ES2390901T3

ES2390901T3 - Método para diseñar mutantes de alfa-amilasa con propiedades predeterminadas

Info

Publication number: ES2390901T3
Application number: ES09161087T
Authority: ES
Inventors: Allan Svendsen; Henrik Bisgaard-Frantzen; Torben Borchert
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2012-11-19
Anticipated expiration: 2016-02-05
Also published as: US5989169A; BR9607013A; ATE432342T1; CA2211316C; CN100419076C; EP2199378B1; KR100511499B1; DE69637940D1; US6022724A; WO1996023874A1; JPH11500003A; CA2211316A1; KR19980701901A; AU4483496A; EP2199378A1; US20050019886A1; ES2329528T3; JP4047379B2; MX9705906A; US7163816B2

Abstract

Variante de una alfa-amilasa parental de tipo Termamyl, que presenta actividad de alfa-amilasa y que tiene unadependencia de iones de calcio disminuida con respecto a la alfa-amilasa parental, que comprende una mutación en unaposición que corresponde a al menos una de las siguientes posiciones en la SEC ID No: 2:N104, A349, 1479, L346, I430, N457, K385, F350, 1411, H408 o G303.

Description

Método para diseñar mutantes de alfa-amilasa con propiedades predeterminadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a nuevos mutantes de a-amilasa con dependencia de Ca2+ disminuida, basándose en la estructura tridimensional hasta ahora desconocida de la a-amilasa bacteriana SEC ID No 2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las a-amilasas (a-1,4 glucan-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas capaces de hidrolizar almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados. Casi todas las a-amilasas estudiadas tienen algunas regiones conservadas con aproximadamente la misma longitud y separación. Una de estas regiones se asemeja al

2+

sitio de unión de Ca de calmodulina y las otras se estiman necesarias para el centro activo y/o la unión del sustrato.

[0003] Aunque se conoce la secuencia de aminoácidos y de este modo la estructura primaria de un gran número de aamilasas, se ha comprobado que es muy difícil determinar la estructura tridimensional de todas las a-amilasas. La estructura tridimensional se puede determinar mediante análisis cristalográfico de rayos X de cristales de a-amilasa, pero ha resultado ser difícil obtener cristales de a-amilasa adecuados para resolver realmente la estructura.

[0004] Hasta ahora sólo se ha determinado la estructura tridimensional de algunas a-amilasas a alta resolución. Éstas incluyen la estructura de la TAKA a-amilasa de Aspergillus oryzae (Swift et al., 1991), la amilasa ácida de Aspergillus niger (Brady et al, 1991), la estructura de la a-amilasa pancreática porcina (Qian et al., 1993), y la alfa-amilasa de cebada (Kadziola et al. 1994, Journal of Molecular Biology 239: 104-121, A. Kadziola, Thesis, Dept of Chemistry, U. of Copenhagen, Denmark). Además, se conoce la estructura tridimensional de una ciclodextrina glicosiltransferasa (CGTasa) de Bacillus circulans (Klein et al., 1992) (Lawson et al., 1994). La CGTasa cataliza el mismo tipo de reacciones que las a-amilasas y muestra cierta similitud estructural con las a-amilasas.

[0005] Además, se han descrito la cristalización y los estudios de rayos X preliminares de las a-amilasas de B. subtilis (Chang et al. (1992) y Mizuno et al. (1993)). No se ha registrado ninguna estructura final de B. subtilis. Análogamente, se ha registrado la preparación de cristales de a-amilasa de B. licheniformis (Suzuki et al. (1990), pero no hay informes posteriores disponibles sobre el análisis cristalográfico de rayos X o la estructura tridimensional.

[0006] Diferentes equipos de investigación han intentado construir estructuras tridimensionales basándose en las anteriores estructuras de a-amilasa conocidas. Por ejemplo, Vihinen et al. (J. Biochem. 107: 267-272, 1990), revela el modelado (o simulación por ordenador) de una estructura tridimensional de la a-amilasa de Bacillus stearothermophilus basándose en la estructura de la TAKA amilasa. El modelo se usó para investigar consecuencias estructurales hipotéticas de diferentes mutaciones dirigidas de la a-amilasa de B. stearothermophilus. E.A. MacGregor (1987) predice la presencia de a-hélices y

�-barriles en a-amilasas de distintas fuentes, incluyendo la cebada, el páncreas de cerdo y el Bacillus amyloliquefaciens, prediciendo algoritmos con base en la estructura conocida de la TAKA a-amilasa de A. oryzae y de la estructura secundaria. Además, se predicen los bucles y subsitios posibles que se pueden encontrar presentes en, p. ej., la a-amilasa de B. amyloliquefaciens (con base en una comparación con la secuencia y la estructura de A. oryzae).

[0007] A.E. MacGregor (Starch/Stärke 45 (1993), No. 7, p. 232-237) presenta una revisión de la relación entre la estructura y la actividad de enzimas relacionadas con la a-amilasa.

[0008] Hasta ahora, no ha estado disponible ninguna estructura tridimensional para las a-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (las cuales se denominan en el contexto presente "a-amilasas de tipo Termamyl"), incluyendo la a-amilasa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, y B. stearothermophilus.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCIÓN

[0009] La estructura tridimensional de una a-amilasa bacteriana de tipo Termamyl se ha aclarado ahora. Con base en un análisis de dicha estructura es posible identificar partes estructurales o residuos de aminoácidos específicos que parezcan ser importantes a partir de consideraciones estructurales o funcionales para conferir las diferentes propiedades a las aamilasas de tipo Termamyl. Además, al comparar la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl con estructuras conocidas de las a-amilasas fúngicas y de mamíferos mencionadas arriba, se ha descubierto que existen algunas similitudes entre las estructuras, pero que también existen algunas diferencias estructurales sorprendentes e imprevistas previamente entre las a-amilasas. La presente invención se basa en estas conclusiones y se refiere sólo a las variantes de las reivindicaciones 1

7. Los siguientes "aspectos" se consideran como formas de realización generales y no definen el alcance de la invención o de las reivindicaciones.

[0010] Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a un método para construir una variante de una aamilasa parental de tipo Termamyl, teniendo esta variante actividad a-amilasa y dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha a-amilasa parental, comprendiendo el método i) analizar la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl con el propósito de identificar al menos un residuo de aminoácido

: o al menos una parte estructural de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl, creyendo que el residuo de aminoácido

: o la parte estructural es relevante para alterar dicha propiedad de la a-amilasa parental de tipo Termamyl (según se evaluó con base en consideraciones estructurales o funcionales), ii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl, que en comparación con la a-amilasa parental de tipo Termamyl, se ha modificado en el residuo de aminoácido o parte estructural identificada en i) de manera que altera dicha propiedad, y iii) analizar la variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante para dicha propiedad.

[0011] En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un método para construir una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, teniendo la variante actividad a-amilasa y dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha a-amilasa parental, comprendiendo el método i) comparar la estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo Termamyl con la estructura de una a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, ii) identificar una parte de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl diferente de la estructura de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, y iii) modificar la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de a-amilasa de tipo Termamyl, una o más propiedades por las cuales difiere de la a-amilasa parental de tipo Termamyl.

[0012] En un tercer aspecto la invención se refiere a un método para construir una variante de una a-amilasa parental de tipo distinto de Termamyl, teniendo la variante actividad a-amilasa y dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha a-amilasa parental, comprendiendo el método i) comparar la estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl con la estructura de una a-amilasa de tipo Termamyl, ii) identificar una parte de la estructura de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl diferente de la estructura de la aamilasa de tipo Termamyl, y iii) modificar la parte de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de aamilasa de tipo distinto de Termamyl, una o más propiedades por las cuales difieren de la a-amilasa parental de tipo Termamyl.

[0013] La propiedad que se puede alterar mediante los métodos anteriores de la presente invención puede ser, p. ej., la especificidad de sustrato,

[0014] En otros aspectos la invención se refiere a variantes de una a-amilasa de tipo Termamyl, a ADN que codifica este tipo de variantes y a métodos para preparar las variantes. Finalmente, la invención se refiere al uso de las variantes para diferentes objetivos industriales.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La a-amilasa de tipo Termamyl

[0015] Es bien conocido que varias alfa-amilasas producidas por el Bacillus spp. son altamente homólogas en el nivel aminoácido. Por ejemplo, se ha observado que la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2 (disponible a nivel comercial como Termamyl®) es homóloga en aproximadamente un 89% a la a-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4 y homóloga en aproximadamente un 79% a la a-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 6. Otras a-amilasas homólogas incluyen una a-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todo lo cual se describe detalladamente en WO 95/26397, y la a-amilasa descrita por Tsukamoto et al., 1988, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 151, No. 1. Otras a-amilasas homólogas incluyen la a-amilasa producida por la B. licheniformis descrita en EP 252 666 (ATCC 27811), y las a-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras a-amilasas de B. licheniformis de tipo Termamyl comerciales son Optitherm® y Takatherm® (disponibles a través de Solvay), Maxamyl® (disponible a través de Gist-brocades/Genencor), Spezym AA® (disponible a través de Genencor), y Keistase® (disponible a través de Daiwa).

[0016] Por la homología sustancial encontrada entre estas a-amilasas, éstas se consideran parte de la misma clase de aamilasas, es decir la clase de las "a-amilasas de tipo Termamyl".

[0017] Por consiguiente, en el contexto presente, el término "a-amilasa de tipo Termamyl" se destina a indicar una a-amilasa que, en el nivel aminoácido, muestra una homología sustancial con Termamyl®, es decir la SEC ID No: 2 de la a-amilasa de

B. licheniformis. En otras palabras, una a-amilasa de tipo Termamyl es una a-amilasa, la cual posee la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2, 4 o 6, o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 1 ó 2 de WO 95/26397 o en Tsukamoto et al., 1988, o i), que muestra al menos un 60%, así como al menos un 70%, p. ej. al menos un 75%, o al menos un 80%, p. ej. al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos y/o ii) muestra reacción cruzada inmunológica con un anticuerpo dirigido contra al menos una de dichas a-amilasas, y/o iii) se codifica por una secuencia de ADN que se hibrida con las secuencias de ADN que codifican las a-amilasas especificadas arriba, las cuales provienen aparentemente de las SEC ID Nos: 1, 3 y 5 de la solicitud presente, y de la SEC ID No: 4 y 5 de WO 95/26397, respectivamente.

[0018] En relación a la propiedad i), la "homología" se puede determinar usando cualquier algoritmo convencional, preferiblemente usando el programa GAP de la versión 7.3 del paquete GCG (Junio 1993), usando valores por defecto para las penalizaciones de GAP (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

[0019] La propiedad ii) de la a-amilasa, es decir la reactividad cruzada inmunológica, se puede evaluar usando un anticuerpo dirigido contra o reactivo con al menos un epítopo de la a-amilasa de tipo Termamyl relevante. El anticuerpo, el cual puede ser o bien monoclonal o policlonal, se puede producir mediante métodos conocidos en la técnica, p. ej. como se describe por Hudson et al., 1989. La reacción cruzada inmunológica se puede determinar usando ensayos conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales son el ensayo de transferencia de Western o de inmunodifusión radial, p. ej. como se describe por Hudson et al., 1989. En este aspecto, se ha encontrado reacción cruzada inmunológica entre las a-amilasas que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nos: 2, 4 y 6, respectivamente.

[0020] La sonda de oligonucleótidos usada en la caracterización de la a-amilasa de tipo Termamyl conforme a la propiedad iii) de arriba se puede preparar de manera adecuada con base en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos completa o parcial de la a-amilasa en cuestión. Las condiciones adecuadas para examinar la hibridación implican preremojar en 5xSSC y prehibridar durante 1h a -40°C en una solución de formamida al 20%, una solución de 5xDenhardt, 50mM de fosfato sódico, a pH 6.8, y 50lg de ADN de timo de ternera sonicado desnaturalizado, seguido de la hibridación en la misma solución suplementada con 100lM de ATP durante 18h a -40°C, u otros métodos descritos p. ej. por Sambrook et al., 1989.

[0021] En el contexto presente, "derivada de" se destina no sólo a indicar una a-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una a-amilasa codificada por una secuencia aislada de ADN de tal cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término se destina a indicar una a-amilasa que esté codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tenga las características identificatorias de la a-amilasa en cuestión. El término se destina también a indicar que la a-amilasa parental puede ser una variante de una a-amilasa de origen natural, es decir una variante que sea el resultado de una modificación (inserción, sustitución, eliminación) de uno o más residuos de aminoácidos de la a-amilasa de origen natural.

a-Amilasas híbridas parentales

[0022] La a-amilasa parental (siendo una a-amilasa de tipo Termamyl o de tipo distinto de Termamyl) puede ser una aamilasa híbrida, es decir una a-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivada de al menos dos a-amilasas.

[0023] La a-amilasa híbrida parental puede aquella que con base en la homología de aminoácido y/o la reacción cruzada inmunológica y/o la hibridación de ADN (según se define arriba) pueda ser determinada como perteneciente a la familia de la a-amilasa de tipo Termamyl. En este caso la a-amilasa híbrida se compone normalmente de al menos una parte de una a-amilasa de tipo Termamyl y parte(s) de otra u otras a-amilasas seleccionadas a partir de las a-amilasas de tipo Termamyl

o las a-amilasas de tipo distinto de Termamyl de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o de mamífero.

[0024] De este modo, la a-amilasa híbrida parental puede comprender una combinación de al menos dos a-amilasas de tipo Termamyl, o de al menos una a-amilasa bacteriana de tipo Termamyl y al menos una de tipo distinto de Termamyl, o de al menos una a-amilasa de tipo Termamyl y al menos una fúngica. Por ejemplo, la a-amilasa parental comprende una parte Cterminal de una a-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis y una parte N-terminal de una a-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B. stearothermophilus. Por ejemplo, la a-amilasa parental comprende al menos 430 residuos de aminoácidos de la parte C-terminal de la a-amilasa de B. licheniformis, y, p. ej. puede comprender a) un segmento de aminoácido correspondiente a los 37 residuos de aminoácidos del N-terminal de la a-amilasa de B. amyloliquefaciens que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4 y un segmento de aminoácidos correspondiente a los 445 residuos de aminoácidos del C-terminal de la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2, o b) un segmento de aminoácido correspondiente a los 68 residuos de aminoácidos del N-terminal de la a-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 6 y un segmento de aminoácidos correspondiente a los 415 residuos de aminoácidos del C-terminal de la aamilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2.

[0025] Análogamente, la a-amilasa híbrida parental puede pertenecer a una familia de a-amilasas de tipo distinto de Termamyl, p. ej. la familia de a-amilasas de tipo Fungamyl. En este caso el híbrido puede comprender al menos una parte de una a-amilasa perteneciente a la familia de a-amilasas de tipo distinto de Termamyl en combinación con una o más partes derivadas de otras a-amilasas.

La estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo Termamyl

[0026] La a-amilasa de tipo Termamyl que se usó para aclarar la estructura tridimensional que forma la base para la presente invención consiste en los 300 aminoácidos del N-terminal de la a-amilasa de B. amyloliquefaciens (con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4) y los aminoácidos 301-483 del extremo del C-terminal de la aamilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 2. La a-amilasa bacteriana pertenece a la "familia de a-amilasas de tipo Termamyl" y la estructura presente se tiene por representativa para la estructura de cualquier a-amilasa de tipo Termamyl.

[0027] La estructura de la a-amilasa se resolvió conforme al principio para los métodos cristalográficos de rayos X dados en "X-Ray Structure Determination", Stout, G.K. and Jensen, L.H., John Wiley & Sons, inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina resuelta de la a-amilasa a una resolución de 2.2 Å usando el método de sustitución isomorfo se dan en un formato PDB estándar (Base de Datos de Proteínas de Brookhaven) en el Apéndice 1. Se debe entender que el Apéndice 1 forma parte de la solicitud presente.

[0028] Los residuos de aminoácidos de la enzima se identifican mediante un código de aminoácido de tres letras (letras mayúsculas).

[0029] La estructura de la a-amilasa se compone de tres dominios globulares siguiendo el orden A, B, y C con respecto a la secuencia, la cual se halla aproximadamente a lo largo de una línea con el orden B, A, C. Los dominios se pueden definir como si fueran los residuos 1-103 y 206 395 para el dominio, A, los residuos 104-205 para el dominio B, y los residuos 396483 para el dominio C, refiriéndose los números a la a-amilasa de B. licheniformis. Ésta da lugar a una molécula alargada, siendo el eje el más largo de aproximadamente 85Å. El punto más ancho perpendicular a este eje es de aproximadamente 50Å y abarca el dominio central A. Los residuos del sitio activo de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2) son D323, D231 y E261.

Dominio A

[0030] El dominio A es el dominio más grande y contiene el sitio activo (compuesto por un clúster de tres residuos de aminoácidos colocado en el fondo de una hendidura profunda en la superficie de la enzima). Los dominios A de todas las estructuras de a-amilasa conocidas tienen el mismo plegado global, es decir que el barril (beta/alfa)8 con 8 cadenas beta centrales (número 1-8) y 8 a-hélices adyacentes. El -barril está definido por McGregor Op. Cit. El extremo C-terminal de la cadena Beta 1 está conectado a la hélice 1 mediante un bucle denominado bucle 1 y se crea un modelo idéntico para los otros bucles. Estos bucles muestran alguna variación en el tamaño y algunos pueden ser bastante extensos.

[0031] Las 8 cadenas Beta centrales en el barril (beta/alpha)8 se superponen bien entre las diferentes estructuras de aamilasa conocidas, y esta parte de la estructura, incluyendo los alrededores cercanos al sitio activo localizado en el extremo del C-terminal de las cadenas Beta, muestra similitud alta entre las diferentes amilasas.

[0032] Los bucles que conectan las cadenas Beta y las alfa hélices muestran variaciones altas entre las alfa amilasas. Estos bucles constituyen el contexto estructural del sitio activo y la mayoría de los contactos del sustrato se encuentran entre los residuos localizados en estos bucles. Tales características importantes como la especificidad de sustrato, la unión de sustrato; el perfil de pH/actividad, el modelo de ruptura de almidón están determinados por los aminoácidos y las posiciones de los mismos en estos bucles.

[0033] Las diferencias sustanciales entre la estructura de la a-amilasa de tipo Fungamyl y la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl reveladas aquí, las cuales se encuentran en los bucles 1, 2, 3, y 8, se visualizan en las Figuras.

Dominio B

[0034] Se ha descubierto que la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl comprende una estructura de dominio especial en el bucle3 del dominio A, también llamado dominio B. La estructura del dominio B de la a-amilasa de tipo Termamyl nunca se había visto antes en alguna de las a-amilasas conocidas o proteínas del barril ( /alfa) 8.

[0035] La estructura del dominio B es un dominio muy compacto que tiene un número muy alto de residuos cargados. El dominio B surge como una extensión del bucle entre la cadena 3 y la hélice 3 del dominio A (mostrada en la Fig. 7) y contiene una estructura de -hojas de 5 láminas antiparalelas que contiene al menos una estructura de bucle larga y que tiene la conectividad -1; +3; -1X; +2 (Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34: 167-339).

[0036] Las primeras cuatro cadenas del dominio B forman dos bucles de horquilla que se enrollan el uno alrededor del otro como dos dedos cruzados (torsión a la derecha). La cadena principal se incorpora a una -cadena que conecta dos estructuras de -hoja pequeñas. Después de hacer un giro en una hoja ésta se repliega y forma una hoja de dos láminas en contacto con el dominio A y un agujero interno en la estructura de la a-amilasa. Entonces la cadena principal se dobla formando una pequeña estructura en capas casi perpendicular a las dos primeras hojas. Antes de introducir la hélice 3 encima de la -cadena 3, los aproximadamente 24 últimos aminoácidos en el dominio B forman dos sitios de unión de calcio en la región en contacto con el dominio A.

[0037] El dominio B se conecta con el dominio A mediante dos extensiones peptídicas, las cuales dividen en dos las áreas de contacto dominio-dominio. El dominio B está en contacto con el dominio A mediante una región de unión de calcio y un agujero internamente oculto que contiene aguas. Están presentes muchos tipos de contactos moleculares. Es posible la interacción iónica entre el ácido y los aminoácidos básicos, estas interacciones son muy importantes para la estabilidad general a alto pH y para mantener intactos los sitios de unión de calcio.

Dominio C

[0038] El dominio C es la parte C-terminal de la proteína que consiste en los aminoácidos 394-483. El dominio C está compuesto en su totalidad por -cadenas que forman una estructura de hojas independiente de 8 láminas, la cual se repliega en sí misma, y en esa forma se puede describir como una estructura -sándwich. La conectividad es +1; +1; +5; -3; +1; +1; -3 aunque las cadenas 6 y 7 sólo están conectadas con holgura. Una parte de la -hoja forma la interfaz para el dominio A.

Sitios de unión de Ca y de Na

[0039] La estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl es destacable en tanto en cuanto muestra cuatro sitios de unión de calcio y un sitio de unión de sodio. En otras palabras, en la estructura se encuentran presentes cuatro iones calcio y un ión sodio, aunque uno de los iones calcio muestra una coordinación muy débil. Dos de los iones calcio forman parte de un clúster lineal de tres iones, estando atribuido el ión central al sodio, el cual se halla en la conjunción de los dominios A y B.

[0040] Los residuos coordinantes para los iones calcio entre los dominios A y B son los siguientes (usando la nomenclatura de fichero Pdb localizada en el mismo Apéndice 1 para los residuos de aminoácidos y los átomos en el fichero Pdb): para el ión calcio más cercano al sitio activo (IUM 502 en el fichero Pdb), los carbonilos de esqueleto de His235 y Asp194, el átomo de cadena lateral OD1 de los residuos Asp194; Asn102 y Asp200, y una molécula de agua WAT X3 (átomo OW7). Para el ión sodio (IUM 505), el sitio de unión incluye el átomo OD2 de Asp194; Asp200; Asp183 y Asp159, y un carbonilo de esqueleto de Val201. Las coordenadas para el otro ión calcio entre los dominios A y B son (IUM 501): el átomo OD2 de Asp204 y Asp159, el carbonilo de esqueleto de Asp183 y Ala181, el átomo OD1 de Asp202, y una molécula de agua WAT X7 (átomo OW7).

[0041] Un ión calcio está localizado entre los dominios A y C, otro está localizado en el dominio C. El primer ión calcio mencionado, el cual también es el que está mejor coordinado (IUM 503), incluye un esqueleto de carbonilo de Gly300, Tyr302 y His406, el átomo OD2/OD1 de Asp430, el átomo OD1 de Asp407, y una molécula de agua WAT X6 (átomo OW7). El otro sitio de calcio, muy débilmente coordinado (IUM 504), comprende 4 moléculas de agua WAT X21 (átomo OW8), X6 (átomo OW6), X9 (átomo OW0) y X28 (átomo OW8), OE1/OE2 de Glu447 y OD1 de Asn444.

Sitio de unión de sustratos

[0042] No habiéndose limitado a ninguna teoría se cree actualmente que se dan interacciones favorables entre una molécula de sustrato y la enzima (tales como enlaces de hidrógeno y/o una interacción electroestática fuerte) dentro de una esfera de 4Å del sustrato, al unirse a la enzima. Se contempla que los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2 están a una distancia de 4Å del sustrato y por ello se cree que intervienen en interacciones con el sustrato:

Trp13; Tyr14; Asn17; Asp18; Ser50; Gln51; Ala52; Asp53; Val54; Gly55; Tyr56; Lys70; Arg74; Lis76; Val102;

His105; Gly107; Gly108; Ala109; Trp138; Tr163; Asp164; Trp165; Asn172; Glu189; Tyr193; Leu196; Met197;

Tyr198; Ala199; Arg229; Asp231; Ala232; Lys234; His235; Glu261; Trp263; His327; Asp328; Gln333; Ser334, y

Leu335.

[0043] Los residuos de aminoácidos de otra a-amilasa de tipo Termamyl, los cuales se considera que están a una distancia de 4Å del sustrato, se pueden identificar fácilmente alineando la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 2 con la de la otra a-amilasa de tipo Termamyl y de ese modo identificando las posiciones equivalentes a aquellas identificadas arriba.

Generalidad de estructura

[0044] Debido a la alta homología entre las diferentes a-amilasas de tipo Termamyl, se considera que la estructura resuelta definida por las coordenadas del Apéndice 1 es representativa para la estructura de todas las a-amilasas de tipo Termamyl. Una estructura modelo de otras a-amilasas de tipo Termamyl se puede construir fácilmente con base en las coordenadas dadas en el Apéndice 1 adaptadas a la a-amilasa en cuestión usando un alineamiento entre las secuencias de aminoácidos respectivas. La creación de una estructura modelo se ejemplifica en el Ejemplo 1.

[0045] Las partes características de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl (sitio de unión de Ca, centro de unión de sustrato, bucles, etc.) identificadas arriba se pueden identificar fácilmente en otras a-amilasas de tipo Termamyl basándose en una estructura modelo (o resuelta) de la a-amilasa pertinente de tipo Termamyl o simplemente basándose en un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa de tipo Termamyl en cuestión con el de la a-amilasa de B. lichenformis usado aquí para identificar los residuos de aminoácidos de los elementos estructurales respectivos.

[0046] Además, en relación con las variantes de tipo Termamyl de la invención, las cuales se definen mediante la modificación de residuos de aminoácidos específicos de una a-amilasa de tipo Termamyl específica, se entenderá que las variantes de otra a-amilasa de tipo Termamyl modificada en una posición equivalente (según se determina a partir del mejor alineamiento de secuencias de aminoácidos posible entre las secuencias respectivas) también se pretenden cubrir. De este modo, con independencia de si un residuo de aminoácido se identifica aquí con el fin de definir una parte estructural de una a-amilasa dada o se usa para identificar una variante de la a-amilasa, este residuo de aminoácido se considerará representativo del residuo de aminoácido equivalente de cualquier otra a-amilasa de tipo Termamyl.

Métodos de la invención para diseñar nuevas variantes de a-amilasa

[0047] En los métodos según el primer, segundo y tercer aspecto de la invención, los términos "estructura de una a-amilasa de tipo Termamyl" y "estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl" están destinados a indicar la estructura resuelta definida por las coordenadas presentadas en el Apéndice 1 o una estructura modelo de una a-amilasa de tipo Termamyl dada (tal como la a-amilasa de B. licheniformis) construida con base en la estructura resuelta.

[0048] En la mayoría de los casos la a-amilasa parental de tipo Termamyl que se va a modificar conforme a la presente invención es diferente de la a-amilasa que ya se usó para resolver la estructura (Apéndice 1). Esto significa que el(los) residuo(s) aminoácido(s) o parte(s) estructural(es) identificada(s) en la estructura resuelta (Apéndice 1) en la fase i) del método según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención se debe traducir en el(los) residuo(s) de aminoácido(s) correspondiente(s) o parte(s) estructural(es) de la a-amilasa parental de tipo Termamyl en cuestión. La "traducción" se realiza convenientemente con base en un alineamiento de secuencias de aminoácidos entre la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa de tipo Termamyl usada para resolver la estructura y la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa parental de tipo Termamyl en cuestión.

[0049] El análisis o comparación realizado en la fase i) del método según el primer, segundo y tercer aspecto, respectivamente, de la invención, se puede realizar usando cualquier programa de ordenador adecuado capaz de analizar y/o comparar estructuras de proteína, p. ej. el programa de ordenador Insight, disponible a través de Biosym Technologies, Inc. Por ejemplo, el principio básico de la comparación de estructuras es que las estructuras tridimensionales que se comparan se superponen con base en un alineamiento de elementos estructurales secundarios (tales como las 8 -cadenas centrales en el barril) y las partes que difieren entre las estructuras se pueden identificar posteriormente con facilidad a partir de la estructura superpuesta.

[0050] La parte estructural que se identifica en la fase i) de los métodos del primer, segundo y tercer aspecto de la invención puede estar compuesta de un residuo de aminoácido. No obstante, normalmente la parte estructural comprende más de un residuo de aminoácido, que normalmente constituye una de las partes de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl de arriba tal como uno de los dominios A, B, o C, una interfaz entre cualquiera de estos dominios, un sitio de unión de calcio, una estructura de bucle, el sitio de unión de sustrato, o similar.

[0051] En el contexto presente el término "consideraciones estructurales o funcionales" se destina a indicar que las modificaciones se hacen con base en un análisis de la estructura o parte estructural pertinente y su impacto contemplado en la función de la enzima. De este modo se puede usar un análisis de las estructuras de las diferentes a-amilasas que hasta ahora se han dilucidado, opcionalmente en combinación con un análisis de las diferencias funcionales entre estas aamilasas, para asignar propiedades determinadas de las a-amilasas a partes determinadas de la estructura de la a-amilasa

o para contemplar tal relación. Por ejemplo, las diferencias en el modelo o estructura de bucles circundantes del sitio activo pueden suponer diferencias en el acceso al sitio activo del sustrato y de este modo a diferencias en la especificidad de sustrato y/o el modelo de corte. Además, se han identificado las partes de una a-amilasa de tipo Termamyl implicadas o con la intención de intervenir en la unión de sustrato (y así p. ej. el modelo de especificidad/corte), la unión de ión calcio o sodio

(p. ej. importante para la dependencia de Calcio de la enzima), y similares (véase más abajo).

[0052] La modificación de un residuo de aminoácido o parte estructural se realiza normalmente mediante modificaciones adecuadas de una secuencia de ADN que codifica la enzima parental en cuestión. El término "modificado" según se usa en la fase ii) en el método según el primer aspecto de la invención pretende significar lo siguiente: en caso de usarse en relación a un residuo de aminoácido el término pretende significar la sustitución del residuo de aminoácido en cuestión por otro residuo de aminoácido. En caso de usarse en relación a una parte estructural, el término pretende significar la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos de dicha parte estructural, la adición de uno o más residuos de aminoácidos a dicha parte, o la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de dicha parte estructural.

[0053] La construcción de la variante de interés se realiza cultivando un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones propicias para producir la variante, y opcionalmente recuperando posteriormente la variante del caldo de cultivo resultante. Esto se describe más detalladamente abajo.

Primer aspecto de la invención

[0054] En una forma de realización del método preferida según el primer aspecto de la invención, la propiedad de la enzima parental para ser modificada se seleccióna a partir de la dependencia de calcio, la unión de sustrato, el modelo de corte, la actividad dependiente del pH y similares. Más abajo se dan ejemplos específicos de cómo cambiar estas propiedades de una a-amilasa parental de tipo Termamyl.

[0055] En otra forma de realización preferida la a-amilasa de tipo Termamyl parental que se modifica es una a-amilasa de B. licheniformis.

Segundo y tercer aspectos de la invención

[0056] Una ventaja importante de los métodos según el segundo y el tercer aspectos de la presente invención es que es posible adaptar la estructura (o una parte estructural) de una a-amilasa de tipo Termamyl a la estructura (o parte estructural) de una a-amilasa de tipo distinto de Termamyl y viceversa. Por ejemplo, habiendo identificado una estructura de bucle de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, la cual se cree que es responsable de o contribuye a una propiedad particular de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, es posible reemplazar la estructura correspondiente de la a-amilasa de tipo Termamyl por dicha estructura de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, o si no existe una estructura correspondiente en la a-amilasa de tipo Termamyl, insertar la estructura en la a-amilasa de tipo Termamyl de manera que la a-amilasa de tipo Termamyl variante resultante, por lo que respecta a la parte relevante, se asemeja a la parte correspondiente de la aamilasa de tipo distinto de Termamyl. Al modificarse dos o más partes de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl parental con el fin de asemejarse a las partes correspondientes de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl es posible aumentar la similitud con la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl de la variante de la a-amilasa de tipo Termamyl y así alterar las propiedades de dicha variante en la dirección de las de dicha a-amilasa de tipo distinto de Termamyl. Las modificaciones de bucle se tratan de forma mucho más detallada más abajo.

[0057] Normalmente, la modificación a realizar en la fase iii) del método según el segundo aspecto de la invención se realiza borrando uno o más residuos de aminoácidos de la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl a modificar con el fin de adaptar la estructura de dicha parte de la a-amilasa parental a la parte correspondiente de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl; sustituyendo uno o más residuos de aminoácidos de la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl a modificar por los residuos de aminoácidos que ocupan posiciones correspondientes en la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl; o insertando uno o más residuos de aminoácidos presentes en la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl en una posición correspondiente en la a-amilasa de tipo Termamyl. Para el método según el tercer aspecto se entiende la modificación de forma análoga, realizada en la a-amilasa parental de tipo distinto de Termamyl preferiblemente a la a-amilasa de tipo Termamyl.

[0058] En la fase ii) del método según el segundo o tercer aspecto de la invención, la parte de la estructura a identificar es preferiblemente una que según se crea esté en contacto con el sustrato en la enzima plegada (compárese la declaración abajo en la sección titulada "El sitio de unión de sustrato) o implicado en el modelo de especifidad y/o corte de sustrato, y/o uno que esté en contacto con uno de los iones calcio o sodio y/o uno, el cual esté contribuyendo en el pH o el perfil de temperatura de la enzima, o uno que de otro modo, a partir de consideraciones estructurales o funcionales, se contemple como responsable de diferencias en una o más propiedades de la a-amilasa de tipo Termamyl y de la de tipo distinto de Termamyl.

a-Amilasa de tipo distinto de Termamyl

[0059] La a-amilasa de tipo distinto de Termamyl con la cual se hace la comparación en la fase i) del método del segundo aspecto de la invención y la cual es la a-amilasa parental en el método del tercer aspecto de la invención, puede ser cualquier a-amilasa que no pertenezca a la familia de las a-amilasas de tipo Termamyl (según se define arriba) y, como consecuencia de esto, tenga una estructura tridimensional diferente. Además, la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl debería tener, al mismo tiempo que se realiza el método, una estructura tridimensional dilucidada o contemplada.

[0060] La a-amilasa de tipo distinto de Termamyl puede ser, p. ej., una a-amilasa fúngica, una a-amilasa de mamífero o de planta o una a-amilasa bacteriana (diferente de una a-amilasa de tipo Termamyl). Ejemplos específicos de tales a-amilasas incluyen la TAKA a-amilasa de Aspergillus oryzae, la a-amilasa ácida de A. niger, la a-amilasa de Bacillus subtilis, la aamilasa pancreática porcina y una a-amilasa de cebada. Todas estas a-amilasas han dilucidado estructuras claramente diferentes de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl mostrada aquí.

[0061] Las a-amilasas fúngicas mencionadas arriba, es decir derivadas de A. niger y A. oryzae, son altamente homólogas en el nivel aminoácido y generalmente consideradas pertenecientes a la misma familia de a-amilasas. En la descripcion presente, esta familia se denomina "a-amilasa de tipo Fungamyl" y se destina a indicar una a-amilasa que muestra una alta homología, es decir de más del 70%, tal como una homología del 80% (según se define aquí) con la a-amilasa fúngica derivada de Aspergillus oryzae, comercialmente disponible como Fungamyl®, y la a-amilasa de A. niger.

[0062] A partir de las ilustraciones incluidas de la estructura de a-amilasa de una a-amilasa de tipo Termamyl y una comparación de dicha estructura con la estructura de una a-amilasa de tipo Fungamyl es evidente que existen diferencias más importantes entre las dos estructuras. En el método de la invención es de interés particular modificar partes de la aamilasa de tipo Termamyl parental que pertenecen a una región con grandes diferencias con respecto a la a-amilasa de tipo Fungamyl. En particular, es de interés modificar la a-amilasa de tipo Termamyl parental en uno o más de los siguientes bucles: bucle 1, bucle 2, bucle 3 y/o bucle 8 de la a-amilasa parental.

[0063] En el método del tercer aspecto de la invención es de interés particular modificar el bucle 1, el bucle 2, el bucle 3 y/o el bucle 8 de la a-amilasa parental de tipo distinto de Termamyl hasta conseguir mayor semejanza con respecto a los bucles similares de una a-amilasa de tipo Termamyl, tal como Termamyl.

[0064] En los siguientes tipos específicos de variantes se describen los que se han diseñado usando el método de la invención.

Modificaciones de bucle

[0065] Con el fin de cambiar la especificidad de sustrato de la a-amilasa parental a modificar es relevante considerar las modificaciones de bucle. Por ejemplo cambiando una o más de las estructuras de bucle de la a-amilasa de tipo Termamyl en una mayor semejanza con respecto a la(s) estructura(s) de bucle correspondiente(s) de una a-amilasa de tipo distinto de Termamyl (tal como una a-amilasa de tipo Fungamyl) se contempla la posibilidad de cambiar la especificidad de sustrato en la dirección de la de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl. A continuación se enumeran diferentes tipos de modificaciones de bucle de interés. Se entenderá que las variantes pueden tener otras propiedades cambiadas además de la especificidad de sustrato modificada. Se entenderá que las siguientes modificaciones identificadas para una a-amilasa de tipo Termamyl específica pretenden incluir modificaciones correspondientes en otras posiciones equivalentes de otras aamilasas de tipo Termamyl. Además, se entenderá que, normalmente, la modificación de bucle comprenderá la sustitución de una estructura de bucle entera o de una parte sustancial de la misma, p. ej., en la a-amilasa de tipo Termamyl, con la estructura de bucle correspondiente (o parte sustancial de la misma) en una a-amilasa de tipo distinto de Termamyl.

Modificaciones del bucle 2

[0066] En una forma de realización la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, en cuya variante al menos un residuo de aminoácido de la a-amilasa parental, el cual está presente en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácidos 44-57 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, es decir el bucle 2, se ha delecionado o sustituido por uno o más residuos de aminoácidos presentes en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácidos 66-84 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en el cual se han añadido uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0067] La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10 es la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa de A. oryzae, es decir una a-amilasa de tipo Fungamyl. Se entenderá que los residuos de aminoácidos o los fragmentos encontrados en las posiciones correspondientes en otras a-amilasas, en particular en a-amilasas de tipo Fungamyl, se pueden usar como molde para construir la variante según la invención. La parte correspondiente en otras a-amilasas homólogas se puede identificar fácilmente con base en una comparación de las secuencias de aminoácidos y/o estructuras tridimensionales de las a-amilasas respectivas.

[0068] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más estrechamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ésta ocupa la misma posición que la parte que se extiende entre el residuo X y el residuo Y de la SEC ID No: 4, teniendo dicha región al menos un 80% así como al menos un 90% de homología secuencial con la parte de la SEC ID No: 10 que se extiende desde el residuo Z al residuo V de la SEC ID No: 10, donde X es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 44, 45, 46, 47 o 48 de la SEC ID No: 4, Y es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 51, 52, 53, 54, 55, 56 o 57 de la SEC ID No: 4, Z es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 66, 67, 68, 69 o 70 de la SEC ID No: 10. y V es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 78, 79, 80, 81, 82, 83 o 84 de la SEC ID No: 10.

[0069] En otras palabras, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido un fragmento de aminoácidos X-Y de la a-amilasa parental, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 44-57 de la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 6684 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, teniendo en X, Y, Z y V el significado indicado arriba.

[0070] Un ejemplo específico de una variante según esta forma de realización es una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, en la cual el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, la cual corresponde a los residuos de aminoácidos 48-51 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 70-78 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

Modificaciones del bucle 3 - alteracion limitada

[0071] En otra forma de realización la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, en cuya variante se ha delecionado o sustituido al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el/los cual(es) está(n) presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 195-202 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de aminoácidos presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 165-177 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se han añadido uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0072] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido un fragmento de aminoácidos X-Y de la a-amilasa parental el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidoss 195-202 de la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidoss 165-177 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, donde X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 195 o 196 de la SEC ID No: 4, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 198, 199, 200, 201, o 202 de la SEC ID No: 4, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 165 o 166 de la SEC ID No: 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 173, 174, 175, 176 o 177 de la SEC ID No: 10.

[0073] Expresado de otra forma, la variante según este aspecto puede ser de tal manera, que, al alinear más estrechamente la secuencia de aminoácidos de la variante con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental de tipo Termamyl, ésta ocupa la misma posición que la parte que se extiende entre el residuo X y el residuo Y de la SEC ID No: 4, teniendo dicha región al menos un 80%, así como un 90% de homología secuencial con la parte de la SEC ID No: 10 que se extiende desde el residuo Z hasta el residuo V de la SEC ID No: 10, siendo el significado de X, Y, Z y V tal y cómo se identifica arriba.

[0074] Un ejemplo específico de una variante según esta forma de realización es una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, en la cual el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácidos 196-198 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 166-173 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

Modificaciones del bucle 3 - dominio B completo

[0075] En otra forma de realización la invención se refiere a una variante de, una a-amilasa parental de tipo Termamyl, en cuya variante se ha(n) delecionado o sustituido al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácidos 117-185 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 98-210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se han añadido uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0076] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido un fragmento de aminoácidos X-Y de la a-amilasa parental, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 117-185 de la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 98-210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119, 120 o 121 de la SEC ID No: 4, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 181, 182, 183, 184 o 185 de la SEC ID No: 4, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101, 102 de la SEC ID No: 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 206, 207, 208, 209 o 210 de la SEC ID No: 10.

[0077] Un ejemplo específico de una variante según esta forma de realización es una variante de una a-amilasa parental, en la cual un fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 121-181 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 102206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

[0078] En otra forma de realización la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, en cuya variante al menos se ha delecionado o sustituido uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácidos 117-181 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 98-206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se han añadido uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0079] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de aminoácidos X- Y de la a-amilasa parental, la cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 117-177 de la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 98-202 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119, 120 o 121 de la SEC ID No: 4, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 174, 175, 176 o 177 de la SEC ID No: 4,

Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101, 102 de la SEC ID No: 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 199, 200, 201 o 202 de la SEC ID No:

10.

[0080] Un ejemplo específico de una variante según esta forma de realización de la invención es una variante, en la cual el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 121-174 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 102-199 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

Modificaciones del bucle 1 - adición mínima

[0081] En otra forma de realización la presente invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, habiéndose delecionado o sustituido en la variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 12-19 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más de los residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos que corresponde al fragmento de aminoácidos 28-42 de la SEC ID No: 10, o en la cual se ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0082] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de aminoácidos X-Y de la a-amilasa parental, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 12-19 de la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 28-42 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 12, 13 o 14 de la SEC ID No: 4, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 15, 16, 17, 18 o 19 de la SEC ID No: 4, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 28, 29, 30, 31 o 32 de la SEC ID No: 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 38, 39, 40, 41 o 42 de la SEC ID No:

10.

[0083] Un ejemplo específico de una variante según este aspecto de la invención es una variante, en la cual se ha sustuido el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 14-15 de la SEC ID No: 4, por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 32-38 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

Modificaciones del bucle 1 - bucle completo

[0084] En otra forma de realización la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, habiéndose delecionado o sustituido en la variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual está presente en un fragmento correspondiente a los residuos de aminoácidos 7-23 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 4, por uno o más residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 13-45 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0085] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de aminoácidos X-Y de la a-amilasa parental, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 7-23 de la SEC ID No: 4, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 13-45 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 7 o 8 de la SEC ID No: 4, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 18, 19, 20, 21, 22 o 23 de la SEC ID No: 4, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 13 o 14 de la SEC ID No: 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 40, 41, 42, 43, 44 o 45 de la SEC ID No: 10.

[0086] En una variante específica según esta forma de realización el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 8-18 de la SEC ID No: 4, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 14-40 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

Modificaciones del bucle 8

[0087] En otra forma de realización la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, habiéndose delecionado o sustituido en la variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual está presente en un fragmento correspondiente a los residuos de aminoácidos 322-346 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 2, por uno o más residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 291 313 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, o en la cual se ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como molde.

[0088] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de aminoácidos X- Y de la a-amilasa parental, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 322-346 de la SEC ID No: 2, por un fragmento de aminoácidos Z-V, que corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 291-313 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10, en cuya variante X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 322, 323, 324 o 325 de la SEC ID No: 2, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 343, 344, 345 o 346 de la SEC ID No: 2, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 291, 292, 293 o 294 de la SEC ID No: 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 310, 311, 312 o 313 de la SEC ID No:

10.

[0089] En una variante específica según este aspecto de la invención, el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 325-345 de la SEC ID No: 2, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 294-313 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

2+

Dependencia de Ca

2+

[0090] Es altamente deseable tener la capacidad de reducir la dependencia de Ca de una a-amilasa de tipo Termamyl. Por consiguiente, en otro aspecto la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, que

2+

muestra actividad a-amilasa y que tiene una dependencia de Ca disminuida en comparación con la a-amilasa parental. La

2+

dependencia de Ca disminuida obtiene como resultado funcional que la variante muestra una actividad amilolítica satisfactoria en presencia de una concentración de iones calcio en el medio extraño inferior a la necesaria para la enzima parental y, por ejemplo, en consecuencia es menos sensible que la parental en condiciones de agotamiento de iones calcio tales como los obtenidos en medios que contienen agentes complejantes de calcio (tales como determinadas construcciones de detergente).

2+

[0091] La dependencia de Ca disminuida de la variante de la invención se puede conseguir ventajosamente aumentando

2+

la afinidad de unión de Ca de la a-amilasa parental de tipo Termamyl, en otras palabras cuanto más fuerte sea la unión de

2+2+

Ca de la enzima, menor será la dependencia de Ca .

[0092] Actualmente se cree que los residuos de aminoácidos localizados en 10Å de un ion sodio o calcio están implicados

2+

en o son importantes para la capacidad de unión de Ca de la enzima.

[0093] Por consiguiente, la variante según este aspecto de la invención es preferiblemente de tal manera, que se haya modificado en uno o más residuos de aminoácidos presentes en 10Å de un ion calcio y/o sodio identificado en la estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo Termamyl de tal manera que se aumente la afinidad de la a-amilasa con el calcio.

2+

[0094] Los residuos de aminoácidos encontrados dentro de una distancia de 10Å desde los sitios de unión de Ca de la aamilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos SEC ID No: 2 se determinaron según se describe en el Ejemplo 2 y son como sigue:

V102; I103; N104; H105; K106; R125; W155; W157; i158; H159; F160; D161; G162; T163; Y175; K176; F177;

G178; K180; A181; W182; D183; W184; E185; V186; S187; N192; Y193; D194; Y195; L196; M197; Y198; A199;

D200; I201; D202; Y203; D204; H205; P206; V208; A209; D231; A232; V233; K234; H235; I236; K237; F238; F240;

L241; A294; A295; S296; T297; Q298; G299; G300; G301; Y302; D303; M304; R305; K306; L307; W342; F343; L346; Q393; Y394; Y396; H405; H406; D407; I408; V409; R413; E414; G415; D416; S417; V419; A420; N421; S422; G423; L424; I428; T429; D430; G431; P432; V440; G441; R442; Q443; N444; A445; G446; E447; T448; W449; I462; G475; Y480; V481; Q482; R483.

[0095] Con el fin de construir una variante según este aspecto de la invención es deseable reemplazar al menos uno de los residuos de aminoácidos anteriormente mencionados (o un residuo de aminoácido que ocupe una posición equivalente en otra a-amilasa de tipo Termamyl a la definida por la SEC ID No: 2), la cual se considere que esté implicada en el suministro

2+

de una unión de calcio no óptima, con cualquier otro residuo de aminoácido que mejore la afinidad de unión de Ca de la enzima variante. En la práctica, la identificación y modificación posterior del residuo de aminoácido se realiza mediante el siguiente método:

i) identificar un residuo de aminoácido en 10Å partiendo de un sitio de unión de Ca2- de una estructura de a-amilasa de tipo Termamyl, la cual a partir de consideraciones estructurales o funcionales se estima responsable de una interacción de ion calcio no óptima, ii) construir una variante en la cual dicho residuo de aminoácido se sustituya por otro residuo de aminoácido el cual partiendo de consideraciones estructurales o funcionales se estima importante para establecer una mayor afinidad

2+ 2+

de unión de Ca , y probar la dependencia de Ca de la variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante.

[0096] En el contexto presente, el término "interacción de ión calcio no óptima" se destina a indicar que el residuo de aminoácido en cuestión se selecciona con base en una presunción de que el hecho de sustituir dicho residuo de aminoácido por otro puede mejorar una interacción de unión de ion calcio de la enzima. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en cuestión se puede seleccionar con base en una o varias de las siguientes consideraciones:

-: obtener una interacción mejorada entre un ion calcio y un residuo de aminoácido localizado cerca de la superficie de la enzima (según se ha identificado a partir de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl). Por ejemplo, si el residuo de aminoácido en cuestión se expone a un solvente circundante, puede ser ventajoso aumentar la protección de dicho residuo de aminoácido con respecto al solvente para proveer una interacción más fuerte entre dicho residuo de aminoácido y un ion calcio. Esta sustitución se puede conseguir reemplazando dicho residuo (o un residuo de aminoácido situado cerca de dicho residuo que contribuye a la protección) por un residuo de aminoácido más voluminoso o de otro modo resultaría en un efecto de protección mejorado.

-: estabilizar un sitio de unión de calcio, por ejemplo estabilizando la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl (p. ej. estabilizando los contactos entre los dominios A, B y C o estabilizando uno o varios de los dominios como tales). Esto, p. ej., se puede conseguir proporcionando una mejor coordinación a las cadenas laterales del aminoácido, las cuales pueden, p. ej., obtenerse mediante la sustitución de un residuo N por un residuo D y/o un residuo Q por un residuo E (p. ej. N104D), p. ej. dentro de 10Å, y preferiblemente dentro de 3 o 4Å, de un sitio de unión de calcio.

-: proteger el sitio de unión de calcio o mejorar la coordinación entre el ión calcio y el sitio de unión de calcio, p. ej. proporcionando una interacción más fuerte entre el ión y el sitio de unión.

[0097] Antes de construir realmente una variante de a-amilasa de tipo Termamyl según los principios de arriba puede ser conveniente evaluar la modificación del aminoácido en cuestión por su acomodación dentro de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl, p. ej. en una estructura modelo de la a-amilasa parental de tipo Termamyl.

[0098] Preferiblemente, el residuo de aminoácido a modificar está localizado dentro de 8Å de un residuo de sitio de unión de

2+

Ca , así como dentro de 5Å de tal residuo. Los residuos de aminoácidos dentro de 8Å y 5Å, respectivamente, se pueden identificar fácilmente mediante un método análogo usado para identificar residuos de aminoácidos dentro de 10Å (cf. Ejemplo 2).

2+

[0099] La mutación siguiente se estima de particular interés con respecto a disminuir la dependencia de Ca de una a

amilasa de tipo Termamyl: N104D (de la SEC ID NO 2 de a-amilasa de B. licheniformis, o una mutación equivalente (N a D) de una posición equivalente en otra a-amilasa de tipo Termamyl.)

2+

[0100] En relación a las sustituciones de relevancia para la dependencia de Ca , algunas otras sustituciones parecen ser importantes a la hora de estabilizar la conformación de la enzima (por ejemplo las interacciones de los Dominios A-B y/o los Dominios A-C contribuyen a la estabilidad global de la enzima) en tanto en cuanto éstas pueden, p. ej., aumentar la resistencia de unión o retención del ión calcio o el ion sodio en o dentro de un sitio de unión de calcio o sodio, respectivamente, dentro de la a-amilasa parental de tipo Termamyl.

[0101] Es deseable estabilizar el dominio C con el fin de aumentar la estabilidad y/o termoestabilidad de calcio de la enzima. A este respecto la estabilización puede resultar en una estabilización de la unión de calcio de la enzima, y un contacto mejorado entre el dominio C y el dominio A (importante para la termoestabilidad). Esto se puede conseguir introduciendo puentes de cisteína, puentes de sal o un aumento de interacciones de hidrógeno, hidrofóbicas y/o electroestáticas.

[0102] Por ejemplo, el dominio C de la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2 se puede estabilizar introduciendo un puente de cisteína entre el dominio A y el dominio C, p. ej. introduciendo las siguientes mutaciones: A349C+I479C y/o L346C+I430C.

[0103] Un puente de sal se puede obtener introduciendo las siguientes mutaciones:

N457D, E

N457D, E+K385R

F350D, E+I430R,K

F350D,E+I411R,K

[0104] El sitio de calcio del Dominio C se puede estabilizar sustituyendo los residuos de aminoácidos H408 y/o G303 por cualquier otro residuo de aminoácido. Son de particular interés las mutaciones siguientes: H408Q, E, N, D y/o G303N,D,Q,E las cuales pretenden proporcionar una mejor unión de calcio o protección de depleción de calcio.

[0105] Se pueden introducir mutaciones similares en posiciones equivalentes de otras a-amilasas de tipo Termamyl.

[0106] Otras mutaciones de sustitución (en relación a la a-amilasa de B. licheniformis, SEC ID n°. 2) que parecen ser importantes, entre otras cosas, en el contexto de reducir la dependencia de calcio, incluyen las siguientes: R23K, H156Y, A181T, A209V y G310D (o mutaciones equivalentes en posiciones equivalentes en otra a-amilasa de tipo Termamyl). Las sustituciones de R214 y P345 por otros aminoácidos también pueden ser importantes a este respecto.

Variantes con actividad alterada a pH mayor/inferior

[0107] Se estima posible cambiar el pH óptimo de una a-amilasa de tipo Termamyl o la actividad enzimática a un pH dado cambiando la pKa de los residuos de sitio activo. Esto se puede conseguir, p. ej. cambiando la interacción electroestática o la interacción hidrofóbica entre los grupos funcionales de las cadenas laterales del aminoácido del residuo de aminoácido a modificar y de sus alrededores cercanos. Esto se puede realizar, p. ej., mediante el siguiente método:

i) identificar un residuo de aminoácido en 15Å desde un residuo de sitio activo, en particular en 10Å desde un

residuo de sitio activo, en una estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl en cuestión, cuyo residuo se estima que

está implicado en interacciones electroestáticas o hidrofóbicas con un residuo de sitio activo,

ii) sustituir, en la estructura, dicho residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que cambie el entorno

electroestático y/o hidrofóbico de un residuo de sitio activo y evaluar la acomodación del residuo de aminoácido en

la estructura,

iii) opcionalmente repetir la fase i) y/o ii) hasta que se haya identificado una sustitución de aminoácido alojada en la

estructura,

iv) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante de las fases i), ii) y opcionalmente iii) y analizar

la actividad enzimática dependiente del pH de interés de dicha variante.

[0108] En el método de arriba puede tener particular relevancia añadir un residuo cargado positivamente dentro de 5Å de un glutamato (reduciendo de ese modo la pKa del glutamato desde aproximadamente 4.5 a 4), o añadir un residuo cargado negativamente dentro de 5 Å de un glutamato (aumentando de ese modo la pKa hasta aproximadamente 5), o hacer modificaciones similares dentro de una distancia de aproximadamente 5Å de una Histidina.

[0109] En otro aspecto la invención se refiere a una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que muestra una actividad mayor a un pH inferior (p. ej. en comparación con el pH óptimo) que la a-amilasa parental. En particular, la variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido correspondiente a al menos una de las siguientes posiciones de la aamilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2):

E336; Q333; P331; I236; V102; A232; I103; L196

[0110] Las siguientes mutaciones son de particular interés:

E336R,K

Q333R,K

P31R,K

V102R,K,A,T,S,G;

I236K,R,N;

I103K,R;

L196K,R; A232T,S,G;

o cualquier combinación de dos o más de estas variantes o cualquier combinación de una o más de estas variantes con cualquiera de las otras variantes descritas aquí.

[0111] En otro aspecto ulterior la invención se refiere a una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que tiene una actividad mayor a un pH mayor que la a-amilasa parental. En particular, la variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido correspondiente a al menos una de las siguientes posiciones de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2):

N236; H281; Y273

[0112] En particular, la variante comprende una mutación correspondiente a al menos una de las siguientes mutaciones de

la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2):

N326I,Y,F,L,V

H281F,I,L

Y273F,W

[0113] Una mutación que parece ser importante en relación con la actividad específica de las variantes de la invención es una mutación correspondiente a la sustitución S187D en la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2).

Variantes con termoestabilidad aumentada y/o temperatura alterada óptima

[0114] En otro aspecto deseado la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, siendo la variante el resultado de uno o más residuos de aminoácidos que han sido delecionados de, sustituidos o añadidos a la aamilasa parental con el fin de obtener una termoestabilidad aumentada de la variante.

[0115] La estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl contiene varios agujeros internos únicos, los cuales pueden contener agua, y varias grietas. Para aumentar la termoestabilidad de la a-amilasa puede ser deseable reducir el número de agujeros y grietas (o reducir el tamaño de los agujeros o grietas), p. ej. introduciendo uno o más contactos hidrofóbicos, preferiblemente conseguidos a base de introducir residuos más voluminosos, en la proximidad o entorno del agujero. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que se van a modificar son aquellos implicados en la formación del agujero.

[0116] Por consiguiente, en otro aspecto la presente invención se refiere a un método para aumentar la termoestabilidad y/o alterar la temperatura óptima de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, comprendiendo el método i) identificar un agujero interno o una grieta de la a-amilasa parental de tipo Termamyl en la estructura tridimensional de dicha a-amilasa, ii) sustituir, en la estructura, uno o más residuos de aminoácidos alrededor del agujero o grieta identificados en i) por otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones estructurales o funcionales se cree que aumenta la interacción hidrofóbica y ensancha o reduce el tamaño del agujero o grieta, iii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante de la fase ii) y analizar la termoestabilidad y/o temperatura óptima de la variante.

[0117] La estructura usada para identificar el agujero o grieta de la a-amilasa parental de tipo Termamyl puede ser la estructura identificada en el Apéndice 1 o una estructura modelo de la a-amilasa parental de tipo Termamyl construida sobre la misma.

[0118] Se entenderá que el agujero o grieta se identifica por los residuos de aminoácidos circundantes al agujero/grieta, y esta modificación de dichos residuos de aminoácidos son importantes para rellenar o reducir el tamaño del agujero/grieta. Los residuos de aminoácidos a los que se hace particular referencia abajo son aquellos que en estructura cristalina se ha observado que flanquean el agujero/grieta en cuestión.

[0119] Con el fin de llenar (completa o parcialmente) un agujero fundamental localizado entre los dominios A y B, la mutación de cualquier otro residuo de aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más de los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:

L61; Y62; F67; K106; G145; I212; S151; R214; Y150; F143; R146

[0120] Es de particular interés una mutación a un residuo de aminoácido más voluminoso que el residuo de aminoácido de la enzima parental.

[0121] Es de particular interés una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que comprende una mutación

correspondiente a las mutaciones siguientes (usando la numeración de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2):

L61W,V,F;

Y62W;

F67W;

K106R,F,W;

G145F,W

I212F,L,W,Y,R,K;

S151 sustituido por cualquier otro residuo de aminoácido y en particular por F,W,I o L;

R214W;

Y150R,K;

F143W; y/o

R146W.

[0122] Con el fin de llenar un agujero en la proximidad de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más de los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID NO 2) se contempla:

L241; I236.

[0123] Es de interés una mutación a un residuo de aminoácido más voluminoso.

[0124] Es de particular interés una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que comprende una mutación

correspondiente a una o más de las siguientes mutaciones en la a-amilasa de B. licheniformis:

L241I,F,Y,W; y/o

I236L,F,W,Y

[0125] Con el fin de llenar un agujero en la proximidad de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más de los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:

L7; V259; F284

[0126] Es de interés una mutación a un residuo de aminoácido más voluminoso.

[0127] Es de particular interés una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que comprende una mutación

L7F,I,W

V259F,I,L

F284W

[0128] Con el fin de llenar un agujero en la proximidad de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más de los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:

F350; F343

[0129] Es de interés una mutación a un residuo de aminoácido más voluminoso.

[0130] Es de particular interés una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que comprende una mutación

F350W

F343W

[0131] Con el fin de llenar un agujero en la proximidad de la mutación de sitio activo a cualquier otro residuo de aminoácido de un residuo de aminoácido correspondiente a uno o más de los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2) se contempla:

L427; V481

[0132] Es de interés una mutación a un residuo de aminoácido más voluminoso.

[0133] Es de particular interés una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que comprende una mutación correspondiente a una o más de las siguientes mutaciones en la a-amilasa de B. licheniformis:

L427F,L,W V481,F,I,L,W

Variantes con un modelo de corte alterado

[0134] En el proceso de licuefacción de almidón es deseable usar una a-amilasa capaz de degradar las moléculas de almidón en oligosacáridos de ramificaciones largas (como, p. ej. las a-amilasas de tipo Fungamyl) mejor que los oligosacáridos de ramificaciones más cortas (como las a-amilasas de tipo Termamyl convencionales). Los oligosacáridos resultantes de ramificaciones muy cortas (precursores de panosa) no se pueden hidrolizar adecuadamente mediante pululanasas, las cuales se usan después de las a-amilasas y antes de las amiloglucosidasas en el proceso de licuefacción. De esta manera, en presencia de precursores de panosa la acción de la amilo-glucoamilasa termina con un grado alto de la dextrina limitante de ramificaciones pequeñas, el trisacárido panosa. La presencia de panosa disminuye significativamente el rendimiento de sacarificación y por ello es indeseable.

[0135] De esta manera, un objetivo de la presente invención es cambiar las características de degradación de una a-amilasa de tipo Termamyl por las de una a-amilasa de tipo Fungamyl sin reducir al mismo tiempo la termoestabilidad de la a-amilasa de tipo Termamyl.

[0136] Por consiguiente, en otro aspecto la invención se refiere a una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que tiene una capacidad reducida para segmentar un sustrato cercano al punto de ramificación.

[0137] La variante se puede construir de manera adecuada mediante un método que comprende i) identificar el área de unión de sustrato de la a-amilasa parental de tipo Termamyl en un modelo de la estructura tridimensional de dicha a-amilasa, (p. ej. dentro de una esfera de 4Å desde el sitio de unión de sustrato (como se define en la sección de arriba titulada "Sitio de unión de sustrato"), ii) sustituir, en el modelo, uno o más residuos de aminoácidos del área de unión de sustrato de la grieta identificada en i), que se tiene(n) por responsable(s) del modelo de corte de la a-amilasa parental, por otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones estructurales se cree que resulta en un modelo de corte de sustrato alterado, o borrar uno o más residuos de aminoácidos del área de unión de sustrato que se considera que introduce(n) interacciónes favorables para el sustrato o añadir uno o más residuos de aminoácidos en el área de unión de sustrato que se considera que introduce(n) interacciónes favorables para el sustrato, y iii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante de la fase ii) y analizar el modelo de corte de sustrato de la variante.

[0138] Es de particular interés una variante que segmente un sustrato de amilopectina, a partir del extremo reductor, más de una unidad de glucosa del punto de ramificación, preferiblemente más de dos o tres unidades de glucosa del punto de ramificación, es decir a una distancia mayor desde el punto de ramificación que la obtenida usando una a-amilasa de B. licheniformis de tipo salvaje.

[0139] Residuos de particular interés en relación con este aspecto de la invención corresponden a los siguientes residuos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2): V54; D53; Y56; Q333; G57, y las variantes según este aspecto comprenden preferiblemente una mutación en uno o más de estos residuos.

[0140] En particular, la variante comprende al menos una de las siguientes mutaciones, que se espera prevenga(n) el corte

próximo al punto de ramificación:

V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q

D53L,I,F,Y,W

Y56W

Q333W

G57 todos los residuos de aminoácidos posibles

A52 residuos de aminoácidos más grandes que A, p. ej. A52W,Y,L,F,I.

Variantes de una a-amilasa fúngica

[0141] En otra forma de realización más la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Fungamyl, habiéndose delecionado o sustituido en la variante al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 291-313 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 10, por uno o más de los residuos de aminoácidos, el/los cual(es) está(n) presente(s) en un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 98-210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4, o donde se ha(n) insertado uno o más residuos de aminoácidos adicionales usando la parte pertinente de la SEC ID No: 4 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Termamyl como molde.

[0142] Por ejemplo, la variante puede ser de tal manera, que en la misma se haya sustituido el fragmento de aminoácidos X-Y de la a-amilasa parental, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 117-185 de la SEC ID No: 10, por un fragmento de aminoácidos Z-V, el cual corresponde a o está dentro del fragmento de aminoácidos 98-210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4, en cuya variante X es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119, 120 o 121 de la SEC ID No: 10, Y es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 181, 182, 183, 184 o 185 de la SEC ID No: 10, Z es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101 o 102 de la SEC ID No: 4, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 206, 207, 208, 209 o 210 de la SEC ID No: 4.

[0143] Un ejemplo específico de una variante según este aspecto de la invención es uno, en el que el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 121-181 de la SEC ID No: 10, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 102-206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4.

[0144] Otro ejemplo de una variante según este aspecto de la invención es uno, en el que el fragmento de aminoácidos de la a-amilasa parental, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos 121-174 de la SEC ID No: 10, se ha sustituido por el fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 102-199 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 4.

[0145] En otra forma de realización la invención se refiere a una variante de una a-amilasa parental de tipo Fungamyl, en la cual se ha delecionado un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 181-184 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 10.

Mutaciones generales en variantes de la invención

[0146] Se puede preferir que la variante de la invención o preparada conforme al método de la invención comprenda una o más modificaciones además de las resumidas arriba. De esta manera, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina presentes en la parte de la variante de a-amilasa que se ha modificado se sustituya(n) por un residuo distinto de prolina, el cual puede ser cualquiera de los residuos distintos de prolina de origen natural posibles, y el cual es preferiblemente una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina.

[0147] Análogamente, puede ser preferible sustituir ése o más residuos de cisteína presentes en los residuos de aminoácidos, con los cuales se modifica la a-amilasa parental, por unos residuos distintos de cisteína tales como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina.

[0148] Además, la variante de la invención se puede modificar bien como única modificación o en combinación con cualquiera de las modificaciones descritas arriba de modo que se sustituya uno o más Asp y/o Glu presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 185-209 de la SEC ID No: 8 por un Asn y/o Gln, respectivamente. También es de interés la modificación de uno o más de los residuos de Lys presentes en la a-amilasa de tipo Termamyl sustituido(s) por un Arg presente en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 185-209 de la SEC ID No: 8 sustituido por un Asn y/o un Gln, respectivamente.

[0149] Se entenderá que, conforme a la presente invención, se pueden preparar variantes que lleven dos o más de las modificaciones descritas arriba. Por ejemplo, se pueden preparar variantes que comprendan una modificación en la región del bucle 1 y el bucle 2, una modificación en el bucle 2 y el bucle 3 limitado, una modificación en el bucle 1, el bucle 2, el bucle 3 y el bucle 8, etc.

[0150] Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas aquí.

Métodos para preparar variantes de a-amilasa [0151] Se conocen en la técnica diferentes métodos para introducir mutaciones en genes. Después de una breve discusión sobre el cierre de secuencias de ADN que codifican a-amilasas, se discutirán los métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica la a-amilasa.

Clonación de una secuencia de ADN que codifica una a-amilasa

[0152] La secuencia de ADN que codifica una a-amilasa parental se puede aislar a partir de cualquier célula o microorganismo que produzca la a-amilasa en cuestión, usando diferentes métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debería construir un ADN genómico y/o biblioteca de ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la a-amilasa objeto de estudio. Después, si se conoce la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa, se pueden sintetizar sondas oligonucleótidas homólogas y marcadas y usarlas para identificar clones que codifiquen aamilasas a partir de una biblioteca genómica obtenida a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a un gen de a-amilasa conocido se podría usar como sonda para identificar clones que codifiquen a-amilasas, usando unas condiciones de hibridación y de lavado de menor astringencia.

[0153] Otro método más para identificar clones que codifiquen la a-amilasa incluiría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transfomar bacterias de a-amilasa negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y después fijar las bacterias transformadas sobre agar que contenga un sustrato para la a-amilasa, de ese modo permitiendo a los clones expresar la a-amilasa que se va a identificar.

[0154] De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, se sintetizan oligonucleótidos, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, se purifican, anillan, ligan y clonan en vectores apropiados.

[0155] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, mezclado sintético y de ADN o mezclado genómico y de ADNc, preparado mediante la ligadura de fragmentos de origen sintético genómico o de ADN (según convenga, los fragmentos correspondientes a diferentes partes de la secuencia completa de ADN), conforme a técnicas estándar. La secuencia de ADN también se puede preparar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo según se describe en US 4.683.202 o en R.K. Saiki et al. (1988).

Mutagénesis dirigida

[0156] Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN que codifica a-amilasas, y se han identificado sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; se insertan nucleótidos mutantes durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, se crea un fragmento monocatenario de ADN, el cual conecta la secuencia que codifica la a-amilasa, en un vector que soporta el gen de la a-amilasa. Después se anilla el nucleótido sintético, el cual soporta la mutación deseada, a una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante se llena después con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y la construcción se liga usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método está descrito en Morinaga et al. (1984). US 4.760.025 expone la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples realizando alteraciones menores del casete. No obstante, se puede introducir una variedad incluso mayor de mutaciones en cualquier momento mediante el método de Morinaga, ya que se puede introducir una multitud de oligonucleótidos, de diferentes longitudes.

[0157] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican a-amilasas está descrito en Nelson y Long (1989). Esto implica la generación en 3 fases de un fragmento de PCR que contenga la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR. A partir del fragmento generado mediante PCR, se puede aislar un fragmento de ADN que soporte la mutación mediante corte con endonucleasas de restricción y reinsertarlo en un plásmido de expresión.

Mutagénesis aleatoria

[0158] La mutagénesis aleatoria se realiza de manera adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica de una región en al menos tres partes del gen que traduce a la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.

[0159] Para la mutagénesis aleatoria específica de una región con el propósito de mejorar la termoestabilidad de una aamilasa parental de tipo Termamyl, se pueden seleccionar apropiadamente las posiciones de codón correspondientes a los siguientes residuos de aminoácidos de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No: 2):

Para mejorar la estabilidad del sitio de calcio entre el Dominio A y C

I428-A435 T297-L308 F403-V409

Para mejorar la estabilidad entre el dominio A y B:

D180-D204 H156-T163 A232-F238

[0160] Con el propósito de conseguir una unión mejorada de un sustrato (es decir, una unión mejorada de una especie de carbohidrato, tal como la amilosa o la amilopectina) en una variante de a-amilasa de tipo Termamyl, una especificidad de sustrato modificada (p. ej. mayor) y/o una especificidad modificada (p. ej. mayor) con respecto al corte (hidrólisis) del sustrato, parece que las siguientes posiciones de codón para la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2 en particular (o posiciones de codón equivalentes para otra a-amilasa parental de tipo Termamyl en el contexto de la invención) se pueden seleccionar apropiadamente:

13-18 50-56 70-76 102-109 163-172 189-199 229-235 360-264 327-335

[0161] La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una a-amilasa parental que se va a realizar conforme a la fase a) del método de la invención descrito anteriormente se puede realizar convenientemente usando cualquier método conocido en la técnica.

[0162] Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria se puede realizar usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria se puede realizar usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.

[0163] El agente mutagenizante puede ser, p. ej., de tal manera que induce transiciones, transversiones, inversiones, aleatorización, deleciones, y/o inserciones.

[0164] Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el propósito presente incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se realiza normalmente incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima parental que se va a mutagenizar en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para la mutagénesis que va a tener lugar, y seleccionando el ADN mutado que tenga las propiedades deseadas.

[0165] Cuando la mutagénesis se realiza usando un oligonucleótido, el oligonucleótido puede estar dopado o adicionado con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que se van a cambiar. El dopaje o adicionado se puede hacer de tal manera que se eviten codones para aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado se puede incorporar en el ADN que codifica la enzima amilolítica mediante cualquier técnica publicada, usando

p. ej. PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa.

[0166] Cuando se usa una mutagénesis generada por PCR, se somete a PCR a un gen tanto químicamente tratado como no tratado que codifica una enzima de a-amilasa parental bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, págs. 11-15).

[0167] Para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la enzima amilolítica se puede usar una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs. 179-191), de S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano p. ej. transformando un plásmido que contenga la enzima parental en la cepa mutágena, madurando la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado se puede transformar posteriormente en el organismo de expresión.

[0168] La secuencia de ADN que se va a mutagenizar puede estar presente convenientemente en una biblioteca genómica

o de ADNc obtenida a partir de un organismo que expresa la enzima parental amilolítica. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, el cual como tal se puede incubar con o de otro modo exponer al agente mutagenizante. El ADN que se va a mutagenizar también puede estar presente en una célula huésped o bien integrándose en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector albergado por la célula. Finalmente, el ADN que se va a mutagenizar puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que se va a someter a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.

[0169] En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de expresión (b) o la fase de selección (c). Tal amplificación se puede realizar conforme a métodos conocidos en la técnica, siendo el método actualmente preferido la amplificación generada por PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados a partir del ADN o de la secuencia de aminoácidos de la enzima parental.

[0170] Después de la incubación con o la exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa cultivando una célula huésped adecuada que lleve la secuencia de ADN bajo condiciones que permitan tener lugar a la expresión. La célula huésped usada para este propósito puede ser de tal manera que se haya transformado con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o de tal manera que haya llevado la secuencia de ADN que codifica la enzima parental durante el tratamiento de la mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas son los siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram negativas tales como E.coli.

[0171] La secuencia de ADN mutada puede comprender además una secuencia de ADN que codifique funciones que permitan la expresión de la secuencia de ADN mutada.

[0172] Mutagénesis aleatoria localizada: la mutagénesis aleatoria se puede localizar ventajosamente en una parte de la aamilasa parental en cuestión. Esto puede ser, p. ej., ventajoso cuando determinadas regiones de la enzima se han identificado como particularmente importantes para una propiedad dada de la enzima, y cuando al modificarse se prevea como resultado una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones se pueden identificar normalmente cuando la estructura terciaria de la enzima parental se ha dilucidado y relacionado con la función de la enzima.

[0173] La mutagénesis localizada aleatoria se realiza convenientemente usando técnicas de mutagénesis generadas por PCR como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica.

[0174] De forma alternativa, se puede aislar la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que se va a modificar, p. ej. insertándose en un vector adecuado, y dicha parte se puede someter posteriormente a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis tratados anteriormente.

[0175] Con respecto a la fase de selección en el método de la invención mencionado anteriormente, ésta se puede realizar convenientemente mediante un ensayo de filtro basado en el siguiente principio:

[0176] Se incuba un microorganismo capaz de expresar la enzima mutada amilolítica de interés en un medio adecuado y bajo condiciones adecuadas para la enzima que se va a segregar, estando el medio provisto de un filtro doble que comprende un primer filtro de enlace proteínico y en lo alto de éste un segundo filtro que muestra una capacidad baja de unión de proteínas. El microorganismo está localizado en el segundo filtro. Después de la incubación, se separa el primer filtro, el cual comprende enzimas segregadas a partir de los microorganismos, del segundo filtro, el cual comprende los microorganismos. El primer filtro se somete a la selección de la actividad enzimática deseada y se identifican las correspondientes colonias microbianas presentes en el segundo filtro.

[0177] El filtro usado para unir la actividad enzimática puede ser cualquier filtro de unión de proteínas p. ej. de nilón o nitrocelulosa. El filtro que está en lo alto y que transporta las colonias del organismo de expresión puede ser cualquier filtro que tenga poca o ninguna afinidad con las proteínas de unión p. ej. el acetato de celulosa o el Durapore™. El filtro se puede pretratar con cualquiera de las condiciones que se van a usar para la selección o se puede tratar durante la detección de actividad enzimática.

[0178] La actividad enzimática se puede detectar mediante un colorante, una fluorescencia, una precipitación, un indicador de pH, una absorbencia de IR o cualquier otra técnica conocida para detectar actividad enzimática. El compuesto detector se puede inmovilizar mediante cualquier agente inmovilizador p. ej. agarosa, agar, gelatina, poliacrilamida, almidón, papel de filtro, tela; o cualquier combinación de agentes inmovilizadores.

[0179] La actividad a-amilasa se detecta mediante amilopectina marcada como Cibacron Red, la cual se inmoviliza en agarosa. Para seleccionar variantes con estabilidad aumentada térmica y con pH alto, se incuba el filtro con variantes de aamilasa enlazadas en un tampón a pH 10.5 y 60° o 65°C durante un tiempo específico, se lava brevemente en agua desionizada y se coloca en la matriz de agarosa de amilopectina para la detección de actividad. Se observa actividad residual en forma de lisis de Cibacron Red mediante la degradación de amilopectina. Las condiciones se han elegido de tal manera que apenas se puede detectar la actividad debido a la a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No:1. Las variantes estabilizadas muestran, bajo las mismas condiciones, una intensidad del color aumentada debido a un incremento de la liberación de Cibacron Red.

[0180] Para seleccionar variantes con una actividad óptima a una temperatura inferior y/o sobre un rango de temperaturas más amplio, el filtro con variantes enlazadas se coloca directamente en la placa de sustrato de Cibacron Red de amilopectina y se incuba a la temperatura deseada (p. ej. 4°C, - 10°C o 30°C) durante un tiempo específico. Después de esta actividad temporal apenas se pueden detectar debido a la a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 1, mientras que las variantes con actividad óptima a menor temperatura mostrarán un incremento de lisis de amilopectina. Antes de la incubación sobre la matriz de amilopectina, se puede llevar a cabo una incubación en toda

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clase de medios deseados, p. ej. en soluciones que contengan Ca , detergentes, EDTA u otros aditivos pertinentes, con el fin de seleccionar la dependencia modificada o la reacción de las variantes en cuestión con tales aditivos.

Evaluación de las variantes de la invención

[0181] La evaluación de las variantes de la invención se puede realizar de manera adecuada determinando la actividad de degradación de almidón de la variante, por ejemplo, madurando células huéspedes transformadas con una secuencia de ADN que codifica una variante en una placa de agarosa que contiene almidón e identificando células huéspedes degradantes de almidón. También se pueden realizar ensayos sobre propiedades alteradas (incluyendo actividad específica, especificidad de sustrato, modelo de corte, termoactivación, pH óptimo, dependencia de pH, temperatura óptima, y cualquier otro parámetro) conforme a métodos conocidos en la técnica.

Expresión de las variantes de a-amilasa

[0182] Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida mediante los métodos anteriormente descritos, o mediante cualquier método alternativo conocido en la técnica, se puede expresar, en forma de enzima, usando un vector de expresión que incluya normalmente secuencias de control que codifiquen un promotor, operador, sitio de unión de ribosomas, señal de inicio de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0183] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la cual se va a introducir éste. De este modo, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser de tal manera que, al introducirse en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el/los cromosoma(s) en los cuales se ha integrado.

[0184] En el vector, la secuencia de ADN debería estar conectada operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y que pueda derivarse de genes que codifican proteínas ya sean homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E.coli, los promotores del gen de agarasa dagA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de a-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM)de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la a-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, son ejemplos de promotores útiles aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra de A. niger, la a-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosafosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans.

[0185] El vector de expresión de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de aamilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse de manera adecuada de las mismas fuentes que el promotor.

[0186] El vector también puede comprender una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Son ejemplos de secuencias de este tipo los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1 y pIJ702.

[0187] El vector también puede comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera resistencia antibiótica así como a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador originando resistencia a la higromicina, o la selección se puede realizar mediante cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91/17243.

[0188] Aunque la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej. al usar ciertas bacterias como células huéspedes, se prefiere generalmente que la expresión sea extracelular. En general, las a-amilasas de Bacillus mencionadas aquí comprenden una preregión que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta preregión puede sustituirse por una preregión diferente o secuencia señal, llevada a cabo convenientemente mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican las respectivas preregiones.

[0189] Los procedimientos usados para enlazar la construcción de ADN de la invención que codifica una variante de aamilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al. (1989)).

[0190] La célula de la invención, bien comprendiendo una construcción de ADN o bien un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, se usa ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una variante de a-amilasa de la invención. La célula se puede transformar con la construcción de ADN de la invención que codifica la variante, integrando convenientemente la construcción de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se considera generalmente como una ventaja en tanto en cuanto la secuencia de ADN es más probable que se mantenga estable en la célula. La integración de las construcciones de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos convencionales, p. ej. mediante recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se describe anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.

[0191] La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero preferiblemente es una célula microbiana, p. ej. una célula bacteriana o fúngica (incluyendo la levadura).

[0192] Son ejemplos de bacterias adecuadas bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E.coli. La transformación de las bacterias se puede efectuar, por ejemplo, transformando el protoplasto o usando células competentes de una manera conocida per se.

[0193] El organismo de levadura se puede seleccionar favorablemente de unas especies de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede pertenecer ventajosamente a una especie de Aspergillus, p. ej. Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células micóticas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Un procedimiento adecuado para transformar células huéspedes de Aspergillus está descrito en EP 238 023.

[0194] En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de a-amilasa de la invención, comprendiendo el método el cultivo de una célula huésped como se describe anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la variante y la recuperación de la variante a partir de las células y/o el medio de cultivo.

[0195] El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para madurar la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de a-amilasa de la invención. Medios adecuados se encuentran disponibles a través de proveedores comerciales o se pueden preparar según recetas publicadas (p. ej. como se describe en catálogos de la American Type Culture Collection).

[0196] La variante de a-amilasa segregada a partir de las células huéspedes se puede recuperar convenientemente a partir del medio de cultivo mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio mediante centrifugado o filtración, y la precipitación de componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguida por el uso de procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, o similares.

Aplicaciones industriales

[0197] Las variantes de a-amilasa de esta invención poseen propiedades valiosas teniendo en cuenta diferentes aplicaciones industriales. En particular las variantes enzimáticas encuentran aplicaciones potenciales como componentes para composiciones para el lavado de la ropa, para el lavado de la vajilla y para detergentes de limpieza de superficie duras, pero también pueden ser útiles en la producción de edulcorantes y etanol a partir de almidón y para el desencolado textil. Las condiciones para los procesos de conversión de almidón convencionales y/o los procesos de sacarificación y licuefacción se describen por ejemplo en la patente estadounidense No: 3.912.590 y las publicaciones de patentes EP Nos.

252.730 y 63.909.

[0198] Producción de edulcorantes a partir de almidón: un proceso "tradicional" para la conversión de almidón en jarabes de fructosa consiste normalmente en tres procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón se degrada a dextrinas mediante una a-amilasa (p. ej. Termamyl™) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a temperaturas de 95-160°C durante un periodo de aprox. 2h. Con el fin de asegurar una estabilidad óptima de la enzima bajo estas condiciones, se añade 1mM de calcio (40 ppm de iones libres de calcio).

[0199] Después del proceso de licuefacción las dextrinas se convierten en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa

(p. ej. AMG™) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej. Promozyme™). Antes de esta fase se reduce el pH a un valor por debajo de 4.5, manteniendo la temperatura alta (por encima de 95°C), y se desnaturaliza la actividad a-amilasa licuefactante. La temperatura se baja a 60°C, y se añaden la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación procede durante 24-72 horas.

[0200] Después del proceso de sacarificación el pH se aumenta a un valor en el rango de 6-8, preferiblemente a pH 7.5, y el calcio se retira mediante un intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte después en jarabe rico en fructosa usando, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme™).

[0201] Se podrían obtener al menos 3 mejoras enzimáticas de este proceso. Cada una de las tres mejoras se podrían ver como beneficios a nivel individual, pero se puede emplear cualquier combinación (p. ej. 1+2, 1+3, 2+3 o 1+2+3):

Mejora 1. Reducción de la dependencia de calcio de la alfa-amilasa licuefactante.

Se requiere la adición de calcio libre para asegurar adecuadamente una alta estabilidad de la a-amilasa, pero el calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa y hace falta eliminarlo, por medio de una operacion única cara, llegando hasta un punto que reduce el nivel de calcio libre por debajo de 3-5 ppm. Se podrían obtener ahorros sobre el coste si se pudiera evitar tal operación y el proceso de licuefacción se podría realizar sin añadir iones calcio libre. Para conseguir esto, se requiere una a-amilasa de tipo Termamyl menos dependiente de calcio que sea estable y muy activa en concentraciones bajas de calcio libre (< 40 ppm). Tal a-amilasa de tipo Termamyl debería tener un pH óptimo a un pH en el rango de 4.5-6.5, preferiblemente en el rango de 4.5-5.5.

Mejora 2. Reducción de la formación de productos de Maillard indeseados

El grado de formación de productos de Maillard indeseados durante el proceso de licuefacción depende del pH. Un pH bajo favorece una formación reducida de productos de Maillard. De este modo sería deseable poder reducir el pH del proceso de un pH de aproximadamente 6.0 a un valor de pH de aproximadamente 4.5; desafortunadamente, lo que es comúnmente sabido, las a-amilasas de tipo Termamyl termoestables no son muy estables a pH bajo (es decir a pH < 6.0) y su actividad específica es generalmente baja.

Lograr los objetivos mencionados arriba requiere una a-amilasa de tipo termamyl que sea estable a pH bajo en el rango de 4.5-5.5 y en concentraciones de calcio libre en el rango de 0-40 ppm, y que mantenga una actividad específica alta.

Mejora 3.

[0202] Se ha expuesto previamente (patente US 5.234.823) que sacarificando con glucoamilasa de A. niger y, pululanasa de

B. acidopullulyticus, la presencia de actividad a-amilasa residual del proceso de licuefacción puede llevar a rendimientos más bajos de la dextrosa si la a-amilasa no se inactiva antes de la fase de sacarificación. Esta inactivación se puede efectuar normalmente ajustando el pH por debajo de 4.3 a 95°C, antes de reducir la temperatura a 60°C para la sacarificación.

[0203] La razón de este efecto negativo en el rendimiento de la dextrosa no se entiende completamente, pero se asume que la a-amilasa licuefactante (por ejemplo Termamyl™ 120 L de B. licheniformis) genera "dextrinas límite" (las cuales son sustratos pobres para la pululanasa de B. acidopullulyticus) mediante la hidrolización de los enlaces 1,4-alfa-glucosídicos situados cerca y en ambos lados de los puntos de ramificación en la amilopectina. La hidrólisis de estas dextrinas límite mediante la glucoamilasa lleva a un aumento del trisacárido panosa, el cual sólo se hidroliza lentamente mediante la glucoamilasa.

[0204] El desarrollo de una a-amilasa termoestable que no padezca de esta desventaja sería una mejora significante del proceso, en tanto en cuanto no se requeriría la fase de inactivación separada.

[0205] Si se desarrolla una a-amilasa de tipo Termamyl estable a pH bajo, una alteración de la especificidad podría ser una ventaja necesaria en combinación con una estabilidad aumentada a pH bajo.

[0206] La metodología y los principios de la presente invención hacen posible diseñar y producir variantes según la invención que tengan las propiedades requeridas según se describe anteriormente.

Composiciones de detergente

[0207] Según la invención, la a-amilasa puede ser normalmente un componente de una composición de detergente. Como tal, se puede incluir en la composición de detergente en forma de un granulado no polvoriento, en un líquido estabilizado, o en una enzima protegida. Los granulados no polvorientos se pueden producir, p. ej. como se describe en US 4.106.991 y

4.661.452 (ambas de Novo Industri A/S) y opcionalmente se pueden revestir mediante métodos conocidos en la técnica. Son ejemplos de materiales de revestimiento ceroso los productos de poli(etileno óxido) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000, nonilfenoles etoxilados con entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Se dan ejemplos de materiales de revestimiento filmógeno adecuados para su aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado en la patente GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas se pueden, por ejemplo, estabilizar añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, azúcar

o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico conforme a métodos establecidos. Otros estabilizadores enzimáticos se conocen bien en la técnica. Las enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238.216.

[0208] La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej. de polvo, gránulos, pasta o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo normalmente hasta un 70% de agua y un 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

[0209] La composición de detergente comprende uno o más surfactantes, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico, catiónico, o zwitteriónico. El detergente normalmente contendrá un 0-50% de surfactante aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal (LAS), alfa-olefinsulfonato (AOS), alquil sulfato (sulfato de alcohol graso) (AS), etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES), alcano sulfonatos secundarios (SAS), ésteres metílicos de ácido alfa-sulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón. También puede contener un 0-40% de surfactante no iónico tal como alcohol etoxilato (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilado, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, o polihidroxi alquil amida de ácido graso (p. ej. como se describe en WO 92/06154).

[0210] La composición de detergente puede comprender adicionalmente otra u otras enzimas, tales como lipasa, cutinasa, proteasa, celulasa, peroxidasa, p. ej., lacasa.

[0211] El detergente puede contener un 1-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTMPA), ácido alquil-o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicato estratificado (p. ej. SKS-6 de Hoechst). El detergente puede también no estar construido, es decir esencialmente libre de constructor de detergente.

5 [0212] El detergente puede comprender uno o más polímeros. Son ejemplos la carboximetilcelulosa (CMC), la poli(vinilpirrolidona) (PVP), el polietilenoglicol (PEG), el alcohol poli(vinílico) (PVA), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

[0213] El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato

10 o percarbonato la cual se puede combinar con un activador blanqueante formador de perácido tal como la tetraacetiletilenodiamina (TAED) o el nonanoiloxibenceno-sulfonato (NOBS). De forma alternativa, el sistema blanqueante puede comprender ácidos de peróxido de p. ej. la amida, la imida, o de tipo sulfona.

[0214] Las enzimas de la composición de detergente de la invención se pueden estabilizar usando agentes estabilizantes

15 convencionales, p. ej. un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico como p. ej. un éster de borato aromático, y la composición se puede formular según se describe en p. ej. WO 92/19709 y WO 92/19708.

[0215] El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como p. ej.

20 acondicionadores de tela incluyendo las arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de suciedad, agentes de reposición antisuciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, o perfumes,

[0216] El pH (medido en solución acuosa en la concentración de uso) será normalmente neutro o alcalino, p. ej. 7-11.

25 [0217] Las formas particulares de composiciones de detergente dentro del campo de la invención incluyen: 1) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 7 - 12%

Etoxisulfato de alcohol (p. ej. C12-18 alcohol, 1-2 EO) o alquil sulfato (p. ej. C16-18): 1 - 4%

Alcohol etoxilato (p. ej. C14-15 alcohol, 7 EO): 5 - 9%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 14 - 20%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 2 - 6%

Zeolita (como NaAlSiO4): 15 - 22%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 0 - 6%

Ácido de citrato/cítrico de sodio (como C6H5Na3O7 /C6H8O7): 0 - 15%

Perborato sódico (como NaBO3.H2O): 11 - 18%

TAED: 2 - 6%

Carboximetilcelulosa: 0 - 2%

Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG): 0 - 3%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume, abrillantador óptico, fotoblanqueador): 0 - 5%

30 2) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 6 - 11%

Etoxisulfato de alcohol (p. ej. C12-18 alcohol, 1-2 EO o alquil sulfato (p. ej. C16-18): 1- 3%

Alcohol etoxilato (p. ej. C14-15 alcohol, 7 EO): 5 - 9%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 15 - 21%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 1 - 4%

Zeolita (como NaAlSiO4): 24 - 34%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 4 - 10%

Acido de citrato/cítrico de sodio (como C6H5Na3O7/C6H8O7): 0 - 15%

Carboximetilcelulosa: 0 - 2%

Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG): 1 - 6%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume): 0 - 5%

3) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 5 - 9%

alcohol etoxilato (p. ej. C12-15 alcohol, 7 EO): 7 - 14%

Jabón como ácido graso (p. ej. C16-22 ácido graso): 1 - 3%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 10 - 17%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 3 - 9%

Zeolita (como NaAlSiO4): 23 - 33%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 0 - 4%

Perborato sódico (como NaBO3.H2O): 8 - 16%

TAED: 2 - 8%

Fosfonato (p. ej. EDTMPA): 0 - 1%

Carboximetilcelulosa: 0 - 2%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume, abrillantador óptico): 0 - 5%

4) Una composición de detergente formulada como un granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 8 - 12%

Alcohol etoxilato (p. ej. C12-15 alcohol, 7 EO): 10 - 25%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 14 - 22%.

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 1 - 5%

Zeolita (como NaAlSiO4): 25 - 35%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 0 - 10%

Carboximetilcelulosa: 0 - 2%

Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG): 1 - 3%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0.0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume): 0 - 5%

5) Una composición de detergente líquida acuosa que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 15 - 21%

Alcohol etoxilato (p. ej. C12-15 alcohol, 7 EO or C12-15 alcohol, 5 EO): 12 - 18%

Jabón como ácido graso (p. ej. ácido oleico): 3 - 13%

Ácido alquenilsuccínico (C12-14): 0 - 13%

Aminoetanol: 8 - 18%

Ácido cítrico: 2 - 8%

Fosfonato: 0 - 3%

Polímeros (e.g. PVP, PEG): 0 - 3%

Borato (como B4O7): 0 - 2%

Etanol: 0 - 3%

Propilenglicol: 8 - 14%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. dispersantes, supresores de espuma, perfume, abrillantador óptico): 0 - 5%

6) Una composición de detergente líquida acuosa estructurada que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 15 - 21%

Alcohol etoxilato (p. ej. C12-15 alcohol, 7 EO, or C12-15 alcohol, 5 EO): 3 - 9%

Jabón como ácido graso (p. ej. ácido oleico): 3 - 10%

Zeolita (como NaAlSiO4 ): 14 - 22%

Citrato de potasio: 9 - 18%

Borato (como B4 O7 ): 0 - 2%

Carboximetilcelulosa: 0 - 2%

Polímeros (e.g. PEG, PVP): 0 - 3%

Polímeros de anclaje tales como, p. ej., un copolímero de lauril metacrilato/ ácido acrílico; proporción molar 25:1; PM 3800: 0 - 3%

Glicerol: 0 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0.0001 - 0.1%

Ingredientes menores (p. ej. dispersantes, supresores de espuma, perfume, blanqueadores ópticos): 0 - 5%

7) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

Sulfato de alcohol graso: 5 - 10%

Monoetanolamida de ácido graso etoxilado: 3 - 9%

Jabón como ácido graso: 0 - 3%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 5 - 10%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 1 - 4%

Zeolita (como NaAlSiO4): 20 - 40%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 2 - 8%

Perborato sódico (como NaBO3.H2O): 12 - 18%

TAED: 2 - 7%

Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PEG): 1 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0.0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. abrillantador óptico, supresores de espuma, perfume): 0 - 5%

8) Una composición de detergente formulada en forma de granulado que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 8 - 14%

Monoetanolamida de ácido graso etoxilado: 5 - 11%

Jabón como ácido graso: 0 - 3%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 4 - 10%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 1 - 4%

Zeolita (como NaAlSiO4): 30 - 50%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 3 - 11%

Citrato sódico (como C6H5Na3O7): 5 - 12%

Polímeros (p. ej. PVP, copolímero de ácido maléico/acrílico, PEG): 1 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0.0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume): 0 - 5%

9) Una composición de detergente formulada en forma de granulado que comprende 10) Una composición de detergente líquida acuosa que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 6 - 12%

Surfactante no iónico: 1 - 4%

Jabón como ácido graso: 2 - 6%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 14 - 22%

Zeolita (como NaAlSiO4): 18 - 32%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 5 - 20%

Citrato sódico (como C6H5Na3O7): 3 - 8%

Perborato sódico (como NaBO3.H2O): 4 - 9%

Activador blanqueante (p. ej. NOBS o 1 TAED): - 5%

Carboximetilcelulosa: 0 - 2%

Polímeros (p. ej. policarboxilato o PEG): 1 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. abrillantador óptico, perfume): 0 - 5%

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 15 - 23%

Etoxisulfato de alcohol (p. ej. C12-15 alcohol, 2-3 EO): 8 - 15%

Alcohol etoxilato (p. ej. C12-15 alcohol, 7 EO, o C12-15 alcohol, 5 EO): 3 - 9%

Jabón como ácido graso (p. ej. ácido láurico): 0 - 3%

Aminoetanol: 1 - 5%

Citrato sódico: 5 - 10%

Hidrotropo (p. ej. sodio toluensulfonato): 2 - 6%

Borato (como B4O7): 0 - 2%

Carboximetilcelulosa: 0 - 1%

Etanol: 1 - 3%

Propilenoglicol: 2 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. polímeros, dispersantes, perfume, blanqueadores ópticos): 0 - 5%

11) Una composición de detergente líquida acuosa que comprende

Alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): 20 - 32%

Alcohol etoxilato (p. ej. C12-15 alsohol, 7 EO, o C12-15 alcohol, 5 EO): 6 - 12%

Aminoetanol: 2 - 6%

Ácido cítrico: 8 - 14%

Borato (como B4O7): 1 - 3%

Polímero (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, polímero de anclaje tal como, p. ej., copolímero de lauril metacrilato/ ácido acrílico): 0 - 3%

Glicerol: 3 - 8%

Enzimas (calculadas, como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0.1%

Ingredientes menores (p. ej. hidrotropos, dispersantes, perfume, blanqueadores ópticos): 0 - 5%

12) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

Surfactante aniónico (alquilbencenosulfonato lineal, alquil sulfato, alfaolefinsulfonato, ésteres metílicos de ácido alfasulfo graso, alcanosulfonatos, jabón): 25 - 40%

Surfactante no iónico (p. ej. alcohol etoxilato): 1 - 10%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 8 - 25%

Silicatos solubles (como Na2O, 2SiO2): 5 - 15%

Sulfato de sodio (como Na2SO4): 0 - 5%

Zeolita (como NaAlSiO4): 15 - 28%

Perborato sódico (como NaBO3.4H2O): 0 - 20%

Activador blanqueante (TAED o NOBS): 0 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. perfume, blanqueadores ópticos): 0 - 3%

13) Formulaciones detergentes según se describe en 1) - 12) donde todo o parte del alquilbencenosulfonato lineal se sustituye por (C12-C18) alquil sulfato. 14) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

(C12-C18) alquil sulfato: 9 - 15%

Alcohol etoxilato: 3 - 6%

Amida de ácido graso de alquilo de polihidroxi: 1 - 5%

Zeolita (como NaAlSiO4): 10 - 20%

Disilicato estratificado (p. ej. SK56 de Hoechst): 10 - 20%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 3 - 12%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 0 - 6%

Citrato sódico: 4 - 8%

Percarbonato de sodio: 13 - 22%

TAED: 3 - 8%

Polímeros (p. ej. policarboxilatos y PVP=: 0 - 5%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras): 0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. abrillantador óptico, fotoblanqueador, perfume, supresores de espuma): 0 - 5%

15) Una composición de detergente formulada en forma de granulado con una densidad en masa de al menos 600 g/l que comprende

(C12 -C 18 ) alquil sulfato: 4 - 8%

Alcohol etoxilato: 11 - 15%

Jabón: 1 - 4%

Zeolita MAP o zeolita A: 35 - 45%

Carbonato sódico (como Na2CO3): 2 - 8%

Silicato soluble (como Na2O, 2SiO2): 0 - 4%

Percarbonato de sodio: 13 - 22%

TAED: 1 - 8%

Carboximetilcelulosa: 0 - 3%

Polímeros (p. ej. policarboxilatos y PVP): 0 - 3%

Enzimas (calculadas como proteínas enzimáticas puras)

0,0001 - 0,1%

Ingredientes menores (p. ej. abrillantador óptico, fosfonato, perfume)

0 - 3%

16) Formulaciones detergentes según se describe en 1) - 15) las cuales contienen un perácido estabilizado o encapsulado, bien como un componente adicional o como un sustituto para los sistemas blanqueantes ya especificados. 17) Composiciones de detergente según se describe en 1), 3), 7), 9) y 12) donde el perborato se sustituye por percarbonato. 18) Composiciones de detergente según se describe en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15) las cuales contienen adicionalmente un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede ser, p. ej., uno de los compuestos descritos en, "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639. 19) Composición de detergente formulada en forma de líquido detergente no acuoso que comprende un líquido no iónico surfactante tal como, p. ej., alcohol primario lineal alcoxilado, un sistema constructor (p. ej. fosfato), enzima y alcali. El detergente también puede comprender un surfactante aniónico y/o un sistema blanqueador.

[0218] La variante de a-amilasa de la invención se puede incorporar en concentraciones convencionalmente empleadas en detergentes. Se contempla actualmente que, en la composición de detergente de la invención, la a-amilasa se puede añadir en una cantidad correspondiente a 0,00001-1 mg (calculada como proteína enzimática pura) de a-amilasa por litro de solución de lavado.

Composición para el lavado de la vajilla

[0219] La composición de detergente para el lavado de la vajilla comprende un surfactante que puede ser aniónico, no iónico, catiónico, anfotérico o una mezcla de estos tipos. El detergente contendrá un 0-90% de surfactante no iónico tal como los alcoholes de cadena lineal propoxilados etoxilados poco o nada espumantes. La composición de detergente puede contener sales constructoras de detergente de tipo orgánico y/o inorgánico. Los constructores de detergente se pueden subdividir en los tipos de los que contienen fósforo y los que no contienen fósforo. La composición de detergente contiene normalmente un 1-90% de constructores de detergente. Ejemplos de constructores de detergente alcalinos inorgánicos con fósforo, en caso de haberlos, incluyen las sales hidrosolubles en especial los pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos, y polifosfatos. Un ejemplo de constructor de detergente orgánico alcalino con fósforo, en caso de haberlo, incluye las sales hidrosolubles de fosfonatos. Ejemplos de constructores inorgánicos sin fósforo, en caso de haberlos, incluyen carbonatos de metal alcalino hidrosolubles, boratos y silicatos así como los diferentes tipos de silicatos de alumino insolubles en agua cristalinos o amorfos de los cuales son las zeolitas las más representativas.

[0220] Ejemplos de constructores orgánicos adecuados incluyen el metal alcalino, el amonio y amonio sustituido, los citratos, los succinatos, los malonatos, los sulfonatos de ácido graso, los carboximetoxi succinatos, los poliacetatos de amonio, los carboxilatos, los policarboxilatos, los aminopolicarboxilatos, los poliacetil carboxilatos, y los polihidroxsulfonatos.

[0221] Otros constructores orgánicos adecuados incluyen los polímeros de mayor peso molecular y los copolímeros sobre los que se sabe tienen propiedades constructoras, por ejemplo un ácido poliacrílico apropiado, copolímeros de ácido polimaléico y poliacrílico/polimaléico y sus sales.

[0222] La composición de detergente para el lavado de la vajilla puede contener agentes blanqueadores del tipo de la clorina/bromina o del tipo del oxígeno. Ejemplos de blanqueadores inorgánicos de tipo clorina/bromina son el litio, el hipoclorito y el hipobromito de sodio o de calcio así como el fosfato de trisodio clorurado. Ejemplos de blanqueadores orgánicos de tipo clorina/bromina son las imidas de N-bromo y N-cloro heterocíclicas tales como los ácidos tricloroisocianúrico, tribromoisocianúrico, dibromoisocianúrico y dicloroisocianúrico, y las sales derivadas de los mismos con cationes solubilizantes en agua tales como el potasio y el sodio. Los compuestos de hidantoina también son apropiados.

[0223] Los blanqueadores de oxígeno se prefieren, por ejemplo en forma de una persal inorgánica, preferiblemente con un precursor blanqueador o en forma de compuesto de ácido de peróxido. Son ejemplos típicos de compuestos blanqueadores de peróxido adecuados los perboratos de metal alcalino, ambos tetrahidratos y monohidratos, los percarbonatos de metal alcalino, los persilicatos y los perfosfatos. Los materiales activadores preferidos son la TAED y el triacetato de glicerol.

[0224] La composición de detergente para el lavado de la vajilla de la invención se puede estabilizar usando agentes estabilizantes convencionales para la(s) enzima(s), p. ej. un poliol tal como p. ej. propilenglicol, azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej. un éster de borato aromático.

[0225] La composición de detergente para el lavado de la vajilla de la invención también puede contener otros ingredientes de detergente convencionales, p. ej. material defloculante, material de relleno, depresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de suciedad, agentes secuestrantes, agentes de reposición antisuciedad, agentes deshidratadores, tintes, bactericidas, fluorescentes, espesantes y perfumes. Finalmente, la variante de a-amilasa de la invención se puede usar en detergentes convencionales para el lavado de la vajilla, p. ej. en cualquiera de los detergentes descritos en cualquiera de las publicaciones de patentes siguientes: EP 518719; EP 518720; EP 518721; EP 516553; EP 516554; EP 516555; GB 2200132; DE 3741617; DE 3727911; DE 4212166; DE 4137470; DE 3833047; WO 93/17089; DE 4205071; WO 52/09680; WO 93/18129; WO 93/04153; WO 92/06157; WO 92/08777; EP 429124; WO 93/21299; US 5141664; EP 561452 ; EP 561446; GB 2234980; WO 93/03129; EP 481547; EP 530870; EP 533239; EP 554943; EP 346137; US 5112518; EP 318204; EP 318279; EP 271155; EP 271156; EP 346136; GB 2228945; CA 2006687; WO 93/25651; EP 530635; EP 414197; US 5240632.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Ejemplo en la construcción de homología de TERM

[0226] La homología global de la a-amilasa de B. licheniformis (en lo sucesivo referida como TERM) con otras a-amilasas de tipo Termamyl es alta y la similitud del porcentaje es extremadamente alta. La similitud calculada entre TERM y BSG (la a-amilasa de B. stearothermophilus con la SEC ID No: 6), y BAN (la a-amilasa de B. amyloliquefaciens con la SEC ID No: 4) usando el programa GCG del University of Wisconsin Genetics Computer Group resultó en un 89% y un 78%, respectivamente. TERM tiene una deleción de 2 residuos entre el residuo G180 y el K181 en comparación con BAN y BSG. BSG tiene una deleción de 3 residuos entre el G371 y el I372 en comparación con BAN y TERM. Además BSG tiene una extension C-terminal de más de 20 residuos en comparación con BAN y TERM. BAN tiene 2 residuos menos y TERM tiene un residuo menos en el N-terminal en comparación con BSG.

[0227] La estructura de la a-amilasa de B. licheniformis (TERM) y de la de B. amyloliquefaciens (BAN), respectivamente, se modeló en la estructura descrita en el Apéndice 1 aquí. La estructura de otras a-amilasas de tipo Termamyl (p. ej. las descritas aquí) se puede construir de forma análoga.

[0228] En comparación con la a-amilasa usada para dilucidar la presente estructura, TERM difiere en que le faltan dos residuos más o menos entre 178-182. Con el fin de compensar ésto en la estructura modelo, se usó el programa HOMOLOGY de BIOSYM para sustituir los residuos en posiciones equivalentes en la estructura (no sólo regiones estructuralmente conservadas) salvo por el punto de deleción. Se estableció un enlace peptídico entre G17 (G177) y K180(K180) en TERM(BAN). La estrecha relación estructural entre la estructura resuelta y la estructura modelo (y de este modo la validez de la última) está indicada mediante la presencia de tan sólo muy pocos átomos encontrados demasiado juntos en el modelo.

[0229] A esta estructura muy irregular de TERM se le añadieron después todas las aguas (605) e iones (4 de calcio y 1 de sodio) de la estructura resuelta (Apéndice 1) en las mismas coordenadas que para dicha estructura resuelta usando el programa INSIGHT. Esto se podría hacer con tan sólo pocas superposiciones, en otras palabras con un pequeño ajuste. Después se minimizó esta estructura modelo usando 200 fases de Steepest-Descent y 600 fases de gradiente conjugado (véase Brooks et al 1983, J. Computational Chemistry 4, págs.187-217). La estructura minimizada se sometió después a dinámica molecular, 5ps de calentamiento seguido de un máximo de 200ps pero más de 35ps de equilibrado. La dinámica según funciona con el algoritmo de Verlet y la temperatura de equilibrado de 300K se mantuvieron usando el acoplamiento Behrendsen en un baño maría (Berendsen et. al., 1984, J. Chemical Physics 81, p. 3684-3690). Se eliminaron las rotaciones y traducciones a cada picosegundo. La energía potencial se volvió estable después de aprox. 35ps de equilibrado. Se extrajo una estructura de dinámica media y se pudo usar para análisis adicionales.

EJEMPLO 2

Determinación de residuos dentro de 10Å de los iones presentes en la estructura resuelta

[0230] Las coordenadas del Apéndice 1 se leen en el programa INSIGHT proporcionado por BIOSYM Technologies. Las coordenadas espaciales se presentan mostrando los enlaces entre los átomos. Se presentan los iones así como los átomos de agua. La parte del paquete de programas del subconjunto de creación se usa para crear un subconjunto de 10Å alrededor de los iones de calcio y de sodio en la estructura usando el comando ZONE. Todos los residuos que tienen un átomo dentro de 10Å se compilan y se introducen bajo el comando LIST MOLECULE. Asignándoles a los iones el nombre de ium en el fichero de coordenadas se compila un esfera de 10Å alrededor de todos los átomos denominados ium. Los

2+

residuos específicos identificados de esta manera se tratan también arriba en la sección titulada "Dependencia de Ca ".

EJEMPLO 3

Determinación de cavidades en la estructura resuelta (Apéndice 1)

[0231] La estructura resuelta muestra muchos agujeros internos y cavidades. A la hora de analizar este tipo de cavidades se usa normalmente el programa Connolly (Lee, B. and Richards, F.M. (1971) J. Mol. Biol. 55,p. 379-400). El programa usa una sonda con radio para buscar la superficie externa e interna de la proteína. El agujero más pequeño que se puede observar de esta manera tiene el radio de la sonda.

[0232] Para analizar la estructura resuelta se usó una version modificada del programa Connolly incluida en el programa de INSIGHT. En primer lugar se eliminaron las moléculas de agua y los iones desfusionando estos átomos de la estructura resuelta. Usando el comando MOLECULE SURFACE SOLVENT se calculó el área de superficie accesible del solvente para todos los átomos y residuos usando un radio de sonda de 1.4Å, y se visualizó en la pantalla de gráficos junto con el modelo de la estructura resuelta. Las cavidades internas se vieron entonces como superficies de puntos sin conexiones con la superficie externa.

[0233] Se sugieren mutantes para rellenar los agujeros en la especificación (en la sección titulada "Variantes con termoestabilidad aumentada y/o temperatura óptima alterada"). Usando las estructuras de construcción de homología y/o las mutaciones de alineamiento de secuencia para las estructuras homólogas de TERM y se pueden hacer BSG y BAN.

EJEMPLO 4

Construcción de variantes de Termamyl™ según la invención

[0234] Termamyl (SEC ID No: 2) se expresa en B. subtilis a partir de un plásmido denominado pDN1528. Este plásmido contiene el gen completo que codifica Termamyl, amyL, cuya expresión dirige su propio promotor. Además, el plásmido contiene el origen de replicación, ori, del plásmido pUB110 y el gen cat del plásmido pC194 que confiere resistencia al cloranfenicol, pDN1528 se muestra en la Fig. 9.

[0235] Se preparó un vector de mutagénesis específico que contiene una parte más importante de la región codificante de la SEC ID No: 1. La característica importante de este vector, denominado pJeEN1, incluye un origen de replicación derivado de los plásmidos pUC, el gen cat que confiere resistencia al cloranfenicol, y una versión con desplazamiento del marco de lectura del gen bla, el tipo salvaje del cual normalmente confiere resistencia a la ampicilina (fenotipo ampR). Esta versión mutada resulta en un fenotipo ampS. El plásmido pJeEN1 se muestra en la Fig. 10, y el origen de replicación de E. coli, ori, bla, cat, la versión truncada en 5' del gen de amilasa Termamyl, y los sitios de restricción seleccionados se indican en el plásmido.

[0236] Las mutaciones se introducen en amyL mediante el método descrito por Deng y Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, págs. 81-88) a excepción de que los plásmidos con el "cebador de selección" (cebador #6616; véase abajo) incorporados se seleccionan con base en el fenotipo ampR de las células de E. coli transformadas que contienen un plásmido con un gen bla reparado, en lugar de utilzar la selección en la digestión de la enzima de restricción descrita por Deng y Nickoloff. Los productos químicos y enzimas usados para la mutagénesis se obtuvieron del equipo de mutagénesis Chameleon™ de Stratagene (número de fabricación 200509).

[0237] Después de la versificación de la secuencia de ADN en los plásmidos variantes, el gen truncado, el cual contiene la alteracion deseada, se subclona en pDN1528 como un fragmento de PstI-EcoRI y se transforma en una cepa de Bacillus subtilis baja en proteasas y amilasas con el fin de expresar la enzima variante.

[0238] La variante de termamyl V54W se construyó usando el siguiente cebador de mutagénesis (escrito como 5' a 3', izquierda a derecha):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG

[0239] La variante de termamyl A52W + V54W se construyó usando el siguiente cebador de mutagénesis (escrito como 5' a 3', izquierda a derecha):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG

[0240] Cebador #6616 (escrito 5' a 3', izquierda a derecha; P simboliza un fosfato 5'): P CTG TGA CTG GTG ACT ACT CAA CCA AGT C

EJEMPLO 5

Sacarificación en presencia de actividad -amilasa "residual"

[0241] Dos variantes de Termamyl apropiadas con especificidad alterada se evaluaron mediante la sacarificación de un sustrato de maltodextrina DE 10 (DE = equivalente de dextrosa) con la glucoamilasa de A. niger y la pululanasa de B. 5 acidopulluliticus bajo condiciones en las que la variante amilasa estaba activa.

[0242] Sacarificación: los sustratos para la sacarificación se prepararon disolviendo 230 g de maltodextrina desecada atomizada DE 10, preparada a partir de almidón de maíz común, en 460 ml de agua desionizada en ebullición y ajustando el contenido de sustancia seca (DS) a aproximadamente un 30% p/p. El pH se ajustó a 4.7 (medido a 60°C) y las partes

10 alícuotas del sustrato correspondientes a 15 g de peso en seco se transfirieron a matraces de vidrio de tapón azul de 50 ml.

[0243] Los matraces se colocaron después en un baño maría con agitación equilibrado a 60°C, y se añadieron las enzimas. El pH se readjustó a 4.7 cuando fue necesario.

15 [0244] Se usaron las siguientes enzimas: Glucoamilasa: AMG™ (Novo Nordisk A/S); dosificación 0,18 Ag/g DS Pululanasa: Promozyme™ (Novo Nordisk A/S);

dosificación 0,06 PUN/g DS a-Amilasas: Termamyl™ (Novo Nordisk A/S); dosificación 60 NU/g DS 20 variante de Termamyl V54W; dosificación 60 NU/g DS variante de Termamyl V54W + A52W; dosificación 60 NU/g DS

[0245] Se tomaron muestras de 2 ml periódicamente. El pH de cada muestra se ajustó a aproximadamente 3.0, y la muestra se calentó después en un baño maría a ebullición durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Tras el enfriamiento, las

25 muestras se trataron con aproximadamente 0,1 g de resina de intercambio iónico en lecho mezclado (BIO-Rad 501-X (D)) durante 30 minutos en un mezclador giratorio y después se filtraron. La composición de carbohidratos de cada muestra se determinó mediante HPLC. Los siguientes resultados se obtuvieron después de 72 horas [DPn simboliza un oligómero de dextrosa (D-glucosa) con n unidades de glucosa]:

a-amilasa: %DP1 %DP2 %DP3 %DP4

Ninguna (control): 95,9 2,8 0,4 1,0

V54W: 96,0 2,9 0,4 0,8

V54W + A52W: 95,9 2,8 0,4 0,8

Termamyl ™: 95,6 2,8 0,8 0,8

30 [0246] Se puede ver en los resultados de arriba que en comparación con el control (ninguna actividad a-amilasa presente durante la licuefacción), la presencia de actividad a-amilasa de las variantes V54W y V54W + A52W no condujo a niveles elevados de panosa (DP3). Por el contrario, la actividad de la a-amilasa Termamyl resultó en niveles más altos de panosa y en una pérdida posterior del rendimiento de la D-glucosa (DP1).

35 [0247] Así, si las variantes de a-amilasa V54W o V54W + A52W se usan para la licuefacción de almidón, no será necesario inactivar la actividad a-amilasa residual antes del inicio de la sacarificación.

EJEMPLO 6

Afinidad de unión de calcio de variantes de a-amilasa de la invención

[0248] El despliegue de amilasas mediante la exposición a una fuente de calor o a desnaturalizantes tales como el hidrocloruro de guanidina está acompañado de una reducción de la fluorescencia. La pérdida de iones de calcio conduce a

45 un despliegue, y la afinidad de las a-amilasas con el calcio se puede medir mediante mediciones de fluorescencia antes y después de la incubación de cada a-amilasa (p. ej. a una concentración de 10 lg/ml) en un regulador (p. ej. 50 mM HEPES, pH 7) con diferentes concentraciónes de calcio (p. ej. en el rango de 1 aM-100 mM) o de EGTA (p. ej. en el rango de 1-1000 lM) [EGTA = ácido 1,2-di(2-aminoetoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético] durante un periodo de tiempo suficientemente largo (tal como 22 horas a 55°C)

50 [0249] La fluorescencia medida F está compuesta por contribuciones a partir de las formas plegadas y desplegadas de la enzima. La siguiente ecuación se puede derivar para describir la dependencia de F en una concentración de calcio ([Ca]):

F = [Ca] / (K +[Ca])(a-�log([Ca])) +

diss NN

k/(k+[Ca])(a log([Ca]))

diss diss u

donde aN es la fluorescencia de la forma (plegada) nativa de la enzima, N es la dependencia lineal de aN en el logaritmo de la concentración de calcio (según se ha observado experimentalmente), aU es la fluorescencia de la forma desplegada y U es la dependencia lineal de aU en el logaritmo de la concentración de calcio. Kdiss es la constante de unión de calcio aparente para un proceso de equilibrio como sigue:

kdiss

N-Ca U + Ca (N = enzima nativa; U = enzima desplegada)

[0250] De hecho, el despliegue procede de forma extremadamente lenta y es irreversible. El promedio del despliegue depende de la concentración de calcio, y la dependencia para una a-amilasa dada proporciona una medida de la afinidad de unión de Ca de la enzima. Definiendo un conjunto estándar de condiciones de reacción (p. ej. 22 horas a 55°C), se puede hacer una comparación significativa de Kdiss para las diferentes a-amilasas. Las curvas de disociación del calcio para las aamilasas en general se pueden ajustar a la ecuación de arriba, permitiendo determinar los valores correspondientes de Kdiss.

[0251] Los siguientes valores para Kdiss se obtuvieron para una a-amilasa parental de tipo Termamyl que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 1 de WO 95/26397 y para la variante de la misma indicada según la invención:

a-Amilasa: Kdiss (mol/l)

L351C + M430C + T183* + G184* Parental: 1.7 (±0.5) x 10 -3 3.5 (±1.1) x 10 -1

[0252] Es evidente según lo anterior que la afinidad de unión de calcio de la variante en cuestión se enlaza con el calcio significativamente más fuerte que la parental, y de ese modo tiene una dependencia de calcio correspondientemente menor que la parental.

FORMAS DE REALIZACIÓN GENERALES (no definiendo la invención)

[0253]

1.: Método para construir una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, la cual tiene actividad de a-amilasa y al menos una propiedad alterada en comparación con dicha a-amilasa parental, este método comprende i) analizar la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl parental para identificar al menos un residuo de aminoácido o al menos una parte estructural de la estructura de a-amilasa de tipo Termamyl, este residuo de aminoácido o parte estructural es considerada relevante para alterar dicha propiedad de la a-amilasa de tipo Termamyl parental (como se evaluó basándose en consideraciones funcionales o estructurales), ii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl, que en comparación con la a-amilasa de tipo Termamyl parental, ha sido modificada en el residuo de aminoácido o parte estructural identificada en i) para alterar dicha propiedad, y iii) evaluar la variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante para dicha propiedad.

2.: Método según la forma de realización 1, donde la propiedad que debe ser alterada es seleccionada del grupo que consiste en especificidad de sustrato, unión de sustrato, modelo de corte de sustrato, estabilidad de temperatura, actividad dependiente del pH, estabilidad dependiente del pH (estabilidad especialmente aumentada a valores de pH bajos (p. ej. pH<6) o altos (p. ej. pH>9)), estabilidad a la oxidación, dependencia de Ca2+ y actividad específica.

3.: Método según la forma de realización 1 o 2, donde la propiedad que debe ser alterada es la dependencia de iones de calcio y la parte estructural que debe ser modificada es seleccionada del grupo que consiste en el dominio C, la interfaz entre el dominio A y B, la interfaz entre el dominio A y C, o la interacción a un sitio de unión de calcio de la a-amilasa de tipo Termamyl.

4.: Método según la forma de realización 1 o 2, donde la propiedad que debe ser alterada es el modelo de corte de sustrato y la parte estructural para ser modificada se localiza dentro de 10Å de un residuo de aminoácido del sitio de unión de sustrato.

5.: Método para construir una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene actividad de aamilasa y una o más propiedades alteradas en comparación con dicha a-amilasa parental, este método comprende i) comparar la estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo Termamyl con la estructura de una a-amilasa no de tipo Termamyl,

ii) identificar una parte de la estructura de a-amilasa de tipo Termamyl que es diferente de la estructura de a-amilasa no de tipo Termamyl y que a partir de consideraciones funcionales o estructurales se considera responsable de diferencias en una

o más propiedades de la a-amilasa de tipo Termamyl y no de tipo Termamyl, y iii) modificar la parte de la a-amilasa de tipo termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de a-amilasa de tipo termamyl, de las cuales una o más propiedades diferen de las de la a-amilasa de tipo termamyl parental.

6.: Método según la forma de realización 5, donde, en la fase iii), la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl es modificada para parecer la parte correspondiente de la a-amilasa no de tipo Termamyl.

7.: Método según la forma de realización 5 o 6, donde, en la fase iii), la modificación se realiza por deleción de uno o más residuos de aminoácidos de la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl para ser modificada; por sustitución de uno o más residuos de aminoácidos de la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl para ser modificada con los residuos de aminoácidos que ocupan posiciones correspondientes en la a-amilasa no de tipo Termamyl; o por inserción de uno o más residuos de aminoácidos presentes en la a-amilasa no de tipo Termamyl en una posición correspondiente en la a-amilasa de tipo Termamyl.

8.: Método según cualquiera de las formas de realización 5-7, donde la estructura de a-amilasa no de tipo Termamyl es la estructura de una a-amilasa fúngica o una a-amilasa mamífera.

9.: Método según la forma de realización 8, donde la a-amilasa no de tipo Termamyl es la TAKA a-amilasa de Aspergillus oryzae, la a-amilasa ácida de A. niger, la a-amilasa de Bacillus subtilis o la a-amilasa pancreática de cerdo.

10.: Método según cualquiera de las formas de realización 1-9, donde la a-amilasa de tipo Termamyl parental se deriva de una cepa de Bacillus.

11.: Método según la forma de realización 10, donde la a-amilasa parental se deriva de una cepa de B.licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus o una cepa de Bacillus sp. alcalofílica tal como NCIB 12289, NCIB 12512 o NCIB 12513.

12.: Método según cualquiera de las formas de realización 1-11, donde la a-amilasa parental es una a-amilasa híbrida que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos a-amilasas, de las cuales una es una a-amilasa de tipo Termamyl y la(s) otra(s) son, por ejemplo, de una a-amilasa microbiana y/o mamífera.

13.: Método según cualquiera de las formas de realización 5-12, donde la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl parental para ser modificada e identificada en la fase ii) es bucle 1, bucle 2, bucle 3 y/o bucle 8 de la a-amilasa parental.

13.: Método para construir una variante de una a-amilasa de tipo termamyl parental, que tiene una reducida dependencia de iones de calcio en comparación con dicha a-amilasa parental, este método comprende: i) identificar un residuo de aminoácido dentro de 10Å de un sitio de unión de Ca2+ de una a-amilasa de tipo Termamyl en un modelo de la estructura tridimensional de dicha a-amilasa, que a partir de consideraciones funcionales o estructurales es considerada ser responsable de una interacción de iones calcio no óptima, ii) construir una variante en la que dicho residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones funcionales o estructurales se considera importante para establecer una mayor afinidad de unión de Ca2+, y iii) evaluar la dependencia de Ca2+ de la variante resultante de a-amilasa de tipo Termamyl.

14.: Método para construir una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, la cual tiene actividad de a-amilasa y una actividad dependiente del pH alterada, este método comprende i) en una estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo Termamyl en cuestión, identificar un residuo de aminoácido dentro de 15Å de un residuo de sitio activo, en particular 10Å de un residuo de sitio activo, este residuo de aminoácido se considera implicado en interacciones hidrofóbicas o electroestáticas con un residuo de sitio activo, ii) sustituir, en la estructura, dicho residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que cambia el entorno hidrofóbico y/o electroestático de un residuo de sitio activo y valorar el alojamiento del residuo de aminoácido en la estructura, iii) opcionalmente repetir la fase i) y/o ii) hasta que una sustitución de aminoácido ha sido identificada que se aloja en la estructura, iv) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl que resulta de las fases i), ii) y opcionalmente iii) y evaluar la actividad dependiente del pH de dicha variante.

15.: Método para aumentar la termostabilidad y/o alterar la temperatura óptima de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, este método comprende i) identificar un agujero interno o una grieta de la a-amilasa de tipo Termamyl parental en la estructura tridimensional de dicha a-amilasa,

ii) sustituir, en la estructura, uno o más residuos de aminoácidos en la vecindad del agujero o grieta identificados en i) con otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones funcionales o estructurales se considera que aumenta la interacción hidrofóbica y que completa o reduce el tamaño del agujero o grieta, iii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl que resulta de la fase ii) y evaluar la termostabilidad y/o temperatura óptima de la variante.

16.: Método para construir una variante de una a-amilasa de tipo Termamyl que tiene una capacidad reducida para cortar un sustrato cerca del punto de ramificación, este método comprende i) identificar el área de unión de sustrato de la a-amilasa de tipo Termamyl parental en un modelo de la estructura tridimensional de dicha a-amilasa, ii) sustituir, en el modelo, uno o más residuos de aminoácidos del área de unión de sustrato del corte identificado en i), que es/son considerado/s responsable/s para el modelo de corte de la a-amilasa parental, con otro residuo de aminoácido que a partir de consideraciones estructurales se considera que supone un modelo de corte de sustrato alterado, o la deleción de uno o más residuos de aminoácidos del área de unión de sustrato contemplado para introducir interacciones favorables al sustrato o añadir uno o más residuos de aminoácidos al área de unión de sustrato contemplado para introducir interacciones favorables al sustrato, y iii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl que resulta de la fase ii) y evaluación del modelo de corte de sustrato de la variante.

17.: Método según cualquiera de las formas de realización precedentes, en el que la variante de a-amilasa se obtiene por cultivo de un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son propicias para producir la variante, y opcionalmente posteriormente recuperar la variante del caldo de cultivo resultante.

18.: Variante de una a-amilasa de tipo termamyl parental, en la cual al menos un residuo de aminoácido de la a-amilasa parental, que están presentes en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácido 44-57 de la secuencia de aminoácido de SEC ID n°. 4, ha sido delecionado o sustituido por uno o más residuos de aminoácido que está/están presente/s en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácido 66-84 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10, o donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/n sido añadido/s usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

19.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de la SEC ID No 4, dicha región teniendo como mínimo 80% de homología de secuencia con la parte de la SEC ID No 10 que se extiende del residuo Z al residuo V de la SEC ID No 10, donde X es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 44, 45, 46,47 o 48 de identidad SEC n°. 4, Y es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 51, 52, 53, 54, 55,56 o 57 de la SEC ID n°. 4, Z es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 66, 67, 68,69 o 70 de la SEC ID n°. 10, y V es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 78, 79, 80, 81, 82,83 o 84 de la SEC ID n°. 10.

20.: Variante según la forma de realización 18 o 19, donde X es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 48 e Y el residuo de aminoácido que ocupa la posición 51 de la SEC ID No 4 y Z es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 70 y V el residuo de aminoácido que ocupa la posición 78 en la SEC ID No 10.

21.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, en la que al menos uno de los residuos de aminoácidos de la aamilasa parental, que están presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 195-202 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n°. 4, ha sido delecionado o sustituido con uno o más de los residuos de aminoácido que está/están presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 165-177 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10, o donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sido adicionado/s usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

22.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de la SEC ID No 4, dicha región con al menos 80%, tal como 90% de homología de secuencia con la parte de la SEC ID No 10 que se extiende del residuo Z al residuo V de la SEC ID no 10, donde X es el aminoácido que ocupa la posición 195 o 196 de la SEC ID n°. 4, Y es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 198, 199, 200, 201, o 202 de la SEC ID n°. 4, Z es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 165 o 166 de la SEC ID n°. 10, y V es el residuo de aminoácido que ocupa la posición 173, 174, 175,176 o 177 de la SEC ID n°. 10.

23.: Variante según la forma de realización 21 o 22, donde el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde los residuos de aminoácido 196-198 de la SEC ID n°. 4, ha sido sustituido por el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 166-173 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10.

24.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, donde la variante de al menos uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, que están presentes en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácido 117-185 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n°. 4, ha sido delecionado o sustituido con uno o más de los residuos de aminoácidos, que está/están presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 98210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10, o donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sido adicionado/s usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

25.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de la SEC ID No 4, dicha región con al menos 80%, tal como al menos 90% de homología de secuencia con la parte de la SEC ID No 10 que se extiende desde el residuo Z al residuo V de la SEC ID No 10, donde X es el aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119,120 o 121 de la SEC ID n°. 4, Y es el aminoácido que ocupa la posición 181, 182, 183,184 o 185 de la SEC ID n°. 4, Z es el aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101,102 de la SEC ID n°. 10, y V es el aminoácido que ocupa la posición 206, 207, 208,209 o 210 de la SEC ID n°. 10.

26.: Variante según la forma de realización 24 o 25, donde un fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácidos 121-181 de la SEC ID n°. 4, ha sido sustituido con el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 102-206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10.

27.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, donde la variante al menos de uno de los residuos de aminoácidos de la a-amilasa parental, que está presente en un fragmento correspondiente al fragmento de aminoácido 117181 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n°. 4, ha sido delecionado o sustituido por uno o más de los residuos de aminoácidos, que está/están presente/s en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 98206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10, o donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sido adicionado/s usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

28.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de la SEC ID No 4, dicha región teniendo al menos 80%, tal como al menos 90% de homología de secuencia con la parte de la SEC ID No 10 que se extiende desde el residuo Z al residuo V de la SEC ID No 10, donde X es el aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119,120 o 121 de la SEC ID n°. 4, Y es el aminoácido que ocupa la posición 174, 175,176 o 177 de la SEC ID n°. 4, Z es el aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100, 101,102 de la SEC ID n°. 10, y V es el aminoácido que ocupa la posición 199, 200,201 o 202 de la SEC ID n°. 10.

29.: Variante según la forma de realización 27 o 28, donde el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácidos 121-174 de la SEC ID n°. 4, ha sido sustituido con el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 102-199 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10.

30.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, en la que al menos uno de los residuos de aminoácidos de la aamilasa parental, que están presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 12-19 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID n°. 4, ha sido delecionado o sustituido con uno o más de los residuos de aminoácidos, que está/están presente/s en un fragmento de aminoácido que corresponde al fragmento de aminoácido 28-42 de la SEC ID n°. 10, o donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sido insertado/s usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

31.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de la SEC ID Nº 4, dicha región teniendo al menos 80%, tal como al menos 90% de homología de secuencia con la parte de la SEC ID Nº 10 que se extiende del residuo Z al residuo V de la SEC ID nº 10, donde

X es el aminoácido que ocupa la posición 12,13 o 14 de la SEC ID n°. 4, Y es el aminoácido que ocupa la posición 15, 16, 17,18 o 19 de la SEC ID n°. 4, Z es el aminoácido que ocupa la posición 28, 29, 30,31 o 32 de la SEC ID n°. 10, y V es un residuo de aminoácido correspondiente al aminoácido que ocupa la posición 38, 39, 40,41 o 42 de la SEC ID n°. 10.

32.: Variante según la forma de realización 30 o 31, donde el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácido 14-15 de la SEC ID n°. 4, ha sido sustituida por el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 32-38 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10.

33.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, en la que al menos uno de los residuos de aminoácidos de la aamilasa parental, que están presentes en un fragmento correspondiente a los residuos de aminoácido 7-23 de la secuencia de aminoácido de la SEC ID n°. 4, ha sido delecionado o sustituido con uno o más residuos de aminoácidos, que está/están presente/s en un fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácidos 13-45 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10, o en la que uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sidos insertado/s usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

34.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de SEC ID Nº 4, dicha región teniendo al menos 80%, tal como al menos 90% de homología de secuencia con la parte de SEC ID Nº 10 que se extiende del residuo Z al residuo V de SEC ID Nº 10, donde X es el aminoácido que ocupa la posición 7 o 8 de la SEC ID n°. 4, Y es el aminoácido que ocupa la posición 18, 19, 20, 21,22 o 23 de la SEC ID n°. 4, Z es el aminoácido que ocupa la posición 13 o 14 de la SEC ID n°. 10, y V es el aminoácido que ocupa la posición 40, 41, 42, 43,44 o 45 de la SEC ID n°. 10.

35.: Variante según la forma de realización 33 o 34, donde el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácido 8-18 de la SEC ID n°. 4, ha sido sustituida con el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 14-40 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10.

36.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, en la que al menos uno de los residuos de aminoácidos de la aamilasa parental, que están presentes en un fragmento correspondiente a los residuos de aminoácido 322-346 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n°. 2, ha sido delecionado o sustituido por uno o más residuos de aminoácidos, que está/están presente/s en un fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 291-313 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10, o en donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sido insertados usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 10 o una parte correspondiente de otra a-amilasa de tipo Fungamyl como un molde.

37.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de SEC ID Nº 2, dicha región teniendo al menos 80% de homología de secuencia con la parte de SEC ID Nº 10 que se extiende del residuo Z al residuo V de la SEC ID Nº 10, donde X es el aminoácido que ocupa la posición 322, 323,324 o 325 de la SEC ID n°. 2, Y es el aminoácido que ocupa la posición 343, 344,345 o 346 de la SEC ID n°. 2, Z es el aminoácido que ocupa la posición 291, 292,293 o 294 de la SEC ID n°. 10, y V es el aminoácido que ocupa la posición 310, 311,312 o 313 de la SEC ID n°. 10.

38.: Variante según la forma de realización 36 o 37, en la que el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácido 325-345 de SEC D n°. 2, ha sido sustituido con el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 294-313 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10.

39.: Variante de una a-amilasa parental de tipo Fungamyl, en la que al menos uno de los residuos de aminoácidos de la aamilasa parental, que está presente en un fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 291-313 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID n°. 10, ha sido delecionado o sustituido con uno o más de los residuos de aminoácidos, que está/están presente/s en un fragmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácido 98210 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 4, o en donde uno o más residuos de aminoácidos adicionales ha/han sido insertados usando la parte pertinente de la SEC ID n°. 4 o una parte correspondiente de otra aamilasa tipo Termamyl como un molde.

40.: Variante de una a-amilasa parental de tipo Fungamyl, esta variante tiene una región que, cuando la secuencia de

aminoácidos de la variante se alinea más cercanamente con la secuencia de aminoácidos de dicha a-amilasa parental, ocupa la misma posición que la parte del residuo X al residuo Y de SEC ID Nº 10, dicha región teniendo al menos 80%, tal como al menos 90% de homología de secuencia con la parte de la SEC ID Nº 10 que se extiende del residuo Z al residuo V de la SEC ID Nº 4, donde X es el aminoácido que ocupa la posición 117, 118, 119,120 o 121 de la SEC ID n°. 10, Y es el aminoácido que ocupa la posición 181, 182, 183,184 o 185 de la SEC ID n°. 10, Z es el aminoácido que ocupa la posición 98, 99, 100,101 o 102 de la SEC ID n°. 4, y V es el aminoácido que ocupa la posición 206, 207, 208,209 o 210 de la SEC ID n°. 4.

41.: Variante según la forma de realización 39 o 40, en la que el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácido 121-181 de la SEC ID n°. 10, ha sido sustituido por el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 102-206 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 4.

42.: Variante según cualquiera de las formas de realización 39-41, en la que el fragmento de aminoácido de la a-amilasa parental, que corresponde a los residuos de aminoácidos 121-174 de la SEC ID n°. 10, ha sido sustituido por el fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 102-199 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 4.

43.: Variante de una a-amilasa parental de tipo Fungamyl, en la que un fragmento de aminoácido correspondiente a los residuos de aminoácido 181-184 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n°. 10 ha sido delecionada.

45.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, que muestra actividad de a-amilasa y que tiene una disminuida dependencia de Ca2+ en comparación con la a-amilasa parental.

46.: Variante según la forma de realización 45, que comprende una mutación en una posición correspondiente al menos a una de las posiciones siguientes en la SEC ID Nº 2: N104; A349,1479; L346,1430; N457; K385; F350,1411; H408 o G303, en particular una mutación que corresponde a N104D; A349C+I479C; L346C+I430C; N457D,E N457D,E+K385R; F350D,E+I430R,K F350D,E+I411R,K H408Q,E,N,D y/o G303N,D,Q,E.

47.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental que muestra una actividad más alta por debajo del pH óptimo que la a-amilasa parental, esta variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido correspondiente al menos a una de las posiciones siguientes de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No 2): E336; Q333; P331,1236; V102; A232; I103; L196, en particular al menos una de las siguientes mutaciones: E336R,K Q333R,K P331R,K V102R, K, A, T, S, G I236K,R,N I103K,R L196K,R y/o A232T,S,G.

48.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental que muestra una actividad más alta por encima del pH óptimo que la a-amilasa parental, esta variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido correspondiente al menos a una de las posiciones siguientes de a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No 2): N236; H281 y/o Y273, en particular una de las siguientes mutaciones: N326I, Y, F, L, V,V H281F,I,L y/o Y273F, W.

49.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental que muestra actividad de a-amilasa y que tiene una termostabilidad aumentada y/o temperatura alterada óptima en comparación con la a-amilasa parental, esta variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido correspondiente al menos a una de las siguientes posiciones de la aamilasa de B. licheniformis (SEC ID No 2): L61; Y62; F67; K106; G145; I212; S151; R214; Y150; F143; R146; L241; I236, L7; V259; F284; F350; F343; L427 y/o V481,

en particular al menos una de las siguientes mutaciones: L61W,V,F Y62W; F67W; K106R,F,W G145F, W I212F, L, W, Y, R, K S151 sustituido con cualquier otro residuo de aminoácido y en particular con F,W,I o L; R214W; Y150R,K F143W; R146W; L241I,F,Y,W I236L, F, W, Y L7F, I, W V259F, I, L F284W; F350W; F343W; L427F,L,W y/o V481, F, I, L, W.

50.: Variante de una a-amilasa de tipo Termamyl parental, que muestra actividad de a-amilasa y que tiene una capacidad reducida de cortar un sustrato de oligosacárido cerca del punto de ramificación en comparación con la a-amilasa parental, esta variante comprende una mutación de un residuo de aminoácido correspondiente al menos a una de las siguientes posiciones de a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID No 2): V54; D53; Y56; Q333 y/o G57, en particular al menos una de las siguientes mutaciones: V54L, I, F, Y, W, R, K, H, E, Q D53L, I, F, Y, W Y,56W; Q333W; y/o G57 a todos los residuos de aminoácidos posibles.

51.: Variante según cualquiera de las formas de realización 17-50, donde uno o más residuos de prolina presentes en los residuos de aminoácidos con el cual la a-amilasa parental es modificada se sustituyen por un residuo no prolina tal como alanina.

52.: Variante según cualquiera de las formas de realización 17-51, donde uno o más residuos de cisteína presentes en los residuos de aminoácidos con los cuales la a-amilasa parental es modificada se sustituye/n por un residuo de no cisteína tal como alanina.

53.: Construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17-52.

54.: Vector de expresión recombinante que lleva una construcción de ADN según la forma de realización 53.

55.: Célula que se transforma con una construcción de ADN según la forma de realización 53 o un vector según la forma de realización 54.

56.: Célula según la forma de realización 55, que es un microorganismo.

57.: Célula según la forma de realización 56, que es una bacteria o un hongo.

58.: Célula según la forma de realización 57, que es una bacteria gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis.

59.: Uso de una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17-52 para el lavado y/o lavavajillas.

60.: Uso de una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17-52 para desencolado.

61.: Uso de una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17-52 para licuefacción de almidón.

62.: Aditivo de detergente que comprendie una variante de a-amilasa según cualquiera de formas de realización 17-52, opcionalmente en forma de un granulado no polvoriento, líquido estabilizado o enzima protegida.

63.: Aditivo de detergente según la forma de realización 62 que contiene 0.02-200 mg de enzima proteína/g del aditivo.

64.: Aditivo de detergente según la forma de realización 62 o 63, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

65.: Composición de detergente que comprende una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17

52.

66.: Composición de detergente según la forma de realización 65 que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

67.: Composición de detergente para lavavajillas automático o a mano que comprende una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17-52.

68.: Composición de detergente para lavavajillas según la forma de realización 67 que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

69.: Composición para el lavado de ropa automático o a mano que comprende una variante de a-amilasa según cualquiera de las formas de realización 17-52.

70.: Composición para el lavado de ropa según la forma de realización 69, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una enzima amilolítica y/o una celulasa.

REFERENCIAS CITADAS

[0262] Klein, C., et al., Biochemistry 1992, 31, 8740-8746 , Mizuno, H., et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283 , Chang, C., et al, J. Mol. Biol. (1993) 229, 235-238 , Larson, S.B., J. Mol. Biol. (1994) 235, 1560-1584 , Lawson, C.L., J. Mol. Biol. (1994) 236, 590-600 , Qian, M., et al., J. Mol. Biol. (1993) 231, 785-799 , Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 527-535 , Swift, H.J., et al., Acta crystallogr. sect. B, 47, 535-544

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LISTADO DE SECUENCIAS

[0263] En las siguientes SEC ID Nos: 1, 3, 5 se ilustra la secuencia codificante 5' y la secuencia 3' de los genes de aamilasa pertinentes. La secuencia 5' es la primera parte separada de la secuencia escrita en letras minúsculas, la secuencia codificante es la parte intermedia de la secuencia, en la cual la secuencia señal está escrita en letras minúsculas y la secuencia que codifica la a-amilasa madura está escrita en letras mayúsculas, y la secuencia 3' es la tercera parte separada de la secuencia escrita en letras minúsculas.

LISTA DE SECUENCIAS [0256]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Variante de una alfa-amilasa parental de tipo Termamyl, que presenta actividad de alfa-amilasa y que tiene una dependencia de iones de calcio disminuida con respecto a la alfa-amilasa parental, que comprende una mutación en una

5 posición que corresponde a al menos una de las siguientes posiciones en la SEC ID No: 2: N104, A349, 1479, L346, I430, N457, K385, F350, 1411, H408 o G303.
2. Variante segun la reivindicación 1, que comprende una mutación que corresponde a N104D; A349C+1479C;

L346C+1430C; N457D,E; N457D,E+K385R; F350D,E+1430R,K; F350D,E+1411R,K; H408Q,E,ND; y/o G303N,D,Q,E. 10
3. Construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. Vector de expresión recombinante que porta una construcción de ADN según la reivindicación 3. 15
5.

Célula que se transforma con una construcción de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4.
6.

Uso de una variante de alfa-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para el lavado y/o para lavavajillas,

desencolado o liquefacción de almidón. 20
7. Aditivo de detergente, composición de detergente, composición de detergente para lavavajillas a mano o automático, o composición para el lavado de ropa comprendiendo una variante de alfa-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1
2.