ES2517245T3 - Enzimas para el tratamiento de almidón - Google Patents

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Abstract

Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, a) donde el módulo catalítico es una secuencia de alfa-amilasa derivada de la alfa-amilasa de Aspergillus niger y tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº.:8 y, b) donde el módulo de unión a carbohidratos consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 25 o un CBM con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos.

Description

Enzimas para el tratamiento de almidón
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una enzima que comprende un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. La enzima puede ser un híbrido entre un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y una alfa-amilasa o la enzima puede ser una variante de una enzima progenitora comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. La invención también se refiere al uso de la enzima en un proceso de licuefacción de almidón en el que almidón se degrada en fragmentos más pequeños de oligo- y/o polisacáridos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Un gran número de enzimas y procesos se han descrito para convertir almidón en hidrolizados de almidón, tal como maltosa, glucosa o jarabes de especialidad, bien para uso como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tal como fructosa. Glucosa puede también ser fermentada a etanol u otros productos de fermentación, tales como ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona, o eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; cetonas; aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), penicilina, tetraciclina, enzimas, vitaminas, tal como riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas.
[0003] El almidón es un polímero de peso molecular alto que consiste en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste en aproximadamente 80 % de amilopectina y 20 % de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el que cadenas lineales de residuos de alfa-1,4 D-glucosa se unen por enlaces alfa-1,6 glucosídicos.
[0004] La amilosa es un polisacárido lineal hecho de unidades de D-glucopiranosa unidas por enlaces alfa-1,4 glucosídicos. En el caso de la conversión del almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado. El proceso de despolimerización convencional consiste en un paso de gelatinización y dos pasos de proceso consecutivos, a saber, un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.
[0005] El almidón granular consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando un compuesto de almidón acuoso se calienta, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento espectacular en la viscosidad. Como el nivel de sólidos es de 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser diluido o "licuado" de modo que puede ser manejado. Esta reducción en la viscosidad se obtiene hoy principalmente por degradación enzimática. Durante el paso de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades lineales y más pequeñas ramificadas (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción se realiza típicamente a aproximadamente 105-110°C durante aproximadamente de 5 a 10 minutos seguidos de aproximadamente a 1-2 horas a aproximadamente 95°C. La temperatura se disminuye luego a 60°C, una glucoamilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa se agregan, y el proceso de sacarificación sigue durante aproximadamente 24 a 72 horas.
[0006] Será evidente de la discusión anterior que el proceso de conversión de almidón convencional consume mucha energía debido a los requisitos diferentes en cuanto a temperatura durante los distintos pasos. Es así deseable poder seleccionar y/o diseñar las enzimas usadas en el proceso de modo que el proceso total puede ser realizado sin tener que gelatinizar el almidón. Tales procesos son el sujeto de las patentes US4591560, US4727026 y US4009074 y EP0171218, y la solicitud de patente danesa PA 2003 00949. Kaneko Akihiro et al., 1996 (Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 81, No 4, p. 292-298) describe la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una alfa-amilasa ácida estable derivada de Aspergillus kawachii. Nagasaka, Y. et al., 1995 (Applied Microbiology and Biotechnology, 44 (3-4): p. 451-458) describe la clonación y la expresión en levadura de la glucoamilasa Athelia rolfsii. La presente invención divulga una nueva enzima híbrida y una modificación genética de una enzima de tipo salvaje diseñada para este tipo de procesos y que comprende una secuencia de aminoácidos de un CBM y una secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de almidón fúngica. Enzimas híbridas son el sujeto de WO9814601, WO0077165 y solicitud de patente danesa PA 2003 00949.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0007] La invención proporciona en un primer aspecto una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, a) donde el módulo catalítico es una secuencia de alfa-amilasa derivada de la alfa-amilasa ácida Aspergillus niger y tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia mostrada en SEC ID
NO:8; y, b) donde el módulo de unión a carbohidratos tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:25 o un CBM con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mencionada antes.
[0008] En otros aspectos, la invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un vector de expresión comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, y una célula huésped transformada con un vector; esta célula huésped es capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto.
[0009] En un sexto aspecto la invención proporciona un método para almidón licuefactante, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular se trata en medio acuoso con la enzima híbrida del primer aspecto de la invención.
[0010] En un séptimo aspecto la invención proporciona un proceso preparar un producto basado en masa que comprende la adición de la enzima híbrida del primer aspecto respecto a una masa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0011] El término "almidón granular" se entiende como almidón crudo sin cocer, es decir, almidón que no ha sido sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como gránulos ínfimos insolubles en agua. Estos gránulos se conservan en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se pone en agua fría, los granos pueden absorber una pequeña cantidad del líquido. Hasta de 50°C a 70°C el hinchamiento es reversible, el grado de reversibilidad depende del almidón particular. Con temperaturas más altas un hinchamiento irreversible llamado gelatinización empieza.
[0012] El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura mínima en la que gelatinización del almidón comienza. Almidón calentado en agua empieza a gelatinizar entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede determinarse fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según las especies de planta, la variedad particular de las especies de planta al igual que con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura en la que birrefringencia se pierde en 5 % de los gránulos de almidón que usan el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Stärke, Vol. 44 (12) pp. 461-466 (1992).
[0013] El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles de los procesos de la invención y puede comprender mono-, di-y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de estas. Preferiblemente al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de los sólidos secos del almidón granular se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.
[0014] El término "homología" de polipéptido se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia desde la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tal como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Los siguientes ajustes para comparación de secuencia de aminoácidos se usan: penalización de creación de GAP de 3,0 y penalización de extensión de GAP de 0,1. La parte pertinente de la secuencia de aminoácidos para la determinación de homología es el polipéptido maduro, es decir, sin el péptido señal.
Enzimas híbridas
[0015] La presente invención se refiere a enzimas híbridas tal y como se define en la reivindicación 1. Números de clasificación enzimáticos (números EC) referidos en la presente especificación con reivindicaciones están en conformidad con Recommendations (1992) del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry y Molecular Biology, Academic Press Inc, 1992.
[0016] Enzimas híbridas o unas enzimas de tipo salvaje genéticamente modificadas, como denominadas en este caso, incluyen especies comprendiendo una secuencia de aminoácidos de una enzima alfa-amilolítica (EC 3.2.1.1) enlazada (es decir, unida de manera covalente) a una secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM).
[0017] Enzimas híbridas conteniendo CBM, al igual que descripciones detalladas de la preparación y purificación de estas, se conocen en la técnica [ver, por ejemplo, WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, al igual que Greenwood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295-1305]. Pueden, por ejemplo, prepararse por trasformación en una célula huésped de una construcción de ADN comprendiendo al menos un fragmento de ADN que codifica el módulo de unión a carbohidratos ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que
codifica la enzima de interés, y cultivando la célula huésped transformada para expresar el gen fundido. El producto resultante recombinante (enzima híbrida), frecuentemente referida a en la técnica como un "proteína de fusión", puede describirse por la siguiente fórmula general:
A-CBM-MR-X
[0018] En la fórmula anterior, un-CBM es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos comprendiendo al menos el módulo de unión a carbohidratos (CBM) per se. MR es la región mediana (el "enlazador") y X es la secuencia de residuos de aminoácidos de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que codifica la enzima (o otra proteína) al que el CBM debe unirse.
[0019] La fracción A puede estar bien ausente (de manera que un-CBM es un CBM per se, es decir, no comprende ninguno de los residuos de aminoácidos otros que aquellos que constituyen el CBM) o puede ser una secuencia de uno o más residuos de aminoácido (funcionando como una extensión terminal del CBM per se). El enlazador (MR) puede ser un enlace, o un grupo de conexión corto comprendiendo de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular, de 2 a 40 átomos de carbono. No obstante, el MR es preferiblemente una secuencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 2 a 40 residuos de aminoácidos, tal como de 2 a 15 residuos de aminoácidos.
[0020] La fracción X puede constituir la región N-terminal o C-terminal de la enzima híbrida global.
[0021] Será así evidente como arriba que el CBM en una enzima híbrida del tipo en cuestión puede situarse Cterminalmente, N-terminal o internamente en la enzima híbrida.
Secuencia enlazadora
[0022] La secuencia enlazadora puede ser cualquier secuencia enlazadora adecuada. En formas de realización preferidas, la secuencia enlazadora deriva de AMG de Athelia rolfsii, del AMG de A. niger o de la alfa-amilasa de A. kawachii tal como una secuencia enlazadora seleccionada de la lista que consiste en enlazador AMG de A. niger: T G G T T T T A T P T G S G S V T S T S K T T A T A S K T S T S T S S T S A (SEC ID NO:26), enlazador de alfaamilasa de A. kawachii: T T T T T T A A A T S T S K A T T S S S S S S A A A T T S S S (SEC ID NO:27), enlazador AMG de Atalia rolfsii: G A T S P G G S S G S (SEC ID NO:28), y el enlazador PEPT: P E P T P E P T (SEC ID NO:29). En otra forma de realización preferida, las enzimas híbridas tienen una secuencia enlazadora que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID NO:26, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, o SEC ID NO:29 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.
Módulos de unión a carbohidratos
[0023] Un módulo de unión a carbohidratos (CBM), o como frecuentemente es referido, un dominio de unión a carbohidratos (CBD), es una secuencia de aminoácidos de polipéptidos que se une preferentemente a un poli u oligosacárido (carbohidrato), frecuentemente, pero no necesariamente exclusivamente, a una forma insoluble en agua (incluyendo cristalino) de esta.
[0024] CBM derivados de enzimas que degradan almidón son frecuentemente referidos como módulos de unión a almidón o SBM (CBM que pueden ocurrir en determinadas enzimas amilolíticas, tales como glucoamilasas determinadas, o en enzimas tales como ciclodextrin glucanotransferasas, o en alfa-amilasas). Asimismo, otras subclases de CBM abarcarían, por ejemplo, módulos de enlace de celulosa (CBM de enzimas celulolíticas), módulos de unión de quitina (CBM que típicamente ocurren en quitinasas), módulos de unión de xilano (CBM que típicamente ocurren en xilanasas), módulos de unión de manano (CBM que típicamente ocurren en mananasas). SBM son frecuentemente referidos como SBD (dominios de unión de almidón)
[0025] CBM se encuentran como partes integrales de polipéptidos grandes o proteínas que consisten en dos o más regiones de secuencia de aminoácidos de polipéptidos, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) que típicamente comprenden un módulo catalítico con el sitio activo para hidrólisis de sustrato y un módulo de unión a carbohidratos (CBM) para unión al sustrato del carbohidrato en cuestión. Tales enzimas pueden comprender más de un módulo catalítico y uno, dos o tres CBM, y opcionalmente además comprenden una o más regiones de secuencia de aminoácidos de polipéptidos que conectan el CBM(s) con el módulo(s) catalítico, una región del último tipo normalmente denominado "enlazador". Ejemplos de enzimas hidrolíticas comprendientdo un CBM, algunos de los cuales ya se han mencionado anteriormente, son celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. CBM se han encontrado también en algas, por ejemplo, estarle en la alga roja Porphyra purpurea en forma de una proteína de unión de polisacáridos no hidrolítica.
[0026] En la proteínas/polipéptidos en los que CBM ocurren (p. ej. enzimas, típicamente enzimas hidrolíticas), un CBM se puede localizar en el N o C terminal o en una posición interna.
[0027] Esta parte de un polipéptido o proteína (p. ej. enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se típicamente consiste en más de aproximadamente 30 y menos de aproximadamente 250 residuos de aminoácidos. El "Módulo de Unión a Carbohidratos de Familia 20" o un módulo CBM-20 se define en el contexto de esta invención como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos con al menos 45 % de homología al módulo de unión a carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol. Lett. 19:10271031. El CBM comprende los últimos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia de aminoácidos 582 a aminoácido 683. La numeración de Familias de Hidrolasa Glucósida aplicada en esta descripción sigue el concepto de Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - servidor Carbohydrate-Active Enzymes en la URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/?cazy/CAZY/index.html o alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and
T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23 , and Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.
[0028] Ejemplos de enzimas que comprenden un CBM son alfa-amilasas, alfa-amilasas maltogénicas, celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. Además, CBM incluyen CBM que derivan de glucoamilasas (EC 3.2.1.3) o de CGTasas (EC 2.4.1.19).
[0029] CBMs que derivan de fuentes fúngicas, bacterianas o de planta generalmente servirán para usarse en el contexto de la presente divulgación. Se prefieren CBMs de origen fúngico. A este respecto, técnicas adecuadas para el aislamiento de los genes pertinentes se conocen bien en la técnica.
[0030] CBMs según la divulgación puede ser de la Familia de Módulo de Unión a Carbohidratos 20. CBMs de la Familia de Módulo de Unión a Carbohidratos 20 se pueden derivar de glucoamilasas de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537), Aspergillus kawachii (SWISSPROT P23176), Aspergillus niger (SWISSPROT P04064), Aspergillus orizae (SWISSPROT P36914), de alfa-amilasas de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370), Aspergillus nidulans (NCBI AAF17100.1), de beta-amilasas de Bacillus cereus (SWISSPROT P36924), o de CGTases de Bacillus circulans (SWISSPROT P43379). Se prefiere según la presente divulgación un CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370) al igual que CBMs teniendo al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso al menos 90 % de homología respecto al CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370), es decir un CBM con al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso al menos 90 % de homología a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6. También se prefieren según la divulgación CBMs de la Familia de Módulo de Unión a Carbohidratos 20 con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, y SEC ID NO:11 y descrito en la solicitud de patente danesa PA 2003 00949 como SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3 respectivamente. Además CBMs incluyen CBMs de la glucoamilasa de Hormoconis sp. tal como de Hormoconis resinae (Sin. hongo de creosota o Amorfoteca resinae) tal como el CBM de SWISSPROT:Q03045 (SEC ID NO:12), de Lentinula sp. tal como de Lentinula edodes (hongo shiitake) tal como el CBM de SPTREMBL:Q9P4C5 (SEC ID NO:13), de Neurospora sp. tal como de Neurospora crassa tal como el CBM de SWISSPROT:P14804 (SEC ID NO:14), de Talaromyces sp. tal como de Talaromyces bissoclamidioides tal como el CBM de NN005220 (SEC ID NO:15), de Geosmitia sp. tal como de Geosmitia cilindrospora, tal como el CBM de NN48286 (SEC ID NO:16), de Scorias sp. tal como de Scorias spongiosa tal como el CBM de NN007096 (SEC ID nº: 17), de Eupenicillium sp. tal como de Eupenicillium ludwigii tal como el CBM de NN005968 (SEC ID NO:18), de Aspergillus sp. tal como de Aspergillus japonicus tal como el CBM de NN001136 (SEC ID NO:19), de Penicillium sp. tal como de Penicillium cf. miczynskii tal como el CBM de NN48691 (SEC ID NO:20), de Mz1 Penicillium sp. tal como el CBM de NN48690 (SEC ID NO:21), de Thysanophora sp. tal como el CBM de NN48711 (SEC ID NO:22), y de Humicola sp. tal como de Humicola grisea var. thermoidea tal como el CBM de SPTREMBL:Q12623 (SEC ID NO:23). Un CBM más preferido incluye el CBM de la glucoamilasa de Atelia sp. tal como de Atelia rolfsii, tal como SEC ID NO:25. También preferido para la invención es cualquier CBD con al menos 90 % de homología para cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CBD mencionadas anteriormente.
[0031] Otros CBMs adecuados de la Familia de Módulo de Unión a Carbohidratos 20 se puede encontrar en la URL: http://afmb.cnrs- mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html).
[0032] Una vez que una secuencia de nucleótidos que codifica la región de enlace de sustratos (enlace de carbohidratos) ha sido identificada, bien como ADNc o ADN cromosómico, puede luego ser manipulada en una variedad de maneras para fundir esta a una secuencia de ADN que codifica la enzima de interés. El fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de enlace de carbohidratos, y el ADN que codifica la enzima de interés son luego ligados con o sin un enlazador. El ADN resultante ligado puede luego ser manipulado en una variedad de vías para conseguir la expresión.
Secuencia alfa-amilolítica
[0033] Alfa-amilasas (en particular alfa-amilasas estables ácidas) que son apropiadas como la base para híbridos de CBM/amilasa de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen aquellas de origen fúngico.
[0034] Preferiblemente la alfa-amilasa es una enzima de tipo salvaje.
[0035] Alfa-amilasas pertinentes incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenibles de la especie de Aspergillus, en particular de Aspergillus niger, tal como una alfa-amilasa estable ácida (SWISSPROT P56271), descrita con más detalle en WO 8901969 (ejemplo 3) y con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:8 y/o codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO:7. También se prefieren secuencias de alfa-amilasa con más de un 90 % de homología respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:8 y/o codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO:7.
[0036] En una forma de realización la enzima híbrida comprende una secuencia alfa-amilolítica derivada del módulo catalítico de alfa-amilasa ácida A.niger con la secuencia mostrada en la SEC ID NO:8, y/o una secuencia enlazadora derivada de la alfa-amilasa A. kawachii o la A. rolfsii AMG, y/o el CBM está derivado de la alfa-amilasa A. kawachii, AMG A. rolfsii o AMG A.niger. En una forma de realización particularmente preferida la enzima híbrida comprende el módulo catalítico de alfa-amilasa ácida A.niger con la secuencia mostrada en SEC ID NO:8 y el enlazador de amilasa alfa A. kawachii y CBM (SEC ID NO:6).
[0037] Preferiblemente la enzima híbrida comprende una secuencia CBD con al menos 90 % de homología respecto a las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID nº: 25. Incluso de manera más preferida, la enzima híbrida comprende una secuencia CBD con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 25. En otra forma de realización preferida la secuencia CBM tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 25 en no más de 10 posiciones de aminoácido, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición. En una forma de realización más preferida la enzima híbrida comprende un CBM derivado de un AMG de
A. rolfsii, tal como el AMG de A. rolfsii AHU 9627 descrita en la patente estadounidense 4,727,026.
[0038] En particular tal forma de realización según la presente divulgación la enzima híbrida tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:32, SEC ID NO:34 o SEC ID NO:38 o la enzima híbrida tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso al menos 90 % de homología para cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas antes.
[0039] En otra forma de realización particular las enzimas híbridas tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:32, SEC ID NO:34, SEC ID NO:36, SEC ID NO:38 o SEC ID NO:40 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.
Vectores de expresión
[0040] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que pueden comprender una secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida o una enzima de tipo salvaje modificada genéticamente, un promotor, una secuencia de péptido señal y señales traduccionales y transcripcionales de parada. Los varios ADN y secuencias de control anteriormente descritos pueden juntarse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir inserción o sustitución de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, la secuencia de ADN de la presente invención se puede expresar por inserción de la secuencia de ADN o una construcción de ADN comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante se une operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión, y posiblemente secreción.
[0041] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej. un plásmido o virus), que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión de la secuencia de ADN. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, un cósmido o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el cromosoma(s) en el que ha sido integrado. El sistema de vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
Marcadores
[0042] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables, que permiten selección fácil de células transformadas. Una etiqueta seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona para resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía para auxótrofos y similares.
[0043] Ejemplos de marcadores seleccionables para uso en una célula huésped de hongo filamentoso pueden ser seleccionados del grupo incluyendo, pero no limitado a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niad (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), frpC (antranilato sintasa), y marcadores de resistencia de glufosinato, al igual que equivalentes de otras especies. Preferido para uso en una célula de Aspergillus son los marcadores amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador de bar de Streptomyces hygroscopicus. Además, selección se puede realizar por cotransformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está sobre un vector separado.
[0044] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento(s) que permite integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula.
[0045] Los vectores de la presente invención se pueden integrar en el genoma de la célula huésped cuando se introducen en una célula huésped. Para integración, el vector puede depender de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés o cualquier otro elemento del vector para integración estable del vector en el genoma por homólogos o ninguna recombinación homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de ADN adicionales para dirigir integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ADN adicionales permiten al vector integrarse en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es) precisa en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de ADN, tal como de 100 a 1500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1500 pares de bases, y de forma más preferida de 800 a 1500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia blanco correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ADN codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no-homóloga. Estas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a una secuencia blanco en el genoma de la célula huésped, y, además, pueden ser secuencias codificantes o no codificantes.
[0046] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación permitiendo al vector replicar de manera autónoma en la célula huésped en cuestión.
[0047] El episómico replicando el AMA1 vector plásmido descrito en WO 00/24883 se puede usar.
[0048] Más de una copia de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se puede insertar en la célula huésped para amplificar expresión de la secuencia de ADN. Amplificación estable de la secuencia de ADN se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped usando métodos bien conocidos en la técnica y selección para transformantes.
[0049] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York).
Células huésped
[0050] La célula huésped de la invención, bien comprendiendo una construcción de ADN o un vector de expresión comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida o una enzima de tipo salvaje genéticamente modificada, se usa ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante de la enzima híbrida o una enzima de tipo salvaje genéticamente modificada. La célula se puede transformar con un vector de expresión. Alternativamente, la célula se puede transformar con la construcción de ADN de la invención codificando la enzima híbrida o una enzima de tipo salvaje genéticamente modificada, convenientemente integrando la construcción de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Integración de la construcción de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homóloga o heteróloga.
[0051] La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota apropiada, por ejemplo, una célula bacteriana, una célula de hongo filamentoso, una célula vegetal o una célula mamífera.
[0052] En una forma de realización preferida, la célula huésped es un hongo filamentoso representado por los siguientes grupos de Ascomycota, incluyendo, por ejemplo, Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus).
[0053] En una forma de realización más preferida, el hongo filamentoso incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al. en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK. Los hongos filamentosos se caracterizan por el hecho de un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. Crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico.
[0054] En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una especie de, pero no limitado a, una célula seleccionada del grupo que consiste en una cepa de una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, o una cepa de Bacillus, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto llamada Gribberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum f. sp. cerealis), o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto llamada Gribberella zeae, sinónimo de Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum y Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crookwellense),
o Fusarium venenatum.
[0055] En una forma de realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una cepa de una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, o Aspergillus niger.
[0056] La célula huésped puede ser una célula huésped de hongo filamentoso de tipo salvaje o una variante, un mutante o una célula huésped de hongo filamentoso genéticamente modificada. En una forma de realización preferida de la invención, la célula huésped es una proteasa deficitaria o cepa menos de proteasa. También específicamente contemplado es cepas de Aspergillus, tales como cepas de Aspergillus niger, genéticamente modificadas para disgregar o reducir expresión de glucoamilasa, alfa-amilasa ácida estable, alfa-1,6 transglucosidasa y actividades de proteasa.
Transformación de células huésped de hongo filamentoso
[0057] Células huésped de hongo filamentoso se pueden transformar por un proceso implicando formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular en una manera conocida en la técnica. Procedimientos adecuados para transformación de células huésped de Aspergillus se describen en EP 238 023, EP 184 438, y Yelton et al. 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Un método adecuado de transformación de especies de Fusarium se describe por Malardier et al. 1989, Gene 78:147156 o US 6,060,305.
Aislamiento y clonación una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora
[0058] Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de estos. La clonación de las secuencias de ADN de la presente invención de tal ADN genómico puede efectuarse, por ejemplo, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de AND tales como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en secuencia de ADN (NASBA) pueden utilizarse.
[0059] La secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora se puede aislar de cualquier célula o microorganismo que produce la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o genoteca de ADNc debería ser construido usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la alfa-amilasa que va a ser estudiada. Luego, si la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa se conoce, sondas oligonucleótidas marcadas se pueden sintetizar y usar para identificar clones codificadores de alfa-amilasa de una genoteca genómica obtenida a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótidos marcada con secuencias homólogas a otro gen de alfa-amilasa conocido podría usarse como una sonda par identificar clones codificadores de alfa-amilasa, usando hibridación y condiciones de lavado de astringencia muy baja a muy alta.
[0060] Otro método para identificar clones codificadores de alfa-amilasa implicaría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar las bacterias negativas de alfa-amilasa con la biblioteca de ADN genómico resultante, y luego colocar placas de bacterias transformadas sobre agar con un
sustrato para alfa-amilasa (es decir, maltosa), permitiendo así a los clones expresar la alfa-amilasa para ser identificada.
[0061] Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosforamidita descrito por Beaucage y M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al. (1984), EMBO J. 3, p. 801-805. En el método de fosforamidita, oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificado anillado, ligado y clonado en vectores apropiados.
[0062] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen genómico mezclado y sintético, sintético mezclado y de origen de ADNc o genómico mezclado y de origen de ADNc, preparado por fragmentos ligantes de sintético, genómico o de origen de ADNc (según sea apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN entera), conforme a técnicas estándar. La secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo, como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491.
Secuencia de ADN aislada
[0063] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una secuencia de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima híbrida de la invención o una enzima de tipo salvaje modificada genéticamente que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico con una actividad de alfaamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde el módulo catalítico es de origen fúngico.
[0064] El término "secuencia de ADN aislada", como se utiliza en este caso, se refiere a una secuencia de ADN, que está esencialmente libre de otra secuencias de ADN, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 % pura, preferiblemente al menos aproximadamente 40 % pura, más preferiblemente al menos aproximadamente 60 % pura, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80 % pura, y de forma más preferida al menos aproximadamente 90 % pura, como determinado por electroforesis de agarosa.
[0065] Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada se puede obtener por procedimientos de clonación estándar usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ADN de su ubicación natural a un sitio diferente donde esta será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ADN deseado comprendiendo la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, inserción del fragmento en una molécula de vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde copias múltiples o clones de la secuencia de ADN se replicarán. Una secuencia de ADN aislada se puede manipular en una variedad de maneras para proveer para expresión del polipéptido de interés. Manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ADN utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.
Construcción de ADN
[0066] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima híbrida o una enzima de tipo salvaje modificada genéticamente comprendiendo una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico con actividad alfa-amilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde el módulo catalítico es de origen fúngico. "Construcción de ADN" se define aquí como una molécula de ADN, bicatenaria o bien monocatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ADN, que se combinan y superponen en cierto modo, que de otra manera no existiría en la naturaleza. El término construcción de ADN es sinónimo del término cassette de expresión cuando la construcción de ADN contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
Mutagénesis dirigida al sitio
[0067] Una vez una secuencia de ADN que codifica alfa-amilasa progenitora ha sido aislada, y los sitios deseables para mutación han sido identificados, se pueden introducir mutaciones utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados. En un método específico, un intervalo monocatenario de ADN, la secuencia que codifica alfa-amilasa, se crea en un vector que lleva el gen de alfa-amilasa. Luego el nucleótido sintético, que soporta la mutación deseada, se anilla a una parte homóloga del ADN monocatenario. El intervalo restante es luego rellenado con polimerasa I de ADN (fragmento Klenow) y la construcción es ligada usando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método es descrito en Morinaga et al. (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. US 4,760,025 revela la introducción de mutaciones múltiples de codificación de oligonucleótidos mediante la realización alteraciones menores del cassette. No obstante, una variedad superior inclusa de mutaciones se puede introducir en cualquier momento por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de longitudes varias, pueden ser introducidos.
[0068] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de DNA que codifican alfa-amilasa es descrito en Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Esto implica la generación de 3-pasos de un fragmento de PCR con la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. Del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que lleva la mutación se puede aislar por escisión con endonucleasas de restricción y reinsertar en un plásmido de expresión.
Mutagénesis aleatoria localizada
[0069] La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada a una parte de la alfa-amilasa progenitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas para ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se han modificado se prevé que resulten en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima parental ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.
[0070] La mutagénesis aleatoria, específica de la región o localizada es convenientemente realizada usando técnicas de mutagénesis generadas por PCR como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN a ser modificada puede ser aislada, por ejemplo por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionado anteriormente.
Expresión de las enzimas en plantas
[0071] Una secuencia de ADN que codifica una enzima de interés, tal como una enzima híbrida o un híbrido de la presente invención, se puede transformar y expresar en plantas transgénicas como se describe abajo.
[0072] La planta transgénica puede ser dicotiledóneo o monocotiledóneo, para abreviar una dicotiledónea o una monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tal como poa de prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (maíz).
[0073] Ejemplos de plantas dicotiledónea son tabaco, leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, colza de semilla de aceite y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.
[0074] Ejemplos de partes de planta son vástago, callo, hojas, raíz, frutas, semillas, y tubérculos al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. En el presente contexto, también compartimentos de célula vegetal específicos, tal como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma se consideran a ser una parte de planta. Además, cualquier célula vegetal, sin importar el origen de tejido, se considera una parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención son también consideradas partes de planta por ejemplo embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semillas.
[0075] También están incluidos dentro del campo de la invención el descendiente de tales plantas, partes de planta y células vegetales.
[0076] La planta transgénica o célula vegetal que expresan la enzima de interés se pueden construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye por incorporación de una o varias construcciones de expresión que codifican la enzima de interés en el genoma de huésped de planta y que propagan la planta modificada resultante o célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.
[0077] Convenientemente, la construcción de expresión es una construcción de ADN que comprende un gen que codifica la enzima de interés en la asociación operable con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o parte de planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender una etiqueta seleccionable útil para identificar células huésped en las que la construcción de expresión ha sido integrado y secuencias de DNA necesarias para introducción de la construcción en la planta en cuestión (el último depende del método de introducción de ADN a usar).
[0078] La elección de secuencias reguladoras, tal como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias de señal o de tránsito está determinada, por ejemplo basándose en cuando, donde y como la enzima se desea que sea expresada. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica la enzima de la invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, fase o tejido específica, y el producto génico puede ser previsto para un compartimento de célula específica, tejido o parte de planta tales como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo por Tague et al, Plant, Phys., 86, 506, 1988.
[0079] Para expresión constitutiva el 35S-CaMV, la ubiquitina 1 de maíz y el promotor de actina 1 de arroz pueden ser usados (Franck et al. 1980. Cell 21: 285-294, Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, termal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mo. Biol. 18,675-689.; Zhang W, McElroy D. and Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5’ region activity in transgenic rice plants. Plant Cell3,1155-1165). Promotores específicos de los órganos pueden, por ejemplo ser un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla como la glutelina, prolamina, globulina o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, nº 8 págs. 885889 (1998), un promotor Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba ha descrito por Conrad U. et al, Journal of Plant Physiology Vol. 152, nº 6 págs. 708-711 (1998), un promotor de una proteína de cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., Plant and cell physiology vol. 39, nº 9 págs. 935-941 (1998), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor de rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, nº 3 págs. 991-1000 (1993), el promotor de gen de metiltransferasa de adenina de virus de chlorella (Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, nº 1 págs. 85-93 (1994), o el promotor de gen aldP de arroz (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Vol. 248, nº 6 págs. 668-674 (1995), o un promotor inducible dañado como promotor pin2 de patata (Xu et al, Plant Molecular Biology Vol. 22, nº 4 págs. 573-588 (1993). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias exógenamente aplicadas que activan el promotor por ejemplo etanol, estrógenos, hormonas de planta como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico y metales pesados.
[0080] Un elemento intensificador del promotor se puede utilizar para conseguir expresión más alta de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima. Por ejemplo, Xu et al. op cit revelan el uso del primer intrón del gen de actina de arroz 1 para mejorar la expresión.
[0081] El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes de la construcción de expresión se pueden elegir de aquellos disponibles en la técnica.
[0082] La construcción de ADN se incorpora en el genoma de planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, micro inyección, bombardeo de partícula, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al, Science, 244,1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535,1990; Shimamoto et al, Nature, 338, 274,1989).
[0083] Actualmente, transferencia de gen mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para revisión Hooykas & Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38), y también pueden usarse para transformar monocotiledóneas, aunque otros métodos de transformación frecuentemente se usan para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas que complementan el método de Agrobacterium es el bombardeo de partícula (oro microscópico o partículas de tungsteno recubierto con el ADN transformado) de callos embrionarios o embriones de desarrollo (Christou, 1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992. Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiledóneas se basa en transformación de protoplasto como se describe por Omirulleh S, et al., Plant Molecular biology Vol. 21, nº 3 págs. 415-428 (1993).
[0084] Después de la transformación, los transformantes habiendo incorporado la construcción de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante regeneración o en las siguientes generaciones usando por ejemplo co-transformación con dos construcciones de T-ADN separado o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.
Tratamiento del almidón
[0085] La enzima híbrida del primer aspecto de la invención puede en un séptimo aspecto usarse en un método para almidón licuefactante, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular se trata en medio acuoso con la enzima híbrida. Preferiblemente el proceso que comprende hidrólisis de un compuesto acuoso de almidón gelatinizado o granular, en particular, hidrólisis de almidón granular en un hidrolizado de almidón soluble a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granular.
[0086] En una forma de realización preferida, el compuesto acuoso de almidón además de estar en contacto con la enzima híbrida del primer aspecto de la invención, contacta con una enzima seleccionada de la lista que consiste en: una alfa-amilasa fúngica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2) y una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3). En una forma de realización, además una alfa-amilasa tipo Termamyl o una enzima desramificante, tal como una isoamilasa
(E.C. 3.2.1.68) o unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41) se añade. En el contexto de la presente invención, una alfaamilasa tipo Termamyl es una alfa-amilasa tal y como se define en WO99/19467 en la página 3, línea 18 a página 6, línea 27.
[0087] El compuesto acuoso de almidón para ser sometido al método del séptimo aspecto de la invención puede tener 20-55 % de almidón granular sólido seco, preferiblemente 25-40 % de almidón granular de sólido seco, más preferiblemente 30-35 % de almidón granular de sólido seco.
[0088] Después de ser sometido al método del séptimo aspecto de la invención, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o preferiblemente al menos 99 % de los sólidos secos del almidón granular se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.
[0089] Según la invención, el método del séptimo aspecto se lleva a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Preferiblemente la temperatura en la que los procesos se llevan a cabo es al menos 30°C, al menos 31°C, al menos 32°C, al menos 33°C, al menos 34°C, al menos 35°C, al menos 36°C, al menos 37°C, al menos 38°C, al menos 39°C, al menos 40°C, al menos 41 °C, al menos 42°C, al menos 43°C, al menos 44°C, al menos 45°C, al menos 46°C, al menos 47°C, al menos 48°C, al menos 49°C, al menos 50°C, al menos 51°C, al menos 52°C, al menos 53°C, al menos 54°C, al menos 55°C, al menos 56°C, al menos 57°C, al menos 58°C, al menos 59°C, o preferiblemente al menos 60°C.
[0090] El pH en el que el método de la invención se lleva a cabo puede estar en el intervalo de 3,0 a 7,0, preferiblemente de 3,5 a 6,0, o más preferiblemente de 4,0-5,0.
[0091] El almidón granular para ser procesado en el método de la invención puede, en particular, ser obtenido de tubérculos, raíces, tallos, leguminosas, cereales o grano entero. Más específicamente, el almidón granular se puede obtener de granos, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judía, plátano o patatas. Especialmente contemplado son ambos tipos no cerosos y cerosos de maíz y cebada. El almidón granulado para ser procesado puede tener una calidad de almidón altamente refinado, preferiblemente al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 99,5 % puro o este puede ser un almidón más crudo con material que comprende grano molido entero incluyendo fracciones no amiláceas tales como residuos de germen y fibras. La materia prima, tal como grano entero, se muele para descubrir la estructura y permitir además tratamiento. Dos procesos de la molienda se prefieren según la invención: molienda húmeda y en seco. En la molienda en seco la avellana entera se muele y se usa. La molienda húmeda da una buena separación de germen y comida (gránulos de almidón y proteína) y se aplica con unas pocas excepciones en lugares donde el hidrolizado de almidón se usa en la producción de jarabes. Ambas molienda húmeda y en seco son bien conocidas en la técnica de tratamiento de almidón y se contemplan igualmente para el proceso de la invención. También sémola de maíz y, preferiblemente, sémola de maíz molida se pueden aplicar.
[0092] En una forma de realización del método del séptimo aspecto de la invención la enzima híbrida se usa en un proceso para la producción de combustible o etanol potable comprendiendo contacto del almidón tratado con una levadura. Preferiblemente el proceso comprende fermentación con una levadura realizada simultáneamente o separadamente/secuencial a la hidrólisis del compuesto acuoso de almidón granular. Cuando la fermentación se realiza simultánea a la hidrólisis la temperatura está preferiblemente entre 30°C y 35°C, y más preferiblemente entre 31 °C y 34°C. En otra forma de realización el compuesto acuoso de almidón granulado es contactado con un polipéptido que comprende un CBM, pero ningún módulo catalítico, es decir aplicación de CBMs sueltos. Los CBMs sueltos pueden ser módulos de unión de almidón, módulos de unión de celulosa, módulos de unión de quitina, módulos de unión de xilano, módulos de unión de manano, y otros módulos de unión. Los CBMs preferidos en el presente contexto son CBMs microbianos, particularmente CBMs bacterianos o fúngicos. Particularmente preferidos son los módulos de unión de almidón descritos en la solicitud de patente danesa PA 2003 01568 como las secuencias polipéptidas SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, y SEC ID NO:3 o los módulos de unión de almidón mostrados en la presente divulgación como SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:15; SEC ID NO:16, SEC ID NO:17, SEC ID NO:18; SEC ID NO:19, SEC ID NO:20, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, SEC ID NO:23. Los CBMs más preferidos incluyen el CBMs descritos en la presente divulgación como SEC ID NO:24 y como SEC ID NO:25. También preferida para la invención es la aplicación de cualquier CBM con al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso al menos 90 % de homología respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos CBM mencionadas antes. Los CBMs sueltos se pueden aplicar al compuesto acuoso de almidón granulado en cantidades eficaces.
[0093] La glucosa puede fermentarse también en otros productos de fermentación, tales como ácido cítrico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, cetonas, aminoácidos, tales como ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), pero también compuestos más complejos tales como antibióticos, tal como penicilina, tetraciclina, enzimas, vitaminas, tales como riboflavina, B12, beta-caroteno, hormonas, que son difíciles de producir sintéticamente.
Productos a base de masa
[0094] La enzima híbrida de la invención se puede utilizar para la preparación de un producto comestible a base de masa.
[0095] La masa generalmente comprende harina (particularmente harina de trigo) y agua. La masa se leuda, por ejemplo, añadiendo agentes de leudado químicos o levadura, normalmente Saccharomyces cerevisiae (levadura panadera).
[0096] El producto a base de masa se hace por leudado y calefacción de la masa, por ejemplo, por cocción o vaporización. Ejemplos son pan horneado o al vapor (en particular blanco, integral o pan de centeno), típicamente en forma de hogazas o rollos.
[0097] La masa puede comprender una o más enzimas adicionales, por ejemplo, una segunda amilasa (p. ej. una alfa-amilasa maltogénica), una ciclodextrin glucanotransferasa, una proteasa o peptidasa, en particular ,una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una fosfolipasa, una celulasa, una hemicelulasa (p. ej. un pentopsanasa o xilanasa), una glicosiltransferasa, un enzima ramificadora o una oxidasa tal como glucosa-oxidasa o una oxidasa con actividad más alta en la maltosa que en la glucosa.
[0098] La enzima híbrida se puede utilizar en una dosificación inferior que el módulo catalítico con actividad de alfaamilasa usado solo (comparado en una base de peso).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material comprado
[0099] Enzimas para manipulaciones de ADN (p. ej. restricción de endonucleasas, ligasas etc.) son obtenibles de New England Biolabs, Inc. y se usaron según las instrucciones del fabricante. Plásmidos amplificados fueron recuperados con equipo Qiagen® Plasmid (Qiagen). Reacción en cadena de polimerasa (PCR) se efectuó con sistema Expand™ PCR (Roche). Equipo de extracción de gel QIAquick™ (Qiagen) se usó para purificación de fragmentos de PCR y fragmentos de ADN cortados a partir de geles de agarosa.
Cepas y plásmidos
[0100] La cepa de Aspergillus kawachii IFO4308 se usó como donante de CBM y secuencias enlazadoras. La cepa de Aspergillus niger DSM 2761 donó la secuencia amilolítica (WO89/01969). La cepa de Aspergillus niger MBin120 descrita en la solicitud de patente provisional US n°. 60/459902 (10345.000-US) fue usada como cepa huésped. El plásmido de expresión de Aspergillus pMT2188 descrito en la patente WO200295014 fue usado como vector. La cepa defectuosa de Escherichia coli DB6507 (ATCC 35673) fue usada para propagación de pHUda381 y pHUda387.
[0101] Plásmido pMT2188 consiste en un cassette de expresión basado en el promotor II de amilasa neutral de Aspergillus niger fusionada a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de Aspergillus niger (Tamg). También presente en el plásmido está el marcador selectivo de Aspergillus amdS de Aspergillus nidulans que permite crecimiento en la acetamida como fuente de nitrógeno solo y el marcador URA3 de Saccharomyces cerevisiae que permite crecimiento de la cepa defectuosa de Escherichia coli pyrF DB6507 (ATCC 35673), que propaga pHUda381 y pHUda387. Transformación en E. coli DB6507 usando el gen de S. cerevisiae URA 3 como marcador selectivo se hizo de la siguiente manera:
E. coli DB6507 se hizo competente por el método de Mandel y Higa (Mandel, M. and A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 45, 154). Transformantes se seleccionaron en el medio M9 sólido (Sambrook et. al (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) complementado con 1 g/l de casaminoácidos, 500 µ/l de tiamina y 10 mg/l de canamicina.
Medios y sustratos
[0102] Cove se compuso por 342,3 g/L de sacarosa, 20 ml/L de solución salina COVE, 10mM de acetamida y 30 g/L de agar noble. Cove-2 se compuso por 30 g/L de sacarosa, 20 ml/L de solución salina COVE, 10mM de acetamida y 30 g/L de agar noble. Solución salina COVE se compuso por 26 g/L de KCI, 26 g/L de MgSO4-7H2O, 76 g/L de KH2PO4 y 50ml/L de metales traza Cove. Metales traza COVE se compusieron por 0,04 g/L de Na2B4O7·10 H2O, 0,4 g/L de CuSO4·5H2O, 1,2 g/L de FeSO4·7H2O, 1,0 g/L de MnSO4·H2O, 0,8 g/L de Na2MoO2·2H2O y 10 g/L de ZnSO4·7H2O. YPG se compuso por 4 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de K2HPO4, 0,5 g/L de MgSO4·7H2O y 15 g/L de glucosa, pH 6,0. STC se compuso por 0,8 M de Sorbitol, 25 mM de Tris pH 8 y 25 mM de CaCl2. STPC se compuso por 40 % de PEG4000 en el tampón STC. Agarosa superior Cove se compuso por 342,3 g/L de sacarosa, 20 ml/L de solución salina COVE, 10mM de acetamida y 10 g/L de agarosa de baja fusión. MLC se compuso por 40 g/L de glucosa, 50 g/L de polvo de semilla de soja, 4 g/L de ácido cítrico, pH 5,0. GO-50 se compuso de glucosa 50 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4-7aq 2 g/L, K2SO4 3 g, ácido cítrico 3 g/L, ácido oxálico 50 g/L, solución de metal traza AMG 0,5 m/L y urea 3 g/L, pH 5,0.
Solución de metal traza AMG se compuso por 6,8 g/L de ZnCl2·7H2O, 2,5 g/L de CuSO4 ·5H2O, 0,24 g/L de NiCl2·6H2O, 13,9 g/L de FeSO4·7H2O, 13,5 g/L de MnSO4·H2O y 3 g/L de ácido cítrico.
Actividad de alfa-amilasa ácida estable
5 [0103] Cuando se usa según la presente invención la actividad de cualquier alfa-amilasa ácida estable se puede medir en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa Ácidas Fúngicas), que se determinan en relación a un estándar enzimático. 1 FAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg de sustancia seca de almidón por hora bajo las condiciones estándar mencionadas más adelante.
10 [0104] Alfa-amilasa ácida estable, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucan-glucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza enlaces alfa-1,4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con longitudes de cadena diferentes. La intensidad de color formado con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. Actividad amilasa se determina usando colorimetría inversa como una
azul/violeta t = 23 seg. decoloración
20 Condiciones estándar/condiciones de reacción:
[0105]
Sustrato: almidón soluble, aprox. 0,17 g/L
25 Tampón: citrato, aprox. 0,03 M Yodo (l2): 0,03 g/L CaCl2: 1,85 mM pH: 2,50 ± 0,05 Temperatura de incubación: 40°C
30 Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: 590nm Concentración enzimática: 0,025 AFAU/mL Intervalo de trabajo enzimático: 0,01-0,04 AFAU/mL
35 [0106] Una carpeta EB-SM-0259.02/01 describiendo este método analítico con más detalle es disponible bajo pedido a Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta es por la presente incluida por referencia.
Actividad de glucoamilasa
40 [0107] Actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades de AmiloGlucosidasa (AGU). La AGU se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 5 minutos.
[0108] Un sistema de autoanalizador puede ser utilizado. Mutarotasa se añade al reactivo de dehidrogenasa de
45 glucosa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierte en beta-D-glucosa. Glucosa dehidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH que se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.
Incubación AMG: 50 [0109]
Sustrato: maltosa 23,2 mM Tampón: acetato 0,1 M
55 pH: 4,30 ± 0,05 Temperatura de incubación: 37°C ± 1 Tiempo de reacción: 5 minutos Intervalo de trabajo enzimático: 0,5-4,0 AGU/mL
60 Reacción de color:
[0110]
GlucDH: 430 U/L Mutarotasa: 9 U/L
5 NAD: 0,21 mM Tampón: fosfato 0,12 M; 0,15 M NaCl pH: 7,60 ± 0,05 Temperatura de incubación: 37°C ± 1 Tiempo de reacción: 5 minutos
10 Longitud de onda: 340 nm
[0111] Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) describiendo este método analítico con más detalle es disponible bajo pedido de Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta es por la presente incluida por referencia.
15 Manipulaciones de ADN
[0112] A menos que se declare de otra manera, manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos de estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F. M. et al. (eds.), "Current protocols
20 in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995 ; Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (eds.)
Ejemplo 1: Clonación de módulo de unión a carbohidratos (CBM) de Aspergillus kawachii
[0113] Para clonar el módulo de unión a carbohidratos (CBM) con enlazador de A.kawachii, los cebadores CBM1
25 (SEC ID NO:1) y CBM2 (SEC ID NO:2) se diseñaron basados en las secuencias de nucleótidos de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus kawachii en la base de datos EMBL (EMBL:#AB008370). CBM1 y CBM2 comprenden un sitio de BamHI y un sitio SalI, respectivamente.
CBM1: 5'- gaagggatccgatttttactagtacatccaaagccaccac- 3' 30 CBM2: 5'- tttgtcgacctacctccacgtatcaaccaccgtctcc- 3'
[0114] La reacción PCR se efectuó con los cebadores CBM1 y CBM2 usando ADN genómico de A. kawachii (IFO4308) como molde. Componentes de reacción (1 ng /microL de ADN genómico, 250 mM d dNTP cada uno, cebador 250 nM cada uno, 0,1 U / microL en la polimerasa de Taq en tampón 1X (Roche Diagnostics, Japan)) se
35 mezclaron y se sometieron a PCR bajo las siguientes condiciones.
Paso Temperatura Tiempo
1 94°C 2 min
2 92°C 1 min
3 55°C 1 min
4 72°C 1 min
5 72°C 10 min
6 4°C para siempre
Los pasos 2 a 4 se repitieron 30 veces.
[0115] Un fragmento 0,4 kb comprendiendo el CBM con región enlazadora se amplificó. El ADN amplificado se cortó por Sal I y BamH I y se ligó en pMT2188 digerido por Xho I y BamH I para crear pHUda381 teniendo CBM con
40 región enlazadora de Aspergillus kawachii, promotor de amilasa neutro de Aspergillus niger, secuencias guía TPI de Aspergillus nidulans, terminador de glucoamilasa de Aspergillus niger y gen Aspergillus nidulans amdS como una etiqueta. El pHUda381 fue ordenado para confirmar presencia de CBM correcta con secuencia enlazadora. El CBM con secuencia enlazadora se muestra en SEC ID NO:5.
45 Ejemplo 2: Expresión de la enzima híbrida en Aspergillus niger
[0116] La producción de la secuencia de ADNc del gen de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger y el clon de ADNc de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger se describen en WO 8901969 (ejemplo 1 y 3). Una reacción PCR con clon de ADNc de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger como molde fue realizada
50 usando los cebadores (SEC ID NO:3) y (SEC ID NO:4) para introducir un sitio BamHI y un sitio Spel, respectivamente.
(SEC ID NO:3): 5'- tttggatccaccatgagattatcgacttcgagtctcttc- 3' (SEQ ID NO:4): 5'- tttactagtagcagcagcagttgtggtcgtggttgttc- 3'
[0117] Componentes de reacción (1 ng /microL de ADN de molde, 250 mM de dNTP cada uno, cebador 250 nM cada uno, 0,1 U / microL en la polimerasa de Taq en tampón 1X (Roche Diagnostics, Japón) se mezclaron y se sometieron a PCR bajo las siguientes condiciones.
Paso
Temperatura Tiempo
1
94°C 2 min
2
92°C 1 min
3
55°C 1 min
4
72°C 2 min
5
72°C 10 min
6
4°C para siempre
Los pasos 2 a 4 se repitieron 30 veces.
[0118] El fragmento 1,5 kb de ADN amplificado se cortó por Spe I y BamH I y se ligó en pHUda381 digerido por Spe I y BamH I para crear el plásmido de expresión pHUda387 comprendiendo ADNc de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger fusionado con CBM de Aspergillus kawachii. El pHUda387 fue ordenado para confirmar que ninguno de los cambios ocurrió en las secuencias de ADNc de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger. La secuencia de ADNc de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger se muestra en SEC ID NO:7.
[0119] El pHUda387 fue transformado en Aspergillus niger MBin120. La cepa huésped se propagó en 100 ml de medio no selectivo YPG a 32°C durante 16 hrs en un agitador giratorio a 120 r.p.m. Células se recogieron por filtración, se lavaron con 0,6 M de KCI y se resuspendieron en 20 ml de 0,6 M de KCI con un producto de betaglucanasa comercial (GLUCANEX™, Novozymes A/S) a concentración final de 600 microL /ml. La suspensión fue incubada a 32°C a 80 r.p.m. hasta que se formaron protoplastos, luego se lavaron dos veces con tampón STC. Los protoplastos se contaron con un hematómetro y se resuspenderion y ajustaron en una solución 8:2:0.1 de STC:STPC:DMSO a una concentración final de 2,5x107 protoplastos/ml. Aproximadamente 3 microgramos de ADN plásmido se añadieron a 100 microL de suspensión de protoplasto, se mezclaron suavemente y se incubaron en hielo durante 20 min. Un ml de SPTC se añadió y la suspensión de protoplasto se incubó durante 30 min a 37°C. Después de la adición de 10 ml de 50 °C agarosa superior Cove, la reacción fue vertida sobre placas de agar Cove y las placas fueron incubadas a 32°C. Después de 5 días, transformantes fueron seleccionados del medio COVE.
[0120] Los transformantes seleccionados fueron inoculados en 100 ml de medio MLC y cultivados a 30 °C durante 2 días. 10 ml de medio MLC fue inoculado a 100 ml de medio GO-50 y cultivado a 30°C durante 5 días. El sobrenadante se obtuvo por centrifugado.
[0121] La actividad de alfa-amilasa ácida estable en el sobrenadante fue determinada como reducción de color azul de complejo de yodo de almidón medido en OD590nm. 25 microL de muestras enzimáticas se disolvieron en el tampón de muestra (51,4 mM de cloruro de calcio en 2 mM de tampón de citrato [pH 2,5]) se mezcló con 135 microL de solución de sustrato (0,6 g/L de almidón [Merck 1253] y 12 g/L de acetato sódico en 100 mM de tampón de citrato [pH 2,5]) y se incubó a 37°C durante 325 seg. Después de 325 seg, 90 microL de solución de yodo (1,2 g/L de yodo de potasio [Merck 5043] y 0,12 g/L de yodo [Merck 4761]) se añadió a la mezcla reactiva y se incubó a 37°C durante 25 seg. Actividad fue medida a 590 nm en un espectrofotómetro. 25 microL de agua destilada fue usada en vez de muestras enzimáticas en los experimentos de blanco.
Ejemplo 3: Rendimiento de la enzima híbrida en SSF de almidón no gelatinizado
[0122] El rendimiento relativo de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger y alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger con un módulo unido de unión a carbohidratos fue evaluado vía fermentaciones mini-escala SSF (Sacarificación Simultánea y Fermentación). Las dosificaciones usadas fueron 0,3, 0,5 y 1,0 AFAU/g DS de la alfaamilasa respectiva complementada con una dosis 0,5 AGU/g DS de glucoamilasa de Aspergillus niger purificada. Brevemente, aproximadamente 1,9 g de maíz molido (amarillo #2 maíz molido dentado en un molino triturador escala de piloto y pasado a través de un 2 mm de pantalla, 11,2 % de contenido de humedad) se añadió a tubos de 16 ml de poliestireno (Falcon 352025). Una solución de 0,02 de N H2SO4 con 3 mg/ml de penicilina fue añadida en una cantidad apropiada para llevar el nivel de sólidos secos (DS) a 34 % y el pH a 5,0. Los tratamientos se hicieron en seis repeticiones.
[0123] Después de dosificación de las enzimas, los tubos fueron inoculados con 4,74 x 108 de levadura células/ml. Los tubos se cubrieron con un destornillador en la tapa que ha sida punzada con una aguja muy pequeña para permitir liberación de gas y agitados brevemente antes de pesaje e incubación a 32°C. El progreso de fermentación fue seguido por pesaje de los tubos según avanzaba el tiempo. Los tubos fueron removidos brevemente antes del pesaje. La relación usada entre cantidad de pérdida de CO2 y el peso de etanol fue: pérdida de CO2 (g) x 1,045 = EtOH (g). Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Rendimiento de etanol medio como g etanol/g DS después de 50 hrs.
Dosis (AFAU/g DS)
alfa-amilasa de Aspergillus niger alfa-amilasa+CBM de Aspergillus niger
0,3
0,342 0,366
0,5
0,348 0,383
1,0
0,365 0,390
95% límites de confifanza:+ /- 0,008
[0124] En una base de actividad igual, alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger con un módulo unido de unión a carbohidratos (híbrido) alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger significativamente superó (nativa) en todas
5 las dosificaciones evaluadas. La enzima híbrida fue aproximadamente tres veces más eficaz que la enzima nativa (es decir, rendimiento de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger podría unirse con aproximadamente tres veces menos alfa-amiliasa ácida estable de Aspergillus niger con un módulo unido de unión a carbohidratos).
Ejemplo 4: Rendimiento de enzimas híbridas con combinaciones diferentes de CBM, secuencia enlazadora y 10 módulo catalítico
[0125] Variantes de enzima híbrida comprendiendo la alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger (AA) y un CBM de alfa-amilasa de A. kawachii, AMG de A. niger, AMG de T. emersonii, AMG de Athelia rolfsii, o alfa-amilasa maltogénica de Bacillus sp. (Novamyl) se construyeron. La secuencia enlazadora de alfa-amilasa de A. kawachii
15 (SEC ID NO:27) fue usada en todas las variantes.
[0126] El rendimiento de las variantes fue evaluado usando almidón de maíz (SIGMA S-9679) como sustrato, glucoamilasa de Aspergillus niger G2 0,5 AGU/g DS, variante 1,0 AFAU/g DS y cuantificación de la glucosa liberada con el equipo Glucose B-test (Wako Pure Chemicals 271-3141). Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Rendimiento de enzimas híbridas con diferentes CBMs. Glucosa mg/ml después de 20, 48, y 68 hrs (1,0 AFAU/gDS)
Variante Módulo catalítico Enlazador SBD
20 hrs 48 hrs 68 hrs
JA001 Aspergillus niger kawachii AA kawachii AA JA002 Aspergillus niger kawachii AA niger AMG JA003 Aspergillus niger kawachii AA emersonii AMG JA004 Aspergillus niger kawachii AA rolfsii AMG JA005 Aspergillus niger kawachii AA bacillus MA
0,18 0,51 1,07 0,38 1,08 1,88 0,04 0,19 0,43 0,48 1,43 2,48 -0,03 -0,04 0,10
[0127] Variantes de enzima híbrida comprendiendo la alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger y un CBM de alfa-amilasa de A. kawachii, AMG de A. niger, o AMG de Athelia rolfsii, se construyeron. También variantes con secuencia enlazadora diferente se construyeron. Las secuencias enlazadoras usadas fueron enlazador AMG de A.
25 niger (SEC ID NO:26), enlazador de alfa-amilasa de A. kawachii (SEC ID NO:27), enlazador AMG de Athelia rolfsii (SEC ID NO:28) y el enlazador PEPT (SEC ID NO:29). Una variante con dos CBD en serie se construyó también (JA012).
[0128] El rendimiento de las variantes fue evaluado como anteriormente, solo con glucoamilasa de Aspergillus niger 30 G1 y la variante fue dosificada como 0,3 AFAU/g DS. Los resultados se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Rendimiento de enzimas híbridas con secuencias enlazadoras diferentes y módulos catalíticos. Glucosa mg/ml después de 18, 24, y 42 hrs.
Variante Módulo catalítico Enlazador SBD
18 hrs 24 hrs 42 hrs 68 hrs
JA001 Aspergllus niger kawachii AA kawachii AA JA002 Aspergillus niger kawachii AA niger AMG JA004 Aspergillus niger kawachii AA rolfsii AMG JA008 Aspergillus niger AMG niger AMG
2,73 4,40 7,01 8,93 2,75 4,30 7,03 9,23 2,91 4,35 7,16 9,11 3,01 4,26 7,31 8,76
niger
JA009
Aspergillus rolfsii AMG niger AMG
niger
JA010
Aspergillus PEPT niger AMG
niger
JA011
Aspergillus rolfsii AMG rolfsii AMG
niger
JA012
Aspergillus kawachii AA niger AMG
niger
+rolfsii AMG
3,02 3,18 3,31 2,99
4,69 4,66 4,62 4,10 7,60 7,82 7,49 6,97 9,11 9,38 9,60 8,85
[0129] Se construyeron variantes de enzima híbrida comprendiendo el enlazador y CBM de alfa-amilasa de A. kawachii con módulos catalíticos diferentes. Los módulos catalíticos aplicados fueron de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger, alfa-amilasa de A. kawachii o alfa-amilasa de Aspergillus oryzae (Fungamyl™). El rendimiento de las variantes fue evaluado como anteriormente, con glucoamilasa de Aspergillus niger G1 y la variante dosificada como 0,3 AFAU/g DS. Los resultados se muestran en la tabla 5.
Tabla 5. Rendimiento de enzimas híbridas con diferentes módulos catalíticos. Glucosa mg/ml después de 18, 24, 42 y 68 hrs.
Variante Módulo catalítico Enlazador SBD 18 hrs 24 hrs 42 hrs 68 hrs
JA001 A. niger AA kawachii AA kawachii AA 2,73 4,40 7,01 8,93 JA006 A. oryzae AA kawachii AA kawachii AA 3,39 5,10 7,99 9,77 JA007 A. kawachii AA kawachii AA kawachii AA 2,91 3,99 6,82 8,57
[0130] Variantes de enzima híbrida comprendiendo el enlazador y CBM de alfa-amilasa de A. kawachii o AMG de A. rolfsii con módulos catalíticos diferentes de alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger o alfa-amilasa de Aspergillus oryzae (Fungamyl™). El rendimiento de las variantes fue evaluado como anteriormente con glucoamilasa de Aspergillus niger G1 y la variante dosificada como 0,3 AFAU/g DS. Los resultados se muestran en la tabla 6.
Tabla 6. Rendimiento de diferentes enzimas híbridas. Glucosa mg/ml después de 18, 24 o 42 hrs.
Variante Módulo catalítico Enlazador SBD
18 hrs 24 hrs 42 hrs
JA001 A. niger AA kawachii AA kawachii AA JA006 A. oryzae AA kawachii AA kawachii AA JA017 A. oryzae AA rolfsii AMG rolfsii AMG
4,64 5,61 8,38 6,27 7,93 9,40 6,68 8,87 9,80
Ejemplo 5: Variante de JA017 con una o más sustituciones en el módulo catalítico.
[0131] Variantes de la enzima híbrida JA017 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:40) comprendiendo el AMG de A. rolfsii CBM, secuencia enlazadora de A. rolfsii y el módulo catalítico de alfa-amilasa de
A. oryzae con una o más sustituciones en el módulo catalítico se construyeron usando técnicas de ingeniería de proteínas convencionales. La tabla 7 enumera las sustituciones en las variantes.
Tabla 7. Variantes de JA017 (SEC ID NO:40) con una o más sustituciones en el módulo catalítico.
Nº
Sustitución
JA019
Y175W E176D
JA050
N264K M266L
JA056
D253N
JA057
K158D S161 D Q163S D164S G466D D468S N470D
JA059
G60N N264K M266L
JA060
D177N
JA061
K158D S161DQ163S D164S Y175W E176D G466D D468S N470D
JA062
K158D S161DQ163S D164S Y175W E176D N264K M266L G466D D468S N470D
JA063
K158V S161DQ163S D164S G466D D468S N470D
JA069
K158D S161NQ163A D164S G466D D468S N470D
18
JA074 K158V S161N Q163A D164S N264K M266L G466D D468S N470D JA076 Q81R K158V S161N Q163A D164S Y175W E176D G466D D468S N470D JA083 K158D S161DQ163S D164S Y175W E176D N264E M266L G466D D468S N470D
JA085 Q81 R K158V S161N Q163A D164S Y175W E176D D177N N264K M266L G466D D468S N470D
JA093 Q81 R K158V S161N Q163A D164S Y175W E176D D177N N264E M266L G466D D468S N470D
JA094 K158V S161N Q163A D164S Y175W E176D D177N N264K M266L G466D D468S N470D
JA095 K158V S161N Q163A D164S Y175W E176D D177N N264E M266L G466D D468S N470D
JA096 K158V S161N Q163A D164S D177N N264K M266L G466D D468S N470D
JA097 K158V S161N Q163A D164S D177N N264E M266L G466D D468S N470D
[0132] Las variantes fueron expresadas en Aspergillus oryzae y caracterizadas para estabilidad de pH, termostabilidad y el rendimiento hacia el almidón crudo por prueba de liberación de glucosa.
5 [0133] JA085 mostró al menos por 5 °C termostabilidad más alta que JA017 a pH 4,5 fue y estable incluso a pH 3,0.
[0134] Las muevas variantes JA085 y JA074 mostraron una alta actividad específica en la prueba de liberación de glucosa. JA085 continuó para liberar glucosa incluso a pH 3,8 donde JA017 fue rápidamente inactivada. JA074 tuvo los máximos rendimientos de glucosa a pH 4,0 fue pero fue inactivado a pH 3,8.
10 [0135] Las tablas 8-10 enumeran la estabilidad de temperatura como actividad residual después de 30 min de incubación a 55°C y 60°C a pH 4,5, la actividad específica, la estabilidad de pH y la actividad en la prueba de liberación de glucosa de varias variantes.
15 Tabla 8. Estabilidad de temperatura y actividad específica de variantes PE seleccionadas. Estabilidad de temperatura (%) Actividad específica (mFAU/OD280) En 1mM CaCl2 Sin CaCl2 55C° 60°C 55°C
JA017 2 0 0 3157 JA057 12 0 0 JA061 51 0 16 JA063 18 0 0 JA069 16 0 0 JA074 19 0 0 JA085 68 20 12 3653 JA095 59 7 2 4240 JA096 53 0 0 JA097 40 0 0
Tabla 10a. Rendimiento en la prueba de liberación de glucosa con AMG de A. niger G2 purificado a pH 4,0. Glucosa mg/ml.
0 min 19 min 43 min 67 min 91 min
JA001 0,48 3,48 5,67 8,26 10,79 JA017 0,46 6,45 7,97 8,71 8,98 JA074 0,44 8,85 14,69 18,24 20,29 JA085 0,41 5,87 10,62 13,92 17,34
Tabla 10b. Rendimiento en la prueba de liberación de glucosa con AMG de A.niger G2 purificado a pH 3,8. Glucosa mg/ml.
0 min 19 min 43 min 67 min 91 min
JA001 0,48 3,19 5,28 7,63 10,32 JA017 0,46 4,28 4,71 4,98 5,13 JA074 0,43 7,75 11,58 13,55 13,93 JA085 0,41 5,71 9,73 12,99 15,76
Ejemplo 6: Variantes de la alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii
10 [0136] Una variante de la alfa-amilasa ácida Aspergillus kawachii adecuada para hidrólisis de almidón crudo se puede producir por proteína convencional creada genéticamente de la secuencia comprendiendo el módulo catalítico. Posición específica donde alteraciones pueden mejorar actividad específica y/o estabilidad se predijo basada en similitud a una de las siguientes alfa-amilasas fúngicas con la secuencia de aminoácidos indicada y una
15 estructura tridimensional encontrada bajo el identificador indicado en el RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org): la alfa-amilasa ácida de A. niger (2aaa, SEC ID NO:42 aquí) y la alfa-amilasa (Taka amilasa) de Aspergillus oryzae (6taa o 7taa, SEC ID NO:43 aquí). Los dos modelos 3D fueron superpuestos alineando los residuos de aminoácidos de cada tríada catalítica. Esto se hizo por métodos conocidos en la técnica basados en las desviaciones de los tres
pares de átomos C-alfa, por ejemplo, minimizando la suma de escuadras de las tres desviaciones o alineando para tener cada desviación por debajo de 0,8 Å, por ejemplo, por debajo de 0,6 Å, por debajo de 0,4 Å, por debajo de 0,3 Å o por debajo de 0,2 Å.
5 [0137] Alternativamente, la superposición puede realizarse alineando las dos secuencias de aminoácidos por un método convencional y minimizando la suma de escuadras de las desviaciones de todos los pares correspondientes de residuos de aminoácidos. El alineamiento de secuencia puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, usando el software GAP de UWGCG versión 8.
10 [0138] En el alineamiento de las tres alfa-amilasas de A. kawachii, A. niger (aaa_new) y A. oryzae (7taa) mostrado debajo se indican los residuos que están dentro de 10Å del sustrato de acarbosa en la estructura 7taa.pdb. Estos residuos son objetivos para alteraciones que confieren actividad específica mejorada.
[0139] Las alteraciones específicas para actividad específica aumentada es una sustitución o una combinación de sustituciones en las siguientes posiciones dentro de "distancia del sustrato 10Å": 13,15,18,32-36 (es decir, 32, 33, 34, 35, 36), 61,63-64, 68- 69,73-84 (p. ej. 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84),117-125 (p. ej. 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125), 152-158 (p. ej. 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158), 161-162, 165-175 (e.g.165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175), 204-211 (p. ej. 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211), 216, 229-239 (229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239), 242, 250, 252-253, 255-257 (p. ej. 255, 256, 257), 259-260, 275, 292, 295-299 (p. ej. 295, 296, 297, 298, 299), 304, 328, 339-344 según la numeración 7taa en el alineamiento arriba donde el N-terminal es ATPAD en 7taa (TAKA amilasa). Muchas posiciones interesantes son: 33, 36, 74, 75, 77, 120, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 162, 166, 169, 170, 199, 232, 233, 235, 238, 239, 256, 257, 331, 336, 339, 340, y 342. Las sustituciones pueden ser para cualquier residuo de aminoácido.
[0140] Variantes que comprenden una de las siguientes sustituciones o combinaciones de estas pueden producirse: G33A, I36K, S74A, D75Y, E77D, P120A, I153D, D154N, W155Y, D156E, N157D, L158Q, Q162E, E166L, T169N, I170T, E199K, E199L, D232L, N233D, N235D, L238Y, D239T, W256Y, Q257P, E331Q, S336A, D339K, D339N, V340D, y Y342A. Las variantes más interesantes comprenden una o más de las siguientes sustituciones; S74A, E166L, E199L, D339K, y D156E. Aún más interesante es la variante con las sustituciones múltiples S74A/E166L/E199L.
[0141] Basado en similitud entre alfa-amilasas ácidas de Aspergillus kawachii y de A. niger las siguientes sustituciones se predijeron para mejorar la actividad específica; N31 D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348K, D378A, K383A, P386A, I387F, I405V, N448S, y N480R, y una variante llamada WA01 comprendiendo estas sustituciones puede producirse.
Ejemplo 7: Rendimiento de una variante de la alfa-amilasa ácida de Aspergillus kawachii
[0142] Las secuencias de los híbridos JA007 y JA001 descritas en el ejemplo 4 son idénticas a respectivamente la secuencia de la alfa-amilasa ácida de A. kawachii (SEC ID NO:41) y la secuencia de la variante WA01 descrita en el ejemplo precedente. Como los dos híbridos JA001 y JA007 han sido comparados en diferentes pruebas, la mejora en la actividad específica conferida por las sustituciones en la variante WA01 puede predecirse con mucha precisión. Actividad específica de la variante WA01 será 1,7 hasta 1,8 veces superior a la actividad específica de la amilasa de
A. kawachii de tipo salvaje. La predicción se basa en los datos mostrados en la tabla 12.
Tabla 12. Rendimiento del híbrido JA007 (idéntico a alfa-amilasa ácida de A. kawachii) y el híbrido JA001 (idéntico a WA01, una variante de la alfa-amilasa ácida de A. kawachii comprendiendo las sustituciones N31D, S74A, Y89D, E209L, Y245V, D348K, D378A, K383A, P386A, I387F, I405V, N448S, y N480R)
AFAU/ml mg/ml AFAU/mg A280 AFAU/A280
JA001 1,41 0,67 2,11 1,22 1,15
JA007 0,56 0,46 1,22 0,89 0,63
Ejemplo 8: Hidrólisis de almidón crudo con una alfa-amilasa ácida fúngica con o sin CBD
[0143] Este ejemplo ilustra la conversión de almidón de trigo granular o sémola de maíz en la glucosa usando amilasa fúngica ácida sin un CBM (SEC ID NO:8) o el correspondiente híbrido con un CBM (JA001). Un compuesto acuoso con 33 % de sólidos secos (DS) de almidón granular se preparó añadiendo 247,5 g de almidón de trigo o sémola de maíz bajo agitación en 502,5 ml de agua. El pH fue ajustado con HCl a 4,5. El compuesto acuoso de almidón granular fue distribuido a matraces 100 ml de tapa azul con 75 g en cada matraz. Los matraces fueron incubados con agitación magnética en un baño maría a 60°C. A cero horas las actividades enzimáticas se dosificaron a los matraces; glucoamilasa (200 AGU/kg DS), una amilasa ácida fúngica (50 AFAU/kg DS) y la alfaamilasa ácida de Aspergillus niger de tipo salvaje (SEC ID NO:8) o la alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger pero fusionada a un enlazador y CBM derivado de A. kawachii (SEC ID NO:8 fusionada en la SEC ID NO:6). La alfaamilasa ácida de Aspergillus niger w/wo CBM fue dosificada como 100 KNU/kg DS. Las muestras fueron retiradas después de 24, 48, 72 y 96 horas.
[0144] Almidón de sólidos secos totales fue determinado usando el siguiente método. El almidón fue completamente hidrolizado añadiendo una cantidad en exceso de alfa-amilasa (300 KNU/Kg sólidos secos) y colocando la muestra en un baño de aceite a 95 °C durante 45 minutos. Posteriormente las muestras fueron enfriadas a 60°C y una cantidad en exceso de glucoamilasa (600 AGU/kg DS) fue añadida seguido de incubación durante 2 horas a 60°C.
[0145] Sólidos solubles secos en el hidrolizado de almidón fueron determinados por medición de índice de refracción en muestras después de filtración a través de un filtro 0,22 microM. Los perfiles de azúcar fueron determinados por HPLC. La cantidad de glucosa fue calculada como DX.
[0146] Los resultados se muestran en las tablas 13-14 (almidón de trigo) y 15-16 (sémola de maíz).
Tabla 13. Sólidos solubles secos como porcentaje de sustancia seca total de almidón de trigo. Enzimas: glucoamilasa, alfa-amilasa ácida fúngica y más alfa-amilasa ácida fúngica con el CBM o sin el CBM.
24 horas 46 horas 70 horas 90 horas
Sin CBM 81,1 88,6 89,4 90,7 Con CBM 86,2 92,6 93,7 95,1
Tabla 14. El DX del hidrolizado soluble de almidón de trigo: enzimas: glucoamilasa, amilasa ácida fúngica y más alfa-amilasa ácida fúngico con el CBM o sin el CBM.
24 horas 46 horas 70 horas 90 horas
Sin CBM 78,1 84,9 85,6 86,7 Con CBM 82,3 88,4 89,5 90,5
Tabla 15. Sólidos solubles secos como porcentaje de sustancia seca total de sémola de maíz. Enzimas: glucoamilasa, alfa-amilasa ácida fúngica y más alfa-amilasa ácida fúngica con el CBM o sin el CBM.
24 horas 46 horas 70 horas 90 horas
Sin CBM 44,0 49,6 56,8 62,2 Con CBM 53,6 59,7 63,8 68,4
Tabla 16. El DX del hidrolizado soluble de sémola de maíz: Enzimas: glucoamilasa, amilasa ácida fúngica y más alfa-amilasa ácida fúngica con el CBM o sin el CBM.
24 horas 46 horas 70 horas 90 horas
Sin CBM 42,1 47,3 53,9 58,8 Con CBM 51,2 56,8 60,4 64,5
LISTADO DE SECUENCIAS [0147]
<110> Novozymes A/S
<120> ENZIMAS HÍBRIDAS PARA TRATAMIENTO DEL ALMIDÓN
<130> 10490-EP-ETD
<140> EP 10181122.2
<141> 2004-06-25
<160> 43
<170> Versión de patentIn 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética
<400> 1 gaagggatcc gatttttact agtacatcca aagccaccac 40
<210> 2
<211> 37 24
<212> ADN <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Construcción sintética
<400> 2 tttgtcgacc tacctccacg tatcaaccac cgtctcc
37
10
<210> 3 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Construcción sintética
20 25
<400> 3 tttggatcca ccatgagatt atcgacttcg agtctcttc <210> 4 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Construcción sintética 39
30
<400> 4 tttactagta gcagcagcag ttgtggtcgt ggttgttc 38
35
<210> 5 <211> 396 <212> ADN <213> Aspergillus kawachii
40
<220> <221> CDS <222> (1)..(396) <400> 5
<210> 6 5 <211> 131
<212> PRT
<213> Aspergillus kawachii
<400> 6 10
<210> 7
<211> 1533 5 <212> ADN
<213> Aspergillus niger
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1533)
<400> 7
<210> 8
<211> 511
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 8
<210> 9
<211> 102
<212> PRT
<213> Bacillus flavothermus
<400> 9
10 15
<210> 10 <211> 99 <212> PRT <213> Bacillus species
<400> 10
<210> 11
<211> 102
<212> PRT
<213> Alcaliphilic Bacillus
<400> 11
10
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> Hormoconis resinae
15
<400> 12
<210> 13 5 <211> 95
<212> PRT
<213> Lentinula edodes
<400> 13 10
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 14
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> Talaromyces byssochlamydioides
<400> 15
<210> 16
<211> 115
<212> PRT
<213> Geosmithia cylindrospora: 15
<400> 16
<210> 17
<211> 139
<212> PRT
<213> Scorias spongiosa
<400> 17
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> Eupenicillium ludwigii
<400> 18
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> Aspergillus japonicus
<400> 19
<210> 20 5 <211> 133
<212> PRT
<213> Penicillium cf. miczynskii
<400> 20 10
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> Mz1 Penicillium sp. 10
<400> 21
<210> 22
<211> 114
<212> PRT
<213> Thysanophora sp
<400> 22
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> Humicola grisea var. thermoidea 15
<400> 23
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 24
10 <210> 25
<211> 97
<212> PRT
<213> Aspergillus rolfsii
15 <400> 25
<210> 26
<211> 38
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 26
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> Aspergillus kawachii 15
<400> 27
20 <210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Athelia rolfsii
25 <400> 28
<210> 29 5 <211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Construcción sintética
<400> 29
<210> 30
<211> 498
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae 20
<400> 30
<210> 31
<211> 1923 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1923)
15 <400> 31
<210> 32
<211> 640
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<400> 32
<210> 33
<211> 1890 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1890)
15 <400> 33
<210> 34
<211> 629 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<400> 34
<210> 35
<211> 1923 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1923)
15 <400> 35
<210> 36
<211> 640 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<400> 36
<210> 37 5 <211> 1830
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Construcción sintética
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1830) 15
<400> 37
<210> 38
<211>
609 <212> PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética
<210> 39
<211>
1827 5 <212> ADN
10 <400> 38
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1827)
15 <400> 39
<210> 40
<211> 608 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<400> 40
<210> 41
<211> 640
<212> PRT
<213> Aspergillus kawachii
<220>
<221> mat_peptide
<222> (22)..(640)
<400> 41
<210> 42
<211> 505 5 <212> PRT
<213> Aspergillus niger
<220>
<221> mat_peptide 10 <222> (22)..(505)
<400> 42
<210> 43
<211> 476 <212> PRT 5 <213> Aspergillus oryzae
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(476) 10
<400> 43

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos,
    a) donde el módulo catalítico es una secuencia de alfa-amilasa derivada de la alfa-amilasa de Aspergillus niger y tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº.:8 y, b) donde el módulo de unión a carbohidratos consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 25 o un CBM con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos.
  2. 2.
    Enzima híbrida de la reivindicación 1, donde la enzima híbrida además comprende una secuencia de aminoácidos de enlace que conecta la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico y la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos.
  3. 3.
    Enzima híbrida de la reivindicación 2, donde la secuencia de enlace es una secuencia de enlace seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de enlace de SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, y SEC ID Nº: 29 o una secuencia de enlace que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, o SEC ID Nº: 29 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o no más de 1 posición.
  4. 4.
    Secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5.
    Construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6.
    Vector de expresión que comprende la secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7.
    Célula huésped transformada con un vector de expresión según la reivindicación 6, esta célula huésped es capaz de expresar la secuencia de ADN aislada según la reivindicación 4.
  8. 8.
    Célula huésped según la reivindicación 7, esta célula huésped es de un hongo, una bacteria, una planta o un mamífero.
  9. 9.
    Método para licuefacción de almidón, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular se trata en medio acuoso con la enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3.
  10. 10.
    Método según la reivindicación 9, que comprende el contacto del almidón tratado con una levadura para producir combustible o etanol potable.
  11. 11.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende la fermentación del almidón tratado en un producto de fermentación, tal como ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona, eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, cetonas, aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), penicilina, tetraciclina, enzimas, vitaminas, tales como riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas.
  12. 12.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 donde el compuesto acuoso de almidón es contactado con un polipéptido que comprende una molécula de unión a carbohidratos, pero no a un módulo catalítico.
  13. 13.
    Proceso para la preparación de un producto a base de masa, que comprende la adición de la enzima híbrida según las reivindicaciones 1 a 3 a una masa.
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