JP2001269173A - 新規ｄｎａ配列 - Google Patents
新規ｄｎａ配列Info
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- JP2001269173A JP2001269173A JP2000084302A JP2000084302A JP2001269173A JP 2001269173 A JP2001269173 A JP 2001269173A JP 2000084302 A JP2000084302 A JP 2000084302A JP 2000084302 A JP2000084302 A JP 2000084302A JP 2001269173 A JP2001269173 A JP 2001269173A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- trypsin
- anchovy
- amino acid
- acid sequence
- protease
- Prior art date
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- Pending
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- Soy Sauces And Products Related Thereto (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明の課題は、イワシ由来のトリプシン様
酵素をコードするＤＮＡを提供することである。 【解決手段】 配列番号１における２０位から２４０位
までのアミノ酸配列または配列番号２における２０位か
ら２４１位までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から
なるイワシ由来のトリプシン様酵素をコードするＤＮ
Ａ、および該ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターにより形
質転換した宿主細胞を培養して、魚由来の他の蛋白質を
実質的に含まない、イワシ由来の組換えトリプシン様酵
素を製造する方法。
酵素をコードするＤＮＡを提供することである。 【解決手段】 配列番号１における２０位から２４０位
までのアミノ酸配列または配列番号２における２０位か
ら２４１位までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から
なるイワシ由来のトリプシン様酵素をコードするＤＮ
Ａ、および該ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターにより形
質転換した宿主細胞を培養して、魚由来の他の蛋白質を
実質的に含まない、イワシ由来の組換えトリプシン様酵
素を製造する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イワシのプロテア
ーゼをコードする新規ＤＮＡおよびその製造方法を提供
する。本発明により製造されたプロテアーゼは、良質な
魚醤を迅速に製造するために有用である。
ーゼをコードする新規ＤＮＡおよびその製造方法を提供
する。本発明により製造されたプロテアーゼは、良質な
魚醤を迅速に製造するために有用である。
【０００２】
【従来の技術】酵素は自然界に広く分布し、多種多様な
機能を果たしている。ウイルスの遺伝子はそれらのコー
トタンパク質の前駆分子を開裂する酵素をコードし、細
菌はそれらの外界にあるタンパク質を分解する多種多様
な細胞外酵素を産生し、高等生物はほとんどすべての生
物学的反応に酵素を用いる。反応プロセスでそれらは生
物学的触媒として作用し、触媒作用のない反応と比較し
て１０12倍にも反応速度を高める（Ｋｕｃｈｅｌ ａｎ
ｄ Ｒａｌｓｔｏｎ，１９８８）。酵素は高度に特殊化
された種類のタンパク質分子であり、それらはＤＮＡ分
子に含まれる遺伝子の最も重要な産物のひとつである。
酵素活性のきわめて重要な特徴は、それがきわめて基質
特異性であることである；すなわち特定の酵素は特定の
基質に作用し、わずかに異なる形状をもつ関連分子を受
け入れない。その理由は酵素が基質の形状に相補的な三
次元の活性部位をもつからであり、タンパク質鎖のフォ
ールドのため、この部位を形成するアミノ酸残基はアミ
ノ酸の一次構造とはかけ離れている可能性がある。
機能を果たしている。ウイルスの遺伝子はそれらのコー
トタンパク質の前駆分子を開裂する酵素をコードし、細
菌はそれらの外界にあるタンパク質を分解する多種多様
な細胞外酵素を産生し、高等生物はほとんどすべての生
物学的反応に酵素を用いる。反応プロセスでそれらは生
物学的触媒として作用し、触媒作用のない反応と比較し
て１０12倍にも反応速度を高める（Ｋｕｃｈｅｌ ａｎ
ｄ Ｒａｌｓｔｏｎ，１９８８）。酵素は高度に特殊化
された種類のタンパク質分子であり、それらはＤＮＡ分
子に含まれる遺伝子の最も重要な産物のひとつである。
酵素活性のきわめて重要な特徴は、それがきわめて基質
特異性であることである；すなわち特定の酵素は特定の
基質に作用し、わずかに異なる形状をもつ関連分子を受
け入れない。その理由は酵素が基質の形状に相補的な三
次元の活性部位をもつからであり、タンパク質鎖のフォ
ールドのため、この部位を形成するアミノ酸残基はアミ
ノ酸の一次構造とはかけ離れている可能性がある。
【０００３】酵素触媒反応の速度は基質濃度に依存す
る。最適条件下では速度は基質濃度の上昇に伴って高ま
り、最終的にプラトー（Ｖmax）に到達する。これはす
べての酵素が酵素−基質（ＥＳ）複合体を形成した状態
である。酵素の基質特異性は、通常はミカエリス・メン
テン定数（ｋm）により表される。これは酵素分子の半
量がＥＳ複合体を形成する基質濃度（Ｖmax/2）である
と定義できる。ｋmの数値が小さいほど、酵素の基質特
異性は大きい。酵素触媒反応の速度定数はｋcat、すな
わち代謝回転数で表される。これは単位時間および酵素
活性部位当たり生成物に変換される基質分子の最大数で
ある。したがってｋmは酵素の親和性を表し、一方ｋcat
はＥＳ複合体の特性および反応を規定する。
る。最適条件下では速度は基質濃度の上昇に伴って高ま
り、最終的にプラトー（Ｖmax）に到達する。これはす
べての酵素が酵素−基質（ＥＳ）複合体を形成した状態
である。酵素の基質特異性は、通常はミカエリス・メン
テン定数（ｋm）により表される。これは酵素分子の半
量がＥＳ複合体を形成する基質濃度（Ｖmax/2）である
と定義できる。ｋmの数値が小さいほど、酵素の基質特
異性は大きい。酵素触媒反応の速度定数はｋcat、すな
わち代謝回転数で表される。これは単位時間および酵素
活性部位当たり生成物に変換される基質分子の最大数で
ある。したがってｋmは酵素の親和性を表し、一方ｋcat
はＥＳ複合体の特性および反応を規定する。
【０００４】タンパク質分解酵素は、タンパク質のペプ
チド結合を加水分解する最も重要な酵素群のひとつであ
る。十分に解明されているすべてのプロテアーゼが、４
つのファミリー、すなわちセリン−、システイン−、ア
スパラギン酸−またはメタロ−プロテアーゼのうちのい
ずれか１つに属する。この分類は官能基基準、すなわち
活性部位における最も目立つ官能基の性質に基づく。プ
ロテアーゼは、不適正な部位または時点でのタンパク質
分解を防ぐために、細胞内でチモーゲンと呼ばれる不活
性前駆物質として合成される（Ｋａｒｄｏｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９９）。チモーゲンは、由来場所から離れた
作用場所中へ分泌された後で初めて、特異的プロテアー
ゼの作用により活性形に変換される。この活性化ペプチ
ドが除かれた後、成熟タンパク質は結合部位を活性化す
る立体配座変化を受け、触媒活性が生じる。しかし分子
レベルでは、開始コドンのすぐ下流に位置する一組のシ
グナルコドンが、シグナル認識粒子への結合により共翻
訳経路（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｗ
ａｙ）を介してこのタンパク質を小胞体へ向かわせる。
次いでこれがその受容体と相互作用し、シグナルペプチ
ドを放出する（Ｂｌｏｂｅｌ ａｎｄ Ｄｏｂｂｅｒｓ
ｔｅｉｎ，１９７５ａ，１９７５ｂ）。次いでそのこの
新生ポリペプチドが脂質二重層にまたがってトランロケ
ーションするには、小胞体内での第２のシグナル認識事
象が必要である（Ｊｕｎｇｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５）。
チド結合を加水分解する最も重要な酵素群のひとつであ
る。十分に解明されているすべてのプロテアーゼが、４
つのファミリー、すなわちセリン−、システイン−、ア
スパラギン酸−またはメタロ−プロテアーゼのうちのい
ずれか１つに属する。この分類は官能基基準、すなわち
活性部位における最も目立つ官能基の性質に基づく。プ
ロテアーゼは、不適正な部位または時点でのタンパク質
分解を防ぐために、細胞内でチモーゲンと呼ばれる不活
性前駆物質として合成される（Ｋａｒｄｏｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９９）。チモーゲンは、由来場所から離れた
作用場所中へ分泌された後で初めて、特異的プロテアー
ゼの作用により活性形に変換される。この活性化ペプチ
ドが除かれた後、成熟タンパク質は結合部位を活性化す
る立体配座変化を受け、触媒活性が生じる。しかし分子
レベルでは、開始コドンのすぐ下流に位置する一組のシ
グナルコドンが、シグナル認識粒子への結合により共翻
訳経路（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｗ
ａｙ）を介してこのタンパク質を小胞体へ向かわせる。
次いでこれがその受容体と相互作用し、シグナルペプチ
ドを放出する（Ｂｌｏｂｅｌ ａｎｄ Ｄｏｂｂｅｒｓ
ｔｅｉｎ，１９７５ａ，１９７５ｂ）。次いでそのこの
新生ポリペプチドが脂質二重層にまたがってトランロケ
ーションするには、小胞体内での第２のシグナル認識事
象が必要である（Ｊｕｎｇｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５）。
【０００５】４つのタンパク質分解酵素ファミリーのう
ち最も大きく、最も多様なセリンプロテアーゼは、タン
パク質のタンパク質分解プロセシング、消化、血液凝
固、免疫応答、および発生を含めた、多数の生物学的プ
ロセスに関与する（Ｎｅｕｒａｔｈ，１９８４）。これ
らの酵素の分子的機序は広く研究されている。セリンプ
ロテアーゼファミリーのうち基質特異性の高いトリプシ
ンは、特に十分に研究されている。それは細菌からヒト
まで共通の触媒機序を特徴とし、３つの必須残基（触媒
三つ組残基：セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン
酸）および基質決定残基としてのアスパラギン酸を伴
う。トリプシンは、インビボおよびインビトロの両方で
アルギニン残基またはリシン残基のカルボキシル側のペ
プチド結合を特異的に開裂する。リシンおよびアルギニ
ンに対する狭いトリプシン特異性は、基質のＰ１側鎖の
正電荷に調和したトリプシンのＳ１結合ポケットにおけ
る負電荷により生じる（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１
９９９）。名称Ｐｎ．．．．Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ
２’．．．．Ｐｎ’は基質アミノ酸残基を表し、Ｐ１−
Ｐ１’は分解（加水分解）しやすい結合であり、Ｓ
ｎ．．．．Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’．．．．Ｓｎ’
は対応する酵素の結合部位である（図１ａ；Ｓｃｈｅｃ
ｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，１９６７）。キモト
リプシン中の同様な残基はセリンであり、これはＰ１に
ある大型疎水性残基を好む。一方、エラスターゼのＳ１
結合ポケットはＶａｌ−２２６およびＴｈｒ−２１６の
側鎖により閉塞され、このためその特異性は小型の脂肪
族残基になる（図１ｂ；Ｃｈｏｂｅｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９６９）。膵臓においてトリプシンは消化酵素
として機能するだけでなく、不活性なチモーゲンのＮ末
端から短い活性化ペプチドを開裂することによりあらゆ
る膵臓酵素（自身を含む）の活性化にも関与する。ウシ
トリプシンは、単離および分析された最初のタンパク質
分解酵素のひとつである。それ以来トリプシンは原核生
物から真核生物にまで及ぶ多様な生物中に確認された
（Ｒｙｐｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
特に重要なのは、それが細菌ストレプトマイセス・グリ
セウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）
中に発見されたことである（Ｏｌｆａｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９７５）。それと哺乳動物トリプシンとの密接
な相同性−トリプシンと同一生物内の関連酵素との相同
性に匹敵する−はきわめて当惑させるものであったた
め、Ｈａｒｔｌｅｙ（１９７９）は哺乳動物から細菌へ
遺伝子伝達が起きたという仮説を立てた。しかしこれは
Ｒｅａｄ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ（１９８８）により除外
された。彼らは、トリプシン特異性に必要なアスパラギ
ン酸の埋没した電荷を安定化する必要性がトリプシンに
関連酵素より厳密な構造要件を課し、おそらく配列がよ
りいっそう保存されるのに寄与したのであろうと反論し
た。ストレプトマイセス・エリスラエウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ）から得た他の
細菌トリプシン（Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
１）も類似の特性をもつことが認められた。トリプシン
が主に消化機能を果たす原始生物から、高等生物におい
てトリプシンが満たす多様でより複雑な機能までのトリ
プシンの進化に伴う分子構造のため、この酵素は構造−
機能関係研究のための優れたモデルとなった。最近のか
なりの研究がこの構造特性の解明に集中し続けている
（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２，１９９
４，１９９６；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９；
Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８，１９９
９；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ ａｎｄ Ｒｕｍｓｈ，１９
９９；Ｇｕｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ただ
しこれらはすべて、哺乳動物トリプシンに対応する。
ち最も大きく、最も多様なセリンプロテアーゼは、タン
パク質のタンパク質分解プロセシング、消化、血液凝
固、免疫応答、および発生を含めた、多数の生物学的プ
ロセスに関与する（Ｎｅｕｒａｔｈ，１９８４）。これ
らの酵素の分子的機序は広く研究されている。セリンプ
ロテアーゼファミリーのうち基質特異性の高いトリプシ
ンは、特に十分に研究されている。それは細菌からヒト
まで共通の触媒機序を特徴とし、３つの必須残基（触媒
三つ組残基：セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン
酸）および基質決定残基としてのアスパラギン酸を伴
う。トリプシンは、インビボおよびインビトロの両方で
アルギニン残基またはリシン残基のカルボキシル側のペ
プチド結合を特異的に開裂する。リシンおよびアルギニ
ンに対する狭いトリプシン特異性は、基質のＰ１側鎖の
正電荷に調和したトリプシンのＳ１結合ポケットにおけ
る負電荷により生じる（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１
９９９）。名称Ｐｎ．．．．Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ
２’．．．．Ｐｎ’は基質アミノ酸残基を表し、Ｐ１−
Ｐ１’は分解（加水分解）しやすい結合であり、Ｓ
ｎ．．．．Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’．．．．Ｓｎ’
は対応する酵素の結合部位である（図１ａ；Ｓｃｈｅｃ
ｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，１９６７）。キモト
リプシン中の同様な残基はセリンであり、これはＰ１に
ある大型疎水性残基を好む。一方、エラスターゼのＳ１
結合ポケットはＶａｌ−２２６およびＴｈｒ−２１６の
側鎖により閉塞され、このためその特異性は小型の脂肪
族残基になる（図１ｂ；Ｃｈｏｂｅｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９６９）。膵臓においてトリプシンは消化酵素
として機能するだけでなく、不活性なチモーゲンのＮ末
端から短い活性化ペプチドを開裂することによりあらゆ
る膵臓酵素（自身を含む）の活性化にも関与する。ウシ
トリプシンは、単離および分析された最初のタンパク質
分解酵素のひとつである。それ以来トリプシンは原核生
物から真核生物にまで及ぶ多様な生物中に確認された
（Ｒｙｐｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
特に重要なのは、それが細菌ストレプトマイセス・グリ
セウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）
中に発見されたことである（Ｏｌｆａｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９７５）。それと哺乳動物トリプシンとの密接
な相同性−トリプシンと同一生物内の関連酵素との相同
性に匹敵する−はきわめて当惑させるものであったた
め、Ｈａｒｔｌｅｙ（１９７９）は哺乳動物から細菌へ
遺伝子伝達が起きたという仮説を立てた。しかしこれは
Ｒｅａｄ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ（１９８８）により除外
された。彼らは、トリプシン特異性に必要なアスパラギ
ン酸の埋没した電荷を安定化する必要性がトリプシンに
関連酵素より厳密な構造要件を課し、おそらく配列がよ
りいっそう保存されるのに寄与したのであろうと反論し
た。ストレプトマイセス・エリスラエウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ）から得た他の
細菌トリプシン（Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
１）も類似の特性をもつことが認められた。トリプシン
が主に消化機能を果たす原始生物から、高等生物におい
てトリプシンが満たす多様でより複雑な機能までのトリ
プシンの進化に伴う分子構造のため、この酵素は構造−
機能関係研究のための優れたモデルとなった。最近のか
なりの研究がこの構造特性の解明に集中し続けている
（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２，１９９
４，１９９６；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９；
Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８，１９９
９；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ ａｎｄ Ｒｕｍｓｈ，１９
９９；Ｇｕｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ただ
しこれらはすべて、哺乳動物トリプシンに対応する。
【０００６】興味深いことに、低温適応種、たとえばカ
タクチイワシ（ａｎｃｈｏｖｙ）（Ｍａｒｔｉｎｅｚ
ｅｔ ａｌ．，１９８８）、カラフトシシャモ（Ｈｊｅ
ｌｍｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒａａ，１９８２）、タラ
（Ｓｉｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｈａａｒｄ，１９８４；Ａ
ｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）および
サケ（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）からの
トリプシンは、それらに対応する哺乳動物トリプシンよ
り実質的に高い触媒効率を示す。たとえばウシトリプシ
ンと比較して、タラトリプシンの触媒効率は１７倍高い
ことが認められ（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９）、アニオン性サケトリプシンは４０倍
高いことが報告された（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，
１９９４）。他のセリンプロテアーゼ、たとえば魚類種
からのキモトリプシンおよびエラスターゼもそれらに対
応する哺乳動物のものより高い触媒効率をもつのが認め
られたことは、特筆すべきである（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏ
ｎ ａｎｄ Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９９１；Ｒａａ
ａｎｄ Ｗａｌｔｈｅｒ，１９８９；Ｋｒｉｓｔｊａｎ
ｓｓｏｎ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９２；Ａｓｇ
ｅｉｒｓｓｏｎ ａｎｄＢｊａｒｎａｓｏｎ，１９９
３；Ｇｉｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｏｖｅｒｂｏ，１９９
０）。さらに、魚類の酵素は対応する温血動物酵素より
極限ｐＨおよび高温で安定性が低い傾向も示し（Ａｓｇ
ｅｉｒｓｓｏｎ ａｎｄ Ｆｏｘ，１９８９；Ｓｉｍｐ
ｓｏｎ ａｎｄ Ｈａａｒｄ，１９８４）、安定性と活
性の両方に関しアルカリ性の方へ移行しているように思
われる（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｌ
ｏｗおよびＳｏｍｅｒｏ（１９７４）は、変温動物の一
連の酵素反応が温血生物における対応する反応より低い
自由エネルギー、エンタルピーおよび活性化エントロピ
ーをもつことを示した。そしてこれは触媒効率にかなり
の相異をもたらす。一方、他の人々（Ａｓｇｅｉｒｓｓ
ｏｎ ａｎｄ Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９８９；Ｇｉｌ
ｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｏｖｅｒｂｏ，１９９０）は、こ
の顕著な相異は魚類酵素の柔軟性の方が大きいためであ
ると示唆している。
タクチイワシ（ａｎｃｈｏｖｙ）（Ｍａｒｔｉｎｅｚ
ｅｔ ａｌ．，１９８８）、カラフトシシャモ（Ｈｊｅ
ｌｍｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒａａ，１９８２）、タラ
（Ｓｉｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｈａａｒｄ，１９８４；Ａ
ｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）および
サケ（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）からの
トリプシンは、それらに対応する哺乳動物トリプシンよ
り実質的に高い触媒効率を示す。たとえばウシトリプシ
ンと比較して、タラトリプシンの触媒効率は１７倍高い
ことが認められ（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９）、アニオン性サケトリプシンは４０倍
高いことが報告された（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，
１９９４）。他のセリンプロテアーゼ、たとえば魚類種
からのキモトリプシンおよびエラスターゼもそれらに対
応する哺乳動物のものより高い触媒効率をもつのが認め
られたことは、特筆すべきである（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏ
ｎ ａｎｄ Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９９１；Ｒａａ
ａｎｄ Ｗａｌｔｈｅｒ，１９８９；Ｋｒｉｓｔｊａｎ
ｓｓｏｎ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９２；Ａｓｇ
ｅｉｒｓｓｏｎ ａｎｄＢｊａｒｎａｓｏｎ，１９９
３；Ｇｉｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｏｖｅｒｂｏ，１９９
０）。さらに、魚類の酵素は対応する温血動物酵素より
極限ｐＨおよび高温で安定性が低い傾向も示し（Ａｓｇ
ｅｉｒｓｓｏｎ ａｎｄ Ｆｏｘ，１９８９；Ｓｉｍｐ
ｓｏｎ ａｎｄ Ｈａａｒｄ，１９８４）、安定性と活
性の両方に関しアルカリ性の方へ移行しているように思
われる（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｌ
ｏｗおよびＳｏｍｅｒｏ（１９７４）は、変温動物の一
連の酵素反応が温血生物における対応する反応より低い
自由エネルギー、エンタルピーおよび活性化エントロピ
ーをもつことを示した。そしてこれは触媒効率にかなり
の相異をもたらす。一方、他の人々（Ａｓｇｅｉｒｓｓ
ｏｎ ａｎｄ Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９８９；Ｇｉｌ
ｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｏｖｅｒｂｏ，１９９０）は、こ
の顕著な相異は魚類酵素の柔軟性の方が大きいためであ
ると示唆している。
【０００７】哺乳動物トリプシンの豊富な構造情報か
ら、このタンパク質は配列、構造および機能の関係に関
する研究のための優れたモデルとなっている。しかし変
温動物に関するデータはまだ断片的であり、特に魚類ト
リプシン独特の構造特性に関する研究を行う必要があ
る。魚類トリプシンの最初のヌクレオチド配列は、タラ
からのものが１９９３年に報告され（Ｇｕｄｍｕｎｄｓ
ｏｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、それ以
来、サケ（Ｍａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、南極
圏魚類（Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、
およびカレイ（Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｇａｌｌａｎ
ｔ，１９９８）のみについては完全な報文が発表され
た。したがって、その独特の触媒特性を理解するため
に、魚類トリプシンをさらにある程度解明する価値があ
る。これは、構造可塑性の基礎的知識、および新規特異
性をもつ酵素の開発に寄与するであろう。
ら、このタンパク質は配列、構造および機能の関係に関
する研究のための優れたモデルとなっている。しかし変
温動物に関するデータはまだ断片的であり、特に魚類ト
リプシン独特の構造特性に関する研究を行う必要があ
る。魚類トリプシンの最初のヌクレオチド配列は、タラ
からのものが１９９３年に報告され（Ｇｕｄｍｕｎｄｓ
ｏｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、それ以
来、サケ（Ｍａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、南極
圏魚類（Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、
およびカレイ（Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｇａｌｌａｎ
ｔ，１９９８）のみについては完全な報文が発表され
た。したがって、その独特の触媒特性を理解するため
に、魚類トリプシンをさらにある程度解明する価値があ
る。これは、構造可塑性の基礎的知識、および新規特異
性をもつ酵素の開発に寄与するであろう。
【０００８】したがって本発明は、魚類トリプシンの高
い触媒活性と関連するトリプシンの構造可塑性が自然選
択の結果であるかどうか、またそうであればこの独自性
を支配する分子的基礎は何であるかを判定することが目
標である。海洋漂泳魚類種である日本カタクチイワシ
（Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）を選択した
のは、トリプシンその他のセリンプロテアーゼの活性が
高いため、捕獲後すぐにその腹部組織が急速に分解する
からである（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｓｅｒｒａ，
１９８９；Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
い触媒活性と関連するトリプシンの構造可塑性が自然選
択の結果であるかどうか、またそうであればこの独自性
を支配する分子的基礎は何であるかを判定することが目
標である。海洋漂泳魚類種である日本カタクチイワシ
（Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）を選択した
のは、トリプシンその他のセリンプロテアーゼの活性が
高いため、捕獲後すぐにその腹部組織が急速に分解する
からである（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｓｅｒｒａ，
１９８９；Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【０００９】タンパク質エンジニアリングの試みには、
新規な基質特異性をもつ酵素の設計を探索することが含
まれる。一般にこの問題に関する研究方法は、適切な触
媒基の付加により反応性を獲得できると確信して、基質
結合部位に注目している。これらの研究は適度な成功を
得たにすぎない。その理由の一部は、特異的基質結合部
位に対する構造要件が十分には理解されていないからで
ある。第２の研究方法は、自然界で特異性を変化させる
のに使われている方法を描き出す目的で、相同酵素の基
質特異性の構造決定因子を調べるものである。しかし大
部分の場合、いわゆる基質結合残基の変更は特異性を完
全に変化させるには不十分である。これは、基質と接触
しない基質特異性決定因子があることを示唆する（Ｈｅ
ｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この現象の
最も良く解明された例がセリンプロテアーゼのトリプシ
ンファミリーにみられ、これは最近関心がもたれている
課題である（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９
２，１９９４；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，１
９９８，１９９９；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９
９；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ ａｎｄ Ｒｕｍｓｈ，１９
９９；Ｇｕｉｎｔｏｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｕｉｎ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。他方、前記のように
対応する温血動物種からの酵素と比較して低温適応種か
らの酵素がもつ特殊な性質は、おそらく構造上の単一ま
たは幾つかの相異によるものではなく、そのような相異
が複雑に相互作用することによるものであって、簡単に
は説明できない（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
４）。
新規な基質特異性をもつ酵素の設計を探索することが含
まれる。一般にこの問題に関する研究方法は、適切な触
媒基の付加により反応性を獲得できると確信して、基質
結合部位に注目している。これらの研究は適度な成功を
得たにすぎない。その理由の一部は、特異的基質結合部
位に対する構造要件が十分には理解されていないからで
ある。第２の研究方法は、自然界で特異性を変化させる
のに使われている方法を描き出す目的で、相同酵素の基
質特異性の構造決定因子を調べるものである。しかし大
部分の場合、いわゆる基質結合残基の変更は特異性を完
全に変化させるには不十分である。これは、基質と接触
しない基質特異性決定因子があることを示唆する（Ｈｅ
ｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この現象の
最も良く解明された例がセリンプロテアーゼのトリプシ
ンファミリーにみられ、これは最近関心がもたれている
課題である（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９
２，１９９４；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，１
９９８，１９９９；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９
９；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ ａｎｄ Ｒｕｍｓｈ，１９
９９；Ｇｕｉｎｔｏｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｕｉｎ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。他方、前記のように
対応する温血動物種からの酵素と比較して低温適応種か
らの酵素がもつ特殊な性質は、おそらく構造上の単一ま
たは幾つかの相異によるものではなく、そのような相異
が複雑に相互作用することによるものであって、簡単に
は説明できない（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
４）。
【００１０】本発明の知見は、トリプシンの構造−機能
関係を推定により理解することだけを目的とするもので
はない。この発明はさらに、バイオテクノロジーにおい
てきわめて重要なものになる可能性がある。トリプシン
の特異性が狭いにもかかわらず、抗生物質からホルモ
ン、芳香化合物にまで及ぶペプチドの合成にトリプシン
を用いる報告が多数ある（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｆａｇ
ａｉｎ，１９９９に概説）。特に重要なのは、海洋漂泳
魚類種からの付加価値魚類製品の開発にトリプシンを使
用できる可能性である。たとえばカタクチイワシやサー
ディン（ｓａｒｄｉｎｅ）の集団は、世界中の温帯およ
び熱帯水域全体にみられ、中間および富栄養沿岸水域に
おいて最も重要である（Ｋｉｅｆｅｒ ａｎｄ Ｇｒａ
ｆｔｏｎ，１９９８）。異例なほどのバイオマスおよび
沿岸性のため、それらは年間捕獲量全体の主要部分を占
める。この捕獲量の多くが魚類の餌に変わるので、この
漁業の経済価値は比較的小さい。しかしアジアその他の
若干の国では、幾つかの伝統食品の味や香りを改良する
ための調味料として発酵カタクチイワシを広く用いてい
る（Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍａｒｔｉｎｚ
ａｎｄ Ｓｅｒｒａ，１９８９）。カタクチイワシの
腸および筋肉中の種々のタンパク質分解酵素が魚類組織
の加水分解に関与する。加水分解は完了するのにおよそ
７〜８カ月かかる。したがってそれらの生化学的特性を
理解すると、それらの妥当な利用を洞察してカタクチイ
ワシ製品の発酵期間を短縮することができる。
関係を推定により理解することだけを目的とするもので
はない。この発明はさらに、バイオテクノロジーにおい
てきわめて重要なものになる可能性がある。トリプシン
の特異性が狭いにもかかわらず、抗生物質からホルモ
ン、芳香化合物にまで及ぶペプチドの合成にトリプシン
を用いる報告が多数ある（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｆａｇ
ａｉｎ，１９９９に概説）。特に重要なのは、海洋漂泳
魚類種からの付加価値魚類製品の開発にトリプシンを使
用できる可能性である。たとえばカタクチイワシやサー
ディン（ｓａｒｄｉｎｅ）の集団は、世界中の温帯およ
び熱帯水域全体にみられ、中間および富栄養沿岸水域に
おいて最も重要である（Ｋｉｅｆｅｒ ａｎｄ Ｇｒａ
ｆｔｏｎ，１９９８）。異例なほどのバイオマスおよび
沿岸性のため、それらは年間捕獲量全体の主要部分を占
める。この捕獲量の多くが魚類の餌に変わるので、この
漁業の経済価値は比較的小さい。しかしアジアその他の
若干の国では、幾つかの伝統食品の味や香りを改良する
ための調味料として発酵カタクチイワシを広く用いてい
る（Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍａｒｔｉｎｚ
ａｎｄ Ｓｅｒｒａ，１９８９）。カタクチイワシの
腸および筋肉中の種々のタンパク質分解酵素が魚類組織
の加水分解に関与する。加水分解は完了するのにおよそ
７〜８カ月かかる。したがってそれらの生化学的特性を
理解すると、それらの妥当な利用を洞察してカタクチイ
ワシ製品の発酵期間を短縮することができる。
【００１１】魚類を発酵させて製造される調味料の代表
例は、魚醤である。魚醤は、魚の持っている自己消化酵
素（主に消化管に局在する）により、高塩濃度下で静菌
しながら、長年（約１年から３年）をかけて、魚蛋白を
アミノ酸まで分解し、調味料としている。主に東南アジ
ア一帯の沿岸部で魚（主に、カークン（キビナゴ科））
と塩で長期間発酵させて作られる。日本では、いしる、
シッツル、イカナゴ醤油等が、同じ製法で作られてい
る。これらは、共に、アミノ酸、短鎖ペプタイドを含有
しているため、うま味が強く、ペプチドによるコク味、
複雑味が、食品に付与できる。近年、食品市場はグルメ
化し、新しい味を求めている。魚醤は、うま味と複雑味
により、市場のニーズに合致し、あたらしい味を創造す
ることができるため、年々、消費量が増えている。
例は、魚醤である。魚醤は、魚の持っている自己消化酵
素（主に消化管に局在する）により、高塩濃度下で静菌
しながら、長年（約１年から３年）をかけて、魚蛋白を
アミノ酸まで分解し、調味料としている。主に東南アジ
ア一帯の沿岸部で魚（主に、カークン（キビナゴ科））
と塩で長期間発酵させて作られる。日本では、いしる、
シッツル、イカナゴ醤油等が、同じ製法で作られてい
る。これらは、共に、アミノ酸、短鎖ペプタイドを含有
しているため、うま味が強く、ペプチドによるコク味、
複雑味が、食品に付与できる。近年、食品市場はグルメ
化し、新しい味を求めている。魚醤は、うま味と複雑味
により、市場のニーズに合致し、あたらしい味を創造す
ることができるため、年々、消費量が増えている。
【００１２】上記のとおり、魚醤は市場のニーズは有る
が、基本的に特有の香気もしくは不快臭成分を有してい
るため、加工食品には使用量を制限されたり、また、利
用分野の制限が大きい。これら不快臭成分は、原料の鮮
度管理、長期の発酵において、微生物の汚染による香気
成分の生成が原因といわれている。近年、この問題を排
除するために、下記のような種々の解決策が提唱されて
いる。
が、基本的に特有の香気もしくは不快臭成分を有してい
るため、加工食品には使用量を制限されたり、また、利
用分野の制限が大きい。これら不快臭成分は、原料の鮮
度管理、長期の発酵において、微生物の汚染による香気
成分の生成が原因といわれている。近年、この問題を排
除するために、下記のような種々の解決策が提唱されて
いる。
【００１３】(a) 原料の鮮度管理 (b) 低温による発酵管理（汚染防止と褐変による不快臭
生成抑制） (c) 酵素を添加し、短期に発酵させる方法 (d) 酵素の代わりに麹を使う、分解促進と不快臭の除去 (e) 魚醤製造後の脱臭方法 1)限外濾過による脱臭（特開平４−３４６７６７） 2)ｐＨ調整後、水蒸気蒸留による脱臭法（特開平５−６
４５６３） 3)麹未分解物を接触させ、不快臭を吸着する方法（特開
平３−４７０５１）。
生成抑制） (c) 酵素を添加し、短期に発酵させる方法 (d) 酵素の代わりに麹を使う、分解促進と不快臭の除去 (e) 魚醤製造後の脱臭方法 1)限外濾過による脱臭（特開平４−３４６７６７） 2)ｐＨ調整後、水蒸気蒸留による脱臭法（特開平５−６
４５６３） 3)麹未分解物を接触させ、不快臭を吸着する方法（特開
平３−４７０５１）。
【００１４】しかしながら、(b) の方法は、低温で行う
ため、呈味力の強い調味料ができない；(c) の方法は、
外来（魚自体のではなく）の酵素を使って、速醸するた
め、ペプチド含量が多い調味料となり、呈味が弱い；
(d) の麹を使った分解は、分解率は高い（魚醤と同様）
が、短鎖、中鎖のペプチド含量が変わり、魚醤特有の味
が失われる（この点、(c) の方法も同様である）；そし
て(e) の方法は、魚醤製造後に加工工程が加わるため、
不快臭はある程度除去できるが、完全な技術がないた
め、不快臭は残り、且つ、加工臭（加工するために新た
につく臭い等）が発生するし、また、加工に伴い、呈味
成分が失われ、効率的ではなく、麹未分解物を利用した
場合、(d) と同様に麹香がつくという問題がある。
ため、呈味力の強い調味料ができない；(c) の方法は、
外来（魚自体のではなく）の酵素を使って、速醸するた
め、ペプチド含量が多い調味料となり、呈味が弱い；
(d) の麹を使った分解は、分解率は高い（魚醤と同様）
が、短鎖、中鎖のペプチド含量が変わり、魚醤特有の味
が失われる（この点、(c) の方法も同様である）；そし
て(e) の方法は、魚醤製造後に加工工程が加わるため、
不快臭はある程度除去できるが、完全な技術がないた
め、不快臭は残り、且つ、加工臭（加工するために新た
につく臭い等）が発生するし、また、加工に伴い、呈味
成分が失われ、効率的ではなく、麹未分解物を利用した
場合、(d) と同様に麹香がつくという問題がある。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は下記の
ものである： （１）分子クローニングによりカタクチイワシトリプシ
ンの一次構造を決定する； （２）可能性のあるアイソザイムのカタクチイワシトリ
プシンをコードするｃＤＮＡクローンを単離する； （３）比較タンパク質モデリングによりそれらの構造特
性を理解する； （４）魚醤の製造には、長期の発酵期間が必要である
が、主に、塩濃度（約２２％程度）が高いため、酵素反
応が抑制されて、分解に長時間かかる。不快臭の生成
は、長期間発酵による成分間の反応による生成と汚染菌
による香気成分の生成である。従って、不快臭を極力抑
えるためには、短期に発酵を進める必要がある。そのた
め、魚醤製造において中心的役割をしている酵素を従来
の製法で存在する量より多く加えてやることにより、従
来の魚醤と同じアミノ酸、同じペプチドの含量を保持し
つつ、もしくはそれ以上のアミノ酸、ペプチドを含有
し、不快臭を生成せずに短期間に魚醤を製造する方法を
提供する。
ものである： （１）分子クローニングによりカタクチイワシトリプシ
ンの一次構造を決定する； （２）可能性のあるアイソザイムのカタクチイワシトリ
プシンをコードするｃＤＮＡクローンを単離する； （３）比較タンパク質モデリングによりそれらの構造特
性を理解する； （４）魚醤の製造には、長期の発酵期間が必要である
が、主に、塩濃度（約２２％程度）が高いため、酵素反
応が抑制されて、分解に長時間かかる。不快臭の生成
は、長期間発酵による成分間の反応による生成と汚染菌
による香気成分の生成である。従って、不快臭を極力抑
えるためには、短期に発酵を進める必要がある。そのた
め、魚醤製造において中心的役割をしている酵素を従来
の製法で存在する量より多く加えてやることにより、従
来の魚醤と同じアミノ酸、同じペプチドの含量を保持し
つつ、もしくはそれ以上のアミノ酸、ペプチドを含有
し、不快臭を生成せずに短期間に魚醤を製造する方法を
提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、イワシ内
臓から、トリプシン様蛋白分解酵素の遺伝子を単離し、
その配列を決定した。本発明によれば、イワシは少なく
とも二種類のトリプシン様蛋白分解酵素を有する。それ
らをコードするＤＮＡは、配列番号１および配列番号２
によりそれぞれ示される。
臓から、トリプシン様蛋白分解酵素の遺伝子を単離し、
その配列を決定した。本発明によれば、イワシは少なく
とも二種類のトリプシン様蛋白分解酵素を有する。それ
らをコードするＤＮＡは、配列番号１および配列番号２
によりそれぞれ示される。
【００１７】配列番号１および２において、１位〜１３
位までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドであり、１
４位〜１９位のアミノ酸配列はトリプシン類の活性化の
ために開裂する活性化ペプチドである。すなわち、少な
くとも２０位以降のアミノ酸を含むアミノ酸配列の大部
分からなるアミノ酸配列は、トリプシン様蛋白分解酵素
活性を有する。したがって、本発明には、配列番号１お
よび配列番号２によりそれぞれ示されるＤＮＡに加え、
その１位〜１９位のいずれかの部分が欠失したアミノ酸
配列をコードするＤＮＡも包含される。また、１つのア
ミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、こ
れらのアミノ酸配列またはその酵素活性部分をコードす
るいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
位までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドであり、１
４位〜１９位のアミノ酸配列はトリプシン類の活性化の
ために開裂する活性化ペプチドである。すなわち、少な
くとも２０位以降のアミノ酸を含むアミノ酸配列の大部
分からなるアミノ酸配列は、トリプシン様蛋白分解酵素
活性を有する。したがって、本発明には、配列番号１お
よび配列番号２によりそれぞれ示されるＤＮＡに加え、
その１位〜１９位のいずれかの部分が欠失したアミノ酸
配列をコードするＤＮＡも包含される。また、１つのア
ミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、こ
れらのアミノ酸配列またはその酵素活性部分をコードす
るいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００１８】本発明のＤＮＡがコードするトリプシン様
蛋白分解酵素は、いずれも、公知のトリプシンに対する
アミノ酸配列の相同性が約８５％より低い新規なアミノ
酸配列を有し、後記表２に示す通り、カレイ、南極圏
魚、サケ、タラ、ウシ、ネズミ、ヒトのトリプシンのア
ミノ酸配列と比較すると、それぞれ８４、８５、８２、
７７、６４、６７および６０％か又はそれより低い相同
性を有している。
蛋白分解酵素は、いずれも、公知のトリプシンに対する
アミノ酸配列の相同性が約８５％より低い新規なアミノ
酸配列を有し、後記表２に示す通り、カレイ、南極圏
魚、サケ、タラ、ウシ、ネズミ、ヒトのトリプシンのア
ミノ酸配列と比較すると、それぞれ８４、８５、８２、
７７、６４、６７および６０％か又はそれより低い相同
性を有している。
【００１９】本発明のＤＮＡは、配列番号１または２の
適当な部分をコードするＤＮＡをプローブとして合成
し、イワシ類のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニン
グすることができる。そのようなスクリーニングの方法
は公知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載さ
れている。スクリーニングにより、配列番号１または２
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが得られる。
適当な部分をコードするＤＮＡをプローブとして合成
し、イワシ類のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニン
グすることができる。そのようなスクリーニングの方法
は公知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載さ
れている。スクリーニングにより、配列番号１または２
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが得られる。
【００２０】本発明により、イワシの内臓から互いに相
同性の高い２種類のトリプシン様酵素が提供されたこと
から、イワシ類の内臓には他の脊椎動物のものとは相同
性の点で区別できる一群のトリプシン様蛋白分解酵素が
ある可能性があり、本発明はそれらのトリプシン様蛋白
分解酵素をコードするＤＮＡを全て包含する。
同性の高い２種類のトリプシン様酵素が提供されたこと
から、イワシ類の内臓には他の脊椎動物のものとは相同
性の点で区別できる一群のトリプシン様蛋白分解酵素が
ある可能性があり、本発明はそれらのトリプシン様蛋白
分解酵素をコードするＤＮＡを全て包含する。
【００２１】さらに、例えば、配列表の配列番号１また
は配列番号２において、一部のアミノ酸残基が置換、挿
入または欠失している変異アミノ酸配列からなるが、配
列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するトリ
プシン様酵素と実質的に同一の生物活性を有するペプチ
ドをコードするＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配
列と公知のプロテアーゼのアミノ酸配列との相同性が約
８５％以下であるなら、本発明に含まれる。このような
変異アミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードするＤ
ＮＡは、配列番号１または２のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡに対して、例えば部位特異的変異導入法等の適
当な方法により変異を導入することにより得ることがで
き、あるいは、他の天然源から得られる可能性がある。
さらに、本発明の範囲内に入るＤＮＡには、温和な又は
苛酷なストリンジェンシーの条件下で本明細書に開示し
た配列番号１または２のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａにハイブリダイズし、かつトリプシン様酵素活性をコ
ードする単離されたＤＮＡも含まれる。温和なストリン
ジェンシーによるハイブリダイゼーションの条件は、例
えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載された条件を意味
する。温和なストリンジェンシーの条件には、５×ＳＳ
Ｃ，0.５％ＳＤＳ，1.０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）の
前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩のハイブリ
ダイゼーション条件の使用が含まれる。苛酷なストリン
ジェンシーの条件には、より高温のハイブリダイゼーシ
ョンと洗浄が含まれる。その際、プローブの長さ等の各
種要因に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節さ
れる。好ましくは、５×ＳＳＣ以下で２０℃以上の範囲
の条件が好ましい。
は配列番号２において、一部のアミノ酸残基が置換、挿
入または欠失している変異アミノ酸配列からなるが、配
列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するトリ
プシン様酵素と実質的に同一の生物活性を有するペプチ
ドをコードするＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配
列と公知のプロテアーゼのアミノ酸配列との相同性が約
８５％以下であるなら、本発明に含まれる。このような
変異アミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードするＤ
ＮＡは、配列番号１または２のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡに対して、例えば部位特異的変異導入法等の適
当な方法により変異を導入することにより得ることがで
き、あるいは、他の天然源から得られる可能性がある。
さらに、本発明の範囲内に入るＤＮＡには、温和な又は
苛酷なストリンジェンシーの条件下で本明細書に開示し
た配列番号１または２のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａにハイブリダイズし、かつトリプシン様酵素活性をコ
ードする単離されたＤＮＡも含まれる。温和なストリン
ジェンシーによるハイブリダイゼーションの条件は、例
えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載された条件を意味
する。温和なストリンジェンシーの条件には、５×ＳＳ
Ｃ，0.５％ＳＤＳ，1.０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）の
前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩のハイブリ
ダイゼーション条件の使用が含まれる。苛酷なストリン
ジェンシーの条件には、より高温のハイブリダイゼーシ
ョンと洗浄が含まれる。その際、プローブの長さ等の各
種要因に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節さ
れる。好ましくは、５×ＳＳＣ以下で２０℃以上の範囲
の条件が好ましい。
【００２２】本発明は、本発明のＤＮＡを含む発現ベク
ター、並びにこれら発現ベクターを含有する宿主細胞を
前記ＤＮＡの発現に適する条件下で培養して、発現され
た組換えタンパク質を回収することにより、魚由来の他
の蛋白質を実質的に含まない組換えイワシ由来プロテア
ーゼを製造する方法も提供する。
ター、並びにこれら発現ベクターを含有する宿主細胞を
前記ＤＮＡの発現に適する条件下で培養して、発現され
た組換えタンパク質を回収することにより、魚由来の他
の蛋白質を実質的に含まない組換えイワシ由来プロテア
ーゼを製造する方法も提供する。
【００２３】本発明のＤＮＡの発現のためには、使用す
る宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動
物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子等から誘導され
た、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に連結し
た本発明のＤＮＡを組み込む。調節配列の例として、転
写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍ
ＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及
び終結を制御する適切な配列が挙げられる。好ましく
は、ＤＮＡはシグナルペプチドをコードする部分を含め
て使用し、宿主が生産した組換えプロテアーゼが、宿主
細胞外に分泌されるようにする。
る宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動
物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子等から誘導され
た、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に連結し
た本発明のＤＮＡを組み込む。調節配列の例として、転
写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍ
ＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及
び終結を制御する適切な配列が挙げられる。好ましく
は、ＤＮＡはシグナルペプチドをコードする部分を含め
て使用し、宿主が生産した組換えプロテアーゼが、宿主
細胞外に分泌されるようにする。
【００２４】発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵
母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及
び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発
現ベクターは、例えば、Pouwels ら, Cloning Vectors:
A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に
記載されている。
母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及
び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発
現ベクターは、例えば、Pouwels ら, Cloning Vectors:
A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に
記載されている。
【００２５】培養された宿主の細胞内または細胞外に蓄
積された組換えプロテアーゼは、蛋白質を精製するため
の適当な方法で回収することができる。
積された組換えプロテアーゼは、蛋白質を精製するため
の適当な方法で回収することができる。
【００２６】本発明の方法により得られた組換えプロテ
アーゼは、魚醤製造時に添加することにより、発酵の短
期化が可能になる。また、本発明のＤＮＡの配列を操作
し、耐塩構造に改変し、少量でも、酵素力価を保持しつ
つ、魚醤を短期に製造できる。
アーゼは、魚醤製造時に添加することにより、発酵の短
期化が可能になる。また、本発明のＤＮＡの配列を操作
し、耐塩構造に改変し、少量でも、酵素力価を保持しつ
つ、魚醤を短期に製造できる。
【００２７】
【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。実施例で使用した材料および方法は次の通
りである。
に説明する。実施例で使用した材料および方法は次の通
りである。
【００２８】トリプシノーゲンをコードするｃＤＮＡク
ローンの単離 トリプシンは、哺乳動物および魚類の両方において膵臓
組織で合成され、不活性前駆物質として分泌される。し
かしカタクチイワシは大部分の硬骨魚類と同様に、特定
された膵臓腺をもたず、胃の後に幽門垂（幽門盲嚢、ｐ
ｙｌｏｒｉｃｃａｅｃｕｍ）と呼ばれる器官系をもつ
（図２）。後記のように、この器官からトリプシノーゲ
ンをコードするｃＤＮＡクローンが単離された。ｃＤＮ
Ａクローンの単離には、ｃＤＮＡ末端迅速増幅法（ｒａ
ｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ
ｅｎｄｓ ｍｅｔｈｏｄ、ＲＡＣＥ）を用いた（３’
−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥの両方を採用）。クロ
ーニング方法全体を図３に模式的に示す。いずれのＲＡ
ＣＥ法でも、反応の第１工程は逆転写酵素を用いてＲＮ
Ａを一本鎖ｃＤＮＡに変換することを伴った。増幅反応
では、遺伝子内の既知配列に対するＰＣＲプライマー
（センスプライマー）を設計し、第２プライマー（アン
チセンスプライマー）を“アンカー"部位として設計し
た（アンカープライマー）。アンカープライマーは、ｃ
ＤＮＡの５’末端または３’末端に隣接する領域に対し
相補的な配列を保有していた。
ローンの単離 トリプシンは、哺乳動物および魚類の両方において膵臓
組織で合成され、不活性前駆物質として分泌される。し
かしカタクチイワシは大部分の硬骨魚類と同様に、特定
された膵臓腺をもたず、胃の後に幽門垂（幽門盲嚢、ｐ
ｙｌｏｒｉｃｃａｅｃｕｍ）と呼ばれる器官系をもつ
（図２）。後記のように、この器官からトリプシノーゲ
ンをコードするｃＤＮＡクローンが単離された。ｃＤＮ
Ａクローンの単離には、ｃＤＮＡ末端迅速増幅法（ｒａ
ｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ
ｅｎｄｓ ｍｅｔｈｏｄ、ＲＡＣＥ）を用いた（３’
−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥの両方を採用）。クロ
ーニング方法全体を図３に模式的に示す。いずれのＲＡ
ＣＥ法でも、反応の第１工程は逆転写酵素を用いてＲＮ
Ａを一本鎖ｃＤＮＡに変換することを伴った。増幅反応
では、遺伝子内の既知配列に対するＰＣＲプライマー
（センスプライマー）を設計し、第２プライマー（アン
チセンスプライマー）を“アンカー"部位として設計し
た（アンカープライマー）。アンカープライマーは、ｃ
ＤＮＡの５’末端または３’末端に隣接する領域に対し
相補的な配列を保有していた。
【００２９】魚 日本カタクチイワシ（Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｊａｐｏｎ
ｉｃａ）（体重１５〜２０ｇ）の生体試料を三浦半島沖
の太平洋沿岸地域から採集した。捕獲後直ちに魚を脊髄
離断により殺した。必要な種々の器官を直ちに切り取
り、液体窒素中で凍結し、ドライアイス上で実験室へ運
び、使用時まで−８０℃に保存した。骨格筋、心臓、
胃、幽門垂、肝臓および腸を含めた種々の組織を用い
て、全ＲＮＡを調製した。
ｉｃａ）（体重１５〜２０ｇ）の生体試料を三浦半島沖
の太平洋沿岸地域から採集した。捕獲後直ちに魚を脊髄
離断により殺した。必要な種々の器官を直ちに切り取
り、液体窒素中で凍結し、ドライアイス上で実験室へ運
び、使用時まで−８０℃に保存した。骨格筋、心臓、
胃、幽門垂、肝臓および腸を含めた種々の組織を用い
て、全ＲＮＡを調製した。
【００３０】全ＲＮＡ抽出 カタクチイワシの種々の組織から、グアニジン−イソチ
オシアナートをベースとする試薬アイソゲン（Ｉｓｏｇ
ｅｎ）（ニッポンジーン）を含有する溶液で全ＲＮＡを
抽出した。３〜５匹の魚から採取した１ｇの組織より、
約１ｍｇの全ＲＮＡが得られた。島津ＵＶ−１６０分光
光度計を用いて２６０ｎｍにおける吸収から、ＲＮＡ濃
度を判定した。こうして採集したＲＮＡ試料を、後記の
第１鎖ｃＤＮＡ合成、ノーザンブロット法およびサザン
ブロット法に用いた。
オシアナートをベースとする試薬アイソゲン（Ｉｓｏｇ
ｅｎ）（ニッポンジーン）を含有する溶液で全ＲＮＡを
抽出した。３〜５匹の魚から採取した１ｇの組織より、
約１ｍｇの全ＲＮＡが得られた。島津ＵＶ−１６０分光
光度計を用いて２６０ｎｍにおける吸収から、ＲＮＡ濃
度を判定した。こうして採集したＲＮＡ試料を、後記の
第１鎖ｃＤＮＡ合成、ノーザンブロット法およびサザン
ブロット法に用いた。
【００３１】トリプシノーゲンの３’末端増幅 トリプシノーゲンｃＤＮＡの３’末端を３’−ＲＡＣＥ
法により増幅した。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−プラ
イムド（Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ）第１鎖キット（ファルマシ
ア・バイオテク）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成し
た。オリゴヌクレオチドプライマーは、種々の脊椎動物
種から得たトリプシノーゲンの保存アミノ酸配列に基づ
いて設計された（図３；表１）。プライマーの縮重を最
小限にするために、サケトリプシノーゲンのコドン使用
によりオリゴヌクレオチドプライマーの設計を案内し
た。プライマー４（ＲＴＧ）は、キットに含まれている
ＮｏｔＩ ｄ（Ｔ）18プライマーのアダプター領域と同
じ配列をもっていた。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡサーマルサ
イクラー（モデル２４００；パーキン・エルマー、アプ
ライド・バイオシステムズ）を用いて、９４℃で３分
間、次いで９４℃で１分間の変性３０サイクル、５０℃
で１分間のアニーリング、そして７２℃で２分間の延長
により行われた。７２℃での最終延長工程を５分間延長
した。反応混合物の組成は下記のとおりであった：各１
００μｌの反応混合物中、４０ｐｍｏｌの正プライマー
および逆プライマー、約１μｇの第１鎖ｃＤＮＡ（鋳型
として）、２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ混合物、１０μｌの
１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍｍｏｌトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．３、５００ｍｍｏｌ ＫＣｌ、１５ｍｍｏｌ
ＭｇＣｌ2、０．０１％ｗ／ｖゼラチン）、ならびに１
単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ；パ
ーキン・エルマー）。
法により増幅した。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−プラ
イムド（Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ）第１鎖キット（ファルマシ
ア・バイオテク）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成し
た。オリゴヌクレオチドプライマーは、種々の脊椎動物
種から得たトリプシノーゲンの保存アミノ酸配列に基づ
いて設計された（図３；表１）。プライマーの縮重を最
小限にするために、サケトリプシノーゲンのコドン使用
によりオリゴヌクレオチドプライマーの設計を案内し
た。プライマー４（ＲＴＧ）は、キットに含まれている
ＮｏｔＩ ｄ（Ｔ）18プライマーのアダプター領域と同
じ配列をもっていた。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡサーマルサ
イクラー（モデル２４００；パーキン・エルマー、アプ
ライド・バイオシステムズ）を用いて、９４℃で３分
間、次いで９４℃で１分間の変性３０サイクル、５０℃
で１分間のアニーリング、そして７２℃で２分間の延長
により行われた。７２℃での最終延長工程を５分間延長
した。反応混合物の組成は下記のとおりであった：各１
００μｌの反応混合物中、４０ｐｍｏｌの正プライマー
および逆プライマー、約１μｇの第１鎖ｃＤＮＡ（鋳型
として）、２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ混合物、１０μｌの
１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍｍｏｌトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．３、５００ｍｍｏｌ ＫＣｌ、１５ｍｍｏｌ
ＭｇＣｌ2、０．０１％ｗ／ｖゼラチン）、ならびに１
単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ；パ
ーキン・エルマー）。
【００３２】トリプシノーゲンの５’末端増幅 Ｆｒｏｈｍａｎら（１９８８）記載のｃＤＮＡ末端迅速
増幅法（ＲＡＣＥ）により、５’−ＲＡＣＥ系（ギブコ
ＢＲＬ、米国ニューヨーク州、グランド・アイランド）
を用いて、トリプシノーゲンｃＤＮＡの５’末端を増幅
した。第１鎖ＤＮＡは、約１ｍｇの全ＲＮＡから、２０
０単位のＲＮＡｓｅＨ欠損モロニー（Ｍｏｌｏｎｙ）ネ
ズミ白血病ウイルス逆転写酵素（スーパースクリプト
（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ ＲＴ；ギブコＢＲ
Ｌ）、および３’−ＲＡＣＥのヌクレオチド２８８〜３
０５に対応する、カタクチイワシトリプシノーゲンに対
する遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ１）（図３；表
１）を用いて、反応緩衝液（０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、
５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、１０ｍＭジチオトレイト
ール）中で合成された。ターミナルデオキシヌクレオチ
ドトランスフェラーゼ処理によりオリゴ−ｄＣを第１鎖
ｃＤＮＡの５’末端に付加した後、キットからのアブリ
ッジド（ａｂｒｉｄｇｅｄ）アンカープライマー（５’
−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩ
ＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’）、およびヌクレオチ
ド２０２〜２２１に対応する、カタクチイワシトリプシ
ノーゲンに対する他の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ
２）（図３；表１）を用いて、ＰＣＲ混合物（０．２ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１単
位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＧ
ｏｌｄ；パーキン・エルマー））中でポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を行った。次いでＰＣＲ生成物を、キッ
トからのアブリッジドユニバーサル増幅プライマー（Ａ
ＵＡＰ）（５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧ
ＴＡＣ−３’）、および３’−ＲＡＣＥ配列のヌクレオ
チド７３〜９３に対応する、カタクチイワシトリプシノ
ーゲンに対する第３の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ
３）（図３；表１）を用いて、再増幅した。ＰＣＲ増幅
は、ＤＮＡサーマルサイクラー、モデル２４００（パー
キン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ）を用
いて、９４℃で３分間、次いで９４℃で３０秒間の変性
３０サイクル、６０℃で１分間のアニーリング、そして
７２℃で２分間の延長により行われた。７２℃での最終
延長工程を５分間延長した。
増幅法（ＲＡＣＥ）により、５’−ＲＡＣＥ系（ギブコ
ＢＲＬ、米国ニューヨーク州、グランド・アイランド）
を用いて、トリプシノーゲンｃＤＮＡの５’末端を増幅
した。第１鎖ＤＮＡは、約１ｍｇの全ＲＮＡから、２０
０単位のＲＮＡｓｅＨ欠損モロニー（Ｍｏｌｏｎｙ）ネ
ズミ白血病ウイルス逆転写酵素（スーパースクリプト
（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ ＲＴ；ギブコＢＲ
Ｌ）、および３’−ＲＡＣＥのヌクレオチド２８８〜３
０５に対応する、カタクチイワシトリプシノーゲンに対
する遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ１）（図３；表
１）を用いて、反応緩衝液（０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、
５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、１０ｍＭジチオトレイト
ール）中で合成された。ターミナルデオキシヌクレオチ
ドトランスフェラーゼ処理によりオリゴ−ｄＣを第１鎖
ｃＤＮＡの５’末端に付加した後、キットからのアブリ
ッジド（ａｂｒｉｄｇｅｄ）アンカープライマー（５’
−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩ
ＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’）、およびヌクレオチ
ド２０２〜２２１に対応する、カタクチイワシトリプシ
ノーゲンに対する他の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ
２）（図３；表１）を用いて、ＰＣＲ混合物（０．２ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１単
位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＧ
ｏｌｄ；パーキン・エルマー））中でポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を行った。次いでＰＣＲ生成物を、キッ
トからのアブリッジドユニバーサル増幅プライマー（Ａ
ＵＡＰ）（５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧ
ＴＡＣ−３’）、および３’−ＲＡＣＥ配列のヌクレオ
チド７３〜９３に対応する、カタクチイワシトリプシノ
ーゲンに対する第３の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ
３）（図３；表１）を用いて、再増幅した。ＰＣＲ増幅
は、ＤＮＡサーマルサイクラー、モデル２４００（パー
キン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ）を用
いて、９４℃で３分間、次いで９４℃で３０秒間の変性
３０サイクル、６０℃で１分間のアニーリング、そして
７２℃で２分間の延長により行われた。７２℃での最終
延長工程を５分間延長した。
【００３３】ＤＮＡヌクレオチド配列決定 増幅したＤＮＡフラグメントをゲル精製し（Ｈｅｅｒｙ
ｅｔ ａｌ．，１９９０）、プラスミドベクターｐＴ
７−Ｂｌｕｅ Ｔ（ノバゲン）中へ製造業者のプロトコ
ルに従い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）
ＪＭ １０９株を宿主細菌として用いてサブクローニン
グした。プラスミドをミニ−プレプ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅ
ｐ）アルカリ法の改変様式で単離して（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔａｌ．，１９８９）、配列決定用プラスミド調
製物を得た。すべてのプラスミド構築体のヌクレオチド
配列決定にチェインターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒｅ
ｔ ａｌ．，１９７７）を用いた。ＤＮＡシークエンサ
ーモデル３７３Ｓ（パーキン・エルマー、アプライド・
バイオシステムズ）を用い、ＤＮＡをダイ−デオキシ
（Ｄｙｅ−Ｄｅｏｘｙ、商標）ターミネーターサイクル
配列決定用キットで標識した後、二本鎖ＤＮＡについて
配列決定を行った。
ｅｔ ａｌ．，１９９０）、プラスミドベクターｐＴ
７−Ｂｌｕｅ Ｔ（ノバゲン）中へ製造業者のプロトコ
ルに従い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）
ＪＭ １０９株を宿主細菌として用いてサブクローニン
グした。プラスミドをミニ−プレプ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅ
ｐ）アルカリ法の改変様式で単離して（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔａｌ．，１９８９）、配列決定用プラスミド調
製物を得た。すべてのプラスミド構築体のヌクレオチド
配列決定にチェインターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒｅ
ｔ ａｌ．，１９７７）を用いた。ＤＮＡシークエンサ
ーモデル３７３Ｓ（パーキン・エルマー、アプライド・
バイオシステムズ）を用い、ＤＮＡをダイ−デオキシ
（Ｄｙｅ−Ｄｅｏｘｙ、商標）ターミネーターサイクル
配列決定用キットで標識した後、二本鎖ＤＮＡについて
配列決定を行った。
【００３４】配列分析 適切なコンピュータープログラム付きのアプライド・バ
イオシステムズモデル６７０１インヘリット（ＩＮＨＥ
ＲＩＴ）配列分析システムを用いて、配列エントリーお
よび分析を行った。比較のために用いた配列は、スイス
プロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）またはジーンバンクの
データベースから入手できる。
イオシステムズモデル６７０１インヘリット（ＩＮＨＥ
ＲＩＴ）配列分析システムを用いて、配列エントリーお
よび分析を行った。比較のために用いた配列は、スイス
プロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）またはジーンバンクの
データベースから入手できる。
【００３５】ノーザンブロット分析 本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）
に従って、下記の操作を行った。ノーザンブロット分析
用試料をカタクチイワシの種々の組織から採集した。こ
れには骨格筋、心臓、胃、幽門垂、肝臓および腸が含ま
れる。約１０μｇの全ＲＮＡを５０％ホルムアミド中、
６５℃で１５分間変性させ、２．２Ｍホルムアミドを含
有する２０ｍＭモップス（Ｍｏｐｓ）（ｐＨ７．０）
中、０．９％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上での電気泳動
により分画した。電気泳動の後、分画試料を２０×ＳＳ
Ｃ中のハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ＋ナイロン膜（ア
マシャム）へ、キャピラリーにより移した。移したＲＮ
Ａを８０℃で真空中、１時間のベーキングにより膜に固
定した。次いで１ｍＭ ＥＤＴＡおよび７％ＳＤＳを含
有する０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）中、６５
℃で１時間、ＲＮＡブロットを保有する膜をプレハイブ
リダイズした（Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｇｅｒ
ｔ，１９８４）。プレハイブリダイゼーションに用いた
ものと同じであるが、後記に従って調製した［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰを含有する溶液中、６５℃で２０時間、
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン後、膜を下記のもので順に洗浄した：０．１％ＳＤ
Ｓを含有する２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化
ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムであ
る）、室温で２０分間；０．１％ＳＤＳを含有する１×
ＳＳＣ、６５℃で３０分間；０．１％ＳＤＳを含有する
０．１×ＳＳＣ、６５℃で１０分間。洗浄後、Ｘ線フィ
ルム上、８０℃で２４時間、増強スクリーンを用いてオ
ートラジオグラフィー処理した。
に従って、下記の操作を行った。ノーザンブロット分析
用試料をカタクチイワシの種々の組織から採集した。こ
れには骨格筋、心臓、胃、幽門垂、肝臓および腸が含ま
れる。約１０μｇの全ＲＮＡを５０％ホルムアミド中、
６５℃で１５分間変性させ、２．２Ｍホルムアミドを含
有する２０ｍＭモップス（Ｍｏｐｓ）（ｐＨ７．０）
中、０．９％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上での電気泳動
により分画した。電気泳動の後、分画試料を２０×ＳＳ
Ｃ中のハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ＋ナイロン膜（ア
マシャム）へ、キャピラリーにより移した。移したＲＮ
Ａを８０℃で真空中、１時間のベーキングにより膜に固
定した。次いで１ｍＭ ＥＤＴＡおよび７％ＳＤＳを含
有する０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）中、６５
℃で１時間、ＲＮＡブロットを保有する膜をプレハイブ
リダイズした（Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｇｅｒ
ｔ，１９８４）。プレハイブリダイゼーションに用いた
ものと同じであるが、後記に従って調製した［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰを含有する溶液中、６５℃で２０時間、
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン後、膜を下記のもので順に洗浄した：０．１％ＳＤ
Ｓを含有する２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化
ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムであ
る）、室温で２０分間；０．１％ＳＤＳを含有する１×
ＳＳＣ、６５℃で３０分間；０．１％ＳＤＳを含有する
０．１×ＳＳＣ、６５℃で１０分間。洗浄後、Ｘ線フィ
ルム上、８０℃で２４時間、増強スクリーンを用いてオ
ートラジオグラフィー処理した。
【００３６】カタクチイワシトリプシノーゲンアイソザ
イムＩ（ａＴｒｙ Ｉ；図７）の３’末端に対応する４
０８ｂｐ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅さ
せ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰの存在下で、ランダムプライ
マーＤＮＡ標識キットＶｅｒ．２（タカラ）を用い、Ｆ
ｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９
８３）の方法に従ってランダムに標識した。得られた放
射性標識プローブを、ウルトラフリー−ＭＣ（Ｕｌｔｒ
ａＦｒｅｅ−ＭＣ）遠心フィルター（ミリポア）により
精製した。
イムＩ（ａＴｒｙ Ｉ；図７）の３’末端に対応する４
０８ｂｐ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅さ
せ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰの存在下で、ランダムプライ
マーＤＮＡ標識キットＶｅｒ．２（タカラ）を用い、Ｆ
ｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９
８３）の方法に従ってランダムに標識した。得られた放
射性標識プローブを、ウルトラフリー−ＭＣ（Ｕｌｔｒ
ａＦｒｅｅ−ＭＣ）遠心フィルター（ミリポア）により
精製した。
【００３７】サザンブロット分析 カタクチイワシ骨格筋からＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７）の方法によりゲノムＤＮＡを調製し
た。カタクチイワシゲノムＤＮＡ（７μｇ）を制限酵素
Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎ ｄＩＩＩで消化した。消化
物を０．８％アガロースゲル上での電気泳動によりサイ
ズ分画し、ナイロン膜（ハイボンドＮ＋、アマシャム）
へ移した。ハイブリダイゼーション前に、膜を８０℃で
真空中、１時間のベーキングにより膜に固定した。ノー
ザンブロット分析について記載したように、ａＴｒｙ
Ｉの３’末端に対応するＤＮＡフラグメントを［α−32
Ｐ］ｄＣＴＰの存在下でランダムに標識した。以後の操
作も前記と同様に、ただし下記の点を若干変更して実施
した。膜を４２℃で１４時間、下記を含有する溶液中で
プレハイブリダイズした：５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム
である）、１０％硫酸デキストラン、５×デンハート
（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液（１×デンハート溶液は、
０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）４００、０．１％
ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン、
ＢＳＡ）、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、およ
び１００ｍｇ／ｍｌ熱変性子ウシ胸腺ＤＮＡ。プレハイ
ブリダイゼーションに用いたものと同じであるが、32Ｐ
標識プローブを含有する溶液中、４２℃で２０時間、ハ
イブリダイゼーションを行った。０．１％ＳＤＳを含有
する１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム）により６５℃で３０分間洗浄した
後、膜をＸ線フィルム上、８０℃で４８時間、増強スク
リーンを用いて露光した。三次元モデルの構築 カタクチイワシトリプシンＩおよびＩＩの三次元モデル
をコンピュータープログラムＰｒｏＭｏｄ、すなわちス
イス−モデルが供給している知識ベース自動タンパク質
モデリングツールにより構築した（Ｐｅｉｔｓｃｈ，１
９９５；１９９６）。構築体の座標を、スイス−Ｐｄｂ
ビューワー（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ）およ
びＲａｓＭｏｌにより観察および分析した。ブルックヘ
ブンタンパク質データバンクから得たサケトリプシン
（Ｐｄｂコード：１ＢＺＸ）について実験的に決定した
構造座標を参照構造として用いた。この方法で形成され
るモデルの信頼性は、参照構造との配列同一性およびそ
の結晶学的解像値に依存する。５０％配列同一性をもつ
タンパク質の共通コアは１Åの相対平均二乗偏差分の偏
差をもつことが観察されている（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎ
ｄ Ｌｅｓｋ，１９８６）。したがって、その結晶学的
解像度が高く（１．８Å）、かつカタクチイワシトリプ
シンとのコア配列同一性が９５％を超えることから、サ
ケ構造体を選択した。ただしそれらの最終電子密度地図
が解釈できないためＣ末端部の最後の３残基が欠けてい
るので（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、そ
れらをウシトリプシン構造（Ｐｄｂコード；１ＡＱ７）
にみられるもので置き換えた。この部分の構造座標をカ
タクチイワシの座標にそのままコピーした。結果 ｃＤＮＡクローンの単離 数種の脊椎動物トリプシンのアミノ酸配列のアラインメ
ントにより保存度の良い構造ペプチドモチーフＳＬＳＧ
ＹＨＦＣＧＧを確認し、変性オリゴヌクレオチドプライ
マーを設計した（表１、図４）。ａＴｒｙＦ１および
３’−ＲＡＣＥプライマー（ＲＴＧ；表１、図３）を用
いるポリメラーゼ連鎖反応によるカタクチイワシ幽門垂
第１鎖ｃＤＮＡの最初の増幅により、電気泳動後のアガ
ロースゲル上に現れるスメアを伴う約７００ｂｐの予想
フラグメントが生成した。したがって、このＰＣＲ生成
物を鋳型とし、ＲＴＧおよびａＴｒｙＦ２［ａＴｒｙＦ
１のすぐ下流にあるネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライ
マーとして設計された（図４）］を用いて、さらにＰＣ
Ｒ増幅を行った。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳
動により分離し、単一の顕著なバンドを溶離し、ｐＴ７
−Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（ノバゲン）中へクローニング
し、配列決定した。６９０ｂｐのヌクレオチド配列が得
られ、これは６００ｂｐのコード領域のほか、推定ポリ
アデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよび終止コドンＴＡ
Ａを含む３’末端非コード領域を含有することが認めら
れた（図５）。この部分ヌクレオチド配列から演繹した
アミノ酸配列の探査により、他の既知の魚類トリプシノ
ーゲンとの相同性がきわめて高いことが明らかになっ
た。
ｌ．（１９８７）の方法によりゲノムＤＮＡを調製し
た。カタクチイワシゲノムＤＮＡ（７μｇ）を制限酵素
Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎ ｄＩＩＩで消化した。消化
物を０．８％アガロースゲル上での電気泳動によりサイ
ズ分画し、ナイロン膜（ハイボンドＮ＋、アマシャム）
へ移した。ハイブリダイゼーション前に、膜を８０℃で
真空中、１時間のベーキングにより膜に固定した。ノー
ザンブロット分析について記載したように、ａＴｒｙ
Ｉの３’末端に対応するＤＮＡフラグメントを［α−32
Ｐ］ｄＣＴＰの存在下でランダムに標識した。以後の操
作も前記と同様に、ただし下記の点を若干変更して実施
した。膜を４２℃で１４時間、下記を含有する溶液中で
プレハイブリダイズした：５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム
である）、１０％硫酸デキストラン、５×デンハート
（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液（１×デンハート溶液は、
０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）４００、０．１％
ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン、
ＢＳＡ）、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、およ
び１００ｍｇ／ｍｌ熱変性子ウシ胸腺ＤＮＡ。プレハイ
ブリダイゼーションに用いたものと同じであるが、32Ｐ
標識プローブを含有する溶液中、４２℃で２０時間、ハ
イブリダイゼーションを行った。０．１％ＳＤＳを含有
する１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム）により６５℃で３０分間洗浄した
後、膜をＸ線フィルム上、８０℃で４８時間、増強スク
リーンを用いて露光した。三次元モデルの構築 カタクチイワシトリプシンＩおよびＩＩの三次元モデル
をコンピュータープログラムＰｒｏＭｏｄ、すなわちス
イス−モデルが供給している知識ベース自動タンパク質
モデリングツールにより構築した（Ｐｅｉｔｓｃｈ，１
９９５；１９９６）。構築体の座標を、スイス−Ｐｄｂ
ビューワー（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ）およ
びＲａｓＭｏｌにより観察および分析した。ブルックヘ
ブンタンパク質データバンクから得たサケトリプシン
（Ｐｄｂコード：１ＢＺＸ）について実験的に決定した
構造座標を参照構造として用いた。この方法で形成され
るモデルの信頼性は、参照構造との配列同一性およびそ
の結晶学的解像値に依存する。５０％配列同一性をもつ
タンパク質の共通コアは１Åの相対平均二乗偏差分の偏
差をもつことが観察されている（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎ
ｄ Ｌｅｓｋ，１９８６）。したがって、その結晶学的
解像度が高く（１．８Å）、かつカタクチイワシトリプ
シンとのコア配列同一性が９５％を超えることから、サ
ケ構造体を選択した。ただしそれらの最終電子密度地図
が解釈できないためＣ末端部の最後の３残基が欠けてい
るので（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、そ
れらをウシトリプシン構造（Ｐｄｂコード；１ＡＱ７）
にみられるもので置き換えた。この部分の構造座標をカ
タクチイワシの座標にそのままコピーした。結果 ｃＤＮＡクローンの単離 数種の脊椎動物トリプシンのアミノ酸配列のアラインメ
ントにより保存度の良い構造ペプチドモチーフＳＬＳＧ
ＹＨＦＣＧＧを確認し、変性オリゴヌクレオチドプライ
マーを設計した（表１、図４）。ａＴｒｙＦ１および
３’−ＲＡＣＥプライマー（ＲＴＧ；表１、図３）を用
いるポリメラーゼ連鎖反応によるカタクチイワシ幽門垂
第１鎖ｃＤＮＡの最初の増幅により、電気泳動後のアガ
ロースゲル上に現れるスメアを伴う約７００ｂｐの予想
フラグメントが生成した。したがって、このＰＣＲ生成
物を鋳型とし、ＲＴＧおよびａＴｒｙＦ２［ａＴｒｙＦ
１のすぐ下流にあるネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライ
マーとして設計された（図４）］を用いて、さらにＰＣ
Ｒ増幅を行った。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳
動により分離し、単一の顕著なバンドを溶離し、ｐＴ７
−Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（ノバゲン）中へクローニング
し、配列決定した。６９０ｂｐのヌクレオチド配列が得
られ、これは６００ｂｐのコード領域のほか、推定ポリ
アデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよび終止コドンＴＡ
Ａを含む３’末端非コード領域を含有することが認めら
れた（図５）。この部分ヌクレオチド配列から演繹した
アミノ酸配列の探査により、他の既知の魚類トリプシノ
ーゲンとの相同性がきわめて高いことが明らかになっ
た。
【００３８】完全ヌクレオチド配列を得るために、この
クローン化フラグメントの配列情報から求めた特異的プ
ライマー（ＧＳＰ１、ＧＳＰ２およびＧＳＰ３；表１、
図３）を用いて５’−ＲＡＣＥを行った。材料と方法の
章に記載したように第１鎖ｃＤＮＡを合成した。プライ
マーＡＵＡＰおよびＧＳＰ２（表１、図３）を用いてＰ
ＣＲ増幅を行い、次いで内部プライマーＧＳＰ３を用い
て他のネステッドＰＣＲを行った。増幅生成物を、ゲル
精製、サブクローニングおよび配列決定した。２３４ｂ
ｐの配列が、推定ＡＴＧ開始コドン、および３’−ＲＡ
ＣＥで得たものとオーバーラップする９４ｂｐの領域を
含むことが認められた（図６）。５’−ＲＡＣＥクロー
ンと３’−ＲＡＣＥクローンのオーバーラップ領域には
差がなかったので、この配列はカタクチイワシトリプシ
ノーゲンの５’末端であると考えられた。これは単一Ｐ
ＣＲおよび全長配列決定により、さらにはっきり確認さ
れた（ａＴｒｙ Ｉ；図７）。
クローン化フラグメントの配列情報から求めた特異的プ
ライマー（ＧＳＰ１、ＧＳＰ２およびＧＳＰ３；表１、
図３）を用いて５’−ＲＡＣＥを行った。材料と方法の
章に記載したように第１鎖ｃＤＮＡを合成した。プライ
マーＡＵＡＰおよびＧＳＰ２（表１、図３）を用いてＰ
ＣＲ増幅を行い、次いで内部プライマーＧＳＰ３を用い
て他のネステッドＰＣＲを行った。増幅生成物を、ゲル
精製、サブクローニングおよび配列決定した。２３４ｂ
ｐの配列が、推定ＡＴＧ開始コドン、および３’−ＲＡ
ＣＥで得たものとオーバーラップする９４ｂｐの領域を
含むことが認められた（図６）。５’−ＲＡＣＥクロー
ンと３’−ＲＡＣＥクローンのオーバーラップ領域には
差がなかったので、この配列はカタクチイワシトリプシ
ノーゲンの５’末端であると考えられた。これは単一Ｐ
ＣＲおよび全長配列決定により、さらにはっきり確認さ
れた（ａＴｒｙ Ｉ；図７）。
【００３９】可能性のあるカタクチイワシトリプシノー
ゲンのアイソザイムをコードする他のクローンを単離す
るために、ａＴｒｙ Ｉ配列の第１ヌクレオチドから他
のプライマーを設計し、３’−アンカープライマーと共
に第１鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いた（表１、図
３）。得られたＰＣＲ生成物を前記に従ってゲル精製お
よびサブクローニングした。次いで幾つかの組換えクロ
ーンをヌクレオチド配列決定して、カタクチイワシトリ
プシノーゲンの他のアイソザイムをコードする、より長
い挿入配列を含むクローンを確認した（ａＴｒｙ Ｉ
Ｉ；図８）。
ゲンのアイソザイムをコードする他のクローンを単離す
るために、ａＴｒｙ Ｉ配列の第１ヌクレオチドから他
のプライマーを設計し、３’−アンカープライマーと共
に第１鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いた（表１、図
３）。得られたＰＣＲ生成物を前記に従ってゲル精製お
よびサブクローニングした。次いで幾つかの組換えクロ
ーンをヌクレオチド配列決定して、カタクチイワシトリ
プシノーゲンの他のアイソザイムをコードする、より長
い挿入配列を含むクローンを確認した（ａＴｒｙ Ｉ
Ｉ；図８）。
【００４０】
【表１】 表１．カタクチイワシトリプシノーゲンのＰＣＲ増幅に用いたプライマーのＤＮ Ａヌクレオチド配列 No. 表示 配列 ヌクレオチド位置 1. aTryF1 5'-TC(T/C)CTGAA(T/C)TCTGG(C/A)TACCA-3' 115-134 2. aTryF2 5'-GG(C/A)TACCACTTCTG(T/C)GG(T/A/G)GG-3' 127-146 3. RTG 5'-AACTGGAAGAATTCCGCGGC-3' 3'-末端 4. GSP1 5'-GCCCCAGCCAGCCACAAG-3' 288-305 5. GSP2 5'-GGCGGGCGTGCTCAGCTTGA-3' 202-221 6. GSP3 5'-CGCCCAAACGCACCTCAACA-3' 73-93 7. AUAP 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 5'-末端8. aTryF3 5'-ATCGACAGGATCAATCAGC-3' 1-19 * 最初の２つのプライマーのヌクレオチド位置は南極圏
サケトリプシノーゲン配列のものを表し（Ｍａｌｅ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５）、プライマー４、５および６の
配列は本発明の３’−ＲＡＣＥ配列に相当する（図５参
照）。プライマー３および７は、それぞれ３’および
５’−ＲＡＣＥキットに含まれるアンカープライマーの
アダプター領域と同じ配列をもっていた。プライマー８
は、本発明のａＴｒｙ Ｉクローンの全長配列の第１ヌ
クレオチドから設計された（図７参照）。単離クローンのｃＤＮＡ特性 ２クローンａＴｒｙ ＩおよびａＴｒｙ ＩＩは、真核
生物転写体の構造特徴をすべて含むと思われた。８３２
ｂｐの挿入配列をもつａＴｒｙ Ｉは、５’側および
３’側非翻訳領域によりフランキングされた、第１ＡＴ
Ｇ開始コドンからＴＡＡ終止コドンまで７２０ｂｐのオ
ープンリーディングフレームを含む（図７）。他方、ａ
Ｔｒｙ ＩＩは、７２３ｂｐのオープンリーディングフ
レームをもつ、より長い挿入配列（９７４ｂｐ；図８）
を含むことが認められた。これら２つの形のカタクチイ
ワシトリプシノーゲンｃＤＮＡは、図９に示すようにヌ
クレオチドレベルで約９２％の配列同一性をもつ（５’
側および３’側非コード領域を除く）。５’側および３’側非コード領域 カタクチイワシトリプシノーゲンｃＤＮＡの両アイソザ
イムの５’−非コード領域は、ＡＴＧ開始コドンに隣接
する２３ヌクレオチドの長さであると思われる（図
９）。ＡＴＧからの位置−３のヌクレオチドはアデニン
である。これは、真核生物ｍＲＮＡの大部分の基準開始
コドンがこの位置にプリンを含むというＫｏｚａｋ（１
９８１，１９８６）の所見と一致する。Ｋｏｚａｋ（１
９８１，１９８６）はさらに、高い割合の機能性開始部
位が位置＋４にもプリンをもつことを見出した。これは
カタクチイワシトリプシノーゲンについても当てはま
る。しかし提唱されたＡ／ＧＣＣＡＴＧＧコンセンサス
配列によれば、それらはこの位置に最も好ましい塩基
（Ｇ）に従わない。このコンセンサス配列は、厳密には
非ＡＴＧイニシエーター（この用語は意図せずにＷｉｅ
ｇａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３により用いられた）
について、または機能性イニシエーターの周りに余分な
ＡＴＧトリプレットが出現して４０Ｓリボソームサブユ
ニットがそれらを識別する必要のある場合に、作動する
と思われる。図１０ｃに提示する多数のトリプシノーゲ
ンヌクレオチド配列により証明されるように、基準開始
コドンについて位置＋４にＧがあるのは普遍的ではない
と思われる。
サケトリプシノーゲン配列のものを表し（Ｍａｌｅ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５）、プライマー４、５および６の
配列は本発明の３’−ＲＡＣＥ配列に相当する（図５参
照）。プライマー３および７は、それぞれ３’および
５’−ＲＡＣＥキットに含まれるアンカープライマーの
アダプター領域と同じ配列をもっていた。プライマー８
は、本発明のａＴｒｙ Ｉクローンの全長配列の第１ヌ
クレオチドから設計された（図７参照）。単離クローンのｃＤＮＡ特性 ２クローンａＴｒｙ ＩおよびａＴｒｙ ＩＩは、真核
生物転写体の構造特徴をすべて含むと思われた。８３２
ｂｐの挿入配列をもつａＴｒｙ Ｉは、５’側および
３’側非翻訳領域によりフランキングされた、第１ＡＴ
Ｇ開始コドンからＴＡＡ終止コドンまで７２０ｂｐのオ
ープンリーディングフレームを含む（図７）。他方、ａ
Ｔｒｙ ＩＩは、７２３ｂｐのオープンリーディングフ
レームをもつ、より長い挿入配列（９７４ｂｐ；図８）
を含むことが認められた。これら２つの形のカタクチイ
ワシトリプシノーゲンｃＤＮＡは、図９に示すようにヌ
クレオチドレベルで約９２％の配列同一性をもつ（５’
側および３’側非コード領域を除く）。５’側および３’側非コード領域 カタクチイワシトリプシノーゲンｃＤＮＡの両アイソザ
イムの５’−非コード領域は、ＡＴＧ開始コドンに隣接
する２３ヌクレオチドの長さであると思われる（図
９）。ＡＴＧからの位置−３のヌクレオチドはアデニン
である。これは、真核生物ｍＲＮＡの大部分の基準開始
コドンがこの位置にプリンを含むというＫｏｚａｋ（１
９８１，１９８６）の所見と一致する。Ｋｏｚａｋ（１
９８１，１９８６）はさらに、高い割合の機能性開始部
位が位置＋４にもプリンをもつことを見出した。これは
カタクチイワシトリプシノーゲンについても当てはま
る。しかし提唱されたＡ／ＧＣＣＡＴＧＧコンセンサス
配列によれば、それらはこの位置に最も好ましい塩基
（Ｇ）に従わない。このコンセンサス配列は、厳密には
非ＡＴＧイニシエーター（この用語は意図せずにＷｉｅ
ｇａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３により用いられた）
について、または機能性イニシエーターの周りに余分な
ＡＴＧトリプレットが出現して４０Ｓリボソームサブユ
ニットがそれらを識別する必要のある場合に、作動する
と思われる。図１０ｃに提示する多数のトリプシノーゲ
ンヌクレオチド配列により証明されるように、基準開始
コドンについて位置＋４にＧがあるのは普遍的ではない
と思われる。
【００４１】カタクチイワシトリプシノーゲンの５’側
非コード領域は、報告された他のすべての脊椎動物配列
のうち最長のヌクレオチドを含む（２３ｂｐ；図１０
ｃ）。既知トリプシノーゲン遺伝子の大部分のｃＤＮＡ
５’側非コード領域は、約１２〜１５ヌクレオチドの
長さである。カタクチイワシトリプシノーゲンＩおよび
ＩＩ遺伝子の正確な転写開始部位は決定されていない
が、ここに報告するｃＤＮＡ配列は全長配列であろう。
真核生物ｍＲＮＡの安定化と翻訳開始効率には短い５’
側非コードリーダー配列の存在が必須であろうと示唆さ
れている（Ｋｏｚａｋ，１９８１）。異種からのトリプ
シノーゲン５’−非コード領域間にはほとんど配列保存
がない（図１０ｃ）。したがって、この領域が翻訳の開
始機構の安定化のほかにトリプシノーゲン遺伝子の発現
または翻訳に何らかの調節の役割を果たしているとは思
われない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
非コード領域は、報告された他のすべての脊椎動物配列
のうち最長のヌクレオチドを含む（２３ｂｐ；図１０
ｃ）。既知トリプシノーゲン遺伝子の大部分のｃＤＮＡ
５’側非コード領域は、約１２〜１５ヌクレオチドの
長さである。カタクチイワシトリプシノーゲンＩおよび
ＩＩ遺伝子の正確な転写開始部位は決定されていない
が、ここに報告するｃＤＮＡ配列は全長配列であろう。
真核生物ｍＲＮＡの安定化と翻訳開始効率には短い５’
側非コードリーダー配列の存在が必須であろうと示唆さ
れている（Ｋｏｚａｋ，１９８１）。異種からのトリプ
シノーゲン５’−非コード領域間にはほとんど配列保存
がない（図１０ｃ）。したがって、この領域が翻訳の開
始機構の安定化のほかにトリプシノーゲン遺伝子の発現
または翻訳に何らかの調節の役割を果たしているとは思
われない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００４２】あらゆる生物源からの小さなリボソームサ
ブユニットのＲＮＡは、それらの３’末端においては広
範なヌクレオチド配列類似性を示す（Ｋｎｉｐｐｅｎｂ
ｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。アニオン性および
カチオン性トリプシノーゲンは真核生物１８Ｓリボソー
ムＲＮＡのオーバーラップ領域に対し相補的な配列を含
むことが示された（Ｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９
８５）。カタクチイワシトリプシノーゲンの５’側非コ
ード領域は、真核生物１８ＳリボソームＲＮＡに相補的
な１２ヌクレオチドを含む。これを図１０ｂに、Ｐｉｎ
ｓｋｙ ｅｔａｌ．（１９８５）が証明したイヌアニオ
ン性トリプシノーゲンの５’側非コード領域の潜在的ハ
イブリダイゼーションと共に示す。
ブユニットのＲＮＡは、それらの３’末端においては広
範なヌクレオチド配列類似性を示す（Ｋｎｉｐｐｅｎｂ
ｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。アニオン性および
カチオン性トリプシノーゲンは真核生物１８Ｓリボソー
ムＲＮＡのオーバーラップ領域に対し相補的な配列を含
むことが示された（Ｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９
８５）。カタクチイワシトリプシノーゲンの５’側非コ
ード領域は、真核生物１８ＳリボソームＲＮＡに相補的
な１２ヌクレオチドを含む。これを図１０ｂに、Ｐｉｎ
ｓｋｙ ｅｔａｌ．（１９８５）が証明したイヌアニオ
ン性トリプシノーゲンの５’側非コード領域の潜在的ハ
イブリダイゼーションと共に示す。
【００４３】カタクチイワシトリプシノーゲンのポリア
デニル化シグナルは、他のすべての真核生物遺伝子と同
様に比較的近接した位置にある２つの配列からなる。一
方は実質的に非変異性のＡＡＴＡＡＡ配列、他方は２５
〜３０ｂｐ下流にあるＧＴまたはＴに富むセグメントで
ある（図７および８）。カタクチイワシトリプシノーゲ
ンのポリ（Ａ）シグナルは、予想どおりポリ（Ａ）トラ
ックの第１Ａから１４〜１８ｂｐ上流にある。しかしカ
タクチイワシトリプシノーゲンＩＩの３’側非コード領
域についてのこれら２つの非コード領域の長さの顕著な
相異は、カタクチイワシトリプシノーゲンＩのものより
１３８ｂｐ長いことである。これは、これまでに報告さ
れている他のすべてのトリプシノーゲンよりかなり長
い。コード領域 前記２種類のトリプシノーゲンの演繹アミノ酸配列を、
それらに対応するヌクレオチド配列と共に図７および８
に示す。カタクチイワシトリプシノーゲンＩのヌクレオ
チド配列（ａＴｒｙ Ｉ；図７）は、第１メチオニンか
ら出発する２４０アミノ酸のプレ−プロタンパク質をコ
ードすると推定される。一方、カタクチイワシトリプシ
ノーゲンＩＩのヌクレオチド配列（ａＴｒｙ Ｉ；図
７）は、１残基長い（２４１アミノ酸残基）であると思
われる。すべての既知トリプシンと同様にカタクチイワ
シトリプシンも、Ｎ末端シグナルペプチドに続く短い
（６〜８アミノ酸残基）活性化ペプチドを含むプレ−プ
ロタンパク質（プレ−トリプシノーゲン）として合成さ
れる。トリプシノーゲン１とＩＩの遺伝子間のコード領
域ｃＤＮＡ配列類似性（シグナルペプチドおよび活性化
ペプチドを除く）は、約８７％である。シグナルペプチド 図１１に、２種類のカタクチイワシトリプシノーゲンア
イソザイムのシグナルペプチドを、数種の魚類および脊
椎動物の配列と比較して示す。一般にシグナルペプチド
は第１メチオニン付近に塩基性残基を含む、らせん破壊
性（ｈｅｌｉｘ−ｂｒｅａｋｉｎｇ）グリシンを末端と
する疎水性コアを含有する（Ｗａｔｓｏｎ，１９８
４）。哺乳動物シグナルペプチドは、より疎水性の低い
アラニンで中断された、それぞれ長さ４および２残基の
２つのクラスターに分かれる。しかしカタクチイワシト
リプシノーゲンのシグナルペプチドは７つの連続した疎
水性残基をもつ。
デニル化シグナルは、他のすべての真核生物遺伝子と同
様に比較的近接した位置にある２つの配列からなる。一
方は実質的に非変異性のＡＡＴＡＡＡ配列、他方は２５
〜３０ｂｐ下流にあるＧＴまたはＴに富むセグメントで
ある（図７および８）。カタクチイワシトリプシノーゲ
ンのポリ（Ａ）シグナルは、予想どおりポリ（Ａ）トラ
ックの第１Ａから１４〜１８ｂｐ上流にある。しかしカ
タクチイワシトリプシノーゲンＩＩの３’側非コード領
域についてのこれら２つの非コード領域の長さの顕著な
相異は、カタクチイワシトリプシノーゲンＩのものより
１３８ｂｐ長いことである。これは、これまでに報告さ
れている他のすべてのトリプシノーゲンよりかなり長
い。コード領域 前記２種類のトリプシノーゲンの演繹アミノ酸配列を、
それらに対応するヌクレオチド配列と共に図７および８
に示す。カタクチイワシトリプシノーゲンＩのヌクレオ
チド配列（ａＴｒｙ Ｉ；図７）は、第１メチオニンか
ら出発する２４０アミノ酸のプレ−プロタンパク質をコ
ードすると推定される。一方、カタクチイワシトリプシ
ノーゲンＩＩのヌクレオチド配列（ａＴｒｙ Ｉ；図
７）は、１残基長い（２４１アミノ酸残基）であると思
われる。すべての既知トリプシンと同様にカタクチイワ
シトリプシンも、Ｎ末端シグナルペプチドに続く短い
（６〜８アミノ酸残基）活性化ペプチドを含むプレ−プ
ロタンパク質（プレ−トリプシノーゲン）として合成さ
れる。トリプシノーゲン１とＩＩの遺伝子間のコード領
域ｃＤＮＡ配列類似性（シグナルペプチドおよび活性化
ペプチドを除く）は、約８７％である。シグナルペプチド 図１１に、２種類のカタクチイワシトリプシノーゲンア
イソザイムのシグナルペプチドを、数種の魚類および脊
椎動物の配列と比較して示す。一般にシグナルペプチド
は第１メチオニン付近に塩基性残基を含む、らせん破壊
性（ｈｅｌｉｘ−ｂｒｅａｋｉｎｇ）グリシンを末端と
する疎水性コアを含有する（Ｗａｔｓｏｎ，１９８
４）。哺乳動物シグナルペプチドは、より疎水性の低い
アラニンで中断された、それぞれ長さ４および２残基の
２つのクラスターに分かれる。しかしカタクチイワシト
リプシノーゲンのシグナルペプチドは７つの連続した疎
水性残基をもつ。
【００４４】カタクチイワシトリプシノーゲンのシグナ
ルペプチドは他の魚類種と同様に１３アミノ酸残基から
なるが、高等脊椎動物トリプシノーゲンのシグナルペプ
チドは１５または１６アミノ酸の長さである（図１
１）。他のプレペプチドの開裂部位および活性化ペプチ
ドのアミノ末端配列の特性に基づいて、カタクチイワシ
トリプシノーゲンシグナルペプチドの開裂はＡｌａ（−
１）とＰｈｅ（１）の間で起きると推定される。活性化ペプチド トリプシノーゲンの典型的な活性化ペプチドは、アニオ
ン性アミノ酸残基のクラスターを含むオクタペプチドま
たはヘキサペプチドである。これらの残基はエンテロキ
ナーゼまたはトリプシン自身により認識され、これらが
活性化ペプチドの開裂によりこのチモーゲンを活性化す
る（Ｌｏｕｖａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９７４）。図１
２に示すように、カタクチイワシトリプシノーゲンＩお
よびＩＩの活性化ペプチドは同一のヘキサペプチドであ
り、タラの場合にみられるのと同様にオクタペプチド構
造体の可能性はない（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９３）。他の魚類活性化ペプチドは
１塩基長い（図１２）が、それらは同じ電荷クラスター
をもつ。それはアスパラギン酸残基で終わる３アミノ酸
残基からなり、ポリアニオンクラスターの前にアラニン
がある。哺乳動物トリプシノーゲンの活性化ペプチド
は、アニオンクラスターが通常は４つの連続した酸性ア
ミノ酸（通常はアスパラギン酸；図１２）からなるとい
う点で、これまでに魚類から確認されたものとかなり異
なる。このプロペプチドのＣ末端に位置し、他のトリプ
シンについてプロ酵素の活性化のために開裂する部位で
あることが知られているリシンが、カタクチイワシの配
列中にも存在する。アミノ酸配列の比較 カタクチイワシトリプシンのアミノ酸配列を、対応する
他の数種の魚類および哺乳動物の配列とアラインさせた
（図１３）。前記のように、カタクチイワシトリプシン
ＩはカタクチイワシトリプシンＩＩおよび比較した他の
魚類配列より１残基短い。しかしそれらを他のアミノ酸
配列とアラインさせるのに著しい数のギャップは必要な
い。このアラインメントから、この欠失はいわゆる自己
消化ループに位置する可能性があり（Ｇｅｎｉｃｏｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９６）、これはウシトリプシンの自
己消化開裂について示されている（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ
ａｎｄ Ｇａｔｔｉ，１９８２；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｈａｗ，１９６８）。一本鎖ウシトリプシン
（β−トリプシン）が残基１４５付近で開裂するとα−
トリプシンが生成し、これはトリプシン活性に影響しな
い（Ｇａｂｌｅ ａｎｄ Ｋａｓｃｈｅ，１９７３）。
ただしα−トリプシンは一本鎖β−トリプシンより低い
熱安定性を示す。さらにα−トリプシンのＬｙｓ−１８
８においてトリプシン開裂するとプソイドトリプシンが
生成し、これがトリプシン基質に対し示す親和性はきわ
めて弱い（Ｓｍｉｔ ａｎｄ Ｓｈａｗ，１９６９）。
興味深いことに、カタクチイワシトリプシンＩＩはカタ
クチイワシトリプシンＩと同じ２つの欠失を必要とする
が、前者の方が１残基長い。この欠失は、ラットトリプ
シンのこの領域にあるイントロン３のスプライスシグナ
ルにおけるシフトの結果であるらしい（図９；Ｃｒａｉ
ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。このように、この場合
は挿入と欠失の頻度が他のいずれより高いと思われる。
カタクチイワシトリプシンの両アイソザイムとも、それ
らに対応するウシ、ラットおよびヒトのトリプシンと、
配列がほとんど等しい。カタクチイワシトリプシンＩは
カレイトリプシンに対し８４％の最高相同性を示し、一
方カタクチイワシトリプシンＩＩは南極圏魚類に対し８
５％の最高相同性を示す（表２）。これら２つのカタク
チイワシトリプシン間には３０アミノ酸の相異がある
が、後記のようにすべての変化は成熟酵素の表面で起
き、構造の補償や著しい電荷プロフィルシフトはない。
触媒三つ組残基、Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２および
Ｓｅｒ−１９５は、すべての酵素に完全に保存されてい
る。Ｓ１基質結合ポケット（特異性ポケット）を形成す
るアミノ酸は、両カタクチイワシ配列とも典型的なトリ
プシン性のものであり、Ａｓｐ１８９を底部とし、Ｇｌ
ｙ−２１６およびＧｌｙ−２２６がポケットの側面を内
張りする。活性部位Ｓｅｒ−１９５の周りにあるコンセ
ンサス反復ＧＤＳＧＧは、通常はセリンプロテアーゼに
特徴的であり（Ｋｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、
これもカタクチイワシトリプシンの両アイソザイムに良
く保存されている。基質結合ポケットを支える２つのル
ープ（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ ｅｔａｌ．，１９９２）が残
基１７２に沿って示される。これはトリプシンの基質特
異性を決定するのに重要な残基であることが示されてい
る（Ｈｅｄｓｔｒｏｍｅｔ ａｌ．，１９９４ａ；図１
３）。ウシトリプシンの基質結合ポケットを内張りし、
エステル加水分解の特異性に関与するとされる残基１８
９〜１９２および２１４〜２１６（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ
ｅｔ ａｌ．，１９９２）は、すべてカタクチイワシト
リプシン中に保存されている。ループ２のすぐ下流にあ
る残基２２５はほとんどすべてのセリンプロテアーゼ中
に高度に保存されているプロリンであり（Ｇｕｉｎｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９９）、これもカタクチイワシ配
列中に存在する。数字はウシキモトリプシンのナンバリ
ングから適用した慣例を表す（Ｈａｒｔｅｌｙ ａｎｄ
Ｋａｕｆｆｍａｎ，１９６６）。１２のシステイン残
基すべて（６つのジスルフィド橋を形成する）も保存さ
れている。
ルペプチドは他の魚類種と同様に１３アミノ酸残基から
なるが、高等脊椎動物トリプシノーゲンのシグナルペプ
チドは１５または１６アミノ酸の長さである（図１
１）。他のプレペプチドの開裂部位および活性化ペプチ
ドのアミノ末端配列の特性に基づいて、カタクチイワシ
トリプシノーゲンシグナルペプチドの開裂はＡｌａ（−
１）とＰｈｅ（１）の間で起きると推定される。活性化ペプチド トリプシノーゲンの典型的な活性化ペプチドは、アニオ
ン性アミノ酸残基のクラスターを含むオクタペプチドま
たはヘキサペプチドである。これらの残基はエンテロキ
ナーゼまたはトリプシン自身により認識され、これらが
活性化ペプチドの開裂によりこのチモーゲンを活性化す
る（Ｌｏｕｖａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９７４）。図１
２に示すように、カタクチイワシトリプシノーゲンＩお
よびＩＩの活性化ペプチドは同一のヘキサペプチドであ
り、タラの場合にみられるのと同様にオクタペプチド構
造体の可能性はない（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９３）。他の魚類活性化ペプチドは
１塩基長い（図１２）が、それらは同じ電荷クラスター
をもつ。それはアスパラギン酸残基で終わる３アミノ酸
残基からなり、ポリアニオンクラスターの前にアラニン
がある。哺乳動物トリプシノーゲンの活性化ペプチド
は、アニオンクラスターが通常は４つの連続した酸性ア
ミノ酸（通常はアスパラギン酸；図１２）からなるとい
う点で、これまでに魚類から確認されたものとかなり異
なる。このプロペプチドのＣ末端に位置し、他のトリプ
シンについてプロ酵素の活性化のために開裂する部位で
あることが知られているリシンが、カタクチイワシの配
列中にも存在する。アミノ酸配列の比較 カタクチイワシトリプシンのアミノ酸配列を、対応する
他の数種の魚類および哺乳動物の配列とアラインさせた
（図１３）。前記のように、カタクチイワシトリプシン
ＩはカタクチイワシトリプシンＩＩおよび比較した他の
魚類配列より１残基短い。しかしそれらを他のアミノ酸
配列とアラインさせるのに著しい数のギャップは必要な
い。このアラインメントから、この欠失はいわゆる自己
消化ループに位置する可能性があり（Ｇｅｎｉｃｏｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９６）、これはウシトリプシンの自
己消化開裂について示されている（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ
ａｎｄ Ｇａｔｔｉ，１９８２；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｈａｗ，１９６８）。一本鎖ウシトリプシン
（β−トリプシン）が残基１４５付近で開裂するとα−
トリプシンが生成し、これはトリプシン活性に影響しな
い（Ｇａｂｌｅ ａｎｄ Ｋａｓｃｈｅ，１９７３）。
ただしα−トリプシンは一本鎖β−トリプシンより低い
熱安定性を示す。さらにα−トリプシンのＬｙｓ−１８
８においてトリプシン開裂するとプソイドトリプシンが
生成し、これがトリプシン基質に対し示す親和性はきわ
めて弱い（Ｓｍｉｔ ａｎｄ Ｓｈａｗ，１９６９）。
興味深いことに、カタクチイワシトリプシンＩＩはカタ
クチイワシトリプシンＩと同じ２つの欠失を必要とする
が、前者の方が１残基長い。この欠失は、ラットトリプ
シンのこの領域にあるイントロン３のスプライスシグナ
ルにおけるシフトの結果であるらしい（図９；Ｃｒａｉ
ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。このように、この場合
は挿入と欠失の頻度が他のいずれより高いと思われる。
カタクチイワシトリプシンの両アイソザイムとも、それ
らに対応するウシ、ラットおよびヒトのトリプシンと、
配列がほとんど等しい。カタクチイワシトリプシンＩは
カレイトリプシンに対し８４％の最高相同性を示し、一
方カタクチイワシトリプシンＩＩは南極圏魚類に対し８
５％の最高相同性を示す（表２）。これら２つのカタク
チイワシトリプシン間には３０アミノ酸の相異がある
が、後記のようにすべての変化は成熟酵素の表面で起
き、構造の補償や著しい電荷プロフィルシフトはない。
触媒三つ組残基、Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２および
Ｓｅｒ−１９５は、すべての酵素に完全に保存されてい
る。Ｓ１基質結合ポケット（特異性ポケット）を形成す
るアミノ酸は、両カタクチイワシ配列とも典型的なトリ
プシン性のものであり、Ａｓｐ１８９を底部とし、Ｇｌ
ｙ−２１６およびＧｌｙ−２２６がポケットの側面を内
張りする。活性部位Ｓｅｒ−１９５の周りにあるコンセ
ンサス反復ＧＤＳＧＧは、通常はセリンプロテアーゼに
特徴的であり（Ｋｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、
これもカタクチイワシトリプシンの両アイソザイムに良
く保存されている。基質結合ポケットを支える２つのル
ープ（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ ｅｔａｌ．，１９９２）が残
基１７２に沿って示される。これはトリプシンの基質特
異性を決定するのに重要な残基であることが示されてい
る（Ｈｅｄｓｔｒｏｍｅｔ ａｌ．，１９９４ａ；図１
３）。ウシトリプシンの基質結合ポケットを内張りし、
エステル加水分解の特異性に関与するとされる残基１８
９〜１９２および２１４〜２１６（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ
ｅｔ ａｌ．，１９９２）は、すべてカタクチイワシト
リプシン中に保存されている。ループ２のすぐ下流にあ
る残基２２５はほとんどすべてのセリンプロテアーゼ中
に高度に保存されているプロリンであり（Ｇｕｉｎｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９９）、これもカタクチイワシ配
列中に存在する。数字はウシキモトリプシンのナンバリ
ングから適用した慣例を表す（Ｈａｒｔｅｌｙ ａｎｄ
Ｋａｕｆｆｍａｎ，１９６６）。１２のシステイン残
基すべて（６つのジスルフィド橋を形成する）も保存さ
れている。
【００４５】
【表２】 表２．カタクチイワシトリプシノーゲンの演繹アミノ酸配列と他の脊椎動物のも のとの相同性％ 脊椎動物種* 片口鰯1 片口鰯 南極 カレイ サケ タラ ラット ウシ ヒト 1 2 圏魚 Ｉ 1 アニオン性 1 片口鰯1 87 83 84 82 76 66 64 60 片口鰯2 87 85 82 82 77 67 64 60 * 相同性比較に用いた配列の出所を図１７の説明文中に挙げた。 カタクチイワシトリプシンのアミノ酸組成を、数種の他
の魚類および哺乳動物トリプシンと共に表３に示す。異
なる魚類トリプシンが類似のアミノ酸組成をもち、魚類
と哺乳動物群の間に有意差はない。しかしカタクチイワ
シトリプシンは他の魚類トリプシンと同様に、それらに
対応する哺乳動物トリプシンより高いメチオニン含量を
もつ。ここに提示する２種類のカタクチイワシトリプシ
ンのアミノ酸組成と、先に発表されたカタクチイワシの
アミノ酸配列（Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）との
間に著しい相異があることを述べるべきである。この相
異、たとえば同じカタクチイワシＩのアミノ酸につい
て、３２残基のＡｓｐ、２４残基のＧｌｕ、３０残基の
Ｓｅｒ、および３残基のＭｅｔ（Ｈｅｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５）（それぞれ１２、９、２２および６に
対応する（本発明））は、表３に提示した組成がヌクレ
オチド配列から演繹したものであるという事実だけでは
説明できない。特に注目すべき点は５システイン残基の
存在（Ｈｅｕ ｅｔａｌ．，１９９５）であり、これは
大部分の脊椎動物において６つのジスルフィド橋に必要
な（Ｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７）１２残基
（本発明）と全く対照的である。さらに、グルタミンお
よびアスパラギンの数を除く全アミノ酸残基は２３５と
報告された（Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これ
は実験的に測定されたものまたはヌクレオチド配列から
演繹されたもののいずれであっても、これまでに報告さ
れたいかなるトリプシンよりはるかに多い（Ｒｏａｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９７に概説）。
の魚類および哺乳動物トリプシンと共に表３に示す。異
なる魚類トリプシンが類似のアミノ酸組成をもち、魚類
と哺乳動物群の間に有意差はない。しかしカタクチイワ
シトリプシンは他の魚類トリプシンと同様に、それらに
対応する哺乳動物トリプシンより高いメチオニン含量を
もつ。ここに提示する２種類のカタクチイワシトリプシ
ンのアミノ酸組成と、先に発表されたカタクチイワシの
アミノ酸配列（Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）との
間に著しい相異があることを述べるべきである。この相
異、たとえば同じカタクチイワシＩのアミノ酸につい
て、３２残基のＡｓｐ、２４残基のＧｌｕ、３０残基の
Ｓｅｒ、および３残基のＭｅｔ（Ｈｅｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５）（それぞれ１２、９、２２および６に
対応する（本発明））は、表３に提示した組成がヌクレ
オチド配列から演繹したものであるという事実だけでは
説明できない。特に注目すべき点は５システイン残基の
存在（Ｈｅｕ ｅｔａｌ．，１９９５）であり、これは
大部分の脊椎動物において６つのジスルフィド橋に必要
な（Ｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７）１２残基
（本発明）と全く対照的である。さらに、グルタミンお
よびアスパラギンの数を除く全アミノ酸残基は２３５と
報告された（Ｈｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これ
は実験的に測定されたものまたはヌクレオチド配列から
演繹されたもののいずれであっても、これまでに報告さ
れたいかなるトリプシンよりはるかに多い（Ｒｏａｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９７に概説）。
【００４６】
【表３】表３．カタクチイワシおよび他の脊椎動物から
のトリプシンのアミノ酸組成。各種のヌクレオチド配列
から演繹したアミノ酸配列は、図１７の説明文中に引用
したものから採用した。
のトリプシンのアミノ酸組成。各種のヌクレオチド配列
から演繹したアミノ酸配列は、図１７の説明文中に引用
したものから採用した。
【００４７】 アミノ酸 片口鰯 タラ サケＩ ウシ ラット I II I X Ala 13 10 16 15 13 18 17 Arg 7 6 6 7 4 3 3 Asn 13 11 11 11 17 13 17 Asp 12 13 10 12 7 10 10 Cys 12 12 12 12 12 12 12 Gln 12 12 8 8 7 12 11 Glu 9 9 7 8 9 8 7 Gly 23 24 23 23 23 25 24 His 8 7 10 9 5 5 5 Ile 10 13 9 9 11 16 15 Leu 14 13 15 15 13 20 17 Lys 5 7 8 6 8 7 7 Met 6 8 6 6 6 1 2 Phe 4 4 2 3 4 3 4 Pro 9 10 7 7 10 9 13 Ser 22 24 24 24 26 20 19 Thr 9 7 10 10 12 9 7 Trp 4 4 4 4 4 5 5 Tyr 10 12 12 11 13 12 8 Val 19 16 22 22 18 16 20 ----------------------------------------------------------------------合計 221 222 222 222 222 224 223 組織発現とゲノムオーガニゼーション トリプシノーゲンｍＲＮＡの組織特異性発現をノーザン
ブロット法により調べた。材料と方法の章に記載したよ
うに、幽門垂、腸、胃、心臓、肝臓および骨格筋から採
集した全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分画
し、ナイロン膜にブロットし、ａＴｒｙ Ｉ ｃＤＮＡ
クローンに由来する４０８ｂｐのＤＮＡプローブにハイ
ブリダイズさせた。予想どおり、幽門垂、次いで腸から
強いハイブリダイゼーション信号が得られた（図１
４）。胃においてもスメア状の信号痕跡がみられた。脊
椎動物からは膵臓以外の組織にも低レベルのトリプシノ
ーゲン発現が報告されている。これにはたとえばニワト
リの肝臓、脾臓および胸腺（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）；ヒトの脳（Ｗｉｅｇａｎｄ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９３）、Ｔ細胞（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）および精子（Ｏｈｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，
１９９９）が含まれる。ごく最近、トリプシノーゲンが
ヒトの胃その他の細胞系で発現することが見出された
（Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。他の組織
におけるトリプシノーゲン遺伝子発現も、まだ分かって
いない何らかの生物学的役割を果たしている可能性があ
る（Ｗａｎｇ ｅｔａｌ．，１９９５）。これは最近の
研究が関心をもつ課題であるように思われる。スメアリ
ングパターンのハイブリダイゼーション信号は、プロー
ブの非特異的結合の人工産物または長期ハイブリダイゼ
ーションによる可能性がある。しかしサケトリプシノー
ゲンには、より強いスメアリングパターンがみられた
（Ｍａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
ブロット法により調べた。材料と方法の章に記載したよ
うに、幽門垂、腸、胃、心臓、肝臓および骨格筋から採
集した全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分画
し、ナイロン膜にブロットし、ａＴｒｙ Ｉ ｃＤＮＡ
クローンに由来する４０８ｂｐのＤＮＡプローブにハイ
ブリダイズさせた。予想どおり、幽門垂、次いで腸から
強いハイブリダイゼーション信号が得られた（図１
４）。胃においてもスメア状の信号痕跡がみられた。脊
椎動物からは膵臓以外の組織にも低レベルのトリプシノ
ーゲン発現が報告されている。これにはたとえばニワト
リの肝臓、脾臓および胸腺（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）；ヒトの脳（Ｗｉｅｇａｎｄ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９３）、Ｔ細胞（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）および精子（Ｏｈｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，
１９９９）が含まれる。ごく最近、トリプシノーゲンが
ヒトの胃その他の細胞系で発現することが見出された
（Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。他の組織
におけるトリプシノーゲン遺伝子発現も、まだ分かって
いない何らかの生物学的役割を果たしている可能性があ
る（Ｗａｎｇ ｅｔａｌ．，１９９５）。これは最近の
研究が関心をもつ課題であるように思われる。スメアリ
ングパターンのハイブリダイゼーション信号は、プロー
ブの非特異的結合の人工産物または長期ハイブリダイゼ
ーションによる可能性がある。しかしサケトリプシノー
ゲンには、より強いスメアリングパターンがみられた
（Ｍａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００４８】同じａＴｒｙ Ｉプローブを用いたカタク
チイワシゲノムＤＮＡのサザンブロット法で、複雑なパ
ターンのバンドがみられた（図１５）。ＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化すると多形バンドがみられ、
これはカタクチイワシトリプシノーゲン遺伝子ファミリ
ーが本発明で単離されたクローン（ａＴｒｙ Ｉおよび
ａＴｒｙ ＩＩ）のほかにさらにアイソザイムを含む可
能性を示す。これは、サケ（Ｍａｌｅ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）、カレイおよび他の多種の魚類（Ｄｏｕｇｌ
ａｓ ａｎｄ Ｇａｌｌａｎｔ，１９９８）にみられた
同じゲノムオーガニゼーションにより、さらに証明され
る。構造と進化 カタクチイワシトリプシンＩの配列とカタクチイワシト
リプシンＩＩの配列は３０アミノ酸の相違があるけれど
も、きわめて類似の荷電残基分布を示す。荷電残基は、
カタクチイワシトリプシンのＣ末端ドメインの方がかな
り負に荷電するように分布し、これはサケトリプシンに
ついての所見と一致する（Ｓｍａｌａｓｅｔ ａｌ．，
１９９４）。活性トリプシン全体にわたって合計した正
味累積電荷は、両カタクチイワシトリプシンとも−９で
ある。カタクチイワシイソ酵素の理論的等電点（ｐＩ）
は酸性（カタクチイワシトリプシンＩについては５．２
０、カタクチイワシトリプシンＩについては５．０９）
であり、他種の魚類にみられたものと同様である（Ｇｅ
ｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｏｈｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８１；Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ ａｎｄ
Ｒａａ，１９８２；Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１
９７５）。２種類のカタクチイワシトリプシンの疎水性
プロットを図１６に示す。比較のためラットトリプシン
（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）もプ
ロットする。カタクチイワシからの２種類のトリプシン
配列は、ラットのアニオン性トリプシンのものときわめ
て類似の疎水性残基分布を示す。Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）が提唱したヒドロパシシ
ティースケールを用いて計算したラットおよびカタクチ
イワシトリプシンの大平均ヒドロパシシティー指数（ｇ
ｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉ
ｔｙ ｉｎｄｅｘ）は、それぞれ−０．２１６および−
０．２４１であると推定された。電荷プロフィル、等電
点および疎水性に基づく結論として、両カタクチイワシ
トリプシンともアニオン性トリプシンであると思われ
る。
チイワシゲノムＤＮＡのサザンブロット法で、複雑なパ
ターンのバンドがみられた（図１５）。ＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化すると多形バンドがみられ、
これはカタクチイワシトリプシノーゲン遺伝子ファミリ
ーが本発明で単離されたクローン（ａＴｒｙ Ｉおよび
ａＴｒｙ ＩＩ）のほかにさらにアイソザイムを含む可
能性を示す。これは、サケ（Ｍａｌｅ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）、カレイおよび他の多種の魚類（Ｄｏｕｇｌ
ａｓ ａｎｄ Ｇａｌｌａｎｔ，１９９８）にみられた
同じゲノムオーガニゼーションにより、さらに証明され
る。構造と進化 カタクチイワシトリプシンＩの配列とカタクチイワシト
リプシンＩＩの配列は３０アミノ酸の相違があるけれど
も、きわめて類似の荷電残基分布を示す。荷電残基は、
カタクチイワシトリプシンのＣ末端ドメインの方がかな
り負に荷電するように分布し、これはサケトリプシンに
ついての所見と一致する（Ｓｍａｌａｓｅｔ ａｌ．，
１９９４）。活性トリプシン全体にわたって合計した正
味累積電荷は、両カタクチイワシトリプシンとも−９で
ある。カタクチイワシイソ酵素の理論的等電点（ｐＩ）
は酸性（カタクチイワシトリプシンＩについては５．２
０、カタクチイワシトリプシンＩについては５．０９）
であり、他種の魚類にみられたものと同様である（Ｇｅ
ｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｏｈｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８１；Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ ａｎｄ
Ｒａａ，１９８２；Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１
９７５）。２種類のカタクチイワシトリプシンの疎水性
プロットを図１６に示す。比較のためラットトリプシン
（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）もプ
ロットする。カタクチイワシからの２種類のトリプシン
配列は、ラットのアニオン性トリプシンのものときわめ
て類似の疎水性残基分布を示す。Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）が提唱したヒドロパシシ
ティースケールを用いて計算したラットおよびカタクチ
イワシトリプシンの大平均ヒドロパシシティー指数（ｇ
ｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉ
ｔｙ ｉｎｄｅｘ）は、それぞれ−０．２１６および−
０．２４１であると推定された。電荷プロフィル、等電
点および疎水性に基づく結論として、両カタクチイワシ
トリプシンともアニオン性トリプシンであると思われ
る。
【００４９】カタクチイワシトリプシンの進化分岐を解
明するために、調べたすべての配列の対合アラインメン
トに基づく進化系統樹（図１７）を作成する。これは、
同一性の程度を反映し、進化に際し各酵素の分離が起き
た場合は必ずしもそうでない。系統樹作成には、外集団
としての細菌に由来するものと共に、成熟トリプシン
（すなわちＮ末端シグナルペプチドおよび活性化ペプチ
ドを除く）のみを採用する。カタクチイワシからのトリ
プシンの各アイソザイムは、哺乳動物トリプシンからほ
ぼ等しい距離にある。系統樹の枝分かれ（図１７）は、
魚類と哺乳動物が共通の祖先（細菌）からの分岐である
ことを明らかに示す。
明するために、調べたすべての配列の対合アラインメン
トに基づく進化系統樹（図１７）を作成する。これは、
同一性の程度を反映し、進化に際し各酵素の分離が起き
た場合は必ずしもそうでない。系統樹作成には、外集団
としての細菌に由来するものと共に、成熟トリプシン
（すなわちＮ末端シグナルペプチドおよび活性化ペプチ
ドを除く）のみを採用する。カタクチイワシからのトリ
プシンの各アイソザイムは、哺乳動物トリプシンからほ
ぼ等しい距離にある。系統樹の枝分かれ（図１７）は、
魚類と哺乳動物が共通の祖先（細菌）からの分岐である
ことを明らかに示す。
【００５０】前記のように、カタクチイワシトリプシン
の配列を対応する哺乳動物配列とアラインさせるために
は２つの欠失が必要であり、これらの欠失はループ内で
起きる（図１３）。これは、カタクチイワシトリプシン
の三次元構造が他のトリプシンと同じ立体配座を示すは
ずであるということを強く示唆する。カタクチイワシト
リプシンＩおよびＩＩの三次元構造のコンピューター画
像を図１８に示す。セリンプロテアーゼのすべての構造
特徴が、トリプシンの特異性を決定する重要な残基と共
に完全に保存されている。事実、両カタクチイワシトリ
プシンのポリペプチドの全体的フォールドは、ブルック
ヘブンタンパク質データバンクに寄託されている実験的
に決定された他のトリプシンのものにほぼ重ね合わせう
ることが認められた。
の配列を対応する哺乳動物配列とアラインさせるために
は２つの欠失が必要であり、これらの欠失はループ内で
起きる（図１３）。これは、カタクチイワシトリプシン
の三次元構造が他のトリプシンと同じ立体配座を示すは
ずであるということを強く示唆する。カタクチイワシト
リプシンＩおよびＩＩの三次元構造のコンピューター画
像を図１８に示す。セリンプロテアーゼのすべての構造
特徴が、トリプシンの特異性を決定する重要な残基と共
に完全に保存されている。事実、両カタクチイワシトリ
プシンのポリペプチドの全体的フォールドは、ブルック
ヘブンタンパク質データバンクに寄託されている実験的
に決定された他のトリプシンのものにほぼ重ね合わせう
ることが認められた。
【００５１】酵素−基質相互作用の詳細な研究に必要な
高精度の構造は実験によって初めて得られるが、理論的
なタンパク質モデリングによって重要な残基の空間配置
についての十分な本質的情報をもつ低解像度のモデルが
分子生物学者に提供されるであろう（Ｐｅｉｔｓｈ，１
９９６）。高い配列類似性は顕著な構造類似性に反映さ
れることは一般に認められている。事実、５０％の残基
同一性をもつタンパク質コアの根平均二乗偏差（ＲＭＳ
Ｄ）は約１Åであると予想される（Ｃｈｏｔｈｉａ ａ
ｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８４）。カタクチイワシトリプシ
ンのポリペプチド主鎖を、比較のためウシトリプシン
（Ｐｄｂコード：１ＡＱ７）のものと共に図１９に示
す。カタクチイワシトリプシンの大部分の置換は表面領
域または柔軟な領域で起き、そこでは残基は重要な残基
を従わせることなく自由に多様な立体配座をとる。対応
する哺乳動物トリプシンと比較して、より自由な空間を
サケトリプシン（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
４）および南極圏魚類トリプシン（Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６）の内部に残すと推定される残基
（残基６３、１３８、２１２）が、カタクチイワシトリ
プシン中で同じ立体配座にあることが見出された。カタ
クチイワシトリプシンとウシトリプシンの基質結合ポケ
ットが全体的に類似することは、それらと基質の相互作
用の類似性と一致する。しかし、カタクチイワシトリプ
シンおよび哺乳動物トリプシンの結合ポケットの分析に
より、ウシの場合はＳ１結合ポケットの入口にあるＧｌ
ｎ−１９２の方へ嵩高いＴｙｒ−１５１環が向いてお
り、カタクチイワシの場合はこれがセリンで置換されて
いるという重要な相異が明らかになった（図２０）。し
たがって、カタクチイワシトリプシン残基１９２はより
いっそう自由度が大きい。さらに、残基１５１の次に哺
乳動物トリプシンではプロリンがあるが、カタクチイワ
シトリプシンではこれがグリシンで置換されている。こ
のような変化の結果、両カタクチイワシトリプシンにお
いては、いわゆる自己消化ループ（残基１４３〜１５
４；図１３および２０）の配向が完全に異なる可能性が
ある。これは、サケトリプシンのポリペプチド鎖が残基
１４４より後でウシトリプシンのものと異なる方向をと
り、１５３から再び元に戻るというＳｍａｌａｓ ｅｔ
ａｌ．（１９９４）の所見と一致する。さらに、ウシ
トリプシンの自己消化ループの開裂部位（Ｌｙｓ−１４
５）が対比した魚類トリプシンのいずれにも存在しない
（図１３）というのは、特筆する価値がある。明らか
に、多数のセリンプロテアーゼが構造的にＣａ++イオン
を結合することが認められており（Ｋｒｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ，１９７６）、その役割は熱分解やタンパク質分解に
対する安定性を付与することである（Ｒｅａｄ ａｎｄ
Ｊａｍｅｓ，１９８８）。Ｃａ++結合部位を形成する
残基（残基６９〜８０）の保存は十分でなく、このカチ
オンの要求は魚類トリプシンにはウシトリプシンについ
て報告された（Ｗａｌｓｈ，１９７０）ほど重要ではな
いと思われる。考察 ｃＤＮＡフラグメントを選択的に増幅させるためのポリ
メラーゼ連鎖反応に変性オリゴヌクレオチドプライマー
を用い、次いでカタクチイワシ幽門垂から得たトリプシ
ノーゲンの２種類のアイソザイムをコードする全長クロ
ーンを単離した。２クローン（ａＴｒｙ ＩおよびａＴ
ｒｙ ＩＩ；図９）のコード領域のヌクレオチド配列は
約９２％の配列類似性をもつが、コードされたタンパク
質の配列相同性は８７％であると思われる。これは、ａ
Ｔｒｙ ＩＩ（またはａＴｒｙＩ）が選択的な進化抑圧
を受け、このためヌクレオチドが非対称的に変異したこ
とを示す。あるいはそれは、遺伝子が複製された後、２
種類のアイソザイムのコア残基を保持する協奏進化が起
きたためという可能性がある。協奏進化は広範な生物の
多重遺伝子ファミリーの特徴であり、コード領域間の配
列類似度が高く、隣接する非コード領域は配列多様性で
あるという明瞭な境界があることを特色とする（Ｗａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかし、極性や側鎖の
大きさを保持することにより、大部分のアミノ酸置換の
性質は保存的である。魚類および哺乳動物ともに、数種
類のトリプシンアイソザイムが記載されている（Ａｓｇ
ｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｆｌｅｔｃ
ｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｃｒａｉｋ ｅｔ
ａｌ．，１９８７；Ｍｕｒａｋａｍｉ ａｎｄ Ｎｏｄ
ａ，１９８１）。タラ（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８９）およびサケ（Ｍａｌｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５）において証明されているように、トリ
プシンの各アイソザイムは異なる反応速度特性をもつ可
能性がある。アイソザイムの存在は、それらが異なる機
能をもつ可能性も示す。しかし、確実な証拠はないが、
Ｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）は、下記のよう
に提唱した：アイソザイムの発生は、消化に対する予告
が短い場合の大量のトリプシン要求に応答して高い遺伝
子量を求める、選択的抑圧によるものであろう。次いで
この選択的抑圧が除かれると、その遺伝子のコピーに不
活性産物を生じる変異が“サイレント遺伝子"プール中
に保存されるであろう。この変動性の高い“サイレント
遺伝子"プールから、サイレント期に蓄積された中立変
異と共に起きる変異によって機能性酵素が再生される可
能性がある。その場合の基質特異性はその祖先のものと
類似し、類似の特異性をもつが配列の異なるアイソザイ
ムが生成するのであろう（Ｈａｒｔｌｅｙ，１９７
９）。ａＴｒｙ ＩとａＴｒｙ ＩＩ間の３’−非コー
ド領域の長さの相異はきわめて印象的であり、これはａ
Ｔｒｙ ＩＩの転写後修飾に何らかの安定化効果をも
ち、その結果ａＴｒｙ Ｉと比較してより良く翻訳され
るのであろう。非交差反応性のアイソザイム特異性プロ
ーブを用いるノーザンブロット分析で、これに関して何
らかの情報が得られるかもしれない。
高精度の構造は実験によって初めて得られるが、理論的
なタンパク質モデリングによって重要な残基の空間配置
についての十分な本質的情報をもつ低解像度のモデルが
分子生物学者に提供されるであろう（Ｐｅｉｔｓｈ，１
９９６）。高い配列類似性は顕著な構造類似性に反映さ
れることは一般に認められている。事実、５０％の残基
同一性をもつタンパク質コアの根平均二乗偏差（ＲＭＳ
Ｄ）は約１Åであると予想される（Ｃｈｏｔｈｉａ ａ
ｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８４）。カタクチイワシトリプシ
ンのポリペプチド主鎖を、比較のためウシトリプシン
（Ｐｄｂコード：１ＡＱ７）のものと共に図１９に示
す。カタクチイワシトリプシンの大部分の置換は表面領
域または柔軟な領域で起き、そこでは残基は重要な残基
を従わせることなく自由に多様な立体配座をとる。対応
する哺乳動物トリプシンと比較して、より自由な空間を
サケトリプシン（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
４）および南極圏魚類トリプシン（Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６）の内部に残すと推定される残基
（残基６３、１３８、２１２）が、カタクチイワシトリ
プシン中で同じ立体配座にあることが見出された。カタ
クチイワシトリプシンとウシトリプシンの基質結合ポケ
ットが全体的に類似することは、それらと基質の相互作
用の類似性と一致する。しかし、カタクチイワシトリプ
シンおよび哺乳動物トリプシンの結合ポケットの分析に
より、ウシの場合はＳ１結合ポケットの入口にあるＧｌ
ｎ−１９２の方へ嵩高いＴｙｒ−１５１環が向いてお
り、カタクチイワシの場合はこれがセリンで置換されて
いるという重要な相異が明らかになった（図２０）。し
たがって、カタクチイワシトリプシン残基１９２はより
いっそう自由度が大きい。さらに、残基１５１の次に哺
乳動物トリプシンではプロリンがあるが、カタクチイワ
シトリプシンではこれがグリシンで置換されている。こ
のような変化の結果、両カタクチイワシトリプシンにお
いては、いわゆる自己消化ループ（残基１４３〜１５
４；図１３および２０）の配向が完全に異なる可能性が
ある。これは、サケトリプシンのポリペプチド鎖が残基
１４４より後でウシトリプシンのものと異なる方向をと
り、１５３から再び元に戻るというＳｍａｌａｓ ｅｔ
ａｌ．（１９９４）の所見と一致する。さらに、ウシ
トリプシンの自己消化ループの開裂部位（Ｌｙｓ−１４
５）が対比した魚類トリプシンのいずれにも存在しない
（図１３）というのは、特筆する価値がある。明らか
に、多数のセリンプロテアーゼが構造的にＣａ++イオン
を結合することが認められており（Ｋｒｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ，１９７６）、その役割は熱分解やタンパク質分解に
対する安定性を付与することである（Ｒｅａｄ ａｎｄ
Ｊａｍｅｓ，１９８８）。Ｃａ++結合部位を形成する
残基（残基６９〜８０）の保存は十分でなく、このカチ
オンの要求は魚類トリプシンにはウシトリプシンについ
て報告された（Ｗａｌｓｈ，１９７０）ほど重要ではな
いと思われる。考察 ｃＤＮＡフラグメントを選択的に増幅させるためのポリ
メラーゼ連鎖反応に変性オリゴヌクレオチドプライマー
を用い、次いでカタクチイワシ幽門垂から得たトリプシ
ノーゲンの２種類のアイソザイムをコードする全長クロ
ーンを単離した。２クローン（ａＴｒｙ ＩおよびａＴ
ｒｙ ＩＩ；図９）のコード領域のヌクレオチド配列は
約９２％の配列類似性をもつが、コードされたタンパク
質の配列相同性は８７％であると思われる。これは、ａ
Ｔｒｙ ＩＩ（またはａＴｒｙＩ）が選択的な進化抑圧
を受け、このためヌクレオチドが非対称的に変異したこ
とを示す。あるいはそれは、遺伝子が複製された後、２
種類のアイソザイムのコア残基を保持する協奏進化が起
きたためという可能性がある。協奏進化は広範な生物の
多重遺伝子ファミリーの特徴であり、コード領域間の配
列類似度が高く、隣接する非コード領域は配列多様性で
あるという明瞭な境界があることを特色とする（Ｗａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかし、極性や側鎖の
大きさを保持することにより、大部分のアミノ酸置換の
性質は保存的である。魚類および哺乳動物ともに、数種
類のトリプシンアイソザイムが記載されている（Ａｓｇ
ｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｆｌｅｔｃ
ｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｃｒａｉｋ ｅｔ
ａｌ．，１９８７；Ｍｕｒａｋａｍｉ ａｎｄ Ｎｏｄ
ａ，１９８１）。タラ（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８９）およびサケ（Ｍａｌｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５）において証明されているように、トリ
プシンの各アイソザイムは異なる反応速度特性をもつ可
能性がある。アイソザイムの存在は、それらが異なる機
能をもつ可能性も示す。しかし、確実な証拠はないが、
Ｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）は、下記のよう
に提唱した：アイソザイムの発生は、消化に対する予告
が短い場合の大量のトリプシン要求に応答して高い遺伝
子量を求める、選択的抑圧によるものであろう。次いで
この選択的抑圧が除かれると、その遺伝子のコピーに不
活性産物を生じる変異が“サイレント遺伝子"プール中
に保存されるであろう。この変動性の高い“サイレント
遺伝子"プールから、サイレント期に蓄積された中立変
異と共に起きる変異によって機能性酵素が再生される可
能性がある。その場合の基質特異性はその祖先のものと
類似し、類似の特異性をもつが配列の異なるアイソザイ
ムが生成するのであろう（Ｈａｒｔｌｅｙ，１９７
９）。ａＴｒｙ ＩとａＴｒｙ ＩＩ間の３’−非コー
ド領域の長さの相異はきわめて印象的であり、これはａ
Ｔｒｙ ＩＩの転写後修飾に何らかの安定化効果をも
ち、その結果ａＴｒｙ Ｉと比較してより良く翻訳され
るのであろう。非交差反応性のアイソザイム特異性プロ
ーブを用いるノーザンブロット分析で、これに関して何
らかの情報が得られるかもしれない。
【００５２】両カタクチイワシトリプシンのシグナルペ
プチドおよび活性化ペプチドは、他種の魚類のものと著
しい配列類似性をもつ。しかしそれらは対応する哺乳動
物ペプチドに対しては相同性がより低い。ただし重要な
特徴は良く保存されている。シグナル配列が初期の構造
と異なってもなお、翻訳時経路および翻訳後経路の両方
において同じ受容体により認識されることが示されてい
る（Ｒａｐｏｐｏｒｔｅｔ ａｌ．，１９９９）。セリ
ンプロテアーゼのサイズ、アミノ酸組成および活性化ペ
プチド配列は、広範に変化する可能性がある。活性化ペ
プチドはカタクチイワシやタラのトリプシンにみられる
ように６アミノ酸という短いこともあり（Ｇｕｄｍｕｎ
ｄｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、一方、
他の場合はプロトロンビン（３２０残基；Ｐｅｎｎｉｃ
ａ ｅｔ ａｌ．，１９８５）またはプラスミノーゲン
（５６０残基；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，１９７９）の場
合のように酵素自体のサイズより大きいこともある。２
種類のカタクチイワシトリプシンは、セリンプロテアー
ゼ全般、特にトリプシンに特徴的なコア残基のほか、Ｒ
ｙｐｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）が各
種生物からの３１のトリプシン配列を調べることによ
り、進化を通じて高度に保存されたものとしてまとめ
た、他のすべての残基を含む。
プチドおよび活性化ペプチドは、他種の魚類のものと著
しい配列類似性をもつ。しかしそれらは対応する哺乳動
物ペプチドに対しては相同性がより低い。ただし重要な
特徴は良く保存されている。シグナル配列が初期の構造
と異なってもなお、翻訳時経路および翻訳後経路の両方
において同じ受容体により認識されることが示されてい
る（Ｒａｐｏｐｏｒｔｅｔ ａｌ．，１９９９）。セリ
ンプロテアーゼのサイズ、アミノ酸組成および活性化ペ
プチド配列は、広範に変化する可能性がある。活性化ペ
プチドはカタクチイワシやタラのトリプシンにみられる
ように６アミノ酸という短いこともあり（Ｇｕｄｍｕｎ
ｄｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、一方、
他の場合はプロトロンビン（３２０残基；Ｐｅｎｎｉｃ
ａ ｅｔ ａｌ．，１９８５）またはプラスミノーゲン
（５６０残基；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，１９７９）の場
合のように酵素自体のサイズより大きいこともある。２
種類のカタクチイワシトリプシンは、セリンプロテアー
ゼ全般、特にトリプシンに特徴的なコア残基のほか、Ｒ
ｙｐｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）が各
種生物からの３１のトリプシン配列を調べることによ
り、進化を通じて高度に保存されたものとしてまとめ
た、他のすべての残基を含む。
【００５３】図１３に他の脊椎動物のものとアラインし
たカタクチイワシ配列を詳細に調べると、注目すべき特
徴が明らかになる。一貫してすべての魚類酵素が、高等
脊椎動物において自己消化ループを形成することが知ら
れている領域に欠失をもつ。これは、魚類トリプシンと
哺乳動物トリプシンの間でみられる触媒活性の相異に何
らかの因果関係をもつ可能性がある。興味深いことに、
カタクチイワシはこの領域にさらに１つの欠失をもつ。
より興味深いと思われるが、カタクチイワシトリプシン
Ｉより１残基長いカタクチイワシトリプシンＩＩが同数
の欠失をもつ。この欠失はこれまでに報告されている他
の魚類トリプシンと比較してカタクチイワシに独特であ
る。このことは、その触媒上の意味を解明するためにさ
らに研究するのが重要であることを明らかに示す。魚類
トリプシンの自己消化ループの構造柔軟性と関連する潜
在開裂部位（Ｌｙｓ−１５０）がないのは、Ｃａ++結合
部位に関与するアミノ酸残基（残基６９〜８０）の多様
化と平行する。このループはトリプシン分子の残りの部
分とはほとんど接触せず、これがその見掛けの可塑性に
関与すると思われる。内部にあるアミノ酸残基が生物学
的活性の決定に明らかに最も重要なペプチド鎖の組立て
に影響を与えずに変化できるのは、狭い範囲内において
のみであるのは明瞭である（Ｈａｒｔｌｅｙ，１９７
９）。これに関して、比較した他のすべての配列におい
て完全に保存されている幾つかがカタクチイワシトリプ
シンＩでは置換されている点を指摘すべきである（残基
３０、７８、１０３、１３９；図１３および図１８）。
残基３０、１０３および１３９は活性酵素の内部にある
のが認められているので（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９４；Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９
９６）、これらの置換はこの酵素の基質特異性に影響を
与える可能性がある。
たカタクチイワシ配列を詳細に調べると、注目すべき特
徴が明らかになる。一貫してすべての魚類酵素が、高等
脊椎動物において自己消化ループを形成することが知ら
れている領域に欠失をもつ。これは、魚類トリプシンと
哺乳動物トリプシンの間でみられる触媒活性の相異に何
らかの因果関係をもつ可能性がある。興味深いことに、
カタクチイワシはこの領域にさらに１つの欠失をもつ。
より興味深いと思われるが、カタクチイワシトリプシン
Ｉより１残基長いカタクチイワシトリプシンＩＩが同数
の欠失をもつ。この欠失はこれまでに報告されている他
の魚類トリプシンと比較してカタクチイワシに独特であ
る。このことは、その触媒上の意味を解明するためにさ
らに研究するのが重要であることを明らかに示す。魚類
トリプシンの自己消化ループの構造柔軟性と関連する潜
在開裂部位（Ｌｙｓ−１５０）がないのは、Ｃａ++結合
部位に関与するアミノ酸残基（残基６９〜８０）の多様
化と平行する。このループはトリプシン分子の残りの部
分とはほとんど接触せず、これがその見掛けの可塑性に
関与すると思われる。内部にあるアミノ酸残基が生物学
的活性の決定に明らかに最も重要なペプチド鎖の組立て
に影響を与えずに変化できるのは、狭い範囲内において
のみであるのは明瞭である（Ｈａｒｔｌｅｙ，１９７
９）。これに関して、比較した他のすべての配列におい
て完全に保存されている幾つかがカタクチイワシトリプ
シンＩでは置換されている点を指摘すべきである（残基
３０、７８、１０３、１３９；図１３および図１８）。
残基３０、１０３および１３９は活性酵素の内部にある
のが認められているので（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９４；Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９
９６）、これらの置換はこの酵素の基質特異性に影響を
与える可能性がある。
【００５４】両カタクチイワシトリプシンの三次元構造
は、他の既知のトリプシン構造すべてとほぼ重ね合わせ
ることができる。観察された構造上の相異の大部分は、
一次構造の相異により説明できる。異なるアミノ酸側鎖
は異なる主鎖立体配座を許容または要求する。これは、
最も顕著な相異がみられるループ領域について、特に明
らかである。ただしこれらの構造上の相異は、活性部位
から離れている限り必ずしも機能に影響を与えない（Ｃ
ｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，１９９
７）。哺乳動物と比較して低温適応酵素の触媒活性にみ
られる相異は、ジスルフィド橋の個数、平均疎水度、お
よび水素結合の個数と強度による可能性が最も高い。こ
れらの因子について以下に考察する。
は、他の既知のトリプシン構造すべてとほぼ重ね合わせ
ることができる。観察された構造上の相異の大部分は、
一次構造の相異により説明できる。異なるアミノ酸側鎖
は異なる主鎖立体配座を許容または要求する。これは、
最も顕著な相異がみられるループ領域について、特に明
らかである。ただしこれらの構造上の相異は、活性部位
から離れている限り必ずしも機能に影響を与えない（Ｃ
ｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，１９９
７）。哺乳動物と比較して低温適応酵素の触媒活性にみ
られる相異は、ジスルフィド橋の個数、平均疎水度、お
よび水素結合の個数と強度による可能性が最も高い。こ
れらの因子について以下に考察する。
【００５５】両カタクチイワシトリプシンとも、他のト
リプシンと同じ残基位置に１２のハーフ−シスチニル残
基が存在する（図１３）。ハーフ−シスチニル残基の対
合は実験により測定されてはいないが、三次元モデル
（図１８）から、対合はＣｙｓ−４２とＣｙｓ−５８；
Ｃｙｓ−２２とＣｙｓ−１５７；Ｃｙｓ−８２とＣｙｓ
−１６８；Ｃｙｓ−１９１とＣｙｓ−２２０；Ｃｙｓ−
１３６とＣｙｓ−２０１；Ｃｙｓ−１２７とＣｙｓ−２
３２の間で起きると思われる。不思議なことにヒトトリ
プシンはすべて１２７：２３２橋を欠如し、かつヒトト
リプシンＩＩは１３６：２０１橋も欠如している（Ｒｏ
ａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これは、これら６
つの橋すべてが必須というわけではないが、多くが酵素
活性に影響を与える可能性があることを示唆する（Ｒｙ
ｐｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｃ末端
らせんは、球体タンパク質の本体に沿った“アーム"で
あって、Ｎ末端β−胴部と相互作用するとみることがで
きる。残基２４５がアスパラギンである場合、カチオン
残基８７および１０７はＣ末端らせんのカルボニル基と
イオン対を形成しうると提唱された（Ｓｍａｌａｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）。サケトリプシンとウシトリプ
シンの比較結晶学的研究で、ウシトリプシンのＡｓｎ−
２４５の側鎖はフォールドバックしてＣ末端らせんの主
鎖と水素結合を形成し、一方、サケの残基２４５はこの
機能を失っていることが証明された（Ｓｍａｌａｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）。サケの場合はＡｓｎ−２４５
がチロシンで置換され、これはフォールドバックしてイ
オン対を形成することができない。しかし、両カタクチ
イワシトリプシンともＡｓｎ−２４５を含有し、残基８
７および１０７とイオン対を形成し、これによりらせん
を安定化することができる。すべてがこの位置にチロシ
ンを含む他の魚類トリプシンについて、同じことを推定
できる。
リプシンと同じ残基位置に１２のハーフ−シスチニル残
基が存在する（図１３）。ハーフ−シスチニル残基の対
合は実験により測定されてはいないが、三次元モデル
（図１８）から、対合はＣｙｓ−４２とＣｙｓ−５８；
Ｃｙｓ−２２とＣｙｓ−１５７；Ｃｙｓ−８２とＣｙｓ
−１６８；Ｃｙｓ−１９１とＣｙｓ−２２０；Ｃｙｓ−
１３６とＣｙｓ−２０１；Ｃｙｓ−１２７とＣｙｓ−２
３２の間で起きると思われる。不思議なことにヒトトリ
プシンはすべて１２７：２３２橋を欠如し、かつヒトト
リプシンＩＩは１３６：２０１橋も欠如している（Ｒｏ
ａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これは、これら６
つの橋すべてが必須というわけではないが、多くが酵素
活性に影響を与える可能性があることを示唆する（Ｒｙ
ｐｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｃ末端
らせんは、球体タンパク質の本体に沿った“アーム"で
あって、Ｎ末端β−胴部と相互作用するとみることがで
きる。残基２４５がアスパラギンである場合、カチオン
残基８７および１０７はＣ末端らせんのカルボニル基と
イオン対を形成しうると提唱された（Ｓｍａｌａｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）。サケトリプシンとウシトリプ
シンの比較結晶学的研究で、ウシトリプシンのＡｓｎ−
２４５の側鎖はフォールドバックしてＣ末端らせんの主
鎖と水素結合を形成し、一方、サケの残基２４５はこの
機能を失っていることが証明された（Ｓｍａｌａｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）。サケの場合はＡｓｎ−２４５
がチロシンで置換され、これはフォールドバックしてイ
オン対を形成することができない。しかし、両カタクチ
イワシトリプシンともＡｓｎ−２４５を含有し、残基８
７および１０７とイオン対を形成し、これによりらせん
を安定化することができる。すべてがこの位置にチロシ
ンを含む他の魚類トリプシンについて、同じことを推定
できる。
【００５６】グリシン残基は鎖の柔軟度を高めることが
知られており、タンパク質のグリシン含量の相異がすべ
ての動的挙動全般における相異の理由の１つの可能性が
ある。しかし、魚類と脊椎動物のグリシン含量はほとん
ど同じであるので（表３）、これが重要な因子であると
は思われない。ただしそうであれば、ポリペプチド鎖の
剛性を高めることが知られているプロリン残基について
も、これに相当する反論を行うことができる。カタクチ
イワシのプロリン数はウシの場合よりわずかに高い。従
って、これら２残基の相反する作用がカタクチイワシト
リプシンの全体的鎖柔軟度を打ち消し合うであろう。事
実、Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）は、グリ
シンがサケトリプシンの鎖の柔軟度の相異を高める傾向
を見出してはいない。特筆すべきことに、カタクチイワ
シを含めたすべての魚類のトリプシンが哺乳動物酵素よ
り高いメチオニン含量をもつ（表３）。これが極限状態
でみられる熱感受性および不安定さに関与するのかもし
れない。
知られており、タンパク質のグリシン含量の相異がすべ
ての動的挙動全般における相異の理由の１つの可能性が
ある。しかし、魚類と脊椎動物のグリシン含量はほとん
ど同じであるので（表３）、これが重要な因子であると
は思われない。ただしそうであれば、ポリペプチド鎖の
剛性を高めることが知られているプロリン残基について
も、これに相当する反論を行うことができる。カタクチ
イワシのプロリン数はウシの場合よりわずかに高い。従
って、これら２残基の相反する作用がカタクチイワシト
リプシンの全体的鎖柔軟度を打ち消し合うであろう。事
実、Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）は、グリ
シンがサケトリプシンの鎖の柔軟度の相異を高める傾向
を見出してはいない。特筆すべきことに、カタクチイワ
シを含めたすべての魚類のトリプシンが哺乳動物酵素よ
り高いメチオニン含量をもつ（表３）。これが極限状態
でみられる熱感受性および不安定さに関与するのかもし
れない。
【００５７】前記のように、カタクチイワシトリプシン
とそれに対応する哺乳動物トリプシンの間のアミノ酸残
基の変化は、ループ領域およびフォールドしたタンパク
質の外面に起きることが見出された。しかし、詳細な実
験で、大部分の非保存的置換はカタクチイワシトリプシ
ンの疎水性を高める（カタクチイワシにおける、Ｘから
Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＡｓｐへの置換）か、またはその
疎水性を低下させる（カタクチイワシにおける、Ｌｅ
ｕ、Ｐｈｅ、ＶａｌおよびＩｌｅからＸへの置換）こと
が明らかになった。哺乳動物と比較してカタクチイワシ
酵素の疎水性が全般的に低下しているのも、南極圏魚類
（Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）およびサ
ケ（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の場合に
提唱されたように、熱感受性や柔軟性に関与している可
能性がある。
とそれに対応する哺乳動物トリプシンの間のアミノ酸残
基の変化は、ループ領域およびフォールドしたタンパク
質の外面に起きることが見出された。しかし、詳細な実
験で、大部分の非保存的置換はカタクチイワシトリプシ
ンの疎水性を高める（カタクチイワシにおける、Ｘから
Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＡｓｐへの置換）か、またはその
疎水性を低下させる（カタクチイワシにおける、Ｌｅ
ｕ、Ｐｈｅ、ＶａｌおよびＩｌｅからＸへの置換）こと
が明らかになった。哺乳動物と比較してカタクチイワシ
酵素の疎水性が全般的に低下しているのも、南極圏魚類
（Ｇｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）およびサ
ケ（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の場合に
提唱されたように、熱感受性や柔軟性に関与している可
能性がある。
【００５８】カタクチイワシトリプシンの荷電残基分布
も、哺乳動物酵素の場合と異なる。カタクチイワシトリ
プシンの酸性残基数が特に活性部位入口で増加している
のは、重要であると思われる。したがって、両カタクチ
イワシトリプシンとも他の魚類トリプシンと同様に、基
質の正に荷電したアルギニンおよびリシン側鎖を結合ク
レフト（ｃｌｅｆｔ）内へ配置および案内するのに、よ
り効果的であると予想できる。これは、最近解明された
トリプシンの基質特異性を決定する２つの重要な基質ル
ープ（ループ１および２；図１３および２１）（Ｈｅｄ
ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２）により、さらに
支持されるであろう。それらは結合した基質と直接に接
触しないが、酵素の触媒活性および特異性に著しい影響
を及ぼす（Ｋｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。残基
１８５〜１８９を含むループ１はすべての種に保存され
ているが、ループ２はアミノ酸配列にかなりの多様性を
示す。興味深いことに、対応する哺乳動物トリプシンと
著しく対照的に、１つの魚類トリプシン以外のすべてが
このループにアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を
含む（図２１）。最近の実験で、Ｓ１結合ポケットの底
部に負の静電界が存在すると、相互作用の幾何学性が最
適なものとはほど遠い場合ですら、トリプシンの加水分
解速度を高めるのに十分であることが認められた（Ｂｒ
ｉａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。さらに、ループ
２は一次特異性ポケットを埋め込む水チャンネルの大部
分を定め、一方、ＡｓｐおよびＧｌｕ残基は水分子と相
互作用する傾向をより強く示すことが知られている（Ｔ
ｈａｎｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗｏｌｆｅｎｄ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９）。したがって、ループ
２にこれら２つの残基が存在することは、カタクチイワ
シおよび他の低温適応トリプシンの触媒特性が増強した
ことにより説明できるであろう。 まとめと結論 各種魚類からのトリプシンは、酵素のｋcat増大または
基質のｋm低下の両方に関して、それらに対応する哺乳
動物トリプシンより実質的に高い触媒効率を示す。この
プロセスの第１工程として、カタクチイワシトリプシン
の一次構造を調べる研究を開始した。これは、この相異
の分子的基礎に貢献すると思われる。そのほか、カタク
チイワシトリプシンの場合にタンパク質モデリングによ
り得られる構造データは、さらにカタクチイワシトリプ
シン独特の特性を支配している法則を理解する上で実験
上の貢献をもたらす。
も、哺乳動物酵素の場合と異なる。カタクチイワシトリ
プシンの酸性残基数が特に活性部位入口で増加している
のは、重要であると思われる。したがって、両カタクチ
イワシトリプシンとも他の魚類トリプシンと同様に、基
質の正に荷電したアルギニンおよびリシン側鎖を結合ク
レフト（ｃｌｅｆｔ）内へ配置および案内するのに、よ
り効果的であると予想できる。これは、最近解明された
トリプシンの基質特異性を決定する２つの重要な基質ル
ープ（ループ１および２；図１３および２１）（Ｈｅｄ
ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２）により、さらに
支持されるであろう。それらは結合した基質と直接に接
触しないが、酵素の触媒活性および特異性に著しい影響
を及ぼす（Ｋｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。残基
１８５〜１８９を含むループ１はすべての種に保存され
ているが、ループ２はアミノ酸配列にかなりの多様性を
示す。興味深いことに、対応する哺乳動物トリプシンと
著しく対照的に、１つの魚類トリプシン以外のすべてが
このループにアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を
含む（図２１）。最近の実験で、Ｓ１結合ポケットの底
部に負の静電界が存在すると、相互作用の幾何学性が最
適なものとはほど遠い場合ですら、トリプシンの加水分
解速度を高めるのに十分であることが認められた（Ｂｒ
ｉａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。さらに、ループ
２は一次特異性ポケットを埋め込む水チャンネルの大部
分を定め、一方、ＡｓｐおよびＧｌｕ残基は水分子と相
互作用する傾向をより強く示すことが知られている（Ｔ
ｈａｎｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗｏｌｆｅｎｄ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９）。したがって、ループ
２にこれら２つの残基が存在することは、カタクチイワ
シおよび他の低温適応トリプシンの触媒特性が増強した
ことにより説明できるであろう。 まとめと結論 各種魚類からのトリプシンは、酵素のｋcat増大または
基質のｋm低下の両方に関して、それらに対応する哺乳
動物トリプシンより実質的に高い触媒効率を示す。この
プロセスの第１工程として、カタクチイワシトリプシン
の一次構造を調べる研究を開始した。これは、この相異
の分子的基礎に貢献すると思われる。そのほか、カタク
チイワシトリプシンの場合にタンパク質モデリングによ
り得られる構造データは、さらにカタクチイワシトリプ
シン独特の特性を支配している法則を理解する上で実験
上の貢献をもたらす。
【００５９】ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）法
（３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥの両方を含む）
に基づくポリメラーゼ連鎖反応を用いて、カタクチイワ
シの幽門垂からトリプシノーゲン（トリプシンの不活性
前駆物質）をコードするｃＤＮＡクローンを単離した。
高度に保存された数種類の脊椎動物トリプシンのアミノ
酸配列に由来する変性オリゴヌクレオチドプライマーを
用いてｃＤＮＡフラグメントの逐次増幅のためのＰＣＲ
を行い、次いで全長クローンａＴｒｙ Ｉを単離した。
その後の実験で、他のクローン、すなわちより長い挿入
配列を含むａＴｒｙＩＩを単離した。
（３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥの両方を含む）
に基づくポリメラーゼ連鎖反応を用いて、カタクチイワ
シの幽門垂からトリプシノーゲン（トリプシンの不活性
前駆物質）をコードするｃＤＮＡクローンを単離した。
高度に保存された数種類の脊椎動物トリプシンのアミノ
酸配列に由来する変性オリゴヌクレオチドプライマーを
用いてｃＤＮＡフラグメントの逐次増幅のためのＰＣＲ
を行い、次いで全長クローンａＴｒｙ Ｉを単離した。
その後の実験で、他のクローン、すなわちより長い挿入
配列を含むａＴｒｙＩＩを単離した。
【００６０】ヌクレオチド配列分析により、これら２ク
ローンは類似の（おそらく非対立遺伝子）プレトリプシ
ノーゲンをコードすることが明らかになった。８３２ｂ
ｐの挿入配列をもつａＴｒｙ Ｉは、７２０ｂｐのオー
プンリーディングフレーム、および１４ｂｐの推定ポリ
（Ａ）テイル、ならびに短い（２３ｂｐ）５’側非コー
ド領域および７５ｂｐの３’側非コード領域を含む。こ
れに対しクローンａＴｒｙ ＩＩは、等しい５’側非コ
ード領域および２２８ｂｐというかなり長い３’側非コ
ード領域でフランキングされた７２３ｂｐのオープンリ
ーディングフレームをもつ、より長い挿入配列（９７４
ｂｐ）を含むと思われる。このような３’側非コード領
域の不確定さにもかかわらず、それらはコード領域にお
いては約９２％の配列同一性をもつ。
ローンは類似の（おそらく非対立遺伝子）プレトリプシ
ノーゲンをコードすることが明らかになった。８３２ｂ
ｐの挿入配列をもつａＴｒｙ Ｉは、７２０ｂｐのオー
プンリーディングフレーム、および１４ｂｐの推定ポリ
（Ａ）テイル、ならびに短い（２３ｂｐ）５’側非コー
ド領域および７５ｂｐの３’側非コード領域を含む。こ
れに対しクローンａＴｒｙ ＩＩは、等しい５’側非コ
ード領域および２２８ｂｐというかなり長い３’側非コ
ード領域でフランキングされた７２３ｂｐのオープンリ
ーディングフレームをもつ、より長い挿入配列（９７４
ｂｐ）を含むと思われる。このような３’側非コード領
域の不確定さにもかかわらず、それらはコード領域にお
いては約９２％の配列同一性をもつ。
【００６１】Ｋｏｚａｋ（１９８１）が報告した配列の
偏りと一致して、両クローンとも推定ＡＴＧコドンに対
しそれぞれ−３および＋４のヌクレオチド位置に、アデ
ニンおよびプリンを含むことが見出された。終止コドン
で中断されていない単一アミノ酸コードフレームは、ａ
Ｔｒｙ Ｉについては２４０アミノ酸、ａＴｒｙ ＩＩ
については２４１アミノ酸のプレトリプシノーゲンを指
令する。２種類のカタクチイワシトリプシノーゲンそれ
ぞれのアミノ酸配列は、１３残基の疎水性シグナルペプ
チドおよび６残基の活性化ペプチドを含有し、すべての
分泌タンパク質にみられる典型的な特徴を保存してい
る。したがって、カタクチイワシトリプシンＩは長さ２
２１残基、計算分子量２３，９３８であると思われ、一
方、カタクチイワシトリプシンＩＩは長さ２２２残基、
計算分子量２４，２１９である。明らかにカタクチイワ
シトリプシンＩでは、比較した他のすべての配列中に完
全に保存されている幾つかが置換されている（残基３
０、７８、１０３、１３９；図１３）。残基３０、１０
３および１３９は活性酵素の内部にあるのが認められて
いるので（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇ
ｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、これらの置
換はこの酵素の基質特異性に影響を与える可能性があ
る。カタクチイワシトリプシンＩＩのアミノ酸配列は８
７％がカタクチイワシトリプシンＩのものと相同であ
る。これは、ヌクレオチドレベルではそれらの９２％が
相同であるのと対照的である。これは、それらがカタク
チイワシゲノム中の異なる遺伝子座によりコードされて
いる可能性を示唆する。これは、ａＴｒｙ Ｉ ｃＤＮ
Ａの一部に相当するプローブを用いるカタクチイワシゲ
ノムのサザンブロット分析により、さらに証明される。
複雑なパターンのハイブリダイゼーションバンドがみら
れた。同じプローブを用いるノーザンブロット分析で
は、予想どおりカタクチイワシの幽門垂、次いで腸およ
び胃において最大の発現を示すことが明らかになった。
非膵臓組織中にトリプシノーゲン転写体が存在すること
の生物学的意味を明らかにするには、さらに研究する必
要がある。
偏りと一致して、両クローンとも推定ＡＴＧコドンに対
しそれぞれ−３および＋４のヌクレオチド位置に、アデ
ニンおよびプリンを含むことが見出された。終止コドン
で中断されていない単一アミノ酸コードフレームは、ａ
Ｔｒｙ Ｉについては２４０アミノ酸、ａＴｒｙ ＩＩ
については２４１アミノ酸のプレトリプシノーゲンを指
令する。２種類のカタクチイワシトリプシノーゲンそれ
ぞれのアミノ酸配列は、１３残基の疎水性シグナルペプ
チドおよび６残基の活性化ペプチドを含有し、すべての
分泌タンパク質にみられる典型的な特徴を保存してい
る。したがって、カタクチイワシトリプシンＩは長さ２
２１残基、計算分子量２３，９３８であると思われ、一
方、カタクチイワシトリプシンＩＩは長さ２２２残基、
計算分子量２４，２１９である。明らかにカタクチイワ
シトリプシンＩでは、比較した他のすべての配列中に完
全に保存されている幾つかが置換されている（残基３
０、７８、１０３、１３９；図１３）。残基３０、１０
３および１３９は活性酵素の内部にあるのが認められて
いるので（Ｓｍａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｇ
ｅｎｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、これらの置
換はこの酵素の基質特異性に影響を与える可能性があ
る。カタクチイワシトリプシンＩＩのアミノ酸配列は８
７％がカタクチイワシトリプシンＩのものと相同であ
る。これは、ヌクレオチドレベルではそれらの９２％が
相同であるのと対照的である。これは、それらがカタク
チイワシゲノム中の異なる遺伝子座によりコードされて
いる可能性を示唆する。これは、ａＴｒｙ Ｉ ｃＤＮ
Ａの一部に相当するプローブを用いるカタクチイワシゲ
ノムのサザンブロット分析により、さらに証明される。
複雑なパターンのハイブリダイゼーションバンドがみら
れた。同じプローブを用いるノーザンブロット分析で
は、予想どおりカタクチイワシの幽門垂、次いで腸およ
び胃において最大の発現を示すことが明らかになった。
非膵臓組織中にトリプシノーゲン転写体が存在すること
の生物学的意味を明らかにするには、さらに研究する必
要がある。
【００６２】電荷プロフィル、疎水性および等電点ｐＨ
に基づけば、これら２種類のカタクチイワシトリプシン
はアニオン性であると考えられる。数種の魚類および脊
椎動物からのアミノ酸配列との多重アラインメントで
は、広範な配列類似性が示される。カタクチイワシトリ
プシンＩは、カレイの配列に８４％の最高相同性、ヒト
トリプシンに６０％の相同性を示す。カタクチイワシト
リプシンＩＩについても、同じ相同性パターンがみられ
る。アミノ酸配列を他のトリプシンとアラインさせるに
は、２つの欠失が必要である。他の魚類トリプシンにみ
られるように、この欠失は自己消化ループとして知られ
る領域に起きている。両カタクチイワシトリプシンと
も、基質特異性を決定する残基、および一次構造中の他
のトリプシンの場合と同じ位置に６つのジスルフィド橋
を形成する１２システイン残基と共に、触媒三つ組残基
を含む。さらに、基質結合ポケットを定める重要な残
基、２つの支持ループも保存されている。これらの所見
は、カタクチイワシトリプシンの三次元構造がそれらに
対応する他の構造に類似することを示唆する。
に基づけば、これら２種類のカタクチイワシトリプシン
はアニオン性であると考えられる。数種の魚類および脊
椎動物からのアミノ酸配列との多重アラインメントで
は、広範な配列類似性が示される。カタクチイワシトリ
プシンＩは、カレイの配列に８４％の最高相同性、ヒト
トリプシンに６０％の相同性を示す。カタクチイワシト
リプシンＩＩについても、同じ相同性パターンがみられ
る。アミノ酸配列を他のトリプシンとアラインさせるに
は、２つの欠失が必要である。他の魚類トリプシンにみ
られるように、この欠失は自己消化ループとして知られ
る領域に起きている。両カタクチイワシトリプシンと
も、基質特異性を決定する残基、および一次構造中の他
のトリプシンの場合と同じ位置に６つのジスルフィド橋
を形成する１２システイン残基と共に、触媒三つ組残基
を含む。さらに、基質結合ポケットを定める重要な残
基、２つの支持ループも保存されている。これらの所見
は、カタクチイワシトリプシンの三次元構造がそれらに
対応する他の構造に類似することを示唆する。
【００６３】この目的で、実験的に決定されたサケおよ
びウシのトリプシンの構造座標をデータバンクから入手
し、カタクチイワシトリプシンのコンピューター支援タ
ンパク質モデリングに用いた。両カタクチイワシトリプ
シンの主鎖構造は、他のトリプシン構造にほぼ重ね合わ
せることができる。大部分の相異は柔軟な領域、たとえ
ば自己消化ループおよび表面ループ２内にみられる。こ
れらの領域は分子の残りの部分、特に酵素の活性部分と
はほとんど接触しない。対応する哺乳動物トリプシンと
比較してカタクチイワシその他の魚類のトリプシンの触
媒活性を高めると思われる構造上の意義を見出すため
に、これらの領域の相異を調べた。潜在自己消化部位Ｌ
ｙｓ−１４５が存在しないこと；基質結合ポケット入口
のＧｌｎ−１９２がより自由であること；Ａｓｎ−２４
５とＣ末端らせんのイオン対相互作用の可能性につい
て、詳細に考察する。これらは魚類トリプシンの構造可
塑性を理解する助けとなるであろう。特に注目すべきこ
とは、Ｓ１基質結合ポケットの縁を定めるカタクチイワ
シトリプシンループ２領域に２つの酸性残基が存在する
ことである。これは、両カタクチイワシトリプシンが他
の魚類トリプシンと同様に、基質の正に荷電したアルギ
ニンおよびリシン側鎖を基質結合ポケット内へ配置およ
び案内するのに、より有効であることを示唆する。
びウシのトリプシンの構造座標をデータバンクから入手
し、カタクチイワシトリプシンのコンピューター支援タ
ンパク質モデリングに用いた。両カタクチイワシトリプ
シンの主鎖構造は、他のトリプシン構造にほぼ重ね合わ
せることができる。大部分の相異は柔軟な領域、たとえ
ば自己消化ループおよび表面ループ２内にみられる。こ
れらの領域は分子の残りの部分、特に酵素の活性部分と
はほとんど接触しない。対応する哺乳動物トリプシンと
比較してカタクチイワシその他の魚類のトリプシンの触
媒活性を高めると思われる構造上の意義を見出すため
に、これらの領域の相異を調べた。潜在自己消化部位Ｌ
ｙｓ−１４５が存在しないこと；基質結合ポケット入口
のＧｌｎ−１９２がより自由であること；Ａｓｎ−２４
５とＣ末端らせんのイオン対相互作用の可能性につい
て、詳細に考察する。これらは魚類トリプシンの構造可
塑性を理解する助けとなるであろう。特に注目すべきこ
とは、Ｓ１基質結合ポケットの縁を定めるカタクチイワ
シトリプシンループ２領域に２つの酸性残基が存在する
ことである。これは、両カタクチイワシトリプシンが他
の魚類トリプシンと同様に、基質の正に荷電したアルギ
ニンおよびリシン側鎖を基質結合ポケット内へ配置およ
び案内するのに、より有効であることを示唆する。
【００６４】細菌のように単純であっても、ヒトのよう
に複雑であっても、生物系の特性は一部はその主要遺伝
子材料ＤＮＡにより支配される。おそらくこの蓄積され
た知識の重要な成果の１つは、あるものを同じ機能特性
を共有する他のものと比較しうることであろう。この比
較から仮説的に洞察すると、一連の基礎研究が導かれる
であろう。これは、酵素の構造−機能関係の研究につい
て特に言える。この論文に提示した研究は、その初期段
階にある。これら２種類のカタクチイワシトリプシンの
触媒活性、基質特異性その他の特性を推定することは、
クローン化したＤＮＡを適切なベクター内で発現させ、
精製した酵素を解明することにより証明できるであろ
う。部位指向型変異は、ここに記載する構造特性を確実
に解明すると思われる。さらに、トリプシンとの広範な
構造類似性を示すもうひとつの重要なセリンプロテアー
ゼであるキモトリプシンを含めて、本発明を拡張すべき
である。
に複雑であっても、生物系の特性は一部はその主要遺伝
子材料ＤＮＡにより支配される。おそらくこの蓄積され
た知識の重要な成果の１つは、あるものを同じ機能特性
を共有する他のものと比較しうることであろう。この比
較から仮説的に洞察すると、一連の基礎研究が導かれる
であろう。これは、酵素の構造−機能関係の研究につい
て特に言える。この論文に提示した研究は、その初期段
階にある。これら２種類のカタクチイワシトリプシンの
触媒活性、基質特異性その他の特性を推定することは、
クローン化したＤＮＡを適切なベクター内で発現させ、
精製した酵素を解明することにより証明できるであろ
う。部位指向型変異は、ここに記載する構造特性を確実
に解明すると思われる。さらに、トリプシンとの広範な
構造類似性を示すもうひとつの重要なセリンプロテアー
ゼであるキモトリプシンを含めて、本発明を拡張すべき
である。
【００６５】
【発明の効果】イワシ内臓から、トリプシン様蛋白質分
解酵素の遺伝子が単離され、配列が決定された。これら
の酵素遺伝子を、例えば、酵母に組み込み、大量に酵素
を調製し、それら酵素を魚醤製造時に添加することによ
り、発酵の短期化が期待できる。また、本発明の新規遺
伝子の配列をさらに操作し、耐塩構造に改変し、少量で
も酵素力価を保持しつつ、魚醤製造を短期間に行うため
に使用することが期待できる。
解酵素の遺伝子が単離され、配列が決定された。これら
の酵素遺伝子を、例えば、酵母に組み込み、大量に酵素
を調製し、それら酵素を魚醤製造時に添加することによ
り、発酵の短期化が期待できる。また、本発明の新規遺
伝子の配列をさらに操作し、耐塩構造に改変し、少量で
も酵素力価を保持しつつ、魚醤製造を短期間に行うため
に使用することが期待できる。
【００６６】
【配列表】 <110> 日本たばこ産業株式会社 <120> 新規ＤＮＡ配列 <130> 000452 <160> 10 <210> SEQ ID NO:1 <211> 832 <212> DNA <213> Engraulis japonica <220> <223> protease <400> 1 atcgacagga tcaatcagca atc atg agg cct ctg gtc ttc ctt gtt ctc ctt 53 Met Arg Pro Leu Val Phe Leu Val Leu Leu 1 5 10 gga gct gct ttc gca gag gac gat aag atc gtc gga gga tat gag tgt 101 Gly Ala Ala Phe Ala Glu Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys 15 20 25 cag gcc cac tct cag ccc cat acg gtc tct ctg aac tcc ggc tac cac 149 Gln Ala His Ser Gln Pro His Thr Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His 30 35 40 ttc tgc ggt ggt tcc ctg gtc aac gag aac tgg gtt gtg tct gct gct 197 Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val Asn Glu Asn Trp Val Val Ser Ala Ala 45 50 55 cac tgc tac aag tcc cgt gtt gag gtg cgt ttg ggc gag cac cac att 245 His Cys Tyr Lys Ser Arg Val Glu Val Arg Leu Gly Glu His His Ile 60 65 70 gga cag aac gag aat acc gag cag ttc atc gac tcc tcc cgc gtc atc 293 Gly Gln Asn Glu Asn Thr Glu Gln Phe Ile Asp Ser Ser Arg Val Ile 75 80 85 90 cgt cac ccc cag tac agc tcc tac aac atc gac aat gac gtc atg ctg 341 Arg His Pro Gln Tyr Ser Ser Tyr Asn Ile Asp Asn Asp Val Met Leu 95 100 105 atc aag ctg agc acg ccc gcc acc ctg aac cag tat gtg cag ccc gtg 389 Ile Lys Leu Ser Thr Pro Ala Thr Leu Asn Gln Tyr Val Gln Pro Val 110 115 120 gcc ctg ccc tcc aga tgt gct tcc gct ggc acc atg tgc ctt gtg gct 437 Ala Leu Pro Ser Arg Cys Ala Ser Ala Gly Thr Met Cys Leu Val Ala 125 130 135 ggc tgg ggc aac acc atg agc aat gtc agt ggt gac aag ctt cag tgc 485 Gly Trp Gly Asn Thr Met Ser Asn Val Ser Gly Asp Lys Leu Gln Cys 140 145 150 ctg caa atc ccc atc ctg tct gac cgc gac tgt gac aac tcc tac ccc 533 Leu Gln Ile Pro Ile Leu Ser Asp Arg Asp Cys Asp Asn Ser Tyr Pro 155 160 165 170 ggc atg atc acc gac gcc atg ttc tgc gct gga tac ctg gag gga ggc 581 Gly Met Ile Thr Asp Ala Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly 175 180 185 aag gac tct tgc cag ggt gac tct ggt ggc ccc gtg gtc tgc aac ggt 629 Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 190 195 200 gag ctg cag ggt gtt gtg tcc tgg gga tac ggc tgt gct gag cgt gac 677 Glu Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp 205 210 215 cat cct ggt gtc tac gcc aag gtc tgc atc ttc act gac tgg ctg cag 725 His Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Cys Ile Phe Thr Asp Trp Leu Gln 220 225 230 agc acc atg gcc agc aac taaatcagat gacaccgtct ctgagttagg 773 Ser Thr Met Ala Ser Asn 235 240 atgtgatgat ccttagatca aaataaatgg atttaaaatg gcagcaaaaa aaaaaaaaa 832 <210> SEQ ID NO:2 <211> 974 <212> DNA <213> Engraulis japonica <220> <223> protease <400> 2 atcgacagga tcaatcagca atc atg agg tct ctg gtc ttc ctt gta ctc ctt 53 Met Arg Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Leu 1 5 10 gga gct gct ttc gca gag gac gat aag atc gtc gga ggc tat gag tgc 101 Gly Ala Ala Phe Ala Glu Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys 15 20 25 cag ccc tac tct cag ccc cat cag gtc tct ctg aac tcc ggc tac cac 149 Gln Pro Tyr Ser Gln Pro His Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His 30 35 40 ttc tgc ggt ggt tcc ctg atc agc gac tcc tgg gtt gtg tct gct gct 197 Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Asp Ser Trp Val Val Ser Ala Ala 45 50 55 cac tgc tac aag tcc cgt gtt gag gtc cgt atg ggc gaa cat cac att 245 His Cys Tyr Lys Ser Arg Val Glu Val Arg Met Gly Glu His His Ile 60 65 70 gga atg acc gag ggt aat gag cag ttc atc gac tcc tcc cgc gtc atc 293 Gly Met Thr Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asp Ser Ser Arg Val Ile 75 80 85 90 cgc cac ccc cag tac gac tcc tac aac atc gac aat gac atc atg ctg 341 Arg His Pro Gln Tyr Asp Ser Tyr Asn Ile Asp Asn Asp Ile Met Leu 95 100 105 atc aag ctg agc aag ccc gcc acc ctg aac cag tat gtg cag acc gtg 389 Ile Lys Leu Ser Lys Pro Ala Thr Leu Asn Gln Tyr Val Gln Thr Val 110 115 120 gcc ctg ccc tcc agc tgt gct ccc gct ggc acc atg tgc ctt gtg tcc 437 Ala Leu Pro Ser Ser Cys Ala Pro Ala Gly Thr Met Cys Leu Val Ser 125 130 135 ggc tgg ggc aac acc atg agc aat gtc agt ggt gac aag ctt cag tgc 485 Gly Trp Gly Asn Thr Met Ser Asn Val Ser Gly Asp Lys Leu Gln Cys 140 145 150 ctg cag atc ccc atc ctg tct gac cgc gac tgt aag aac tcc tac ccc 533 Leu Gln Ile Pro Ile Leu Ser Asp Arg Asp Cys Lys Asn Ser Tyr Pro 155 160 165 170 ggc atg atc acc gaa tcc atg ttc tgc gct gga tac ctg gag ggt ggc 581 Gly Met Ile Thr Glu Ser Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly 175 180 185 aag gac tct tgc cag ggt gac tct ggt ggc ccc gtg gtc tgc aac ggt 629 Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 190 195 200 gag ctg cag ggt att gtg tcc tgg gga tac ggc tgt gct gag cgt gac 677 Glu Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp 205 210 215 cat cct ggt gtc tac gcc aag gtc tgc ctc ttc aat gac tgg atc gac 725 His Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Cys Leu Phe Asn Asp Trp Ile Asp 220 225 230 agt acc atg gcc cag tac aac taagcctgtt cacctagaac attttgtgca 776 Ser Thr Met Ala Gln Tyr Asn 235 240 gttaaacaat aacttgcggt tgtacgaaga tggtgtaata tttgctattc tttgtatttt 836 gtttgtgttt tttttccatc cagcaataca ttcaatgcaa ttcaactgtt caaactgtac 896 tagcctgcct ctttcttggg ccatcatgtt agtatccaca ataaaaaacc ttcataatga 956 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 974 <210> SEQ ID NO:3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer aTryF1 <400> 3 tcyctgaayt ctggmtacca 20 <210> SEQ ID NO:4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer aTryF2 <400> 4 ggmtaccact tctgyggdgg 20 <210> SEQ ID NO:5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RTG <400> 5 aactggaaga attccgcggc 20 <210> SEQ ID NO:6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GSP1 <400> 6 gccccagcca gccacaag 18 <210> SEQ ID NO:7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GSP2 <400> 7 ggcgggcgtg ctcagcttga 20 <210> SEQ ID NO:8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GSP3 <400> 8 cgcccaaacg cacctcaaca 20 <210> SEQ ID NO:9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AUAP <400> 9 ggccacgcgt cgactagtac 20 <210> SEQ ID NO:10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer aTryF3 <400> 10 atcgacagga tcaatcagc 19
【図１】 酵素へのペプチド基質の結合に関するＳｃｈ
ｅｃｔｅｒ ａｎｄＢｅｒｇｅｒ（１９６８）命名法を
示す模式図（ａ）。プロテアーゼをぼかし部分として表
す。Ｐ１．．．．Ｐ’は６つのアミノ酸、Ｓ１．．．．
Ｓ’は酵素上の対応するサブ部位である。図の下側は３
種類の代表的セリンプロテアーゼのＳ１ポケットのオー
ガニゼーションを表す（ｂ）。
ｅｃｔｅｒ ａｎｄＢｅｒｇｅｒ（１９６８）命名法を
示す模式図（ａ）。プロテアーゼをぼかし部分として表
す。Ｐ１．．．．Ｐ’は６つのアミノ酸、Ｓ１．．．．
Ｓ’は酵素上の対応するサブ部位である。図の下側は３
種類の代表的セリンプロテアーゼのＳ１ポケットのオー
ガニゼーションを表す（ｂ）。
【図２】 幽門垂の相対位置を示したカタクチイワシの
内臓器官の模式図。この器官から採集した全ＲＮＡを、
第１鎖ｃＤＮＡ構築、次いでトリプシノーゲンの２つの
アイソザイムをコードするｃＤＮＡクローンの単離に用
いた。
内臓器官の模式図。この器官から採集した全ＲＮＡを、
第１鎖ｃＤＮＡ構築、次いでトリプシノーゲンの２つの
アイソザイムをコードするｃＤＮＡクローンの単離に用
いた。
【図３】 カタクチイワシトリプシノーゲンの２つのア
イソザイム（ａＴｒｙ Ｉ、ａＴｒｙ ＩＩ）をコード
するｃＤＮＡクローンの単離のための配列決定方法。水
平長方形はオープンリーディングフレームであり、それ
らの濃いぼかし部分および淡いぼかし部分はそれぞれシ
グナルペプチドおよび活性化ペプチドを表す。これらの
長方形から伸びた太線は、非コード領域を表し、各クロ
ーンの３’末端にポリＡ（ｎ）を示す。プライマーの方
向と模式的位置を示す。
イソザイム（ａＴｒｙ Ｉ、ａＴｒｙ ＩＩ）をコード
するｃＤＮＡクローンの単離のための配列決定方法。水
平長方形はオープンリーディングフレームであり、それ
らの濃いぼかし部分および淡いぼかし部分はそれぞれシ
グナルペプチドおよび活性化ペプチドを表す。これらの
長方形から伸びた太線は、非コード領域を表し、各クロ
ーンの３’末端にポリＡ（ｎ）を示す。プライマーの方
向と模式的位置を示す。
【図４】 各種脊椎動物からのトリプシノーゲンの保存
アミノ酸配列に基づく、３’−ＲＡＣＥのためのネステ
ッドプライマー。プライマーの縮重を最小限にするため
に、サケトリプシノーゲンのコドン利用によりこれらの
オリゴヌクレオチドプライマーの設計を案内した（表１
に示す）。数字はサケ配列中の数字に対応する。参考と
して図１７参照。 Ｓ：シグナルペプチド；Ａ：活性化ペプチド。
アミノ酸配列に基づく、３’−ＲＡＣＥのためのネステ
ッドプライマー。プライマーの縮重を最小限にするため
に、サケトリプシノーゲンのコドン利用によりこれらの
オリゴヌクレオチドプライマーの設計を案内した（表１
に示す）。数字はサケ配列中の数字に対応する。参考と
して図１７参照。 Ｓ：シグナルペプチド；Ａ：活性化ペプチド。
【図５】 ＰＣＲにより増幅した３’−ＲＡＣＥ生成物
の電気泳動パターン（ａ）およびヌクレオチド配列
（ｂ）。プライマーａＴｒｙＦ２の位置を指示する。推
定終止コドン（ＴＡＡ）およびポリアデニル化シグナル
（ＡＡＴＡＡＡ）を太字で示し、ポリ（Ａ）テイルに下
線を施した。
の電気泳動パターン（ａ）およびヌクレオチド配列
（ｂ）。プライマーａＴｒｙＦ２の位置を指示する。推
定終止コドン（ＴＡＡ）およびポリアデニル化シグナル
（ＡＡＴＡＡＡ）を太字で示し、ポリ（Ａ）テイルに下
線を施した。
【図６】 ５’−ＲＡＣＥ生成物の電気泳動パターン
（ａ）およびヌクレオチド配列（ｂ）。３’側オーバー
ラップ領域を太字で示す。推定開始コドンを四角で囲
み、プライマーＧＳＰ ３に対応するヌクレオチド配列
に下線を施し、下側に指示した。
（ａ）およびヌクレオチド配列（ｂ）。３’側オーバー
ラップ領域を太字で示す。推定開始コドンを四角で囲
み、プライマーＧＳＰ ３に対応するヌクレオチド配列
に下線を施し、下側に指示した。
【図７】 カタクチイワシトリプシノーゲンＩをコード
するｃＤＮＡクローン（ａＴｒｙ Ｉ）のＤＮＡヌクレ
オチド配列および演繹アミノ酸配列。右端の各列のロー
マ数字およびイタリック数字は、それぞれｃＤＮＡの
５’末端からのＤＮＡヌクレオチド、および第１メチオ
ニンからのアミノ酸を指示する。開始コドン（ＡＴＧ）
および終止コドン（ＴＡＡ）を太字で示す。推定ポリア
デニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよびポリ（Ａ）テイル
に下線を施した。アミノ酸配列中の中空の四角およびぼ
かしを施した四角は、それぞれトリプシノーゲンのシグ
ナルペプチドおよび活性化ペプチドを指示する。
するｃＤＮＡクローン（ａＴｒｙ Ｉ）のＤＮＡヌクレ
オチド配列および演繹アミノ酸配列。右端の各列のロー
マ数字およびイタリック数字は、それぞれｃＤＮＡの
５’末端からのＤＮＡヌクレオチド、および第１メチオ
ニンからのアミノ酸を指示する。開始コドン（ＡＴＧ）
および終止コドン（ＴＡＡ）を太字で示す。推定ポリア
デニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよびポリ（Ａ）テイル
に下線を施した。アミノ酸配列中の中空の四角およびぼ
かしを施した四角は、それぞれトリプシノーゲンのシグ
ナルペプチドおよび活性化ペプチドを指示する。
【図８】 カタクチイワシトリプシノーゲンＩＩをコー
ドするｃＤＮＡクローン（ａＴｒｙ ＩＩ）のＤＮＡヌ
クレオチド配列および演繹アミノ酸配列。右端の各列の
ローマ数字およびイタリック数字は、それぞれｃＤＮＡ
の５’末端からのＤＮＡヌクレオチド、および第１メチ
オニンからのアミノ酸を指示する。開始コドン（ＡＴ
Ｇ）および終止コドン（ＴＡＡ）を太字で示す。推定ポ
リアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよびポリ（Ａ）テ
イルに下線を施した。アミノ酸配列中の中空の四角およ
びぼかしを施した四角は、それぞれトリプシノーゲンの
シグナルペプチドおよび活性化ペプチドを指示する。
ドするｃＤＮＡクローン（ａＴｒｙ ＩＩ）のＤＮＡヌ
クレオチド配列および演繹アミノ酸配列。右端の各列の
ローマ数字およびイタリック数字は、それぞれｃＤＮＡ
の５’末端からのＤＮＡヌクレオチド、および第１メチ
オニンからのアミノ酸を指示する。開始コドン（ＡＴ
Ｇ）および終止コドン（ＴＡＡ）を太字で示す。推定ポ
リアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよびポリ（Ａ）テ
イルに下線を施した。アミノ酸配列中の中空の四角およ
びぼかしを施した四角は、それぞれトリプシノーゲンの
シグナルペプチドおよび活性化ペプチドを指示する。
【図９】 カタクチイワシからのトリプシノーゲンのヌ
クレオチド配列（ａＴｒｙ Ｉ、ａＴｒｙＩＩ；本発
明）とラットからのもの（ｒＴｒｙ１；ＭａｃＤｏｎａ
ｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）との比較。ａＴｒｙ
Ｉに関する同一および欠失ヌクレオチドを、それぞれ点
およびダッシュで示す。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ
終止コドンを四角で囲んだ。推定ポリアデニル化シグナ
ルに下線を施し、太字で強調した。ラットトリプシンの
エキソン／イントロン境界を配列の下側に指示した。
クレオチド配列（ａＴｒｙ Ｉ、ａＴｒｙＩＩ；本発
明）とラットからのもの（ｒＴｒｙ１；ＭａｃＤｏｎａ
ｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）との比較。ａＴｒｙ
Ｉに関する同一および欠失ヌクレオチドを、それぞれ点
およびダッシュで示す。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ
終止コドンを四角で囲んだ。推定ポリアデニル化シグナ
ルに下線を施し、太字で強調した。ラットトリプシンの
エキソン／イントロン境界を配列の下側に指示した。
【図１０】 （ａ）イヌアニオン性トリプシノーゲンｍ
ＲＮＡ（Ｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）およ
び（ｂ）カタクチイワシトリプシノーゲンｍＲＮＡの
５’末端非コード領域の、真核生物１８ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端（Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｂｂｅｒｇ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８４）に対する潜在ハイブリダイゼー
ション部位；ならびに（ｃ）カタクチイワシトリプシノ
ーゲンの５’末端非コード領域と図１７に示した他の脊
椎動物のものとの相同性。アラインメントを最大にする
ために、ギャップを導入した。潜在塩基対合（ａ，ｂ）
を点でマークした。第１コドン（ｃ）を太字で示す。
ＲＮＡ（Ｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）およ
び（ｂ）カタクチイワシトリプシノーゲンｍＲＮＡの
５’末端非コード領域の、真核生物１８ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端（Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｂｂｅｒｇ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８４）に対する潜在ハイブリダイゼー
ション部位；ならびに（ｃ）カタクチイワシトリプシノ
ーゲンの５’末端非コード領域と図１７に示した他の脊
椎動物のものとの相同性。アラインメントを最大にする
ために、ギャップを導入した。潜在塩基対合（ａ，ｂ）
を点でマークした。第１コドン（ｃ）を太字で示す。
【図１１】 カタクチイワシトリプシノーゲンシグナル
ペプチドと他種の魚類および脊椎動物のものとの比較。
疎水性コア残基を四角で囲んだ。小胞体ルーメン内にあ
る、シグナルペプチドのタンパク質分解性開裂について
推定される残基を太字で示す。これらの配列の出所を図
１７の説明文中に挙げた。
ペプチドと他種の魚類および脊椎動物のものとの比較。
疎水性コア残基を四角で囲んだ。小胞体ルーメン内にあ
る、シグナルペプチドのタンパク質分解性開裂について
推定される残基を太字で示す。これらの配列の出所を図
１７の説明文中に挙げた。
【図１２】 カタクチイワシトリプシノーゲンの活性化
ペプチドと他種の魚類および脊椎動物のものとの比較。
アラインメントを最大にするために、ギャップを導入し
た。特徴的なアニオン残基クラスターを濃い背景に太字
で示し、淡いハッチング部分は活性化ペプチドのタンパ
ク質開裂のための残基を強調したものである。これらの
配列の出所を図１７の説明文中に挙げた。
ペプチドと他種の魚類および脊椎動物のものとの比較。
アラインメントを最大にするために、ギャップを導入し
た。特徴的なアニオン残基クラスターを濃い背景に太字
で示し、淡いハッチング部分は活性化ペプチドのタンパ
ク質開裂のための残基を強調したものである。これらの
配列の出所を図１７の説明文中に挙げた。
【図１３】 カタクチイワシトリプシンの演繹アミノ酸
配列と他の脊椎動物のものとの比較。アミノ酸を、標準
的なキモトリプシンのナンバリング方式（Ｈａｒｔｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｆａｕｆｍａｎｎ，１９６６）でナンバリ
ングした。これらの配列はジーンバンクまたはスイスプ
ロットのデータベースから入手された（参考文献につい
ては図１７参照）。同一残基を点で示し、アラインメン
トを最大にするためにギャップを導入した。２つの表面
ループ（残基１８５〜１８９、ループ１；２２１〜２２
５、ループ２）に網掛けし、下側に指示した。自己消化
ループ形成残基（残基１４３〜１５４；Ｇｅｎｉｃｏｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９６）に淡いぼかしを施し、Ｓ１
結合ポケット形成残基を四角で囲み、下側に指示した。
配列と他の脊椎動物のものとの比較。アミノ酸を、標準
的なキモトリプシンのナンバリング方式（Ｈａｒｔｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｆａｕｆｍａｎｎ，１９６６）でナンバリ
ングした。これらの配列はジーンバンクまたはスイスプ
ロットのデータベースから入手された（参考文献につい
ては図１７参照）。同一残基を点で示し、アラインメン
トを最大にするためにギャップを導入した。２つの表面
ループ（残基１８５〜１８９、ループ１；２２１〜２２
５、ループ２）に網掛けし、下側に指示した。自己消化
ループ形成残基（残基１４３〜１５４；Ｇｅｎｉｃｏｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９６）に淡いぼかしを施し、Ｓ１
結合ポケット形成残基を四角で囲み、下側に指示した。
【図１４】 カタクチイワシの種々の組織におけるトリ
プシノーゲンをコードするｍＲＮＡのノーザンブロット
分析。幽門垂（列１）、腸（列２）、肝臓（列３）、胃
（列４）、心臓（列５）、骨格筋（列６）から採集した
約１０μｇの全ＲＮＡを、０．９％アガロースゲル上で
電気泳動した。次いでＲＮＡをナイロン膜にブロット
し、カカクチイワシトリプシノーゲンＩ ｃＤＮＡ（ａ
ＴｒｙＩ；図７）の３’末端由来の４０８ｂｐ ＤＮＡ
プローブとハイブリダイズさせた。平行した臭化エチジ
ウム染色ゲルは、２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡを示
す。
プシノーゲンをコードするｍＲＮＡのノーザンブロット
分析。幽門垂（列１）、腸（列２）、肝臓（列３）、胃
（列４）、心臓（列５）、骨格筋（列６）から採集した
約１０μｇの全ＲＮＡを、０．９％アガロースゲル上で
電気泳動した。次いでＲＮＡをナイロン膜にブロット
し、カカクチイワシトリプシノーゲンＩ ｃＤＮＡ（ａ
ＴｒｙＩ；図７）の３’末端由来の４０８ｂｐ ＤＮＡ
プローブとハイブリダイズさせた。平行した臭化エチジ
ウム染色ゲルは、２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡを示
す。
【図１５】 骨格筋から抽出したカタクチイワシゲノム
ＤＮＡのサザンブロット分析。ＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩ
（列１）およびＨｉｎ ｄＩＩＩ（列２）で消化し、
０．８％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜にブロ
ットした。次いでこのブロットした膜を、ノーザンブロ
ット分析に用いたものと同じプローブとハイブリダイズ
させた。ＥｃｏＴ１４Ｉ消化したλ−ファージＤＮＡマ
ーカーの移動を左側に示す。
ＤＮＡのサザンブロット分析。ＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩ
（列１）およびＨｉｎ ｄＩＩＩ（列２）で消化し、
０．８％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜にブロ
ットした。次いでこのブロットした膜を、ノーザンブロ
ット分析に用いたものと同じプローブとハイブリダイズ
させた。ＥｃｏＴ１４Ｉ消化したλ−ファージＤＮＡマ
ーカーの移動を左側に示す。
【図１６】 カタクチイワシトリプシンおよびラットト
リプシン（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８
２）からのアミノ酸の疎水性プロット：Ｋｙｔｅ ａｎ
ｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）が示した目盛によ
る。１０残基ウインドーを用いてアミノ酸の電荷をプロ
ットした。成熟トリプシンのアミノ酸のみを含む。
リプシン（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８
２）からのアミノ酸の疎水性プロット：Ｋｙｔｅ ａｎ
ｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）が示した目盛によ
る。１０残基ウインドーを用いてアミノ酸の電荷をプロ
ットした。成熟トリプシンのアミノ酸のみを含む。
【図１７】 図１３に示したアミノ酸アラインメントか
ら推測したトリプシンの進化系統樹。系統樹作成には、
外集団としての細菌に由来するものと共に、成熟トリプ
シン（すなわちＮ末端シグナルペプチドおよび活性化ペ
プチドを除く）のみを採用する。近縁種参入法（ｎｅｉ
ｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｉ
ｔｏ ａｎｄ Ｎｅｉ，１９８７）により作成した根無
し進化系統樹は、クラスタルＷ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）
コンピュータープログラムにより提供された全アミノ酸
配列（ギャップを除く）の対合アラインメントに基づく
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この
系統樹はフィリップ（ＰＨＹＬＩＰ）パッケージからの
ドローツリー（ＤＲＡＷＴＲＥＥ）プログラムに合わせ
て描かれた（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，１９９３）；距
離は相対分岐を示す。カタクチイワシトリプシンのアミ
ノ酸配列（カタクチイワシＩおよびＩＩ）を、ジーンバ
ンクおよびスイスプロットのデータベースから入手した
ものと比較した：サケＩ（ＳａｌＴＲＰＩ；Ｍａｌｅ
ｅｔ ａｌ．，１９９５）、タラＩおよびタラＸ（太平
洋タラトリプシンＩおよびＸ；Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔ
ｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、カレイ（Ｐａｒａ
ｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ；寄託番号ＡＢ
０２９７５０）、南極圏（南極圏魚、Ｐａｒａｎｏｔｏ
ｔｈｅｎｉａ ｍａｇｅｌｌａｎｉｃａ；Ｇｅｎｉｃｏ
ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、ラット１（ＭａｃＤｏ
ｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、ウシアニオン
（ウシアニオン性；Ｌｅ Ｈｕｅｒｏｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９０）、ウシカチオン（ウシカチオン性；Ｗ
ａｌｓｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ，１９６４，Ｗａｌ
ｓｈ，１９７０）、ヒト１（ヒト膵臓；Ｅｍｉ ｅｔ
ａｌ．，１９８６）および細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｆｒａｄｉａｅ；寄託番号Ｄ１６６８７）。
ら推測したトリプシンの進化系統樹。系統樹作成には、
外集団としての細菌に由来するものと共に、成熟トリプ
シン（すなわちＮ末端シグナルペプチドおよび活性化ペ
プチドを除く）のみを採用する。近縁種参入法（ｎｅｉ
ｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｉ
ｔｏ ａｎｄ Ｎｅｉ，１９８７）により作成した根無
し進化系統樹は、クラスタルＷ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）
コンピュータープログラムにより提供された全アミノ酸
配列（ギャップを除く）の対合アラインメントに基づく
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この
系統樹はフィリップ（ＰＨＹＬＩＰ）パッケージからの
ドローツリー（ＤＲＡＷＴＲＥＥ）プログラムに合わせ
て描かれた（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，１９９３）；距
離は相対分岐を示す。カタクチイワシトリプシンのアミ
ノ酸配列（カタクチイワシＩおよびＩＩ）を、ジーンバ
ンクおよびスイスプロットのデータベースから入手した
ものと比較した：サケＩ（ＳａｌＴＲＰＩ；Ｍａｌｅ
ｅｔ ａｌ．，１９９５）、タラＩおよびタラＸ（太平
洋タラトリプシンＩおよびＸ；Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔ
ｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、カレイ（Ｐａｒａ
ｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ；寄託番号ＡＢ
０２９７５０）、南極圏（南極圏魚、Ｐａｒａｎｏｔｏ
ｔｈｅｎｉａ ｍａｇｅｌｌａｎｉｃａ；Ｇｅｎｉｃｏ
ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、ラット１（ＭａｃＤｏ
ｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、ウシアニオン
（ウシアニオン性；Ｌｅ Ｈｕｅｒｏｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９０）、ウシカチオン（ウシカチオン性；Ｗ
ａｌｓｈ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ，１９６４，Ｗａｌ
ｓｈ，１９７０）、ヒト１（ヒト膵臓；Ｅｍｉ ｅｔ
ａｌ．，１９８６）および細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｆｒａｄｉａｅ；寄託番号Ｄ１６６８７）。
【図１８】 スイスモデルで作成し、スイスＰｄｂビュ
ーワーで観察したカタクチイワシトリプシンＩおよびト
リプシンＩＩの三次元構造（材料と方法、参照）。２つ
の表面ループ、および自己消化ループは示されている。
水素結合を点で示す。これらの図はコンピュータープロ
グラムＲａｓＭｏｌ ｖｅｒ２．６を用いて作成され
た。
ーワーで観察したカタクチイワシトリプシンＩおよびト
リプシンＩＩの三次元構造（材料と方法、参照）。２つ
の表面ループ、および自己消化ループは示されている。
水素結合を点で示す。これらの図はコンピュータープロ
グラムＲａｓＭｏｌ ｖｅｒ２．６を用いて作成され
た。
【図１９】 カタクチイワシトリプシンＩ（細線；左パ
ネル）およびウシトリプシンＩ（太線；右パネル）のＣ
αトレース。触媒性残基Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２
およびＳｅｒ−１９５の側鎖をボールとスティック型モ
デルにより示す。Ｓ１ポケットの底部に位置するＡｓｐ
−１８９および他のトリプシン決定残基Ｔｙｒ−１７２
の側鎖をワイヤ型モデルで表す。主鎖らせんと水素結合
を形成すると推定されるＣ末端Ａｓｎ−２４５も示す。
ネル）およびウシトリプシンＩ（太線；右パネル）のＣ
αトレース。触媒性残基Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２
およびＳｅｒ−１９５の側鎖をボールとスティック型モ
デルにより示す。Ｓ１ポケットの底部に位置するＡｓｐ
−１８９および他のトリプシン決定残基Ｔｙｒ−１７２
の側鎖をワイヤ型モデルで表す。主鎖らせんと水素結合
を形成すると推定されるＣ末端Ａｓｎ−２４５も示す。
【図２０】 残基１５１がカタクチイワシトリプシン
（右パネル）およびウシトリプシン（左パネル）のＳ１
結合ポケット組立てに及ぼす影響。このモデルの構築に
は、Ｓ１結合ポケットを構成する残基および基質特異性
を決定する重要な残基のみを採用した。触媒性残基Ｈｉ
ｓ−５７、Ａｓｐ−１０２およびＳｅｒ−１９５を空間
充填型モデルにより示す。Ｓ１ポケットの底部に位置す
るＡｓｐ−１８９および他のトリプシン決定残基Ｔｙｒ
−１７２の側鎖もマークした。両トリプシンの自己消化
ループ（黒色の太線）の相対配向を、ウシのＴｙｒ−１
５１がＳ１ポケットのＧｌｎ−１９２を指した状態で示
す。カタクチイワシの残基Ｇｌｎ−１９２はＴｙｒ１５
１Ｓｅｒ置換のため、自由度がより大きい点に注目され
たい。
（右パネル）およびウシトリプシン（左パネル）のＳ１
結合ポケット組立てに及ぼす影響。このモデルの構築に
は、Ｓ１結合ポケットを構成する残基および基質特異性
を決定する重要な残基のみを採用した。触媒性残基Ｈｉ
ｓ−５７、Ａｓｐ−１０２およびＳｅｒ−１９５を空間
充填型モデルにより示す。Ｓ１ポケットの底部に位置す
るＡｓｐ−１８９および他のトリプシン決定残基Ｔｙｒ
−１７２の側鎖もマークした。両トリプシンの自己消化
ループ（黒色の太線）の相対配向を、ウシのＴｙｒ−１
５１がＳ１ポケットのＧｌｎ−１９２を指した状態で示
す。カタクチイワシの残基Ｇｌｎ−１９２はＴｙｒ１５
１Ｓｅｒ置換のため、自由度がより大きい点に注目され
たい。
【図２１】 カタクチイワシおよびウシのトリプシンに
おける表面ループ２（残基２２１〜２２５；図１３参
照）、ならびにＳ１結合ポケットを内張りする残基のス
ティック型モデル。カタクチイワシトリプシンのループ
２のＧｌｕ−２２１およびＡｓｐ−２２３、ならびに対
応するウシトリプシンの残基を、ボールおよびスティッ
ク型モデルにより示す。触媒三つ組を構成する残基も指
示する。
おける表面ループ２（残基２２１〜２２５；図１３参
照）、ならびにＳ１結合ポケットを内張りする残基のス
ティック型モデル。カタクチイワシトリプシンのループ
２のＧｌｕ−２２１およびＡｓｐ−２２３、ならびに対
応するウシトリプシンの残基を、ボールおよびスティッ
ク型モデルにより示す。触媒三つ組を構成する残基も指
示する。
Claims (8)
- 【請求項１】 配列番号１における２０位から２４０位
までのアミノ酸配列または配列番号２における２０位か
ら２４１位までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から
なるプロテアーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号１における１４ないし２０位の
何れかの位置から２４０位までのアミノ酸配列または配
列番号２における１４ないし２０位の何れかの位置から
２４１位までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からな
るプロテアーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号１における１ないし１３位の何
れかの位置から２４０位までのアミノ酸配列または配列
番号２における１ないし１３位の何れかの位置から２４
１位までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるプ
ロテアーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のＤＮＡがコードする
アミノ酸配列において、一部のアミノ酸残基が置換、挿
入または欠失しているアミノ酸配列からなるが、請求項
１ないし３のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有する
プロテアーゼと実質的に同一の生物活性を有するプロテ
アーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１ないし４のＤＮＡを組み込んだ
発現ベクター。 - 【請求項６】 請求項５の発現ベクターにより、形質転
換された宿主細胞をイワシ由来プロテアーゼまたはそれ
と実質的に同一の生物活性を有するプロテアーゼを生産
する条件下で培養し、該宿主により生産されたプロテア
ーゼを回収することからなる、イワシ由来プロテアーゼ
を製造する方法。 - 【請求項７】 請求項６の方法で生産され、魚由来の他
の蛋白質を実質的に含まないプロテアーゼ。 - 【請求項８】 約８％〜２４％の高塩濃度の水性溶液中
に、ニシン目からなる群から選択される魚介類の一種以
上を浸漬したものに、請求項７の方法で製造したプロテ
アーゼを添加し、約１〜１１ケ月間発酵させ該プロテア
ーゼを添加しない場合に比べて不快臭の発生を抑制しつ
つ短期間に魚醤を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000084302A JP2001269173A (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 新規ｄｎａ配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000084302A JP2001269173A (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 新規ｄｎａ配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001269173A true JP2001269173A (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=18600794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000084302A Pending JP2001269173A (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 新規ｄｎａ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001269173A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009521943A (ja) * | 2006-01-04 | 2009-06-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 醤油の製造方法 |
-
2000
- 2000-03-24 JP JP2000084302A patent/JP2001269173A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009521943A (ja) * | 2006-01-04 | 2009-06-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 醤油の製造方法 |
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