CN101365349A - 用于产生酱油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用包含糖类结合模块的淀粉分解酶的用于产生酱油的方法。

Description

用于产生酱油的方法
技术领域
本发明涉及使用包含糖类结合模块(carbohydrate binding module)的淀粉分解酶产生酱油的方法。
发明背景
酱油产生自大豆和任选的其它植物成分例如小麦和稻。在该过程中，期望将淀粉和其它糖类降解成能被用于发酵的微生物所利用的糖，作为形成芳香化合物(aroma compound)的底物和能量源。常规通过由曲发酵(kojifermentation)期间使用的发酵剂(culture)产生的淀粉分解酶来实现淀粉的分解。淀粉水解的效率对于酱油的生产是重要的。
发明概述
发明人发现在相关的酱油生产条件下，与不含糖类结合模块(CBM)的淀粉分解酶相比，使用包含CBM的淀粉分解酶使淀粉水解的速率增加。
因此，本发明涉及用于产生酱油的方法，其包括：i)使用淀粉分解酶处理植物材料；和ii)从处理的植物材料产生酱油；其中所述淀粉分解酶包含糖类结合模块。在进一步的方面，本发明涉及包含糖类结合模块的淀粉分解酶用于产生酱油的用途，和通过本发明的方法可以获得的酱油。
发明详述
酶
在本发明的方法中使用的酶是包含糖类结合模块(CBM)的淀粉分解酶。淀粉分解酶是能够降解淀粉和相关寡糖和多糖的酶。优选的淀粉分解酶是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、产麦芽α-淀粉酶(maltogenicalpha-amylase)(EC 3.2.1.133)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。EC(EnzymeCommission；酶学委员会)号指国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Unionof Biochemistry andMolecular Biology)(IUBMB)的酶定义。
糖类结合模块(CBM)，或者通常称为糖类结合域(CBD)，是优先与多糖或寡糖(糖类)结合，通常(但并非必然唯一地)与它们不溶于水的(包括结晶)形式结合的多肽氨基酸序列。
源自淀粉降解酶的CBM通常指淀粉结合模块或SBM(可出现在特定淀粉分解酶如特定葡糖淀粉酶中的CBM，或可出现在酶如环糊精葡聚糖转移酶或内淀粉酶中的CBM)。SBM通常称为SBD(Starch Binding Domains；淀粉结合域)。对于本发明优选的是其为淀粉结合模块的CBM。
发现CBM是在由两个或更多个多肽氨基酸序列区组成的大多肽或大蛋白的整合部分(integral part)，特别是在通常包含催化模块和糖类结合模块(CBM)的水解酶(hydrolytic enzyme)(水解酶(hydrolase))中，所述催化模块含有用于底物水解的活性位点，而所述糖类结合模块用于结合至所述的糖类底物。这些酶可包含多于一个催化模块和一个、两个或三个CBM，并且任选地进一步包含一个或多个将CBM与催化模块连接的多肽氨基酸序列区，后一种类型的区通常被表示为“接头”。已经在藻类中发现了CBM，例如在红藻紫红紫菜(Porphyra purpurea)中发现了非水解多糖结合蛋白(non-hydrolyticpolysaccharide-binding)形式的CBM。
在存在CBM的蛋白/多肽(例如，酶，通常为水解酶)中，CBM可以位于N末端或C末端，或位于内部位置。
构成CBM本身的多肽或蛋白的部分通常由多于大约30个并且少于大约250个氨基酸残基组成。
将本发明上下文中的“家族20的糖类结合模块”或CBM-20模块定义为与Joergensen et al(1997)in Biotechnol.Lett.19：1027-1031的图1中公开的多肽的糖类结合模块具有至少45％同一性的大约100个氨基酸的序列。所述CBM包含该多肽的后102个氨基酸，即从氨基酸582至氨基酸683的亚序列。在本公开中应用的糖苷水解酶家族的编号遵循Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)CAZy-Carbohydrate-Active Enzymes server(糖类-活性酶服务器)在URL：http://afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html或者Coutinho，P.M.&Henrissat，B.1999；The modular structure of cellulases and othercarbohydrate-active enzymes：an integrated database approach.In″Genetics，Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation″，K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita and T.Kimura eds.，Uni Publishers Co.，Tokyo，pp.15-23，and Bourne，Y.& Henrissat，B.2001；Glycoside hydrolases andglycosyltransferases：families and functional modules，Current Opinion inStructural Biology 11：593-600的概念。
包含适合用于本发明上下文的CBM的酶的实例是内淀粉酶(即EC 3.2.1.1中的α-淀粉酶)、产麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)和CGT酶(EC 2.4.1.19)。
包含根据本发明的CBM的淀粉分解酶可以是天然包含CBM的野生型酶，或者它可以是重组酶。在本发明的一个实施方式中，包含CBM的淀粉分解酶是杂合酶，其包含具有淀粉分解活性的催化模块的氨基酸序列和糖类结合模块的氨基酸序列。
对于本发明优选的是糖类结合模块家族20的CBM。适合于本发明的糖类结合模块家族20的CBM可以源自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的β-淀粉酶(SWISSPROT P36924)，或源自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的CGT酶(SWISSPROT P43379)。对于本发明还优选的是与前述CBM氨基酸序列中的任一具有至少60％，至少70％，至少80％或甚至至少90％同一性的任何CBM。糖类结合模块家族20中其它合适的CBM可以见于URL：http://afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html。
一旦作为cDNA或染色体DNA的形式鉴定了编码底物结合(糖类结合)区的核苷酸序列，其后可以多种方式对其进行操作以将其融合至编码感兴趣的酶活性的DNA序列。其后用接头或不用接头将编码糖类结合氨基酸序列的DNA片段与编码感兴趣的酶的DNA连接。之后可以将所得连接的DNA以多种方式操作来实现表达。
源自细菌的CBM将通常适合用于本发明的上下文中，然而，优选的是芽孢杆菌属(Bacillus)来源的CBM，例如来自黄热芽孢杆菌(Bacillusflavothermus)(同物异名Anoxybacillus contaminans)的CBM20，优选来自淀粉酶AMY1048(WO 2005/003311的SEQ ID NO:2)、AMY1039或AMY1079(分别作为WO 2005/001064中的SEQ ID NO1、2和3公开)、来自Diversa的WO 2002068589中公开的芽孢杆菌属淀粉酶、芽孢杆菌属菌种TS23(Korea)(Lin，L.-L.；(1995年3月1日)提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库。Long-LiuLin，Food Industry Research Institute，Culture Collection and Research Center，331 Food Road，Hsinchu，Taiwan 300，Republic of China)。
本文所指的杂合酶或遗传修饰的野生型酶包括以下种类，所述种类包含α-淀粉分解酶(EC3.2.1.1)的氨基酸序列，其与包含糖类结合模块(CBM)的氨基酸序列连接(即共价结合)。
含有CBM的杂合酶，以及对其制备和纯化的详细描述是本领域已知的[参见，例如WO 90/00609、WO 94/24158和WO 95/16782，以及Greenwood etal.Biotechnology and Bioengineering 44(1994)pp.1295-1305]。例如可以通过如下方法来制备它们：将DNA构建体转化入宿主细胞，所述DNA构建体至少包含通过或不通过接头与编码感兴趣的酶的DNA序列连接的编码糖类结合模块的DNA的片段，并且培养转化的宿主细胞以表达融合的基因。在本领域中通常将所得重组产物(杂合酶)称为“融合蛋白”，可以通过如下通式来描述：
A-CBM-MR-X
在后面的通式中，A-CBM是至少包含糖类结合模块(CBM)本身的氨基酸序列的N-末端或C-末端区。MR是中间区(“接头”)，并且X是由编码与CBM连接的酶(或其它蛋白质)的DNA序列所编码的多肽的氨基酸残基序列。
可以不存在部分A(由此A-CBM为CBM本身，即不包含构成CBM的氨基酸残基之外的氨基酸残基)，或者部分A可以是一个或多个氨基酸残基的序列(作为CBM本身的末端延伸发挥功能)。接头(MR)可以是键，或是包含大约2至大约100个碳原子，尤其是2至40个碳原子的短连接基团。然而，MR优选是大约2至大约100个氨基酸残基，更优选是2至40个氨基酸残基，例如2至15个氨基酸残基的序列。
部分X可以构成完整杂合酶的N-末端或C-末端区。
因此从上文中显而易见的是，在所讨论类型的杂合酶中CBM可以位于该杂合酶的C-末端、N-末端或内部。
在优选的实施方式中，包含根据本发明的CBM的淀粉分解酶是包含淀粉结合域的α-淀粉酶，例如包含淀粉结合域并且针对生淀粉具有活性的酸性α-淀粉酶。适合用于本发明的包含淀粉结合域的α-淀粉酶可以是杂合酶，或所述多肽可以是已经包含具有α-淀粉酶活性的催化模块和淀粉结合域的野生型酶。在本发明的方法中使用的多肽还可以是这种野生型酶的变体。合适的包含淀粉结合域的α-淀粉酶在WO2005003311A2中公开。优选的是具有WO2006/066579中公开为SEQ ID NO:2、S“：Q ID NO：3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的淀粉酶，或具有WO 2006/066596中公开为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的淀粉酶，或任何具有α-淀粉酶活性并且包含淀粉结合域的多肽，所述多肽具有的氨基酸序列与前述氨基酸序列中任一具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少95％同一性。
在具体的实施方式中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)菌株的α-淀粉酶。
在本发明的方法中，包含CBM的淀粉分解酶可以是经纯化的(purified)。术语“经纯化的”用于本文包括不含(free from)来自生物的成分的淀粉分解酶蛋白，所述淀粉分解酶蛋白源自所述生物。术语“经纯化的”还包括不含来自天然生物的成分的淀粉分解酶蛋白，所述淀粉分解酶蛋白从该天然生物获得，这也被称为“基本上纯的(essentially pure)”淀粉分解酶，并且可与天然存在且未经遗传修饰的淀粉分解酶特别相关，所述遗传修饰如通过缺失、取代或插入一个或多个氨基酸残基来进行。
因此，可将包含CBM的淀粉分解酶纯化，即只存在较少量其它蛋白。表述“其它蛋白”具体涉及其它酶。本文所用术语“纯化”还指去除其它成分，特别是其它蛋白质，并且最特别是存在于所述淀粉分解酶所来源的细胞中的其它酶。淀粉分解酶可以是“基本上纯的”，即不含来自产生该淀粉分解酶的生物的其它成分，所述产生该淀粉分解酶的生物即，例如，用于重组产生淀粉分解酶的宿主生物。优选地，所述酶是至少75％(重量/重量)纯的，更优选至少80％、85％、90％或甚至至少95％纯的。在还更优选的实施方案中，所述淀粉分解酶是至少98％纯的酶蛋白制剂。
本领域技术人员可以通过本领域熟知的方法来选择将在本发明的方法中使用的特定的酶。可以选择在期望该酶有活性的酱油方法的部分的条件下具有期望活性的酶。例如可以选择在酱油生产方法使用的高NaCl浓度和低pH下有活性的酶。
酱油
酱油是基于大豆和源自大豆的材料的浅褐色至黑色液体型调味品(condiment)，具有肉样的咸味，用作调味料(seasoning)，特别是在东方食品中。在酱油的产生中，使用植物成分例如大豆或源自大豆的材料，例如大豆粉、脱脂大豆和脱脂大豆粉；小麦；源自小麦的材料；稻；源自稻的材料；和大麦。酱油的主要成分通常是大豆或脱脂大豆粉、小麦、盐和水。通常而言，使用发酵方法来制造酱油，但是也可以生产未发酵的酱油。
发酵酱油通常按照以下步骤生产：制备曲，盐水发酵(brine fermentation)(醪发酵(moromi fermentation))，过滤/巴氏灭菌，和成熟作用(maturation)。
通常通过将经烹制的大豆(cooked soy bean)或经烹制的脱脂大豆粉与经炙烤的小麦(roasted wheat)混合来制备曲。其后用通常为米曲霉(Aspergillusoryzae)和/或酱油曲霉(Aspergillus sojae)的起子培养物(starter culture)来接种该混合物，并且使其在用于需氧发酵的浅床中发酵数日。在发酵之后，将曲转移至用于盐水发酵(醪发酵)的罐中。添加盐水(salt brine)至总NaCl量通常为16-18％，并且通常用酵母和乳酸细菌培养物来接种以进一步厌氧发酵。所得混合物称作醪。数日的发酵之后，可以从醪压出粗制酱油(raw soy sauce)，过滤，巴氏灭菌并且进行发酵，通常发酵数个月，或可将醪进行发酵直至发酵结束，此时将其过滤并且装瓶用于消费。
在曲和醪发酵过程中糖类例如淀粉被水解，并且在醪发酵期间将所得的糖发酵以产生风味(flavour)和小量的醇和乳酸，并且将蛋白质分解成肽和氨基酸。这些过程对于产生发酵酱油典型的复合风味是重要的。
未发酵酱油通常从水解的植物蛋白制备，通常从例如大豆、脱脂大豆、小麦、源自小麦的材料、稻、源自稻的材料和/或大麦的酸水解物制备，向其中添加额外的成分例如焦糖色(caramel colour)、玉米糖浆和盐。
可以将酱油生产成低盐酱油(reduce salt soy sauce)。在发酵酱油的情况下这通常通过如下方法完成，通过过滤和/或离子交换从酱油中去除盐。制成的酱油通常具有4-6.5的pH和13-22％ NaCl(重量/重量)的盐含量，只是低盐酱油通常具有低至6％ NaCl的盐含量。
酶处理
使用包含CBM的淀粉分解酶处理植物材料可以通过本领域已知的任何方法来进行。所述处理可以通过如下方法实施：例如将酶添加至植物材料的浆料，或将酶喷雾至原料上。例如可以在曲发酵之前或期间添加所述酶，或者例如可以在醪发酵之前或期间添加所述酶。可以同时用淀粉分解酶处理酱油中的全部成分，或可以在将酱油的一种或多种植物成分与其它成分混合之前进行处理。在本发明的一个实施方式中，待用淀粉分解酶处理的植物材料包含大豆和/或源自大豆的材料。在本发明的另一个实施方式中，待用淀粉分解酶处理的植物材料包含小麦；源自小麦的材料，例如小麦面粉或小麦淀粉；稻；和/或源自稻的材料，例如米淀粉。可以将含淀粉成分在其与酱油的其它成分混合之前，单独(separately)用淀粉分解酶处理；例如可以用淀粉分解酶单独处理小麦、小麦面粉、小麦淀粉、稻和/或米淀粉；并且可以在用淀粉分解酶处理之后添加其它成分。因此，在本发明的一个实施方式中，在步骤i)之后将大豆和/或源自大豆的材料添加至经处理的植物材料。
使用的酶量应该足以使淀粉水解与曲发酵剂本身的淀粉水解相比增加。在本发明的一个实施方式中，包含CBM的淀粉分解酶的量足以使淀粉水解的程度与未添加淀粉分解酶的相似方法相比增加。在本发明的其它实施方式中，包含CBM的淀粉分解酶的量足以使淀粉水解的程度与添加不含CBM的淀粉分解酶的相似方法相比增加。包含CBM的淀粉分解酶应该以如下量添加，所述量使其在酶必须起作用的酱油方法条件下，例如在25-45℃的温度，和醪发酵步骤中的盐(NaCl)浓度为例如17-18％的条件下具有足够的活性。
在一个实施方式中，本发明涉及可以通过本发明的方法获得的或通过本发明的方法获得的酱油。在进一步的实施方式中，本发明涉及包含糖类结合模块的淀粉分解酶用于产生酱油的用途。
实施例1
酶
两种具有CBM的细菌α-淀粉酶：
AMY1048：氨基酸序列在WO 2006/066596中作为SEQ ID NO:2给出。包含CBM的来自黄热芽孢杆菌(同物异名Anoxybacillus contaminans)的野生型α-淀粉酶。催化域是WO 2006/066596的SEQ ID NO:2的氨基酸1-484，而CBM是氨基酸485-586。
AX379+CBM：氨基酸序列在WO 2006/066596中作为SEQ ID NO:12给出。酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶和来自AMY1048的CBM的杂合体。
两种不具有CBM的细菌α-淀粉酶：
不具有CBM的AMY1048：氨基酸序列在WO 2006/066596中作为SEQ IDNO:2的氨基酸1-484给出。
AX379：氨基酸序列在WO 2006/066596中作为SEQ ID NO:12的氨基酸1-484给出。
实施例举例说明了如使用细菌α-淀粉酶通过还原端的增加来测量小麦面粉水解成可溶性寡糖。在50mM乙酸钠pH 5.0、20％ NaCl中制备具有1％(重量/重量)干固体(DS)小麦面粉的浆料。将1mL的小麦面粉浆分配至试管。将试管在25℃的热混合器上温育。在第0分钟将酶按照剂量(160微克/克干固体)添加至试管。在36、64和90分钟之后取出样品。
通过使用DNS试剂方法测量还原端的增加来测定寡糖的释放。
DNS试剂::将1g3，5-二硝基水杨酸溶解在20ml 2N NaOH和50ml水中，继而添加30g Rochelle盐(酒石酸钾钠四水合物)，并且将溶液加热至大约70℃，随后用水调节至100ml。
通过将50微升反应混合物与50微升DNS试剂一起在100℃温育10分钟来测定释放的还原糖。煮沸之后，添加250微升水，并且在550nm测量吸光度。使用D-葡萄糖标准曲线来对释放的还原糖量进行定量。结果示于表1。
表1
Figure A200780001939D00101

Claims (13)

1.用于产生酱油的方法，其包括：
i)使用淀粉分解酶处理植物材料；和
ii)从处理的植物材料产生酱油；
其中所述淀粉分解酶包含糖类结合模块。
2.权利要求1的方法，其中在醪(moromi)发酵过程之前或期间添加所述淀粉分解酶。
3.权利要求1和2中任一项的方法，其中在曲(koji)发酵过程之前或期间添加所述淀粉分解酶。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述淀粉分解酶是包含糖类结合模块的α-淀粉酶。
5.权利要求4的方法，其中所述淀粉分解酶是包含糖类结合模块的细菌α-淀粉酶。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述植物材料包含大豆和/或源自大豆的材料。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤i)之后将大豆和/或源自大豆的材料添加至处理的植物材料。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述植物材料包含小麦、源自小麦的材料、稻和/或源自稻的材料。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述过程包括在步骤ii)中使用曲发酵剂的发酵。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述过程包括在步骤ii)中使用醪发酵剂的发酵。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤ii)期间进行步骤i)。
12.包含糖类结合模块的淀粉分解酶用于产生酱油的用途。
13.通过前述权利要求中任一项的方法可以获得的酱油。
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