Thr Gly Ile Lys Ala
355 360 365
Asp Gly Lys Leu Phe Lys Ala Met Ile Glu Ser Ala Val Asp Asp Leu
370 375 380
Lys Lys Glu Glu Pro Gln Ile Thr Lys Tyr Asp Thr Ile Ala Gly Asp
385 390 395 400
Gly Asp Cys Gly Glu Thr Leu Leu Ala Gly Gly Asp Gly Ile Leu Asp
405 410 415
Ala Ile Lys Asn Lys Lys Ile Asp Leu Asp Asp Ala Ala Gly Val Ala
420 425 430
Asp Ile Ser His Ile Val Glu Asn Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly
435 440 445
Leu Tyr Ser Ile Phe Phe Ser Gly Leu Val Val Gly Ile Lys Glu Thr
450 455 460
Lys Ala Lys Glu Leu Ser Val Asp Val Phe Ala Lys Ala Cys Glu Thr
465 470 475 480
Ala Leu Glu Thr Leu Ser Lys Tyr Thr Gln Ala Arg Val Gly Asp Arg
485 490 495
Thr Leu Met Asp Ala Leu Val Pro Phe Val Glu Thr Leu Ser Lys Thr
500 505 510
Lys Asp Phe Ala Lys Ala Val Glu Ala Ala Arg Lys Gly Ala Asp Glu
515 520 525
Thr Ser Lys Leu Pro Ala Asn Phe Gly Arg Ala Ser Tyr Val Asn Glu
530 535 540
Glu Gly Leu Glu Asn Ile Pro Asp Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Val
545 550 555 560
Ile Phe Glu Gly Leu Leu Lys Ala Trp Glu Lys Lys
565 570
<210> 5
<211> 580
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<220>
<223> 解脂耶氏酵母二羟基丙酮激酶(Ylip_DAK1)的氨基酸
序列
<400> 5
Met Asp Lys His Phe Ile Asn Asp Pro Glu Val Leu Val Leu Asp Gly
1 5 10 15
Leu Lys Ser Leu Ala Asp Met Asn Lys Thr Leu Thr Val His Glu Glu
20 25 30
Gly Lys Phe Ile Tyr Phe His Asp Tyr Asn Lys Lys Asn Val Ser Val
35 40 45
Ile Ser Gly Gly Gly Ala Gly His Glu Pro Thr His Ser Ser Phe Val
50 55 60
Gly Lys Gly Met Leu Thr Ala Ala Val Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ser
65 70 75 80
Pro Ser Ser Lys Gln Ile Tyr Thr Gly Ile Lys Gln Val Glu Ser Glu
85 90 95
Ala Gly Thr Leu Val Ile Cys Lys Asn Tyr Thr Gly Asp Ile Leu His
100 105 110
Phe Gly Met Ala Leu Glu Lys Gln Arg Thr Ala Gly Lys Lys Ala Glu
115 120 125
Leu Ile Ala Val Ala Asp Asp Val Ser Val Gly Arg Lys Lys Ser Gly
130 135 140
Lys Val Gly Arg Arg Gly Leu Ser Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile
145 150 155 160
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Arg Gly Leu Pro Leu Glu Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ile Ala Lys Ala Ala Ile Asp Asn Leu Val Ser Ile Gly Ala Ser Leu
180 185 190
Ala His Val His Val Pro Gly His Glu Pro Ile Ala Lys Glu Asp Glu
195 200 205
Met Lys His Asp Glu Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro
210 215 220
Gly Cys Lys Arg Ile Ser Pro Ile Pro Ser Ile Asp Asp Leu Ile Ala
225 230 235 240
Gln Met Leu Lys Gln Met Leu Asp Gln Ser Asp Lys Asp Arg Ala Tyr
245 250 255
Val Lys Ile Glu Gly Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Met Asn Asn Leu
260 265 270
Gly Gly Leu Ser Met Leu Glu Phe Ser Ala Ile Ser His Lys Val Lys
275 280 285
Glu Ala Leu Ala Lys Glu Tyr Lys Ile Asn Pro Val Arg Ile Phe Ala
290 295 300
Gly Pro Phe Thr Thr Ser Leu Asn Gly Leu Gly Phe Gly Ile Thr Leu
305 310 315 320
Leu Arg Thr Thr Asp Arg Val Lys Val Glu Gly Glu Glu Tyr Ser Leu
325 330 335
Val Asp Leu Ile Asp Gln Pro Val Glu Ala Ile Gly Trp Pro Leu Cys
340 345 350
Gln Pro Ser Asp Leu Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Asn Val Ser Ile
355 360 365
Glu Glu Gly Gln Lys Asp Val Lys Ser Pro Val Thr Val Asp Lys Glu
370 375 380
Lys Val Arg Gln Ala Ile Val Asn Ser Met Glu Asn Leu Ile Lys Ala
385 390 395 400
Glu Pro Lys Ile Thr Lys Phe Asp Thr Met Ala Gly Asp Gly Asp Cys
405 410 415
Gly Thr Thr Leu Lys Arg Gly Ala Glu Gly Val Leu Lys Phe Val Lys
420 425 430
Ser Asp Lys Phe Ser Asp Asp Pro Ile Arg Ile Val Arg Asp Ile Ala
435 440 445
Asp Val Ile Glu Asp Asn Met Asp Gly Thr Ser Gly Ala Leu Tyr Ala
450 455 460
Ile Phe Phe His Gly Phe Ala Lys Gly Met Lys Asp Thr Leu Glu Lys
465 470 475 480
Ser Lys Asp Ile Ser Ser Lys Thr Trp Ala Ala Gly Leu Lys Val Ala
485 490 495
Leu Asp Thr Leu Phe Lys Tyr Thr Pro Ala Arg Pro Gly Asp Ser Thr
500 505 510
Met Cys Asp Ala Leu Val Pro Phe Val Glu Thr Phe Val Lys Thr Asn
515 520 525
Asp Leu Asn Ala Ala Val Glu Glu Ala Arg Lys Gly Ala Asp Ala Thr
530 535 540
Ala Asp Met Gln Ala Lys Leu Gly Arg Ala Val Tyr Val Gly Asp Asp
545 550 555 560
Val Lys Val Pro Asp Ala Gly Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Val Glu
565 570 575
Gly Phe Thr Lys
580
<210> 6
<211> 580
<212> PRT
<213> 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)
<220>
<223> 粟酒裂殖酵母二羟基丙酮激酶(Spom_DAK1)的氨基酸序列
<400> 6
Met Asp Lys His Phe Ile Asn Asp Pro Glu Val Leu Val Leu Asp Gly
1 5 10 15
Leu Lys Ser Leu Ala Asp Met Asn Lys Thr Leu Thr Val His Glu Glu
20 25 30
Gly Lys Phe Ile Tyr Phe His Asp Tyr Asn Lys Lys Asn Val Ser Val
35 40 45
Ile Ser Gly Gly Gly Ala Gly His Glu Pro Thr His Ser Ser Phe Val
50 55 60
Gly Lys Gly Met Leu Thr Ala Ala Val Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ser
65 70 75 80
Pro Ser Ser Lys Gln Ile Tyr Thr Gly Ile Lys Gln Val Glu Ser Glu
85 90 95
Ala Gly Thr Leu Val Ile Cys Lys Asn Tyr Thr Gly Asp Ile Leu His
100 105 110
Phe Gly Met Ala Leu Glu Lys Gln Arg Thr Ala Gly Lys Lys Ala Glu
115 120 125
Leu Ile Ala Val Ala Asp Asp Val Ser Val Gly Arg Lys Lys Ser Gly
130 135 140
Lys Val Gly Arg Arg Gly Leu Ser Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile
145 150 155 160
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Arg Gly Leu Pro Leu Glu Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ile Ala Lys Ala Ala Ile Asp Asn Leu Val Ser Ile Gly Ala Ser Leu
180 185 190
Ala His Val His Val Pro Gly His Glu Pro Ile Ala Lys Glu Asp Glu
195 200 205
Met Lys His Asp Glu Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro
210 215 220
Gly Cys Lys Arg Ile Ser Pro Ile Pro Ser Ile Asp Asp Leu Ile Ala
225 230 235 240
Gln Met Leu Lys Gln Met Leu Asp Gln Ser Asp Lys Asp Arg Ala Tyr
245 250 255
Val Lys Ile Glu Gly Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Met Asn Asn Leu
260 265 270
Gly Gly Leu Ser Met Leu Glu Phe Ser Ala Ile Ser His Lys Val Lys
275 280 285
Glu Ala Leu Ala Lys Glu Tyr Lys Ile Asn Pro Val Arg Ile Phe Ala
290 295 300
Gly Pro Phe Thr Thr Ser Leu Asn Gly Leu Gly Phe Gly Ile Thr Leu
305 310 315 320
Leu Arg Thr Thr Asp Arg Val Lys Val Glu Gly Glu Glu Tyr Ser Leu
325 330 335
Val Asp Leu Ile Asp Gln Pro Val Glu Ala Ile Gly Trp Pro Leu Cys
340 345 350
Gln Pro Ser Asp Leu Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Asn Val Ser Ile
355 360 365
Glu Glu Gly Gln Lys Asp Val Lys Ser Pro Val Thr Val Asp Lys Glu
370 375 380
Lys Val Arg Gln Ala Ile Val Asn Ser Met Glu Asn Leu Ile Lys Ala
385 390 395 400
Glu Pro Lys Ile Thr Lys Phe Asp Thr Met Ala Gly Asp Gly Asp Cys
405 410 415
Gly Thr Thr Leu Lys Arg Gly Ala Glu Gly Val Leu Lys Phe Val Lys
420 425 430
Ser Asp Lys Phe Ser Asp Asp Pro Ile Arg Ile Val Arg Asp Ile Ala
435 440 445
Asp Val Ile Glu Asp Asn Met Asp Gly Thr Ser Gly Ala Leu Tyr Ala
450 455 460
Ile Phe Phe His Gly Phe Ala Lys Gly Met Lys Asp Thr Leu Glu Lys
465 470 475 480
Ser Lys Asp Ile Ser Ser Lys Thr Trp Ala Ala Gly Leu Lys Val Ala
485 490 495
Leu Asp Thr Leu Phe Lys Tyr Thr Pro Ala Arg Pro Gly Asp Ser Thr
500 505 510
Met Cys Asp Ala Leu Val Pro Phe Val Glu Thr Phe Val Lys Thr Asn
515 520 525
Asp Leu Asn Ala Ala Val Glu Glu Ala Arg Lys Gly Ala Asp Ala Thr
530 535 540
Ala Asp Met Gln Ala Lys Leu Gly Arg Ala Val Tyr Val Gly Asp Asp
545 550 555 560
Val Lys Val Pro Asp Ala Gly Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Val Glu
565 570 575
Gly Phe Thr Lys
580
<210> 7
<211> 291
<212> PRT
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<220>
<223> 斑马鱼水通道蛋白9 (Drer_T3)的氨基酸序列
<400> 7
Met Glu Tyr Leu Glu Asn Ile Arg Asn Leu Arg Gly Arg Cys Val Leu
1 5 10 15
Arg Arg Asp Ile Ile Arg Glu Phe Leu Ala Glu Leu Leu Gly Thr Phe
20 25 30
Val Leu Ile Leu Phe Gly Cys Gly Ser Val Ala Gln Thr Val Leu Ser
35 40 45
Arg Glu Ala Lys Gly Gln Leu Leu Thr Ile His Phe Gly Phe Thr Leu
50 55 60
Gly Val Met Leu Ala Val Tyr Met Ala Gly Gly Val Ser Gly Gly His
65 70 75 80
Val Asn Pro Ala Val Ser Leu Ala Met Val Val Leu Arg Lys Leu Pro
85 90 95
Leu Lys Lys Phe Pro Val Tyr Val Leu Ala Gln Phe Leu Gly Ala Phe
100 105 110
Phe Gly Ser Cys Ala Val Tyr Cys Leu Tyr Tyr Asp Ala Phe Thr Glu
115 120 125
Phe Ala Asn Gly Glu Leu Ala Val Thr Gly Pro Asn Val Thr Ala Gly
130 135 140
Ile Phe Ala Ser Tyr Pro Arg Glu Gly Leu Ser Leu Leu Asn Gly Phe
145 150 155 160
Ile Asp Gln Val Ile Gly Ala Gly Ala Leu Val Leu Cys Ile Leu Ala
165 170 175
Val Val Asp Lys Lys Asn Ile Gly Ala Pro Lys Gly Met Glu Pro Leu
180 185 190
Leu Val Gly Leu Ser Ile Leu Ala Ile Gly Val Ser Met Ala Leu Asn
195 200 205
Cys Gly Tyr Pro Ile Asn Pro Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Phe
210 215 220
Thr Ala Ile Ala Gly Trp Gly Leu Thr Val Phe Ser Ala Gly Asn Gly
225 230 235 240
Trp Trp Trp Val Pro Val Val Gly Pro Met Val Gly Gly Val Val Gly
245 250 255
Ala Ala Ile Tyr Phe Leu Met Ile Glu Met His His Pro Glu Asn Asp
260 265 270
Lys Asn Leu Glu Asp Asp Asn Ser Leu Lys Asp Lys Tyr Glu Leu Asn
275 280 285
Thr Val Asn
290
<210> 8
<211> 592
<212> PRT
<213> 鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)
<220>
<223> 鲁氏接合酵母ZYRO0E01210p (Zrou_T5)的氨基酸序列
<400> 8
Met Gly Lys Arg Thr Gln Gly Phe Met Asp Tyr Val Phe Ser Arg Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Gly Leu Lys Gly Ala Arg Leu Arg Tyr Thr Ala Ala Ala
20 25 30
Val Ala Val Ile Gly Phe Ala Leu Phe Gly Tyr Asp Gln Gly Leu Met
35 40 45
Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asp Gln Phe Asn Lys Glu Phe Pro Pro Thr
50 55 60
Lys Ser Asn Gly Asp Asn Asp Arg Tyr Ala Ser Val Ile Gln Gly Ala
65 70 75 80
Val Thr Ala Cys Tyr Glu Ile Gly Cys Phe Phe Gly Ser Leu Phe Val
85 90 95
Leu Phe Phe Gly Asp Ala Ile Gly Arg Lys Pro Leu Ile Ile Phe Gly
100 105 110
Ala Ile Ile Val Ile Ile Gly Thr Val Ile Ser Thr Ala Pro Phe His
115 120 125
His Ala Trp Gly Leu Gly Gln Phe Val Val Gly Arg Val Ile Thr Gly
130 135 140
Val Gly Thr Gly Phe Asn Thr Ser Thr Ile Pro Val Trp Gln Ser Glu
145 150 155 160
Met Thr Lys Pro Asn Ile Arg Gly Ala Met Ile Asn Leu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Ile Ala Phe Gly Thr Met Ile Ala Tyr Trp Leu Asp Phe Gly Phe
180 185 190
Ser Phe Ile Asn Ser Ser Val Gln Trp Arg Phe Pro Val Ser Val Gln
195 200 205
Ile Ile Phe Ala Leu Val Leu Leu Phe Gly Ile Val Arg Met Pro Glu
210 215 220
Ser Pro Arg Trp Leu Met Ala Lys Lys Arg Pro Ala Glu Ala Arg Tyr
225 230 235 240
Val Leu Ala Cys Leu Asn Asp Leu Pro Glu Asn Asp Asp Ala Ile Leu
245 250 255
Ala Glu Met Thr Ser Leu His Glu Ala Val Asn Arg Ser Ser Asn Gln
260 265 270
Lys Ser Gln Met Lys Ser Leu Phe Ser Met Gly Lys Gln Gln Asn Phe
275 280 285
Ser Arg Ala Leu Ile Ala Ser Ser Thr Gln Phe Phe Gln Gln Phe Thr
290 295 300
Gly Cys Asn Ala Ala Ile Tyr Tyr Ser Thr Val Leu Phe Gln Thr Thr
305 310 315 320
Val Gln Leu Asp Arg Leu Leu Ala Met Ile Leu Gly Gly Val Phe Ala
325 330 335
Thr Val Tyr Thr Leu Ser Thr Leu Pro Ser Phe Tyr Leu Val Glu Lys
340 345 350
Val Gly Arg Arg Lys Met Phe Phe Phe Gly Ala Leu Gly Gln Gly Ile
355 360 365
Ser Phe Ile Ile Thr Phe Ala Cys Leu Val Asn Pro Thr Lys Gln Asn
370 375 380
Ala Lys Gly Ala Ala Val Gly Leu Tyr Leu Phe Ile Ile Cys Phe Gly
385 390 395 400
Leu Ala Ile Leu Glu Leu Pro Trp Ile Tyr Pro Pro Glu Ile Ala Ser
405 410 415
Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Asn Ala Met Ser Thr Cys Thr Asn Trp
420 425 430
Val Thr Asn Phe Ala Val Val Met Phe Thr Pro Val Phe Ile Gln Thr
435 440 445
Ser Gln Trp Gly Cys Tyr Leu Phe Phe Ala Val Met Asn Phe Ile Tyr
450 455 460
Leu Pro Val Ile Phe Phe Phe Tyr Pro Glu Thr Ala Gly Arg Ser Leu
465 470 475 480
Glu Glu Ile Asp Ile Ile Phe Ala Lys Ala His Val Asp Gly Thr Leu
485 490 495
Pro Trp Met Val Ala His Arg Leu Pro Lys Leu Ser Met Thr Glu Val
500 505 510
Glu Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Gly Leu His Asp Asp Glu Asn Glu Lys
515 520 525
Glu Glu Tyr Asp Glu Lys Glu Ala Glu Ala Asn Ala Ala Leu Phe Gln
530 535 540
Val Glu Thr Ser Ser Lys Ser Pro Ser Ser Asn Arg Lys Asp Asp Asp
545 550 555 560
Ala Pro Ile Glu His Asn Glu Val Gln Glu Ser Asn Asp Asn Ser Ser
565 570 575
Asn Ser Ser Asn Val Glu Ala Pro Ile Pro Val His His Asn Asp Pro
580 585 590
<210> 9
<211> 97
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 来自大肠杆菌的groES
<400> 9
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile
35 40 45
Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Ile
50 55 60
Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser Glu Lys Ile Asp Asn
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu Ser Asp Ile Leu Ala Ile Val Glu
85 90 95
Ala
<210> 10
<211> 548
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 来自大肠杆菌的groEL
<400> 10
Met Ala Ala Lys Asp Val Lys Phe Gly Asn Asp Ala Arg Val Lys Met
1 5 10 15
Leu Arg Gly Val Asn Val Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly
20 25 30
Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Ser Phe Gly Ala Pro Thr
35 40 45
Ile Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Arg Glu Ile Glu Leu Glu Asp
50 55 60
Lys Phe Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys
65 70 75 80
Ala Asn Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala
85 90 95
Gln Ala Ile Ile Thr Glu Gly Leu Lys Ala Val Ala Ala Gly Met Asn
100 105 110
Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Thr Ala Ala Val
115 120 125
Glu Glu Leu Lys Ala Leu Ser Val Pro Cys Ser Asp Ser Lys Ala Ile
130 135 140
Ala Gln Val Gly Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asp Glu Thr Val Gly Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Lys Glu Gly Val Ile Thr
165 170 175
Val Glu Asp Gly Thr Gly Leu Gln Asp Glu Leu Asp Val Val Glu Gly
180 185 190
Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Lys Pro
195 200 205
Glu Thr Gly Ala Val Glu Leu Glu Ser Pro Phe Ile Leu Leu Ala Asp
210 215 220
Lys Lys Ile Ser Asn Ile Arg Glu Met Leu Pro Val Leu Glu Ala Val
225 230 235 240
Ala Lys Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly
245 250 255
Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Thr Met Arg Gly Ile Val Lys
260 265 270
Val Ala Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met
275 280 285
Leu Gln Asp Ile Ala Thr Leu Thr Gly Gly Thr Val Ile Ser Glu Glu
290 295 300
Ile Gly Met Glu Leu Glu Lys Ala Thr Leu Glu Asp Leu Gly Gln Ala
305 310 315 320
Lys Arg Val Val Ile Asn Lys Asp Thr Thr Thr Ile Ile Asp Gly Val
325 330 335
Gly Glu Glu Ala Ala Ile Gln Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Gln
340 345 350
Ile Glu Glu Ala Thr Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg
355 360 365
Val Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala
370 375 380
Thr Glu Val Glu Met Lys Glu Lys Lys Ala Arg Val Glu Asp Ala Leu
385 390 395 400
His Ala Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly Val Val Ala Gly Gly Gly
405 410 415
Val Ala Leu Ile Arg Val Ala Ser Lys Leu Ala Asp Leu Arg Gly Gln
420 425 430
Asn Glu Asp Gln Asn Val Gly Ile Lys Val Ala Leu Arg Ala Met Glu
435 440 445
Ala Pro Leu Arg Gln Ile Val Leu Asn Cys Gly Glu Glu Pro Ser Val
450 455 460
Val Ala Asn Thr Val Lys Gly Gly Asp Gly Asn Tyr Gly Tyr Asn Ala
465 470 475 480
Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Asn Met Ile Asp Met Gly Ile Leu Asp Pro
485 490 495
Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Tyr Ala Ala Ser Val Ala Gly
500 505 510
Leu Met Ile Thr Thr Glu Cys Met Val Thr Asp Leu Pro Lys Asn Asp
515 520 525
Ala Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met
530 535 540
Gly Gly Met Met
545
<210> 11
<211> 459
<212> PRT
<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)
<220>
<223> 来自脱氮硫杆菌的RubisCO cbbM基因
<400> 11
Met Asp Gln Ser Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Ser Leu Lys Glu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Lys Gly Gly Arg His Ile Leu Val Ala Tyr Lys Met Lys Pro
20 25 30
Lys Ser Gly Tyr Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Ala His Phe Ala Ala Glu
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Thr Asn Val Glu Val Ser Thr Thr Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Lys Gly Val Asp Ala Leu Val Tyr Tyr Ile Asp Glu Ala Ser Glu Asp
65 70 75 80
Met Arg Ile Ala Tyr Pro Leu Glu Leu Phe Asp Arg Asn Val Thr Asp
85 90 95
Gly Arg Phe Met Leu Val Ser Phe Leu Thr Leu Ala Ile Gly Asn Asn
100 105 110
Gln Gly Met Gly Asp Ile Glu His Ala Lys Met Ile Asp Phe Tyr Val
115 120 125
Pro Glu Arg Cys Ile Gln Met Phe Asp Gly Pro Ala Thr Asp Ile Ser
130 135 140
Asn Leu Trp Arg Ile Leu Gly Arg Pro Val Val Asn Gly Gly Tyr Ile
145 150 155 160
Ala Gly Thr Ile Ile Lys Pro Lys Leu Gly Leu Arg Pro Glu Pro Phe
165 170 175
Ala Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Trp Leu Gly Gly Asp Phe Ile Lys Asn
180 185 190
Asp Glu Pro Gln Gly Asn Gln Val Phe Cys Pro Leu Lys Lys Val Leu
195 200 205
Pro Leu Val Tyr Asp Ala Met Lys Arg Ala Gln Asp Asp Thr Gly Gln
210 215 220
Ala Lys Leu Phe Ser Met Asn Ile Thr Ala Asp Asp His Tyr Glu Met
225 230 235 240
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Ala Leu Glu Val Phe Gly Pro Asp Ala Asp
245 250 255
Lys Leu Ala Phe Leu Val Asp Gly Tyr Val Gly Gly Pro Gly Met Val
260 265 270
Thr Thr Ala Arg Arg Gln Tyr Pro Gly Gln Tyr Leu His Tyr His Arg
275 280 285
Ala Gly His Gly Ala Val Thr Ser Pro Ser Ala Lys Arg Gly Tyr Thr
290 295 300
Ala Phe Val Leu Ala Lys Met Ser Arg Leu Gln Gly Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
His Val Gly Thr Met Gly Tyr Gly Lys Met Glu Gly Glu Gly Asp Asp
325 330 335
Lys Ile Ile Ala Tyr Met Ile Glu Arg Asp Glu Cys Gln Gly Pro Val
340 345 350
Tyr Phe Gln Lys Trp Tyr Gly Met Lys Pro Thr Thr Pro Ile Ile Ser
355 360 365
Gly Gly Met Asn Ala Leu Arg Leu Pro Gly Phe Phe Glu Asn Leu Gly
370 375 380
His Gly Asn Val Ile Asn Thr Ala Gly Gly Gly Ser Tyr Gly His Ile
385 390 395 400
Asp Ser Pro Ala Ala Gly Ala Ile Ser Leu Arg Gln Ser Tyr Glu Cys
405 410 415
Trp Lys Gln Gly Ala Asp Pro Ile Glu Phe Ala Lys Glu His Lys Glu
420 425 430
Phe Ala Arg Ala Phe Glu Ser Phe Pro Lys Asp Ala Asp Lys Leu Phe
435 440 445
Pro Gly Trp Arg Glu Lys Leu Gly Val His Ser
450 455
<210> 12
<211> 352
<212> PRT
<213> 菠菜(Spinacia oleracea)
<220>
<223> PRK菠菜
<400> 12
Met Ser Gln Gln Gln Thr Ile Val Ile Gly Leu Ala Ala Asp Ser Gly
1 5 10 15
Cys Gly Lys Ser Thr Phe Met Arg Arg Leu Thr Ser Val Phe Gly Gly
20 25 30
Ala Ala Glu Pro Pro Lys Gly Gly Asn Pro Asp Ser Asn Thr Leu Ile
35 40 45
Ser Asp Thr Thr Thr Val Ile Cys Leu Asp Asp Phe His Ser Leu Asp
50 55 60
Arg Asn Gly Arg Lys Val Glu Lys Val Thr Ala Leu Asp Pro Lys Ala
65 70 75 80
Asn Asp Phe Asp Leu Met Tyr Glu Gln Val Lys Ala Leu Lys Glu Gly
85 90 95
Lys Ala Val Asp Lys Pro Ile Tyr Asn His Val Ser Gly Leu Leu Asp
100 105 110
Pro Pro Glu Leu Ile Gln Pro Pro Lys Ile Leu Val Ile Glu Gly Leu
115 120 125
His Pro Met Tyr Asp Ala Arg Val Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ile
130 135 140
Tyr Leu Asp Ile Ser Asn Glu Val Lys Phe Ala Trp Lys Ile Gln Arg
145 150 155 160
Asp Met Lys Glu Arg Gly His Ser Leu Glu Ser Ile Lys Ala Ser Ile
165 170 175
Glu Ser Arg Lys Pro Asp Phe Asp Ala Tyr Ile Asp Pro Gln Lys Gln
180 185 190
His Ala Asp Val Val Ile Glu Val Leu Pro Thr Glu Leu Ile Pro Asp
195 200 205
Asp Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Val Arg Met Ile Gln Lys Glu Gly
210 215 220
Val Lys Phe Phe Asn Pro Val Tyr Leu Phe Asp Glu Gly Ser Thr Ile
225 230 235 240
Ser Trp Ile Pro Cys Gly Arg Lys Leu Thr Cys Ser Tyr Pro Gly Ile
245 250 255
Lys Phe Ser Tyr Gly Pro Asp Thr Phe Tyr Gly Asn Glu Val Thr Val
260 265 270
Val Glu Met Asp Gly Met Phe Asp Arg Leu Asp Glu Leu Ile Tyr Val
275 280 285
Glu Ser His Leu Ser Asn Leu Ser Thr Lys Phe Tyr Gly Glu Val Thr
290 295 300
Gln Gln Met Leu Lys His Gln Asn Phe Pro Gly Ser Asn Asn Gly Thr
305 310 315 320
Gly Phe Phe Gln Thr Ile Ile Gly Leu Lys Ile Arg Asp Leu Phe Glu
325 330 335
Gln Leu Val Ala Ser Arg Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Lys Ala
340 345 350
<210> 13
<211> 367
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 大肠杆菌甘油脱氢酶(Ec_gldA)的氨基酸序列
<400> 13
Met Asp Arg Ile Ile Gln Ser Pro Gly Lys Tyr Ile Gln Gly Ala Asp
1 5 10 15
Val Ile Asn Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Lys Pro Leu Ala Glu Arg Trp
20 25 30
Leu Val Val Gly Asp Lys Phe Val Leu Gly Phe Ala Gln Ser Thr Val
35 40 45
Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ala Gly Leu Val Val Glu Ile Ala Pro Phe
50 55 60
Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Arg Gly Ile Ala
65 70 75 80
Glu Thr Ala Gln Cys Gly Ala Ile Leu Gly Ile Gly Gly Gly Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala His Phe Met Gly Val Pro Val Ala
100 105 110
Ile Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Asp Ala Pro Cys Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Val Ile Tyr Thr Asp Glu Gly Glu Phe Asp Arg Tyr Leu Leu Leu Pro
130 135 140
Asn Asn Pro Asn Met Val Ile Val Asp Thr Lys Ile Val Ala Gly Ala
145 150 155 160
Pro Ala Arg Leu Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asp Ala Leu Ala Thr Trp
165 170 175
Phe Glu Ala Arg Ala Cys Ser Arg Ser Gly Ala Thr Thr Met Ala Gly
180 185 190
Gly Lys Cys Thr Gln Ala Ala Leu Ala Leu Ala Glu Leu Cys Tyr Asn
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Glu Gly Glu Lys Ala Met Leu Ala Ala Glu Gln His
210 215 220
Val Val Thr Pro Ala Leu Glu Arg Val Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Val Gly Phe Glu Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Val
245 250 255
His Asn Gly Leu Thr Ala Ile Pro Asp Ala His His Tyr Tyr His Gly
260 265 270
Glu Lys Val Ala Phe Gly Thr Leu Thr Gln Leu Val Leu Glu Asn Ala
275 280 285
Pro Val Glu Glu Ile Glu Thr Val Ala Ala Leu Ser His Ala Val Gly
290 295 300
Leu Pro Ile Thr Leu Ala Gln Leu Asp Ile Lys Glu Asp Val Pro Ala
305 310 315 320
Lys Met Arg Ile Val Ala Glu Ala Ala Cys Ala Glu Gly Glu Thr Ile
325 330 335
His Asn Met Pro Gly Gly Ala Thr Pro Asp Gln Val Tyr Ala Ala Leu
340 345 350
Leu Val Ala Asp Gln Tyr Gly Gln Arg Phe Leu Gln Glu Trp Glu
355 360 365
<210> 14
<211> 584
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 酿酒酵母二羟基丙酮激酶(S. cerevisiae DAK1)的氨基酸
序列
<400> 14
Met Ser Ala Lys Ser Phe Glu Val Thr Asp Pro Val Asn Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Gly Phe Ala Leu Ala Asn Pro Ser Ile Thr Leu Val Pro Glu Glu
20 25 30
Lys Ile Leu Phe Arg Lys Thr Asp Ser Asp Lys Ile Ala Leu Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Thr His Ala Gly Phe Ile Gly Lys
50 55 60
Gly Met Leu Ser Gly Ala Val Val Gly Glu Ile Phe Ala Ser Pro Ser
65 70 75 80
Thr Lys Gln Ile Leu Asn Ala Ile Arg Leu Val Asn Glu Asn Ala Ser
85 90 95
Gly Val Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr Gly Asp Val Leu His Phe
100 105 110
Gly Leu Ser Ala Glu Arg Ala Arg Ala Leu Gly Ile Asn Cys Arg Val
115 120 125
Ala Val Ile Gly Asp Asp Val Ala Val Gly Arg Glu Lys Gly Gly Met
130 135 140
Val Gly Arg Arg Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile Val
145 150 155 160
Gly Ala Phe Ala Glu Glu Tyr Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Thr
165 170 175
Ala Lys Val Ala Lys Ile Ile Asn Asp Asn Leu Val Thr Ile Gly Ser
180 185 190
Ser Leu Asp His Cys Lys Val Pro Gly Arg Lys Phe Glu Ser Glu Leu
195 200 205
Asn Glu Lys Gln Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro Gly
210 215 220
Val Lys Val Leu Asp Pro Ile Pro Ser Thr Glu Asp Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Tyr Met Leu Pro Lys Leu Leu Asp Pro Asn Asp Lys Asp Arg Ala Phe
245 250 255
Val Lys Phe Asp Glu Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Val Asn Asn Leu
260 265 270
Gly Gly Val Ser Asn Phe Val Ile Ser Ser Ile Thr Ser Lys Thr Thr
275 280 285
Asp Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asn Ile Thr Pro Val Gln Thr Ile Ala
290 295 300
Gly Thr Leu Met Thr Ser Phe Asn Gly Asn Gly Phe Ser Ile Thr Leu
305 310 315 320
Leu Asn Ala Thr Lys Ala Thr Lys Ala Leu Gln Ser Asp Phe Glu Glu
325 330 335
Ile Lys Ser Val Leu Asp Leu Leu Asn Ala Phe Thr Asn Ala Pro Gly
340 345 350
Trp Pro Ile Ala Asp Phe Glu Lys Thr Ser Ala Pro Ser Val Asn Asp
355 360 365
Asp Leu Leu His Asn Glu Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Thr Tyr Asp
370 375 380
Phe Asp Lys Phe Ala Glu Trp Met Lys Ser Gly Ala Glu Gln Val Ile
385 390 395 400
Lys Ser Glu Pro His Ile Thr Glu Leu Asp Asn Gln Val Gly Asp Gly
405 410 415
Asp Cys Gly Tyr Thr Leu Val Ala Gly Val Lys Gly Ile Thr Glu Asn
420 425 430
Leu Asp Lys Leu Ser Lys Asp Ser Leu Ser Gln Ala Val Ala Gln Ile
435 440 445
Ser Asp Phe Ile Glu Gly Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr
450 455 460
Ser Ile Leu Leu Ser Gly Phe Ser His Gly Leu Ile Gln Val Cys Lys
465 470 475 480
Ser Lys Asp Glu Pro Val Thr Lys Glu Ile Val Ala Lys Ser Leu Gly
485 490 495
Ile Ala Leu Asp Thr Leu Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala Arg Lys Gly Ser
500 505 510
Ser Thr Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Phe Val Lys Glu Phe Thr Ala
515 520 525
Ser Lys Asp Phe Asn Lys Ala Val Lys Ala Ala Glu Glu Gly Ala Lys
530 535 540
Ser Thr Ala Thr Phe Glu Ala Lys Phe Gly Arg Ala Ser Tyr Val Gly
545 550 555 560
Asp Ser Ser Gln Val Glu Asp Pro Gly Ala Val Gly Leu Cys Glu Phe
565 570 575
Leu Lys Gly Val Gln Ser Ala Leu
580
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 菠菜(Spinacia oleracea)
<220>
<223> PRK基序
<400> 15
Asn Asn Asn Ala Thr Thr Gly Thr Thr Asn Asn Asn
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 菠菜(Spinacia oleracea)
<220>
<223> PRK基序
<400> 16
Thr Cys Gly Thr Thr Tyr Ala Gly
1 5
<210> 17
<211> 561
<212> PRT
<213> 皱革菌(Punctularia strigosozonata)
<220>
<223> 皱革菌葡糖淀粉酶
<400> 17
Ser Ser Lys Ser Val Ser Ala Tyr Ile Ser Ser Glu Ser Pro Ile Ala
1 5 10 15
His Ser Lys Leu Leu Asp Asn Ile Gly Pro Asp Gly Ala Lys Ala Pro
20 25 30
Gly Ala Phe Pro Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro
35 40 45
Asn Tyr Tyr Tyr Ser Trp Ile Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Thr
50 55 60
Leu Ile Asp Asp Tyr Val Asn Gly Lys Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ser Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Ser Ser Val Phe Gln Gln Thr
85 90 95
Pro Asn Pro Ser Gly Asn Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys
100 105 110
Phe Tyr Val Asn Glu Thr Ala Phe Leu Asp Ser Trp Gly Arg Pro Gln
115 120 125
Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala Asn
130 135 140
Tyr Leu Leu Asp Asn Asp Asn Thr Thr Trp Val Lys Asp Thr Leu Trp
145 150 155 160
Pro Ile Ile Glu Leu Asp Val Asn Tyr Val Ser Asp Phe Trp Asn Tyr
165 170 175
Thr Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser Phe Phe Thr
180 185 190
Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Gln Ala Ser Lys Leu Ala Lys
195 200 205
Thr Leu Asp Lys Thr Asp Asn Ile Asp Ser Trp Asn Thr Gln Ala Asp
210 215 220
Asn Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Gly Ser Ala Ile Ile
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Ile Asp Ala Asn Thr Val Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Phe Asp Ser Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Glu Ile Asn Ser Gly Ile Asp Pro Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Phe Tyr Asp Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Tyr Val Trp Asn Thr Thr Gly Ser Leu Glu Ile Thr Asp Ile
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Asp Ser Asp Val Lys Thr Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Asp Asp Asp Thr Phe Asp Ser Leu Ile Ser Ser Ile Gln Ser
370 375 380
Phe Ala Asp Gly Phe Leu Glu Ile His Ala Lys Tyr Thr Pro Asp Asp
385 390 395 400
Gly Ala Leu Ser Glu Glu Phe Ser Lys Thr Asp Gly Ser Gln Thr Ser
405 410 415
Ala Ala Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe Asp
420 425 430
Ala Arg Ser Arg Asp Ala Ala Val Lys Trp Gly Ala Lys Gly Leu Gln
435 440 445
Val Pro Asp Gly Thr Cys Lys Thr Asn Glu Gly Gly Asp Asp Gly Leu
450 455 460
Gly Val Pro Val Thr Phe Leu Val Lys Asp Ala Glu Thr Val Glu Gly
465 470 475 480
Gln Ser Val Tyr Ile Thr Gly Ser Ile Ala Thr Leu Lys Ser Trp Ser
485 490 495
Pro Asp Asp Ala Leu Leu Met Ser Pro Ser Asp Tyr Pro Thr Trp Thr
500 505 510
Leu Thr Val Asn Leu Ser Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Lys Tyr Ile
515 520 525
Lys Lys Asp Thr Ala Gly Thr Val Ile Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn
530 535 540
Ser Leu Leu Val Pro Ser Gly Gly Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr Trp
545 550 555 560
Arg
<210> 18
<211> 578
<212> PRT
<213> 皱革菌(Punctularia strigosozonata)
<220>
<223> 具有天然信号序列
FGA09的皱革菌葡糖淀粉酶
<400> 18
Met Leu Ser Ser Leu Ile Val Ser Gly Leu Leu Ala Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Ala Ser Ser Lys Ser Val Ser Ala Tyr Ile Ser Ser Glu Ser Pro Ile
20 25 30
Ala His Ser Lys Leu Leu Asp Asn Ile Gly Pro Asp Gly Ala Lys Ala
35 40 45
Pro Gly Ala Phe Pro Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn
50 55 60
Pro Asn Tyr Tyr Tyr Ser Trp Ile Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Asp Tyr Val Asn Gly Lys Asn Thr Ser Lys Ser Leu
85 90 95
Arg Ser Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Ser Ser Val Phe Gln Gln
100 105 110
Thr Pro Asn Pro Ser Gly Asn Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro
115 120 125
Lys Phe Tyr Val Asn Glu Thr Ala Phe Leu Asp Ser Trp Gly Arg Pro
130 135 140
Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Asn Tyr Leu Leu Asp Asn Asp Asn Thr Thr Trp Val Lys Asp Thr Leu
165 170 175
Trp Pro Ile Ile Glu Leu Asp Val Asn Tyr Val Ser Asp Phe Trp Asn
180 185 190
Tyr Thr Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser Phe Phe
195 200 205
Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Gln Ala Ser Lys Leu Ala
210 215 220
Lys Thr Leu Asp Lys Thr Asp Asn Ile Asp Ser Trp Asn Thr Gln Ala
225 230 235 240
Asp Asn Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Gly Ser Ala Ile
245 250 255
Ile Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Ile Asp Ala Asn Thr Val
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Phe Asp Ser Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Glu Ile Asn Ser Gly Ile Asp Pro
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Phe Tyr Asp
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Tyr Val Trp Asn Thr Thr Gly Ser Leu Glu Ile Thr Asp
355 360 365
Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Asp Ser Asp Val Lys Thr Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Asp Asp Asp Thr Phe Asp Ser Leu Ile Ser Ser Ile Gln
385 390 395 400
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Leu Glu Ile His Ala Lys Tyr Thr Pro Asp
405 410 415
Asp Gly Ala Leu Ser Glu Glu Phe Ser Lys Thr Asp Gly Ser Gln Thr
420 425 430
Ser Ala Ala Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe
435 440 445
Asp Ala Arg Ser Arg Asp Ala Ala Val Lys Trp Gly Ala Lys Gly Leu
450 455 460
Gln Val Pro Asp Gly Thr Cys Lys Thr Asn Glu Gly Gly Asp Asp Gly
465 470 475 480
Leu Gly Val Pro Val Thr Phe Leu Val Lys Asp Ala Glu Thr Val Glu
485 490 495
Gly Gln Ser Val Tyr Ile Thr Gly Ser Ile Ala Thr Leu Lys Ser Trp
500 505 510
Ser Pro Asp Asp Ala Leu Leu Met Ser Pro Ser Asp Tyr Pro Thr Trp
515 520 525
Thr Leu Thr Val Asn Leu Ser Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Lys Tyr
530 535 540
Ile Lys Lys Asp Thr Ala Gly Thr Val Ile Trp Glu Ser Asp Pro Asn
545 550 555 560
Asn Ser Leu Leu Val Pro Ser Gly Gly Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr
565 570 575
Trp Arg
<210> 19
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有Sc α交配因子信号序列的
皱革菌葡糖淀粉酶
<400> 19
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ser Ser Lys Ser Val Ser Ala Tyr Ile Ser Ser Glu Ser
20 25 30
Pro Ile Ala His Ser Lys Leu Leu Asp Asn Ile Gly Pro Asp Gly Ala
35 40 45
Lys Ala Pro Gly Ala Phe Pro Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr
50 55 60
Asp Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Ser Trp Ile Arg Asp Ser Ser Leu Val
65 70 75 80
Phe Lys Thr Leu Ile Asp Asp Tyr Val Asn Gly Lys Asn Thr Ser Lys
85 90 95
Ser Leu Arg Ser Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Ser Ser Val Phe
100 105 110
Gln Gln Thr Pro Asn Pro Ser Gly Asn Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly
115 120 125
Glu Pro Lys Phe Tyr Val Asn Glu Thr Ala Phe Leu Asp Ser Trp Gly
130 135 140
Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Ala Asn Tyr Leu Leu Asp Asn Asp Asn Thr Thr Trp Val Lys Asp
165 170 175
Thr Leu Trp Pro Ile Ile Glu Leu Asp Val Asn Tyr Val Ser Asp Phe
180 185 190
Trp Asn Tyr Thr Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser
195 200 205
Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Gln Ala Ser Lys
210 215 220
Leu Ala Lys Thr Leu Asp Lys Thr Asp Asn Ile Asp Ser Trp Asn Thr
225 230 235 240
Gln Ala Asp Asn Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Gly Ser
245 250 255
Ala Ile Ile Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Ile Asp Ala Asn
260 265 270
Thr Val Leu Ala Ser Ile His Thr Phe Asp Ser Ser Ala Gly Cys Asp
275 280 285
Ala Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys
290 295 300
Val Tyr Val Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Glu Ile Asn Ser Gly Ile
305 310 315 320
Asp Pro Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Phe
325 330 335
Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ala Glu Gln
340 345 350
Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Val Trp Asn Thr Thr Gly Ser Leu Glu Ile
355 360 365
Thr Asp Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Asp Ser Asp Val Lys
370 375 380
Thr Gly Thr Tyr Ser Asp Asp Asp Thr Phe Asp Ser Leu Ile Ser Ser
385 390 395 400
Ile Gln Ser Phe Ala Asp Gly Phe Leu Glu Ile His Ala Lys Tyr Thr
405 410 415
Pro Asp Asp Gly Ala Leu Ser Glu Glu Phe Ser Lys Thr Asp Gly Ser
420 425 430
Gln Thr Ser Ala Ala Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr
435 440 445
Ala Phe Asp Ala Arg Ser Arg Asp Ala Ala Val Lys Trp Gly Ala Lys
450 455 460
Gly Leu Gln Val Pro Asp Gly Thr Cys Lys Thr Asn Glu Gly Gly Asp
465 470 475 480
Asp Gly Leu Gly Val Pro Val Thr Phe Leu Val Lys Asp Ala Glu Thr
485 490 495
Val Glu Gly Gln Ser Val Tyr Ile Thr Gly Ser Ile Ala Thr Leu Lys
500 505 510
Ser Trp Ser Pro Asp Asp Ala Leu Leu Met Ser Pro Ser Asp Tyr Pro
515 520 525
Thr Trp Thr Leu Thr Val Asn Leu Ser Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr
530 535 540
Lys Tyr Ile Lys Lys Asp Thr Ala Gly Thr Val Ile Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Asn Ser Leu Leu Val Pro Ser Gly Gly Ser Val Thr Thr Asp
565 570 575
Asp Thr Trp Arg
580
<210> 20
<211> 619
<212> PRT
<213> 瘤孢棒囊孢壳菌(Corynascus sepedonium)
<220>
<223> 瘤孢棒囊孢壳菌葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 20
Arg Pro Gly Ala Ile Pro Arg Ser Gln Arg Gly Gly Ala Ile Ser Lys
1 5 10 15
Arg Ala Val Asp Ser Tyr Ile Glu Thr Glu Thr Pro Ile Ala Trp Glu
20 25 30
Lys Leu Leu Cys Asn Ile Gly Pro Asp Gly Cys Ala Val Ser Gly Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr
50 55 60
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Gly Leu Val Leu Thr Gly Ile Val
65 70 75 80
Asp Ser Leu Ala His Asn Tyr Ser Ala Ser Leu Gln Thr Asn Ile Gln
85 90 95
Asn Tyr Ile Ile Ala Gln Ala Lys Leu Gln Gly Val Gly Asn Pro Ser
100 105 110
Gly Gly Leu Ser Asp Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Met Val
115 120 125
Asp Leu Thr Glu Phe Thr Gly Asp Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly
130 135 140
Pro Pro Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Arg Tyr Ala Lys Trp Leu Val
145 150 155 160
Ala Asn Gly Tyr Lys Asp Thr Ala Asn Glu Leu Val Trp Pro Val Ile
165 170 175
Gln Asn Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Trp Asn Glu Thr Gly Phe
180 185 190
Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Ser
195 200 205
Thr His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ala Ala Leu Ala Ala Gln Leu Asp
210 215 220
Thr Glu Cys Arg Ala Cys Ile Thr Val Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe
225 230 235 240
Leu Gln Thr Phe Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Val Val Ser Asn Ile
245 250 255
Asn Gly Gly Glu Gly Arg Ser Gly Lys Asp Leu Asn Ser Ile Leu Ala
260 265 270
Ser Ala His Thr Phe Asp Pro Ala Ile Gly Cys Asp Ser Val Thr Phe
275 280 285
Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ala Asn His Lys Ala Tyr Val Asp
290 295 300
Ser Phe Arg Glu Ile Tyr Gly Ile Asn Ser Gly Ile Ala Lys Gly Lys
305 310 315 320
Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Ser Glu Asp Val Tyr Tyr Asn Gly Asn
325 330 335
Pro Trp Tyr Leu Ala Asn Phe Gly Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala
340 345 350
Ile Tyr Val Trp Lys Glu Gln Gly Ser Ile Glu Val Thr Asp Leu Ser
355 360 365
Leu Pro Phe Phe Gln Asp Leu Leu Ser Asp Ile Ser Thr Gly Thr Tyr
370 375 380
Asp Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Leu Asp Ala Val Ser Ala
385 390 395 400
Tyr Ala Asp Gly Phe Ile Asp Val Ala Ala Gln Tyr Thr Pro Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Leu Ala Glu Gln Phe Glu Arg Asp Ser Gly Asn Pro Ile Ser
420 425 430
Ala Ala Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ser Ala Phe Leu Ser Ala Thr Asp
435 440 445
Arg Arg Ala Gly Ile Val Pro Ala Gly Trp Ser Ala Glu Asn Gly Lys
450 455 460
Thr Leu Pro Asp Ser Cys Glu Ala Ile Gln Val Ala Gly Thr Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Ala Ser Pro Thr Ala Phe Pro Pro Asn Gln Thr Pro Asn Pro Ser
485 490 495
Ala Glu Thr Pro Glu Thr Pro Phe Pro Ser Ser Cys Ala Asp Ala Asn
500 505 510
Glu Val Tyr Val Thr Phe Lys Gly Lys Val Thr Thr Gln Trp Gly Glu
515 520 525
Ser Val Lys Val Val Gly Ser Thr Pro Glu Leu Gly Ser Trp Asp Val
530 535 540
Lys Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Ser Ala Tyr Thr Glu Ser Asn Pro
545 550 555 560
Leu Trp Lys Ile Thr Val Pro Met Lys Ala Gly Gln Ala Val Gln Tyr
565 570 575
Lys Phe Ile Arg Val Asn Gly Asp Gly Lys Ala Gln Trp Glu Ser Asp
580 585 590
Pro Asn Arg Thr Phe Glu Val Gly Ala Ala Gly Lys Ala Asp Gly Gly
595 600 605
Cys Ser Ser Gln Thr Val Glu Gly Thr Trp Arg
610 615
<210> 21
<211> 622
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<223> 黑曲霉葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 21
Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu
1 5 10 15
Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly
20 25 30
Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu
50 55 60
Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ser Leu
65 70 75 80
Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val Gln Gly
85 90 95
Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu Gly Glu
100 105 110
Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg
115 120 125
Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe
130 135 140
Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile
145 150 155 160
Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp
165 170 175
Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe
180 185 190
Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe
195 200 205
Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro
210 215 220
Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu
225 230 235 240
Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser
290 295 300
Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val
340 345 350
Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys
370 375 380
Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser
385 390 395 400
Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Gln Leu
405 410 415
Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn
420 425 430
Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr Ser Ala
435 440 445
Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly Thr Tyr
450 455 460
Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr Gly Gly
465 470 475 480
Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr
485 490 495
Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr
515 520 525
Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser
530 535 540
Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp
545 550 555 560
Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro
565 570 575
Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp
580 585 590
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln
595 600 605
Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
610 615 620
<210> 22
<211> 612
<212> PRT
<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)
<220>
<223> 里氏木霉葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 22
Arg Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ser Asp Val Thr Lys Arg Ser Val Asp
1 5 10 15
Asp Phe Ile Ser Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Asn Asn Leu Leu Cys
20 25 30
Asn Val Gly Pro Asp Gly Cys Arg Ala Phe Gly Thr Ser Ala Gly Ala
35 40 45
Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ile Asp Pro Asp Tyr Tyr Tyr Met Trp
50 55 60
Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Phe Lys Asn Leu Ile Asp Arg Phe Thr
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Ala Gly Leu Gln Arg Arg Ile Glu Gln Tyr Ile Thr
85 90 95
Ala Gln Val Thr Leu Gln Gly Leu Ser Asn Pro Ser Gly Ser Leu Ala
100 105 110
Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Leu Thr Leu Lys Pro
115 120 125
Phe Thr Gly Asn Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg
130 135 140
Ala Ile Ala Leu Ile Gly Tyr Ser Lys Trp Leu Ile Asn Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Gln Ser Thr Val Ser Asn Val Ile Trp Pro Ile Val Arg Asn Asp Leu
165 170 175
Asn Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu
180 185 190
Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn Gln His Arg Ala
195 200 205
Leu Val Glu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Leu Gly Gln Ser Gly Ser
210 215 220
Ala Tyr Ser Ser Val Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Arg Phe
225 230 235 240
Trp Val Ser Ser Gly Gly Tyr Val Asp Ser Asn Ile Asn Thr Asn Glu
245 250 255
Gly Arg Thr Gly Lys Asp Val Asn Ser Val Leu Thr Ser Ile His Thr
260 265 270
Phe Asp Pro Asn Leu Gly Cys Asp Ala Gly Thr Phe Gln Pro Cys Ser
275 280 285
Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Val Val Asp Ser Phe Arg Ser
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Asn Lys Gly Ile Pro Ala Gly Ala Ala Val Ala Ile
305 310 315 320
Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu
325 330 335
Ala Thr Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Val Trp
340 345 350
Lys Lys Thr Gly Ser Ile Thr Val Thr Ala Thr Ser Leu Ala Phe Phe
355 360 365
Gln Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Ala Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser
370 375 380
Ser Thr Phe Thr Asn Ile Ile Asn Ala Val Ser Thr Tyr Ala Asp Gly
385 390 395 400
Phe Leu Ser Glu Ala Ala Lys Tyr Val Pro Ala Asp Gly Ser Leu Ala
405 410 415
Glu Gln Phe Asp Arg Asn Ser Gly Thr Pro Leu Ser Ala Leu His Leu
420 425 430
Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Ala Arg Arg Ala Gly
435 440 445
Ile Val Pro Pro Ser Trp Ala Asn Ser Ser Ala Ser Thr Ile Pro Ser
450 455 460
Thr Cys Ser Gly Ala Ser Val Val Gly Ser Tyr Ser Arg Pro Thr Ala
465 470 475 480
Thr Ser Phe Pro Pro Ser Gln Thr Pro Lys Pro Gly Val Pro Ser Gly
485 490 495
Thr Pro Tyr Thr Pro Leu Pro Cys Ala Thr Pro Thr Ser Val Ala Val
500 505 510
Thr Phe His Glu Leu Val Ser Thr Gln Phe Gly Gln Thr Val Lys Val
515 520 525
Ala Gly Asn Ala Ala Ala Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ser Ala Ala Val
530 535 540
Ala Leu Asp Ala Val Asn Tyr Ala Asp Asn His Pro Leu Trp Ile Gly
545 550 555 560
Thr Val Asn Leu Glu Ala Gly Asp Val Val Glu Tyr Lys Tyr Ile Asn
565 570 575
Val Gly Gln Asp Gly Ser Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn His Thr
580 585 590
Tyr Thr Val Pro Ala Val Ala Cys Val Thr Gln Val Val Lys Glu Asp
595 600 605
Thr Trp Gln Ser
610
<210> 23
<211> 535
<212> PRT
<213> 灰葡萄孢菌(Botryotinia fuckeliana)
<220>
<223> 灰葡萄孢菌葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 23
Lys Asn Leu Glu His Pro Lys Leu Ser Thr Arg Thr Thr Gly Thr Ile
1 5 10 15
Asp Asp Tyr Leu Thr Ala Gln Ser Pro Ile Ser Leu Gln Gly Ile Leu
20 25 30
Asn Asn Ile Gly Pro Asp Gly Ser Lys Ala Gln Gly Ala Ser Ala Gly
35 40 45
Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Val Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Thr
50 55 60
Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu Thr Phe Lys Tyr Leu Ile Asp Thr Gly
65 70 75 80
Asn Ser Ser Leu Gln Ser Leu Ile Glu Asp Tyr Val Thr Ala Gln Ala
85 90 95
Lys Leu Gln Thr Val Glu Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ala Thr Gly Ala
100 105 110
Gly Leu Ala Glu Pro Lys Tyr Tyr Thr Asn Glu Thr Ala Phe Leu Gly
115 120 125
Glu Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Ile Ala
130 135 140
Leu Ile Ser Phe Gly Asn Asp Arg Leu Thr Leu Gly Gln Asn Asp Thr
145 150 155 160
Val Lys Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Arg Asn Asp Leu Ala Tyr Val
165 170 175
Ser Gln Tyr Trp Asn Phe Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Ile Asn
180 185 190
Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu
195 200 205
Gly Ala Lys Phe Ala Thr Ala Leu Gly Glu Ser Cys Asn Asp Cys Glu
210 215 220
Glu Gln Ala Pro Glu Val Leu Cys Met Leu Gln Asp Tyr Trp Asn Gly
225 230 235 240
Ala Ser Ile Asn Ser Asn Ile Gln Val Gln Ser Ser Thr Tyr Asp Arg
245 250 255
Ser Gly Leu Asp Cys Asn Ser Ile Leu Thr Ser Ile His Thr Phe Asp
260 265 270
Pro Asp Gln Ala Val Gly Cys Asp Ser Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser
275 280 285
Asp Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Leu Val Asp Ser Phe Arg Ser
290 295 300
Ile Tyr Thr Ile Asn Ser Asn Ala Ser Thr Gly Gln Ala Ala Ala Ile
305 310 315 320
Gly Arg Tyr Ala Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Ile
325 330 335
Cys Thr Tyr Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Trp Thr Tyr
340 345 350
Asn Thr Thr Glu Ser Ile Thr Ile Thr Asp Ile Ser Gln Asp Phe Phe
355 360 365
Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile Glu Thr Gly Thr Phe Ala Ser Asp Ser
370 375 380
Ser Gln Phe Lys Asp Ile Val Lys Ala Met Gln Asp Tyr Ala Asp Gly
385 390 395 400
Phe Val Ser Ile Ala Glu Thr Tyr Thr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Ala
405 410 415
Glu Gln Phe Ser Arg Glu Asn Gly Thr Ala Leu Ser Ala Val Asp Leu
420 425 430
Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Phe Leu Thr Met Gln Arg Ala Arg Glu Gly
435 440 445
Lys Ser Gly Pro Ser Trp Gly Ala Ala Ser Ala Ile Ala Lys Gly Val
450 455 460
Pro Asp Lys Cys Ser Gly Gly Gly Val Lys Gly Ala Tyr Ser Thr Pro
465 470 475 480
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Gln Ser Glu Glu Gly Thr Phe Gly Thr Lys
485 490 495
Thr Ser Ser Thr Ser Asp Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Val Ser Gly
500 505 510
Thr Ala Val Ser Ala Thr Thr Ser Lys Ser Ala Gly Asn Arg Val Met
515 520 525
Pro Ile Gly Phe Phe Leu His
530 535
<210> 24
<211> 575
<212> PRT
<213> 皱木耳(Auricularia delicata)
<220>
<223> 皱木耳葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 24
Phe Val Ala Gln Asp Ala Arg Phe Ser Ser Gly Phe Gly Leu Thr Leu
1 5 10 15
Gly Lys Arg Ala Ala Val Asp Asp Tyr Val Ala Ser Glu Gly Pro Ile
20 25 30
Ala Leu Lys Gly Val Leu Asp Asn Ile Gly Pro Asp Gly Pro Lys Ser
35 40 45
His Gly Ala Lys Pro Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Val Asp
50 55 60
Pro Asp Tyr Val Phe Ala Trp Ile Arg Asp Ser Ala Leu Val Phe Lys
65 70 75 80
Ala Leu Ile Asp Arg Phe Val Asp Gly Arg Asp Ala Ser Arg Leu Pro
85 90 95
Leu Leu Leu Gln Phe Val Ser Ser Gln Ser Ala Ile Gln Asn Leu Asp
100 105 110
Asn Arg Ser Gly Ala Ala Arg Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Glu Ile Asn Gln Thr Ala Phe Asn Gly Asp Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Leu Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Phe Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ser Phe Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro
165 170 175
Met Ile Gln Leu Asp Leu Asn Tyr Val Ala Thr Tyr Trp Asn Gln Pro
180 185 190
Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Gln Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ile Ala Leu Ala Gln Thr
210 215 220
Leu Gly Thr Thr Gly Ser Val Ala Thr Trp Ser Thr Gln Ala Ser Asn
225 230 235 240
Val Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Pro Ser Gly Ala Phe Ile
245 250 255
Asn Ser Asn Thr Asn Ser Gly Arg Ser Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile
260 265 270
Leu Thr Ser Ile His Thr Phe Ser Pro Asn Thr Gly Cys Asp Ala Val
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ala Gly His Leu Ala Val
290 295 300
Val Asn Ser Phe Arg Gly Ser Leu Tyr Pro Ile Asn Ser Gly Ile Pro
305 310 315 320
Ala Gly Gln Ala Val Ala Ile Gly Arg Tyr Lys Glu Asp Val Tyr Tyr
325 330 335
Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu
340 345 350
Tyr Leu Ala Leu Phe Thr Trp Asp Gln Gln Lys Ser Ile Ala Val Thr
355 360 365
Ala Ile Ser Gln Pro Phe Phe Ala Gln Phe Ile Pro Asn Ile Ala Thr
370 375 380
Gly Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Ser Gln Tyr Ala Thr Leu Thr Ser Lys
385 390 395 400
Ile Arg Glu Phe Ala Asp Gly Phe Ile Ala Val Asn Gln Lys Tyr Thr
405 410 415
Pro Ala Asn Gly Ala Leu Ala Glu Gln Phe Thr Arg Ala Asn Gly Thr
420 425 430
Pro Ile Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr
435 440 445
Ala Phe Asp Arg Arg Ala Gly Ile Val Pro Gly Ala Trp Pro Ala Thr
450 455 460
Gly Leu Thr Val Ala Pro Ser Cys Ser Thr Ala Gly Gly Gly Asn Ser
465 470 475 480
Thr Ile Thr Phe Lys Val Thr Ala Gln Thr Val Phe Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Ala Ala Leu Lys Asn Trp Ser Pro Glu Asn
500 505 510
Ala Leu Gly Pro Leu Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Gln Trp Gln Ile Thr
515 520 525
Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys
530 535 540
Asn Gly Gly Ser Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Ile Val
545 550 555 560
Ser Pro Ala Ala Gly Glu Ser Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
565 570 575
<210> 25
<211> 617
<212> PRT
<213> 柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)
<220>
<223> 柄篮状菌葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 25
Ala Pro Gly Leu Ser Pro Arg Ala Ser Thr Ser Leu Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Ala Thr Glu Thr Thr Val Ser Leu Ser Gly Ile Leu Ala Asn Ile Gly
20 25 30
Ala Asp Gly Ala Tyr Ser Lys Ser Ala Lys Pro Gly Val Val Ile Ala
35 40 45
Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp
50 55 60
Ser Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Ile Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asn
65 70 75 80
Leu Gly Leu Gln Thr Val Ile Glu Glu Tyr Val Asn Ala Gln Ala Tyr
85 90 95
Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly
100 105 110
Leu Ala Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Met Ser Ala Phe Thr Gly Ser
115 120 125
Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Ile Ala Leu
130 135 140
Ile Asp Phe Gly Asn Trp Leu Ile Glu Asn Gly Tyr Thr Ser Leu Ala
145 150 155 160
Ala Asn Asn Ile Trp Pro Ile Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala
165 170 175
Gln Tyr Trp Ser Gln Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser
180 185 190
Met Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn Gln His Arg Ser Leu Val Glu Gly
195 200 205
Ser Thr Phe Ala Ala Lys Val Gly Ala Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser
210 215 220
Gln Ala Pro Gln Ile Leu Cys Tyr Met Gln Thr Phe Trp Thr Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Met Asn Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn
245 250 255
Thr Val Leu Thr Ser Ile Ala Thr Phe Asp Pro Glu Ala Thr Cys Asp
260 265 270
Asp Val Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys
275 280 285
Val Tyr Thr Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Gly Leu Asn Ser Gly Ile
290 295 300
Ala Glu Gly Val Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr
305 310 315 320
Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Ser Asn Leu Ala Ala Ala Glu Gln
325 330 335
Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Asn Lys Ile Gly Ser Ile Thr Ile
340 345 350
Thr Ser Thr Ser Leu Ala Phe Phe Lys Asp Val Tyr Ser Ser Ala Ala
355 360 365
Val Gly Thr Tyr Ala Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Ser Ile Ile Asn
370 375 380
Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly Tyr Ile Ser Val Val Gln Ser His
385 390 395 400
Ala Met Asn Asn Gly Ser Leu Ser Glu Gln Phe Asp Lys Asn Thr Gly
405 410 415
Ala Glu Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu
420 425 430
Thr Ala Asn Met Arg Arg Asn Gly Val Val Pro Pro Ser Trp Gly Ala
435 440 445
Ala Ser Ala Thr Ser Ile Pro Ser Ser Cys Thr Thr Gly Ser Ala Ile
450 455 460
Gly Thr Tyr Ser Thr Pro Thr Ala Thr Ser Trp Pro Ser Thr Leu Thr
465 470 475 480
Ser Gly Thr Gly Ser Pro Gly Ser Thr Thr Ser Ala Thr Gly Ser Val
485 490 495
Ser Thr Ser Val Ser Ala Thr Thr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Thr Thr
500 505 510
Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Ala Thr Thr Ser Tyr
515 520 525
Gly Glu Asn Val Tyr Ile Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Ser Trp
530 535 540
Asn Thr Ala Asn Ala Ile Ala Leu Ser Ala Ser Lys Tyr Thr Thr Ser
545 550 555 560
Asn Asn Leu Trp Tyr Val Thr Ile Asn Leu Pro Ala Gly Thr Thr Phe
565 570 575
Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Glu Ser Asp Gly Thr Val Lys Trp Glu
580 585 590
Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ser Ala Cys Gly Val Ser
595 600 605
Thr Ala Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
610 615
<210> 26
<211> 576
<212> PRT
<213> 印度梨形孢菌(Piriformospora indica)
<220>
<223> 印度梨形孢菌葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 26
Arg Ala Ser Pro Arg Glu Asn Pro Phe Asn Lys Arg Val Ser Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Val Ala Asp Phe Asp Thr Phe Glu Thr Pro Ile Ala Leu Ala Gly
20 25 30
Leu Tyr Ala Asn Ile Gly Pro Asp Gly Ala Lys Ser Gln Gly Ala Lys
35 40 45
Ala Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr Leu
50 55 60
Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Ser Leu Val Phe Lys Tyr Ile Val Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ser Gly Arg Asp Ser Ser Leu Arg Thr Lys Ile Asp Asn
85 90 95
Phe Val Gly His Val Gly Arg Ile Gln Gln Val Thr Asn Pro Ser Gly
100 105 110
Thr Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Met Ile Ser Glu
115 120 125
Ala Ala Phe Thr Gly Glu Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala
130 135 140
Leu Arg Ala Thr Thr Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Trp Leu Arg Ala Asn
145 150 155 160
Ser Asn Thr Thr His Val Gln Asn Val Leu Trp Pro Ile Ile Ser Leu
165 170 175
Asp Leu Asn Tyr Val Ser Asn Asn Trp Asn Ser Thr Thr Phe Asp Leu
180 185 190
Trp Glu Glu Val Ser Gly Ala Ser Phe Phe Thr Thr Ala Ala Gln His
195 200 205
Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ile Ala Leu Ala Thr Ala Leu Gly Ala Pro
210 215 220
Ser Ser Thr Ile Thr Ala Trp Thr Thr Gln Ala Gln Asn Leu Leu Cys
225 230 235 240
Phe Leu Gln Thr Tyr Trp Ser Pro Glu Ser Gly Phe Ile Val Ala Asn
245 250 255
Val Asp Pro Ile Asn Gly Ala Ile Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
260 265 270
Val Leu Thr Thr Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ser
275 280 285
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ala Asn Leu Lys Val
290 295 300
Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Pro Ile Asn Tyr Gly Ile Ala
305 310 315 320
Ser Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Tyr
325 330 335
Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu
340 345 350
Tyr Arg Ala Leu Gln Val Trp Asp Ala Glu Gly Lys Gly Ile Glu Val
355 360 365
Thr Ser Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Asn Ser Ser Ala Thr
370 375 380
Val Thr Thr Ile Pro Ala Gly Ser Ala Ser Tyr Thr Thr Leu Thr Asn
385 390 395 400
Ala Ile Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Ala Leu Lys Gly Ala Gln Phe
405 410 415
Val Pro Ser Ser Gly Ala Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Arg Asn Asp Gly
420 425 430
Thr Pro Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Val Leu
435 440 445
Thr Met Phe Asp Ala His Asp Arg Leu Ala Val Asp Ser Trp Gly Ala
450 455 460
Ala Gly Leu Thr Val Pro Thr Thr Cys Ser Ser Gly Asp Gly Lys Ser
465 470 475 480
Ala Thr Val Ile Phe Lys Glu Thr Ala Thr Thr Ile Trp Gly Glu Asn
485 490 495
Ile Tyr Leu Val Gly Asn Ile Glu Ala Leu Lys Asn Trp Asn Thr Asn
500 505 510
Asn Pro Ile Gly Pro Leu Ser Thr Thr Thr Tyr Pro Val Trp Thr Thr
515 520 525
Leu Val Ser Ile Pro Ala Asn Thr His Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg
530 535 540
Lys Phe Asn Gly Thr Val Thr Trp Glu Ser Gly Ala Asn Arg Trp Asn
545 550 555 560
Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Arg Leu Thr Leu Asn Asn Val Trp Lys
565 570 575
<210> 27
<211> 497
<212> PRT
<213> 扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)
<220>
<223> 扣囊复膜孢酵母葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 27
Val Pro Val Glu Leu Asp Lys Arg Asn Thr Gly His Phe Gln Ala Tyr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Thr Val Ala Arg Ser Asn Phe Thr Gln Trp Ile His Glu
20 25 30
Gln Pro Ala Val Ser Trp Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile Asp Tyr Pro
35 40 45
Glu Gly Gln Phe Lys Ser Ala Lys Pro Gly Val Val Val Ala Ser Pro
50 55 60
Ser Thr Ser Glu Pro Asp Tyr Phe Tyr Gln Trp Thr Arg Asp Thr Ala
65 70 75 80
Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ala Glu Val Glu Asp His Ser Phe Ser
85 90 95
Asn Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn Thr Tyr
100 105 110
Thr Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Ser Gly Asn Phe Asp Ser Pro Asn
115 120 125
His Asp Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Asp Thr Ala Tyr
130 135 140
Thr Ala Ser Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala
145 150 155 160
Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Val Ala Lys His Asn Asn Gly
165 170 175
Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gln Asn Gly Ile Pro Tyr Ser Ser Ala Ser
180 185 190
Asp Ile Tyr Trp Lys Ile Ile Lys Pro Asp Leu Gln His Val Ser Thr
195 200 205
His Trp Ser Thr Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln Gly Thr
210 215 220
His Phe Phe Thr Ala Leu Val Gln Leu Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ile
225 230 235 240
Pro Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Asp Pro Gly Phe Thr Ser Trp Leu Glu
245 250 255
Lys Gln Lys Asp Ala Leu Asn Ser Tyr Ile Asn Ser Ser Gly Phe Val
260 265 270
Asn Ser Gly Lys Lys His Ile Val Glu Ser Pro Gln Leu Ser Ser Arg
275 280 285
Gly Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Ile Thr His Asp
290 295 300
Ile Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Thr Pro Phe Asn Val Asp Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Val Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Val Asp Asn Lys Asn Arg Tyr
325 330 335
Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Gly Ala Ala Val Gly Arg Tyr Pro
340 345 350
Glu Asp Val Tyr Asn Gly Val Gly Thr Ser Glu Gly Asn Pro Trp Gln
355 360 365
Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Gly Gln Thr Phe Tyr Thr Leu Ala Tyr Asn
370 375 380
Ser Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Val Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Asp
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ile Asp Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Ser Lys Asp Ser Leu Thr Leu Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Tyr Lys
420 425 430
Asn Val Ile Lys Ser Leu Leu Gln Phe Gly Asp Ser Phe Leu Lys Val
435 440 445
Leu Leu Asp His Ile Asp Asp Asn Gly Gln Leu Thr Glu Glu Ile Asn
450 455 460
Arg Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Gly Ala Val Ser Leu Thr Trp Ser Ser
465 470 475 480
Gly Ser Leu Leu Ser Ala Asn Arg Ala Arg Asn Lys Leu Ile Glu Leu
485 490 495
Leu
<210> 28
<211> 785
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 糖化酵母(S. cerevisiae diastaticus)葡糖淀粉酶（成熟）
<400> 28
Phe Pro Thr Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Ser Ser Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Ser Gly Pro Ser Ser Thr Pro Phe Ser Ser Ala Thr Glu Ser Phe
20 25 30
Ser Thr Gly Thr Thr Val Thr Pro Ser Ser Ser Lys Tyr Pro Gly Ser
35 40 45
Lys Thr Glu Thr Ser Val Ser Ser Thr Thr Glu Thr Thr Ile Val Pro
50 55 60
Thr Thr Thr Thr Thr Ser Val Ile Thr Pro Ser Thr Thr Thr Ile Thr
65 70 75 80
Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Glu Thr Thr Ser
85 90 95
Gly Cys Ser Pro Lys Thr Ile Thr Thr Thr Val Pro Cys Ser Thr Ser
100 105 110
Pro Ser Glu Thr Ala Ser Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Thr Val Val Ser Thr Thr Val Val Thr Thr Glu Tyr Ser Thr
130 135 140
Ser Thr Lys Gln Gly Gly Glu Ile Thr Thr Thr Phe Val Thr Lys Asn
145 150 155 160
Ile Pro Thr Thr Tyr Leu Thr Thr Ile Ala Pro Thr Ser Ser Val Thr
165 170 175
Thr Val Thr Asn Phe Thr Pro Thr Thr Ile Thr Thr Thr Val Cys Ser
180 185 190
Thr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Glu Thr Thr Ser Gly Cys Ser Pro Lys
195 200 205
Thr Val Thr Thr Thr Val Pro Cys Ser Thr Gly Thr Gly Glu Tyr Thr
210 215 220
Thr Glu Ala Thr Ala Pro Val Thr Thr Ala Val Thr Thr Thr Val Val
225 230 235 240
Thr Thr Glu Ser Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Lys Thr Thr Thr
245 250 255
Ser Tyr Thr Thr Lys Ser Val Pro Thr Thr Tyr Val Phe Asp Phe Gly
260 265 270
Lys Gly Ile Leu Asp Gln Ser Cys Gly Gly Val Phe Ser Asn Asn Gly
275 280 285
Ser Ser Gln Val Gln Leu Arg Asp Val Val Leu Met Asn Gly Thr Val
290 295 300
Val Tyr Asp Ser Asn Gly Ala Trp Asp Ser Ser Ala Leu Glu Glu Trp
305 310 315 320
Leu Gln Arg Gln Lys Lys Val Ser Ile Glu Arg Ile Phe Glu Asn Ile
325 330 335
Gly Pro Ser Ala Val Tyr Pro Ser Ile Leu Pro Gly Val Val Ile Ala
340 345 350
Ser Pro Ser Gln Thr His Pro Asp Tyr Phe Tyr Gln Trp Ile Arg Asp
355 360 365
Ser Ala Leu Thr Ile Asn Ser Ile Val Ser His Ser Ala Asp Pro Ala
370 375 380
Ile Glu Thr Leu Leu Gln Tyr Leu Asn Val Ser Phe His Leu Gln Arg
385 390 395 400
Thr Asn Asn Thr Leu Gly Ala Gly Ile Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Val
405 410 415
Ala Leu Gly Asp Pro Lys Trp Asn Val Asp Asn Thr Ala Phe Thr Glu
420 425 430
Pro Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Ile Ala
435 440 445
Ile Leu Lys Ile Ile Asp Tyr Ile Lys Gln Ser Gly Thr Asp Leu Gly
450 455 460
Ala Lys Tyr Pro Phe Gln Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Asp Ile Val
465 470 475 480
Arg Trp Asp Leu Arg Phe Ile Ile Asp His Trp Asn Ser Ser Gly Phe
485 490 495
Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Met His Phe Phe Thr Leu Leu Val
500 505 510
Gln Leu Ser Ala Val Asp Arg Ser Leu Ser Tyr Phe Asn Ala Ser Glu
515 520 525
Arg Ser Ser Pro Phe Val Glu Glu Leu Arg Gln Thr Arg Arg Asp Ile
530 535 540
Ser Lys Phe Leu Val Asp Pro Ala Asn Gly Phe Ile Asn Gly Lys Tyr
545 550 555 560
Asn Tyr Ile Val Glu Thr Pro Met Ile Ala Asp Thr Leu Arg Ser Gly
565 570 575
Leu Asp Ile Ser Thr Leu Leu Ala Ala Asn Thr Val His Asp Ala Pro
580 585 590
Ser Ala Ser His Leu Pro Phe Asp Ile Asn Asp Pro Ala Val Leu Asn
595 600 605
Thr Leu His His Leu Met Leu His Met Arg Ser Ile Tyr Pro Ile Asn
610 615 620
Asp Ser Ser Lys Asn Ala Thr Gly Ile Ala Leu Gly Arg Tyr Pro Glu
625 630 635 640
Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Gly Val Gly Glu Gly Asn Pro Trp Val Leu
645 650 655
Ala Thr Cys Ala Ala Ser Thr Thr Leu Tyr Gln Leu Ile Tyr Arg His
660 665 670
Ile Ser Glu Gln His Asp Leu Val Val Pro Met Asn Asn Asp Cys Ser
675 680 685
Asn Ala Phe Trp Ser Glu Leu Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Leu Gly
690 695 700
Asn Asp Glu Gly Tyr Leu Ile Leu Glu Phe Asn Thr Pro Ala Phe Asn
705 710 715 720
Gln Thr Ile Gln Lys Ile Phe Gln Leu Ala Asp Ser Phe Leu Val Lys
725 730 735
Leu Lys Ala His Val Gly Thr Asp Gly Glu Leu Ser Glu Gln Phe Asn
740 745 750
Lys Tyr Thr Gly Phe Met Gln Gly Ala Gln His Leu Thr Trp Ser Tyr
755 760 765
Thr Ser Phe Trp Asp Ala Tyr Gln Ile Arg Gln Glu Val Leu Gln Ser
770 775 780
Leu
785
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 树脂枝胞菌(Amorphotheca resinae)
<220>
<223> 树脂枝胞菌葡糖淀粉酶信号序列
<400> 29
Met His Ser Phe Thr Ser Leu Leu Leu Val Ser Gly Leu Ala Leu Gln
1 5 10 15
Thr Ala Val Gly
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 瘤孢棒囊孢壳菌(Corynascus sepedonium)
<220>
<223> 瘤孢棒囊孢壳菌葡糖淀粉酶信号序列
<400> 30
Met His Ala Leu Ser Ser Leu Val Val Leu Gly Thr Cys Ala Val Gln
1 5 10 15
Thr Ala Leu Gly
20
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<223> 黑曲霉葡糖淀粉酶信号序列
<400> 31
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<223> 里氏木霉葡糖淀粉酶信号序列
<400> 32
Met His Val Leu Ser Thr Ala Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Val Gln
1 5 10 15
Lys Val Leu Gly
20
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 灰葡萄孢菌(Botryotinia fuckeliana)
<220>
<223> 灰葡萄孢菌葡糖淀粉酶信号序列
<400> 33
Met Leu Trp Glu Arg Ala Thr Ala Phe Val Ala Gly Ala Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ala
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 皱木耳(Auricularia delicata)
<220>
<223> 皱木耳葡糖淀粉酶信号序列
<400> 34
Met Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Phe Ala Ala Ala Ala Ser Ala
1 5 10 15
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)
<220>
<223> 柄篮状菌葡糖淀粉酶信号序列
<400> 35
Met Thr Arg Leu Ser Ser Val Leu Cys Ala Leu Ala Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Leu Ala
20
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> 印度梨形孢菌(Piriformospora indica)
<220>
<223> 印度梨形孢菌葡糖淀粉酶信号序列
<400> 36
Met Leu Phe Thr Ser Val Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ala Leu Ala
20
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 皱革菌(Punctularia strigosozonata)
<220>
<223> 皱革菌葡糖淀粉酶信号序列
<400> 37
Met Leu Ser Ser Leu Ile Val Ser Gly Leu Leu Ala Ser Gly Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 扣囊复膜孢酵母-Sfib-1.381
<220>
<223> 扣囊复膜孢酵母葡糖淀粉酶信号序列
<400> 38
Met Ile Arg Leu Thr Val Phe Leu Thr Ala Val Phe Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Ser Cys
<210> 39
<211> 21
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 酿酒酵母/糖化酵母葡糖淀粉酶信号序列
<400> 39
Met Gln Arg Pro Phe Leu Leu Ala Tyr Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe
1 5 10 15
Asn Ser Ala Leu Gly
20
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 酿酒酵母AGA2葡糖淀粉酶信号序列
<400> 40
Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 酿酒酵母EXG1葡糖淀粉酶信号序列
<400> 41
Met Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Cys Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 酿酒酵母Mfalfa信号序列
<400> 42
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala
<210> 43
<211> 44
<212> PRT
<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)
<220>
<223> 里氏木霉Xyn2信号序列
<400> 43
Met Val Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ser Pro Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Ser Cys Arg Pro Ala Ala Glu Val Glu Ser Val Ala Val Glu Lys Arg
20 25 30
Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly
35 40
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<223> 酿酒酵母/糖化酵母葡糖淀粉酶信号序列
<400> 44
Met Val Lys Ser Ile Leu Ala Ser Val Phe Phe Ala Ala Thr Ala Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 45
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物DBC-16841
<400> 45
cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc agcttttgtt gggccagaaa 60
aaggaagtgt 70
<210> 46
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物DBC-16903
<400> 46
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct ggaggaaatg 60
agaaatgaga 70
<210> 47
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物DBC-16904
<400> 47
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct ggaggaaatg 60
agaaatgaga 70
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物DBC-16844
<400> 48
gaacaaaagc tgggtaccgg 20
<210> 49
<211> 4967
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pRS313
<400> 49
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataattc cgttttaaga gcttggtgag cgctaggagt cactgccagg tatcgtttga 240
acacggcatt agtcagggaa gtcataacac agtcctttcc cgcaattttc tttttctatt 300
actcttggcc tcctctagta cactctatat ttttttatgc ctcggtaatg attttcattt 360
ttttttttcc acctagcgga tgactctttt tttttcttag cgattggcat tatcacataa 420
tgaattatac attatataaa gtaatgtgat ttcttcgaag aatatactaa aaaatgagca 480
ggcaagataa acgaaggcaa agatgacaga gcagaaagcc ctagtaaagc gtattacaaa 540
tgaaaccaag attcagattg cgatctcttt aaagggtggt cccctagcga tagagcactc 600
gatcttccca gaaaaagagg cagaagcagt agcagaacag gccacacaat cgcaagtgat 660
taacgtccac acaggtatag ggtttctgga ccatatgata catgctctgg ccaagcattc 720
cggctggtcg ctaatcgttg agtgcattgg tgacttacac atagacgacc atcacaccac 780
tgaagactgc gggattgctc tcggtcaagc ttttaaagag gccctactgg cgcgtggagt 840
aaaaaggttt ggatcaggat ttgcgccttt ggatgaggca ctttccagag cggtggtaga 900
tctttcgaac aggccgtacg cagttgtcga acttggtttg caaagggaga aagtaggaga 960
tctctcttgc gagatgatcc cgcattttct tgaaagcttt gcagaggcta gcagaattac 1020
cctccacgtt gattgtctgc gaggcaagaa tgatcatcac cgtagtgaga gtgcgttcaa 1080
ggctcttgcg gttgccataa gagaagccac ctcgcccaat ggtaccaacg atgttccctc 1140
caccaaaggt gttcttatgt agtgacaccg attatttaaa gctgcagcat acgatatata 1200
tacatgtgta tatatgtata cctatgaatg tcagtaagta tgtatacgaa cagtatgata 1260
ctgaagatga caaggtaatg catcattcta tacgtgtcat tctgaacgag gcgcgctttc 1320
cttttttctt tttgcttttt cttttttttt ctcttgaact cgacggatca tatgcggtgt 1380
gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata 1440
ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 1500
aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 1560
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 1620
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 1680
cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 1740
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 1800
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 1860
cgccgctaca gggcgcgtcg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 1920
gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa ggggggatgt gctgcaaggc 1980
gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 2040
aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca ccgcggtggc ggccgctcta 2100
gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatatcaa gcttatcgat accgtcgacc 2160
tcgagggggg gcccggtacc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tccgagcttg 2220
gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 2280
aacataggag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gaggtaactc 2340
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 2400
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 2460
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 2520
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 2580
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 2640
aggctcggcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 2700
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttc ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 2760
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 2820
ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 2880
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 2940
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 3000
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 3060
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 3120
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 3180
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 3240
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 3300
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 3360
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 3420
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactgcccgt cgtgtagata 3480
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 3540
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 3600
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 3660
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 3720
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 3780
gttacatgat cccccatgtt gtgaaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 3840
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 3900
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 3960
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 4020
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 4080
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 4140
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 4200
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 4260
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 4320
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 4380
cctgggtcct tttcatcacg tgctataaaa ataattataa tttaaatttt ttaatataaa 4440
tatataaatt aaaaatagaa agtaaaaaaa gaaattaaag aaaaaatagt ttttgttttc 4500
cgaagatgta aaagactcta gggggatcgc caacaaatac taccttttat cttgctcttc 4560
ctgctctcag gtattaatgc cgaattgttt catcttgtct gtgtagaaga ccacacacga 4620
aaatcctgtg attttacatt ttacttatcg ttaatcgaat gtatatctat ttaatctgct 4680
tttcttgtct aataaatata tatgtaaagt acgctttttg ttgaaatttt ttaaaccttt 4740
gtttattttt ttttcttcat tccgtaactc ttctaccttc tttatttact ttctaaaatc 4800
caaatacaaa acataaaaat aaataaacac agagtaaatt cccaaattat tccatcatta 4860
aaagatacga ggcgcgtgta agttacaggc aagcgatccg tcctaagaaa ccattattat 4920
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 4967
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 50
tcctgtacgc actttgtccc acaaattccc gattccgcaa tttgttcgcc 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 51
gaacaggata tttcgatctt ggatacgtac tcgcttgtgt ctggtttcgt 50
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 整合靶序列
<400> 52
agaaaactct tagcttttcc 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 整合靶序列
<400> 53
caatatggta tgccgagtct 20

Claims (16)

1.重组酵母，所述重组酵母包含：
-允许表达葡糖淀粉酶的核苷酸序列，所述葡糖淀粉酶具有根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或所述葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO:17有至少70％的序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组酵母，所述重组酵母还包含：
-编码甘油脱氢酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组酵母，所述重组酵母还包含：
-编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(EC 4.1.1.39，RuBisCO)的核苷酸序列；以及
-编码磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19，PRK)的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母还包含编码甘油转运体的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母包含编码甘油输出蛋白的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
6.根据前述权利要求中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母包含编码甘油激酶(EC2.7.1.30)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
7.根据前述权利要求中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母包含编码甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1/2)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
8.根据前述权利要求中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母包含编码甘油-3-磷酸磷酸水解酶(GPP 1/2)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
9.根据前述权利要求中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母是酵母属(Saccharomyces)，优选地是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的重组酵母，所述重组酵母还包含一种或多种编码来自大肠杆菌(E.coli)的分子伴侣的核苷酸序列，所述分子伴侣选自由以下项组成的组：GroEL、GroES、GroEL的功能同源物和GroES的功能同源物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的重组酵母用于制备乙醇和/或琥珀酸的用途。
12.一种生产乙醇的方法，所述方法包括：
-在根据权利要求1-10中任一项所述的重组酵母存在下在厌氧条件下发酵组合物，所述组合物包含可发酵碳水化合物，所述可发酵碳水化合物特别地选自以下项的组：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖；以及
-回收乙醇。
13.根据前述权利要求所述的方法，其中可发酵碳水化合物获自淀粉、木质纤维素和/或果胶。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述组合物包含10mM或更少的量的未离解的乙酸。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述组合物包含介于50μM与10mM之间的量的未离解的乙酸。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，所述方法包括以0.05g/L或更低的浓度投入葡糖淀粉酶。
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