ES2356703T3 - Enzimas híbridas que consisten en una primera secuencia de aminoácidos de endoamilasa y un módulo de unión de carbohidratos como segunda secuencia de aminoácidos. - Google Patents
Enzimas híbridas que consisten en una primera secuencia de aminoácidos de endoamilasa y un módulo de unión de carbohidratos como segunda secuencia de aminoácidos. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido el cual es un híbrido comprendiendo; a) una primera secuencia de aminoácidos teniendo actividad endo-amilasa y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 35 y b) una segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácidos del 485 al 586 en la SEC ID NO: 2, donde dicha primera secuencia de aminoácidos y/o dicha segunda secuencia de aminoácidos se deriva de una bacteria.
Description
Enzimas híbridas que consisten en una primera
secuencia de aminoácidos de endoamilasa y un módulo de unión de
carbohidratos como segunda secuencia de aminoácidos.
La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a enzimas híbridas comprendiendo un módulo de unión a
carbohidratos y teniendo actividad endo-amilasa. Las
enzimas se pueden utilizar en procesos comprendiendo la modificación
y/o degradación de almidón, o en procesos de producción de puré.
Se usan endo-amilasas
bacterianas en un gran número de procesos, por ejemplo, para la
licuefacción de almidón en procesos donde se modifica, y/o degrada
almidón a polímeros más pequeños o monómeros de glucosa. Los
productos de degradación pueden usarse en la industria, por ejemplo,
como maltosa y/o jarabes de fructosa o además procesarse en un paso
de fermentación a un producto de fermentación, por ejemplo, etanol.
Las endo-amilasas bacterianas se usan en la cocción
para dar blandura adicional y una mejor humedad de la miga de pan.
No obstante, es fácil sobredosificar las
endo-amilasas, lo cual puede resultar en una
gomosidad y una pérdida indeseable de elasticidad en el producto
horneado. Existe una necesidad de endo-amilasas con
propiedades para el uso mejoradas en varios procesos, por ejemplo,
dentro del tratamiento y de la cocción de almidón.
Los presentes inventores han descubierto ahora
sorprendentemente que añadiendo un módulo de unión a carbohidratos
(CBM) a una endo-amilasa se puede modificar la
actividad catalítica de la endo-amilasa dando así
como resultado un rendimiento de cocción aumentado en comparación
con la enzima de tipo salvaje. No hay ningún cambio significante en
el sabor o el olor del producto horneado. Sin atarse a la teoría se
sugiere que el efecto se debe a una actividad aumentada hacia el
almidón crudo en la masa conferida por el CBM, y/o una actividad
reducida hacia el almidón calentado en el pan de cocción conferida
por el CBM. La endo-amilasa con un CBM se puede usar
como una enzima de cocción con menos riesgo de sobredosificación en
comparación con la enzima sin un CBM. Tales híbridos que consisten
en un polipéptido teniendo actividad endo-amilasa y
un módulo de unión a carbohidratos, principalmente teniendo afinidad
con el almidón como por ejemplo con el CBM20, tiene la ventaja sobre
las endo-amilasas existentes que seleccionando un
dominio catalítico con propiedades deseadas como por ejemplo el
perfil de pH, el perfil de temperatura, la resistencia a la
oxidación, la estabilidad del calcio, la afinidad del sustrato o el
perfil del producto se puede combinar con un módulo de unión a
carbohidratos con afinidades de enlace más débiles o más fuertes,
por ejemplo, afinidades específicas con la amilosa, afinidades
específicas con la amilopectina o afinidades con la estructura
específica en el carbohidrato. El híbrido se puede utilizar como un
aditivo de cocción, por ejemplo, como una enzima
anti-endurecimiento.
Los presentes inventores también han descubierto
sorprendentemente que añadiendo un módulo de unión a carbohidratos
(CBM) a una endo-amilasa la actividad y la
especificidad se pueden alterar aumentando así la eficacia de
diferentes procesos de degradación de almidón, por ejemplo,
comprendiendo la degradación de la sustancia cruda, por ejemplo,
almidón no gelatinizado al igual que almidón gelatinizado. Debido a
la actividad de hidrólisis superior de estas
endo-amilasas teniendo un CBM el proceso de
conversión de almidón global se puede realizar sin tener que
gelatinizar el almidón, es decir las endo-amilasas
teniendo un CBM hidrolizan almidón granulado en un proceso de
almidón crudo al igual que almidón completamente o parcialmente
gelatinizado en un proceso de almidón tradicional.
Por consiguiente la invención proporciona en un
primer aspecto un polipéptido que es un híbrido comprendiendo; una
primera secuencia de aminoácidos teniendo actividad
endo-amilasa y teniendo al menos un 60% de identidad
con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 35 y una
segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a
carbohidratos y teniendo al menos un 60% de identidad con la
secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácidos
485 a 586 en la SEC ID NO: 2, donde dicha primera secuencia de
aminoácidos y/o dicho segundo amino se deriva de una bacteria.
La invención proporciona además un proceso
preparando una masa o un producto comestible hecho de una masa,
comprendiendo el proceso añadir el polipéptido del primer aspecto a
la masa.
La invención proporciona además un proceso
comprendiendo; (a) poner en contacto un almidón con un polipéptido
según el primer aspecto, (b) incubar dicho almidón con dicho
polipéptido durante un tiempo y a una temperatura suficiente para
conseguir la conversión de al menos el 90% p/p de dicho sustrato de
almidón en azúcares fermentables, (c) fermentar para producir un
producto de fermentación, (d) opcionalmente recuperar el producto de
fermentación.
La invención proporciona además un aditivo para
mejorar el pan o la masa en forma de un granulado o polvo aglomerado
comprendiendo el polipéptido del primer aspecto.
La invención proporciona además una secuencia de
ADN codificando el polipéptido del primer aspecto.
La invención proporciona además un constructo de
ADN comprendiendo la secuencia de ADN al igual que una célula
huésped comprendiendo el constructo de ADN.
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El polipéptido de la invención es una enzima
híbrida comprendiendo una primera secuencia de aminoácidos teniendo
actividad endo-amilasa, y una segunda secuencia de
aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM).
El híbrido se puede producir por fusión de unas primeras secuencias
de ADN codificando unas primeras secuencias de aminoácidos y unas
segundas secuencias de ADN codificando unas segundas secuencias de
aminoácidos, o el híbrido se puede producir como un gen
completamente sintético basado en el conocimiento de las secuencias
de aminoácidos de CBMs adecuados, enlazadores y dominios
catalíticos.
El término "enzima híbrida" (también
referido como, "proteína de fusión", "híbrido",
"polipéptido híbrido" o "proteína híbrida") se usa aquí
para caracterizar los polipéptidos de la invención comprendiendo una
primera secuencia de aminoácidos comprendiendo al menos un módulo
catalítico teniendo actividad endo-amilasa y una
segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo al menos un módulo de
unión a carbohidratos donde la primera y la segunda están derivadas
de distintas fuentes. El término "fuente" siendo entendido como
por ejemplo, pero no limitado a, una enzima parental, o una variante
de la misma, por ejemplo, una amilasa o glucoamilasa, u otra
actividad catalítica comprendiendo un módulo catalítico adecuado y/o
un CBM adecuado y/o un enlazador adecuado. No obstante el CBM
también puede estar derivado de un polipéptido no teniendo ninguna
actividad catalítica. La primera y la segunda secuencia de
aminoácidos se pueden derivar de la misma cepa bacteriana, de cepas
en las mismas especies, de especies estrechamente relacionadas u
organismos menos relacionados. Preferiblemente la primera y la
segunda secuencia de aminoácidos de los híbridos derivados de
distintas fuentes, por ejemplo, de distintas enzimas de la misma
cepa y/o especies, o por ejemplo, de cepas dentro de especies
diferentes.
Los números de clasificación enzimáticos
(números EC) referidos en la presente especificación están conforme
a las Recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular
(http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/).
Enzimas híbridas como las denominadas en este
caso incluyen especies comprendiendo una secuencia de aminoácidos de
una endo-amilasa, es decir una
alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) la cual se enlaza (es
decir, mediante unión covalente) a una secuencia de aminoácidos
comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM). La enzima
híbrida es así una enzima capaz de catalizar hidrólisis de almidón
en una endo-forma.
Enzimas híbridas conteniendo CBM, al igual que
descripciones detalladas de la preparación y purificación de las
mismas, se conocen en la técnica [véase, por ejemplo, WO 90/00609,
WO 94/24158 y WO 95/16782, al igual que Greenwood et al.
Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) págs.
1295-1305]. Estas pueden, por ejemplo, prepararse
transformando en una célula huésped un constructo de ADN
comprendiendo al menos un fragmento de ADN codificando el módulo de
unión a carbohidratos ligado, con o sin un enlazador, a una
secuencia de ADN codificando la enzima de interés, y cultivando la
célula huésped transformada para expresar el gen fundido. El
enlazador puede ser una unión (es decir, comprendiendo 0 residuos),
o un grupo corto de enlaces comprendiendo de aproximadamente 2 a
aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular de de 2 a 40
átomos de carbono. No obstante, el enlazador es preferiblemente una
secuencia de 0 residuos de aminoácidos (p. ej., justo un enlace) o
es de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 residuos de
aminoácidos, más preferiblemente de entre 2 y 40 residuos de
aminoácidos, tal como de 2 a 15 residuos de aminoácidos.
Preferiblemente el enlazador no es sensible a o al menos tiene una
sensibilidad baja a la hidrólisis por una proteasa, la cual por
ejemplo, puede estar presente durante la producción del híbrido y/o
durante la aplicación industrial del híbrido. El CBM en una enzima
híbrida del tipo en cuestión puede estar situado
C-terminalmente, N-terminalmente o
internamente en la enzima híbrida. En una forma de realización un
polipéptido puede comprender más de un CBM, por ejemplo, dos CBMs;
uno situado C-terminalmente, el otro
N-terminalmente o los dos CBMs situados en serie
C-terminalmente, N-terminalmente o
internamente. No obstante, los polipéptidos con más de dos CBMs son
igualmente contemplados.
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El término "identidad" del polipéptido se
entiende como el grado de identidad entre dos secuencias indicando
una derivación de la primera secuencia de la segunda. La identidad
se puede determinar adecuadamente mediante programas informáticos
conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete
de programas GCG (Manual del Programa para el paquete informático
Wisconsin, versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575
Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. y
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453. Se usan los siguientes ajustes para la
comparación de secuencias de aminoácidos: penalización de creación
de gaps de 3.0 y penalización de extensión de gaps de 0.1. La parte
pertinente de la secuencia de aminoácidos para la determinación de
identidad es el polipéptido maduro, es decir sin el péptido
señal.
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Un módulo de unión a carbohidratos (CBM), o como
frecuentemente es referido, un dominio de unión a carbohidratos
(CBD), es una secuencia de aminoácidos de polipéptidos que se une
preferentemente a un poli- u oligosacárido (carbohidrato),
frecuentemente, pero no necesariamente de forma exclusiva, a una
forma insoluble en agua (incluyendo cristalina) de la misma.
CBMs derivados de enzimas de degradación de
almidón son frecuentemente referidos como módulos de unión a almidón
o SBMs (CBMs que pueden ocurrir en determinadas enzimas
amilolíticas, tales como determinadas glucoamilasas, o en enzimas
tales como glucanotransferasas de ciclodextrina, o en
endo-amilasas). Los SBMs son frecuentemente
referidos como SBDs (Starch Binding Domains: Dominios de unión a
almidón). Se prefieren para la invención CBMs los cuales son Módulos
de unión a almidón.
Los CBMs se encuentran como partes integrales de
polipéptidos grandes o proteínas que consisten en dos o más
regiones de secuencia de aminoácidos de polipéptido, especialmente
en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) las cuales típicamente
comprenden un módulo catalítico conteniendo el sitio activo para la
hidrólisis del sustrato y un módulo de unión a carbohidratos (CBM)
para la unión con el sustrato de carbohidrato en cuestión. Tales
enzimas pueden comprender más de un módulo catalítico y uno, dos o
tres CBMs, y opcionalmente además comprender una o más regiones de
secuencia de aminoácidos de polipéptido conectando el CBM(s)
con el módulo(s) catalítico, una región del tipo último
normalmente denominada como "enlazador". También se han sido
encontrado CBMs en algas, por ejemplo, en el alga roja Porphyra
purpurea de alga en forma de una proteína de proteína de unión
de polisacáridos no hidrolítica.
En proteínas/polipéptidos en las cuales ocurren
CBMs (p. ej., enzimas, normalmente enzimas hidrolíticas), un CBM se
puede localizar en el terminal N ó C o en una posición interna.
La parte de un polipéptido o proteína (p. ej.,
enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se típicamente
consiste en más de aproximadamente 30 y menos de aproximadamente 250
residuos de aminoácidos. El "Módulo de unión a carbohidratos de la
Familia 20" o un módulo CBM-20 se define en el
contexto de esta invención como una secuencia de aproximadamente 100
aminoácidos teniendo al menos un 45% de identidad con el Módulo de
unión a carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la Figura 1
por Joergensen et al (1997) en Biotechnol. Lett. 19:
1027-1031. El CBM comprende los últimos 102
aminoácidos del polipéptido, es decir la subsecuencia desde el
aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de las Familias de
hidrolasa glucósida usadas en esta descripción sigue el concepto de
Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - servidor de enzimas
carbohidratas activas en la URL:
http://afmb.cnrs-mrs.fr/<``cazy/CAZY/index.html o
alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999 la
estructura modular de celulasas y otras enzimas activas de
carbohidrato: un enfoque de base de datos integrada. En "Genetics,
Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiya, K.
Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni
Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23, y Bourne, Y. &
Henrissat, B. 2001 Glycoside hydrolases and glycosyltransferases:
families and functional modules, Current Opinion in Structural
Biology 11: 593-600.
Ejemplos de enzimas que comprenden un CBM
adecuado para el uso en el contexto de la invención son
endo-amilasas (es decir,
alfa-amilasas en EC 3.2.1.1),
alfa-amilasas maltogénicas (EC 3.2.1.133),
glucoamilasas (EC 3.2.1.3) o CGTasas (EC 2.4.1.19).
Se prefieren para la invención los CBMs de la
Familia 20 del Módulo de unión a carbohidratos. Los CBMs de la
familia CBM 20 adecuados para la invención se pueden derivar a
partir de beta-amilasas de Bacillus cereus
(SWISSPROT P36924), o de CGTasas de Bacillus circulans
(SWISSPROT P43379). Otros CBMs adecuados de la familia CBM 20 se
pueden encontrar en la \underbar{URL:
http://afmb.cnrs-mrs.fr/<``cazy/CAZY/index.html)}.
Una vez se ha identificado una secuencia de
nucleótidos codificando la región de unión a sustratos (unión a
carbohidratos), o bien como ADNc o como ADN cromosómico, se puede
manipular entonces en una variedad de maneras para fundir ésta a una
secuencia de ADN codificando la enzima de interés. El fragmento de
ADN codificando la secuencia de aminoácidos de unión a carbohidratos
y el ADN codificando la enzima de interés se ligan después con o sin
un enlazador. El ADN ligado resultante se puede manipular en una
variedad de formas para conseguir la expresión.
Son adecuados para el uso en el contexto de la
invención CBMs de origen de Bacillus, tales como un CBM20 de
Bacillus flavothermus (Syn. Anoxybacillus
contaminans), preferiblemente de la amilasa AMY1048 (SEC ID NO:
2 aquí), AMY1039, o AMY1079 (descrito como respectivamente las SEC
ID NO1, 2 y 3 en la PCT/US2004/023031), las amilasas de Bacillus
descritas en WO 2002068589 de Diversa, Bacillus sp. TS23
(Corea) (Lin, L.-L.; Sometido
(01-MAR-1995) a las bases de datos
EMBL/GenBank/DDBJ. Liu Lin, Food Industry Research Institute,
Culture Collection and Research Center, 331 Food Road, Hsinchu,
Taiwan 300, República de China).
En una forma de realización particular la
secuencia del CBM tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como
los residuos de aminoácidos 485 a 586 en la SEC ID NO: 2 o la
secuencia del CBM tiene una secuencia de aminoácidos teniendo al
menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o incluso al menos un
90% de identidad con la secuencia de aminoácidos mencionada
anteriormente.
\newpage
En otra forma de realización preferida la
secuencia del CBM tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de
la secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de
aminoácidos 485 a 586 en la SEC ID NO: 2 en no más de 10 posiciones,
no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7
posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más
de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o
incluso no más de 1 posición.
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Las endo-amilasas que son
apropiadas como la base para híbridos de CBM/amilasa de los tipos
empleados en el contexto de la presente invención incluyen los de
origen bacteriano y teniendo actividad endo-amilasa.
La endo-actividad de la amilasa se puede determinar
según el ensayo en la sección "Materiales y métodos" de la
presente solicitud. Se prefieren las endo-amilasas
derivadas de Bacillus sp., particularmente de B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus o
B. flavotermus. La endo-amilasa es
preferiblemente una endo-amilasa teniendo al menos
un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o incluso al menos un 90%
de identidad con la amilasa de Bacillus licheniformis (BLA,
SEC ID NO: 8 en WO2002/010355) mostrada en la SEC ID NO: 35 aquí.
Esto incluye pero de forma no limitativa la amilasa de la variante
LE429 de B. licheniformis (WO2002/010355) mostrada en la SEC
ID NO: 41 aquí, la amilasa de B. stearothermophilus (BSG, SEC
ID NO: 6 en WO2002/010355) mostrada en la SEC ID NO: 36 aquí, la
amilasa de B. amiloliquefaciens (BAN, SEC ID NO: 10 en
WO2002/010355) mostrada en la SEC ID NO: 37 aquí, la amilasa de
B. halodurans SP722 (SEC ID NO: 4 en WO2002/010355) mostrada
en la SEC ID NO: 38 aquí, SP690 (WO9526397) mostrada en la SEC ID
NO: 39 aquí, la amilasa de AA560 (SEC ID NO: 12 en WO2002/010355)
mostrada en la SEC ID: 40 aquí, la amilasa de cepas de alcalino
Bacillus como por ejemplo, SP707 (Tsukamoto et al., actividad
endo-amilasa, 151 (1988), págs.
25-31.), la amilasa KSM-AP1378
(WO9700324/KAO), las amilasas KSM-K36 y
KSM-K38 (EP
1,022,334-A/KAO/1,022,334-A/KAO), la
amilasa SP7-7 (WO0210356/Henkel), y la amilasa
AAI-6 (WO0060058), fragmentos de AMRK385
(PCT/DK01/00133), variantes o formas truncadas de lo anterior.
Preferiblemente la endo-amilasa
es una enzima de tipo salvaje o la endo-amilasa es
una endo-amilasa variante comprendiendo
modificaciones de aminoácidos conduciendo a actividad aumentada y/o
estabilidad de proteína aumentada a bajo pH, y/o a alto pH,
estabilidad aumentada hacia la depleción de calcio, y/o estabilidad
aumentada a temperatura elevada. Mutantes modificados química o
genéticamente de tales endo-amilasas se incluyen a
este respecto.
La endo-amilasa de B.
licheniformis BLA mostrada en la SEC ID NO: 35 es una amilasa de
tipo salvaje de un fragmento catalítico de 483 aminoácidos. El
dominio catalítico se puede dividir en el dominio de núcleo central
conteniendo el centro catalítico y un dominio C
c-terminal para el dominio catalítico. En la Sec. ID
8/NN10062 el dominio de núcleo catalítico consiste en los primeros
396 aminoácidos y el dominio C se define como los aminoácidos del
397 al 483.
La variante de la endo-amilasa
de B. licheniformis, LE429 mostrada en la SEC ID NO: 41
consiste en un fragmento catalítico de 481 aminoácidos. El dominio
catalítico se puede dividir en el dominio de núcleo central
conteniendo el centro catalítico y un dominio C
c-terminal para el dominio catalítico. En la SEC ID
NO: 41 el dominio de núcleo catalítico consiste en los primeros 394
aminoácidos y el dominio C se define como los aminoácidos del 395 al
481.
La endo-amilasa de B.
amiloliquefacience, BAN mostrada en la SEC ID NO: 37 es una
amilasa de tipo salvaje de un fragmento catalítico de 483
aminoácidos. El dominio catalítico se puede dividir en el dominio de
núcleo central conteniendo el centro catalítico y un dominio C
c-terminal para el dominio catalítico. En la SEC ID
NO: 37 el dominio de núcleo catalítico consiste en los primeros 396
aminoácidos y el dominio C se define como los aminoácidos del 397 al
483.
La endo-amilasa de B.
stearothermophilus, BSG mostrada en la SEC ID NO: 36 es un
amilasa de tipo salvaje de un fragmento catalítico de 483
aminoácidos y además una extensión c-terminal. El
dominio catalítico se puede dividir además en el dominio de núcleo
central conteniendo el centro catalítico y un dominio C
c-terminal para el dominio catalítico. En la SEC ID
NO: 36 el dominio del núcleo catalítico consiste en los primeros 396
aminoácidos, el dominio C se define como los aminoácidos del 397 al
483 y la extensión c-terminal se define como los
aminoácidos del 484 al 515.
La endo-amilasa de B.
halodurance SP722 mostrada en la SEC ID NO: 38 es un amilasa de
tipo salvaje de un fragmento catalítico de 485 aminoácidos. El
dominio de núcleo se puede dividir además en el dominio AB central
conteniendo el centro catalítico y un dominio C
c-terminal para el dominio catalítico. En la SEC ID
NO: 38 el dominio del núcleo catalítico consiste en los primeros
aminoácidos 398 y el dominio C se define como los aminoácidos del
399 al 485.
La endo-amilasa de Bacillus
alcalina, AA560 mostrada en la SEC ID: 40 aquí es un amilasa de
tipo salvaje de un fragmento catalítico de 485 aminoácidos. El
dominio de núcleo se puede dividir además en el dominio AB central
conteniendo el centro catalítico y un dominio C
c-terminal para el dominio catalítico. El dominio de
núcleo catalítico consiste en los primeros 398 aminoácidos y el
dominio C se define como los aminoácidos del 399 al 485. El dominio
de núcleo catalítico se codifica por los nucleótidos
1-1194 y el dominio C se codifica por los
nucleótidos
1189-1455.
1189-1455.
En el primer aspecto la secuencia de
endo-amilasas tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID NO: 35, o la secuencia de
endo-amilasas tiene una secuencia de aminoácidos
teniendo al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o
incluso al menos un 99% de identidad con cualquiera de las
secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.
En otra forma de realización preferida del
primer aspecto la secuencia de endo-amilasas tiene
una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 35, en no más de 10
posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más
de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no
más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones,
o incluso no más de 1 posición.
En una forma de realización preferida del primer
aspecto la secuencia de endo-amilasa tiene una
secuencia de aminoácidos como se muestra en la |SEQ ID: 40
(AA560), y comprendiendo una o más de las siguientes alteraciones
R118K, D183*, G184*, N195F, R320K y R458K|.
En otra forma de realización particularmente
preferida del primer aspecto la secuencia de
endo-amilasa tiene una secuencia de aminoácidos como
se muestra en la |SEQ ID: 40, y comprendiendo una o más, por
ejemplo, así como todas, de las siguientes alteraciones R118K,
D183*, G184*, N195F, R320K, R458K, N33S, D36N, K37L, E391I, Q394R,
K395D, T452i y N484P.
En otra forma de realización particularmente
preferida del primer aspecto la secuencia de
endo-amilasas tiene una secuencia de aminoácidos
como se muestra en la |SEQ ID: 40, y comprendiendo una o más, por
ejemplo, así como todas, de las siguientes alteraciones R118K,
D183*, G184*, N195F, R320K, R458K y N484P|.
En otra forma de realización altamente preferida
del primer aspecto la secuencia de endo-amilasas
tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO:
37 y comprende una o más, p. ej así como todas las siguientes
alteraciones: S31A, D32N, 133L, E178*, G179*, N190F, K389I, K392R,
E393D, V508A.
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En una forma de realización particular el
híbrido de la invención tiene la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC ID NO: 4, o el híbrido de la invención tiene una secuencia
de aminoácidos teniendo al menos un 60%, al menos un 70%, al menos
un 80% o incluso al menos un 90% de identidad con la SEC ID NO:
4.
En otra forma de realización preferida el
híbrido de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que
difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4
en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8
posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más
de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no
más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.
En una forma de realización preferida el
polipéptido de la invención comprende a) el dominio catalítico
mostrado en la SEC ID NO: 40 o un dominio catalítico homólogo, y b)
el CBM mostrado como los residuos del 485 al 585 de la SEC ID NO: 2,
donde una o más, o preferiblemente todas, de las siguientes
sustituciones se han introducido: R118K, D183*, G184*, N195F, R320K,
R458K, N33S, D36N, K37L, E391I, Q394R, K395D, T452Y y N484P, usando
la numeración de la SEC ID nº: 40.
En otra forma de realización preferida el
polipéptido de la invención comprende el dominio catalítico mostrado
en la SEC ID NO: 40 o un dominio catalítico homólogo, y b) el CBM
mostrado como los residuos del 485 al 585 de la SEC ID NO: 2, donde
una o más, o preferiblemente todas, de las siguientes sustituciones
se han introducido: R118K, D183*, G184*, N195F, R320K, R458K y
N484P, usando la numeración de la SEC ID nº: 40.
En otra forma de realización preferida el
polipéptido de la invención comprende el dominio catalítico mostrado
en la SEQ.ID: 37 y comprende uno o más, por ejemplo así como todas
las siguientes alteraciones: S31A, D32N, I33L, E178*, G179*, N190F,
K3891; K392R, E393D, V508A y un CBM teniendo la secuencia de
aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácidos del 485 al 586
en la SEC ID NO: 2.
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Un híbrido de la invención puede ser volátil a
la incursión proteolítica si el CBM y las proteínas de dominio
catalítico no forman interacciones proteína-proteína
suficientemente apretadas. No obstante, la estabilidad del híbrido
se puede mejorar por sustituciones de introducción en la superficie
de cualquiera de las proteínas para crear un híbrido estable.
Los presentes inventores han identificado los
siguientes residuos de aminoácidos en la superficie de
endo-amilasas bacterianas, por ejemplo, tales
polipéptidos teniendo al menos un 60% de identidad con la amilasa de
Bacillus licheniformis (SEC ID NO: 8), para estar en contacto
cercano con el CBM comprendido en el híbrido de la invención, es
decir a menos de 5.0 \ring{A} de distancia. Estos residuos son
objetivos adecuados para mutaciones para hacer un híbrido estable:
12, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 368, 371, 372, 381, 383,
384, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 422, 423,
448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 458, 459, 460, 461,
483, 484, 485 usando la numeración de la SEC ID nº: 40. El dominio
catalítico del híbrido de la invención pueden comprender una o más
sustituciones en las posiciones correspondientes a estos
residuos.
El híbrido de la invención puede comprender a)
el dominio catalítico mostrado en la SEC ID NO: 40 o un dominio
catalítico homólogo, y b) el CBM mostrado como los residuos del 485
al 585 de la SEC ID NO: 2, donde una o más, o preferiblemente todas,
de las siguientes sustituciones se han introducido: N33S, K35S/A,
D36A/N/S, K37L, E391I, Q394R, K395D, N484A/P usando la numeración de
la SEC ID nº: 40.
En la superficie del CBM que sobresale hacia el
dominio catalítico del híbrido los siguientes residuos se encuentran
en contacto cercano con el dominio catalítico, es decir dentro de un
radio de 5.0 \ring{A} de distancia, y estos residuos son objetivos
adecuados para mutaciones para hacer un híbrido estable: 485, 486,
487, 488, 507, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521,
522, 523, 524, 526, 538, 539, 540, 541, 553, 554, 555, 556, 557,
558, 559 usando la numeración de la SEC ID nº: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión recombinantes que pueden comprender una
secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida, un promotor, una
secuencia de péptido señal, y señales de parada traduccionales y
transcripcionales. Los diferentes ADN y secuencias de control
anteriormente descritas se pueden unir para producir un vector de
expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de
restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de
la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en tales sitios.
Alternativamente, la secuencia de ADN de la presente invención se
puede expresar por inserción de la secuencia de ADN o un constructo
de ADN comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la
expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia
codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia
codificante está operativamente vinculada con las secuencias de
control apropiadas para la expresión, y posiblemente la
secreción.
El vector de expresión recombinante puede ser
cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus), que puede ser
convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y
pueden provocar la expresión de la secuencia de ADN. La elección del
vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la
célula huésped en la que el vector ha de ser introducido. Los
vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El
vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un
vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación
del cual es independiente de replicación cromosómica, por ejemplo,
un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, un
cósmido o un cromosoma artificial. El vector puede contener
cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente,
el vector puede ser uno que, introducido en la célula huésped, se
integra en el genoma y replica con la cromosoma(s) en el cual
se ha integrado. El sistema de vector puede ser un único vector o
plásmido o dos o más vectores o plásmido que juntos contienen el ADN
total a introducir en el genoma de la célula huésped, o un
transposón.
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La célula huésped de la invención, o bien
comprendiendo un constructo de ADN o un vector de expresión
comprendiendo la secuencia de ADN que codifica el polipéptido del
primer aspecto, por ejemplo, una enzima híbrida, se usa
ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante
de la enzima híbrida, enzima de tipo salvaje o una enzima de tipo
salvaje genéticamente modificada. La célula se puede transformar con
un vector de expresión. Alternativamente, la célula se puede
transformar con el constructo de ADN de la invención codificando la
enzima híbrida o un enzima de tipo salvaje genéticamente modificada,
integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más
copias) en el cromosoma huésped. La integración del constructo de
ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos
convencionales, por ejemplo, por recombinación homóloga o
heteróloga.
La célula huésped puede ser cualquier célula
eucariótica o procariótica apropiada, por ejemplo, una célula
bacteriana, una célula fúngica filamentosa, una célula de levadura,
una célula vegetal o una célula mamífera.
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Las técnicas usadas para aislar o clonar una
secuencia de ADN que codifica el polipéptido del primer aspecto, por
ejemplo, una enzima híbrida, se conocen en la técnica e incluyen el
aislamiento de ADN genómico, la preparación de ADNc, o una
combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ADN de
la presente invención de tal ADN genómico se pueden efectuar, por
ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) o la selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para
detectar fragmentos de ADN clonados con características
estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al.,
1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva
York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de
ADN tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la
transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación basada en la
secuencia de ADN (NASBA).
La secuencia de ADN codificando una
endo-amilasa parental se puede aislar a partir de
cualquier célula o microorganismo produciendo la
endo-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien
conocidos en la técnica. Primero, se debería construir un ADN
genómico y/o una genoteca de ADNc usando ADN cromosómico o ARN
mensajero del organismo que produce la endo-amilasa
a estudiar. Luego, si la secuencia de aminoácidos de la
endo-amilasa es conocida, se pueden sintetizar
sondas de oligonucleótidos marcadas y usar para identificar clones
codificando endo-amilasa a partir de una genoteca
genómica obtenida a partir del organismo en cuestión.
Alternativamente, una sonda de oligonucleótidos marcada conteniendo
secuencias homólogas a otros genes de endo-amilasa
conocidos se podría usar como una sonda para identificar clones
codificando endo-amilasa, usando condiciones de
hibridación y lavado de una astringencia muy baja a altísima.
Otro método para identificar clones codificando
endo-amilasa implicarían insertar fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tales como un plásmido,
transformar bacterias endo-amilasas negativas con la
genoteca de ADN resultante, y luego colocar en placas las bacterias
transformadas sobre agar conteniendo un sustrato para la
endo-amilasa (es decir, maltosa), permitiendo así
que los clones expresen la endo-amilasa a
identificar.
Alternativamente, la secuencia de ADN
codificando la enzima se puede preparar sintéticamente por métodos
estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosforamidita
descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruters, (1981), letras de
tetraedro 22, p. 1859-1869, o el método descrito por
Mattes et al. (1984), EMBO J. 3, p. 801-805.
En el método de fosforamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por
ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican,
recuecen, ligan y clonan en vectores apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mezclado sintético y genómico, origen mezclado sintético y
de ADNc u origen mezclado genómico y de ADNc, preparado ligando
fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea
apropiado, los fragmentos correspondientes a diferentes partes de la
secuencia de ADN entera), conforme a técnicas estándar. La secuencia
de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se
describe en US 4.683.202 o por R.K. Saiki et al. (1988),
Science 239, 1988, págs. 487-491.
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La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a una secuencia de ADN aislada comprendiendo una secuencia de
ADN que codifica un polipéptido del primer aspecto, por ejemplo, una
enzima híbrida.
El término "secuencia de ADN aislada" como
se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ADN, la cual
está esencialmente libre de otra secuencias de ADN, por ejemplo, al
menos aproximadamente un 20% pura, preferiblemente al menos
aproximadamente un 40% pura, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 60% pura, incluso más preferiblemente al menos
aproximadamente un 80% pura, y de la forma más preferible al menos
aproximadamente un 90% pura como se determina por electroforesis de
agarosa.
Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada se
puede obtener por procedimientos de clonación estándar usados en
ingeniería genética para recolocar la secuencia de ADN de su
ubicación natural a un sitio diferente dónde éste estará
reproducido. Los procedimientos de clonación pueden implicar
escisión y aislamiento de un fragmento de ADN deseado comprendiendo
la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés,
inserción del fragmento en una molécula de vector, e incorporación
del vector recombinante en una célula huésped dónde copias múltiples
o clones de la secuencia de ADN estará replicada. Una secuencia de
ADN aislada se puede manipular en una variedad de vías para proveer
a expresión del polipéptido de interés. Manipulación de la secuencia
de ADN antes de la inserción su en un vector necesario o puede ser
deseable dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para
modificar secuencias de ADN utilizando métodos DNA recombinante se
conocen bien en la técnica.
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La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a un constructo de ADN comprendiendo una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido del primer aspecto. "Constructo de ADN"
se define aquí como una molécula de ADN, o bien bicatenaria o única,
la cual se aísla a partir de un gen de origen natural o la cual se
ha modificado para contener segmentos de ADN, los cuales se combinan
y superponen de tal manera, que de otro modo no existirían en la
naturaleza. El término constructo de ADN es sinónimo del término
cassette de expresión cuando el constructo de ADN contiene todas las
secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia
codificante de la presente invención.
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Una vez se ha aislado una secuencia de ADN
codificando endo-amilasa parental adecuada para el
uso en un polipéptido del primer aspecto, y se han identificado
sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones
usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen
secuencias de nucleótidos flanqueando los sitios de mutación
deseados. En un método específico, un fragmento monocatenario de
ADN, la secuencia codificando endo-amilasa, se crea
en un vector llevando el gen de endo-amilasa. Luego
el nucleótido sintético, llevando la mutación deseada, se recuece a
una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante se
llena después con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y el
constructo se liga usando la ligasa T4. Un ejemplo específico de
este método se describe en Morinaga et al. (1984),
Biotechnology 2, p. 646-639. US 4.760.025 describe
la introducción de oligonucleótidos codificando mutaciones múltiples
mediante la realización de alteraciones menores del casete. No
obstante, una variedad incluso mayor de mutaciones se pueden
introducir en cualquier momento por el método de Morinaga, porque se
puede introducir una multitud de oligonucleótidos, de diferentes
longitudes.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN codificando endo-amilasa se
describe en Nelson y Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p.
147-151. Éste implica la generación en 3 fases de un
fragmento de PCR conteniendo la mutación deseada introducida usando
una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores
en las reacciones de la PCR. Del fragmento generado por reacción en
cadena de la polimerasa, un fragmento de ADN llevando la mutación se
puede aislar por escisión con endo-nucleasas de
restricción y reinsertar en un plásmido de expresión.
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La mutagénesis aleatoria se puede localizar
ventajosamente en una parte de la endo-amilasa
parental en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando
regiones determinadas de la enzima se han identificado por ser
particularmente importantes para una propiedad dada de la enzima, y
al modificarse se espera que resulten en un variante con propiedades
mejoradas. Tales regiones se pueden identificar normalmente cuando
la estructura terciaria de la enzima parental se ha dilucidado y
relacionado con la función de la enzima.
La mutagénesis aleatoria localizada o de región
específica se realiza convenientemente usando técnicas de
mutagénesis generadas de PCR como se ha descrito anteriormente o
cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica.
Alternativamente, la secuencia de ADN codificando la parte de la
secuencia de ADN a modificar se puede aislar, por ejemplo, por
inserción en un vector adecuado, y dicha parte se puede someter
posteriormente a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de
mutagénesis mencionados anteriormente.
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Una secuencia de ADN codificando una enzima de
interés, tal como una enzima híbrida de la presente invención, se
puede transformar y expresar en plantas transgénicas como se
describe abajo.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea o
monocotiledónea, para abreviar una dicot o una monocot. Ejemplos de
plantas monocot son hierbas, tales como poa de los prados (Poa
pratense, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium,
césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo,
avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (en grano).
Ejemplos de plantas dicot son tabaco,
leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera,
guisantes, moldura y semilla de soja, y plantas crucíferas (de la
familia Brassicaceae), tales como la coliflor, aceite de semilla de
colza y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis
thaliana.
Ejemplos de partes de planta son vástago, callo,
hojas, raíz, frutos, semillas, y tubérculos como weii como los
tejidos individuales comprendiendo estas partes, por ejemplo,
epidermis, mesophyii, parenchyma, tejidos vasculares, meristemas. En
el presente contexto, también compartimentos de células vegetales
específicos, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria,
vacuola, peroxisomas y citoplasma se consideran como partes de
planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el
origen del tejido, se considera como una parte de planta. Asimismo,
partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas
para facilitar la utilización de la invención también se consideran
partes de planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y
revestimientos de semillas.
También se incluye dentro del campo de la
invención la progenie de tales plantas, partes de planta y células
vegetales.
La planta transgénica o célula vegetal
expresando la enzima de interés se puede construir conforme a
métodos conocidos en la técnica. En resumidas cuentas la planta o
célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de
expresión codificando la enzima de interés en el genoma huésped de
la planta y propagando la planta modificada resultante o célula
vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.
Convenientemente, el constructo de expresión es
un constructo de ADN que comprende un gen codificando la enzima de
interés en asociación operable con secuencias reguladoras apropiadas
requeridas para la expresión del gen en la planta o parte de la
planta de elección. Además, el constructo de expresión puede
comprender un marcador seleccionable útil para identificar células
huéspedes en las cuales el constructo de expresión se ha integrado y
secuencias de ADN necesarias para introducir el constructo en la
planta en cuestión (esto depende del método de introducción de ADN a
usar).
La elección de secuencias reguladoras, así como
secuencias de promotor y de terminador y opcionalmente secuencias de
señal o de tránsito se determina, por ejemplo, basándose en cuándo,
dónde y cómo se desea expresar la enzima. Por ejemplo, la expresión
del gen codificando la enzima de la invención puede ser constitutiva
o inducible, o puede ser desarrollable, específica de fase o tejido,
y el producto genético se puede prever en un compartimiento celular,
tejido o parte de planta específicos tales como semillas u hojas. Se
describen secuencias reguladoras, por ejemplo, por Tague et
al, Plant, Phys., 86, 506, 1988.
Para la expresión constitutiva se puede usar el
35S-CaMV, la ubiquitina de maíz 1 y el promotor de
actina 1 de arroz (Franck et al. 1980. Cell 21:
285-294, Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992.
Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of
expression and transcript splicing, and promoter activity following
transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mo. Biol. 18,
675-689.; Zhang W, McElroy D. y Wu R 1991, Analysis
of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant
Cell 3, 1155-1165). Promotores
órgano-específicos pueden ser, por ejemplo, un
promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas,
tubérculos de patata, y frutos (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu.
Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero
metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994. Plant
Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor de semilla
específico tal como la glutelina, prolamina, globulina o promotor de
albúmina de arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol.
39, No. 8 págs. 885-889 (1998), un promotor Vicia
faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla
desconocido de Vicia faba descrito por Conrad U. et
al, Journal of Plant Physiology Vol. 152, nº. 6 págs.
708-711 (1998), un promotor de una proteína corporal
de aceite de semilla (Chen et al., Plant and cell physiology
vol. 39, nº. 9 págs. 935-941 (1998), el promotor
napA de proteína de almacenamiento Brassica napus, o
cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la
técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el
promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el
promotor rbcs de arroz o tomate (Kiozuka et al., Plant
Physiology Vol. 102, nº. 3 págs. 991-1000 (1993), el
promotor de gen de metiltransferasa de adenina del virus chlorella
(Mitra, A. y Higgins, DW, Plant Molecular Biology vol. 26, nº. 1
págs. 85-93 (1994), o el promotor del gen aldP de
arroz (Kagaya et al., Molecular and General Genetics vol.
248, nº. 6 págs. 668-674 (1995), o un promotor
inducible dañado tal como el promotor pin2 de patata (Xu et
al, Plant Molecular Biology vol. 22, nº. 4 págs.
573-588 (1993). Asimismo, el promotor se puede
inducir por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o
alteraciones en la salinidad o inducidas por sustancias exógenamente
aplicadas que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos,
hormonas de planta como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico
y metales pesados.
Un elemento promotor intensificador se puede
utilizar para conseguir una mayor expresión de la enzima en la
planta. Por ejemplo, el elemento intensificador promotor puede ser
un intrón el cual se coloca entre el promotor y la secuencia de
nucleótidos codificando la enzima. Por ejemplo, Xu et al. op
cit revela el uso del primer intrón del gen actina 1 de arroz para
mejorar la expresión.
El gen marcador seleccionable y cualquier otra
parte del constructo de expresión se pueden elegir a partir de las
disponibles en la técnica.
El constructo de ADN se incorpora en el genoma
de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica,
incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación
mediada por virus, micro inyección, bombardeo de partículas,
transformación biolística, y electroporación (Gasser et al,
Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto
et al, Nature, 338, 274, 1989).
Actualmente, la transferencia genética mediada
por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para
generar dicots transgénicas (para revisión Hooikas &
Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38), y
también se pueden usar para transformar monocots, aunque se usan
frecuentemente otros métodos de transformación para estas plantas.
Actualmente, el método de elección para generar monocots
transgénicas complementando el método del Agrobacterium es el
bombardeo de partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno
revestidas con el ADN de transformación) de callos embrionarios o
desarrollando embriones (Christou, 1992. Plant J. 2:
275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5:
158-162; Vasil et al., 1992. Bio/Technology
10: 667-674). Un método alternativo para la
transformación de monocots se basa en la transformación de
protoplastos como se describe por Omirulleh S, et al., Plant
Molecular biology Vol. 21, nº. 3 págs. 415-428
(1993).
La siguiente transformación, teniendo
incorporados los transformantes el constructo de expresión se
seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien
conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de
transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de
selección o bien durante la regeneración o en las siguientes
generaciones usando por ejemplo, la
co-transformación con dos constructos de
T-ADN separados o una escisión
sitio-específica del gen de selección por una
recombinasa específica.
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La enzima híbrida de la presente invención se
puede utilizar para la preparación de un producto basado en masa
comestible tal como, pan, tortillas, pasteles, panqueques,
bizcochos, galletas, costras de pastel, más preferiblemente
productos horneados, tales como, productos de pan.
La masa usada para preparar el producto basado
en masa generalmente comprende harina, por ejemplo, de granos, tal
como, harina de trigo, harina de maíz, harina de centeno, harina de
avena, o harina de sorgo. La masa generalmente se leuda por la
adición de un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de
Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero) o un agente
de leudación químico.
El producto basado en masa comestible puede ser
preferiblemente cualquier tipo de producto horneado obtenido a
partir de masa, tanto de carácter blando como crujiente, tanto de
tipo blanco, claro u oscuro. Productos a base de masa comestibles
preferidos incluyen pan (en particular pan blanco, de trigo,
integral, bajo en carbohidratos, marrón,
multi-cereales, oscuro y de centeno), típicamente en
forma de barras, panecillos o bollos, y más preferiblemente, pan
árabe, panecillos de hamburguesa, pan de tipo Baguette francesa, pan
pita, tortillas, pasteles, panqueques, bizcochos, galletas, costras
de pastel, pan crujiente, pan vaporizado, corteza de pizza y
similares.
El producto a base de masa comestible se hace
calentando la masa, por ejemplo, por cocción o vaporización.
Ejemplos son el pan horneado o vaporizado (en particular el pan
blanco, integral o de centeno), típicamente en forma de barras o
bollos. El producto comestible a base de masa también se puede
preparar por fritura (p. ej., fritura profunda en grasa o aceite
caliente). Un ejemplo de tal producto comestible es un donut.
La enzima híbrida del primer aspecto de la
invención tiene preferiblemente una alta tolerancia a la
sobredosificación. La adición del polipéptido de la invención, por
ejemplo, el polipéptido del primer aspecto, en 2 veces, 3 veces,
preferiblemente 4 veces, más preferiblemente 5 veces, de la forma
más preferible 6 veces la dosis eficaz de dicho polipéptido a una
masa resulta en un ELR y/o un ELRN inferior al 15%, menos del 10%,
menos del 7%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4% o incluso
menos del 3%.
El polipéptido de la invención puede tener una
actividad residual de al menos un 20%, tal como al menos un 25% o un
30%, preferiblemente al menos un 35%, más preferiblemente al menos
un 40% y de la forma más preferible al menos un 50%, en las
condiciones de prueba dadas en la especificación.
El polipéptido de la presente invención puede
tener además una proporción
exo-a-endo mejorada definida como
IEF1 o IEF2 en la especificación. La IEF1 o IEF2 del polipéptido
puede ser más grande que 1, tal como 1,1 ó 1,5, preferiblemente 2 ó
2,5 o 3, más preferiblemente 3,5 ó 4, de la forma más preferible 5 ó
7 ó 10.
En otras formas de realización la invención
proporciona polipéptidos con características que son de interés
particular para objetivos de cocción, concretamente una actividad
residual de al menos un 25% a 70ºC en las condiciones de prueba
dadas en la especificación, una proporción
exo-a-endo aumentada (IEF), donde
IEF es más grande que 1, y finalmente una firmeza reducida inferior
a un 5% (en las condiciones de prueba dadas en la especificación)
mientras que el cambio en la dureza es de al menos 85 unidades (en
las condiciones de prueba dadas en la especificación) y/o el
cam-
bio de movilidad de agua libre es de al menos 1100 unidades (en las condiciones de prueba dadas en la especificación).
bio de movilidad de agua libre es de al menos 1100 unidades (en las condiciones de prueba dadas en la especificación).
Para fines de cocción el polipéptido de la
invención puede dar una reducción de firmeza, cuando se mide en las
condiciones de prueba dadas en la especificación, de al menos un 5%,
mientras que la dureza d, cuando se mide en las condiciones de
prueba dadas en la especificación, es de al menos 85 unidades, tal
como 90 unidades o 100 unidades, preferiblemente 150 unidades o 200
unidades, más preferiblemente 250 unidades o 300 unidades, de la
forma más preferible 400 unidades o 600 unidades. En otra forma de
realización el polipéptido de la invención puede dar una reducción
de firmeza, cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 4%, mientras que la dureza d, cuando
se mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es
de al menos 85 unidades, tal como 90 unidades o 100 unidades,
preferiblemente 150 unidades o 200 unidades, más preferiblemente 250
unidades o 300 unidades, de la forma más preferible 400 unidades o
600 unidades. En otra forma de realización el polipéptido de la
invención puede dar una reducción de firmeza, cuando se mide en las
condiciones de prueba dadas en la especificación, de al menos un 2%,
mientras que la dureza d, cuando se mide en las condiciones de
prueba dadas en la especificación, es de al menos 85 unidades, tales
como 90 unidades o 100 unidades, preferiblemente 150 unidades o 200
unidades, más preferiblemente 250 unidades o 300 unidades, de la
forma más preferible 400 unidades o 600 unidades. En otra forma de
realización el polipéptido de la invención puede dar una reducción
de firmeza, cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 1%, mientras que la dureza d, cuando
se mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es
de al menos 85 unidades, tales como 90 unidades o 100 unidades,
preferiblemente 150 unidades o 200 unidades, más preferiblemente 250
unidades o 300 unidades, de la manera más preferible 400 unidades o
600 unidades.
Cuando el polipéptido de la invención se añade
junto con 300 MANU Novamyl®/kg de harina éste puede dar una
reducción de firmeza, cuando se mide en las condiciones de prueba
dadas en la especificación, de al menos un 5%, mientras la dureza d,
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, es de al menos 15 unidades, tales como 20 unidades o
30 unidades, preferiblemente 40 unidades o 50 unidades, más
preferiblemente 60 unidades o 70 unidades, de la forma más
preferible 85 unidades o 100 unidades. En otra forma de realización
el polipéptido de la invención puede dar una reducción de firmeza,
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 4%, mientras la dureza d, cuando se
mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es de
al menos 15 unidades, tal como 20 unidades o 30 unidades,
preferiblemente 40 unidades o 50 unidades, más preferiblemente 60
unidades o 70 unidades, de la forma más preferible 85 unidades o 100
unidades. En otra forma de realización el polipéptido de la
invención puede dar una reducción de firmeza, cuando se mide en las
condiciones de prueba dadas en la especificación, de al menos un 2%,
mientras la dureza d, cuando se mide en las condiciones de prueba
dadas en la especificación, es de al menos 15 unidades, tal como 20
unidades o 30 unidades, preferiblemente 40 unidades o 50 unidades,
más preferiblemente 60 unidades o 70 unidades, de la forma más
preferible 85 unidades o 100 unidades. En otra forma de realización
el polipéptido de la invención puede dar una reducción de firmeza,
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 1%, mientras dHardness (dureza d),
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, es de al menos 15 unidades, tal como 20 unidades o
30 unidades, preferiblemente 40 unidades o 50 unidades, más
preferiblemente 60 unidades o 70 unidades, de la forma más
preferible 85 unidades o 100 unidades.
Para fines de cocción el polipéptido de la
invención puede dar una reducción de firmeza, cuando se mide en las
condiciones de prueba dadas en la especificación, de al menos un 5%,
mientras dMobility (movilidad d), cuando se mide en las condiciones
de prueba dadas en la especificación, es de al menos 300 unidades,
tal como 400 unidades o 500 unidades, preferiblemente 600 unidades o
700 unidades, más preferiblemente 800 unidades o 900 unidades, de la
forma más preferible 1000 unidades o 1200 unidades. En otra forma de
realización el polipéptido de la invención puede dar una reducción
de firmeza, cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 4%, mientras dMobility, cuando se
mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es de
al menos 300 unidades, tal como 400 unidades o 500 unidades,
preferiblemente 600 unidades o 700 unidades, más preferiblemente 800
unidades o 900 unidades, de la forma más preferible 1000 unidades o
1200 unidades. En otra forma de realización el polipéptido de la
invención puede dar una reducción en la firmeza, cuando se mide en
las condiciones de prueba dadas en la especificación, de al menos un
2%, mientras dMobility, cuando se mide en las condiciones de prueba
dadas en la especificación, es de al menos 300 unidades, tal como
400 unidades o 500 unidades, preferiblemente 600 unidades o 700
unidades, más preferiblemente 800 unidades o 900 unidades, de la
forma más preferible 1000 unidades o 1200 unidades. En otra forma de
realización el polipéptido de la invención puede dar una reducción
de firmeza, cuando medido en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos 1%, mientras dMobility, cuando medido en
las condiciones de prueba dadas en la especificación, es al menos
300 unidades, tales como 400 unidades o 500 unidades,
preferiblemente 600 unidades o 700 unidades, más preferiblemente 800
unidades o 900 unidades, de la forma más preferible 1000 unidades o
1200 unidades.
Cuando el polipéptido de la invención se añade
junto con 300 MANU Novamyl®/kg de harina éste puede dar una
reducción de firmeza, cuando se mide en las condiciones de prueba
dadas en la especificación, de al menos un 5%, mientras dMobility,
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, es de al menos 1000 unidades, tal como 1100 unidades
o 1200 unidades, preferiblemente 1400 unidades o 1500 unidades, más
preferiblemente 1800 unidades o 2000 unidades, de la forma más
preferible 2200 unidades o 2500 unidades. En otra forma de
realización el polipéptido de la invención puede dar una reducción
de firmeza, cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 4%, mientras dMobility, cuando se
mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es de
al menos 1000 unidades, tal como 1100 unidades o 1200 unidades,
preferiblemente 1400 unidades o 1500 unidades, más preferiblemente
1800 unidades o 2000 unidades, de la forma más preferible 2200
unidades o 2500 unidades. En otra forma de realización el
polipéptido de la invención puede dar una reducción de firmeza,
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 2%, mientras dMobility, cuando se
mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es al
menos 1000 unidades, tal como 1100 unidades o 1200 unidades,
preferiblemente 1400 unidades o 1500 unidades, más preferiblemente
1800 unidades o 2000 unidades, de la forma más preferible 2200
unidades o 2500 unidades. En otra forma de realización el
polipéptido de la invención puede dar una reducción de firmeza,
cuando se mide en las condiciones de prueba dadas en la
especificación, de al menos un 1%, mientras dMobility, cuando se
mide en las condiciones de prueba dadas en la especificación, es de
al menos 1000 unidades, tal como 1100 unidades o 1200 unidades,
preferiblemente 1400 unidades o 1500 unidades, más preferiblemente
1800 unidades o 2000 unidades, de la forma más preferible 2200
unidades o 2500 unidades.
Los valores anteriores para la reducción de la
firmeza, dHardness y dMobility son particularmente relevantes para
el pan, en particular para el pan preparado por el método de esponja
y masa. Una correlación similar entre reducción de firmeza y
dHardness y dMobility se describe en el Ejemplo 7.
La enzima híbrida de la presente invención se
puede usar opcionalmente junto con una o más enzimas adicionales
y/o agentes antiendurecimiento.
Agentes antiendurecimiento incluyen, pero de
forma no limitativa, emulsionantes, hidrocoloides y agentes
antiendurecimiento enzimáticos. Como se utiliza en este caso, un
agente antiendurecimiento se refiere a un agente químico, enzimático
o biológico que puede retardar el endurecimiento de los productos a
base de masa, es decir, que puede reducir el índice de deterioro de
la blandura del producto a base de masa durante el almacenamiento.
La blandura de productos a base de masa (y el efecto
antiendurecimiento del agente antiendurecimiento) se puede evaluar
empíricamente por los panaderos expertos o medir usando un
analizador de textura (por ejemplo; TAXT2), como se conoce en la
técnica.
Ejemplos de agentes antiendurecimiento químicos
incluyen lípidos polares, por ejemplo, ácidos grasos y sus ésteres
de monoglicéridos, tales como, se describe en la patente
estadounidense nº. 4.160.848.
El agente antiendurecimiento puede ser una
enzima antiendurecimiento, la cual preferiblemente se añade a la
masa antes de cocinarla (p. ej., hornearla). Ejemplos de enzimas
antiendurecimiento incluyen, sin limitación,
endo-amilasas, tales como los híbridos de la
invención, exo-endo-amilasas, tales
como, por ejemplo, la exo-amilasa descrita en la
patente estadounidense nº. 6.667.065 y US 2004/0043109, pululanasas,
glicosiltransferasas, amiloglicosidasas, enzimas de ramificación
(enzima ramificadora
1,4-alfa-glyucan),
4-alfa-glucanotransferasas
(transferasa de dextrina), beta-amilasas,
alfa-amilasas maltogénicas, lipasas, fosfolipasas,
galactolipasas, aciltransferasas, pectato liasas, xilanasas,
endotransglucosilasas de xiloglucano, proteasas, por ejemplo, como
se describe en WO 2003/084331, peptidasas y combinaciones de las
mismas.
La amilasa puede ser de un hongo, bacteria o
planta. Puede ser una endo-amilasa, por ejemplo, de
Bacillus, particularmente B. licheniformis o B.
amyloliquefaciens, una beta-amilasa, por
ejemplo, de planta (p. ej., soja) o de fuentes microbianas (por
ejemplo, Bacillus), tal como la alfa-amilasa de
Bacillus clausii no maltogénica descrita en WO9950399A2, la
amilasa Pseudomonas saccharofilia en la SEC ID NO: 1 de WO
2004111217, o una glucoamilasa, o una endo-amilasa
fúngica, por ejemplo, de A. niger o A. oryzae.
Más preferiblemente, la enzima adicional es una
enzima de antiendurecimiento y preferiblemente la enzima de
antiendurecimiento es una amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133). Las
amilasas maltogénicas se añaden a la masa en una cantidad eficaz
para retardar el endurecimiento del producto, tal como, al menos 500
MANU/kg de harina, más preferiblemente en una cantidad de al menos
500 a 1500 MANU/kg de harina. Una amilasa maltogénica se puede
obtener de cualquier fuente adecuada, tal como derivada de una
bacteria, tal como Bacillus, preferiblemente B.
stearothermophilus, por ejemplo, de la cepa NCIB 11837 o una
variante de la mismo hecha por modificación de aminoácido (EP 494233
B1, Pat nº. 6.162.628). La amilasa maltogénica se puede añadir
preferiblemente en una dosis de 20 a 2000 MANU/kg de harina,
preferiblemente 500 a 1000 MANU/kg de harina, más preferiblemente,
al menos 750 MANU/kg de harina, al menos 1000 MANU/kg de harina. Una
amilasa maltogénica preferida es Novamyl® (disponible a través de
Novozymes A/S).
En otra forma de realización preferida, la
enzima antiendurecimiento es una xilanasa. La xilanasa se puede
obtener de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, de Bacillus, por
ejemplo, Bacillus subtilis, como se describe en WO
2003/010923, WO 2001/066711 o WO 2000/039289, y Aspergillus, en
particular de A. aculeatus, A. niger, A. awamori, o A.
tubigensis o Trichoderma y Thermomyces como se describe en WO
96/32472, por ejemplo, T. reesei, o de una cepa de Humicola,
por ejemplo, H. insolens. Opcionalmente, una enzima adicional
se puede utilizar con las enzimas antiendurecimiento anteriores,
tales como, una enzima lipolítica, particularmente actividad
fosfolipasa, galactoilipasa y/o triacil glicerol lipasa, por
ejemplo, como se describe en WO 9953769, WO 0032758, WO 0200852 o WO
2002066622. O por ejemplo, una transglutaminasa, una enzima
celulítica, por ejemplo, una celulasa, una aciltransferasa, una
proteína disulfuro isomerasa, una pectinasa, una pectato liasa, una
oxidorreductasa. La enzima puede ser de cualquier origen, incluyendo
de origen mamífero, vegetal, y preferiblemente microbiano
(bacteriano, de levadura o fúngico) y se puede obtener por técnicas
usadas de forma convencional en la técnica.
La enzima adicional también puede ser una enzima
lipolítica, particularmente actividad fosfolipasa, galactoilipasa
y/o triacil glicerol lipasa, por ejemplo, como se describe en WO
9953769, WO 0032758, WO 0200852 o WO 2002066622.
Además, la enzima adicional puede ser una
segunda amilasa, una glucanotransferasa de ciclodextrina, una
proteasa o peptidasa, en particular una exopeptidasa, una
transglutaminasa, una lipasa, una fosfolipasa, una celulasa, una
hemicelulasa, una glicosiltransferasa, una enzima ramificadora
(enzima ramificadora
1,4-alfa-glucano) o una
oxidorreductasa. La enzima adicional puede ser de origen mamífero,
vegetal o microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico).
La segunda amilasa puede ser de un hongo,
bacteria o planta. Puede ser una amilasa maltogénica (EC
3.2.1.133), por ejemplo, de B. stearothermophilus, una
endo-amilasa, por ejemplo, de Bacillus,
particularmente B. licheniformis o B.
amyloliquefaciens, una beta-amilasa, por
ejemplo, de planta (p. ej., soja) o de fuentes microbianas (por
ejemplo, Bacillus), una glucoamilasa, por ejemplo, de A.
niger, o una endo-amilasa fúngica, por ejemplo,
de A. oryzae o de Pseudomonas saccharofilia tal como
la alfa-amilasa no maltogénica descrita en
WO9950399A2.
La hemicelulasa puede ser una pentosanasa, por
ejemplo, una xilanasa que puede ser de origen microbiano, por
ejemplo, derivada de una bacteria u hongo, tal como una cepa de
Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger, A.
awamori, o A. tubigensis, de una cepa de Trichoderma, por
ejemplo, T. reesei, o de una cepa de Humicola, por ejemplo,
H. insolens.
La proteasa puede ser de Bacillus, por ejemplo,
B. amyloliquefaciens.
La oxidorreductasa puede ser una glucosa
oxidasa, una carbohidrato oxidasa, una hexosa oxidasa, una
lipoxigenasa, una peroxidasa, o una lacasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima híbrida de la presente invención se
puede proporcionar como una masa y/o aditivo de mejora del pan en
forma de un granulado o polvo aglomerado. La masa y/o aditivo de
mejora del pan puede tener preferiblemente una distribución del
tamaño de las partículas reducida con más de un 95% (en peso) de las
partículas en el rango de 25 a 500 \muM.
En una forma de realización preferida una
composición, por ejemplo, un aditivo de mejora del pan, se produce
en un proceso que incluye las etapas de; a) proporcionar una primera
secuencia de aminoácidos teniendo actividad
endo-amilasa; b) proporcionar una segunda secuencia
de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos; c)
y construir un polipéptido comprendiendo dicha primera secuencia de
aminoácidos y segunda secuencia de aminoácidos; d) proporcionar una
secuencia de ADN codificando dicho polipéptido; e) expresar dicha
secuencia de ADN en una célula huésped adecuada y recuperar dicho
polipéptido; f) añadir dicho polipéptido a harina o a un granulado o
polvo aglomerado.
Los granulados y polvos aglomerados se pueden
preparar por métodos convencionales, por ejemplo, pulverizando la
amilasa, es decir la enzima híbrida, sobre un portador en un
granulador de lecho fluidizado. El portador puede consistir en
núcleos granulosos con un tamaño de partícula adecuado. El portador
puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o
sulfato de sodio), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), un
alcohol de azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, sémola de
maíz, o soja.
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido de esta invención, es decir una
endo-amilasa con un CBM, posee propiedades valiosas
que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En
particular, enzimas del primer aspecto son aplicables como un
componente en composiciones detergentes de lavado, lavado de vajilla
y limpieza de superficie duras. Numerosas variantes son
particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol de
almidón, y/o para el desencolado textil. Un ejemplo de producción de
etanol, donde se puede utilizar una endo-amilasa de
la invención se describe en la patente estadounidense nº. 5.231.017
la cual se incorpora por referencia por la presente.
Además, un proceso donde se puede utilizar una
endo amilasa de la invención se describe en la solicitud de patente
danesa PA 2003 01568 (por la presente incorporada por referencia).
Dicho proceso comprende hidrolizar almidón en un hidrolizado de
almidón soluble a una temperatura inferior a la temperatura de
gelatinización inicial de dicho almidón granulado. Otro proceso
adecuado se describe en WO2004081193 (por la presente incorporado
por referencia).
Condiciones para procesos de conversión de
almidón convencionales, incluyendo la licuefacción de almidón y/o
procesos de sacarificación se describen en, por ejemplo, 3.912.590 y
en las publicaciones de patente EP Nos. 252.730 y 63.909.
Un uso preferido es en un proceso de
fermentación donde un sustrato de almidón se licúa y/o sacarifica en
presencia de la endo-amilasa teniendo un CBM para
producir glucosa y/o maltosa, por ejemplo, para el uso como
edulcorantes o adecuado para la conversión en un producto de
fermentación por un organismo de fermentación, preferiblemente una
levadura. Tales procesos de fermentación incluyen un proceso para
producir etanol para etanol combustible o potable (alcohol
portátil), un proceso para producir una bebida, un proceso para
producir compuestos orgánicos, tal como ácido cítrico, ácido
itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; cetonas; aminoácidos,
tales como ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), pero también
más compuestos complejos tales como antibióticos, tales como
penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas, tales como
riboflavina, B12, betacarotenos; hormonas, las cuales son difíciles
de producir sintéticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Un proceso "tradicional" para la conversión
de almidón a jarabes de fructosa normalmente consiste en tres
procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de
licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso de
isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón se
degrada a dextrinas por una endo-amilasa,
preferiblemente por una endo-amilasa con un CBM, tal
como el polipéptido de la invención a valores de pH de entre 5.5 y
6.2 y a temperaturas de 95-160ºC durante un periodo
de aprox. 2 horas. Para asegurar una estabilidad enzimática óptima
bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones de
calcio libres).
Después del proceso de licuefacción las
dextrinas se convierten en dextrosa por la adición de una
glucoamilasa (por ejemplo, AMG^{TM}) y una enzima desramificante,
tal como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej., Promozyme^{TM}).
Antes de esta fase el pH se reduce a un valor inferior a 4.5,
manteniendo la alta temperatura (por encima de 95ºC), y se
desnaturaliza la actividad endo-amilasa
liquefactante. La temperatura se baja a 60ºC, y se agrega
glucoamilasa y enzima desramificante. El proceso de sacarificación
continúa durante 24-72 horas.
Después del proceso de sacarificación el pH se
aumenta a un valor en el rango de pH de 6-8,
preferiblemente 7.5, y el calcio se retira por intercambio iónico.
El jarabe de dextrosa se convierte luego en jarabe rico en fructosa
usando, por ejemplo, una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como
Sweetzyme^{TM}).
En una forma de realización de un proceso de
almidón de la invención, se descompone materia prima de grano entero
gelatinizada molida (hidrolizada) en maltodextrinas (dextrinas)
principalmente de un DE superior a 4 usando el polipéptido del
primer aspecto. La materia prima es en una forma de realización de
la invención grano molido (entero).
En una forma de realización de la invención, se
lleva a cabo una licuefacción enzimática como un proceso de
compuesto acuoso caliente de tres pasos. El compuesto acuoso se
calienta a entre 60-95ºC, preferiblemente
80-85ºC, y la(s) enzima(s) se
añade(n) para iniciar la licuefacción (dilución), se añade al
menos un polipéptido del primer aspecto. Entonces el compuesto
acuoso se cuece a chorro a una temperatura entre de
95-140ºC, preferiblemente 105-125ºC
para completar la gelanitización del compuesto acuoso. Luego el
compuesto acuoso se enfría a 60-95ºC y más
enzima(s), preferiblemente comprendiendo el polipéptido del
primer aspecto, se añade(n) para finalizar la hidrólisis
(licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción se realiza a
pH 4.5-6.5, en particular a un pH entre 5 y 6. Los
granos enteros molidos y licuados se conocen como masa. El
polipéptido del primer aspecto se puede añadir en cantidades
eficaces bien conocidas por el experto en la técnica.
En un aspecto el proceso puede comprender; a)
poner en contacto un sustrato de almidón con una
endo-amilasa teniendo un CBM, por ejemplo, el
polipéptido del primer aspecto; b) incubar dicho sustrato de almidón
con dicho polipéptido y una alfa-amilasa fúngica y/o
o una glucoamilasa durante un tiempo y a una temperatura suficiente
para conseguir la licuefacción y la sacarificación de al menos un
90%, o al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos
un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos
un 99,5% p/p de dicho sustrato de almidón en azúcares fermentables;
c) fermentar hasta producir un producto de fermentación, d)
opcionalmente recuperar el producto de fermentación.
En otro aspecto el proceso comprendiendo la
licuefacción y/o la hidrólisis de un compuesto acuoso de almidón
gelatinizado o granulado, en particular la licuefacción y/o la
hidrólisis de almidón granulado en un hidrolizado de almidón soluble
a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización
inicial de dicho almidón granulado. Además de haberse puesto en
contacto con un polipéptido de la invención, p. ej, el polipéptido
del primer aspecto, el almidón se puede poner en contacto con una
enzima seleccionada del grupo que consiste en; una
alfa-amilasa fúngica (EC 3.2.1.1), una
beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), y una glucoamilasa
(E.C.3.2.1.3). En una forma de realización se puede añadir además
una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (E.C. 3.2.1.68) o
unas pululanasas
(E.C. 3.2.1.41).
(E.C. 3.2.1.41).
En una forma de realización el proceso se lleva
a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de
gelatinización inicial. Preferiblemente la temperatura en la cual
los procesos se llevan a cabo es al menos 30ºC, al menos 31ºC, al
menos 32ºC, al menos 33ºC, al menos 34ºC, al menos 35ºC, al menos
36ºC, al menos 37ºC, al menos 38ºC, al menos 39ºC, al menos 40ºC, al
menos 41ºC, al menos 42ºC, al menos 43ºC, al menos 44ºC, al menos
45ºC, al menos 46ºC, al menos 47ºC, al menos 48ºC, al menos 49ºC, al
menos 50ºC, al menos 51ºC, al menos 52ºC, al menos 53ºC, al menos
54ºC, al menos 55ºC, al menos 56ºC, al menos 57ºC, al menos 58ºC, al
menos 59ºC, o preferiblemente al menos 60ºC. El pH al cual se lleva
a cabo el proceso puede en estar en el rango de 3.0 a 7.0,
preferiblemente de 3.5 a 6.0, o más preferiblemente de
4.0-5.0. En una forma de realización preferida el
proceso comprende la fermentación, p. ej con una levadura para
producir etanol, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente
32ºC, tal como de 30 a 35ºC. Durante la fermentación el contenido de
etanol alcanza al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al
menos un 10% tal como al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un
13%, al menos un 14%, al menos un 15% tal como al menos un 16% de
etanol (p/p).
El compuesto acuoso de almidón a usar en
cualquiera de los aspectos anteriores pueden tener un
20-55% de almidón granulado de sólidos secos,
preferiblemente un 25-40% de almidón granulado de
sólidos secos, más preferiblemente un 30-35% de
almidón granulado de sólidos secos. Después de ponerse en contacto
con la endo-amilasa teniendo un CBM, p. ej, el
polipéptido del primer aspecto al menos un 85%, al menos un 86%, al
menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al
menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al
menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o
preferiblemente al menos un 99% de los sólidos secos del almidón
granulado se convierte en un hidrolizado de almidón soluble.
La endo-amilasa con un CBM, p.
ej, el polipéptido del primer aspecto, se puede utilizar en un
proceso para la licuefacción, la sacarificación de un almidón
gelatinizado, por ejemplo, pero no limitándose a la gelatinización
por cocinado a chorro. El proceso puede comprender la fermentación
para producir un producto de fermentación, por ejemplo, etanol. Tal
proceso para producir etanol a partir de material conteniendo
almidón por fermentación comprende: (i) licuefactar dicho material
conteniendo almidón con una endo-amilasa conteniendo
un CBM, p. ej, el polipéptido del primer aspecto; (ii) sacarificar
la masa licuada obtenida; (iii) fermentar el material obtenido en la
fase (ii) en presencia de un organismo de fermentación.
Opcionalmente el proceso comprende además la recuperación del
etanol. La sacarificación y la fermentación se pueden realizar como
una proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso
SSF). Durante la fermentación el contenido de etanol alcanza al
menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10% tal
como al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un
14%, al menos un 15% tal como al menos un 16% de etanol.
El almidón a procesar en cualquiera de los
procesos anteriores se puede obtener en particular a partir de
tubérculos, raíces, tallos, leguminosas, cereales o grano entero.
Más específicamente el almidón granulado se puede obtener a partir
de granos, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca,
tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, plátanos o patatas. Se
contemplan especialmente ambos tipos ceroso y no ceroso de maíz y
cebada.
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La invención también se refiere a una
composición comprendiendo el polipéptido del primer aspecto. La
composición puede comprender además una enzima seleccionada del
grupo comprendido por; una alfa-amilasa fúngica (EC
3,2,1,1), una beta-amilasa (E.C. 3,2,1,2), una
glucoamilasa (E.C.3,2,1,3) y unas pululanasas (E.C. 3,2,1,41). La
glucoamilasa puede derivar preferiblemente de una cepa de
Aspergillus sp., tal como Aspergillus niger, o de una
cepa de Talaromyces sp. y en particular derivar de
Talaromyces leycettanus tal como la glucoamilasa descrita en
la patente estadounidense nº. Re. 32.153, Talaromyces duponti
y/o Talaromyces thermopiles tales como las glucoamilasas
descritas en la patente estadounidense nº. 4.587.215 y más
preferiblemente se deriva de Talaromyces emersonii. De la
forma más preferible la glucoamilasa se deriva de la cepa CBS 793.97
de Talaromyces emersonii y/o teniendo la secuencia descrita
como la SEC ID nº: 7 en WO 99/28448. Es más preferible una
glucoamilasa teniendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos
un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos
un 90% o incluso al menos un 95% de homología con la secuencia de
aminoácidos mencionada. Una preparación de glucoamilasa de
Talaromyces comercial se suministra por Novozymes A/S como Spirizyme
Fuel.
También se prefieren para una composición
comprendiendo el polipéptido del primer aspecto y una glucoamilasa
polipéptidos teniendo actividad glucoamilasa los cuales se derivan
de una cepa del género Trametes, preferiblemente Trametes
cingulata. Se prefieren además polipéptidos teniendo actividad
glucoamilasa y conteniendo al menos un 50%, al menos un 60%, al
menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o incluso al menos un
95% de homología con los aminoácidos para los aminoácidos de
polipéptido maduros del 1 al 575 de la SEC ID nº: 5 en la solicitud
de patente estadounidense 60/650,612.
También se prefiere para una composición
comprendiendo el polipéptido del primer aspecto y una glucoamilasa
polipéptidos teniendo actividad glucoamilasa los cuales se derivan
de una cepa del género Pachykytospora, preferiblemente
Pachykytospora papiracea. También se prefieren los
polipéptidos teniendo actividad glucoamilasa y conteniendo al menos
un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos
un 90% o incluso al menos un 95% de homología con los aminoácidos
para los aminoácidos de polipéptido maduros del 1 al 556 de la SEC
ID nº: 2 en la solicitud de patente estadounidense 60/650.612.
La composición anteriormente descrita se puede
utilizar licuefactar y/o sacarificar un almidón gelatinizado o
granulado, al igual que un almidón parcialmente gelatinizado, por
ejemplo en una producción de edulcorante, o un proceso de
fermentación, tal como para etanol. Un almidón parcialmente
gelatinizado es un almidón que se gelatiniza hasta cierto punto, es
decir donde parte del almidón se ha hinchado y gelatinizado
irreversiblemente y parte del almidón sigue estando presente en un
estado granuloso.
La composición anteriormente descrita también
puede comprender una alfa-amilasa ácida fúngica
presente en una cantidad de 0,01 a 10 AFAU/g de DS, preferiblemente
de 0,1 a 5 AFAU/g de DS, más preferiblemente de 0,5 a 3 AFAU/AGU, y
de la forma más preferible de 0,3 a 2 AFAU/g DS. La composición se
puede añadir en cualquiera de los procesos de almidón anteriormente
descritos.
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A partir de almidón gelatinizado: en este
aspecto la presente invención se refiere a un proceso para producir
un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir de
material conteniendo almidón, incluyendo el proceso una fase de
licuefacción y una fase(s) de sacarificación y fermentación
realizadas separada o simultáneamente. El producto de fermentación,
tal como especialmente etanol, se puede recuperar opcionalmente
después de la fermentación, por ejemplo, por destilación. Materias
primas adecuadas con almidón se catalogan en la sección
"Materiales conteniendo almidón", más adelante. Enzimas
contempladas se catalogan en la sección "Enzimas", más
adelante. La fermentación se realiza preferiblemente en presencia de
levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces. Organismos de
fermentación adecuados se catalogan en la sección "Organismos de
fermentación", más adelante.
Un proceso preferido comprende a) poner en
contacto un compuesto de almidón acuoso con un polipéptido
comprendiendo una primera secuencia de aminoácidos teniendo
actividad alfa-amilasa y una segunda secuencia de
aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos, b)
incubar dicho compuesto acuoso de almidón con dicho polipéptido, c)
fermentar para producir un producto de fermentación, y d)
opcionalmente recuperar el producto de fermentación. Preferiblemente
el paso b) se realiza durante un tiempo y a una temperatura
suficiente para conseguir la conversión de al menos un 90% p/p de
dicho sustrato de almidón en azúcares fermentables. Preferiblemente
la primera secuencia de aminoácidos y/o la segunda secuencia de
aminoácidos de dicho polipéptido se deriva de una bacteria. Dicho
polipéptido puede ser preferiblemente el híbrido del primer
aspecto.
El compuesto acuoso puede contener un
10-40% en peso, preferiblemente un
25-35% en peso de material conteniendo almidón. El
compuesto acuoso se calienta a una temperatura mayor a la de
gelatinización y se puede añadir alfa-amilasa
fúngica bacteriana y/o ácida para iniciar la licuefacción
(dilución). En una forma de realización el compuesto acuoso se puede
cocinar a chorro para gelatinizar aún más el compuesto acuoso antes
de someterse a una alfa-amilasa en la fase (a) de la
invención.
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Más específicamente la licuefacción se puede
realizar como un proceso de compuesto acuoso caliente de tres
fases. El compuesto acuoso se calienta a entre
60-95ºC, preferiblemente 80-85ºC, y
se añade alfa-amilasa para iniciar la licuefacción
(dilución). Después el compuesto acuoso se puede cocer a chorro a
una temperatura de entre 95-140ºC, preferiblemente
105-125ºC, durante 1-15 minutos,
preferiblemente durante 3-10 minutos, especialmente
alrededor de 5 minutos. El compuesto acuoso se enfría a
60-95ºC y se añade más alfa-amilasa
para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso
de licuefacción se realiza normalmente a pH 4.5-6.5,
en particular a un pH entre 5 y 6. Los granos enteros molidos y
licuados se conocen como puré.
La sacarificación en la fase se puede realizar
usando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un
proceso de sacarificación completo puede durar hasta de
aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, no obstante, es común
hacer solamente una pre-sacarificación de
típicamente 40-90 minutos a una temperatura de entre
30-65ºC, normalmente de aproximadamente 60ºC,
seguida de la sacarificación completa durante la fermentación en un
proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La
sacarificación se realiza normalmente a temperaturas de
30-65ºC, normalmente alrededor de 60ºC, y a un pH de
entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4.5.
El proceso más extensamente usado en la
producción de etanol es el proceso de sacarificación y fermentación
simultáneas (SSF), en el cual no hay ninguna fase de retención para
la sacarificación, significando que los organismos de fermentación,
tales como levadura, y enzima(s) se pueden juntos. Al
realizar el SSF es común introducir una fase de
pre-sacarificación a una temperatura mayor de 50ºC,
justo antes de la fermentación.
Conforme a la presente invención la fase de
fermentación (c) incluye, sin limitación, procesos de fermentación
usados para producir alcoholes (p. ej., etanol, metanol, butanol);
ácidos orgánicos (p. ej., ácido cítrico, ácido acético, ácido
itacónico, ácido láctico, ácido glucónico); cetonas (p. ej.,
acetona); aminoácidos (p. ej., ácido glutámico); gases (p. ej., H2 y
CO2); antibióticos (p. ej., penicilina y tetraciclina); enzimas;
vitaminas (p. ej., riboflavina, B12, betacaroteno); y hormonas.
Procesos de fermentación preferidos incluyen procesos de
fermentación alcohólicos, como se conocen en la técnica. Son
procesos de fermentación preferidos los procesos de fermentación
anaeróbicos, como se conocen bien en la técnica.
A partir de almidón no gelatinizado: en
esta forma de realización la invención se refiere a procesos para
producir un producto de fermentación a partir de material
conteniendo almidón sin la gelatinización del material conteniendo
almidón. En una forma de realización se usa un polipéptido de la
invención, por ejemplo la enzima híbrida del primer aspecto, y
opcionalmente una glucoamilasa durante la sacarificación y la
fermentación. Según la invención el producto de fermentación
deseado, tal como etanol, se puede producir sin licuefactar el
compuesto acuoso conteniendo el material con almidón. En una forma
de realización un proceso de la invención incluye sacarificar
material conteniendo almidón molido por debajo de la temperatura de
gelatinización inicial en presencia de la enzima híbrida del primer
aspecto y una glucoamilasa para producir azúcares que se pueden
fermentar en el producto de fermentación deseado mediante un
organismo de fermentación adecuado.
Un proceso preferido comprende a) poner en
contacto un compuesto acuoso de almidón granulado acuoso con un
polipéptido comprendiendo una primera secuencia de aminoácidos
teniendo actividad alfa-amilasa y una segunda
secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a
carbohidratos, b) incubar dicho compuesto acuoso de almidón con
dicho polipéptido, c) fermentar para producir un producto de
fermentación, y d) opcionalmente recuperar el producto de
fermentación. Preferiblemente la fase b) se realiza durante un
tiempo y a una temperatura suficientes para conseguir la conversión
de al menos un 90% p/p de dicho sustrato de almidón en azúcares
fermentables. Preferiblemente la primera secuencia de aminoácidos
y/o la segunda secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido se
deriva de una bacteria. Dicho polipéptido puede ser preferiblemente
el híbrido del primer aspecto.
El término "temperatura de gelatinización
inicial" significa la temperatura mínima a la cual comienza la
gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua comienza a
gelatinizarse a entre 50ºC y 75ºC; la temperatura exacta de
gelatinización depende del almidón específico, y puede ser
fácilmente determinada por el experto en la técnica. Así, la
temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie
de la planta, la variedad particular de la especie de planta al
igual que con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta
invención la temperatura de gelatinización inicial de un material
conteniendo almidón dado es la temperatura a la cual la
birrefringencia se pierde en un 5% de los gránulos de almidón usando
el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Stärke,
Vol. 44 (12) págs. 461-466 (1992).
Antes de la fase (a) se puede preparar un
compuesto acuoso de material con almidón, tal como almidón
granulado, teniendo un 20-55% en peso de sólidos
secos, preferiblemente un 25-40% en peso de sólidos
secos, más preferiblemente un 30-35% de sólidos
secos de material con almidón. El compuesto acuoso puede incluir
agua y/o aguas de proceso, tales como aguas residuales (volúmenes
anteriores), agua del lavador, condensada o destilada del
evaporador, agua de destilación de la depuradora lateral, u otro
agua del proceso del producto de fermentación vegetal. Debido a que
el proceso de la invención se realiza por debajo de la temperatura
de gelatinización y por tanto no tiene lugar un aumento de
viscosidad significante, se pueden usar altos niveles de aguas
residuales si se desea. En una forma de realización el compuesto
acuoso contiene de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 70% en
volumen de aguas residuales, preferiblemente un
15-60% en volumen de aguas residuales, especialmente
de aproximadamente un 30 a un 50% en volumen de aguas
residuales.
\newpage
El material molido conteniendo almidón se puede
preparar moliendo material conteniendo almidón hasta conseguir un
tamaño de partícula de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente de
0,1-0,5 mm. Después de haberse sometido a un proceso
de la invención al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%,
al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%,
al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%,
al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o preferiblemente
al menos un 99% de los sólidos secos del material conteniendo
almidón se convierte en un hidrolizado de almidón soluble.
El proceso de la invención se lleva a cabo a una
temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial.
Preferiblemente la temperatura a la cual la fase (a) se realiza es
de entre 30-75ºC, preferiblemente de entre
45-60ºC.
En una forma de realización preferida la fase
(a) y la fase (b) se realizan como un proceso de sacarificación y
fermentación simultáneas. En tal forma de realización preferida el
proceso se lleva a cabo normalmente a una temperatura de entre 28ºC
y 36ºC, tal como a entre 29ºC y 35ºC, tal como a entre 30ºC y 34ºC,
tal como alrededor de 32ºC. Según la invención la temperatura se
puede aumentar o disminuir durante la fermentación.
En una forma de realización la sacarificación y
fermentación simultáneas se llevan a cabo de modo que el nivel de
azúcar, así como el nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo
tal como por debajo de aproximadamente un 3% en peso,
preferiblemente por debajo de aproximadamente un 2% en peso, más
preferiblemente por debajo de aproximadamente un 1% en peso, incluso
más preferiblemente por debajo de aproximadamente un 0,5%, o incluso
más preferiblemente por debajo de aproximadamente un 0,1% en peso.
Tales niveles bajos de azúcar se pueden conseguir simplemente
utilizando cantidades de enzima y organismo de fermentación
ajustadas. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué
cantidades de enzima y organismo de fermentación se deben emplear.
Las cantidades empleadas de enzima y organismo de fermentación
también ser pueden seleccionar para mantener concentraciones bajas
de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de
maltosa puede mantenerse por debajo de aproximadamente un 0,5% en
peso o por debajo de aproximadamente un 0,2% en peso.
El proceso de la invención se puede llevar a
cabo a un pH en el rango de entre 3 y 7, preferiblemente de 3,5 a 6,
o más preferiblemente de 4 a 5.
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Cualquier materia prima adecuada conteniendo
almidón, incluyendo almidón granulado, se puede utilizar según la
presente invención. La materia prima se selecciona generalmente en
base al producto de fermentación deseado. Ejemplos de materias
primas conteniendo almidón, adecuadas para el uso en un proceso de
la presente invención, incluyen tubérculos, raíces, tallos, granos
enteros, granos, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú,
mandioca, tapioca, sorgo, guisantes de arroz, alubias, o cereales,
materias primas conteniendo azúcares, tales como melaza, materias de
fruta, azúcar, bastonera o remolacha azucarera, patatas, y materias
conteniendo celulosa, tales como madera o residuos vegetales. Se
contemplan ambos tipos no cerosos y cerosos de maíz y cebada.
El término "almidón granulado" significa
almidón crudo no cocido, es decir, almidón en su forma natural
encontrada en cereales, tubérculos o granos. El almidón se forma
dentro de células vegetales como gránulos ínfimos insolubles en
agua. Al ponerlo en agua fría, los gránulos de almidón pueden
absorber una pequeña cantidad del líquido e hincharse. A
temperaturas de hasta 50ºC a 75ºC el hinchamiento puede ser
reversible. No obstante, a temperaturas más altas comienza un
hinchamiento irreversible llamado "gelatinización". El almidón
granulado a procesar puede ser un almidón de calidad altamente
refinada, preferiblemente de al menos un 90%, al menos un 95%, al
menos un 97% o al menos un 99,5% puro o éste puede ser un almidón
más crudo conteniendo material comprendiendo grano entero molido
incluyendo fracciones no amiláceas tales como residuos de germen y
fibras. La materia prima, tal como grano entero, se muele para
descubrir la estructura y permitir un tratamiento posterior. Se
prefieren dos procesos de molienda según la invención: molienda
húmeda y seca. En la molienda seca se muelen y se usan granos
enteros. La molienda húmeda ofrece una buena separación de germen y
harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica frecuentemente
en lugares donde el hidrolizado de almidón se usa en la producción
de jarabes. Ambas moliendas seca y húmeda son bien conocidas en la
técnica del tratamiento de almidón y se contemplan igualmente para
el proceso de la invención.
El material con almidón se muele para exponer
más área de superficie. En una forma de realización el tamaño de
partícula es de entre 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente de
0,1-0,5 mm, o de modo que al menos un 30%,
preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un
70%, incluso más preferiblemente al menos un 90% del material molido
conteniendo almidón pase a través de una criba con una malla de
criba de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente una malla de
0,1-0,5 mm.
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El término "producto de fermentación"
significa un producto producido mediante un proceso incluyendo una
fase de fermentación usando un organismo de fermentación. Productos
de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes
(p. ej., etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (p. ej., ácido
cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido
glucónico); cetonas (p. ej., acetona); aminoácidos (p. ej., ácido
glutámico); gases (p. ej., H2 y CO2); antibióticos (p. ej.,
penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (p. ej., riboflavina,
B12, betacaroteno); y hormonas. En una forma de realización
preferida el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol
combustible; etanol potable, es decir, licores neutrales potables; o
etanol industrial o productos usados en la industria alcohólica de
consumo (p. ej., cerveza y vino), industria lechera (p. ej.,
productos lácteos fermentados), industria de cuero e industria de
tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden las cervezas Ale,
Stout, Porter, Lager, Bitter, soluciones de malta, Happoushu,
cerveza con un alto porcentaje de alcohol, cerveza con un bajo
porcentaje de alcohol, cerveza con un bajo nivel de calorías o
cerveza light. Procesos de fermentación preferidos usados incluyen
procesos de fermentación alcohólicos, como se conocen en la técnica.
procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación
anaeróbicos, como se conocen bien en la técnica.
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Con "organismo de fermentación" se hace
referencia a cualquier organismo, incluyendo organismos fúngicos y
bacterianos, adecuados para el uso en un proceso de fermentación y
capaces de producir un producto de fermentación deseado. Organismos
de fermentación especialmente adecuados son capaces de fermentar, es
decir, convertir azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o
indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de
organismos de fermentación incluyen organismos fúngicos, tales como
levadura. La levadura preferida incluye cepas de
Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces
cerevisiae.
En una forma de realización preferida el
organismo de fermentación, por ejemplo la levadura, se puede
transformar con el polipéptido del primer aspecto y aplicar en un
proceso comprendiendo; a) poner en contacto un sustrato de almidón
con una célula de organismo de fermentación transformada para
expresar un polipéptido comprendiendo una primera secuencia de
aminoácidos teniendo actividad alfa-amilasa y una
segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a
carbohidratos; b) retener dicho sustrato de almidón con dicha
levadura durante un tiempo y a una temperatura suficientes para
conseguir la conversión de al menos un 90% p/p de dicho sustrato de
almidón en azúcares fermentables; c) fermentar para producir un
producto de fermentación, por ejemplo, etanol, d) opcionalmente
recuperar el producto de fermentación, por ejemplo, etanol. Los
pasos a, b, y c se realizan separadamente o simultáneamente. En una
forma de realización preferida la primera secuencia de aminoácidos
y/o la segunda secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido se
derivan de una bacteria.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad amilolítica KNU: La actividad
amilolítica se puede determinar usando almidón de patata como
sustrato. Este método se basa en la descomposición de almidón de
patata modificado por la enzima, y la reacción se continúa mezclando
muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo.
Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la
descomposición del almidón el color azul se torna más débil y
gradualmente se transforma en un marrón rojizo, el cual se compara
con un estándar de vidrio coloreado.
Una unidad de Alfa-amilasa Kilo
Novo (KNU) se define como la cantidad de enzima que, bajo
condiciones estándar (es decir, a 37ºC+/- 0,05, 0,0003 m Ca^{2+};
y a pH 5.6) dextriniza 5,26 g de sustancia seca de almidón Merck
Amylum solubile. Una carpeta AF 9/6 describiendo este método
analítico en más detalle está disponible bajo pedido a Novozymes
A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incluye por la presente por
referencia.
Ensayo de endo actividad: La actividad de
endo-amilasa se puede determinar usando el ensayo de
endo actividad. 1 ml de sustrato de Phadebas resuspendido (0,25
comprimidos/ml 50 mM de acetato sódico, 1 mM de CaCl_{2}, ajustado
a pH 5.7) se incuba con 25 microL de enzima durante 15 min a 40ºC
con agitación. La reacción se detiene por adición de 0,5 ml de 1 m
de NaOH y la mezcla se centrifuga en un centrifugador de tabla a
14,000 r.p.m. Se mide la absorbancia del sobrenadante a 620 nm. La
actividad se determina comparando un estándar con actividad
declarada (BAN 480 L, 480 KNU/g).
Actividad amilasa maltogénica: una MANU (Unidad
de amilasa maltogénica Novo) se puede definir como la cantidad de
enzima requerida para liberar un micromol de maltosa por minuto en
una concentración de 10 mg de sustrato de maltotriosa (Sigma M 8378)
por ml de 0,1 m de tampón de citrato, a pH 5.0 a 37ºC durante 30
minutos (la unidad MANU también se define en US Pat. nº. 6.162.628,
la cual se incorpora por la presente por referencia).
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se declare de otra manera, las
manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando
métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook
et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold
Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et
al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John
Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (eds.).
\vskip1.000000\baselineskip
La amilasa AMY1048 es un amilasa de Bacillus de
tipo salvaje de un fragmento catalítico de 484 aminoácidos y además
un fragmento CBM20 de 101 aminoácidos. La secuencia de ADN
codificando la AMY1048 se incluye como la SEC ID NO: 1 y la
secuencia AMY1048 madura se incluye como la SEC ID NO: 2. En la SEC
ID NO: 1 el CBM se define como los residuos de aminoácidos del 485
al 586 los cuales corresponden a los nucleótidos
1540-1845 en la SEC ID NO: 2. La amilasa incluyendo
el CBM se puede expresar de una construcción similar a la cual se ha
descrito para otras amilasas, es decir, por ejemplo, insertada en un
vector bajo el control de un promotor constitutivo activo y
flanqueada por la secuencia señal (SEC ID NO: 15) y la secuencia del
terminador de la endo-amilasa de B.
licheniformis.
La sustitución del fragmento catalítico de la
endo-amilasa AMY1048 con un dominio catalítico de
otra endo-amilasa, creando así un híbrido del CBM a
partir de AMY1048 y una endo-amilasa nueva, se hace
amplificando el fragmento de ADN codificando el dominio catalítico
de la amilasa nueva por PCR usando dos oligonucleótidos. El
oligonucleótido sentido es en su extremidad 5' idéntico a los
últimos 20 nucleótidos de la secuencia de ADN codificando la
secuencia señal previa a la secuencia madura AMY1048 y además en
ello es extremidad 3' es idéntica al primero 20 nucleótidos de
secuencia de ADN codificando la parte madura del ADN de amilasa
deseado. Los oligonucleótidos antisentido son en su extremidad 5'
idénticos al ADN antisentido de los primeros 20 nucleótidos de la
secuencia de ADN codificando el CBM de AMY1048 y además en su
extremidad 3' es idéntica al antisentido de los últimos 20
nucleótidos de la secuencia de ADN codificando la parte madura del
ADN de amilasa deseado.
Tanto el ADN de amilasa amplificado como el
vector huésped en la amilasa AMY1048, se digiere con SacII y ScaI y
el vector y fragmentos de la PCR ligados antes de la transferencia
en la cepa SHA273 de Bacillus subtilis. En las secuencias de
cebador de debajo los sitios de reconocimiento de las enzimas de
restricción se indican mediante subrayado.
Para construir un híbrido de la
endo-amilasa de B. licheniformis (SEC ID NO:
35) y el CBM20 de la amilasa de B. flavotermus los siguientes
oligonucleótidos fueron usados por los presentes inventores:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcagcaaatcttaatgggacgct-3' | (P1s SEC ID NO: 19). |
| Antisentido: | 5'-atttgggaagtagtacttattctttgaacataaattgaaa-3' | (P1as SEC ID NO: 20). |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y la secuencia de aminoácidos del polipéptido
maduro se incluyen como SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4,
respectivamente
Para construir un híbrido de la variante LE429
de la endo-amilasa de B. licheniformis (SEC
ID NO: 41) y el CBM20 de la amilasa de B. flavotermus se
usaron los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcagtaaatggcacgctgatgca-3' | (P2s SEC ID NO: 21). |
| Antisentido: | 5'-atttgggaagtagtacttatttttggaacataaattgaaa-3' | (P2as SEC ID NO: 22). |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y la secuencia de aminoácidos del polipéptido
maduro se incluyen como SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6,
respectivamente
Para construir un híbrido de la
endo-amilasa de B. stearothermophilus (SEC ID
NO: 36) y el CBM20 de la amilasa de B. flavotermus se usaron
los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcagcaccgtttaacggctttaa-3' | (P3s SEC ID NO: 23). |
| Antisentido: | 5'-atttgggaagtagtacttattttaggaacccaaaccgaaa-3' | (P3as SEC ID NO: 24) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y la secuencia de aminoácidos del polipéptido
maduro se incluyen como SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8,
respectivamente
\newpage
Para construir un híbrido de una variante de la
endo-amilasa de sp. SP722 de Bacillus
alcalina (SEC ID NO: 38) y el CBM20 de la amilasa de B.
flavotermus se usaron los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcacatcataatgggacaaatgg-3' | (P4s SEC ID NO: 25). |
| Antisentido: | 5'-atttgggaagtaatacttatccatttgtcccattatgatg-3' | (P4as SEC ID NO: 26). |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y la secuencia de aminoácidos del polipéptido
maduro se incluyen como SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10,
respectivamente.
Para construir un híbrido de una variante de la
endo-amilasa de la especie AA560 de Bacillus
alcalina (SEC ID NO: 40) y el CBM20 de la amilasa de B.
flavotermus se usaron los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcacaccataatggtacgaacgg-3' | (P5s SEC ID NO: 27) |
| Antisentido: | 5'-atttgggaagtagtacttattttgtttacccaaatagaaa-3' | (P5as SEC ID NO: 28). |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y la secuencia de aminoácidos del polipéptido
maduro se incluyen como SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12,
respectivamente.
Para construir un híbrido de una variante de la
endo-amilasa de Bacillus amiloliquefaciens
(SEC ID NO: 37) y el CBM20 de B. flavotermus amilasa se
usaron los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcagtaaatggcacgctgatgca-3' | (P6s SEC ID NO: 29) |
| Antisentido: | 5'-atttgggaagtagtacttatttttggaacataaatggaga-3' | (P6as SEC ID NO: 30) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y la secuencia de aminoácidos del polipéptido
maduro se incluyen como SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 14,
respectivamente.
Las enzimas híbridas descritas anteriormente se
expresaron por B. subtilis cultivada en frascos de agitación
durante 72 horas y segregada en el sobrenadante. La presencia de
enzima híbrida en el sobrenadante se demostró mediante
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento catalítico de la
endo-amilasa de B. flavotermus, AMY1048 se
puede dividir en el dominio AB central conteniendo el centro
catalítico y un dominio C c-terminal al dominio
catalítico pero anterior al CBM. En la SEC ID NO: 2 el dominio de
núcleo catalítico consiste en los primeros 397 residuos de
aminoácidos, el dominio C se define como los residuos de aminoácidos
del 398 al 484 y el CBM se define como los residuos de aminoácidos
del 485 al 586. En la SEC ID NO: 1 la secuencia señal se codifica
por los nucleótidos 1 a 87, el dominio de núcleo catalítico se
codifica por los nucleótido 88-1278, el dominio C se
codifica por los nucleótidos 1279-1539, y el CBM se
codifica por los nucleótidos 1540-1845.
La amilasa incluyendo el CBM se puede expresar a
partir de una construcción de vector similar a la que se ha
descrito en WO0060060A2 en el ejemplo 4, es decir el gen de amilasa
se inserta en un vector bajo el control de un promotor de amilasa y
flanqueado por la secuencia señal y la secuencia del terminador de
la endo-amilasa de B. licheniformis.
Como una alternativa a contener el gen en un
plásmido, el casete incluyendo la codificación de secuencia de ADN
para el marcador antibiótico, promotor, secuencia señal, la proteína
madura y el terminador se puede integrar en el genoma del B.
subtilis por cruce homólogo in vivo, por ADN genómico
flanqueado corriente arriba y corriente abajo con una alta similitud
a una parte no esencial del ADN de B. subtilis. Regiones de
ADN útiles podrían ser la pectato liasa o la
endo-amilasa loci. En este ejemplo la AMY1048 y el
híbrido se insertan en los la amilasa loci en dirección opuesta en
relación a la amilasa de B. subtilis original.
El dominio de núcleo catalítico de la
endo-amilasa AMY1048 se sustituyó por un dominio de
núcleo catalítico de la endo-amilasa de Bacillus
starotermofilus (BSG), creando así un híbrido del dominio C y el
CBM de AMY1048 y el dominio de núcleo catalítico de la
endo-amilasa nueva.
El fragmento de ADN codificando el núcleo
catalítico de la amilasa de B. stearothermophilus (SEC ID NO:
36) se amplificó por PCR usando dos oligonucleótidos. Los
oligonucleótidos sentido eran en su extremidad 5' idénticos a los
últimos 20 nucleótidos de la secuencia de ADN (SEC ID NO: 15)
codificando la secuencia señal previa a la secuencia madura de
AMY1048 (SEC ID NO: 1) y también en su extremidad 3' idénticos a los
primeros 20 nucleótidos de la secuencia de ADN codificando la parte
madura del ADN de amilasa deseado. Los oligonucleótidos antisentido
eran en su extremidad 5' idénticos al ADN antisentido de los
primeros 20 nucleótidos de la secuencia de ADN codificando el
dominio C de AMY1048 y además en su extremidad 3' eran idénticos al
antisentido de los últimos 20 nucleótidos de la secuencia de ADN
codificando el núcleo catalítico del ADN de amilasa BSG.
Para construir un híbrido del dominio de núcleo
de la endo-amilasa de B. stearothermophilus y
el dominio C y el CBM20 de la amilasa de B. flavotermus los
siguientes oligonucleótidos fueron usados por los presentes
inventores:
\vskip1.000000\baselineskip
| Sentido: | 5'-ctcattctgcagccgcggcagcaccgtttaacggctttaa-3' | (P7s SEC ID NO: 31). |
| Antisentido: | 5'-atatagtcgtgctgtgttccgtaagcataatccctgcgcg7-3' | (P7as SEC ID NO: 32). |
\vskip1.000000\baselineskip
Para facilitar la integración de genoma, un
fragmento de 5 kb corriente arriba de la secuencia señal y en la
secuencia del genoma de la amilasa se hace por PCR usando la
construcción genómica de AMY1048 como patrón, y el cebador inverso
del cebador antisentido y el cebador específico del genoma:
5'-ctgcatcagggctgcggcatcc-3 (P8 SEC
ID NO: 33).
Otro fragmento de la terminación del gen y
corriente arriba de la amilasa de B. subtilis genómica se
hace por PCR usando la construcción genómica de AMY1048 como patrón,
y el cebador inverso del cebador sentido y el cebador específico del
genoma:
5'-ctgcatcagggctgcggcatcc-3'; (P9
SEC ID NO: 34).
Tomando ventajas del recubrimiento de 40 par de
bases, los tres fragmentos de la PCR se ensamblaron por PCR y el
producto resultante se amplificó en otra PCR usando los cebadores
específicos del genoma, antes de transferirlos a la cepa SHA273 de
Bacillus subtilis (descrita en WO92/11357 y WO95/10603).
La secuencia de ADN resultante codificando el
polipéptido maduro y el polipéptido maduro se incluyen como SEC ID
NO: 17 y SEC ID NO: 18, respectivamente.
La enzima híbrida se expresó cultivando B.
subtilis en medios PS1 en frascos de agitación durante 72 horas
a 37ºC y segregados en el sobrenadante. La presencia de enzima
híbrida en el sobrenadante se demostró mediante
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
EIF es la medida de un incremento de la
proporción exo/endo en relación a una enzima parental, es decir EIF
= (exo/endo de variante)/(exo/endo de enzima parental). Una enzima
tiene un aumento en la proporción exo/endo en comparación con su
enzima parental si EIF>1. EIF se puede basar en uno de los
siguientes métodos.
Ensayo de Endo actividad EIF1: El Test de
amilasa de Phadebas (Pharmacia Diagnostics) se lleva a cabo según
las recomendaciones de los proveedores y las unidades endo
calculadas a partir de la fórmula proporcionada donde el logaritmo
natural para la actividad equivale a N, donde N = A + raíz cuadrada
[B + C * In(Abs)]. Abs es la absorbancia a 620 nm, A =
-13.3235, B = 243.3293, y C = 26.73797.
Ensayo de Exo actividad: 50 microL de 50
mM de citrato sódico, 5 mM de CaCl_{2}, a pH 6.5 se mezclan con 25
microL de enzima en el mismo tampón y 25 microL de sustrato de
Betamyl (Método Betamyl, Megazyme) se disuelven según las
recomendaciones de proveedores. La mezcla del ensayo se incuba
durante 30 min. a 40ºC y la reacción se detiene añadiendo 150 microL
de un 4% (p/p) de base Trizma
(Tris(hidroximetil)-aminometano). La
actividad se expresa directamente como la absorbancia a 420 nm
medido usando un lector de placa de microtitulación.
Ensayo de Endo actividad EIF2: 1 mL de
sustrato de Phadebas resuspendido (Pharmacia Diagnostics) (0,25
comprimidos/ml de 50 mM de acetato de sodio, 1 mM de CaCl_{2},
ajustado a pH 5.7) se incuba con 25 microL de enzima durante 15 min
a 40ºC con agitación. La reacción se detiene por adición de 0,25 ml
de 1 M de NaOH y la mezcla se centrifuga en un centrifugador de
tabla a 14,000 r.p.m. Se mide la absorbancia del sobrenadante a 620
nm. La actividad se determina comparando con un estándar la
actividad declarada (BAN 480 L, 480 KNU/g).
Ensayo de Exo actividad: 900 microL de un
3,3% de almidón de maíz céreo solubilizado (3,3% de almidón se
hierve en 50 mM de acetato sódico, 1 mM de CaCl_{2}, a pH 5.7
durante 5 min y se enfría a 40ºC) se incuba con 100 microL de enzima
a 40ºC con agitación. Después del tiempo de reacción apropiado el
almidón restante se precipita por adición de 450 microL a 4ºC con un
96% de etanol. El precipitado se retira inmediatamente por
centrifugado a 3000 G durante 20 min. El carbohidrato total en el
sobrenadante se determina mezclando 200 microL de sobrenadante con
50 microL de un 2% de triptófano y 900 microL de un 64% de ácido
sulfúrico. La mezcla se calienta durante 15 min a 95ºC y la
absorbancia a 630 nm se mide tras el enfriamiento a temperatura
ambiente. La actividad se determina comparando con la absorbancia de
estándares de glucosa en el mismo ensayo. Una unidad se define como
la cantidad de enzima que a índices iniciales libera 1 mg de
productos oligoméricos (productos que no se precipitan mediante
etanol) por min.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la conversión de almidón de
trigo granuloso en glucosa usando una endo-amilasa
bacteriana con un CBM (SEC ID NO: 4) o la misma
endo-amilasa bacteriana sin CBM (SEC ID NO: 35)
junto con una glucoamilasa y una amilasa ácida fúngica. Un compuesto
acuoso con un 33% de sólidos secos (DS) de almidón granulado se
preparó añadiendo 247,5 g de almidón de trigo bajo agitación a 502,5
ml de agua. El pH se ajustó con HCl a 4.5. El compuesto acuoso de
almidón granuloso se distribuyó en matraces Erlenmeyer de 100 ml con
75 g en cada matraz. Los matraces se incubaron con agitación
magnética en un baño maría a 60ºC. En la hora cero las actividades
enzimáticas dadas en la tabla 1 se dosificaron en los matraces. Las
muestras se retiraron después de 24, 48 y 73 y 94 horas. Los niveles
enzimáticos usados fueron endo-amilasa +/CBM 100
KNU/kg de DS, glucoamilasa 200 AGU/kg de DS,
alfa-amilasa fúngica ácida 50 AFAU/g de DS.
El almidón de sólidos secos total se determinó
usando el siguiente método. El almidón se hidrolizó completamente
añadiendo una cantidad excesiva de endo-amilasa (300
KNU/kg de sólidos secos) y colocando la muestra en un baño de aceite
a 95ºC durante 45 minutos. Posteriormente las muestras se enfriaron
a 60ºC y se añadió una cantidad excesiva de glucoamilasa (600 AGU/kg
de DS) seguida de una incubación durante 2 horas a 60ºC.
Los sólidos secos solubles en el hidrolizado de
almidón se determinaron midiendo el índice de refracción en muestras
después del filtrado a través de un filtro de 0,22 microM. El perfil
de azúcar se determinó por HPLC. La cantidad de glucosa se calculó
como DX. Los resultados se muestran en las tablas 2 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.970000\baselineskip
La "dosis efectiva" de la amilasa en
cuestión se define como la dosis dando como resultado una reducción
en la solidez superior a un 10%, por ejemplo, de entre un 10 y un
20%, en comparación con la solidez de un pan sin enzimas (el
control). La reducción en la solidez se mide después del
almacenamiento durante 14 días en atmósfera inerte a temperatura
ambiente.
La tolerancia a la sobredosificación se mide
usando la Proporción de pérdida de elasticidad = ELR. ELR se mide
el día 1 después la cocción o más tarde, tal como el día 5, día 10 o
como en el ejemplo de debajo después de 14 días de almacenamiento y
se define entonces de la siguiente manera:
ELR % =
(Elasticidad_{control \ d\text{í}a \ 14} - Elasticidad_{amilasa \
d\text{í}a \ 14} x 100)/Elasticidad_{control \ d\text{í}a \
14}
En combinación con 450 MANU/kg de harina
Novamyl® la tolerancia a la sobredosificación se mide:
ELR_{N} % =
(Elasticidad_{Novamyl \ d\text{í}a \ 14} -
Elasticidad_{Novamyl+amilasa \ d\text{í}a \ 14} x
100)/Elasticidad_{Novamyl \ d\text{í}a \
14}
Si la amilasa se sobredosifica el ELR y/o
ELR_{N} será > 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
El pan se hornea según el método de esponja
& masa.
- Aceite de soja
- 2,5
- SSL
- 0,38
- Levadura
- 5
- Harina de trigo
- 60
- Agua
- 62
\vskip1.000000\baselineskip
- Ácido ascórbico
- a optimizarse para cada harina
- ADA
- 20 ppm
- Sal
- 2
- Almíbar
- 7 (sustancia seca)
- Agua
- a optimizarse para cada harina
- Harina de trigo
- 40
- Calcio propionato+ enzimas
- 0,25
\vskip1.000000\baselineskip
Los ingredientes de esponja levadura, agua,
harina, SSL y aceite se mezclan a 90 r.p.m. durante 1 minuto, 150
r.p.m. durante 4 minutos.
La esponja se fija para fermentación durante 3
horas a 27ºC y un 86% de RH.
La esponja se añade a los ingredientes de masa y
se mezclan hasta obtener una masa a 90 r.p.m. durante 1 minuto y a
150 r.p.m. durante 14 minutos. La masa se corta en pedazos de 340 g
cada uno y se deja reposar durante 10 minutos.
Las porciones de masa se colocan en láminas y se
moldean seguidamente de una fermentación durante 55 minutos a 42ºC y
un 86% de RH. las masas se hornean a 225ºC durante 15 minutos. El
pan horneado se enfría y almacena hasta el análisis.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El pan se hornea con el enzima
CBM-híbrida y con la enzima correspondiente sin un
CBM. La dosis efectiva se determina con y sin adición de Novamyl® a
450 MANU/kg de harina. La solidez y la elasticidad de un pan se
miden con el analizador de textura TA.XT2 según el método AACC
74-09.
Se determina la dosificación eficaz de la enzima
CBM-híbrida y un conjunto nuevo de pan se hornea con
3 y 5 veces la dosificación eficaz con y sin adición de Novamyl® a
450 MANU/kg de harina.
El ELR se mide después de 14 días de
almacenamiento, y se ha descubierto que el ELR al igual que el ELRN
es inferior al 5% para la amilasa con CBM dosificado 5 veces la
dosificación eficaz mientras que es más del 5% para las enzimas
correspondientes sin la adición del CBM dosificado 3 veces la dosis
efectiva.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 6 se realizó como se describe en el
ejemplo 5 excepto porque se usó una dosificación de 500 MANU/kg de
harina.
Se usaron dos variantes de un híbrido
comprendiendo la endo-amilasa de la especie AA560
alcalina de Bacillus (SEX ID NO: 40) y el CBM20 de la amilasa de
B. flavotermus (residuos 485 a 586 en la SEC ID NO: 2): La
variante BE1 comprendiendo las alteraciones siguientes en la
secuencia de amilasa: R118K, D183*, G184*, N195F, R320K, R458K,
N33S, D36N, K37L, E391I, Q394R, K395D, T452Y y N484P, y la variante
BE2 comprendiendo las siguientes alteraciones en la secuencia de
amilasa: R118K, D183*, G184*, N195F, R320K, R458K y N484P.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La masa del pastel se preparó con los híbridos
BE1, BE2, la amilasa de Bacillus mostrada en la SEC ID NO: 40
(homólogo donante CD) y las amilasas de Bacillus de la SEC ID NO: 2
(CBM donante).
La masa se hizo a partir de una mezcla para
pastel comercial "Tegral Allegro" de Puratos consistiendo en
harina de trigo, azúcar, levadura, emulsionante (mono- y
diglicéridos de ácidos grasos). La mezcla de pastel, la enzima (4
mg/kg de harina) y el agua se colocaron en un bol y se removieron
con una espátula, Bear AR 5
A-Vari-mixer, a la tercera velocidad
hasta que se obtuvo una mezcla homogenea (aproximadamente 2
minutos). Se llenaron moldes con 300g de masa y se horneó a 180ºC
durante 45 minutos. Los pasteles horneados se enfriaron a
temperatura ambiente durante 30 minutos y se embalaron en nitrógeno
antes del almacenamiento a temperatura ambiente hasta el
análisis.
La movilidad de agua libre se determinó usando
un campo bajo de RMN como se describe por P.L. Chen, Z. Long, R.
Ruan y T.P. Labuza, Nuclear Magnetic Resonance Studies of water
Mobility in bread during Storage. Lebensmittel Wissenschaft und
Technologie 30, 178-183 (1997).
La dureza y la firmeza se midieron según el
método descrito en Food Texture and viscosity, 2nd edition, Malcolm
Bourne, Food Science and Technology, International Series, Academic
Press, páginas 182-186.
Todos los datos se midieron después de 14 días.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
En base a los datos anteriores se calcularon los
siguientes parámetros (I) - (III):
- (I):
- Reducción de firmeza % = (Firmeza_{Referencia} - Firmeza_{amilasa})x100% / Firmeza_{Referencia}
- (II):
- dHardness = HardneSS_{Referencia} - HardneSS_{Amilasa}
- (III):
- dMobility = Mobility_{Amilasa} - Mobility_{Referencia}
Amyl1 es idéntica a la amilasa de la SEC ID nº:
40 con las siguientes sustituciones: R118K, D183*, G184*, N195F,
R320K, R458K, N33S, D36N, K37L, E391I, Q394R, K395D, T452i y N484P,
usando la numeración de la SEC ID nº: 40.
\vskip1.000000\baselineskip
Los panes se hornearon según la método de
esponja & masa. Los panes se almacenaron a temperatura ambiente
durante 14 días hasta el análisis. La dureza y la firmeza se
midieron según el método descrito en Food Texture and viscosity, 2
edition, Malcolm Bourne, Food Science and Technology, International
Series, Academic Press, página 182-186, y la
movilidad de agua libre se determinó usando un campo bajo de RMN
como se describe por P.L. Chen, Z. Long, R. Ruan y T.P. Labuza,
Nuclear Magnetic Resonance Studies of water Mobility in bread during
Storage. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 30,
178-183 (1997). Se usaron tres amilasas; las
variantes BE1 y BE3 y la amilasa de Bacillus de la SEC ID NO: 2 (CBM
donante). La variante BE3 tiene el dominio catalítico teniendo la
secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID: 37 y
comprende uno o más, por ejemplo tal como todas las siguientes
alteraciones: S31A, D32N, I33L, E178*, G179*, N190F, K3891; K392R,
E393D, V508A y un CBM teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada
como los residuos de aminoácidos 485 a 586 en la SEC ID NO: 2.
Todos los datos se midieron después de 14 días.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
En base a los datos anteriores se calcularon los
siguientes parámetros (I) - (VI):
Para tratamientos sin Novamyl®
- (I):
- Reducción de firmeza % = (Firmeza_{Referencia} - Firmeza_{amilasa})x100% / Firmeza_{Referencia}
- (II):
- dHardness = HardneSS_{Referencia} - Hardness_{Amilasa}
- (III):
- dMobility = Mobility_{Amilasa} - Mobility_{Referencia}
\vskip1.000000\baselineskip
Para tratamientos con Novamyl®
- (I):
- Reducción de firmeza % = (Firmeza_{Novamyl} - Firmeza_{amilasa+Novamyl})x100%/ Firmeza_{Novamyl}
- (V):
- dHardness = Hardness_{Novamyl} - Hardness_{Amilasa+Novamyl}
- (VI):
- dMobility = Mobility_{Amilasa+Novamyl} - Mobility_{Novamyl}
\vskip1.000000\baselineskip
La termoestabilidad se determinó a 60, 65 o 70ºC
durante 30 minutos en un tampón de 50 mM de NaOAc y 1 mM de
CaCl_{2} a pH 5.7. Las muestras se enfriaron y la actividad
residual se midió usando el método de Phadebas como se describe en
la sección Materiales y Métodos excepto que la determinación tuvo
lugar a 50ºC. La actividad residual (R.A.) se puede calcular según
la siguiente ecuación: R.A.. (%) = [ABS (tratado con calor)- ABS (en
blanco)] / [ABS (tratado con calor a 60ºC) - ABS (en
blanco)]*100%.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
Actividad residual para Fungamyl, una amilasa de
cocción fúngica de A. oryzae bien conocida, y para enzimas
híbridas de la invención.
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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- \bullet US 6162628 A [0100] [0154]
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (1)..(40)
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<212> ADN
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<213> artificial
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<223> cebador
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<220>
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<221> misc feature
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<222> (1)..(22)
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<400> 33
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcatcagg gctgcggcat cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 35
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<211> 483
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BLA it B. licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(483)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BSG B. stearothermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> malt peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(514)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BAN B. amiloliquefacience
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(482)
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<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
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<211> 485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SP722 bacillus sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(485)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SP690 bacillus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(485)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AA560 bacillus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(485)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LE429 B. lich. variante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(481)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas saccharofila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(417)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
Claims (10)
1. Polipéptido el cual es un híbrido
comprendiendo;
- a)
- una primera secuencia de aminoácidos teniendo actividad endo-amilasa y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 35 y
- b)
- una segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácidos del 485 al 586 en la SEC ID NO: 2,
donde dicha primera secuencia de aminoácidos y/o
dicha segunda secuencia de aminoácidos se deriva de una
bacteria.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
teniendo al menos un 60% de identidad, al menos un 70% de identidad,
al menos un 80% de identidad, o incluso al menos un 90% de identidad
con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4.
3. Proceso para preparar una masa o un producto
comestible hecho a partir de una masa, cuyo proceso comprende añadir
el polipéptido según la reivindicación 1 a la masa.
4. Proceso según la reivindicación 3
comprendiendo además añadir una actividad de
exo-amilasa, preferiblemente una actividad de
alfa-amilasa maltogénica, preferiblemente
Novamyl.
5. Proceso comprendiendo;
- a)
- poner en contacto un almidón con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2,
- b)
- incubar dicho almidón con dicho polipéptido durante un tiempo y a una temperatura suficientes para conseguir la conversión de al menos un 90% p/p de dicho sustrato de almidón en azúcares fermentables,
- c)
- fermentar para producir un producto de fermentación,
- d)
- opcionalmente recuperar el producto de fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Aditivo de mejora de pan o de masa en forma
de un granulado o polvo aglomerado comprendiendo el polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
7. Secuencia de ADN codificando un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
8. Constructo de ADN comprendiendo la secuencia
de ADN según la reivindicación 7.
9. Vector de expresión recombinante el cual
porta el constructo de ADN según la reivindicación 8.
10. Célula huésped la cual se transforma con el
constructo de ADN según la reivindicación 8 o el vector según la
reivindicación 9.
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