ES2604666T3 - Polipéptidos de amilasa - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene actividad amilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 78 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipéptido comprende una sustitución de aminoácido en la posición 235 con referencia a la numeración de la posición de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1, dicho polipéptido tiene una mayor termoestabilidad cuando se compara con la SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION

Polipeptidos de amilasa Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a polipeptidos, espedficamente polipeptidos de amilasa y acidos nucleicos que codifican estos, y sus usos por ejemplo, como exoamilasas no maltogenicas en produccion de alimentos o productos alimenticios para animales.

Antecedentes de la invencion

Las amilasas mejoradas pueden mejorar los problemas inherentes en ciertos procesos, tales como en la conversion de almidones vegetales, o para hornear.

La cristalizacion de la amilopectina tiene lugar en los granulos de almidon dfas despues del horneado, lo que lleva a un aumento de la firmeza del pan y causa el envejecimiento del pan. Cuando el pan envejece, el pan pierde la suavidad de la miga y la humedad de la miga. Como resultado, las migas se vuelven menos elasticas, y el pan se desarrolla una corteza de cuero.

La hidrolisis enzimatica (por ejemplo, por amilasas) de las cadenas laterales de amilopectina puede reducir la cristalizacion y aumentar antienvejecimiento. La cristalizacion depende de la longitud de las cadenas laterales de amilopectina: cuanto mas largas las cadenas laterales, mayor es la cristalizacion. La mayona de los granulos de almidon se compone de una mezcla de dos polfmeros: amilopectina y amilosa, de los cuales aproximadamente el 75% es amilopectina. La amilopectina es una molecula muy grande, ramificada que consiste en cadenas de unidades • unidades de -D-glucopiranosilo unidades por enlaces (1-4), en los que las cadenas estan unidas por • uniones -D- (1-6) para formar ramas. La amilosa es una cadena lineal de unidades de • -D-glucopiranosilo unidas (14) que tienen pocas ramas • -D- (1-6).

El horneado de artfculos de panificacion farinaceas tales como pan blanco, pan hecho de harina de centeno y harina de trigo tamizados y rodillos se logra mediante el horneado de la masa de pan en las temperaturas del horno en el rango de 180 a 250°C durante aproximadamente 15 a 60 minutos. Durante el proceso de horneado un gradiente de temperatura pronunciado (200-120°C) prevalece sobre las capas de masa exteriores donde se desarrolla la corteza del producto horneado. Sin embargo, debido al vapor, la temperatura en la miga es solo de aproximadamente 100°C al final del proceso de horneado. A temperaturas superiores de aproximadamente 85°C, se puede producir la inactivacion de la enzima y la enzima no tendra propiedades antienvejecimiento. Por los tanto, solo las amilasas termoestable son capaces de modificar el almidon de manera eficiente durante el horneado.

La actividad de endoamilasa actividad puede afectar negativamente la calidad del producto de pan final mediante la produccion de una miga pegajosa o gomosa debido a la acumulacion de dextrinas ramificadas. Se prefiere la actividad de exoamilasa, debido a que lleva a cabo la modificacion deseada de almidon que lleva al retraso del envejecimiento, con menos de los efectos negativos asociados con la actividad de endo-amilasa. La reduccion de la actividad endoamilasa puede llevar a mayor exoespecificidad, lo que puede reducir las dextrinas ramificadas y producir un pan de mejor calidad.

La conversion de los almidones vegetales, especialmente almidon de mafz, a etanol es una industria en rapida expansion. El jarabe de maltotetraosa (G4 o DP4) es uno de muchos productos comercialmente importantes derivados del tratamiento enzimatico del almidon. La conversion de almidones vegetales, especialmente almidon de mafz, a maltotetraosa y azucares inferiores, tales como glucosa o maltosa, es una industria en rapida expansion.

El proceso actual consiste en dos etapas catalizadas por enzimas secuenciales que dan como resultado la produccion de glucosa o maltosa. La levadura se puede utilizar para fermentar la glucosa a etanol.

La primera etapa es catalizada por la enzima es la licuefaccion del almidon. Tfpicamente, una suspension de almidon se gelatiniza mediante calentamiento rapido a 85°C o mas. • -las amilasas (EC 3.2.1.1) se utilizan para degradar el licuefacto viscoso a maltodextrinas. • -amilasas son endohidrolasas que catalizan la escision aleatoria de enlaces • 1,4-D-glucosfdicos internos. A medida que las • -amilasas descomponen el almidon, la viscosidad disminuye. Debido a que la licuefaccion se realiza tfpicamente a temperaturas elevadas, las • -amilasas termoestables, tales como un • -amilasa de Bacillus sp., son las preferidas para esta etapa.

Las maltodextrinas producidas de esta manera generalmente no pueden ser fermentadas por la levadura para formar alcohol. En consecuencia, se requiere una segunda etapa de sacarificacion catalizada enzimaticamente, para descomponer las maltodextrinas. Las glucoamilasas y/o • -amilasas maltogenicas comunmente se utilizan para catalizar la hidrolisis de extremos no reductores de las maltodextrinas formadas despues de licuefaccion, la liberacion de D-glucosa, maltosa e isomaltosa. Las enzimas desramificantes tales como pululanasas, se pueden usar para ayudar a la sacarificacion. La sacarificacion generalmente se realiza en condiciones acidas a temperaturas elevadas, por ejemplo, 60°C, pH 4,3.

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El jarabe G4 (tambien denominado como DP4) tiene numerosas propiedades ventajosas en comparacion con los jarabes de sacarosa. Por ejemplo, el reemplazo parcial de la sacarosa con jarabe G4 en un alimento reduce la dulzura de la comida sin afectar a su sabor o aroma. El jarabe de G4 tiene una alta retencion de la humedad en los alimentos y exhibe productos de reaccion de Maillard menos perjudiciales debido a contenido menor de glucosa y maltosa. El jarabe G4 tambien tiene mayor viscosidad que la sacarosa, lo que mejora la textura de los alimentos. El jarabe de G4 disminuye el punto de congelacion del agua menos que el jarabe de sacarosa o alta fructosa, por lo que el jarabe G4 puede controlar mejor los puntos de congelacion de los alimentos congelados. Despues de la ingestion, el jarabe G4 tambien afecta la presion osmotica menos que la sacarosa. En conjunto, estas cualidades hacen que el jarabe G4 sea ideal como un ingrediente en alimentos y productos medicos. El jarabe de G4 es util en otras industrias, tambien. Por ejemplo, el jarabe de G4 imparte brillo y se puede utilizar ventajosamente como un medidor de papel. Ver, por ejemplo, Kimura et al, "Maltotetraose, a new saccharide of tertiary property", Starch 42: 151-57 (1990).

Una de las levaduras usadas para producir el etanol es Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae contiene • glucosidasa que se ha demostrado para utilizar mono-, di-, y tri-sacaridos como sustratos. Yoon et al., Carbohydrate Res. 338: 1127-32 (2003). La capacidad de S. cerevisiae para utilizar tri-sacaridos se puede mejorar mediante la administracion de suplementos Mg2+ y la sobreexpresion de AGT1 permeasa (Stambuck et al, Lett Appl Microbiol 43:370-76 (2006)), sobreexpresion de MTT1 y MTT1alt para aumentar la captacion de maltotriosa (Dietvorst et al., Yeast 22: 775-88 (2005)), o la expresion de la MAL32 maltasa en la superficie celular (Dietvorst et al., Yeast 24: 2738 (2007)). La etapa de sacarificacion se puede omitir por completo, si la etapa de licuefaccion produjo niveles suficientes de mono-, di-, o tri-sacaridos y se usaron S. cerevisiae o sus variantes modificadas geneticamente para la etapa de fermentacion.

Pseudomonas saccharophila expresa una maltotetraohidrolasa formadora de maltotetraosa (CE 3.2.1.60; amilasa formadora de G4; G4-amilasa). Se ha determinado la secuencia de nucleotidos del gen P. saccharophila que codifica PS4. Zhou et al., "Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila”, FEBS Lett. 255: 37-41 (1989); GenBank Acc. No. X16732. PS4 se expresa como una protema precursora con un peptido senal N-terminal de 21 residuos. La forma madura de PS4, como se expone en SEQ ID NO: 10, contiene 530 residuos de aminoacidos con un dominio catalttico en el extremo N-terminal y un dominio de union a almidon en el extremo C-terminal. PS4 muestra tanto actividad endo y exo -• -amilasa. La actividad de endo^ -amilasa es util para disminuir la viscosidad del almidon gelatinizado, y la actividad de exo • -amilasa es util para descomponer las maltodextrinas en sacaridos mas pequenos.

Smtesis de la invencion

Esta invencion se refiere a polipeptidos, espedficamente polipeptidos de amilasa y acidos nucleicos que los codifican, y sus usos por ejemplo como exoamilasas no maltogenicas en la produccion de productos alimenticios. Las amilasas de la presente invencion se han manipulado geneticamente para tener cualidades mas beneficiosas. En forma espedfica, las amilasas de la invencion actual muestran una exoespecificidad alterada y/o termoestabilidad alterada. En particular, los polipeptidos derivan de los polipeptidos que tienen actividad de exoamilasa no maltogenica, en particular, actividad de glucan 1,4-alfa maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60). En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente tienen un mejor efecto antienvejecimiento, en comparacion con la amilasa de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, los polipeptidos definidos en la presente tienen una mejor termoestabilidad en comparacion con la amilasa de la SEQ ID nO: 1.

Se proporciona una variante de polipeptido que se exponen en las reivindicaciones. En un aspecto adicional, se proporciona el uso de tal variante de polipeptido, que se incluye en y como aditivos alimentarios, productos alimenticios, productos de productos de panadena, composiciones mejoradoras, productos alimenticios, que incluyendo alimentos para animales, etc. tal como se establece en las reivindicaciones. En un aspecto adicional, se proporcionan acidos nucleicos que codifican y que se refieren a variantes de polipeptidos, como se establece en las reivindicaciones. Los metodos para producir tales variantes de polipeptidos, asf como otros aspectos, tambien se estableces en las reivindicaciones.

Leyendas de las figuras

Las figuras acompanantes se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva e ilustran varias formas de realizacion.

La Fig. 1 muestra el desarrollo de firmeza del pan horneado con pMS1776 (SEQ ID NO: 12), pMS2020 (SEQ ID NO: 14), pMS2022 (SEQ ID NO: 15) y pMS2062 (SEQ ID NO: 16) en comparacion con el pan horneado con una composicion que comprende la SEQ ID NO: 1.

La Fig. 2 muestra el desarrollo de firmeza del pan horneado con pMS1776 (SEQ ID NO: 12), pMS1934 (SEQ ID NO: 13), pMS2022 (SEQ ID NO: 15) y pMS2062 (SEQ ID NO: 16) en comparacion con el pan horneado con una composicion que comprende la SEQ ID NO: 1 y Novamil 1500,

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Descripcion detallada de la invencion

De acuerdo con esta descripcion detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe senalar que, como se usa en la presente, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. As^ por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales enzimas, y la referencia a "la formulacion" incluye la referencia a una o mas formulaciones y equivalentes de estas conocidos por los expertos en la tecnica, y similares,

En un aspecto, se proporciona un polipeptido que tiene actividad de amilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 78% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 235 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 1, dicho polipeptido tiene mejor termoestabilidad cuando se compara con la SEQ ID NO: 1.

La presente invencion tambien abarca el uso de polipeptidos que tienen un grado de identidad de secuencia u homologfa de secuencia con la secuencia de aminoacidos definida en la presente o con un polipeptido que tiene las propiedades espedficas definidas en la presente. La presente invencion abarca, en particular, peptidos que tienen un grado de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, que se define a continuacion u homologos de estos. En la presente, el termino "homologo" significa una identidad de secuencia de entidad que tiene la presente secuencia de aminoacidos o la presente secuencias de nucleotidos, donde la secuencia de aminoacidos presente es con preferencia la SEQ ID NO: 1 y la presente secuencia de nucleotidos es con preferencia la SEQ ID NO: 52.

En un aspecto, la secuencia de aminoacidos y/o secuencia de nucleotidos homologa puede proporcionar y/o codificar un polipeptido que retiene la actividad funcional y/o mejora la actividad de un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10, con preferencia la actividad de un polipeptido de la SEQ ID NO: 1.

En el presente contexto, se toma una secuencia homologa para incluir una secuencia de aminoacidos que puede ser al menos 78%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, identica a la secuencia presente. Normalmente, los homologos comprenderan los mismos sitios activos etc. que la presente secuencia de aminoacidos. Aunque la homologfa tambien se puede considerar en terminos de semejanza (es decir, residuos de aminoacidos que tienen propiedades/funciones qrnmicas similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de identidad de secuencia se pueden realizar a simple vista, o mas normalmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencias facilmente disponibles. Estos programas informaticos disponibles en el comercio utilizan algoritmos de comparacion complejos para alinear dos o mas secuencias que reflejan mejor los eventos evolutivos que podna haber llevado a la diferencia) entre las dos o mas secuencias. Por lo tanto, estos algoritmos funcionan con un sistema de puntuacion de recompensa del alineamiento de aminoacidos identicos o similares y la penalizacion de la insercion de las brechas, extensiones de brecha y alineamientos de los aminoacidos no similares. El sistema de puntuacion de los algoritmos de comparacion incluye:

i) la asignacion de una puntuacion de penalizacion cada vez que se inserta una brecha (puntuacion de penalizacion de la brecha),

ii) la asignacion de una puntuacion de penalizacion cada vez que se extiende una brecha existente con una posicion extra (puntuacion de la penalizacion de extension),

iii) la asignacion de puntuaciones altas despues del alineamiento de aminoacidos identicos, y

iv) la asignacion de puntuaciones variables despues del alineamiento de aminoacidos no identicos.

La mayona de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores predeterminados cuando se utiliza tal software para las comparaciones de secuencias.

Las puntuaciones dadas para el alineamiento de los aminoacidos no identicos se asignan de acuerdo con una matriz de puntuacion tambien llamada una matriz de sustitucion. Las puntuaciones provistas en tales matrices de sustitucion estan reflejando el hecho de que la probabilidad de que un aminoacido sea sustituido con otro durante la evolucion vana y depende la naturaleza ffsica/qmmica del aminoacido para sustituir. Por ejemplo, la probabilidad de que un aminoacido polar sea sustituido con otro aminoacido polar es mayor en comparacion con que sea sustituido con un aminoacido hidrofobico. Por lo tanto, la matriz de puntuacion asignara la puntuacion mas alta de aminoacidos identica, menor puntuacion de aminoacidos no identicos, pero similares e incluso mas baja puntuacion para los aminoacidos no similares no identicos. Las matrices de puntuacion mas frecuentemente usadas son las matrices PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), las matrices BLOSUM (Henikoff y Henikoff (1992)) y la matriz de Gonnet (Gonnet et al. (1992)).

Los programas de computadora adecuados para llevar a cabo tal alineamiento incluyen, pero sin limitacion, Vector NTI (Invitrogen Corp.) y los programas ClustalV, ClustalW y ClustalW2 (Higgins DG y Sharp PM (1988), Higgins et al.

(1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Una seleccion de diferentes herramientas de alineamiento estan disponibles desde el servidor ExPASy Proteomics en
www.expasy.org. Otro ejemplo de software que puede realizar el alineamiento de secuencia es BLAST (herramienta de busqueda de alineamiento local basico), que esta disponible en la pagina web del National Center for Biotechnology Information que en la actualidad se pueden 5 encontrar en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y que fue descrito en primer lugar en Altschul et al. (1990). J. Mol Biol 215; 403-410.

Una vez que el software ha producido un alineamiento, es posible calcular el % de semejanza y el % de identidad de secuencia. El software normalmente realiza esto como parte de la comparacion de secuencias y genera un resultado numerico.

10 En una forma de realizacion, se prefiere utilizar el software ClustalW para realizar alineamientos de secuencias. Con preferencia, el alineamiento con ClustalW se lleva a cabo con los siguientes parametros para el alineamiento por pares:

Matriz de sustitucion:

Gonnet 250

Penalizacion de apertura de brecha:

20

Penalizacion de extension de la brecha:

0.2

Penalizacion de fin de la brecha:

Ninguno

ClustalW2 esta, por ejemplo, disponible en Internet por el Instituto Europeo de Bioinformatica en la pagina web
www.ebi.ac.uk EMBL-EBIen bajo herramientas - analisis de secuencia - ClustalW2. En la actualidad, la direccion 15 exacta de la herramienta ClustalW2 es
www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.

En otra forma de realizacion, se prefiere utilizar el programa Align X de Vector NTI (Invitrogen) para realizar alineamientos de secuencias. En una forma de realizacion, se ha usado Exp10 con la configuracion predeterminada:

Penalidad de apretura de brecha: 10

Penalizacion de extension de la brecha: 0.05

20 Rango de penalizacion de la separacion de brecha: 8

Matriz de puntuacion: blosum62mt2

Por lo tanto, la presente invencion tambien abarca el uso de variantes, homologos y derivados de cualquier secuencia de aminoacidos de una protema o polipeptido como se define en la presente, en particular los de la SEQ ID NO: 1 o las de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 o 10 se define a continuacion,

25 Las secuencias, en particular las de las variantes, homologos y derivados de la SEQ ID NO: 1, tambien pueden tener supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoacidos que producen un cambio silencioso y producen una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoacidos deliberadas se pueden realizar sobre la base de la semejanza de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipatica de los residuos siempre que se retenga la actividad de union secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoacidos 30 cargados negativamente incluyen acido aspartico y acido glutamico; aminoacidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoacidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

La presente invencion tambien abarca una sustitucion conservadora (sustitucion y reemplazo se usan en la presente 35 para significar el intercambio de un residuo de aminoacido existente, con un residuo alternativo) que se puede producir es decir sustitucion de igual a igual, tal como basico por basico, acido por acido, polar por polar, etc. La sustitucion no conservadora tambien se puede producir, es decir, de una clase de residuo a otro, o que alternativamente involucra la inclusion de aminoacidos no naturales tales como ornitina (de aqrn en adelante en la presente denominada como Z), ornitina del acido diaminobutmco (de aqrn en adelante en la presente denominada 40 como B), ornitina norleucina (de aqrn en adelante en la presente denominada como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Las sustituciones conservadoras que se pueden realizar estan, por ejemplo dentro de los grupos de aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina), aminoacidos acidos (acido glutamico y acido aspartico), aminoacidos alifaticos (alanina, valina, leucina, isoleucina), aminoacidos polares (glutamina, asparagina, serina, treonina), aminoacidos 45 aromaticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), hidroxilaminoacidos (serina, treonina), aminoacidos grandes (fenilalanina y triptofano) y aminoacidos pequenos (glicina, alanina).

Los reemplazos tambien se pueden realizar mediante aminoacidos no naturales e incluyen; aminoacidos alfa * y alfa-disustituidos*, N-alquil aminoacidos *, acido lactico *, derivados de haluro de aminoacidos naturales tales como

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trifluorotirosina *, p-Cl-fenilalanina *, p-Br-fenilalanina *, p-I-fenilalanina *, L-alil-glicina *, 13-alanina*, acido L-a-amino butmco*, acido L-Y-amino butmco*, acido L-a-amino isobutmco*, acido L-£-amino caproico#, acido 7-amino heptanoico*, L-metionina sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, metil derivados de fenilalanina (Phe) tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metil)*, L- Phe (4-isopropil)*, L-Tic (acido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilo)*, acido L-diaminopropionico# y L-Phe (4- benci)*. Se ha usado la notacion * para el fin de la discusion anterior (con relacion a la sustitucion homologa o no conservadora), para indicar la naturaleza hidrofobica del derivado mientras que # se ha usado para indicar la naturaleza hidrofflica del derivado #* indica caractensticas anfipaticas.

Las variantes de secuencias de aminoacidos pueden incluir grupos espaciadores adecuados que se pueden insertar entre cualquiera de dos residuos de aminoacidos de la secuencia que incluyen grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo, ademas de espaciadores de aminoacidos tales como residuos de glicina o p-alanina. Una forma adicional de variacion, que implica la presencia de uno o mas residuos de aminoacidos en forma peptoide, sera bien entendida por los expertos en la tecnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a variantes de los residuos de aminoacidos en los que el grupo sustituyente a-carbono esta en atomo de nitrogeno del residuo en lugar del a-carbono. Los procesos para preparar peptidos en forma peptoide son conocidos en la tecnica, por ejemplo Simon RJ et al. (1992), Horwell dC. (1995).

En una forma de realizacion, la variante de polipeptido es una variante de amilasa de Pseudomonas saccharophila (PS4) que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y que tiene al menos al menos 78%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoacidos con esta.

En un aspecto, con preferencia la secuencia utilizada en la presente invencion esta en una forma purificada. El termino "purificado" significa que un componente dado esta presente en un nivel alto. El componente es de forma deseable, el componente activo predominante presente en una composicion.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente tienen el mismo significado comunmente entendido por un experto en la tecnica. Los siguientes terminos se proporcionan a continuacion.

"Amilasa" significa una enzima que es, entre otras cosas, capaz de catalizar la degradacion del almidon. Una actividad de la amilasa de accion endo escinde enlaces a-D- (1 ^ 4) O-glicosfdicos dentro de la molecula de almidon de una manera aleatoria. Por el contrario, una actividad amilolttica de accion exo escinde una molecula de almidon del extremo no reductor del sustrato. "Actividad de amilasa de accion endo", "endo-actividad", "actividad endo-espedfica" y "endo-especificidad" son sinonimos, cuando los terminos se refieren a las variantes de polipeptidos tal como se definen en las reivindicaciones. Lo mismo es valido para los terminos correspondientes para actividad exo.

"Maltotetrahidrolasa formadora de maltotetraosa; EC 3.2.1.60; amilasa formadora de G4; G4-amilasa y glucano 1,4- alfa-maltotetrahidrolasa" se pueden usar de manera intercambiable".

En el presente contexto "" PS4 "se utiliza para designar el maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila.

Una "variante" o "variantes" se refiere a polipeptidos o acidos nucleicos. El termino "variante" se puede usar indistintamente con el termino "mutante". Las variantes incluyen inserciones, sustituciones, transversiones, truncamientos, y/o inversiones en una o mas localizaciones en la secuencia de aminoacidos o de nucleotidos, respectivamente. Las frases "variante de polipeptido", "polipeptido", "variante" y "variante de la enzima" significa un polipeptido/protema que tiene una secuencia de aminoacidos que se ha modificado de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Las variantes de polipeptidos incluyen un polipeptido que tiene un cierto porcentaje, por ejemplo, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. Como se usa en la presente, "enzimas originales", "secuencia original", "polipeptido original" significan enzimas y polipeptidos a partir de los cuales se basan las variantes de polipeptidos, por ejemplo, SEQ ID NO: 1. Un "acido nucleico original" significa una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido original. La secuencia de senal de una "variante" puede ser la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 11) o puede diferir de la secuencia senal de la PS4 de tipo salvaje. Una variante se puede expresar como una protema de fusion que contiene un polipeptido heterologo. Por ejemplo, la variante puede comprender un peptido senal de otra protema o una secuencia disenada para ayudar a la identificacion o purificacion de la protema de fusion expresada, tal como una secuencia de His-Tag.

Para describir las diferentes variantes que se consideran abarcadas por la presente descripcion, se adoptara la siguiente nomenclatura para facilitar la referencia. Cuando la sustitucion incluye un numero y una letra, por ejemplo, 141P, entonces se refiere a {posicion de acuerdo con el sistema de numeracion /aminoacido sustituido}. De acuerdo con ello, por ejemplo, la sustitucion de un aminoacido a prolina en la posicion 141 se designa como 141P. Cuando la sustitucion incluye una letra, un numero, y una letra, por ejemplo, A141P, entonces se refiere a {aminoacido original/ posicion de acuerdo do con el sistema de numeracion /aminoacido sustituido}. De acuerdo con ello, por ejemplo, la sustitucion de alanina con prolina en la posicion 141 se designa como A141P.

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Cuando son posibles dos o mas sustituciones en una posicion particular, esta se denominara con letras contiguas, que puede estar opcionalmente separados por marcas de barra "/", por ejemplo, G303ED o G303E/D.

Las posiciones y sustituciones de aminoacidos mencionadas en la presente documento se listan con referencia a la posicion correspondiente y el aminoacido correspondiente de la SEQ ID NO: 1. Las posiciones equivalentes en otra secuencia se pueden encontrar mediante el alineamiento de esta secuencia con la SEQ ID NO: 1 para encontrar un alineamiento con el porcentaje de identidad mas alto y determinar a partir de entonces cual aminoacido se alinea para corresponder con un aminoacido de una posicion espedfica de la SEQ ID NO: 1. Tal alineamiento y uso de una secuencia como una primera referencia es simplemente una cuestion de rutina para un experto en la tecnica.

Las "variantes de acidos nucleicos" pueden incluir secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleotidos presentadas en este documento, en particular, con la SEQ ID NO: 52. Por ejemplo, una variante de secuencia es complementaria a secuencias capaces de hibridarse en condiciones rigurosas, por ejemplo, (50°C y 0,2X SSC (1X SsC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0), a las secuencias de nucleotidos presentadas en este documento, en particular, a la SEQ ID NO: 52 (ADN pMS 382) Mas particularmente, el termino variante abarca secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces de hibridar en condiciones muy rigurosas, por ejemplo, 65°C y 0,1 x SSC, a las secuencias de nucleotidos presentadas en este documento, en particular, a la SEQ ID NO: 52 (aDn pMS 382). El punto de fusion (Tm) de una variante de acido nucleico puede ser de aproximadamente 1, 2, o 3°C inferior a la Tm del acido nucleico de tipo salvaje. Las variantes de acidos nucleicos incluyen un polinucleotido que tiene un cierto porcentaje, por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, de identidad de secuencia con el acido nucleico que codifica SeQ ID NO: 1.

Como se usa en la presente, el termino "expresion" se refiere al proceso por el cual se produce un polipeptido sobre la base de la secuencia de acidos nucleicos de un gen. El proceso incluye tanto la transcripcion como la traduccion.

"Aislado" significa que la secuencia esta al menos sustancialmente libre de al menos otro componente que la secuencia asociada naturalmente y hallada en la naturaleza, por ejemplo, secuencias genomicas.

"Purificado" significa que el material esta en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 90% puro, al menos aproximadamente 95% de pureza, o al menos aproximadamente 98% puro.

"Termoestable" significa que la enzima mantiene su actividad despues de la exposicion a temperaturas elevadas. La termoestabilidad de una enzima se puede medir por su vida media (t-ic), donde la mitad de la actividad enzimatica se pierde por la vida media. El valor de la vida media se calcula en unas condiciones determinadas mediante la medicion de la actividad de la amilasa residual. Para determinar la vida media de la enzima, la muestra se calienta a la temperatura de ensayo durante 1-10 min, y la actividad se mide usando un ensayo estandar para la actividad de la amilasa, tal como el ensayo Betamyl® (Megazyme, Irlanda).

Como se usa en la presente, "pH optimo" significa el pH en el que las variantes de polipeptidos descriptas en la presente muestran la actividad en un ensayo estandar para la actividad de la amilasa, medida en un rango de pH.

Como se usa en la presente, "polipeptido" se usa de forma intercambiable con las expresiones "secuencia de aminoacidos", "enzima", "peptido" y/o "protema". Como se usa en la presente, "secuencia de nucleotidos" o "secuencia de acido nucleico" se refiere a una secuencia de oligonucleotido o secuencia de polinucleotidos y variantes, homologos, fragmentos y derivados de estos. La secuencia de nucleotidos puede ser de origen genomico, sintetico o recombinante y puede ser de cadena doble o cadena simple, sea que represente la cadena de sentido o anti-sentido. Como se usa en la presente, la expresion "secuencia de nucleotidos" incluye ADN genomico, ADNc, ADN sintetico y ARN.

"Homologo" significa una entidad que tiene un cierto grado de identidad u "homologfa" con las secuencias de aminoacidos presentes y las secuencias de nucleotidos presentes. Una "secuencia homologa" incluye un polinucleotido o un polipeptido que tiene un cierto porcentaje, por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, de identidad de secuencia con otra secuencia. El porcentaje de identidad significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o residuos de aminoacidos son los mismos que cuando se comparan las dos secuencias. Las secuencias de aminoacidos no son identicas, donde se sustituye, elimina o anade un aminoacido en comparacion con la secuencia presente. El porcentaje de identidad de secuencia tfpicamente se mide con respecto a la secuencia madura de la protema presente, es decir, por ejemplo despues de la eliminacion de una secuencia senal. Tfpicamente, los homologos comprenderan los mismos residuos del sitio activo que la presente secuencia de aminoacidos. Los homologos tambien retienen actividad de la amilasa, aunque el homologo puede tener diferentes propiedades enzimaticas que la PS4 de tipo salvaje.

Como se usa en la presente, "hibridacion" incluye el proceso por el cual una cadena de acido nucleico se une con una cadena complementaria a traves de apareamiento de basas, asf como el proceso de amplificacion que se lleva a cabo en las tecnologfas de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). La variante de acido nucleico puede existir como ADN o ARN de cadena simple o doble, un heteroduplex de ADN/ARN o un copolfmero ARN/ADN. Como se usa en la presente, "copolfmero" se refiere a una cadena de acido nucleico simple que comprende tanto ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos. La variante de acido nucleico se puede optimizar por codones para aumentar adicionalmente la expresion.

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Como se usa en la presente, un compuesto "sintetico" se produce por smtesis qmmica o enzimatica in vitro. Incluye, pero sin limitacion, variantes de acidos nucleicos hechos con el uso optimo de codones para los organismos huesped, tales como una celula huesped de levadura u otros huespedes de expresion de eleccion.

Como se usa en la presente, la "celula transformada" incluye celulas, que incluyen celulas bacterianas y fungicas, que se han transformado mediante el uso de tecnicas de ADN recombinante. La transformacion se produce normalmente mediante la insercion de una o mas secuencias de nucleotidos en una celula. La secuencia de nucleotidos insertada puede ser una secuencia de nucleotidos heterologa, es decir, es una secuencia que no es natural para la celula que se debe transformar, tal como una protema de fusion.

Como se usa en la presente, "unido operativamente" significa que los componentes descriptos estan en una relacion que les permite funcionar de la manera prevista. Por ejemplo, una secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia codificadora se liga de tal manera que la expresion de la secuencia codificadora se obtiene en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Como se usa en la presente, el termino "almidon" se refiere a cualquier material compuesto de los hidratos de carbono de polisacaridos complejos de plantas, tales como mafz, compuesto de amilosa y amilopectina con la formula (C6HioO5)x, donde X puede ser cualquier numero. El termino "almidon granular" se refiere a almidon crudo, es decir, almidon sin cocer, por ejemplo, que no se ha sometido a gelatinizacion.

El termino "licuefaccion" se refiere a la etapa en la conversion del almidon en el que gelatiniza el almidon se hidroliza para dar dextrinas solubles de bajo peso molecular. Como se usa en la presente, el termino "sacarificacion" se refiere a la conversion enzimatica de almidon a glucosa. El termino "grado de polimerizacion" (DP) se refiere al numero (n) de unidades glucopiranosa anhidra en un sacarido determinado. Los ejemplos de DPI son los monosacaridos glucosa y fructosa. Los ejemplos de DP2 son los disacaridos maltosa y sacarosa.

Como se usa en la presente, la expresion "contenido de solidos secos" (ds) se refiere a los solidos totales de una suspension en una base de porcentaje en peso seco. El termino "suspension" se refiere a una mezcla acuosa que contiene solidos insolubles.

La frase "sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF)" se refiere a un proceso en la microorganismo productor de etanol y al menos una enzima, tal como PS4 o una variante de esta, estan presentes durante la misma etapa del proceso. SSF se refiere a la hidrolisis simultanea de sustratos de almidon granular a sacaridos y la fermentacion de los sacaridos en alcohol, por ejemplo, en el mismo recipiente del reactor.

Como se usa en la presente, "microorganismo etanologenico" se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azucar u oligosacarido a etanol.

1.2. Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se aplican a menos que se indique lo contrario:

ADA azodicarbonamida

cDNA ADN complementario

CGTase ciclodextrina glucanotransferasa

DEAE dietilaminoetanol

dH2O agua desionizada

DNA acido desoxirribonucleico

ds-ADN ADN de cadena doble

EC comision de enzimas para la clasificacion de enzimas

FGSC Fungal Genetics Stock Center

G121F residuo de glicina (G) en la posicion 121 de la SEQ ID NO: 2 se reemplaza con un residuo de

fenilalanina (F), donde los aminoacidos se designan con las abreviaturas de una sola letra comunmente conocida en la tecnica

HPLC cromatograffa lfquida de alto rendimiento

mARN acido ribonucleico mensajero

PCR reaccion en cadena de polimerasa

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PDB

base de datos de protema

polietilenglicol

partes por millon

amilasa formadora de G4 P. saccharophila

reaccion en cadena de polimerasa- transcriptasa inversa

amilasa formadora de G4 P. saccharophila

PEG

ppm

PS4

RT-PCR

SAS

SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

1X SSC NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0

SSF

sacarificacion y fermentacion simultanea

vida media

Tm

temperatura de fusion (°C) a la que funde el 50% de la protema presente

ATm

°

C de aumento en la Tm

w/v

peso/volumen

peso/peso

w/w

2. Variantes de polipeptidos de la SEQ ID NO: 1

En un aspecto, se proporciona un polipeptido que tiene una sustitucion en una o mas posiciones que produce una propiedad alterada, que puede ser cualquier combinacion de exospecificidad, endoespecificidad o termoestabilidad alterada, o una alteracion de propiedades de manipulacion, en relacion con la SEQ ID NO: 1. Tales variantes de polipeptidos se denominan tambien en la presente por conveniencia como "variante del polipeptidoe", "variante de polipeptido" o "variante". En un aspecto, los polipeptidos tal como se definen en la presente tienen un efecto antienvejecimiento mejorado en comparacion con la amilasa de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, los polipeptidos tal como se definen en la presente tienen una termoestabilidad mejorada en comparacion con la amilasa de la SEQ ID NO: 1. En formas de realizacion muy preferidas, tienen la ventaja anadida de una mayor termoestabilidad, o actividad exoamilasa mayor o una mayor estabilidad de pH, o cualquier combinacion.

En un aspecto, las variantes definidas en la presente exhiben actividad enzimatica. En un aspecto, las variantes de polipeptidos comprenden actividad de amilasa. En un aspecto adicional, las variantes de polipeptidos comprenden actividad de exoamilasa. En un aspecto adicional, las variantes de polipeptidos exhiben actividad de exoamilasa no maltogenica. En un aspecto, las variantes definidas en la presente se pueden derivar de la a-amilasa de Pseudomonas saccharophila (PS4). En un aspecto, las variantes definidas en la presente son una maltotetrahidrolasa fomadora de maltotetraosa, tambien denominada EC 3.2.1.60; amilasa formadora de G4; G4- amilasa o glucan 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa.

Las composiciones, que incluyen aditivos alimentarios, productos alimenticios, productos de panadena, composiciones mejoradoras, productos alimenticios, que incluyendo alimentos para animales, etc. que comprenden tales variantes de polipeptidos definidas en la presente, tales como los que tienen actividad exoamilasa no maltogenica, asf como metodos de fabricacion y uso de tales polipeptidos y las composiciones, se proporcionan en la presente.

Como se senalo anteriormente, las variantes de polipeptidos pueden comprender una o mas propiedades de manipulacion mejoradas, con preferencia propiedades de horneado mejoradas. Por lo tanto, las variantes de polipeptidos son tales que los productos alimenticios asf tratados tienen una o mas de (con preferencia todas de) una firmeza inferior, una elasticidad superior, una cohesion superior, una friabilidad inferior o mayor capacidad de plegado. Tales propiedades de manipulacion u horneado mejoradas exhibidas por los polipeptidos variantes se describen con mas detalle a continuacion.

Ademas, se proporciona un tratamiento de los productos alimenticios, en particular masas y productos de panadena con tales polipeptidos, y de modo que tales productos alimenticios presentan las cualidades deseadas anteriormente expuestas.

Ademas se proporcionan otros usos de las variantes descriptas en la presente y composiciones que comprenden estas variantes, tales como en la preparacion de detergentes, como edulcorantes, jarabes, etc. Las composiciones incluyen el polipeptido junto con al menos otro componente. En particular, se proporcionan aditivos para alimentos o alimentos para animales que comprenden los polipeptidos.

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Se proporciona un polipeptido aislado y/o purificado que comprende una variante de polipeptido definida en la presente. En una forma de realizacion, la variante de polipeptido es una forma madura del polipeptido (SEQ ID NO: 1), donde se escinde la secuencia lfder de 21 aminoacidos, de modo que el extremo N-terminal del polipeptido comienza en el residuos de acido aspartico (D). En un aspecto, las variantes incluyen un dominio de union de almidon C-terminal. Una secuencia de aminoacidos representativa de un dominio de union al almidon comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 36. Otras variantes incluyen las variantes donde se han anadido o suprimido entre uno y aproximadamente 25 residuos de aminoacidos con respecto a la SEQ ID NO: 1. En un aspecto, la variante tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, donde se ha sustituido cualquier numero entre uno y aproximadamente 25 aminoacidos. En un aspecto adicional, la variante tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, donde se ha sustituido cualquier numero entre tres y doce aminoacidos. En un aspecto adicional, la variante tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, donde se ha sustituido cualquier numero entre cinco y nueve aminoacidos.

En un aspecto, se han sustituido al menos dos, en otro aspecto al menos tres, y aun en otro aspecto al menos cinco aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto adicional, la longitud de la variante del polipeptido es 390 a 540 aminoacidos. En un aspecto adicional, la longitud de la variante del polipeptido es 410 a 440 aminoacidos. En un aspecto adicional, la longitud de la variante del polipeptido es 420 a 435 aminoacidos. En un aspecto adicional, la longitud de la variante del polipeptido es 429 a 430 aminoacidos.

En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente ademas comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, 205, 240, 248, 266, 311, 377 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D o 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente ademas comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, 205, 240, 311 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/N/I/H/F, 272D, o 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende sustituciones de aminoacidos al menos en cuatro, cinco o en todas las siguientes posiciones: 88, 205, 235, 240, 311 o 409 y/o tiene al menos una, o dos de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/N/I/H/F, 272D o 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente ademas comprende uno o mas de los siguientes aminoacidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E/S/K/A, 229P, 307K, 309P y 334P. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente further tiene los siguientes aminoacidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 229P, 307K, 309P y 334P. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene al menos una de las sustituciones de aminoacidos en b) del punto 1 y ademas comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 44, 96, 204, 354 o 377. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 34Q. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 42K/F/H/I/N/A/V. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 42K/F/H/I/N. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 42K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 88. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 88L/Y/K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 88L. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 88Y. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 205. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 205L/K/M/N/Q/R/V/Y. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 205L/K/M/N/Q/R/V. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 205L. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 235H/K/R/Q/S. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 235H/K/R/Q. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 235H/K/R. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 235R. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 235H. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 235K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 240. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 240E/H/M/D/S. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 240E/H/M/D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 240E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 272D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 311. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 311P. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 409. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 409H/Q/T/E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 100Q/K/N/R. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 100Q. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T/G. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392D/E/K/Y. En un aspecto adicional, el

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polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 392Y. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene ambos de los siguientes aminoacidos 235R y 311P. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 16. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 16/A/E/K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 48. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 48/C/L. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 97. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 105. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 105/N/R. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 248. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 266. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 347. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 347/C/D/H/K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 350. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 350E/H/N. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 354. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 354D/E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 362. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 362E/H/P. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 364. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 364E/K/NQ. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 369. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 369I/N. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 377. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 393. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 393D/E/K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 395. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 395C/E/K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 396. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 396D/E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 399. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 399C/H. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 400. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 400S/W. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 401. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 401D/K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 403. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 403E/T/V. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 412. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 412D/N. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente ademas comprende uno o mas de los siguientes aminoacidos 121F, 134R, 141P, 229P, o 307K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene uno o mas de los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272d, 311P, 392D, o 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 235R, 311P, 392D yr 223S, 223k o 223A. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente ademas comprende uno o mas seleccionados del grupo que consiste en 272D, 409E, 205L y 240E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene al menos cuatro, cinco, seis, siete u ocho de los siguientes aminoacidos 42K, 88l, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D, o 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido 223A/K/S. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P y 392D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 223K, 235R, 272D, 311P y 392D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 223K, 240E, 235R, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 223A, T235R, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente tiene uno o mas aminoacidos en el extremo N-terminal. En un aspecto, el polipeptido definido en la presente tiene el aminoacido M en el extremo N-terminal. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, 205, 235 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 34Q, 100Q, 223A/S, 240E, 311P, 392D, o 409e con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 34Q, 88K/L/Y, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/H/Q/R, 240E/D, 248H, 266T, 311P, 377D/E/P, 392K/D/Y o 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 34Q, 42K, 88L, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/R, 240E, 311P, 392D o 409E. En un aspecto adicional, el

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polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 235R y 311P. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende la sustitucion de aminoacidos 42K. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K y 223S. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 223S y 392D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 223A, 235R, 3l1P y 392D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235r, 311P y 392D. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 34Q, 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E. En un aspecto adicional, el polipeptido definido en la presente comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 100Q, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E.

Las formas de realizacion representativas de los polipeptidos definidos en la presente comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: l3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID

NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID

NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. Otras formas de realizacion representativas de los polipeptidos definidos en la presente comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, SEQ ID nO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17. Otras formas de realizacion representativas de los polipeptidos definidos en la presente tiene una secuencia de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en las sEq ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID

NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. Otras

formas de realizacion representativas de los polipeptidos definidos en la presente tiene una secuencia de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17, y opcionalmente uno o mas aminoacidos en el extremo N-terminal.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia HGGDEIILQFHWN (SEQ ID NO: 37) en las posiciones correspondientes a las posiciones 13-26 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como sEq ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD- X4-SSW (SEQ ID NO: 38), donde X1 es S o T, X2 es M o L, X3 es V o P y X4 es cualquier residuo de aminoacido natural, con preferencia un L-aminoacido, en las posiciones correspondientes a las posiciones 49-66 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia GGEGYFW (SEQ ID NO: 39) en las posiciones correspondientes a las posiciones 79-85 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia VPNH (SEQ ID NO: 40) en las posiciones correspondientes a las posiciones 114-117 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia CDDGD (SEQ ID NO: 41) en las posiciones correspondientes a las posiciones 150-154 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia AGGFRFDFVRG (SEQ ID NO: 42) en las posiciones correspondientes a las posiciones 187-197 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia FALK (SEQ ID NO: 43) en las posiciones correspondientes a las posiciones 256-259 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia WREVAVTFVDNHD (SEQ ID NO: 44) en las posiciones correspondientes a las posiciones 282-294 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia GYSPG (SEQ ID NO: 45) en las posiciones correspondientes a las posiciones 296-300 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia GQH (SEQ ID NO: 46) en las posiciones correspondientes a las posiciones 304-306 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia AYAYI (SEQ ID NO: 47) en las 5 posiciones correspondientes a las posiciones 318-322 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia SPGTP (SEQ ID NO: 48) en las posiciones correspondientes a las posiciones 325-329 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

10 En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia VYW (SEQ ID NO: 49) en las posiciones correspondientes a las posiciones 331-333 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente comprenden la secuencia HMYDWG (SEQ ID NO: 50) en las posiciones correspondientes a las posiciones 335-340 con referencia a la numeracion de la posicion de la 15 secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la variante del polipeptido definida en la presente tiene la secuencia de la SEQ ID NO:1, donde se ha sustituido cualquier numero entre uno y aproximadamente 25 aminoacidos. Los ejemplos representativos de las variantes de polipeptidos tienen sustituciones de aminoacidos unicas o diversas se muestran en la siguiente TABLA A:

pMS

Mutaciones en comparacion con pMS382 que tienen la SEQ ID NO:1

pms1104 (SEQ ID NO: 20)

Q42K

pms1105 (SEQ ID NO: 27)

Q42K, E223S

pms1723 (SEQ ID NO: 28)

Q42K, E223S, A392D

pms2104 (SEQ ID NO: 29)

Q42K, R88L, E223A, T235R, Q311P, A392D

pms2118 (SEQ ID NO: 34)

Q42K, R88L, S205L, E223S, T235R, Q240E, Q311P, A392D, S409E

pms2124 (SEQ ID NO: 31)

Q42K, R88L, S205L, E223K, T235R, Q240E, Q311P, A392D, S409E

pms1284 (SEQ ID NO: 23)

T235R, Q311P

pms1286 (SEQ ID NO: 22)

T235R

pms1290 (SEQ ID NO: 24)

T235K

pms465 (SEQ ID NO: 18)

E223S

pms1042 (SEQ ID NO: 19)

Q311P

pms1153 (SEQ ID NO: 21)

R88L

pms1484 (SEQ ID NO: 25)

S205L

pms1579 (SEQ ID NO: 26)

S409E

pms2138 (SEQ ID NO: 30)

Q42K, R88L, S205L, E223S, T235R, Q311P, A392D

pms2177 (SEQ ID NO: 32)

N34Q, Q42K, R88L, S205L, E223K, T235R, Q240E, Q311P, A392D,S409E

pms2178 (SEQ ID NO: 33)

Q42K, R88L, G100Q, S205L, E223K, T235R, Q240E, Q311P, A392D,S409E

pms1776 (SEQ ID NO: 12)

Q42K, R88L, E223S, T235R, Q311P, A392D

pms1934 (SEQ ID NO: 13)

Q42K, R88L, E223K, T235R, H272D, Q311P, A392D

pms2020 (SEQ ID NO: 14)

Q42K, R88L, E223S, T235R, Q311P, A392D, S409E

pms2022 (SEQ ID NO: 15)

Q42K, R88L, S205L, E223S, T235R, Q311P, A392D, S409E

pms2062 (SEQ ID NO: 16)

Q42K, R88L, S205L, E223K, Q240E, T235R, Q311P, A392D, S409E

pms2171 (SEQ ID NO: 17)

Q42K, R88L, S205L, E223A, T235R, Q311P, A392D, S409E

20 Las variantes de polipeptidos definidas en la presente pueden tener una termoestabilidad alterada, una actividad de endo-amilasa alterada, una actividad de exo-amilasa alterada, y/o una relacion alterada de actividad de exo- a endo-

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amilasa en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 10. En un aspecto, los polipeptidos definidos en la presente tiene un mejor efecto antienvejecimiento en comparacion con la amilasa de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, los polipeptidos definidos en la presente tienen una mejor termoestabilidad en comparacion con la amilasa de la SEQ ID NO: 1.

Las variantes de polipeptidos definidas en la presente pueden tener hasta 25, 23, 21, 19, 17, 15, 13, 11, 9, 8, 7, 6, 5 supresiones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

La presente descripcion tambien se refiere a cada uno y todo el esqueleto de G4-amilasa que tiene la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 que comprende las sustituciones definidas adicionalmente en la presente.

Tambien se proporcionan acidos nucleicos que codifican las variantes de polipeptidos anteriores. En una forma de realizacion, un acido nucleico que codifica una variante del polipeptido definida en la presente es una secuencia de nucleotidos que codifica la protemas que comprende una secuencia de aminoacidos de residuos 1-429 de la SEQ ID NO: 1 expuesta en la SEQ ID NO: 52. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 3 codifica el esqueleto de la G4 amilasa con SEQ ID NO: 2. Como es bien entendido por los expertos en la tecnica, el codigo genetico esta degenerado, lo que significa que multiples codones en algunos casos pueden codificar el mismo aminoacido acido. Los acidos nucleicos pueden incluir el ADN genomico, ARNm, y ADNc que codifica una variante de polipeptido

2.1. Caracterizacion de la variante del polipeptido

Las variantes de la enzima se pueden caracterizar por sus secuencias de acidos nucleicos y polipeptidos primaria, mediante el modelado estructural tridimensional, y/o por su actividad espedfica. Las caractensticas adicionales de las variantes de polipeptidos tal como se definen en la presente incluyen por ejemplo, estabilidad, rango de pH, estabilidad a la oxidacion, y termoestabilidad. Los niveles de expresion y actividad de la enzima se pueden evaluar usando ensayos estandares conocidos por los expertos en este campo. En otro aspecto, las variantes demuestran caractensticas de rendimiento mejorado en relacion con el polipeptido con la SEQ ID NO: 1, tales como una mejor estabilidad a altas temperaturas, por ejemplo, 65-85°C. En un aspecto, las variantes de polipeptidos definidas en la presente son ventajosas para usar en la licuefaccion u otros procesos que requieren temperaturas elevadas, tales como el horneado. Por ejemplo, una variante de polipeptido termoestable definida en la presente puede degradar el almidon a temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 85°C o mas.

Una caractenstica de expresion significa un nivel alterado de expresion de la variante, cuando la variante se produce en una celula huesped particular. La expresion se refiere en general a la cantidad de variante activa que es recuperable a partir de un caldo de fermentacion utilizando tecnicas estandares en la materia, durante un penodo de tiempo dado. La expresion tambien se puede referir a la cantidad o tasa de variante producida dentro de la celula huesped o secretada por la celula huesped. La expresion tambien se puede referir a la tasa de traduccion del ARNm que codifica la variante de la enzima.

Se proporciona un acido nucleico complementario a un acido nucleico que codifica cualquiera de las variantes de polipeptido definidas en la presente expuestas en la presente. Adicionalmente, se proporciona un acido nucleico capaz de hibridar con el complemento. En otra forma de realizacion, la secuencia para su uso en los metodos y composiciones descriptos en la presente es una secuencia sintetica. Incluye, pero sin limitacion, las secuencias obtenidas con el uso optimo de codones para la expresion en organismos huesped, tales como levaduras.

3. Produccion de las variantes de polipeptidos definidas en la presente

Las variantes de polipeptidos provistas en la presente se pueden producir sinteticamente o mediante expresion recombinante en una celula huesped, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica. La variante de polipeptido expresada definida en la presente opcionalmente se afsla antes de su uso. En otra forma de realizacion, variante del polipeptido definida en la presente se purifica despues de la expresion. Se describen los metodos de modificacion genetica y la produccion recombinante de variantes de polipeptido, por ejemplo, en las patentes U.S. Nros 7.371.552, 7.166.453; 6.890.572; y 6.667.065; y Solicitudes publicadas U.S. Nros 2007/0141693; 2007/0072270; 2007/0020731; 2007/0020727; 2006/0073583; 2006/0019347; 2006/0018997; 2006/0008890; 2006/0008888; y 2005/0137111. Las ensenanzas pertinentes de estas descripciones, que incluyen las secuencias de polinucleotidos que codifican el polipeptido, cebadores, vectores, metodos de seleccion, celulas huesped, purificacion y reconstitucion de variantes de polipeptidos expresadas y la caracterizacion de variantes de polipeptidos definidas en la presente, que incluyen tampones utiles, rangos de pH, concentraciones de Ca2+, concentraciones de sustrato y concentraciones de enzima para ensayos enzimaticos, se incorporan en la presente.

En otra forma de realizacion, las celulas huesped adecuadas incluyen una bacteria Gram positiva seleccionada del grupo que consiste en Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amiloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans, o S. murinus; o una bacteria Gram negativa, donde dicha bacteria Gram negativa es una especie Escherichia coli o Pseudomonas. En un aspecto, la celula huesped es una B. subtilus o B. licheniformis. En una forma de realizacion, la celula huesped es B. subtilis, y la protema expresada se manipula geneticamente para comprender una secuencia senal de B.

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subtilis, que se exponen con mayor detalle a continuacion. En un aspecto, la celula huesped expresa el polinucleotido expuesto en las reivindicaciones.

En algunas formas de realizacion, una celula huesped se manipula geneticamente para expresar una variante del polipeptido definida en la presente con una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con el polipeptido de la SEQ ID NO:1. En algunas formas de realizacion, el polinucleotido que codifica una variante del polipeptido definida en la presente tendra una secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de acidos nucleicos que tiene al menos aproximadamente 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un acido nucleico que codifica la protema de la SEQ ID NO: 1. En una forma de realizacion, la secuencia de acidos nucleicos tiene al menos aproximadamente 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el acido nucleico de la SEQ ID NO: 52.

3.1. Vectores

En un aspecto, la invencion se refiere a un vector que comprende un polinucleotido. En un aspecto, de la invencion una celula bacteriana comprende el vector. En algunas formas de realizacion, un constructo de ADN que comprende un acido nucleico que codifica una variante se transfiere a una celula huesped en un vector de expresion que comprende secuencias reguladoras unidas operativamente a una secuencia codificadora. El vector puede ser cualquier vector que puede ser integrado en un genoma de la celula huesped fungica y se replica cuando se introduce en la celula huesped. El catalogo de FGSC de cepas de la Universidad de Missouri, enumera vectores adecuados. Los ejemplos adicionales de vectores de expresion y/o vectores de integracion adecuados se proporcionan en Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Bennett et al., MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991), pp. 396-428 y la patente U.S, N°. 5.874.276. Los ejemplos de vectores incluyen pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 y pENTR/D, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z y pGEM®4Z. Los ejemplos para usar en las celulas bacterianas incluyen pBR322 y pUC19, que permiten la replicacion en E. coli, y pE194, por ejemplo, que permite la replicacion en Bacillus.

En algunas formas de realizacion, un acido nucleico que codifica una variante esta unido operativamente a un promotor adecuado, que permite la transcripcion en la celula huesped. El promotor puede derivar de genes que codifican protemas homologas o heterologas a la celula huesped. Los ejemplos adecuados no limitantes de promotores incluyen promotores cbh1, cbh2, egl1, y egl2. En una forma de realizacion, el promotor es uno que es nativa de la celula huesped. Por ejemplo, cuando P. saccharophila es el huesped, el promotor es un promotor de P, saccharophila P nativo. Un "promotor inducible" es un promotor que es activo bajo regulacion ambiental o de desarrollo. En otra forma de realizacion, el promotor es uno que es heterologo para la celula huesped.

En algunas formas de realizacion, la secuencia codificadora esta unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una secuencia senal. Un peptido senal representativo es la SEQ ID NO: 11, que es la secuencia senal nativa del precursor de PS4. En otras realizaciones, el ADN que codifica la secuencia senal se reemplaza con una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia senal de una especie distinta de P. saccharophila. En esta forma de realizacion, el polinucleotido que codifica la secuencia senal esta inmediatamente corriente arriba y en marco del polinucleotido que codifica el polipeptido. La secuencia de senal se puede seleccionar de la misma especie que la celula huesped. En un ejemplo no limitante, la secuencia senal es una secuencia senal de ciclodextrina glucanotransferasa. (CGTasa; EC 2.4.1.19) de Bacillus sp, y las variantes de polipeptidos descriptas en la presente se expresan en una celula huesped de B. subtilis. Un residuo de metionina se puede anadir al extremo N-terminal de la secuencia senal.

En algunas formas de realizacion, una secuencia de senal y una secuencia de promotor que comprende un constructo de ADN o vector para introducir en una celula huesped fungica derivan de la misma fuente. En algunas realizaciones, el vector de expresion tambien incluye una secuencia de terminacion. En una forma de realizacion, la secuencia de terminacion y la secuencia promotora se derivan de la misma fuente. En otra forma de realizacion, la secuencia de terminacion es homologa a la celula huesped.

En algunas realizaciones, un vector de expresion incluye un marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen los que confieren resistencia a los agentes antimicrobianos, por ejemplo, higromicina o fleomicina. Los marcadores selectivos nutricionales tambien son adecuados e incluyen amdS, argB, y pyr4. En una forma de realizacion, el marcador selectivo es el gen amdS, que codifica la enzima acetamidasa que permite a las celulas transformadas crecer en acetamida como fuente de nitrogeno. El uso de un gen amdS de A. nidulans como marcador selectivo se describe en Kelley et al, EMBO J. 4:. 475-479 (1985) y Penttila et al, Gene 61: 155-164 (1987).

Un vector de expresion adecuado que comprende un constructo de ADN con un polinucleotido que codifica una variante puede ser cualquier vector que es capaz de replicarse de forma autonoma en un organismo huesped dado o integrarse en el ADN del huesped. En algunas realizaciones, el vector de expresion es un plasmido. En algunas formas de realizacion, se contemplan dos tipos de vectores de expresion para obtener la expresion de genes. El primer vector de expresion comprende secuencias de ADN en el que el promotor, la region codificadora y el

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terminador se originan a partir del gen para expresar. En algunas realizaciones, el truncamiento de genes se obtiene mediante la supresion de las secuencias de aDn no deseadas, por ejemplo, ADN que codifica el dominio de union a almidon-C-terminal, para dejar que el dominio se exprese bajo el control de sus propias secuencias reguladoras de transcripcion y traduccion. El segundo tipo de vector de expresion se preensambla y contiene secuencias necesarias para la transcripcion de alto nivel y un marcador seleccionable. En algunas realizaciones, la region codificadora para un gen o parte de este se inserta en este vector de expresion de uso general, de modo que esta bajo el control transcripcional de las secuencias promotoras y de terminacion del constructo de expresion. En algunas realizaciones, los genes o parte de estos se insertan corriente abajo del promotor cbhl fuerte.

3.2. Transformacion, expresion y cultivo de las celulas huesped

La introduccion de un constructo de ADN o vector en una celula huesped incluye tecnicas tales como la transformacion; electroporacion; microinyeccion nuclear; transduccion; transfeccion, por ejemplo, transfeccion mediada por lipoinfeccion y mediada por DEAE-Dextrina; incubacion con precipitado de ADN con fosfato de calcio; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN; y fusion de protoplastos. Las tecnicas de transformacion general son conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Ausubel et al. (1987), supra, capttulo 9; Sambrook et al. (2001), supra; y Campbell et al., Curr. Gineta. 16: 53-56 (1989). La expresion de la protema heterologa en Trichoderma se describe, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 6.022.725; Patente U.S. N.° 6.268.328; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991); Harkki et al., Biotechnol. 7: 596-603 (1989); EP 244.234; y EP 215,594. En una forma de realizacion, los transformantes geneticamente estables se construyen con sistemas de vectores mediante el cual el acido nucleico que codifica una variante esta integrado de manera estable en un cromosoma de la celula huesped. Los transformantes se purifican luego mediante tecnicas conocidas.

En un ejemplo no limitante, los transformantes estables, que incluyen un marcador de amdS se distinguen de los transformantes inestables por su velocidad de crecimiento mas rapida y la formacion de colonias circulares con un contorno regular mas que irregular en medio de cultivo solido que contiene acetamida. Ademas, en algunos casos, se lleva a cabo una prueba adicional de la estabilidad mediante el cultivo de los transformantes en un medio no selectivo solido, por ejemplo, un medio que carece de acetamida, recoleccion de las esporas de este medio de cultivo y la determinacion del porcentaje de estas esporas que posteriormente germinaran y creceran en medio selectivo que contiene acetamida. Se pueden usar otros metodos conocidos en la tecnica para seleccionar transformantes.

3.3. Identificacion de la actividad

Para evaluar la expresion de una variante en una celula huesped, los ensayos pueden medir la protema expresada, ARNm correspondiente, o • la actividad amilasa. Por ejemplo, los ensayos apropiados incluyen transferencia Northern y Southern, RT-PCR (reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa), y la hibridacion in situ, utilizando una sonda de hibridacion marcada apropiadamente. Los ensayos adecuados tambien incluyen actividad de medicion en una muestra. Los ensayos adecuados de la exo-actividad de la variante incluyen, pero sin limitacion, el ensayo Betamyl® (Megazyme, Irlanda). Los ensayos adecuados de la endo-actividad de la variante incluyen, pero sin limitacion, el ensayo de azul Phadebas (Pharmacia y Upjohn Diagnostics AB). Los ensayos tambien incluyen el analisis de HPLC de licuefactos preparado en presencia de la variante. Se puede usar HPLC para medir la actividad de la amilasa mediante la separacion de los sacaridos DP-3 y DP-4 de otros componentes del ensayo.

Propiedades de manipulacion mejoradas

Las variantes de polipeptidos descriptas en la presente con preferencia, con preferencia propiedades de horneado mejoradas. Por lo tanto, las variantes de polipeptidos tienen propiedades mejoradas cuando se compara con la SEQ ID NO:1, tales como una o mas de termoestabilidad mejorada, estabilidad al pH mejorada, o exo-especificidad mejorada. Las variantes de polipeptidos descriptas en la presente con preferencia tambien tienen mejores propiedades de manipulacion, de modo que un producto alimenticio tratado con una variante de polipeptido tiene una o todas de firmeza inferior, elasticidad mayor, cohesion mayor, friabilidad inferior o mayor capacidad de plegado en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con la SEQ ID NO: 1.

Sin desear estar ligado a ninguna teona en particular, se considera que las mutaciones en las posiciones particulares tienen efectos individuales y acumulados sobre las propiedades de un polipeptido que comprende dichas mutaciones.

Termoestabilidad y estabilidad al pH

Con preferencia, la variante de polipeptido es termoestable; con preferencia, tiene mayor termoestabilidad que la SEQ ID NO: 1.

En el trigo y otros cereales las cadenas laterales externas de amilopectina estan en el rango de 12-19 DP. Por lo tanto, la hidrolisis enzimatica de las cadenas laterales de amilopectina, por ejemplo, mediante variantes de polipeptidos descriptos que tienes actividad de exoamilasa no maltogenica, puede reducir marcadamente sus tendencias de cristalizacion.

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El almidon en el trigo y otros cereales que se utilizan para fines de horneado esta presente en la forma de granulos de almidon que generalmente son resistentes al ataque enzimatico por las amilasas. Por lo tanto la modificacion del almidon se limita principalmente al almidon danado y progresa muy lentamente durante la elaboracion de la masa y horneado inicial hasta que la gelatinizacion comienza a aproximadamente 60°C. Como consecuencia de esto solamente las amilasas con un alto grado de termoestabilidad son capaces de modificar el almidon de manera eficiente durante el horneado. Y, en general la eficiencia de amilasas se incrementa con el aumento de la termoestabilidad. Esto es asf porque cuanto mas termoestable es la enzima puede estar activa mas tiempo durante el horneado y por lo tanto proporcionara mas efecto antienvejecimiento.

Por consiguiente, el uso de polipeptidos variantes como se describe en la presente cuando se anade al almidon en cualquier etapa de su procesamiento en un producto alimenticio, por ejemplo, antes, durante o despues del horneado en pan puede retardar o impedir o lentificar la retrogradacion. Tal uso se describe con mas detalle a continuacion.

Como se usa en la presente, el termino "termoestable" se refiere a la capacidad de la enzima para conservar la actividad despues de la exposicion a temperaturas elevadas. Con preferencia, la variante de polipeptido es capaz de degradar almidon a temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 80°C o mas. Convenientemente, la enzima conserva su actividad despues de la exposicion a temperaturas de hasta aproximadamente 95°C.

La termoestabilidad de una enzima tal como una exoamilasa no maltogenica se mide por su vida media. En consecuencia, las variantes de polipeptidos descriptas en la presente tienen vidas medias extendidas con respecto a la enzima original con preferencia en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mas, con preferencia a temperaturas elevadas de 55°C a aproximadamente 95°C o mas, con preferencia a aproximadamente 80°C.

Como se usa en la presente, la vida media (t1/2) es el tiempo (en minutos) durante el cual se inactiva la mitad de la actividad de la enzima en condiciones de calor definidas. En formas de realizacion preferidas, la vida media se ensaya a 80 grados C, con preferencia; la muestra se calienta durante 1-10 minutos a 80°C o superior. El valor de la vida media luego se calcula mediante la medicion de la actividad de la amilasa residual, por cualquiera de los metodos descriptos en la presente. Con preferencia, se lleva a cabo un ensayo de la vida media como se describe en mas detalle en los Ejemplos.

Con preferencia, las variantes de polipeptidos descriptas en la presente son activas durante el horneado e hidrolizan el almidon durante y despues de la gelatinizacion de los granulos de almidon que empieza a temperaturas de aproximadamente 55 grados C. Cuanto mas termoestable es la exoamilasa no maltogenica mas tiempo puede ser activa y por lo tanto proporcionara mas efecto antienvejecimiento. Sin embargo, durante el horneado a temperaturas por encima de aproximadamente 85 grados C, se puede producir la inactivacion de la enzima. Si esto sucede, la exoamilasa no maltogenica se puede inactivar gradualmente de modo que no hay sustancialmente actividad despues del proceso de horneado en el pan final. Por lo tanto, con preferencia, las exoamilasas no malogenicas adecuadas para su uso como se ha descrito tienen una temperatura optima por encima de 50 grados C y por debajo de 98 grados C.

La termoestabilidad de las variantes de polipeptidos descriptas en la presente se pueden mejorar mediante el uso de manipulacion genetica de protemas para ser mas termoestable y por lo tanto mas adecuadas para los usos descritos en la presente; por lo tanto esta abarcado el uso de variantes de polipeptidos modificadas para ser mas termoestables mediante la manipulacion genetica de protemas .

Con preferencia, la variante de polipeptido es estable al pH; con mas preferencia, tiene una mayor estabilidad al pH que la SEQ ID NO: 1. Como se usa en la presente el termino "estable al pH" se refiere a la capacidad de la enzima para conservar la actividad en un amplio rango de pH. Con preferencia, la variante de polipeptido es capaz de degradar el almidon a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,5. En una forma de realizacion, el grado de estabilidad del pH se puede ensayar midiendo la vida media de la enzima en condiciones de pH espedficas. En otra forma de realizacion, el grado de estabilidad al pH se puede ensayar midiendo la actividad o la actividad espedfica de la enzima en condiciones de pH espedficas. Las condiciones de pH espedficos pueden ser cualquier pH desde pH 5 a pH 10,5.

En consecuencia, la variante de polipeptido puede tener una vida media mas larga o una actividad mas alta (de acuerdo con el ensayo) cuando se compara con la SEQ ID NO: 1 en condiciones identicas. Las variantes de polipeptidos pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o vida media mas larga en comparacion con la SEQ ID NO: 1 en condiciones de pH identicas. De forma alternativa o adicional pueden tener mayor actividad cuando se compara con la SEQ ID NO:1 en condiciones de pH identicas.

Exoespecificidad

Se sabe que algunas exoamilasas no maltogenicas pueden tener algun grado de actividad endoamilasa. En algunos casos, puede ser necesario reducir o eliminar este tipo de actividad ya que la actividad endoamilasa posiblemente puede afectar negativamente a la calidad del producto de pan final mediante la produccion de una miga pegajosa o gomosa debido a la acumulacion de dextrinas ramificadas.

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La exoespecificidad se puede medir utilmente mediante la determinacion de la relacion de actividad de amilasa total a actividad de endo-amilasa total. Esta relacion se denomina en este documento como un 'Indice de exoespecificidad". En formas de realizacion preferidas, una enzima se considera una exoamilasa si tiene un mdice de exoespecificidad de 20 o mas,. Es decir, su actividad de amilasa total (que incluye la actividad de exo-amilasa) es 20 veces o mas grande que su actividad de endoamilasa. En formas de realizacion muy preferidas, el mdice de exoespecificidad de las exoamilasas es 30 o mas, 40 o mas, 50 o mas, 60 o mas, 70 o mas, 80 o mas, 90 o mas, o 100 o mas. En formas de realizacion muy preferidas, el mdice de exoespecificidad es 150 o mas, 200 o mas, 300 o mas, 400 o mas, 500 o mas o 600 o mas.

La actividad de la amilasa total y la actividad de endoamilasa se pueden medir por cualquier medio conocido en la tecnica. Por ejemplo, la actividad total de amilasa se puede medir mediante el ensayo el numero total de extremos reductores liberados de un sustrato de almidon. Alternativamente, el uso de un ensayo de Betamyl se describe con mas detalle en los ejemplos, y por conveniencia, la actividad amilasa analizada en los Ejemplos se describe en terminos de "unidades de Betamyl" en las Tablas.

La actividad de endoamilasa se puede analizar mediante el uso de un kit de Phadebas (Pharmacia y Upjohn). Este emplea un almidon reticulado marcado con azul (marcado con un colorante azoico); solo cortes internos de la molecula de almidon liberan la marca, mientras que los cortes externos no lo hacen. La liberacion de colorante se puede medir por espectrofotometna. En consecuencia, el kit Phadebas mide la actividad de endoamilasa, y por conveniencia, los resultados de tal ensayo se denominan en este documento como "unidades Phadebas".

En una forma de realizacion muy preferida, en consecuencia el mdice de exoespecificidad se expresa en terminos de unidades Betamil /unidades Phadebas, tambien denominadas como "B/Phad".

La exoespecificidad tambien se puede analizar de acuerdo con los metodos descriptos en la tecnica anterior, por ejemplo, en nuestra Publicacion de patente Internacional numero WO99/50399. Esto mide exoespecificidad por medio de una relacion entre la actividad endoamilasa a la actividad exoamilasa. Por lo tanto, en un aspecto preferido, la variante de polipeptido descripta en la presente tendra menos de 0,5 unidades de endoamilasa (EAU) por unidad de actividad exoamilasa. Con preferencia, las exoamilasas no maltogenicas que son adecuadas para uso de acuerdo con la presente invencion tienen menos de 0,05 EAU por unidad de actividad exoamilasa y con mas preferencia menos de 0,01 EAU por unidad de actividad exoamilasa.

La variante de polipeptido descripta en la presente con preferencia tendra exoespecificidad, por ejemplo, medida por los indices de exoespecificidad, descriptos anteriormente, en forma compatible con las exoamilasas. Ademas, con preferencia tiene o mayor o aumento de exoespecificidad cuando se compara con la SEQ ID NO:1. En consecuencia, por ejemplo, la variante de polipeptido puede tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mayor mdice de exoespecificidad cuando se compara con la SEQ ID NO:1, con preferencia en condiciones identicas. Pueden tener 1,5x o superior, 2x o superior, 5 x o superior, 10 x o superior, 50 x o superior, 100 x o superior, cuando se compara con la SEQ ID NO:1, con preferencia en condiciones identicas.

3.4. Metodos para purificar variantes

En general, una variante producida en cultivo celular es secretada en el medio y puede ser purificado o aislado, por ejemplo, mediante la eliminacion de componentes no deseados del medio de cultivo celular. En algunos casos, una variante se puede recuperar a partir de un lisado celular. En tales casos, la enzima se purifica a partir de las celulas en las que se produjo usando tecnicas de rutina empleados por los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, cromatograffa de afinidad, metodos cromatograficos de intercambio de iones, que incluyen intercambio ionico de alta resolucion, cromatograffa de interaccion hidrofobica, particion de dos fases, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatograffa en sflice o una resina de intercambio cationica tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitacion con sulfato de amonio, y filtracion en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

4. Composiciones y usos de variantes

Una variante de polipeptido producido y purificado por los metodos descritos anteriormente es util para una variedad de aplicaciones industriales. En una forma de realizacion, la variante de polipeptido definida en la presente es util en un proceso de conversion de almidon, particularmente en un proceso de licuefaccion de un almidon, por ejemplo, almidon de mafz, almidon de trigo o almidon de cebada. El producto final deseado puede ser cualquier producto que puede ser producido por la conversion enzimatica del sustrato de almidon. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en sacaridos utiles para la fermentacion, en particular maltotriosa, glucosa y/o maltosa. El producto final luego se puede utilizar directamente en un proceso de fermentacion para producir alcohol para combustible o potable (es decir, alcohol potable). El experto en la materia es consciente de las diversas condiciones de fermentacion que se pueden usar en la produccion de etanol u otros productos finales de fermentacion. Un organismo microbiano capaz de fermentar maltotriosas y/o azucares menos complejos, tales como S. cerevisiae o una variante modificada geneticamente de esta es particularmente util. Las variantes alteradas geneticamente adecuadas de S. cerevisiae particularmente utiles para la fermentacion maltotriosas incluyen variantes que expresan AGT1 permeasa (Stambuck et al., Lett. Appl. Microbiol. 43: 370-76 (2006)), MTT1 y MTT1alt (Dietvorst et al., Yeast

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22: 775-88 (2005)), o MAL32 (Dietvorst et al., Yeast 24: 27-38 (2007)). Las presentes variantes de polipeptidos tambien son utiles en composiciones y metodos de preparacion de los alimentos, cuando se desean, enzimas que expresan actividad de la amilasa a altas temperaturas.

La conveniencia de utilizar una variante de polipeptido particular dependera de las propiedades generales mostradas por la variante de polipeptido con respecto a los requerimientos de una aplicacion particular. Como cuestion general, las variantes de polipeptido utiles para un proceso de conversion de almidon tienen actividad de endo-amilasa sustancial en comparacion con PS4 de tipo salvaje o SEQ ID NO: 1, y/o tienen una actividad exo a endo-amilasa inferior en comparacion con PS4 tipo salvaje o SEQ ID NO: 1. Tales variantes de polipeptidos pueden ser particularmente utiles en un proceso de licuefaccion, cuando se usa solo o en combinacion con otras variantes de amilasa, en donde la escision interna de los sacaridos de ramificacion complejos reduce la viscosidad del sustrato. Se espera que algunas variantes de polipeptidos utiles para la licuefaccion, sin embargo, tengan una actividad de endo-amilasa comparable o incluso menores que PS4 tipo salvaje. Las variantes de polipeptidos utiles incluyen los que tienen mas o menos la actividad exo-amilasa del polipeptido de PS4 de tipo salvaje o la SEQ ID NO: 1, de acuerdo con la aplicacion. Las composiciones pueden incluir uno o una combinacion de variantes de amilasa, cada una de los cuales puede mostrar un conjunto diferente de propiedades.

4.1. Preparacion de los sustratos de almidon

Los expertos en la tecnica son muy conscientes de los metodos disponibles que se pueden usar para preparar sustratos de almidon para su uso en los procesos descriptos en la presente. Por ejemplo, un sustrato de almidon util se puede obtener de tuberculos, rafces, tallos, leguminosas, cereales o grano entero. Mas espedficamente, el almidon granular viene de las plantas que producen altas cantidades de almidon. Por ejemplo, el almidon granular se puede obtener a partir de mafces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, mijo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, porotos, bananas o papas. El mafz contiene aproximadamente 60 a 68% de almidon; la cebada contiene aproximadamente 55-65% de almidon; el mijo contiene aproximadamente de 75 a 80% de almidon; el trigo contiene aproximadamente 60 a 65% de almidon; y el arroz pulido contiene almidon de 70-72%. Los sustratos de almidon espedficamente contemplados son almidon de mafz, almidon de trigo y almidon de cebada. El almidon de un grano puede estar molido o entero e incluye solidos de mafz, tales como granos, salvado y/o mazorcas. El almidon puede ser almidon altamente refinado en bruto o materia prima a partir de procesos de la refinena de almidon. Diversos almidones tambien estan disponibles en el comercio. Por ejemplo, el almidon de mafz esta disponible en Cerestar, Sigma, y Katayama Chemical Industry Co. (Japon); almidon de trigo esta disponible de Sigma; almidon de batata esta disponible en Wako Pure Chemical Industry Co. (Japon); y almidon de papa esta disponible en Nakaari Qrnmica Pharmaceutical Co. (Japon).

Las maltodextrinas son utiles como sustratos de almidon en las formas de realizacion de la presente invencion. Las maltodextrinas comprenden productos de hidrolisis del almidon que tienen aproximadamente 20 o menos unidades de dextrosa (glucosa). Las maltodextrinas comerciales tfpicas contienen mezclas de polisacaridos que incluyen de aproximadamente tres a aproximadamente diecinueve unidades de dextrosa ligadas. Las maltodextrinas son definidas por la FDA como productos que tienen una equivalencia de dextrosa (DE) de menos de 20. Por lo general, se reconocen como ingredientes de alimentos (GRAS) seguros para el consumo humano. La equivalencia de dextrosa (DE) es una medicion de energfa reductora en comparacion con un estandar de dextrosa (glucosa) de 100. Cuanto mayor es la DE, mayor es el grado de despolimerizacion del almidon, lo que produce un tamano de polfmero promedio menor (polisacarido), y mayor la dulzura. Una maltodextrina particularmente util se MALTRIN® M040 obtenida a partir de almidon de mafz, disponible de Grain Processing Corp. (Muscatine, Iowa): DE 4.0-7.0; densidad aparente de 0,51 g/cc; contenido de agua medido al 6,38% en peso.

El sustrato de almidon puede ser un almidon crudo de grano entero molido, que contiene fracciones no de almidon, por ejemplo, residuos de germen y fibras. La molienda puede comprender molienda humeda o molienda en seco. La molienda en humedo, el grano entero se sumerge en agua o acido diluido para separar el grano en sus partes componentes, fibras, por ejemplo, almidon, protemas, germen, aceite, fibras de grano. La molienda en humedo separa de manera eficiente el germen y la harina (es decir, granulos de almidon y protema) y es especialmente adecuado para la produccion de jarabes. En la molienda en seco, los granos enteros se muelen en un polvo fino y se procesan sin fraccionar el grano en sus partes componentes. El grano molido en seco de este modo comprendera cantidades significativas de compuestos de carbohidratos no amilaceos, ademas de almidon. La mayor parte de etanol proviene de la molienda en seco. Alternativamente, el almidon para procesar puede ser una calidad de almidon altamente refinado, por ejemplo, al menos aproximadamente 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99,5% de pureza.

4.2. Sacarificacion, gelatinizacion y licuefaccion del almidon

Como se usa en la presente, el termino "licuefaccion" o "licuar" significa un proceso mediante el cual el almidon se convierte en dextrinas de cadena mas cortas y menos viscosas. Este proceso implica la gelatinizacion del almidon de manera simultanea con o seguida de la adicion de una variante de polipeptido descripto en la presente. Una variante de polipeptido termoestable descripta en la presente con preferencia se usa para esta aplicacion. Se puede anadir opcionalmente enzimas inductoras de licuefaccion adicionales.

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En algunas formas de realizacion, el sustrato de almidon o maltodextrina preparada como se describio anteriormente se suspende con agua. La suspension almidon o maltodextrina puede contener almidon como un por ciento en peso de solidos secos de aproximadamente 10-55%, aproximadamente 20-45%, aproximadamente 30-45%, aproximadamente 30-40%, o, de modo opcional, aproximadamente 30-35%. Las • -amilasas, por ejemplo, alfa- amilasas bacterianas que incluyen alfa-amilasas de Bacillus, usualmente se suministran, por ejemplo, en aproximadamente 1500 unidades por kg de materia seca de almidon. Para optimizar estabilidad y actividad de • - amilasa, el pH de la suspension se puede ajustar al pH optimo para la variante de polipeptido usada. Se pueden anadir otras •-amilasas y pueden requerir diferentes condiciones optimas. La •- amilasa bacteriana restante en la suspension despues de la licuefaccion se puede desactivar mediante la reduccion de pH en una etapa de reaccion subsiguiente o mediante la eliminacion de calcio de la suspension.

La suspension de almidon mas la variante de polipeptido se pueden bombear de forma continua a traves de un cocedor de chorro, que es calentado por vapor de aproximadamente 85°C hasta 105°C. La gelatinizacion se produce muy rapidamente en estas condiciones, y la actividad enzimatica, combinada con las fuerzas de cizallamiento importantes, comienza la hidrolisis del sustrato de almidon. El tiempo de permanencia en el cocedor de chorro es muy breve. El almidon parcialmente gelatinizado se puede pasar en una serie de tubos de retencion mantenidos a aproximadamente 85 a 105°C y se mantuvo durante aproximadamente 5 min. para completar el proceso de gelatinizacion. Estos tanques pueden contener deflectores para desalentar la retromezcla. Como se usa en la presente, la expresion "licuefaccion secundaria" se refiere la etapa de licuefaccion posterior a la licuefaccion primaria, cuando la suspension se deja enfriar a temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede ser de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos, por ejemplo, unos 90 minutos a 120 minutos.

Una variante del polipeptido definida en la presente se puede anadir al almidon licuado obtenido por el procedimiento anterior o a una suspension maltodextrina en aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 kg/MTDS. 1 kg/MTDS = 0,1% en peso de solidos disueltos. En una forma de realizacion, un polipeptido definido en la presente se puede anadir a un suspension de almidon o maltodextrina licuada a un nivel de tratamiento en un rango de aproximadamente 0,001% en peso a aproximadamente 0,01% en peso sobre la base de los solidos disueltos. En una forma de realizacion tfpica, un polipeptido definido en la presente se puede anadir a un suspension de almidon o maltodextrina licuada a un nivel de tratamiento en un rango de aproximadamente 0,0025% en peso a aproximadamente 0,01% en peso sobre la base de los solidos disueltos. En una forma de realizacion,, el polipeptido definido en la presente se inmoviliza, y el sustrato de almidon o maltodextrina licuado se hace pasar sobre el polipeptido inmovilizado definido en la presente y se convierte en n el producto en una reaccion continua. En esta forma de realizacion, el polipeptido definido en la presente se puede inmovilizar con enzimas adicionales, tales como un pullulanasa.

La produccion de maltotetraosa puede comprender ademas poner en contacto el almidon licuado u otra fuente de maltodextrinas con un isoamilasa, una proteasa, una celulasa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa, o cualquier combinacion de estas.

Tambien se proporciona un metodo de obtener de preparar un jarabe de sacarido (por ejemplo, maltotetraosa), que comprende anadir una variante del polipeptido definida en la presente o una composicion que comprende la variante en un licuefacto de almidon y sacarificar el licuefacto de almidon para formar el jarabe de sacarido. La variante del polipeptido definida en la presente se puede anadir al licuefacto de almidon en un rango de aproximadamente 0,001% en peso a aproximadamente 0,1% en peso sobre la base de los solidos disueltos. En una forma de realizacion, la variante se anade al licuefacto de almidon en un rango de aproximadamente 0,0025% en peso a aproximadamente 0,01% en peso sobre la base de los solidos disueltos. Las unidades de concentracion tambien se expresan en la presente como kg de variante del polipeptido por tonelada metrica de solidos secos (MTDS), donde 1 kg/MTDS = 0,1 % en peso de solidos disueltos. La solucion de almidon licuado puede ser una suspension de almidon licuado a aproximadamente 20-35% p/p solidos secos. El almidon puede obtener a partir de mafces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, mijo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, porotos, bananas o papas. El licuefacto de almidon se puede sacarificar a aproximadamente 55 °C a aproximadamente 65 °C tal como aproximadamente 60°C a aproximadamente 65 °C. El licuefacto de almidon se puede sacarificar a aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0. Una pululanasa, isoamilasa, pululanasa, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, o cualquier combinacion de estas, se puede anadir con la variante del polipeptido al licuefacto de almidon. En una forma de realizacion, el jarabe de sacarido se puede fermentar para producir etanol. El jarabe de sacarido producido por el metodo puede comprender al menos aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, o aproximadamente 60% en peso de maltotetraosa sobre la base del contenido de sacaridos total.

En otro aspecto se proporciona un metodo de preparar un jarabe de sacarido, que incluye la adicion de una variante del polipeptido definida en la presente y una alfa-amilasa al almidon granular y la hidrolisis del almidon granular para formar el jarabe de sacarido. En una forma de realizacion, el licuefacto de almidon granular se produce mediante una alfa-amilasa. En una forma de realizacion, el licuefacto de almidon granular es un licuefacto producida acido. En una forma de realizacion la variante del polipeptido definida en la presente se anade al almidon granular en un rango de aproximadamente 0,001% en peso a aproximadamente 0,1% en peso sobre la base de los solidos disueltos. En otra forma de realizacion la variante del polipeptido definida en la presente se anade al almidon granular en un rango de aproximadamente 0,0025% en peso a aproximadamente 0,01% en peso sobre la base de los solidos disueltos. El

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almidon granular se puede obtener almidon de mafces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, mijo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, porotos, bananas o papas.

En una forma de realizacion particular el almidon granular se sacarifica a 55°C a 65°C tal como 60°C a 65°C. En otra forma de realizacion el almidon granular se sacarifica a pH 5,0 a pH 7,0. Se preve que el metodo tambien puede incluir la fermentacion del jarabe de sacarido para producir etanol.

En una forma de realizacion el metodo incluye una etapa de adicion de una enzima que tiene actividad de desramificacion en el almidon granular. La enzima que tiene actividad de desramificacion puede incluir pero sin limitacion una isoamilasa, una pululanasa, una isopululanasa, una neopululanasa o cualquiera de sus combinaciones. Tambie se preve que el metodo puede incluir opcionalmente una etapa adicional de adicion de una proteasa, una celulasa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa, una pectato liasa o cualquiera de sus combinaciones al almidon granular.

En una forma de realizacion el jarabe de sacarido incluye al menos 35% en peso de maltotetraosa sobre la base del contenido de sacaridos total. De modo alternativo, el jarabe de sacarido incluye al menos 45% en peso de maltotetraosa sobre la base del contenido de sacaridos total. En otra forma de realizacion el jarabe de sacarido incluye al menos 50% en peso de maltotetraosa sobre la base del contenido de sacaridos total. En una forma de realizacion adicional el jarabe de sacarido incluye de 45% en peso a 60% en peso de maltotetraosa sobre la base del contenido de sacaridos total.

Se preve que la variante del polipeptido definida en la presente del metodo puede esta inmovilizada.

En otro aspecto se proporciona un metodo para obtener IMO, que incluye la adicion de a) una variante del polipeptido definida en la presente, b) una alfa-amilasa, y c) una transglucosidasa para el almidon en la forma de un licuefacto de almidon o almidon granular y sacarificar el almidon para formar IMO. Se preve que el IMO se puede formar en un numero IMO de al menos 30, al menos 40 y/o al menos 45. En una forma de realizacion el almidon se obtiene de mafces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, mijo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, porotos, bananas o papas.

En otro aspecto se proporciona un metodo para obtener IMO, que incluye la adicion de a) una variante del polipeptido, b) una alfa-amilasa, y c) una transglucosidasa al almidon en la forma de un licuefacto de almidon o almidon granular y sacarificar el almidon para formar IMO. Se puede usar cualquier numero de enzimas de transgucosidasa (TG), por ejemplo, TRANSGLUCOSIDASE L-500® (Danisco US Inc., Genencor Division).

Se preve que el IMO se puede formar en un numero de IMO de al menos 30, al menos 40 y/o al menos 45. En una forma de realizacion el almidon se obtiene de mafces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, mijo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, porotos, bananas o papas.

4.3. Proceses de fermentacion

La levadura tfpicamente de Saccharomyces spp. se anade a la masa y la fermentacion continua durante 24-96 horas, tal como tfpicamente 35 a 60 horas. La temperatura es de entre aproximadamente 26-34°C, tfpicamente a aproximadamente 32°C, y el pH es de aproximadamente pH 3-6, por lo general alrededor de un pH de aproximadamente 4-5.

En una forma de realizacion, un proceso de fermentacion por lotes se utiliza en un sistema cerrado, en donde la composicion del medio se fija al comienzo de la fermentacion y no se altera durante la fermentacion. Al comienzo de la fermentacion, el medio se inocula con el organismo microbiano deseado. En este metodo, se permite que la fermentacion se produzca sin la adicion de ningun componente al sistema. Tfpicamente, una fermentacion por lotes califica como un "lote" con respecto a la adicion de la fuente de carbono, y a menudo se realizan intentos para controlar factores tales como el pH y la concentracion de oxfgeno. Las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema por lote cambian constantemente hasta el momento que se detiene la fermentacion. Dentro de los cultivos por lote, las celulas progresan a traves de una fase de latencia estatica a una fase logantmica de crecimiento alto y finalmente a una fase estacionaria, donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se trata, las celulas en la fase estacionaria finalmente mueren. En general, las celulas en fase logantmica son responsables de la masa de produccion del producto.

Una variacion adecuada en el sistema por lote estandar es el sistema de fermentacion "alimentado por lotes”. En esta variacion de un sistema por lote tfpico, el sustrato se anade en incrementos a medida que progresa la fermentacion. Los sistemas de alimentacion por lotes son utiles cuando la represion de catabolitos probablemente inhibe el metabolismo de las celulas y cuando es conveniente tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medicion de la concentracion de sustrato real en los sistemas alimentado por lotes es diffcil y por lo tanto se estima sobre la base de los cambios de factores medibles, tales como pH, oxfgeno disuelto y la presion parcial de gases residuales, tales como CO2. Las fermentaciones por lotes y alimentados por lotes son bien conocidas en la tecnica.

La fermentacion continua es un sistema abierto en el que se anade un medio de fermentacion definido continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultaneamente durante el

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procesamiento. La fermentacion continua mantiene generalmente los cultivos a una alta densidad constante, donde las celulas estan principalmente en crecimiento en fase logantmica. La fermentacion continua permite la modulacion de uno o mas factores que afectan el crecimiento celular y/o la concentracion de producto. Por ejemplo, en una forma de realizacion, un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o fuente de nitrogeno, se mantiene a una tasa fija y se permiten moderar todos los otros parametros. En otros sistemas, un numero de factores que afectan al crecimiento se puede alterar continuamente mientras que la concentracion celular, medida por la turbidez media, se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento de estado estacionario. Por lo tanto, la perdida de celulas debido al medio que se extrae se debe equilibrar con la tasa de crecimiento celular en la fermentacion. Los metodos de modulacion de nutrientes y factores de crecimiento para los procesos de fermentacion continuos, asf como tecnicas para maximizar la tasa de formacion de producto, son bien conocidos en la tecnica de la microbiologfa industrial.

Despues de la fermentacion, la mezcla se destila para extraer el etanol. El etanol obtenido de acuerdo con el proceso de la descripcion se puede usar como, por ejemplo, etanol combustible; etanol para bebida, es decir, alcohol neutro potable o etanol industrial. El sobrante de la fermentacion es el grano, que normalmente se utiliza para la alimentacion animal, ya sea en forma lfquida o seca. Los detalles adicionales sobre como llevar a cabo la licuefaccion, sacarificacion, fermentacion, destilacion, y recuperacion de etanol son bien conocidos por los expertos. De acuerdo con el procedimiento de la invencion, la sacarificacion y la fermentacion se pueden llevar a cabo simultaneamente o por separado.

5. Composiciones y metodos para la preparacion de panadena y alimentos

En un aspecto, las composiciones, que incluyen aditivos, productos alimenticios, productos de panadena, composiciones mejoradoras, productos de alimentacion, que incluyen alimentos para animales, etc. que comprenden tales variantes alteradas que se describen en el presente, tales como las que tienen actividad exoamilasa no maltogenica, asf como los metodos de obtener y usar tales polipeptidos y se proporcionan las composiciones.

Como se senalo anteriormente, las variantes de polipeptidos descriptas anteriormente pueden comprender una o mas propiedades de manipulacion mejoradas, con preferencia propiedades de horneado mejoradas. Por lo tanto, las variantes de polipeptidos descriptas anteriormente pueden proporcionar productos alimenticios asf tratados tienen una o mas de (con preferencia todas de) una firmeza inferior, una elasticidad superior, una cohesion superior, una friabilidad inferior o mayor capacidad de plegado. Tales propiedades de manipulacion u horneado mejoradas exhibidas por los polipeptidos variantes se describen con mas detalle a continuacion. En un aspecto, se proporciona una variante, en la que la vida media (ti/2), con preferencia a 60 grados C, aumenta en 15% o mas, con preferencia 50% o mas, con maxima preferencia 100% o mas, en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, se proporciona una variante, como se describe en la presente, en la que un producto tratado con la variante tiene una o mas, con preferencia todas las siguientes propiedades: (a) firmeza inferior; (b) elasticidad superior; (c) cohesion superior; (d) friabilidad inferior; y (e) mayor capacidad de plegado en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con la secuencia de aminoacidos de la SEQ Id NO: 1.

En un aspecto, se proporciona una variante, como se describe en la presente, en la que la elasticidad. cohesion o capacidad de plegado del producto alimenticio aumenta de modo independiente en 15% o mas, con preferencia 50% o mas, con maxima preferencia 100% o mas, en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, se proporciona una variante, como se describe en la presente, en la que cada una de elasticidad. cohesion y capacidad de plegado de un producto alimenticio tratado con la variante esta aumentada en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, se proporciona una variante, como se describe en la presente, en la que la firmeza o la friabilidad del producto alimenticio disminuye de modo independiente en 15% o mas, con preferencia 50% o mas, con maxima preferencia 100% o mas, con respecto a un producto alimenticio se ha tratado con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, se proporciona una variante, como se describe en la presente, en que cada una firmeza y friabilidad de un producto alimenticio tratado con el polipeptido esta disminuida en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1,

En un aspecto, se proporciona una variante, como se describe en la presente que comprende un fragmento de al menos 20 residuos de un polipeptido como se expone en las reivindicaciones, en que el polipeptido tiene actividad de exoamilasa no maltogenica.

En un aspecto, una variante, como se describe en la presente tiene actividad de exoamilasa no maltogenica. Tal actividad se puede determinar mediante los metodos descriptos en US 6.667.065.

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En un aspecto, el tratamiento de los productos alimenticios, en particular masas y productos de panadena con tales polipeptidos, y de modo que los productos alimenticios exhiben las cualidades deseadas expuestas anteriormente.

En un aspecto, se proporciona un proceso para tratar un almidon que comprende poner en contacto el almidon con una variante, como se describe en la presente y permitir que el polipeptido genere a partir del almidon uno o mas productos lineales. En un aspecto, se proporciona el uso de una variante, como se describe en la presente para preparar un producto alimenticio o alimento para animales. En un aspecto, se proporciona un proceso para preparar un producto alimenticio o alimento para animales que comprende mezclar una variante, como se describe en la presente con un ingrediente para alimentos o alimentos para animales. En un aspecto, se proporciona el uso o un proceso, en que el producto alimenticio comprende una masa o producto de masa, con preferencia un producto de masa procesado. En un aspecto, se proporciona el uso o un proceso, en que el producto alimenticio es un producto de panadena. En un aspecto, se proporciona un proceso para obtener un producto de panadena que comprende: (a) proporcionar un medio de almidon; (b) anadir al medio de almidon una variante, como se describe en la presente; y (c) aplicar calor al medio de almidon durante o despues de la etapa (b) para producir un producto de panadena. En un aspecto, se proporciona un producto alimenticio, producto alimenticio para animales, producto de masa o un producto de panadena obtenido por un proceso definido en las reivindicaciones.

En un aspecto, se proporciona el uso de una variante, como se describe en la presente, en un producto de masa 'para retardar o reducir el envejecimiento, con preferencia retrogradacion perjudicial, del producto de masa.

En un aspecto, se proporciona el uso de una variante, como se describe en la presente, en un producto de masa para mejorar alguna o mas de firmeza, elasticidad, cohesion, friabilidad o capacidad de plegado del producto de masa.

En un aspecto, una combinacion de una variante, como se describe en la presente, junto con alguna o mas de los siguientes:

(a) se proporciona alfa-amilasa maltogenica tambien llamada glucan 1,4- • -maltohidrolasa (EC 3.2.1.133) de Bacillus stearothermophilus, o una variante, homologo o mutantes de esta que tiene actividad de alfa-amilasa maltogenica;

(b) una xilanasa de panadena (EC 3.2.1.8) de por ejemplo Bacillus sp., Aspergillus sp., Thermomyces sp. o Trichoderma sp.;

(c) a-amilasa (EC 3.2.1.1) de Bacillus amiloliquefaciens o de Aspergillus sp. o una variante, homologo o mutantes de esta que tiene actividad de alfa-amilasa; y

(d) una lipasa tal como glicolipasa de Fusarium heterosporum.

Las variantes descriptas en la presente con preferencia comprende una o mas propiedades de manipulacion mejoradas en comparacion con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje, tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia sEq ID NO: 1. Las propiedades de manipulacion mejoradas en formas de realizacion preferidas pueden comprender propiedades de horneado mejoradas.

En consecuencia, la variante descripta en la presente en un aspecto es tal que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene una propiedad de manipulacion mejorada o con preferencia de horneado en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia sEq ID NO: 1. La propiedad de manipulacion u horneado se puede seleccionar del grupo que consiste en: firmeza, elasticidad, cohesion, friabilidad y capacidad de plegado.

Estas propiedades de manipulacion se pueden analizar mediante cualquier medio conocido en la tecnica. Por ejemplo, la firmeza, elasticidad y cohesion se pueden determinar mediante el analisis de las rebanadas de pan por el analisis del perfil de textura usando por ejemplo un analizador de textura, como por ejemplo, se describe en el 11

Firmeza

Las variantes descriptas en la presente estan en un aspecto de modo que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene firmeza inferior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

La firmeza en formas de realizacion preferidas esta inversamente correlacionada con la blandura del producto alimenticio; en consecuencia, una blandura superior puede reflejar una firmeza inferior, y viceversa.

La firmeza se puede medir mediante el "Protocolo de evaluacion de la firmeza" expuesto en el ejemplo 11.

En un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene a 10%, 20%, 3o%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mas firmeza inferior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje

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tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID NO: 1. Un producto alimenticio tratado con Las variantes de polipeptidos descriptas en la presente pueden tener 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o mas de firmeza inferior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

Elasticidad

En un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene a elasticidad superior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

La elasticidad se puede medir mediante el "Protocolo de evaluacion de elasticidad" expuesto en 11.

En consecuencia en un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene a 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mas de elasticidad superior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID NO: 1. Un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido puede tener un 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o mas de elasticidad superior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ iD No: 1.

Cohesion

En un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene cohesion superior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

La cohesion se puede medir mediante el "Protocolo de evaluacion de cohesion" expuesto en 11.

En consecuencia en un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante del polipeptido descripta en la presente tienen un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mas de cohesion superior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SeQ ID NO: 1. Un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido puede tener 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o mas de cohesion superior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID NO: 1.

Friabilidad

En un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene friabilidad inferior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

La friabilidad se puede medir mediante el "Protocolo de evaluacion de friabilidad" expuesto en el Ejemplo 13.

En consecuencia en un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mas de friabilidad inferior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID NO: 1. Un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido puede tener un 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o mas de friabilidad inferior en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

Capacidad de plegado

En un aspecto, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene mayor capacidad de plegado en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID NO: 1.

La capacidad de plegado con preferencia se mide mediante el "Protocolo de evaluacion de la capacidad de plegado" expuesto en el Ejemplo 14.

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En consecuencia, las variantes descriptas en la presente son tales que un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido tiene un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mas de mayor capacidad de plegado en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o l0, con preferencia SEQ ID NO: 1. Un producto alimenticio tratado con la variante de polipeptido puede tener un 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o mas de mayor capacidad de plegado en comparacion con un producto alimenticio que se ha tratado con un polipeptido original o un polipeptido tipo salvaje tal como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SEQ ID No: 1.

En un aspecto, se proporciona el uso de las variantes de polipeptidos descriptas en la presente en combinacion con una xilanasa para mejorar la capacidad de plegado.

Ademas, se proporciona un metodo para preparar un producto alimenticio, el metodo que comprende: (a) obtener una exoamilasa no maltogenica; (b) introducir una mutacion en cualquiera o varias de las posiciones de la exoamilasa no maltogenica como se establece en este documento; (c) mezclar el polipeptido resultante con un ingrediente alimenticio.

Las variantes de polipeptidos se pueden usar para mejorar el volumen de productos de panadena tales como pan. Sin desear estar ligado por teona particular alguna, se considera que esto proviene de la reduccion de la viscosidad de la masa durante el calentamiento (tal como el horneado) como resultado de la amilasa que acorta las moleculas de amilosa. Esto permite que el dioxido de carbono generado por la fermentacion para aumentar el tamano del pan con menos impedimentos.

En consecuencia, los productos alimenticios que comprenden o tratar con las variantes de polipeptidos se expanden en volumen cuando se compara con productos que no se han tratado de este modo, o tratado con los polipeptidos originales tales como un polipeptido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 o 10, con preferencia SeQ iD NO: 1. En otras palabras, los productos alimenticios tienen un volumen mas grande aire por volumen del producto alimenticio. Alternativamente, o ademas, los productos alimenticios tratados con variantes de polipeptidos como se describe en la presente tienen una densidad mas baja, o el peso (o masa) por relacion de volumen. En formas de realizacion particularmente preferidas, las variantes de polipeptidos se utilizan para mejorar el volumen de pan. La mejora o expansion de volumen es beneficiosa porque reduce la gomosidad o el contenido de almidon de los alimentos. Los alimentos livianos son los preferidos por los consumidores, y la experiencia del cliente esta aumentada. En formas de realizacion preferidas, el uso de las variantes de polipeptidos aumenta el volumen en un 10%, 20%, 30% 40%, 50% o mas.

Las variantes de polipeptidos y acidos nucleicos descriptos en la presente se pueden usar como -o en la preparacion de- un alimento. En particular, se pueden anadir a un alimento, es decir, como un aditivo alimentario. Se considera que el termino "alimento" incluye tanto el alimento preparado, asf como un ingrediente para un alimento, tal como una harina. En un aspecto preferido, el alimento es para el consumo humano. El alimento puede estar en la forma de una solucion o como un solido - de acuerdo con el uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Las variantes de polipeptidos y acidos nucleicos se pueden usar como un ingrediente alimentario. Como se usa en la presente, el termino "ingrediente alimentario" incluye una formulacion, que es o se puede anadir a los alimentos funcionales o comestibles e incluye formulaciones que se pueden usar a niveles bajos en una amplia variedad de productos que requieren, por ejemplo, acidificacion o emulsion. El ingrediente alimentario puede estar en forma de una solucion o como un solido - de acuerdo con el uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Las variantes de polipeptidos y acidos nucleicos descriptos en la presente pueden ser - o se puede anadir a - complementos alimentarios. Las variantes de polipeptidos y acidos nucleicos descriptos en la presente pueden ser - o se puede anadir a - alimentos funcionales. Como se usa en la presente, el termino "alimento funcional" significa un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o una satisfaccion de sabor, sino que tambien es capaz de suministrar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Aunque no existe una definicion legal de un alimento funcional, la mayona de las partes interesadas en esta area estan de acuerdo en que son alimentos comercializados que tienen efectos sobre la salud espedficos.

Las variantes de polipeptidos tambien se pueden usar en la fabricacion de un producto alimenticio o un comestible. Los comestibles tfpicos incluyen productos lacteos, productos carnicos, productos avfcolas, productos de pescado y productos de masa. El producto de masa puede ser cualquier producto de masa procesada, que incluyen masas fritas, frita con aceite, asado, horneado, al vapor y hervida, tales como pan al vapor y tortas de arroz. En formas de realizacion muy preferidas, el producto alimenticio es un producto de panadena.

Con preferencia, el comestible es un producto de panadena. Los productos de panadena tfpicos (al horno) incluyen pan - tales como panes, panecillos, bollos, rosquillas, bases de pizza, etc. pastelena, pretzels, tortillas, tortas, galletitas dulces, bizcochos, galletitas saladas, etc.

Los productos alimenticios con preferencia se benefician de una o mas de las propiedades de manipulacion u horneado de las variantes de polipeptidos descriptas en la presente. La propiedad de manipulacion u horneado

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mejorada se puede seleccionar del grupo que consiste en: firmeza mejorada, elasticidad mejorada, cohesion mejorada, friabilidad mejorada y capacidad de plegado mejorada.

Ademas, en un aspecto, se proporciona un metodo para modificar un aditivo alimentario que comprende una exoamilasa no maltogenica, el metodo que comprende introducir una mutacion en una o mas de las posiciones de la exoamilasa no maltogenica expuesto en este documento. El mismo metodo se puede usar para modificar un ingrediente alimenticio, o un suplemento alimenticio, un producto alimenticio, o un comestible.

En un aspecto, se proporciona el uso de variantes de polipeptidos que son capaces de retardar el revenimiento de los medios de almidon, tales como geles de almidon. Las variantes de polipeptidos son especialmente capaces de retardar la retrogradacion perjudicial del almidon.

La mayona de los granulos de almidon se componen de una mezcla de dos polfmeros: un contenido de amilosa esencialmente lineal y una amilopectina altamente ramificada. La amilopectina es una molecula muy grande, ramificada que consiste en cadenas de unidades de a-D-glucopiranosilo unidas por enlaces (1-4), en el que dichas cadenas estan unidas por enlaces a-D-(1-6) para formar ramas. La amilopectina esta presente en todos los almidones naturales, constituyendo aproximadamente el 75% de la mayona de los almidones comunes. La amilosa es esencialmente una cadena lineal de unidades de a-D-glucopiranosilo (1-4) ligadas que tienen pocas ramas a-D- (1-6). La mayona de los almidones contienen aproximadamente 25% de amilosa.

Los granulos de almidon calentados en presencia de agua experimentan una transicion de fase orden-desorden denominada gelatinizacion, donde el lfquido es absorbido por los granulos de hinchamiento. Las temperaturas de gelatinizacion vanan para diferentes almidones. Despues del enfriamiento del pan recien horneado la fraccion de amilosa, dentro de horas, retrograda para desarrollar una red. Este proceso es beneficioso ya que crea una estructura de miga deseable con un bajo grado de firmeza y mejores propiedades de corte en rodajas. La cristalizacion mas gradual de la amilopectina tiene lugar dentro de los granulos de almidon gelatinizados durante los dfas despues del horneado. En este proceso se considera que la amilopectina refuerza la red de amilosa en la que estan incrustados los granulos de almidon. Este refuerzo lleva a un aumento de la firmeza de la miga de pan. Este refuerzo es una de las principales causas de envejecimiento del pan.

Se sabe que la calidad de los productos horneados se deteriora gradualmente durante el almacenamiento. Como consecuencia de la recristalizacion del almidon (tambien llamada retrogradacion), la capacidad de retencion de agua de la miga se cambia con implicaciones importantes sobre las propiedades organolepticas y dietarias. La miga pierde suavidad y elasticidad y se vuelve firme y quebradiza. El aumento de la firmeza de la miga se utiliza a menudo como una medida del proceso de envejecimiento del pan.

La tasa de retrogradacion perjudicial de la amilopectina depende de la longitud de las cadenas laterales de amilopectina. En consecuencia, la hidrolisis enzimatica de las cadenas laterales de amilopectina, por ejemplo, mediante las variantes de polipeptidos descriptas en la presente que tiene actividad de exoamilasa no maltogenica, puede reducir marcadamente sus tendencias de cristalizacion.

En consecuencia, en un aspecto, el uso de variantes de polipeptido descriptos en la presente cuando se anade al almidon en cualquier fase de su transformacion en un producto alimenticio, por ejemplo, antes, durante o despues del horneado en pan puede retardar o impedir o lentificar laa retrogradacion. Tal uso se describe con mas detalle a continuacion.

En un aspecto, se proporciona un metodo para mejorar la capacidad de una exoamilasa no maltogenica para prevenir el envejecimiento, con preferencia la retrogradacion perjudicial, de un producto de masa, el metodo que comprende la introduccion de una mutacion en cualquiera o varias de las posiciones de la exoamilasa no maltogenica expuestas en este documento.

Para la evaluacion del efecto inhibidor del antienvejecimiento de las variantes de polipeptidos, tal variante que tiene actividad de exoamilasa no maltogenica descripta en la presente, se puede medir la firmeza de la miga 1, 3 y 7 dfas despues del horneado por medio de un Analizador de textura de alimentos universal Instron 4301 o equipo similar conocido en la tecnica.

Otro metodo utilizado tradicionalmente en la tecnica y que se usa para evaluar el efecto sobre la retrogradacion del almidon de una variante de polipeptido tal como una variante que tiene actividad de exoamilasa se basa en DSC (calorimetna diferencial de barrido). En la presente, se mide la entalpfa de fusion de la amilopectina retrogradada en miga de pan o miga de una masa del sistema modelo de masa horneada con o sin enzimas (control). El equipo de DSC aplicada puede ser una corrida de DSC 820 Mettler-Toledo con un gradiente de temperatura de 10°C por minuto, de 20 a 95°C. Para la preparacion de las muestras se pesan 10 a 20 mg de miga y se transfieren a placas de aluminio Mettler-Toledo que se sellan hermeticamente.

Las masas del sistema modelo pueden contener harina de trigo estandar y cantidades optimas de agua o tampon con o sin la variante de polipeptido. Se mezclan en un farinografo Brabender 10 o 50 g durante 6 o 7 min., respectivamente. Las muestras de las masas se colocan en tubos de ensayo de vidrio (15 * 0,8 cm) con una tapa. Estos tubos de ensayo se someten a un proceso de horneado en un bano de agua empezando con 30 min. de

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incubacion a 33°C seguido de calentamiento 33 a 95°C con un gradiente de 1,1 °C por minuto. y, finalmente, a 5 min. incubacion a 95°C. Posteriormente, los tubos se almacenan en un termostato a 20°C antes del analisis DSC.

En una forma de realizacion, las variantes descriptas en la presente tienen una entalpfa de fusion reducida, en comparacion con el control. En una forma de realizacion adicional, las variantes tienen un 10% o mas de entalpfa de fusion reducida. En aun otro aspecto, tienen un 20% o mas, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas de entalpfa de fusion reducida cuando se compara con el control.

En un aspecto, se proporciona el uso de variantes de polipeptidos en la preparacion de los productos alimenticios, en particular, productos de almidon. El metodo comprende formar el producto de almidon mediante la adicion de una enzima exoamilasa no maltogenica tal como una variante de polipeptido a un medio de almidon. Si el medio de almidon es una masa, a continuacion, la masa se prepara mezclando harina, agua, la exoamilasa no maltogenica que es una variante de polipeptido descripta en la presente y opcionalmente otros posibles ingredientes y aditivos.

El termino "almidon" se debe entender en el sentido de almidon per se o un componente de este, especialmente amilopectina. El termino "medio de almidon" significa cualquier medio adecuado que comprende almidon. El termino "producto de almidon" significa cualquier producto que contiene o se basa en o se deriva de almidon. Con preferencia, el producto de almidon contiene o se basa en o se deriva de almidon obtenido a partir de harina de trigo. El termino "harina", como se usa en la presente es un sinonimo de harina finamente molida de trigo o de otro grano. Con preferencia,, sin embargo, el termino significa harina obtenida a partir de trigo per se y no a partir de otro grano. De este modo, y a menos que se exprese lo contrario, las referencias a "harina de trigo" como se usa en la presente con preferencia significa referencias a harina de trigo per se, asf como a la harina de trigo cuando esta presente en un medio, tal como una masa.

Una harina preferida es harina de trigo o harina de centeno o mezclas de harina de trigo y centeno. Sin embargo, tambien se contempla masa que comprende harina derivada de otros tipos de cereales tales como por ejemplo de arroz, mafz, cebada y durra. Con preferencia, el producto de almidon es un producto de panadena. Con mas preferencia, el producto de almidon es un producto de pan. Incluso con mas preferencia, el producto de almidon es un producto de panificacion farinaceo horneado. El termino "producto de panificacion farinaceo horneado" se refiere a cualquier producto horneado basado en una masa obtenible mediante la mezcla de harina, agua, y un agente de fermentacion en condiciones de formacion de masa. Obviamente se puede anadir otros componentes a la mezcla de masa.

En consecuencia, si el producto de almidon es un producto de panificacion farinaceo horneado, el proceso entonces comprende mezclar - en cualquier orden adecuado - harina, agua, y un agente leudante en condiciones de formacion de masa y ademas la adicion de una variante de polipeptido descripta en la presente, opcionalmente en la forma de una premezcla. El agente leudante puede ser un agente leudante qmmico tal como bicarbonato de sodio o cualquier cepa de Saccharomyces cerevisiae (levadura de Baker).

La variante de polipeptido descripta en la presente se puede anadir junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo la mezcla de ingredientes agua o masa o con cualquier aditivo o mezcla de aditivos. La masa se puede preparar por cualquier metodo de preparacion de masa convencional comun en la industria de panadena o en cualquier otra industria de elaboracion de productos de a base de masa de harina.

El horneado de productos de panificacion farinaceos tal como por ejemplo pan blanco, pan hecho de harina centeno y harina de trigo tamizados, panecillos y similares normalmente se logra mediante el horneado de la masa de pan en las temperaturas del horno en el rango de 180 a 250°C durante aproximadamente 15 a 60 minutos. Durante el proceso de horneado un fuerte gradiente de temperatura (200-120 • C) es prevalerte en las capas de masa exteriores donde se desarrolla la corteza caractenstica del producto horneado. Sin embargo, a causa del consumo de calor debido a la generacion de vapor, la temperatura en la miga es solamente cerca de 100°C al final del proceso de horneado.

Tambien se proporciona un proceso para obtener un producto de pan que comprende: (a) proporcionar un medio de almidon; (b) anadir la medio de almidon una variante de polipeptido descripto en este documento; y (c) aplicar calor al medio de almidon durante o despues de la etapa (b) para producir un producto de pan. Se proporciona un proceso para obtener un producto de pan que comprende anadir a un medio de almidon una variante de polipeptido descripta.

En un aspecto, la variante de polipeptido se puede anadir como una preparacion lfquida o como una composicion pulverulenta seca que comprende el enzima como el unico componente activo o en mezcla con uno o mas ingredientes de la masa o aditivo de la masa.

En un aspecto adicional, se proporcionan las composiciones mejoradoras, que incluyen composiciones de mejora del pan y composiciones de mejora de la masa. Estos comprenden una variante de polipeptido, opcionalmente junto con un ingrediente adicional, o una enzima adicional, o ambos.

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En un aspecto, se proporciona una composicion mejoradora para una masa, en la que la composicion mejoradora comprende una variante expuesta en cualquiera de las reivindicaciones, y al menos un ingrediente de la masa o aditivo de masa adicional.

En un aspecto, se proporciona una composicion que comprende una harina y una variante expuesta en cualquiera de las reivindicaciones.

En un aspecto adicional, se proporciona el uso de composiciones mejoradora de pan y masa en el horneado. En un aspecto adicional, se proporciona un producto o masa horneado u obtenido de la composicion mejoradora del pan o composicion mejoradora de la masa. En otro aspecto, se proporciona un producto o masa horneado u obtenido mediante el uso de una composicion mejoradora del pan o composicion mejoradora de la masa.

Una masa se puede preparar mediante la mezcla de harina, agua, composicion mejoradora de la masa que comprende una variante de polipeptido (como se describio anteriormente) y opcionalmente otros ingredientes y aditivos.

La composicion mejoradora de la masa se puede anadir junto con cualquier ingrediente de la masa que incluye harina, agua u otros ingredientes o aditivos opcionales. La composicion mejoradora de la masa se puede anadir antes de la harina o el agua u otros ingredientes y aditivos opcionales. La composicion mejoradora de la masa se puede anadir despues de la harina o el agua, o de otros ingredientes y aditivos opcionales. La masa se puede preparar por cualquier metodo de preparacion de masa convencional comun en la industria de panadena o en cualquier otra industria de elaboracion de productos de a base de masa de harina

La composicion mejoradora de la masa se puede anadir como una preparacion lfquida o en forma de una composicion de polvo seco que comprende la composicion como el unico componente activo o en mezcla con uno o mas de otros ingredientes o aditivos de la masa.

La cantidad de la variante de polipeptido que se anade normalmente esta en una cantidad que se produce la presencia en la masa terminada de 50 a 100.000 unidades por kg de harina, con preferencia 100 a 50,000 unidades por kg de harina. Con preferencia, la cantidad esta en el rango de 200 a 20.000 unidades por kg de harina. Alternativamente, la variante de polipeptido se anade en una cantidad que se produce la presencia en la masa terminada de 0,02 - 50 ppm de enzima basada en la harina (0,02 - 50 mg enzima por kg de harina), con preferencia 0.2 -10 ppm.

En el presente contexto, 1 unidad de la exoamilasa no maltogenica se define como la cantidad de enzima que libera productos de hidrolisis equivalentes a 1 pm ol de azucar reductor por min cuando se incuba a 50 grados C en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg de almidon de mafz ceroso ml/en MES 50 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 como se describe de aqrn en adelante.

La masa tal como se describe en la presente generalmente comprende semola de trigo o harina de trigo y/o otros tipos de semola, harina o almidon tal como harina de mafz, almidon de mafz, harina de mafz, harina de arroz, harina de centeno, semola de centeno, harina de avena, semola de avena, harina de soja, semola de sorgo, harina de sorgo, semola de papa, harina de patata o almidon de papa. La masa puede ser fresca, congelada, o parcialmente horneada.

La masa puede ser una masa leudada o una masa que se debe someter al leudado. La masa se puede leudar de varias maneras, tales como mediante la adicion de agentes de leudado qmmicos, por ejemplo, bicarbonato sodico o mediante la adicion de un leudante (masa de fermentacion), pero se prefiere leudar la masa anadiendo un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo, una cepa comercialmente disponible de S. cerevisiae.

La masa puede comprender grasas, tales como grasa o manteca granulada. La masa puede comprender ademas un emulsionante adicional tal como mono- o digliceridos, esteres de azucar de acidos grasos, poliglicerol esteres de acidos grasos, esteres de acido lactico de monogliceridos, esteres de acido acetico de monogliceridos, estearatos de polioxietileno, o lisolecitina.

Tambien se proporciona una premezcla que comprende harina junto con la combinacion descripta en la presente. La premezcla puede contener aditivos mejoradores de la masa y/o aditivos mejoradores de pan, por ejemplo, cualquiera de los aditivos, que incluyen enzimas, mencionados en la presente.

Con el fin de mejorar aun mas las propiedades del producto horneado e impartir calidades distintivas al producto horneados se pueden incorporar ingredientes de la masa y/o aditivos de masa adicionales en la masa. Tfpicamente, tales componentes anadidos adicionalmente pueden incluir ingredientes de la masa tales como sal, granos, grasas y aceites, azucar o edulcorante, fibras dieteticas, fuentes de protemas tales como leche en polvo, soja gluten o huevos y aditivos de masa tales como emulsionantes, otras enzimas, hidrocoloides, agentes saborizantes, agentes oxidantes, minerales y vitaminas.

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Los emulsionantes son utiles como reforzadores de la masa y suavizadores de la miga. Como reforzadores de la masa, los emulsionantes pueden proporcionar tolerancia con respecto al tiempo de reposo y tolerancia al choque durante la fermentacion. Ademas, los reforzadores de la masa mejoraran la tolerancia de una masa dada a variaciones en el tiempo de fermentacion. La mayona de los reforzadores de la masa tambien mejoran el esponjado lo que significa el aumento del volumen de los productos fermentados a horneados. Por ultimo, los reforzadores de la masa emulsionaran todas las grasas presentes en la mezcla de la receta.

Los emulsionantes adecuados incluyen lecitina, estearato de polioxietileno, mono- y digliceridos de acidos grasos comestibles, esteres de acido acetico de monogliceridos y digliceridos de acidos grasos comestibles, esteres de acido lactico de mono- y digliceridos de acidos grasos comestibles, esteres de acido cftrico de mono- y digliceridos de acidos grasos comestibles, esteres de acido diacetil tartarico de monogliceridos y digliceridos de acidos grasos comestibles, esteres de sacarosa de acidos grasos comestibles, estearoil-2-lactilato de sodio, y estearoil-2-lactilato de calcio.

El aditivo o ingrediente de la masa adicional se pueden anadir junto con cualquier ingrediente de la masa que incluyen harina, agua u otros ingredientes o aditivos opcionales, o la composicion mejoradora de la masa. El aditivo o ingrediente de masa adicional se pueden anadir antes de la harina, agua, otros ingredientes y aditivos opcionales o la composicion mejoradora de la masa. El aditivo o ingrediente de masa adicional se pueden anadir despues de la harina, agua, otros ingredientes y aditivos opcionales o la composicion mejoradora de la masa.

El aditivo o ingrediente de masa adicional puede ser convenientemente una preparacion lfquida. Sin embargo, el aditivo o ingrediente de masa adicional puede ser convenientemente en la forma de una composicion seca.

En un aspecto ele aditivo o ingrediente de masa adicional es al menos 1% del peso del componente de harina de la masa. En un aspecto adicional, el aditivo o ingrediente de masa adicional es al menos 2%, con preferencia al menos 3%, con preferencia al menos 4%, con preferencia al menos 5%, con preferencia al menos 6%. Si el aditivo es una grasa, luego normalmente la grasa puede estar presente en una cantidad de 1 a 5%, normalmente 1 a 3%, mas normalmente aproximadamente 2%.

Para el uso comercial y el uso domestico de harina para hornear y producir alimentos, es importante mantener un nivel adecuado de actividad de •-amilasa en la harina. Un nivel de actividad que es demasiado alto puede producir un producto que es pegajoso y/o pastoso y por lo tanto no comercializable. La harina con insuficiente actividad de • - amilasa puede no contener suficiente azucar para la funcion apropiada de levadura, lo que produce pan o productos horneados friables, secos. Por consiguiente, una variante, como se describe en la presente, por sf misma o en combinacion con otra • -amilasa u otra variante, se puede anadir a la harina para aumentar el nivel de actividad de • - amilasa endogena en la harina. La variante de esta forma de realizacion puede tener una temperatura optima en presencia de almidon, por ejemplo en los rangos de aproximadamente 30-90 °C, 40-80 °C, 40-50 °C, 45-65 °C, o 5060 °C. El pH optimo en una solucion de 1% de almidon soluble puede ser por ejemplo entre pH 4,5 a 6,0.

Los cereales, como la cebada, avena, trigo, asf como componentes de la planta, tales como mafz, lupulo, y arroz, tambien se utilizan para elaboracion de la cerveza, tanto en la elaboracion de cerveza industrial como casera. Los componentes utilizados en la industria cervecera pueden ser sin maltear o pueden ser malteada, es decir, parcialmente germinado, lo que produce un aumento en los niveles de enzimas, que incluyen • -amilasa. Para elaboracion de la cerveza exitosa, son necesarios niveles adecuados de actividad de enzima • -amilasa para asegurar los niveles apropiados de azucares para la fermentacion. Una variante, por sf mismo o en combinacion con otra • -amilasa, en consecuencia se puede anadir a los componentes usados para elaborar cerveza.

Como se usa en la presente, el termino "harina" significa grano de cereal molido o triturado. El termino "harina" tambien puede significar productos de sagu o tuberculos que han sido molidas o triturados. En algunas formas de realizacion, la harina tambien puede contener componentes ademas de la materia de cereales o planta molido o triturado. Un ejemplo de un componente adicional, aunque no pretende ser limitante, es un agente leudante. Los granos de cereales incluyen trigo, avena, centeno y cebada. Los productos de tuberculos incluyen harina de tapioca, harina de yuca, y el polvo de flan. El termino "harina" tambien incluye harina de mafz molida, semola de mafz, harina de arroz, harina de trigo integral, harina leudante, harina de tapioca, harina de yuca, arroz molido, harina enriquecido, y el polvo de flan.

Como se usa en la presente, el termino "suministros", significa granos y componentes de la planta que se trituran o rompen. Por ejemplo, la cebada usada en la produccion de cerveza es un grano que se ha molido o triturado grueso para obtener una consistencia apropiada para producir una pasta para la fermentacion. Como usa en la presente, el termino "suministros" incluye cualquiera de los tipos mencionados anteriormente de plantas y granos en formas trituradas o molidas en trozos grandes. Los metodos descriptos en la presente se pueden usar para determinar los niveles de actividad de amilasa en ambas harinas y suministros.

Una o mas enzimas adicionales se pueden usar en combinacion con las variantes de polipeptidos descriptos en la presente. Tales combinaciones por ejemplo se pueden anadir a la comida, preparacion de la masa, producto alimenticio o composicion de almidon.

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Las amilasas de horneado pueden provenir de un hongo, bacteria o planta. Puede ser una alfa-amilasa (EC 3.2.1.1). La lafa-amilasa puede ser una alfa-amilasa fungica de Aspergillus o Trichoderma, por ejemplo de Aspergillus oryzae. O puede ser una alfa-amilasa de Bacillus, por ejemplo B. amiloliquefaciens o B. licheniformis. O puede ser una beta- amilasa de planta (EC 3.2.1.2), por ejemplo beta-amilasa de malta de cebada o poroto de soja o puede ser una exo- amilasa usada para el antienvejecimiento, por ejemplo exo-amilasa no maltogenica (EC 3.2.1.60) desarrollada de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila (SEQ ID NO: 10) o amilasa maltogenica (EC 3.2.1.133) desarrollada de Bacillus stearothermophilus que se describe adicionalmente a continuacion.

En un aspecto, la amilasa adicional es una alfa-amilasa maltogenica. Una "alfa-amilasa maltogenica" (glucan 1,4- alfa-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina a maltosa en la configuracion alfa. Una alfa-amilasa maltogenica de Bacillus (EP 120 693) esta disponible comercialmente bajo el nombre comercial Novamyl (Novozymes, Dinamarca) y se utiliza ampliamente en la industria de panadena como un agente antienvejecimiento debido a su capacidad para reducir la retrogradacion del almidon. Novamyl se describe en detalle en la Publicacion de Patente Internacional WO 91/04669. La alfa-amilasa maltogenica acciones Novamyl comparte varias caractensticas con ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasas), que incluyen homologfa de secuencia (Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) y la formacion de productos de transglicosilacion (Christophersen, C., et al., 1997, starch, vol. 50, No. 1, 39-45). El Novamyl puede comprender en particular Novamyl 1500 MG. Otros documentos que describen Novamyl y sus usos incluyen Christophersen, C., Pedersen, S., y Christensen, T., (1993) Method for production of maltose an a limit dextrin, the limit dextrin, and use of the limit dextrin. Dinamarca, yo WO 95/10627. Se describe adicionalmente en la patente U.S. N.° 4.598.048 y la patente U.S. N.° 4.604.355. Los ejemplos preferidos de amilasas antienvejecimiento son exo-amilasas, por ejemplo, exo-amilasa no maltogenica o G4-amilasa (EC 3.2.1.60) desarrollada a partir de maltotetraohidrolasa de Pseudomonas saccharophila que tiene la SEQ ID NO: 1 o de amilasa maltogenica (EC 3.2.1.133) desarrollada a partir de Bacillus stearothermophilus que tiene la SEQ ID NO: 51.

Una amilasa antienvejecimiento reduce el envejecimiento despues del horneado y lleva a una reduccion en el aumento de la firmeza y una reduccion de la disminucion de la elasticidad desde el 1 al dfa 7 despues del horneado con relacion a un control sin enzima. Una amilasa antienvejecimiento se puede analizar mediante la realizacion de una prueba de horneado y usando analisis de textura para determinar el desarrollo de la firmeza y elasticidad con el tiempo. El analisis de textura se describe en el ejemplo 11.

Las enzimas adicionales se pueden seleccionar de, por ejemplo, cualquier combinacion de los siguientes: (a) Novamyl, o una variante, homologo, o mutantes de esta que tienen actividad de alfa-amilasa maltogenica; (c) una xilanasa como GRINDAMYL ™ POWERBake 900 (Danisco A/S); (c) una a-amilasa bacteriana tal como Max-Life U4 (Danisco A/S); y (d) una lipasa tal como GRINDAMIL™ POWERBake 4050 (Danisco A/S).

En una forma de realizacion una variante de polipeptido descripta en la presente se usa en combinacion con al menos una enzima seleccionada de la lista que consiste en oxidorreductasas, hidrolasas, lipasas, esterasas, glicosidasas, amilasas, pululanasas, xilanasas, celulasas, hemicelulasas, enzimas degradantes de almidon, proteasas y lipoxigenasas. En una forma de realizacion, la composicion comprende al menos una variante de polipeptido descripta en la presente y una amilasa maltogenica de Bacillus, descripta en WO91/04669. Una forma de realizacion comprende una variante de polipeptido descripta en la presente y harina.

Otras enzimas que se pueden anadir a la masa incluyen oxidorreductasas, hidrolasas, tales como lipasas y esterasas, asf como glicosidasas como a-amilasa, pululanasa y xilanasa. Las oxidorreductasas, tales como por ejemplo glucosa oxidasa y hexosa oxidasa, se pueden utilizar para el fortalecimiento de la masa y el control de volumen de los productos horneados y xilanasas y otras hemicelulasas masa se puede anadir para mejorar las propiedades de manipulacion de la masa, firmeza de la miga y el volumen del pan. Las lipasas son utiles como reforzadores de la masa y suavizadores de la miga y a-amilasas y otras enzimas amiloltticas se pueden incorporar en la masa para controlar el volumen del pan y reducir aun mas firmeza de la miga.

Otras enzimas que se pueden usar se pueden seleccionar del grupo que consiste en una celulasa, una hemicelulasa, una enzima de degradacion del almidon, una proteasa, una lipoxigenasa.

Una variante, como se define en la presente, tambien se puede anadir sola o en combinacion con otras amilasas, que incluyen otras variantes de amilasa para prevenir o retardar el envejecimiento, es decir, firmeza de la miga de los productos horneados. La cantidad de amilasa antienvejecimiento normalmente estara en el rango de 0,01-10 mg de protema enzimatica por kg de harina, por ejemplo, 0,5 mg/kg ds. Las amilasas antienvejecimiento adicionales se pueden usar en combinacion con una variante de polipeptido descripta en la presente incluyen una endo-amilasa, por ejemplo, una endo-amilasa bacteriana de Bacillus. La amilasa adicional puede ser una • -amilasa maltogenica (EC 3.2.1.133), por ejemplo, de Bacillus. Novamil® es un ejemplo de • -amilasa maltogenica de B. stearothermophilus cepa NCIB 11837 y se describe en Christophersen et al., Starch 50: 39-45 (1997). Otros ejemplos de endo-amilasas antienvejecimiento incluyen • -amilasas bacterianas derivadas de Bacillus, tal como B. licheniformis o B. amiloliquefaciens. La amilasa antienvejecimiento puede ser una exo-amilasa, tal como • -amilasa, por ejemplo, de fuentes vegetales, tal como soja o de fuentes microbianas, tal como Bacillus.

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La composicion de horneado que comprende una variante de polipeptido descripta en la presente puede comprender ademas una fosfolipasa. La fosfolipasa puede tener actividad A1 o A2 para eliminar el acido graso de los fosfoKpidos, lo que forma un lisofosfolfpido. Puede tener o no actividad de lipasa, es decir, la actividad en sustratos de trigliceridos. La fosfolipasa tipicamente tiene una temperatura optima en el rango de 30-90°C, por ejemplo, 30- 70°C. Las fosfolipasas anadidas pueden ser de origen animal, por ejemplo, de pancreas, por ejemplo, pancreas bovino o porcino, veneno de serpiente o veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, tales como el genero o especie. Los ejemplos de fuentes de fosfolipasas incluyen Aspergillus, A. niger; Dictyostelium, D. discoideum; Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor, R. pusillus; Rhizopus, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, S. libertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum; Bacillus, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, C. freundii; Enterobacter, E. aerogenes, E. cloacae; Edwardsiella, E. tarda; Etwinia, E. herbicola; Escherichia, E. coli; Klebsiella, K. pneumoniae; Proteus, P. vulgaris; Providencia, P. stuartii; Salmonella, S. typhimurium; Serratia, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, S. flexneri; Streptomyces, S. violeceoruber; Yersinia, Y. enterocolitica; Fusarium, y F. oxysporum (por ejemplo, cepa DSM 2672).

La fosfolipasa se anade en una cantidad que mejora la suavidad del pan durante el penodo inicial despues del horneado, en particular de las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa estara tfpicamente en el rango de aproximadamente 0,01 a 10 mg de protema enzimatica por kg de harina, por ejemplo, 0,1 a 5 mg/kg. La actividad de la fosfolipasa generalmente estara en el rango de aproximadamente 20 a 1000 Unidad de Lipasa (LU)/kg de harina, donde una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de acido butmco por minuto a 30°C, pH 7,0, con goma arabiga como emulsionante y tributirina como sustrato.

Las composiciones de masa generalmente comprenden semola de trigo o harina de trigo y/o otros tipos de semola, harina o almidon tal como harina de mafz, almidon de mafz, harina de mafz, harina de arroz, harina de centeno, semola de centeno, harina de avena, semola de avena, harina de soja, semola de sorgo, harina de sorgo, semola de papa, harina de patata o almidon de papa. La masa puede ser fresca, congelada, o parcialmente horneada. La masa puede ser una masa leudada o una masa que se debe someter al leudado. La masa se puede leudar de varias maneras, tales como mediante la adicion de agentes de leudado qrnmicos, por ejemplo, bicarbonato sodico o mediante la adicion de un leudante, es decir, masa de fermentacion. La masa tambien se puede leudar mediante la adicion de un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo, una cepa comercialmente disponible de S. cerevisiae.

La masa tambien puede comprender otros ingredientes convencionales de la masa, por ejemplo, protemas, tal como leche en polvo, gluten y soja; huevos (por ejemplo, huevos enteros, yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante, tal como acido ascorbico, bromato de potasio, yodato de potasio, azodicarbonamida (ADA) o persulfato de amonio; un aminoacido tal como L-cistema; un azucar; o una sal, tal como cloruro de sodio, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de calcio. La masa grasa puede comprender ademas, por ejemplo, trigliceridos, tales como grasa o manteca granulada. La masa puede comprender ademas un emulsionante tal como mono- o digliceridos, esteres de acido diacetil tartarico de mono o digliceridos, esteres de azucar de acidos grasos, poliglicerol esteres de acidos grasos, esteres de acido lactico de monogliceridos, esteres de acido acetico de monogliceridos, estearatos de polioxietileno o lisolecitina. En particular, la masa se puede hacer sin adicion de emulsionantes.

Opcionalmente, se puede usar una enzima adicional junto con la amilasa de antienvejecimiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, tal como una amiloglucosidasa, una •-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa, o de la enzima adicional puede ser una peptidasa, en particular una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una celulasa, una hemicelulasa, en particular una pentosanasa, tal como xilanasa, una proteasa, una protema disulfuro isomerasa, por ejemplo, una protema disulfuro isomerasa, como se describe en WO 95/00636, por ejemplo, una glicosiltransferasa, una enzima de ramificacion (enzima de ramificacion 1,4-^ -glucano), una 4-^-glucanotransferasa (dextrina glicosiltransferasa) o una oxidorreductasa, por ejemplo, una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipoxigenasa, una L-aminoacido oxidasa o una carbohidrato oxidasa. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, incluyendo marnfferos y plantas, y en particular de origen microbiano (bacteriano, levadura o fungico) y se puede obtener mediante tecnicas usadas convencionalmente en la materia.

La xilanasa es normalmente de origen microbiano, por ejemplo, derivado de una bacteria u hongo, tal como una cepa de Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger (cf. WO 91/19782), A. awamori (por ejemplo, WO 91/18977), o A. tubigensis (por ejemplo, WO 92/01793); de una cepa de Trichoderma, por ejemplo, T. reesei, o de una cepa de Humicola, por ejemplo, H. insolens (por ejemplo, WO 92/17573). Pentopan® y Novozym 384® son preparaciones de xilanasa disponibles en el comercio producidas de Trichoderma reesei. La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa de A. niger (tal como AMG®). Otros productos de amilasa utiles incluyen Grindamil® A 1000 o A 5000 (disponible en Danisco, Dinamarca) y Amylase® H o Amylase P (disponible en Gist-Brocades, Holanda). La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa fungica, en particular una glucosa oxidasa de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®). Un ejemplo de proteasa es Neutrase®. Un ejemplo de lipasa se puede derivar de las cepas de Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus, o Pseudomonas, en particular de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa), Rhizomucor miehei, Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus delemar o Rhizopus arrhizus, o Pseudomonas cepacia. En forma de realizaciones espedficas, la lipasa puede ser Lipasa A o Lipasa B derivada de Candida Antarctica como se describe en el documento WO

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88/02775, por ejemplo, o la lipasa se puede derivar de Rhizomucor miehei como se describe en el documento EP 238,023, por ejemplo, o Humicola lanuginosa, descrita en el documento EP 305.216, por ejemplo, o Pseudomonas cepacia como se describe en los documentos EP 214,761 y WO 89/01032, por ejemplo.

El proceso se puede usar para cualquier tipo de producto horneado preparado a partir de masa, ya sea de un caracter suave o crujiente, ya sea de tipo blanco, claro u oscuro. Los ejemplos son pan, en particular pan blanco, integral o centeno, por lo general en forma de panes o rollos, tales como, pero sin limitacion, pan tipo baguette francesa, pan de pita, tortillas, tortas, panqueques, bizcochos, galletitas, masa quebrada, pan crujiente, pan al vapor, pizza y similares.

En otra forma de realizacion, una variante de polipeptido descripta en la presente se puede usar en una premezcla, que comprende harina junto con una amilasa antienvejecimiento, una fosfolipasa y un fosfolfpido. La premezcla puede contener otros aditivos mejoradores de masa y/o mejoradores del pan, por ejemplo, cualquiera de los aditivos, que incluyen las enzimas, mencionadas anteriormente. En un aspecto, la variante de polipeptido descripta en la presente es un componente de una preparacion enzimatica que comprende una amilasa antienvejecimiento y una fosfolipasa, para usar como aditivo de horneado.

La preparacion enzimatica esta opcionalmente en forma de un granulado o polvo aglomerado. La preparacion puede tener una distribucion de tamano de partfcula estrecha de mas de 95% (en peso) de las partfculas en el rango de 25 a 500 pm. Los granulados y polvos aglomerados se pueden preparar por metodos convencionales, por ejemplo, por pulverizacion de la de polipeptido descripta en la presente sobre un portador en un granulador de lecho fluido. El portador puede consistir en nucleos de partfculas que tienen un tamano de partfcula adecuado. El portador puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), un azucar (tal como sacarosa o lactosa), un alcohol de azucar (tal como sorbitol), almidon, arroz, semola de mafz, o soja.

Otro aspecto contempla la envoltura de partfculas que comprenden una variante de polipeptido descripta en la presente, es decir, partfculas de • -amilasa. Para preparar las partfculas de amilasa envueltas, la enzima se pone en contacto con un lfpido de calidad alimentaria en cantidad suficiente para suspender la totalidad de las partfculas de • -amilasa. Los lfpidos de calidad alimentaria, como se usa en la presente, pueden ser cualquier compuesto organico natural, que insoluble en agua pero es soluble en solventes organicos no polares tales como hidrocarburos o eter dietilico. Los lfpidos adecuados de calidad alimentaria incluyen, pero sin limitacion, trigliceridos, ya sea en forma de grasas o aceites que son saturados o insaturados. Los ejemplos de acidos grasos y combinaciones de estos que componen los trigliceridos saturados incluyen, pero sin limitacion, acido butmco (derivado de grasa de la leche), palmttico (derivado de grasa animal y vegetal), y/o estearico (derivado de grasa animal y vegetal ). Los ejemplos de acidos grasos y combinaciones de estos que componen los trigliceridos insaturados incluyen, pero sin limitacion, palmitoleico (derivado de grasa animal y vegetal), oleico (derivado de grasa animal y vegetal), linoleico (derivado de los aceites vegetales), y/o linolenico (derivado de aceite de linaza). Otros lfpidos adecuados de calidad alimentaria incluyen, pero sin limitacion, monogliceridos y digliceridos derivados de los trigliceridos mencionados anteriormente, fosfolfpidos y glicolfpidos.

El lfpido de calidad alimentaria, en particular en forma de lfquido, se pone en contacto con una forma en polvo de las partfculas de • -amilasa de manera tal que el material de lfpidos cubre al menos una porcion de la superficie de al menos una mayona, por ejemplo, 100% de las partfculas de • -amilasa. De este modo, cada partfcula de • -amilasa esta envuelto individualmente en un lfpido. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las partfculas de • -amilasa estan provistas de una pelfcula envolvente de lfpidos fina y continua. Esto se puede lograr mediante el vertido primero de una cantidad de lfpidos en un recipiente y, a continuacion suspension de las partfculas de fina, continua de manera que el lfpido humecta completamente la superficie de cada partfcula de • -amilasa. Despues de un corto periodo de agitacion, las partfculas de • -amilasa envueltas, que llevan una cantidad sustancial de los lfpidos en sus superficies, se recuperan. El grosor del recubrimiento aplicado de este modo a las partfculas de • -amilasa se puede controlar mediante la seleccion del tipo de lfpido utilizado y la repeticion de la operacion con el fin de construir una pelfcula mas gruesa, cuando se desee.

El almacenamiento, la manipulacion y la incorporacion del vehfculo de administracion cargado se puede lograr por medio de una mezcla envasada. La mezcla envasada puede comprender la • -amilasa con envoltura. Sin embargo, la mezcla de envasado puede contener ademas ingredientes adicionales segun sea requerido por el fabricante o el panadero. Despues de que la • -amilasa con envoltura se ha incorporado en la masa, el panadero continua a traves del proceso normal de produccion de dicho producto.

Las ventajas de envolver las partfculas de • -amilasa son de dos veces. En primer lugar, el lfpido de calidad alimentaria protege la enzima de la desnaturalizacion termica durante el proceso de horneado para las enzimas que son labiles al calor. En consecuencia, mientras que la • -amilasa se estabiliza y protege durante las etapas de fermentacion y horneado, se libera de la capa protectora en el producto horneado final, en el que hidroliza los enlaces glucosfdicos en poliglucanos. El vehfculo de suministro cargado tambien proporciona una liberacion sostenida de la enzima activa en el producto horneado. Es decir, despues de proceso de horneado, la • -amilasa activa se libera continuamente de la capa protectora a una tasa que contrarresta, y por lo tanto reduce la tasa de los mecanismos de envejecimiento.

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En n general, la cantidad de Ifpidos aplicado a las partfculas • -amilasa puede variar de unos pocos por ciento del peso total de la • -amilasa en muchas veces esel peso, de acuerdo con la naturaleza del lfpido, la manera en la que se aplica a las partfculas de • -amilasa, la composicion de la mezcla de la masa para tratar, y la gravedad de la operacion de mezcla de la masa involucrada.

El vehuculo de suministro cargado, es decir, la enzima con envoltura de lfpidos, se anade a los ingredientes usados para preparar un producto horneado en una cantidad efectiva para extender la vida util del producto horneado. El panadero calcula la cantidad de • -amilasa con envoltura, preparada como se describio anteriormente, que se requerira para lograr el efecto antienvejecimiento deseado. La cantidad de • -amilasa con envoltura, necesaria se calcula sobre la base de la concentracion de la enzima con envoltura en la proporcion de • -amilasa a la harina especificada. Se ha hallado que un amplio rango de concentraciones es efectivo, aunque, como se ha discutido, las mejoras observables en el antienvejecimiento no corresponden linealmente con la concentracion de • -amilasa, pero por encima de ciertos niveles mmimos, grandes aumentos en la concentracion de • -amilasa producen poca mejora adicional. La concentracion de • -amilasa utilizada realmente en una produccion de panadena particular podna ser mucho mas alta que la minima necesaria para proporcionar al panadero algo de seguridad contra errores involuntarios de medicion por el panadero. El lfmite inferior de concentracion de la enzima se determina por el mmimo efecto antienvejecimiento que el panadero desea alcanzar.

Un metodo para preparar un producto horneado puede comprender: (a) preparar partfculas de • -amilasa recubiertas con lfpido, donde sustancialmente todas las parttculas de • -amilasa estan recubiertas; (b) mezclar una masa que contiene harina; (c) anadir las partfculas de • -amilasa recubiertas con lfpido antes de que la mezcla este completa y terminar la mezcla antes de eliminar la capa de lfpidos de la • -amilasa; (d) fermentar la masa; y (e) hornear la masa para proporcionar el producto horneado, en el que la • -amilasa esta inactivo durante las etapa de mezcla, fermentacion y horneado y esta activa en el producto horneado.

La • -amilasa con envoltura se puede anadir a la masa durante el ciclo de mezcla, por ejemplo, cerca del final del ciclo de mezcla. La • -amilasa con envoltura se anade en un punto en la etapa de mezcla que permite la distribucion suficiente de la • -amilasa con envoltura en toda la masa; sin embargo, la etapa de mezclado se termina antes de que la capa protectora sea desprendida de la partfcula de • -amilasa. De acuerdo con el tipo y volumen de la masa, y la accion y velocidad del mezclador, se puede requerir en cualquier momento de uno a seis minutos o mas para mezclar la • -amilasa con envoltura en la masa, pero dos a cuatro minutos es el promedio. Por lo tanto, varias variables pueden determinar con precision el procedimiento. En primer lugar, la cantidad de • -amilasa con envoltura debe tener un volumen total suficiente para permitir que la • -amilasa con envoltura se extienda por toda la mezcla de masa. Si la preparacion de • -amilasa con envoltura esta muy concentrada, puede ser necesario anadir aceite a la premezcla antes de anadir la • -amilasa con envoltura a la masa. Las recetas y procesos de produccion pueden requerir modificaciones espedficas; sin embargo, los buenos resultados en general, se pueden lograr cuando el 25% del aceite especificado en una formula de masa de pan se mantiene fuera de la masa y se utiliza como un portador para una • -amilasa con envoltura concentrada cuando se anade cerca del final del ciclo de mezcla. En pan u otros productos horneados, especialmente los que tienen un bajo contenido de grasa, por ejemplo, los panes de tipo frances, una mezcla de • -amilasa con envoltura de aproximadamente 1% del peso de harina seca es suficiente para mezclar la • -amilasa con envoltura correctamente con la masa. El rango de porcentajes adecuados es amplio y depende de la formula, producto terminado y los requerimientos de la metodologfa de produccion del panadero individual. En segundo lugar, la suspension de la • -amilasa con envoltura se debe anadir a la mezcla con el tiempo suficiente para la mezcla completa en la masa, pero no durante un tiempo tal que la accion mecanica excesiva desprenda la capa lipfdica protectora de las partfculas de • -amilasa con envoltura.

6. Composiciones de desencolado textil y uso

Tambien se contemplan las composiciones y metodos de tratar telas (por ejemplo, para desencolar un tejido) usando una variante de polipeptido descripta en la presente. En un aspecto, se proporciona un metodo de desencolar tejidos, que comprende poner en contacto la variante de polipeptido descripta en la presente con un tejido durante un tiempo suficiente para desencolar el tejido.

Los metodos de tratamiento de telas son bien conocidos en la tecnica (ver, por ejemplo, la Patente U.S. N.°. 6.077.316). Por ejemplo, en un aspecto, el tacto y el aspecto de una tela se mejora mediante un metodo que comprende poner en contacto la tela con la variante de polipeptido descripta en la presente en una solucion. En un aspecto, la tela se trata con la solucion bajo presion.

En un aspecto, una variante de polipeptido descripta en la presente se aplica durante o despues del tejido de un tejido, o durante la etapa de desencolado, o una o mas etapas adicionales de procesamiento de tejido. Durante el tejido del material textil, los hilos se exponen a tension mecanica considerable. Antes de tejer en telares mecanicos, los hilos de urdimbre a menudo se recubren con almidon de encolado o derivados de almidon para aumentar su resistencia a la traccion y para evitar la rotura. Una variante de polipeptido descripta en la presente se puede aplicar durante o despues del tejido para eliminar estos derivados de almidon de encolada o almidon. Despues de tejer, una variante de polipeptido descripta en la presente se puede usar para eliminar la ACPA de encolado antes de procesar adicionalmente la tela para asegurar un resultado homogeneo y a prueba de agua.

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A variante de polipeptido descripta en la presente se puede usar solo o con otros reactivos qmmicos de desencolado y/o enzimas de desencolado para desencolar telas, incluidos las telas que contienen algodon, como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. Una variante de polipeptido descripta en la presente tambien se puede utilizar en composiciones y metodos para producir un aspecto de lavado a la piedra en la tela y prendas de denim tenidas con indigo. Para la fabricacion de ropa, la tela se puede cortar y coser ropa o prendas de vestir, que luego se someten al acabado. En particular, para la fabricacion de pantalones vaqueros, se han desarrollado diferentes metodos de acabado enzimatico. El acabado de prendas de denim normalmente se inicia con una etapa de desencolado enzimatico, durante la cual las prendas se someten a la accion de enzimas amilolfticas para proporcionar suavidad a la tela y hacer al algodon mas accesible a las etapas de acabado enzimatico posteriores. Una variante del polipeptido descripta en la presente se puede usar en metodos de acabado de prendas de denim (por ejemplo, un "proceso de pre-lavado biologico"), desencolado enzimatico y provision de suavidad a los tejidos, y/o proceso de acabado.

La descripcion proporciona los siguientes items:

1. Un polipeptido que tiene actividad amilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene

a. al menos 65 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88 o 205, y/o

b. al menos 78 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 16, 48, 97, 105, 235, 240, 248, 266, 311, 347, 350, 362, 364, 369, 393, 395, 396, 400, 401,403, 412 o 409, y/o

c. al menos 78 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D, 392 K/D/E/Y/N/Q/R/T/G o 399C/H, y/o

d. al menos 95% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 44, 96, 204, 354 o 377, y/o

e. al menos 95% identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende la siguiente sustitucion de aminoacido: 392S

en donde una sustitucion de aminoacido esta relacionada con el aminoacido correspondiente de la SEQ ID NO:1 y las posiciones son con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

2. Un polipeptido que tiene actividad amilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 65 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, o 205 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 235H/K/R, 240E, 392 K/D/E/Y o 409E en donde una sustitucion de aminoacido esta relacionada con el aminoacido correspondiente de la SEQ ID NO:1 y las posiciones son con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

3. El polipeptido de acuerdo con el item 1, en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, 205, 235, 240, 248, 266, 311, 377 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D o 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.

4. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 3, en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, 205, 235, 240, 311 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/N/I/H/F, 272D, o 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.

5. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 3-4, en donde el polipeptido comprende sustituciones de aminoacidos al menos en cuatro, cinco o en todas las siguientes posiciones: 88, 205, 235, 240, 311 o 409 y/o tiene al menos una, o dos de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/N/I/H/F, 272D o 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.

6. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-5, en donde el polipeptido comprende ademas uno o mas de los siguientes aminoacidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E/S/K/A, 229P, 307K, 309P o 334P.

7. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-6, en donde el polipeptido tiene ademas los siguientes aminoacidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 229P, 307K, 309P y 334P.

8. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-6, en donde el polipeptido tiene al menos una de las sustituciones de aminoacidos en b) del item 1 y ademas comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 44, 96, 204, 354 o 377.

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9. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los ttems 1-8 que tiene al menos 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

10. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-9, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 34Q.

11. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-10, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 42K/F/H/I/N/A/V.

12. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-10, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 42K/F/H/I/N.

13. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-12, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 42K.

14. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-13, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 88.

15. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-14, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 88L/Y/K.

16. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-15, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 88L.

17. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-16, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 88Y.

18. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-17, en donde el polipeptido comprende una sustitucion

de aminoacido en la posicion 205.

19. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-18, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 205L/K/M/N/Q/R/V/Y.

20. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-19, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 205L/K/M/N/Q/R/V.

21. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-20, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 205L.

22. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-21, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 235.

23. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-22, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235H/K/R/Q/S.

24. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-23, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235H/K/R/Q.

25. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 24, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235H/K/R.

26. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 25, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235R.

27. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 25, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235H.

28. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 25, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235K.

29. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-28, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 240.

30. El polipeptido de acuerdo con los items 29, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 240E/H/M/D/S.

31. El polipeptido de acuerdo con los items 29, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 240E/H/M/D.

32. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 29, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 240E.

33. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-32, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 272D.

34. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-33, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 311.

35. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 34, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 311P.

36. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-35, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 409.

37. El polipeptido de acuerdo con los items 36, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 409H/Q/T/E.

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38. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 37, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 409E.

39. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-38, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 100Q/K/N/R.

40. El polipeptido de acuerdo con los items 39, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 100Q.

41. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 y 2-39, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T/G.

42. El polipeptido de acuerdo con los items 41, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T.

43. El polipeptido de acuerdo con los items 2 o 41, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392D/E/K/Y.

44. El polipeptido de acuerdo con los items 43, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392D.

45. El polipeptido de acuerdo con los items 43, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392E.

46. El polipeptido de acuerdo con los items 43, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392K.

47. El polipeptido de acuerdo con los items 43, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 392Y.

48. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-47, en donde el polipeptido tiene los dos aminoacidos siguientes 235R y 311P.

49. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-48, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 16.

50. El polipeptido de acuerdo con los items 49, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 16/A/E/K.

51. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-50, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 48.

52. El polipeptido de acuerdo con los items 51, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 48/C/L.

53. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-52, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 97.

54. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-53, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 105.

55. El polipeptido de acuerdo con los items 54, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 105/N/R

56. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-55, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 248.

57. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-56, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 266.

58. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-57, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 347.

59. El polipeptido de acuerdo con los items 58, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 347/C/D/H/K.

60. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-59, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 350.

61. El polipeptido de acuerdo con los items 60, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 350E/H/N.

62. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-61, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 354.

63. El polipeptido de acuerdo con los items 62, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 354D/E.

64. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-63, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 362.

65. El polipeptido de acuerdo con los items 64, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 362E/H/P.

66. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-65, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 364.

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67. El polipeptido de acuerdo con los items 66, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 364E/K/NQ.

68. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-67, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 369.

69. El polipeptido de acuerdo con los items 68, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 369I/N.

70. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-69, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 377.

71. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-70, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 393.

72. El polipeptido de acuerdo con los items 71, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 393D/E/K.

73. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-72, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 395.

74. El polipeptido de acuerdo con los items 73, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 395C/E/K.

75. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-74, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 396.

76. El polipeptido de acuerdo con los items 75, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 396D/E.

77. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-76, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 399.

78. El polipeptido de acuerdo con los items 77, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 399C/H.

79. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-78, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 400.

80. El polipeptido de acuerdo con los items 79, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 400S/W.

81. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-80, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 401.

82. El polipeptido de acuerdo con los items 81, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 401D/K.

83. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-82, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 403.

84. El polipeptido de acuerdo con los items 83, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 403E/T/V.

85. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-84, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 412.

86. El polipeptido de acuerdo con los items 85, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 412D/N.

87. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-86, en donde el polipeptido comprende ademas uno o mas de los siguientes aminoacidos 121F, 134R, 141P, 229P o 307K.

88. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-87, en donde el polipeptido tiene uno o mas de los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D y 409E.

89. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-88, en donde el polipeptido comprende los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 235R, 311P, 392D y o bien 223S, 223K o 223A.

90. El polipeptido de acuerdo con los items 89 que comprende ademas uno o mas seleccionados del grupo que consiste en 272D, 409E, 205L o 240E.

91. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-90, en donde el polipeptido tiene al menos cuatro, cinco, seis, siete u ocho de los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D o 409E.

92. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-91, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 223A/K/S.

93. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-92, en donde el polipeptido tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P y 392D.

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94. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-93, aminoacidos 42K, 88L, 223K, 235R, 272D, 311P y 392D.

95. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-94, aminoacidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P, 392D y 409E.

96. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-95, aminoacidos 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P, 392D y 409E.

97. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-96, aminoacidos 42K, 88L, 205L, 223K, 240E, 235R, 311P, 392D y 409E.

98. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-97, en donde el polipeptido tiene los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 223A, T235R, 311P, 392D y 409E.

99. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-98 que comprende una secuencia de aminoacidos

seleccionada del grupo que consiste en SeQ ID NO: 12, SEQ ID nO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID

NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID

NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

100. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-99 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID nO: 13, sEq ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17,

101. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-100 que tiene una secuencia de aminoacidos

seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID

NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID

NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, y opcionalmente uno o mas aminoacidos adicionales en el extremo N.

102. El polipeptido de acuerdo con los items 101 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17, y opcionalmente uno o mas aminoacidos adicionales en el extremo N.

103. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 101-102 en donde dichos uno o mas aminoacidos adicionales en el extremo N es un M.

104. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-103, en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 88, 205, 235 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 34Q, 100Q, 223A/S, 240E, 311P, 392D, o 409E con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

105. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-104, en donde el polipeptido comprende una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 34Q, 88K/L/Y, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/H/Q/R, 240E/D, 248H, 266T, 311P, 377D/E/P, 392K/D/Y o 409E.

106. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-105, en donde el polipeptido comprende una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 34Q, 42K, 88L, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/R, 240E, 311P, 392D o 409E.

107. El polipeptido de acuerdo con los items 106, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 235R y 311P.

108. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-107, en donde el polipeptido comprende la sustitucion de aminoacido 42K.

109. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-108, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K y 223S.

110. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-109, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 223S y 392D.

111. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-110, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 223A, 235R, 311P y 392D.

112. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-111, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E.

en donde el polipeptido tiene los siguientes

en donde el polipeptido tiene los siguientes

en donde el polipeptido tiene los siguientes

en donde el polipeptido tiene los siguientes

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113. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-112, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E.

114. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-113, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P y 392D.

115. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-114, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 34Q, 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E.

116. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-115, en donde el polipeptido comprende las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 88L, 100Q, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D y 409E.

117. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-116 que comprende ademas un dominio de ligacion a almidon en el extremo C.

118. El polipeptido de acuerdo con los items 117 en donde el dominio de ligacion a almidon es el residuo de SEQ ID NO: 36.

119. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-118 que tiene un ligador fusionado al extremo C.

120. El polipeptido de acuerdo con los items 119, en donde el ligador es el residuo de SEQ ID NO: 35.

121. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-120 que tiene exoactividad amilasa.

122. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-121 que tiene exoactividad amilasa no maltogenica.

123. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-122, en donde el polipeptido presenta una mayor termoestabilidad cuando se compara con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

124. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-123, en el cual la vida media (t1/2), preferentemente a 60 grados C, esta aumentada en un 15% o mas, preferentemente 50% o mas, mas preferentemente 100% o mas, con relacion a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

125. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-124, en el cual un producto alimenticio tratado con el polipeptido tiene una cualquiera o mas, preferentemente todas las siguientes propiedades: (a) menor firmeza; (b) mayor resistencia; (c) mayor cohesividad; (d) menor friabilidad; y (e) mayor capacidad de plegado en comparacion con un producto alimenticio que ha sido tratado con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

126. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-125, en el cual la resistencia, la cohesividad o la capacidad de plegado del producto alimenticio tratado con el polipeptido esta aumentada independientemente en un 15% o mas, preferentemente 50% o mas, mas preferentemente 100% o mas, con relacion a un producto alimenticio que ha sido tratado con la SEQ ID NO: 1 o la sEq ID NO: 10.

127. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-126, en el cual cada una de la resistencia, la cohesividad y la capacidad de plegado de un producto alimenticio tratado con el polipeptido esta aumentada en comparacion con un producto alimenticio que ha sido tratado con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

128. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-127, en el cual la firmeza o la friabilidad del producto alimenticio tratado con el polipeptido esta disminuida independientemente en un 15% o mas, preferentemente 50% o mas, mas preferentemente 100% o mas, con relacion a un producto alimenticio que ha sido tratado con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

129. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-128, en el cual cada una de la firmeza y la friabilidad de un producto alimenticio tratado con el polipeptido esta disminuida en comparacion con un producto alimenticio que ha sido tratado con la SEQ ID NO: 1 o la SeQ ID NO: 10.

130. Uso de un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129 como un aditivo para alimentos o piensos.

131. Un proceso para tratar un almidon, que comprende poner en contacto el almidon con un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129 y permitir que el polipeptido genere a partir del almidon uno o mas productos lineales.

132. Uso de un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129 para preparar un producto alimenticio o de pienso.

133. Un proceso para la preparacion de un producto alimenticio o de pienso que comprende mezclar un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129 con un ingrediente de un alimento o pienso.

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134. Uso de acuerdo con los items 130, o un proceso de acuerdo con los items 133, en el cual el producto alimenticio comprende una masa o producto de masa, preferentemente un producto de masa procesado.

135. Un uso o proceso de acuerdo con cualquiera de los items 130 a 133, en el cual el producto alimenticio es un producto de panadena.

136. Un proceso para la preparacion de un producto de panadena que comprende: (a) proporcionar un medio de almidon; (b) agregar al medio de almidon un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129; y (c) aplicar calor al medio de almidon durante o despues del paso (b) para producir un producto de panadena.

137. Un producto alimenticio, producto de pienso, producto de masa o un producto de panadena obtenido por un proceso de acuerdo con cualquiera de los items 130 a 136.

138. Una composicion de mejorador para una masa, en la cual la composicion de mejorador comprende un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129, y al menos otro ingrediente de masa o aditivo de masa.

139. Una composicion que comprende una harina y un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1129.

140. Uso de un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129, en un producto de masa para retardar o reducir el enranciamiento, preferentemente la retrogradacion perjudicial, del producto de masa.

141. Uso de un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129, en un producto de masa para mejorar una cualquiera o mas de la firmeza, la resistencia, la cohesividad, la friabilidad o la capacidad de plegado del producto de masa.

142. Una combinacion de un polipeptido como se describio en cualquiera de los items 1-129, junto con una cualquiera o mas de las siguientes:

a. alfa-amilasa maltogenica, tambien denominada glucano 1,4-a-maltohidrolasa (EC 3.2.1.133) de Bacillus stearothermophilus, o una variante, homologo, o mutantes de esta, que tiene actividad alfa-amilasa maltogenica;

b. una xilanasa de panadena (EC 3.2.1.8) de, por ejemplo, Bacillus sp., Aspergillus sp., Thermomyces sp. o Trichoderma sp.;

c. a-amilasa (EC 3.2.1.1) de Bacillus amyloliqufaciens o una variante, homologo, o mutantes de esta, que tiene actividad alfa-amilasa; y

d. una lipasa tal como glicolipasa de Fusarium heterosporum.

143. Uso de una combinacion de acuerdo con los items 142 para una aplicacion de acuerdo con cualquier item precedente.

144. Un producto alimenticio o de pienso producido por tratamiento con una combinacion de acuerdo con los items 142.

145. Un acido nucleico capaz de codificar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 a 129.

146. Un acido nucleico de acuerdo con los items 145 que tiene una secuencia de acido nucleico que es al menos 78% identica a la SEQ ID NO: 52.

147. Un acido nucleico que comprende un fragmento de al menos 60 residuos de un acido nucleico de acuerdo con los items 145 o 146 que es capaz de codificar un polipeptido que tiene exoactividad amilasa no maltogenica.

148. Un plasmido que comprende un acido nucleico de acuerdo con cualquiera de los items 145 a 147.

149. Un vector de expresion que comprende un acido nucleico de acuerdo con cualquiera de los items 145 a 147, o capaz de expresar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 a 129.

150. Una celula huesped que comprende, preferentemente transformada con, un plasmido de acuerdo con los items 148 o un vector de expresion de acuerdo con los items 149.

151. Una celula capaz de expresar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 a 129.

152. Una celula huesped de acuerdo con los items 150, o una celula de acuerdo con los items 151, que es una celula bacteriana, fungica o de levadura.

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153. Un metodo de expresion de un polipeptido, metodo que comprende obtener una celula huesped o una celula de acuerdo con los ttems 150, 151 o 152 y expresar el polipeptido de la celula o celula huesped, y opcionalmente purificar el polipeptido.

154. Un metodo para producir un polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 a 129, metodo que comprende introducir una sustitucion de aminoacido en la SEQ ID NO: 1 que tiene exoactividad amilasa no maltogenica, estando la sustitucion de aminoacido

a. en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 16, 48, 88, 97, 105, 205, 235, 240, 248, 266, 311, 347, 350, 362, 364, 369, 393, 395, 396, 400, 401, 403, 412 y 409 y/o

b. una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D, 392 K/D/E/Y/N/Q/R/T/G o 399C/H y/o

c. en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 44, 96, 204, 354 y 377 y/o

d. la siguiente sustitucion de aminoacido: 392S.

155. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 que comprende la secuencia DGF-X1-AIW-X2-P- X3-PWRD-X4-SSW (SEQ ID NO: 38), en donde X1 es S o T, X2 es M o L, X3 es V o P y X4 es cualquier residuo de aminoacido que existe naturalmente, preferentemente un L-aminoacido, en las posiciones correspondientes a las posiciones 49-66 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

156. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155 que comprende la secuencia GGEGYFW (SEQ ID NO: 39) en las posiciones correspondientes a las posiciones 79-85 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como sEq ID NO: 1.

157. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-156 que comprende la secuencia VPNH (SEQ ID NO: 40) en las posiciones correspondientes a las posiciones 114-117 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

158. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-157 que comprende la secuencia CDDGD (SEQ ID NO: 41) en las posiciones correspondientes a las posiciones 150-154 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

159. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-158 que comprende la secuencia AGGFRFDFVRG (SEQ ID NO: 42) en las posiciones correspondientes a las posiciones 187-197 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

160. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-159 que comprende la secuencia FALK (SEQ ID NO: 43) en las posiciones correspondientes a las posiciones 256-259 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

161. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-160 que comprende la secuencia WREVAVTFVDNHD (SEQ ID NO: 44) en las posiciones correspondientes a las posiciones 282-294 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

162. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-161 que comprende la secuencia GYSPG (SEQ ID NO: 45) en las posiciones correspondientes a las posiciones 296-300 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

163. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-162 que comprende la secuencia GQH (SEQ ID NO: 46) en las posiciones correspondientes a las posiciones 304-306 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

164. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-163 que comprende la secuencia AYAYI (SEQ ID NO: 47) en las posiciones correspondientes a las posiciones 318-322 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

165. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-164 que comprende la secuencia SPGTP (SEQ ID NO: 48) en las posiciones correspondientes a las posiciones 325-329 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

166. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-165 que comprende la secuencia VYW (SEQ ID NO: 49) en las posiciones correspondientes a las posiciones 331-333 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

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167. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-166 que comprende la secuencia HMYDWG (SEQ ID NO: 50) en las posiciones correspondientes a las posiciones 335-340 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

168. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1-129 y 155-167 que comprende la secuencia HGGDEIILQFHWN (SEQ ID NO: 37) en las posiciones correspondientes a las posiciones 13-26 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

169. A metodo para producir un polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 a 129 y 155-167, metodo que comprende introducir una sustitucion de aminoacido en la SEQ ID NO: 1 que tiene exoactividad amilasa no maltogenica, estando la sustitucion de aminoacido en una o mas de las siguientes posiciones: 88, o 205 y/o siendo una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K, 235H/K/R, 240E, 392 K/D/E/Y o 409E.

170. Un metodo para preparar un jarabe de sacarido, que comprende agregar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de los items 1 a 129 y 155-167 a un licuado de almidon granular para formar el jarabe de sacarido.

171. El metodo del item 170, en donde el licuado de almidon granular es producido por una alfa-amilasa.

172. El metodo del item 170, en donde el licuado de almidon granular es un licuado producido por acido.

173. El metodo del item 170, en donde el licuado de almidon granular se obtiene de almidon de mafz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, porotos, bananas o papas.

174. El metodo del item 170, en donde el licuado de almidon granular es sacarificado a 55 °C a 65 °C.

175. El metodo del item 170, en donde el licuado de almidon granular es sacarificado a 60 °C a 65 °C.

176. El metodo del item 170, en donde el licuado de almidon granular es sacarificado a pH 5,0 a pH 7,0.

177. El metodo del item 170, que comprende ademas una etapa de agregar una enzima que tiene actividad

desramificadora al licuado de almidon granular.

178. El metodo del item 177, en donde la enzima que tiene actividad desramificadora es una isoamilasa, una pululanasa, una isopululanasa, una neopululanasa o cualquier combinacion de estas.

179. El metodo del item 177, que comprende opcionalmente una etapa adicional de agregar una proteasa, una celulasa, una hemicelulasa, una lipasa, una cutinasa, una pectato liasa o cualquier combinacion de estas al almidon granular.

180. El metodo del item 170, en donde el jarabe de sacarido comprende al menos 35% en peso de maltotetraosa en base al contenido total de sacarido.

181. El metodo del item 180, en donde el jarabe de sacarido comprende al menos 45% en peso de maltotetraosa en base al contenido total de sacarido.

182. El metodo del item 181, en donde el jarabe de sacarido comprende al menos 50% en peso de maltotetraosa en base al contenido total de sacarido.

183. El metodo del item 182, en donde el jarabe de sacarido comprende de 40% en peso a 60% en peso de maltotetraosa en base al contenido total de sacarido.

Ejemplos

Ejemplo 1. Clonacion de PS4 y G4-amilasas

Se cultivo Pseudomonas sacharophila durante la noche en medio LB y se aislo ADN cromosomico por metodos estandar (Sambrook J, 1989). Un fragmento de 2190 bp que contema el marco de lectura abierto PS4 (Zhou et al., 1989) se amplifico de ADN cromosomico de P. sacharophila por PCR usando los cebadores P1 y P2 (ver Tabla 3). El fragmento resultante se uso como un molde en una PCR anidada con los cebadores P3 y P4, amplificando el marco de lectura abierto de PS4 sin su secuencia senal e introduciendo un sitio NcoI en el extremo 5' del gen y un sitio BamHI en el extremo 3'. Junto con el sitio NcoI se introdujo un codon para una metionina N-terminal, permitiendo la expresion intracelular de PS4. El fragmento de 1605 bp se clono en pCRBLUNT TOPO (Invitrogen) y se analizo la integridad del constructo por secuenciacion. El vector transportador del Bacillus E.coli pDP66K (Penninga et al., 1996) se modifico para permitir la expresion del PS4 bajo control del promotor P32 y la secuencia senal ctgasa. El plasmido resultante, pCSmta es transformado en B. subtilis.

Se preparo un segundo constructo de expresion en el cual se removio el dominio de ligacion de almidon de PS4. En una PCR con los cebadores P3 y P6 (Tabla 3) en pCSmta, se genero una version truncada del gen mta. El gen mta de longitud completa en pCSmta se intercambio con la version truncada que resulto en el plasmido pCSmta-SBD.

Amilasas G4 de Pseudomonas sp. AM1 (2006), Pseudomonas sp. 7193, Pseudomonas mendocina (cepa ymp) y Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396) fueron clonadas en un vector de expresion de Bacillus con la secuencia senal por smtesis de genes (GeneScript; NJ, USA) de las secuencias que codifican las protemas maduras con un M agregado en el extremo N como se muestra en las SEQ ID NO 3, 5, 7 y 9.

5 Ejemplo 2. Mutagenesis dirigida a un sitio

La mutagenesis dirigida a un sitio se uso para producir polipeptido variante como se divulga en la presente. Las mutaciones fueron introducidas en un acido nucleico que codifica pMS 382 que tiene la SEQ ID: 1, usando el metodo Quick Change™ (Stratagene, California), de acuerdo con las instrucciones suministradas con el kit con algunas modificaciones. Brevemente, se tomo una sola colonia y se inoculo en 3 ml de LB (22 g/l de Caldo Base Lennox L, 10 Sigma) suplementado con 50 pg/ml de kanamicina (Sigma) en un tubo Falcon de 10 ml. Despues de incubacion

durante la noche a 37 °C a 200 rpm, el cultivo fue centrifugado a 5000 rpm durante 5 min. El medio fue removido y

se preparo un molde de ADN de doble hebra usando columnas de QlAGEN (QIAGEN). Los cebadores fueron disenados de acuerdo con el protocolo del fabricante. Por ejemplo, la TABLA 1 indica los cebadores que se usaron para generar nuevas variantes basadas en la secuencia de nucleotidos de pMS382 como se muestra en la SEQ ID 15 NO: 52.

A continuacion se realizo una PCR para sintetizar la hebra mutante. La mezcla de reaccion de la PCR contema lo siguiente:

2.5 • l 10 X QuickChange tampon de multirreaccion 0.75 • l QuickSolution

20 X • l cebadores (10 pmoles para los cebadores de 28-35 nt; 7 pmoles para los cebadores de 24-27 nt; o 5 pmoles para los cebadores de 20-23 nt)

1 • I mezcla de dNTP

X • l molde de ds-ADNe (200 ng)

1 • l QuickChange mezcla de multienzimas (2.5 U/^ l) (PfuTurbo ADN polimerasa)

25 X • l dH2O (hasta un volumen final de 25 • l)

La reaccion de PCR se realizo en un ciclador termico Eppendorf durante 35 ciclos de desnaturalizacion (96°C durante 1 min), reasociacion de cebadores (62,8°C durante 1 min), y alargamiento (6°°C durante 15 min), y luego se mantuvo a 4°C. Para cada reaccion de amplificacion se agregaron 2 • l de enzima de restriccion Dpnl (10 U/^ l), y la mezcla se incubo a 37°C durante ~ 3 hs.

30 El ADN tratado con Dpnl se uso luego para transformar celulas ultracompetentes XL10-Gold® (Stratagene). Las celulas XL10-Gold® fueron descongeladas en hielo. Para cada reaccion de mutagenesis se agregaron 45 • l celulas a un tubo Falcon preenfriado. Subsiguientemente, se agregaron 2 • l de mezcla de beta-mercaptoetanol a cada tubo. La mezcla se incubo en hielo durante 10 min con haciendola girar cada 2 min. Luego se agregaron 1,5 • l de ADN tratado con Dpnl a cada alfcuota de celulas, y la mezcla se incubo en hielo durante 30 min. La muestra fue sometida 35 a un pulso termico de 30 seg a 42°C, y se coloco en hielo durante otros 2 min. Se agregaron 0,5 ml de caldo NZY+ precalentado a cada muestra y se llevo a cabo la incubacion a 37°C durante 1 h con agitacion a 225-250 rpm. Se colocaron en placas 200 • l de cada reaccion de transformacion sobre placas con LB (33,6 g/l de Lennox L Agar, Sigma) suplementado con 1% de almidon y 50 • g/ml de kanamicina. Las placas fueron incubadas durante la noche a 37°C. Se identificaron colonias individuales que alojaban las mutaciones deseadas por secuenciacion de ADN y se 40 sometieron a preps de plasmidos para cosechar plasmidos con las mutaciones deseadas.

Ejemplo 3. Transformacion en Bacillus subtilis.

Se transformo Bacillus subtilis (cepa DB104A; Smith et al., Gene 70, 351-361 (1988)) con el ADN plasmido mutado de acuerdo con el siguiente protocolo.

A. Medios para preparacion de protoplastos y transformacion

2 x SMM por litro: 342 g sacarosa (1 M); 4,72 g de maleato de sodio (0,04 M); 8,12 g de MgCV6H20 ( 0,04 M);

pH 6,5 con NaOH concentrado. Distribuir en porciones de 50 ml y colocar en autoclave durante 10 min.

4 x YT (1/2 2 g de extracto de levadura + 3,2 g de Triptona + 0,5 g de NaCl por 100 ml.

NaCl)

5

10

15

20

25

SMMP mezclar volumenes iguales de 2 x SMM y 4 x YT.

PEG 10 g de polietilenglicol 6000 (BDH) o 8000 (Sigma) en 25 ml

1 x SMM (Autoclave durante 10 min.).

B. Medios para colocacion en placas/regeneracion

agar 4% Difco minimal agar. Autoclave durante 15 min.

succinato de sodio 270 g/1 (1 M), pH 7,3 con HCl. Autoclave durante 15 min.

tampon fosfato 3,5 g de K2HPO4 + 1,5 g de KH2PO4 por 100 ml. Autoclave durante 15 min

MgCl2 20,3 g de MgC12'6H2O por 100 ml (1 M).

casaminoacidos solucion al 5% (p/v). Autoclave durante 15 min.

extracto de levadura 10 g por 100 ml, autoclave durante 15 min.

glucosa solucion al 20% (p/v). Autoclave durante 10 min.

Medio de regeneracion DM3: mezclar a 60 °C (bano de agua; frasco de 500 ml):

250 ml de succinato de sodio 50 ml de casaminoacidos 25 ml de extracto de levadura 50 ml de tampon fosfato 15 ml de glucosa 10 ml de MgCl2 100 ml agar fundido

Agregar antibioticos apropiados: cloranfenicol y tetraciclina, 5 • g/ml; eritromicina, I • g/ml. La seleccion en kanamicina es problematica en medio DM3: pueden requerirse concentraciones de 250 • g/ml.

C. Preparacion de protoplastos

Usar recipientes de plastico o de vidrio libres de detergente.

Inocular 10 ml de 2 x medio YT en un matraz de 100 ml de una sola colonia. Cultivar un cultivo de una noche a 25- 30°C en un agitador (200 rev/min).

Diluir el cultivo de una noche 20 veces en 100 ml de 2 x medio YT fresco (matraz de 250 ml) y cultivar hasta OD600 = 0,4-0,5 (aprox. 2 hs) a 37°C en un agitador (200-250 rev/min).

Cosechar las celulas por centrifugacion (9000 g, 20 min, 4°C).

Remover el sobrenadante con una pipeta y volver a suspender las celulas en 5 ml de SMMP + 5 mg lisozima, filtrada en forma esteril.

Incubar a 37 °C en un agitador en un bano de agua (100 rpm).

Despues de 30 min y luego a intervalos de 15 min, examinar muestras de 25 • I por el microscopio. Continuar la incubacion hasta que 99% de las celulas son formadas como protoplastos (aspecto globular). Cosechar los protoplastos por centrifugacion (4000 g, 20 min, RT) y retirar con una pipeta el sobrenadante. Volver a suspender el pellet suavemente en 1-2 ml de SMMP.

5

10

15

20

25

Los protoplastos estan listos ahora para usar. Porciones (por ejemplo, 0,15 ml) pueden ser congeladas a -80 °C para uso futuro (no se requiere adicion de glicerol). Aunque esto puede dar por resultado una cierta reduction de la capacidad de transformation, se pueden obtener 106 transformantes por ug de ADN con protoplastos congelados).

D. Transformacion

Transferir 450 • l de PEG a un microtubo.

Mezclar 1-10 • l de ADN (0,2 • g) con 150 • l de protoplastos y agregar la mezcla al microtubo con PEG. Mezclar inmediatamente, pero suavemente.

Dejar durante 2 min a temperatura ambiente, y luego agregar 1,5 ml de SMMP y mezclar.

Cosechar los protoplastos por microcentrifugado (10 min, 13.000 rpm (10.000-12.000 g)) y retirar el sobrenadante. Remover las gotas remanentes con un papel tisu.

Agregar 300 • l de SMMP (no agitar en torbellino) e incubar durante 60-90 min a 37 °C en un agitador con bano de agua (100 rpm) para permitir la expresion de marcadores de resistencia a antibioticos. (Los protoplastos son suficientemente resuspendidos a traves de la action de agitation del bano de agua). Realizar diluciones apropiadas en 1 x SSM y colocar en placas 0,1 ml en placas de DM3.

Ejemplo 4. Fermentation de variantes en matraces de agitacion.

El sustrato del matraz de agitacion es preparado disolviendo lo siguiente en agua:

Extracto de levadura

2% (p/v)

Harina de soja

2% (p/v)

NaCl

0,5% (p/v)

Fosfato dipotasico

0,5% (p/v)

Agente antiespumante

0,05% (p/v)

El substrato se ajusto a pH 6,8 con acido sulfurico 4 N o hidroxido de sodio antes de colocar en autoclave. Se colocaron 100 ml de sustrato en un matraz de 500 ml con un baffle y se coloco en autoclave durante 30 minutos. Subsiguientemente, se agregaron 6 ml de jarabe de dextrosa esteril. El jarabe de dextrosa es preparado mezclando un volumen de 50% p/v de dextrosa con un volumen de agua seguido por colocation en autoclave durante 20 minutos.

Los matraces de agitacion son inoculados con las variantes e incubados durante 24 horas a 35°C y 180 rpm en una incubadora. Despues de la incubation se separan las celulas del caldo por centrifugation (10.000 g en 10 minutes) y finalmente, se retiran las celulas del sobrenadante por microfiltracion a 0,2 ^m. El sobrenadante libre de celulas se usa para ensayos y ensayos de aplicacion.

Tabla 1. Cebadores usados para generar variantes en base a la secuencia de nucleotidos de pMS382 como se muestra en la SEQ ID NO: 52.

Mutation

5' Oligosecuencia 3' Modification Hebra Proposito

Q42K

GT AT AACATCCT G AGACAAaaaGCG AGCACAATTGC CG 5' fosfato + MSDM

Q42N

GT AT AACATCCT G AGACAAaacGCGAGCACAATTGC C 5' fosfato + MSDM

R88L

GCAT GACTTT AACAAAAACGGCct g T ATGGAAGCGA TGCTC 5' fosfato + MSDM

R88Y

GGCAT GACTTT AACAAAAACGGCt at TATGGAAGCG ATGCTCAAC 5' fosfato + MSDM

L88K

GGCAT GACTTT AACAAAAACGGCaaaT ATGGAAGC GATGCTCAAC 5' fosfato + MSDM

S205L

GCCCCGG AAAGAGTTG ATct g TGGAT G AGCGATTCA GCG 5' fosfato + MSDM

5

10

15

20

25

Mutation

5' Oligosecuencia 3' Modification Hebra Proposito

T235R

GTGGGATTGGAGAAATagaGCGAGCTGGCAGC 5' fosfato + MSDM

T235K

GTGGGATTGGAGAAATaaaGCGAGCTGGCAGC 5' fosfato + MSDM

T235H

GCCGTGGG ATTGGAG AAAT cat GCGAGCT GGCAGC AG 5' fosfato + MSDM

T235Q

CCGTGGGATTGG AG AAAT cag GCGAGCTGGCAGCA G 5' fosfato + MSDM

Q240E

CGCTCCAATCTTTGATGATTTCCTGCCAGCTCGCTG 5' fosfato - MSDM

Q240D

CAGCG AGCTG GCAGg at AT CAT CA AAGATTGG AGC G 5' fosfato + MSDM

Q311P

CAACAT AAATGGCCGCTT ccg GATGGCCTT ATCAGA CAG 5' fosfato + MSDM

A392D

GCCCTGAATAGCGATCTGgatAATCCGGGACAAGTT GC 5' fosfato + MSDM

A392Y

CGCCCTGAATAGCGATCTGt at AATCCGGGACAAGT TGCTAG 5' fosfato + MSDM

S409E

GCG AAGCAGT CAAT GCCg aaAATGGCCAAGT CAGA GTCTG 5' fosfato + MSDM

R248H

CATCAAAGATTGGAGCGATcatGCAAAATGCCCG GTCTTTGAC 5' fosfato + MSDM

S266T

CGCAT GCAAAATGGAacg GT CGCCGATTGG AAAC ATG 5' fosfato + MSDM

S377D

CTACAGTTgatGGCAGCCAACAAAC 5' fosfato + MSDM

Ejemplo 5. Ensayos de amilasa Ensayo de Betamyl

Una unidad Betamyl se define como la actividad que degrada 0,0351 mmoles por 1 min de maltopentaosa acoplada con PNP de tal modo que 0,0351 mmoles de PNP por 1 min pueden ser liberados por exceso de alfa-glucosidasa en la mezcla de ensayo. La mezcla de ensayo contienes 50 ul de 50 nM citrato de Na, 5 mM de CaCl2, pH 6,5 con 25 ul de muestra de enzima y 25 ul de sustrato Betamyl (Glc5-PNP y alfa-glucosidasa) de Megazyme, Irlanda (1 vial disuelto en 10 ml de agua). La mezcla de ensayo se incubo durante 30 min a 40°Cy luego se detuvo agregando 150 ul de 4% Tris. Se midio la absorbancia a 420 nm usando un lector ELISA y se calculo la actividad de Betamyl en base a la Actividad = A420 * d en unidades Betamyl/ml de muestra de enzima ensayada. Para la dosificacion en los ensayos de horneado se usaron 1 BMK = 1000 unidades Betamyl.

Ensayo de endo-amilasa

El ensayo de endo-amilasa es identico al ensayo Phadebas realizado de acuerdo con el fabricante (Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB).

Exo-especificidad

La relation entre la exo-actividad de amilasa y la actividad de Phadebas se uso para evaluar la exo-especificidad.

Ejemplo 6. Determinaciones de estabilidad termica del procedimiento basadas en la actividad residual

Las muestras de enzimas en diluciones apropiadas fueron incubadas en 50 mM de tampon acetato de Na, pH 5,0 con 0,5 M de NaCl a temperatura ambiente (control) o durante 4 minutos a 80°C (muestra calentada), e inmediatamente despues que la muestra control y la muestra calentada fueron analizadas usando el ensayo Betamyl. La actividad residual se calculo como la actividad Betamyl de la muestra calentada dividido por la actividad Betamyl de la muestra control.

Ejemplo 7. Efectos estabilizadores de mutaciones

Usando el procedimiento descripto en el Ejemplo 6 los efectos estabilizadores de las mutaciones Q42K, R88L, S205L, E223S, Q311P, S409E y T235K se muestran en la Tabla 2 como un aumento de la actividad residual despues del calentamiento. De igual forma el efecto estabilizador de A392D se muestra en la Tabla 3, de S205L, S223A y S205L combinado con S409 en la Tabla 4, de N34Q y G100Q en la Tabla 5 y de Q240E en la Tabla 6. En

46

las tablas 2-6, las variantes tienen la misma secuencia que la mencionada en la primera lmea excepto para la o las mutaciones ulteriores realizadas como se describio en la segunda columna.

Tabla 2. Efecto estabilizador de Q42K, R88L, S205L, E223S, Q311P, S409E y T235K combinados con Q311P

Variante

Mutacion ulterior en pMS382 Actividad residual (%)

pMS382 (SEQ ID NO: 1)

8,4

pMS465 (SEQ ID NO: 18)

E223S 9,6

pMS1042 (SEQ ID NO: 19)

Q31 1 P 13,1

pMS1104 (SEQ ID NO: 20)

Q42K 11,2

pMS1153 (SEQ ID NO: 21)

R88L 19,5

pMS1286 (SEQ ID NO: 22)

T235R 12,3

pMS1284 (SEQ ID NO: 23)

T235R, Q31 1 P 17,2

pMS1290 (SEQ ID NO: 24)

T235K 14,1

pMS1484 (SEQ ID NO: 25)

S205L 8,8

pMS1579 (SEQ ID NO: 26)

S409E 16,4

Tabla 3. Efecto estabilizador de A392D

Variante

Mutacion ulterior en pMS1105 Actividad residual (%)

pMS1105 (SEQ ID NO: 27)

11,0

pMS1723 (SEQ I D NO: 28)

A392D 12,3

5 Tabla 4. Efecto estabilizador de S205L, S223A y S205L combinado con S409E

Variante

Mutacion ulterior en pMS1776 Actividad residual (%)

pMS1776 (SEQ ID NO: 12)

18,9

pMS2104 (SEQ ID NO: 29)

S223A 22,1

pMS2138 (SEQ I D NO: 30)

S205L 22,4

pMS2022 (SEQ ID NO: 15)

S205L, S409E 23,3

Tabla 5. Efecto estabilizador de N34Q y G100Q

Variante

Mutacion ulterior en pMS2124 Actividad residual (%)

pMS2124 (SEQ ID NO: 31)

24,7

pMS2177 (SEQ I D NO: 32)

N34Q 28,8

pMS2178 (SEQ I D NO: 33)

G100Q 26,4

Tabla 6. Efecto estabilizador de Q240E

Variante

Mutacion ulterior en pMS2022 Actividad residual (%)

pMS2022 (SEQ ID NO: 15)

23,3

pMS2118 (SEQ I D NO: 34)

Q240E 26,8

Ejemplo 10. Receta para los ensayos de horneado

Los ensayos de horneado fueron llevados a cabo con una receta de esponja (prefermento) y masa de pan blanco 10 estandar para el pan de tostada de Estados Unidos. La masa de esponja es preparada a partir de 1500 g de harina "Gold Medal" de General Mills, USA, 890 g de agua, 40 g de aceite de poroto de soja, 7,5 g de GRINDSTED™ SSL P55 Veg, 10 g de emulsionante DIMODAN™ PH300, 26 g de levadura seca y acido ascorbico (20 ppm de concentracion final). La esponja es mezclada durante 1 min a baja velocidad y subsiguientemente 3 min a velocidad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2 en un mezclador de espiral Hobart. La esponja es fermentada subsiguientemente durante 3 horas a 25 °C, 85% de HR.

Luego se agregan a la esponja 500 g de harina "Gold Medal", 14 g de levadura seca, 5 g de propionato de calcio, 240 g de jarabe de mafz alto en fructosa (42%), 5 g de propionato de calcio, 250 g de agua y acido ascorbico (30 ppm de concentracion final) y 40 g de sal. La masa resultante se mezcla durante 0,5 min a baja velocidad y luego durante 10,5 min a alta velocidad en un mezclador de espiral Hobart.

La masa se deja descansar durante 5 min a temperatura ambiente, y luego trozos de masa de 794 g son pesados, moldeados en un moldeador de grano cruzado y transferido a recipientes. Despues de 60 min de fermentacion a 43 °C a 80% HR las masas son horneadas durante 21 min a 200 °C en un horno de bandejas Reed.

Ejemplo 11. Protocolo para la evaluacion de la firmeza, la resistencia y la cohesividad

Analisis del perfil de textura del pan

La firmeza, la resistencia y la cohesividad son determinadas analizando rebanadas de pan por el Analisis de Perfil de Textura usando un Analizador de Textura de Stable Micro Systems, Reino Unido. El calculo de la firmeza, la resistencia, y la cohesividad se realiza de acuerdo con el estandar prefijado suministrado por Stable Micro System, Reino Unido. La sonda usada es redonda de aluminio de 50 mm.

La firmeza es determinada a 40% de compresion durante la primera compresion. La cifra es la fuerza requerida para comprimir la rebanada al 40% del espesor total. Cuanto mas bajo el valor, mas blando es el pan. La firmeza se expresa, por ejemplo, en gramos.

Ejemplo 12. Evaluacion de los efectos antiranciamiento de los polipeptidos variantes de amilasa G4

El pan fue horneado como se describio en el Ejemplo 10 con pMS1776, pMS1934, pMS2020, pMS2022 y pMS2062 en dosificaciones que variaban de 7,5 a 20 BMK/kg correspondientes a 7.500 a 20.000 unidades Betamyl/kg.

La firmeza del pan es testeada de acuerdo con el protocolo presentado en el Ejemplo 11 a diversos tiempos despues del horneado. Como controles, tambien se horneo pan horneado con dosificaciones estandar de 600 ppm de Novamyl 1500 y/o 416,66 ppm de una composicion que comprende la SEQ ID NO: 1.

Las Figs. 1 y 2 muestran los resultados de la firmeza. Con relacion a los controles con dosificaciones estandar de 600 ppm de Novamyl 1500 y/o 416,66 ppm de una composicion que comprende la SEQ ID NO: 1, se obtiene una reduccion mucho mas fuerte en la tasa de firmeza del dfa 3 al dfa 10 despues del horneado con pMS1776, pMS1934, pMS2020, pMS2022 y pMS2062. Estos panes tambien habfan mejorado mucho en cuanto a resistencia y la cohesividad con relacion a los controles.

Esto indica que los polipeptidos variantes, como se describio en la presente mejoraron mucho los efectos anti- enranciamiento en comparacion con Novamyl 1500 y una composicion que comprende la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 13. Protocolo para la evaluacion de la friabilidad (Resistencia a la friabilidad)

Dos rebanadas de pan son colocadas sobre un trozo de papel. Cada rebanada es dividida en 4 cuadrados mediante rupturas verticales y subsiguientemente horizontales de la rebanada.

La ruptura se realiza desmenuzando la miga con los dedos. Primero se separa la rebanada del centro de la superficie superior del pan al centro de la superficie inferior del pan. Luego, cada mitad de la rebanada original se separa del lado de la corteza al interior de la rebanada. Los pequenos trozos de miga, que son separados de los 4 cuadrados, son retirados agitando cada trozo al menos 3 veces moviendo la mano hacia arriba y hacia abajo.

El peso de los pequenos trozos de miga separados es determinado como una medida de la friabilidad. Este ensayo puede ser denominado "Protocolo de evaluacion de la friabilidad".

Ejemplo 14. Protocolo para la evaluacion de la capacidad de plegado

El pan para tostadas es cortado usando un cortador de pan automatico con un espesor de rebanada prefijado de 15 mm. La rebanada es plegada a mano desde la parte superior de la rebanada hacia la parte inferior, de tal modo que la direccion del pliegue es de lado a lado.

La capacidad de plegado es evaluada visualmente usando el siguiente sistema de puntuacion:

Resultado

Caractenstica

1

No plegable, la rebanada se rompe al plegar

2

Plegable, toda la rebanada se rompe dentro de 5 segundos despues del plegado

Resultado

Caractenstica

3

Plegable, parte de la rebanada se rompe dentro de 5 segundos despues del plegado. Otras partes se rompen despues.

4

Plegable, parte de la rebanada se rompe despues de 5 segundos despues del plegado. Otras partes no se rompen.

5

Plegable, ninguna parte de la rebanada se rompe despues del plegado.

Este ensayo puede ser denominado "Protocolo de evaluacion de la capacidad de plegado".

Ejemplo 15. Preparacion de jarabe DP4 Materiales:

SPEZYME FRED® licuado de almidon de mafz granular (34%ds, 9.1DE) tratado con alfa-amilasa bacteriana 5 (Danisco US Inc., Genencor Division).

Pululanasa (OPTIMAX L-1000, Danisco US Inc., Genencor Division)

Experimental:

Se ajusto el pH del licuado de almidon a 5,2 con NaOH y luego cada 100 g de licuado fue incubado a 60°C durante la sacarificacion con DP4 dosificando enzimas a 0,03 BMK/gds. Cuando se uso pululanasa, se dosifico a 0,5 10 ASPU/gds. La reaccion se llevo a cabo hasta 40 horas, se detuvo para el muestreo periodico para chequear el DP4 maximo. Cuando se observo el DP4 maximo, se detuvo la reaccion calentando en agua hirviendo.

Resultados:

Tabla 1.

Produccion (%)

Enzimas

Hs % DP1 % DP2 % DP3 % DP4 % DP5 % DP6 % DP7 % DP8 % DP9 % DP10 % DP11+

pMS2062

16 2,31 5,50 8,67 38,00 0,81 0,17 0,67 0,99 3,23 0,39 39,30

pMS2062+PU

2,42 5,70 8,99 38,12 1,06 0,19 0,85 1,29 4,10 1,06 36,20

pMS2062

19.5 2,49 5,73 9,03 39,86 0,63 0,00 0,51 0,83 2,62 0,38 37,90

pMS2062+PU

2,60 5,89 9,45 40,37 0,88 0,00 0,70 1,18 3,65 1,19 34,10

pMS2062

22 2,59 5,69 9,20 41,16 0,56 0,00 0,45 0,75 2,27 0,37 37,00

pMS2062+PU

2,81 5,95 9,91 41,96 0,78 0,00 0,58 1,02 3,30 1,26 32,40

pMS2062

40 3,41 6,32 10,47 43,76 0,24 0,12 0,16 0,87 0,30 0,20 34,10

pMS2062+PU

3,67 7,01 11,42 45,80 0,43 0,26 0,42 2,22 1,87 0,17 26,70

cn

o

Como se muestra en la Tabla 1, los resultados indicaron que PMS2062 produjo un DP4 como un producto de azucar principal. Como tambien se indico, la adicion de pululanasa (PU) (PMS2062 + PU) dio por resultado una reduccion mas rapida de los azucares superiores (ver, por ejemplo, DP11+), mientras que el nivel de DP4 fue afectado mmimamente.

5 Secuencias

SEQ ID NO: 1. Secuencia de protemas maduras de pMS382

DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPYNWYI1ILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGDKSGGGEGYFWHDF NKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDWPNHMNRFYPDKEINLPAGQRFWRNDCPDFGNGPNDCDDGDRFLGGEADLNTG HPQIYGMFRDEFTNLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKEPSEYPPWDWRNTASWQQIIKDWSDRA KCFVFDFALKERMQHGSVADWKHGLNGNFDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHKKTPLQDGLIRQAYAYILTSPGTPWY WPHMYDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSDLANPGQVASGSFSEAVHASMGQVRV WRSGSGDGGGHDGG

SEQ ID NO: 2. Protema madura de amilasa G4 de Pseudomonas sp. AM1 (2006) con M agregado en el extremo N (protema Q1EJP2):

1 MDLAGKSPGG VRYHGGDEII LQGFHKNVIR ESPNNWYNTL RDMAPTIAAD

51 GFSAIWMPVP WRDFSSWSDG ANSGGGEGYF WHDFNKNGRY GSDTQLKQAA

101 GALNNAQVECV LYDWPNHMN RGYPDKQINL PAGQGFWRIID CADPGNYPND

151 CDDGDRFMGG DADLNTANPQ VYGMFRDEFA NLRSNYGAGG FRFDFVRGYA

201 GERVDSWMGA AHD1IAFCVGE LWKAPAEYPS WDWRNTASWQ QVIKDWSDRA

251 KCPVFDFALK ERMQNGSIAD WKNGLNGNPD PRWREVAVTF VDNHDAGYSP

301 GQNGGQHHWA LQDGLIRQAY AYILTSPGTP WYWSHMYDW GYGDFIRQLI

351 QVRRTAGVRA DSAISFHSGY SGLVATVSGS QQTLWALNS DLAHPGQVAS

401 GSFSEAVNAS NGQVRVWRSG SGDGGGNDGG EGGLV1IVMFR CDNGVTQMGD

451 SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR

501 NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F*

10

SEQ ID NO: 3. Secuencia de ADN de nucleotido que codifica la amilasa G4 de Pseudomonas sp. AM1 (2006) (Q1EJP2) con M agregado en el extremo N (ADN de QlEJP2):

atggatctggcaggc&aat cacegggcggcgtt agat atcatggcggcgatgaaattattctgcaeLggctttcattggaatgt tattagagaatcaccgaataattggtataatacactgagagatatggcaccgacaattgcagcagatggcttttcagcaattt ggatgccggttccgtggagagatttttcatcatggtcagatggcgcaaattcaggcggcggcgaaggctatttttggcatgat tttaataaaaatggcagatatggctcagatacacaactgaaacaagcagcaggcgcactgaataatgcacaagttaaagttct gtatgatgttgttccgaatcatatgaatagaggctatccggataaacaaattaatctgccggcaggccaaggcttttggagaa atgattgcgcagatcGgggcaattatccgaatgattgcgatgatggcgatagatttatgggcggcgatgctgatctgaataca gcaaatccgcaagtttatggcatgtttagagatgaatttgcaaatctgagatcaaattatggcgcaggcggctttagatttga ttttgttagaggctatgcaggcgaaagagttgattcatggatgggcgcagcacatgataatgcattttgcgttggcgaactgt ggaaagcaccggcagaatatccgtcatgggattggagaaatacagcatcatggcaacaagttattaaagattggtcagataga gcaaaatgcccggtttttgattttgcactgaaagaaagaatgcaaaatggctcaattgcagattggaaaaatggcctgaatgg caatccggatccgagatggagagaagttgcagttacatttgttgataatcatgatgcaggctattcaccgggccaaaatggcg gccaacatcattgggcactgcaagatggcctgattagacaagcatatgcatatattctgacatcaccgggcacaccggttgtt tattggtcacatatgtatgattggggctatggcgattttattagacaactgattcaagttagaagaacagcaggcgttagagc agattcagcaattteatttcattcaggctattcaggcctggttgcaacagttteaggctcaeaacaaacactggttgttgcac tga.atagcga.tctggcaaatccgggccaagttgcatcaggctcattttcagaagcagttaatgcatcaaatggccaagttaga gtttggagatcaggctcaggcgatggcggcggcaatgatggcggcgaaggcggcctggttaatgttaattttagatgcgataa tggcgttacacaaatgggcgattcagtttatgcagttggcaatgtttcacaactgggcaattggtcaccggcatcagcagtta gactgacagatacatcatcatatccgacatggaaaggctcaattgcactgccggatggccaaaatgttgaatggaaatgcctg attagaaatgaagcagatgcaacactggttagacaatggcaatcaggcggcaataatcaagttcaagcagcagcaggcgcatc aacatcaggctcattttaa

SEQ ID NO: 4. Protema madura de amilasa G4 de Pseudomonas sp. 7193 con M agregado en el extremo N (protema A5CVD5):

1

51

101

151

201

251

301

351

401

451

501

MDLAGK5PGG

GFSAIWMPVP

GALNNAQVKV

CDDGDRFMGG

GERVDSWMGD

KVPGCSNFAL

SPGQNGGQHH

LIQIRRAAGV

SSGSFSQALN

PGDSVYAVGS

IVRSEADPTQ

VRYHGGDEII

WRDFSSWSDG

LYDAVPNHMN

DADLNTANPQ

GACQRLLRGR

KGAHAERLPS

WALRDDLVRQ

RADSAIEFHS

QDSGQLRIWT

LAQLGSWSPA

VRQWQAGDNI4

LQGFHWNVIR

ANSGGGEGYF

RGYPDKQINL

VYGMFRDEFA

ALEGTGRIPE

PTGRTASTAT

AYAYILASPG

GYSGLVATVR

TGSIGGDEGD

MAVRLTDVSN

RVTAGAGATT

ESPNNWYHTL WHDFNKKGRY PAG QGFWR1JD NLRSNYGAGG LGLAQYGQLA PMPRWREVAU TPVVYHSHMY GTAQTLVMAL GGGDGTMVSV YPTWKGAISL IGRL*

RDMAPTIAAD

GSDTQLKQAA

CADPGNYPMD

FRFDFVRGYA

AVIKDWSDRA

TFVDNHDTGY

DHGHGPLIRQ

GSWLSSPAEV

NFRCD14GITQ

PAGQAVEWKC

SEQ ID NO: 5. Secuencia de ADN de nucleotido que codifica la amilasa G4 de Pseudomonas sp. 7193 (A5CVD5) 5 con M agregado en el extremo N (A5CVD5 DNA):

atggatctggcaggc&aatcaccgggcggcgttagatatcatggcggcgatgaaattat tctgca&ggctttcattggaatgt tattagagaatcaccgaataattggtataatacactgagagatatggcaccgacaattgcagcagatggcttttcagcaattt ggatgccggttccgtggagagatttttcatcatggtcagatggcgcaaattcaggcggcggcgaaggctatttttggcatgat tttaataaaaatggcagatatggctcagatacacaactgaaacaagcagcaggcgcactgaataatgcacaagttaaagttct gtatgatgcagttccgaatcatatgaatagaggctatccggataaacaaattaatctgccggcaggccaaggcttttggagaa atgattgcgcagatccgggcaattatccgaatgattgcgatgatggcgatagatttatgggcggcgatgctgatctgaataca gcaaatccgcaagtttatggcatgtttagagatgaatttgcaaatctgagatcaaattatggcgcaggcggctttagatttga ttttgttagaggctatgcaggcgaaagagttgattcatggatgggcgatggcgcatgccaaagactgctgagaggcagagcac tggaaggcacaggcagaattccggaactgggcctggcacaatatggccaactggcagcagttattaaagattggtcagataga gcaaaagttccgggctgctcaaattttgcactgaaaggcgcacatgcagaaagactgccgtcaccgacaggcagaacagcatc aacagcaa.caccgatgccgagatggagag&agttgcagttaca.tttgttgataatc&tgatacaggctattcaccgggcca.&a atggcggccaacatcattgggcactgagagatgatctggttagacaagcatatgcatatattctggcatcaccgggcacaccg gttgtttattggtcacatatgtatgattggggtcatggaccgctgattagacaactgattcaaattagaagagcagcaggcgt tagagcagattcagcaattgaatttcattcaggctattcaggcctggttgcaacagttagaggcacagcacaaacactggtta tggcactgggetcaaatctgtcatcaccggcagaagtttcatcaggctcattttcacaagcactgaatcaagattcaggccaa ctgagaatttggacaacaggctcaacaggcggcgatgaaggcgatggcggcggcgatggcacaatggtttcagttaattttag atgegataatggeattacacaaccgggcgattcagtttatgcagttggctcactggcacaactgggetcatggtcaccggcaa atgeagttagactgacagatgtttcaaattatccgacatggaaaggcgcaatttcactgccggcaggccaagcagttgaatgg aaatgcattgttagatcagaagcagatccgacacaagttagacaatggcaagcaggcgataataatagagttacagcaggcgc aggcgcaacaacaattggcagactgtaa

SEQ ID NO: 6. Protema madura de amilasa G4 de Pseudomonas mendocina (cepa ymp) con M agregado en el extremo N (protema A4XX23):

1 MDAPGKTA3G VRYHGGDEII LQGFHWNTVR TSSNWYATLA

51 FSAIWMPVPW RDFSSWSDPG NGTSGGGEGY FHHDFNKMGR

101 ASALNAAGVK PIYDVVPNHM NRGYPDKEIN LPAGQGLWRH

151 DCDDGDRFMG GDADLNTGHP QNYAMFRDEF ARLRSQYGAG

201 AGERVASWMS DAHDMGFCLG ELWKAPGEYP SWDWRMGASW

251 AKCTVFDFAL KERMQHGGIA DWRHGLHGNP DARWREVAVT

301 PGPHGGQHHW PLPDARLKQA YAYILSSPGT PWYHPHMYD

351 IQIRRAAGVK AASAIQFHTG FSGLVATISG SQQQLLIALD

401 SGDFIQALWT DLIGAIRIWRS GQGGGDGQGH LVSVNFRCDH

451 ALGNVTQLGN WSPAGAVRLT DTSAYPTWKG SIALPAGQQV

501 MPTQVKTWQP GGMHSVTVAS GASTAGSF*

SMAPTLAADG

YGSDSLLRQA

DCNDPGNYAN

GFRFDFVRGY

QQILKDWSDR

FVDNHDTGYS

WGHGDFIRQL

SNLSSPGQVA

GVTQWGDSVY

QWKCIVRSES

5

SEQ ID NO: 7. Secuencia de ADN de nucleotido que codifica la amilasa G4 de Pseudomonas mendocina (cepa ymp) (A4XX23) con M agregado en el extremo N: (a4xX23 DNA):

atggatgcaccgggcaaaacagcatcaggcgttagatatcatggcggcgatgaaattattctgcaaggctttcattggaatac agttagaacatcatcaaattggtatgcaacactggcatcaatggcaccgacactggcagcagatggcttttcagcaatttgga tgccggttccgtggagagatttttcatcatggtcagatccgggcaatggcacatcaggcggcggcgaaggctatttttggcat gattttaataaaaatggcagatatggctcagattcactgctgagacaagcagcatcagcactgaatgcagcaggcgttaaacc gatttatgatgttgttccgaatcatatgaatagaggctatccggataaagaaattaatctgccggcaggccaaggcctgtgga gacatgattgcaatgatccgggcaattatgcaaatgattgcgatgatggcgatagatttatgggcggcgatgctgatctgaat acaggccatccgcaaaattatgcaatgtttagagatgaatttgcaagactgagatcacaatatggcgcaggcggctttagatt tgattttgttagaggctatgcaggcgaaagagttgcatcatggatgtcagatgcacatgataatggcttttgcctgggcgaac tgtggaaagcaccgggcgaatatccgtcatgggattggagaaatggcgcatcatggcaacaaattctgaaagattggtcagat agagcaaaatgcacagtttttgattttgcactgaaagaaagaatgcaaaatggcggcattgcagattggagacatggcctgaa tggcaatccggatgcaagatggagagaagttgcagttacatttgttgataatcatgatacaggctattcaccgggcccgcatg gcggccaacatcattggccgctgccggatgcaagactgaaacaagcatatgcatatattctgtcatcaccgggcacaccggtt gtttattggccgcatatgtatgattggggtcatggagattttatt agacaactgattcaaattagaagagcagcaggcgttaa agcagcatcagcaattcaattteatacaggcttttcaggcctggttgcaacaatttcaggctcacaacaacaactgctgattg cactggattcaaatctgtcatcaccgggccaagttgcatcaggcgattttacacaagcactgaatacagataatggcgcaatt agaat ttggagat caggccaaggcggcggcgat ggcc aaggcaat ct ggttt c agtt aat ttt agat gcgataat ggcgt tac acaatggggcgattcagtttatgcactgggcaatgttacacaactgggcaattggtcaccggcaggcgcagttagactgacag atacatcagcatatccgacatggaaaggctcaattgcactgccggcaggccaacaagttcaatggaaatgcattgttagatca gaatcaaatccgacacaagttaaaacatggcaaccgggcggcaataattcagttacagttgcatcaggcgcatcaacagcagg ctcattttaa

SEQ ID NO: 8. Protema madura de amilasa G4 de Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396) con M agregado en el extremo N (protema Q2SEA8):

1 MESSGKSGAG VRFHGGDEII LQGFHWNWR TAERNWYNIL QSKAQQISED

51 GFTAIWMPVP WRDNSSWQAS SDTRFGGEGY FWADMDKNSR YGDDGQLKQA

101 ASALKNKGVK VIYDIVPHHH DRGHSHDSLN LPSGQGYYRS DCSSCDDGDP

151 FMDGGSDF3T AHPDVYDLFK MELVNLKTNY SAGGFRFDFV RGYAPERISA

201 WMSASLDSGY CVGELWKGPS EYPSWDWRHS ASWQEILKDF TDASDCSVFD

251 FALKERMQNG SISDWRYGLM GHPSAQWREV AVTFVDNHDT GYSPGPLGGQ

301 HHWALPDWKR KMAYAYILSS PGTPWYWPH MYDWGMRDFI RNLIQLRKSA

351 GVKAYSGVQF HDGFSGLVGT TSGSNGKLLF AIDSNFSSPW QVAGGAWHLA

401 VNEDNGRIRI WRQ*

SEQ ID NO: 9. Secuencia de ADN de nucleotido que codifica la amilasa G4 de Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396) con M agregado en el extremo N (ADN de Q2SEA8):

atggaatcatcaggcaaatcaggcgcaggcgttagatttcatggcggcgatgaaattattctgcaaggctttcattggaacgt tgttagaacagcagaaagaaactggtacaacatcctgcaatcaaaagcacaacaaatttcagaagatggctttacagcaattt ggatgccggttccgtggagagat aattcatcatggcaagcatcatcagatacaagatttggcggcgaaggctatttttgggca gatatggataaaaattcaagatatggcgatgatggccaactgaaacaagcagcatcagcactgaaaaataaaggcgttaaagt tatttatgatattgttccgaatcatcatgatagaggccattcaaatgattcactgaatctgccgtcaggccaaggctattata gatcagattgetcatcatgcgatgatggcgatccgtttatggatggcggctcagatttttcaacagcacatccggatgtttac gatctgtttaaaaacgaactggttaacctgaaaacaaactactcagcaggcggctttagatttgattttgttagaggctatgc accggaaagaatttcagcatggatgtcagcatcactggattcaggctattgcgttggcgaactgtggaaaggcccgtcagaat atccgteatgggattggagacattcagcateatggcaagaaattctgaaagattttacagatgcatcagattgctcagttttt gattttgcactgaaagaaagaatgcaaaatggctcaatttcagattggagatatggcctgaatggcaatccgtcagcacaatg gagagaagttgcagttacatttgttgataatcatgatacaggctattcaccgggcccgctgggcggccaacatcattgggcac tgccggattggaaaagaaaaatggcatatgcatatattctgtcatcaccgggcacaccggttgtttattggccgcatatgtat gattggggcatgagagattttattaga.aatctga.ttcaactgaga.aaatca.gc aggcgttaaagcatattcaggcgttcaatt tcatgatggcttttcaggcctggttggcacaacatcaggctcaaatggcaaactgctgtttgcaattgattcaaattttteat caccgaatcaagttgcaggcggcgcatggaatctggcagttaatgaagataatggcagaattagaatttggagacaataa

SEQ ID NO: 10. >gi|77787|pir| |S05667 protema madura glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolasa (EC 3.2.1.60) sin la secuencia senal - Pseudomonas saccharophila

DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDWYHILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGEGYFWHDF NKMGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDWPNHMNRGYPDKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPMDCDDGDRFIGGESDLNTG HPQIYGMFRDELANLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRA KCPVFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPWY WSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRV WRSGSGDGGGNDGGEGGLVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPASAVRLTDTSSYPTWKGSIALPDGQNVEWKCLI RHEADATLVRQWQSGGNHQVQAAAGAS TSG3F

SEQ ID NO: 11. Peptido senal de glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolasa (EC 3.2.1.60) - Pseudomonas saccharophila 5 MSHILRAAVLAAVLLPFPALA

SEQ ID NO: 12. Secuencia de protemas maduras de pMS1776

1 31 101 151 201 231 3C1 251 '101

DQAGKSPAGV

F5AIWMRVPW

ALGGAGVKVL

DDGDRFLGGE

ERVDSWMSD3

CPVFDFALKE

QNGGQHKWPL

VRRTAGVRAD

SFSEAVNASN

RYHGGDEIIL

RDFSSWTDGD

YDWPNHHMR

ADLHTGHPQT

ADSEFCVGEL

RMQHGSVADW

PDGLIRQAYA

SAISFHSGYS

GQVRVWRSGS

QGFHWt IWRE KSGGGEGYFW FYPDKEIMLP YGMFRDEFTH WKSPSEYPPW KHGLNGHFDF YILTSPGTPV GLVATVSGSQ GDGGG1IDGG*

A?Y1 IHYMILR HDFMKMGLYG AGQRFWRMDC LRSGYGAGGF DWRNRASWQQ RWREVAVTFV VYWPHMYDWG QTLWALMSD

SEQ ID NO: 13. Secuencia de protemas maduras de pMS1934

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYHILR

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFMKNGLYG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEIMLP AGQRFWRMDC

151 DDGDRFLGGE ADLMTGHPQI YGMFRDEFTH LRSGYGAGGF

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQQ

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KDGLNGNPDP RWREVAVTFV

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALMSD

401 SFSEAVNASH GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

QKASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGHGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LDNPGQVASG

QKASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGHGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LDNPGQVASG

10 SEQ ID NO: 14 Secuencia de protemas maduras de pMS2020

DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFMKNGLYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDWPHHMNR FYPDKEIMLP AGQRFWRMDC PDPGHGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLMTGHPQI YGMFRDEFTH LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQHGSVADW KHGLNGHPDF RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

3 51 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALMSD LDNPGQVASG

401 SFSEAVHAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 15 Secuencia de protemas maduras de pMS2022

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYHILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKHGLYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEIMLP AGQRFWRMDC PDPGHGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLMTGHPQI YGMFRDEFTH LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQHGSVADW KHGLNGNFDF RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

3 51 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LDNPGQVASG

401 SFSEAVHAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LDNPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 17 Secuencia de protemas maduras de pMS2171

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEI IL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKAPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LDNPGQVASG

401 SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

5 SEQ ID NO: 18 Secuencia de protemas maduras de pMS465:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEI IL QGFHWNWRE APYNWYNILR QQASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 19 Secuencia de protemas maduras de pMS1042:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEI IL QGFHWNWRE APYNWYNILR QQASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 20 Secuencia de protemas maduras de pMS1104:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEI IL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

l

51

101

151

201

251

301

351

401

DQAGKSPAGV

FSAIWMPVPW

ALGGAGVKVL

DDGDRFLGGE

ERVDSWMSDS

CPVFDFALKE

QNGGQHKWPL

VRRTAGVRAD

SFSEAVNASN

RYHGGDEIIL RDFSSWTDGD YDVVPNHMNR ADLNTGHPQI ADSSFCVGEL RMQNGSVADW QDGLIRQAYA SAISFHSGYS GQVRVWRSGS

QGFHWNWRE

KSGGGEGYFW

FYPDKEINLP

YGMFRDEFTN

WKEPSEYPPW

KHGLNGNPDP

YILTSPGTPV

GLVATVSGSQ

GDGGGNDGG*

APYNWYNILR

HDFNKNGLYG

AGQRFWRNDC

LRSGYGAGGF

DWRNTASWQQ

RWREVAVTFV

VYWPHMYDWG

QTLWALNSD

QQASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGNGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LANPGQVASG

SEQ ID NO: 22 Secuencia de protemas maduras de pMS1286:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QQASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

5 SEQ ID NO: 23 Secuencia de protemas maduras de pMS1284:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QQASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 24 Secuencia de protemas maduras de pMS1290:

l

51

101

151

201

251

301

351

401

DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL CPVFDFALKE RMQNGSVADW QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA VRRTAGVRAD SAISFHSGYS SFSEAVNASN GQVRVWRSGS

QGFHWNWRE APYNWYNILR KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG FYPDKEINLP AGQRFWRNDC YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF WKEPSEYPPW DWRNRASWQQ KHGLNGNPDP RWREVAVTFV YILTSPGTPV VYWPHMYDWG GLVATVSGSQ QTLWALNSD GDGGGNDGG*

QQASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGNGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LANPGQVASG

SEQ ID NO: 25 Secuencia de protemas maduras de pMS1484:

1

DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL

51

FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD

101

ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR

151

DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI

QGFHWNWRE APYNWYNILR QQASTIAADG KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKEPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK 251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG 301 QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ 351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG 401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

l

51

101

151

201

251

301

351

401

DQAGKSPAGV

FSAIWMPVPW

ALGGAGVKVL

DDGDRFLGGE

ERVDSWMSDS

CPVFDFALKE

QNGGQHKWPL

VRRTAGVRAD

SFSEAVNAEN

RYHGGDEIIL RDFSSWTDGD YDVVPNHMNR ADLNTGHPQI ADSSFCVGEL RMQNGSVADW QDGLIRQAYA SAISFHSGYS GQVRVWRSGS

QGFHWNWRE

KSGGGEGYFW

FYPDKEINLP

YGMFRDEFTN

WKEPSEYPPW

KHGLNGNPDP

YILTSPGTPV

GLVATVSGSQ

GDGGGNDGG*

APYNWYNILR

HDFNKNGRYG

AGQRFWRNDC

LRSGYGAGGF

DWRNTASWQQ

RWREVAVTFV

VYWPHMYDWG

QTLWALNSD

QQASTIAADG SDAQLRQAAG PDPGNGPNDC RFDFVRGYAP IIKDWSDRAK DNHDTGYSPG YGDFIRQLIQ LANPGQVASG

SEQ ID NO: 27 Secuencia de protemas maduras de pMS1105:

l

51

101

151

201

251

301

351

401

DQAGKSPAGV RYHGGDEI IL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

5 SEQ ID NO: 28 Secuencia de protemas maduras de pMS1723:

l

51

101

151

201

251

301

351

401

DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNTASWQQ IIKDWSDRAK CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG QNGGQHKWPL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LDNPGQVASG SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 29 Secuencia de protemas maduras de pMS2104:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKAPSEYPPW DWRNRASWQQ IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LDNPGQVASG

401 SFSEAVNASN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 30 Secuencia de protemas maduras de pMS2138:

l

51

101

151

201

251

301

351

DQAGKSPAGV

FSAIWMPVPW

ALGGAGVKVL

DDGDRFLGGE

ERVDLWMSDS

CPVFDFALKE

QNGGQHKWPL

VRRTAGVRAD

SFSEAVNASN

RYHGGDEIIL

RDFSSWTDGD

YDVVPNHMNR

ADLNTGHPQI

ADSSFCVGEL

RMQNGSVADW

PDGLIRQAYA

SAISFHSGYS

GQVRVWRSGS

QGFHWNWRE

KSGGGEGYFW

FYPDKEINLP

YGMFRDEFTN

WKSPSEYPPW

KHGLNGNPDP

YILTSPGTPV

GLVATVSGSQ

GDGGGNDGG*

APYNWYNILR

HDFNKNGLYG

AGQRFWRNDC

LRSGYGAGGF

DWRNRASWQQ

RWREVAVTFV

VYWPHMYDWG

QTLWALNSD

QKASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGNGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LDNPGQVASG

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR QKASTIAADG

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG SDAQLRQAAG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC PDPGNGPNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP

201 ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE IIKDWSDRAK

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG YGDFIRQLIQ

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LDNPGQVASG

401 SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

SEQ ID NO: 32 Secuencia de protemas maduras de pMS2177:

l

51

101

151

201

251

301

351

401

DQAGKSPAGV

FSAIWMPVPW

ALGGAGVKVL

DDGDRFLGGE

ERVDLWMSDS

CPVFDFALKE

QNGGQHKWPL

VRRTAGVRAD

SFSEAVNAEN

RYHGGDEIIL

RDFSSWTDGD

YDVVPNHMNR

ADLNTGHPQI

ADSSFCVGEL

RMQNGSVADW

PDGLIRQAYA

SAISFHSGYS

GQVRVWRSGS

QGFHWNWRE

KSGGGEGYFW

FYPDKEINLP

YGMFRDEFTN

WKKPSEYPPW

KHGLNGNPDP

YILTSPGTPV

GLVATVSGSQ

GDGGGNDGG*

APYQWYNILR

HDFNKNGLYG

AGQRFWRNDC

LRSGYGAGGF

DWRNRASWQE

RWREVAVTFV

VYWPHMYDWG

QTLWALNSD

QKASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGNGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LDNPGQVASG

5 SEQ ID NO: 33 Secuencia de protemas maduras de pMS2178:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF

201 ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKKPSEYPPW DWRNRASWQE

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD

401 SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

QKASTIAADG

SDAQLRQAAQ

PDPGNGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LDNPGQVASG

SEQ ID NO: 34 Secuencia de protemas maduras de pMS2118:

1 DQAGKSPAGV RYHGGDEIIL QGFHWNWRE APYNWYNILR

51 FSAIWMPVPW RDFSSWTDGD KSGGGEGYFW HDFNKNGLYG

101 ALGGAGVKVL YDVVPNHMNR FYPDKEINLP AGQRFWRNDC

151 DDGDRFLGGE ADLNTGHPQI YGMFRDEFTN LRSGYGAGGF

201 ERVDLWMSDS ADSSFCVGEL WKSPSEYPPW DWRNRASWQE

251 CPVFDFALKE RMQNGSVADW KHGLNGNPDP RWREVAVTFV

301 QNGGQHKWPL PDGLIRQAYA YILTSPGTPV VYWPHMYDWG

351 VRRTAGVRAD SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD

401 SFSEAVNAEN GQVRVWRSGS GDGGGNDGG*

QKASTIAADG

SDAQLRQAAG

PDPGNGPNDC

RFDFVRGYAP

IIKDWSDRAK

DNHDTGYSPG

YGDFIRQLIQ

LDNPGQVASG

SEQ ID NO: 35. Secuencia Enlazadora

10 GSGDGGGNDGG

SEQ ID NO: 36: Secuencia de PS4 SBD:

1 EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT

51 WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS

101 F*

SEQ ID NO: 37

HGGDEIILQFHWN

SEQ ID NO: 38

DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD-X4-SSW

SEQ ID NO: 39 GGEGYFW

5

10

15

20

25

SEQ ID NO: 40 VPNH

SEQ ID NO: 41

CDDGD

SEQ ID NO: 42

AGGFRFDFVRG

SEQ ID NO: 43

FALK

SEQ ID NO: 44

WREVAVTFVDNHD

SEQ ID NO: 45

GYSPG

SEQ ID NO: 46

GQH

SEQ ID NO: 47 AYAYI

SEQ ID NO: 48 SPGTP

SEQ ID NO: 49 VYW

SEQ ID NO: 50 HMYDWG

SEQ ID NO: 51: Novamyl:

SSSASVKGDVIYQIIIDRFYDGDTTNNNPAKSYGLYDPTKSKWKMYWGGDLEGVRQKLPYLKQLGVTTIWLSPVLDNLDTLAG TDNTGYHGYWTRDFKQIEEHFGNWTTFDTLVNDAHQNGIKVIVDFVPNHSTPFKANDSTFAEGGALYNNGTYMGNYFDDATKG YFHHNGDISNWDDRYEAQWKNFTDPAGFSLADLSQENGTIAQYLTDAAVQLVAHGADGLRIDAVKHFNSGFSKSLADKLYQKK DIFLVGEWYGDDPGTANHLEKVRYANNSGVNVLDFDLNTVIRNVFGTFTQTMYDLNNMVNQTGNEYKYKENLITFIDNHDMSR FLSVNSNKANLHQALAFILTSRGTPSIYYGTEQYMAGGNDPYNRGMMPAFDTTTTAFKEVSTLAGLRRNNAAIQYGTTTQRWI NNDVYIYERKFFNDVVLVAINRNTQSSYSISGLQTALPNGSYADYLSGLLGGNGISVSNGSVASFTLAPGAVSVWQYSTSASA PQIGSVAPNMGIPGNWTIDGKGFGTTQGTVTFGGVTATVKSWTSNRIEVYVPNMAAGLTDVKVTAGGVSSNLYSYNILSGTQ TSVVFTVKSAPPTNLGDKIYLTGNIPELGNWSTDTSGAVNNAQGPLLAPNYPDWFYVFSVPAGKTIQFKFFIKRADGTIQWEN GSNHVATTPTGATGNITVTWQN

Claims (23)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   1. Un polipeptido que tiene actividad amilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 78 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 235 con referencia a la numeracion de la posicion de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1, dicho polipeptido tiene una mayor termoestabilidad cuando se compara con la SEQ ID NO: 1.
2. 2. El polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 235, 88, 205, 240, 248, 266, 311, 377 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D o 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.
3. 3. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el polipeptido comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en las siguientes posiciones: 235, 88, 205, 240, 311 o 409 y/o una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/N/I/H/F, 272D o 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.
4. 4. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polipeptido comprende sustituciones de aminoacidos al menos en cuatro, cinco o en todas las siguientes posiciones: 88, 205, 235, 240, 311 o 409 y/o tiene al menos una o dos de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 42K/N/I/H/F, 272D o 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.
5. 5. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el polipeptido comprende ademas una o mas de los siguientes aminoacidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146g, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E/S/K/A, 229P, 307K, 309P y 334P.
6. 6. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el polipeptido tiene al menos cuatro, cinco, seis, siete u ocho de los siguientes aminoacidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D o 409E.
7. 7. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 223A/K/S.
8. 8. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que tiene al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.
9. 9. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 88.
10. 10. El polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 88L.
11. 11. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el polipeptido tiene el aminoacido 235R.
12. 12. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el polipeptido comprende ademas una o mas de los siguientes aminoacidos 121F, 134R, 141P, 229P o 307K.
13. 13. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.
14. 14. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que tiene un ligador fusionado en el extremo C.
15. 15. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 que tiene exoactividad amilasa.
16. 16. El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15 que tiene exoactividad amilasa no maltogenica.
17. 17. Un acido nucleico capaz de codificar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
18. 18. Un vector de expresion vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 17, o capaz de expresar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
19. 19. Un plasmido que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 17.
20. 20. Una celula huesped que comprende, preferentemente transformada con, un plasmido de acuerdo con la reivindicacion 19 o un vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 18.
21. 21. Uso de un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 como un aditivo de alimentos o de piensos.
22. 22. Un metodo de preparacion de un jarabe de sacarido, que comprende agregar un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 a un licuado de almidon granular para formar el jarabe de sacarido.

    5 23. Un producto alimenticio que comprende un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1
23. 16.