KR20080080162A

KR20080080162A - 간장의 제조방법

Info

Publication number: KR20080080162A
Application number: KR1020087016160A
Authority: KR
Inventors: 페르 문크 니엘슨; 안데르스 빅소에-니엘슨
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2007-01-03
Publication date: 2008-09-02
Also published as: EP1971229A2; WO2007077244A2; WO2007077244A3; JP2009521943A; CN101365349A; US20090041895A1

Abstract

본 발명은 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 전분분해 효소를 사용하는 간장의 제조방법에 관련된다.

전분분해, 아밀라제, 간장, 모로미, 코지.

Description

간장의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING SOY SAUCE}

본 발명은 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 전분분해 효소(amylolytic enzyme)를 사용하는 간장의 제조방법에 관한 것이다.

간장은 대두(soy beans) 및 선택적으로 소맥 및 쌀과 같은 다른 식물성 성분들로부터 제조된다. 공정의 동안에 전분 및 다른 탄수화물은 방향 화합물의 형성을 위해 에너지원 및 기질로서 발효를 위해 사용된 미생물에 의해 이용될 수 있는 당으로 분해된다. 전분의 붕괴는 전통적으로 코지(koji) 발효의 동안에 사용된 배양물에 의해 생산된 전분분해 효소에 의해 달성된다. 전분 가수분해의 효율은 간장의 제조에 중요하다.

발명의 개요

본 발명자들은 탄수화물 결합 모듈(Carbohydrate Binding Module: CBM)을 포함하는 전분분해 효소의 사용이 간장 제조에 관련된 조건 하에 CBM 없는 전분분해 효소와 비교하여 전분 가수분해의 증가된 비율을 이끈다는 것을 발견하였다.

결과적으로, 본 발명은 i) 식물성 재료를 전분분해 효소로 처리하는 단계와; ii) 처리된 식물성 재료로부터 간장을 제조하는 단계를 포함하며; 여기서 전분분해 효소는 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 간장의 제조방법에 관련된다. 더 이상의 관점에서, 본 발명은 간장을 제조하는 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 전분분해 효소의 사용에 관련되고, 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 간장에 관련된다.

효소

본 발명의 방법에 사용되는 효소는 탄수화물 결합 모듈(Carbohydrate Binding Module: CBM)을 포함하는 전분분해 효소이다. 전분분해 효소는 전분 및 관련 올리고당류 및 다당류를 분해할 수 있는 효소이다. 바람직한 전분분해 효소는 알파-아밀라제(EC 3.2.1.1), 베타-아밀라제(EC 3.2.1.2), 말토젠 알파-아밀라제(EC 3.2.1.133) 및 글루코아밀라제(EC 3.2.1.3)이다. EC (Enzyme Commission) 번호는 「생화학 및 분자 생물학의 국제연합 학술용어 위원회」(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB)의 효소 정의를 말한다.

탄수화물 결합 모듈(CBM), 또는 종종 말하는 탄수화물 결합 도메인( carbohydrate-binding domain: CBD)은 다당류 또는 올리고당류(탄수화물)에 우선적으로 결합하나, 빈번하게는 그러나 반드시 오로지는 아닌 그것의 수불용성(결정성 포함) 형태에 결합하는 폴리펩티드 아미노산 서열이다.

전분 분해 효소로부터 유도된 CBM은 종종 전분 결합 모듈 또는 SBM들(어떤 글루코아밀라제와 같은 어떤 전분분해 효소에서, 또는 시클로덱스트린 글루코트렌스퍼라제와 같은 효소에서, 또는 엔도-아밀라제에서 일어날 수도 있는 CBM들)로도 부른다. SBM은 종종 SBD(Starch Binding Domains)로도 부른다. 본 발명에서 바람직한 것은 전분 결합 모듈인 CBM이다.

CBM은 기질 가수분해를 위한 활성 부위를 함유하는 촉매 모듈과 문제의 탄수화물 기질에 결합하기 위한 탄수화물-결합 모듈(CBM)을 전형적으로 포함하는 가수분해 효소(하이드롤라제)에서 특히, 두가지 이상의 폴리펩티드 아미노산 서열 영역으로 구성되는 대형 폴리펩티드 또는 단백질의 일체부로서 발견된다. 이러한 효소들은 하나 이상의 촉매 모듈을 포함하고 하나, 둘 또는 세개의 CBM을 포함할 수 있고, 그리고 선택적으로 촉매 모듈로 CBM(s)을 연결하는 하나 이상의 폴리펩티드 아미노산 서열 영역을 더 포함하며, 후자의 형태의 영역은 보통 "링커(linker)"라고 한다. CBM은 또한 비가수분해성 다당류 결합 단백질의 형태로 해초에서, 예를 들면 홍조(red alga) Porphyra purpurea 에서 발견되었다.

CBM이 일어나는 단백질/폴리펩티드(예를 들면, 효소, 전형적으로 가수분해 효소)에서, CBM은 N 또는 C 말단에서 또는 내부 위치에서 위치될 수도 있다.

CBM 자체를 구성하는 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들면 가수분해 효소)의 그 부분은 약 30개 이상이고 약 250개 미만의 아미노산 잔기들로 구성된다. "패밀리 20의 탄수화물 결합 모듈(Carbohydrate-Binding Module of Family 20)" 또는 CBM-20 모듈은 본 발명의 내용에서 Joergensen et al (1997) in Biotechnol. Lett. 19:1027-1031에 의해 도 1에 개시된 폴리펩티드의 탄수화물 결합 모듈(CBM)에 적어도 45% 동일성을 갖는 대략 100개의 아미노산의 서열로서 정의된다. CBM은 폴리펩티드의 마지막 102개의 아미노산, 즉 아미노산 582 내지 아미노산 683의 서열을 포함한다. 이 명세서에서 적용된 글리코시드 하이드롤라제 패밀리의 번호매기기는 다음 문헌의 컨셉에 따른다: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate-Active Enzymes server at URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html or alternatively Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; 셀룰라제 및 다른 탄수화물 활성 효소의 모듈 구조: 통합된 데이터베이스 접근. In " Genetics , Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation ", K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23, 그리고 Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; 글리코시드 하이드롤라제 및 글리코실트랜스퍼라제: 패밀리 및 기능성 모듈, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

본 발명의 내용에서 사용하기에 적합한 CBM을 포함하는 효소의 예들은 엔도-아밀라제(즉 알파-아밀라제, EC 3.2.1.1), 말토젠 알파-아밀라제(EC 3.2.1.133), 글루코아밀라제(EC 3.2.1.3) 및 CGT아제(EC 2.4.1.19)이다.

본 발명에 따르는 CBM을 포함하는 전분분해 효소는 자연적으로 CBM을 포함하는 야생형 효소일 수도 있고 또는 재조합 효소일 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서 CBM을 포함하는 전분분해 효소는 전분분해 활성을 갖는 촉매 모듈의 아미노산 서열과 탄수화물 결합 모듈의 아미노산 서열을 포함하는 하이브리드 효소이다.

본 발명에 바람직한 것은 탄수화물 결합 모듈 패밀리 20의 CBM이다. 본 발명에 적합한 탄수화물 결합 모듈 패밀리 20의 CBM은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) (SWISSPROT P36924)의 배타-아밀라제로부터 유도될 수도 있고, 또는 바실러스 서큘란스( Bacillus circulans ) (SWISSPROT P43379)의 CGTases로부터 유도될 수도 있다. 본 발명에서 또한 바람직한 것은 상기한 CBM 아미노산 서열의 어떤 것에 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%로도 동일성을 갖는 어떤 CBM도 된다. 탄수화물 결합 모듈 패밀리 20의 또한 적합한 CBM은 URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html)에서 찾아볼 수 있다.

일단 기질 결합(탄수화물 결합) 영역이 cDNA 또는 염색체 DNA로서 확인되면, 그 다음 그것을 관심있는 효소 활성을 코딩하는 DNA 서열에 융합하도록 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 탄수화물 결합 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편과 관심있는 효소를 코딩하는 DNA를 그 다음 링커와 또는 링커 없이 라이게이션한다. 결과된 라이게이션된 DNA를 그 다음, 발현을 달성하기 위한 여러가지 방법으로 조작할 수 있다

세균으로부터 유도하는 CBM는 일반적으로 본 발명의 내용에 사용하기에 적합할 것이나, 바람직한 것은 바실러스 유래의 CBM들, 예를 들면, 바실러스 플라보테르무스(Bacillus flavothermus ) (Syn. Anoxybacillus contaminans)로부터의, 바람직하게는 아밀라제 AMY1048 (WO 2005/003311의 SEQ ID NO:2), AMY1039, 또는 AMY1079 (WO 2005/001064에서 각각 SEQ ID NO 1, 2 및 3으로서 개시된 것들), Diversa로부터의 WO 2002068589에 개시된 바실러스 아밀라제, Bacillus sp. TS23 (한국) (Lin,L.-L.; (01-MAR-1995) EMBL/GenBank/DDBJ 데이터베이스에 제출됨. Long-Liu Lin, Food Industry Research Institute, Culture Collection and Research Center, 331 Food Road, Hsinchu, Taiwan 300, Republic of China)로부터의 CBM20이다.

여기서 언급된 하이브리드 효소 또는 유전공학적으로 변형된 야생형 효소는 탄수화물 결합 모듈(CBM)을 포함하는 아미노산 서열에 연결된(즉, 공유 결합된) 알파-전분분해 효소(EC 3.2.1.1)의 아미노산 서열을 포함하는 종을 포함한다.

CBM-함유 하이브리드 효소, 또한 그것의 제조 및 정제의 상세한 설명은 본 분야에 공지되어 있다.[예를 들면 WO 90/00609, WO 94/24158 및 WO 95/16782, 또한 Greenwood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295-1305 참조]. 그것들은, 관심있는 효소를 코딩하는 DNA 서열에, 예를 들면 링커를 가지고 또는 링커 없이, 라이게이션된 탄수화물 결합 모듈을 코딩하는 DNA의 단편을 적어도 포함하는 DNA 구조물을 숙주 세포로 형질전환하고, 형질전환된 숙주 세포를 융합된 유전자를 발현하도록 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 결과된 재조합 생산물(하이브리드 효소) - 본 분야에서 종종 "융합 단백질(fusion protein)"이라 함 - 은 다음 일반식으로 표시할 수 있다:

A-CBM-MR-X

후자의 식에서, A-CBM은 적어도 탄수화물 결합 모듈(CBM) 자체를 포함하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단 영역이다. MR은 중간 영역("링커")이고, X는 CBM이 결합되는 효소(또는 다른 단백질)을 코딩하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 서열이다.

부분 A는 없을 수도 있고(A-CBM은 CBM 자체이고, 즉 CBM을 구성하는 것들이외의 아미노산 잔기를 포함하지 않고), 아니면 하나 이상의 아미노산 잔기의 서열(CBM 자체의 말단 연장부로서 기능함)일 수도 있다. 링커(MR)는 결합일 수도 있고, 또는 약 2 내지 약 100 탄소 원자, 특히 2 내지 40 탄소 원자를 포함하는 짧은 연결기일 수도 있다. 그러나, MR은 바람직하게는 약 2 내지 약 100 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 2 내지 40 아미노산 잔기, 예를 들면 2 내지 15 아미노산 잔기의 서열이다.

부분 X는 전면적인 하이브리드 효소의 N-말단이나 아니면 C-말단 영역으로 구성될 수도 있다.

문제의 형태의 하이브리드 효소에서 CBM은, 하이브리드 효소에서 C-말단으로, N-말단으로 또는 내부에 위치될 수도 있다는 것은 위로부터 명백할 것이다.

바람직한 구체예에서 본 발명에 따르는 CBM을 포함하는 전분분해 효소는 전분 결합 도메인을 포함하는 알파-아밀라제, 예를 들면 전분 결합 도메인을 포함하고 원료 전분에 대해 활성을 갖는 산 알파-아밀라제이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 전분 결합 도메인을 포함하는 알파-아밀라제는 하이브리드 효소이거나 또는 폴리펩티드는 이미 알파-아밀라제 활성과 전분 결합 도메인을 갖는 촉매 모듈을 포함하는 야생형 효소일 수도 있다. 본 발명 방법에서 사용되는 폴리펩티드는 또한 이러한 야생형 효소의 변형일 수도 있다. 전분 결합 도메인을 포함하는 적합한 알파-아밀라제는 WO2005003311A2에 개시되어 있다. 바람직한 것은 WO 2006/066579에 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4로서 개시된 아미노산 서열을 갖는 아밀라제, 또는 WO 2006/066596에 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 12로서 개시된 아미노산 서열을 갖는 아밀라제, 또는 알파-아밀라제 활성을 갖고, 상기한 아미노산 서열들 중 어떤 것과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 로도 동일성을 갖는 전분 결합 도메인을 포함하는 어떤 폴리펩티드도 된다.

특정 구체예에서 알파-아밀라제는, 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis ), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens ), 및 바실러스 스테아로테르모필러스(B. stearothermophilus ) 알파-아밀라제의 균주로부터 유도된 세균 알파-아밀라제이다.

본 발명의 방법에서, CBM을 포함하는 전분분해 효소는 정제될 수도 있다. 여기서 사용되는 용어 "정제된"은 유도되는 유기체로부터의 성분들이 없는 전분분해 효소 단백질을 망라한다. 용어 "정제된"은 또한 얻어지는 본래의 유기체로부터의 성분들이 없는 전분분해 효소 단백질을 망라하며, 이것은 또한 "본질적으로 순수한" 전분분해 효소를 말하고 특히 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 삽입에 의해서와 같은 유전공학적으로 변형되지 않은 자연 발생하는 전분분해 효소에 관련된다.

따라서, CBM을 포함하는 전분분해 효소는 정제될 수도 있다. 즉, 단지 극소량의 다른 단백질들이 존재한다. "다른 단백질"이라는 표현은 구체적으로 다른 효소들에 관련된다. 여기서 사용되는 용어 "정제된"은 또한 다른 성분들, 특히 다른 단백질들, 및 가장 구체적으로는 전분분해 효소의 기원 세포에서 존재하는 다른 효소들의 제거를 말한다. 전분분해 효소는 "실질적으로 순수"할 수도 있고, 즉 그것이 생산된 유기체, 즉 예를 들면 재조합 생산된 전분분해 효소에 대한 숙주 유기체로부터의 다른 성분들이 없다. 바람직하게는, 효소는 적어도 75% (w/w) 순수하고, 더 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90% 또는 적어도 95% 로도 순수하다. 여전히 더 바람직한 구체예에서, 전분분해 효소는 적어도 98% 순수한 효소 단백질 제제이다.

본 발명 방법에서 사용되는 특정 효소들은 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 당업자에 의해 선택될 수도 있다. 효소가 활성일 것을 요망하는 간장 공정의 일부의 조건하에 원하는 활성을 갖는 효소가 선택될 수도 있다. 예를 들면, 효소는 간장 제조 공정에서 사용되는 높은 NaCl 농도 및 낮은 pH 하의 그것의 활성에 대해 선택될 수도 있다.

간장

간장은 특히 동양 음식에서 향신료로서 사용되는 육류 같은, 짠 맛을 갖는 대두 또는 대두 유도된 재료를 기재로 한 옅은 갈색 내지 흑색 액체 형태의 양념이다. 간장의 제조에서, 예를 들어서 대두 또는 대두 유도된 재료, 예를 들면, 대두가루, 탈지 대두, 및 탈지 대두가루; 소맥; 소맥 유도된 재료; 쌀; 쌀 유도된 재료; 및 보리와 같은 식물성 성분들이 사용된다. 간장의 주성분들은 보통 대두 또는 탈지 대두가루 및, 소맥, 염 및 물이다. 전통적으로, 간장은 발효공정으로 만들어지나 미발효 간장도 제조될 수도 있다.

발효된 간장은 보통 다음 단계들: 코지의 제조, 염수 발효(모로미 발효: moromi fermentation), 여과/멸균, 및 숙성으로 제조된다.

코지는 보통 조리된 대두 또는 조리된 탈지 대두가루를 볶은 소맥과 혼합함으로써 제조된다. 혼합물은 다음에, 보통 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및/또는 아스퍼질러스 소자에(Aspergillus sojae)의 스타터 배양물로 접종하고 호기성 발효를 위해 얕은 베드에서 2-3일간 발효되도록 둔다. 발효 후 코지를 염수 발효(모로미 발효)를 위해 탱크에 옮긴다. 염수를 첨가하여 보통 16-18%의 전체 NaCl 함량으로 하고 그것은 보통 더욱 혐기성 발효를 위해 효모 및 젖산 세균 배양물로 접종시킨다. 결과된 혼합물을 모로미라고도 한다. 2-3일 배양 후에 원료 간장을 모로미로부터 압착, 여과, 멸균시키고 종종 수개월간 발효를 위해 두거나, 또는 여과하고 병에 담아 소비자에게 갈때, 모로미를 발효가 마무리될 때까지 발효를 위해 방치할 수도 있다.

코지 및 모로미 발효 공정의 동안에 전분과 같은 탄수화물을 가수분해하고 결과된 당을 모로미 발효의 동안에 발효시켜 향료와 소량의 알콜 및 젖산을 생산하고 단백질을 펩티드 및 아미노산으로 붕괴시킨다. 이들 공정은 발효된 간장의 전형적인 복합체 향료의 개발을 위해 중요하다.

비발효 간장은 보통 가수분해된 식물성 단백질, 전형적으로 예를 들어서 대두, 탈지 대두, 소맥, 소맥 유도된 재료, 쌀, 쌀 유도된 재료 및/또는 보리의 산 가수분해물로부터 제조되는데, 여기에 카라멜 색소, 콘 시럽 및 염분과 같은 추가의 성분들이 첨가된다.

간장은 염분을 줄인 간장으로서 제조될 수도 있다. 발효된 간장의 경우에 이것은 보통 여과 및/또는 이온 교환에 의해 간장으로부터 염분을 제거함으로써 달성된다. 마무리된 간장은 보통 4-6.5의 pH와 13-22% NaCl (중량/중량)의 염 함량을 가지며, 단, 염분을 줄인 간장인 경우는 보통 6% NaCl로 줄인다.

효소학적 처리

CBM을 포함하는 전분분해 효소로 식물성 재료의 처리는 본 분야의 어떤 공지의 방법으로도 수행될 수 있다. 처리는 예를 들면 식물성 재료의 슬러리에 효소를 첨가함으로써 또는 원료에 효소를 분무함으로써 실행될 수도 있다. 효소는 예를 들면 코지 발효의 전에 또는 그동안에 첨가될 수도 있고, 또는 효소는 모로미 발효의 전에 또는 그동안에 첨가될 수도 있다. 간장의 모든 성분들은 동시에 전분분해 효소로 처리될 수도 있고, 또는 간장의 한가지 이상의 식물성 성분이 추가의 성분들과 혼합되기 전에 처리될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 전분분해 효소로 처리할 식물성 재료는 대두 및/또는 대두 유도된 재료를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 전분분해 효소로 처리할 식물성 재료는 소맥; 소맥 유도된 재료; 예를 들면, 밀가루 또는 밀 전분; 쌀; 및/또는 쌀 유도된 재료, 예를 들면 쌀 전분을 포함한다. 전분을 포함하는 성분들을 간장의 다른 성분들과 혼합되기 전에 따로따로 전분분해 효소로 처리할 수도 있고, , 예를 들면 소맥, 밀가루, 밀전분, 쌀 및/또는 쌀 전분을 전분분해 효소로 따로따로 처리할 수도 있고, 그리고 대두 및/또는 대두 유도된 재료, 뿐만아니라 다른 성분들을 전분분해 효소로 처리 후에 첨가할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 대두 및/또는 대두 유도된 재료는 단계 i) 후에 처리된 식물성 재료에 첨가된다.

사용된 효소의 양은 코지 배양물 자체의 전분 가수분해와 비교하여 전분 가수분해를 증가시키기에 충분해야 한다. 본 발명의 한 구체예에서 CBM을 포함하는 전분분해 효소의 양은 전분분해 효소가 첨가되지 않은 유사한 공정과 비교하여 전분 가수분해도를 증가시키기에 충분하다. 본 발명의 또다른 구체예에서 CBM을 포함하는 전분분해 효소의 양은 CBM 없이 전분분해 효소가 첨가되는 유사한 공정과 비교하여 전분 가수분해도를 증가시키기에 충분하다. CBM을 포함하는 전분분해 효소는 효소가 작용해야하는 간장 공정의 조건, 예를 들면 25 내지 45℃의 온도 및 예를 들면 17-18%의 모로미 발효 단계에서의 염 (NaCl) 농도와 같은 조건하에 충분한 활성을 갖도록 하는 양으로 첨가되어야 한다.

한 구체예에서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 또는 얻어지는 간장과 관련된다. 더 이상의 구체예에서 본 발명은 간장의 제조를 위한 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 전분분해 효소의 사용에 관련된다.

실시예 1

효소

CBM을 갖는 두 세균성 알파-아밀라제:

AMY1048: 아미노산 서열은 WO 2006/066596에서 SEQ ID NO:2로서 주어진다. CBM을 포함하는 바실러스 플라보테르무스(Bacillus flavothermus) (Syn. Anoxybacillus contaminans)로부터의 야생형 알파-아밀라제. 촉매작용 도메인은 아미노산 1 내지 484이고 CBM은 WO 2006/066596의 SEQ ID NO:2의 485 내지 586의 아미노산이다.

AX379 + CBM: 아미노산 서열은 WO 2006/066596에서 SEQ ID NO:12로서 주어진 다. 효소는 바실러스(Bacillus) 알파-아밀라제와 AMY1048로부터의 CBM의 하이브리드이다.

CBM이 없는 두 세균성 알파-아밀라제:

CBM 없는 AMY1048: 아미노산 서열은 WO 2006/066596에서 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-484로서 주어진다.

AX379 : 아미노산 서열은 WO 2006/066596에서 SEQ ID NO:12의 아미노산 1-484로서 주어진다.

실시예는 밀가루를 세균성 알파-아밀라제를 사용하는 환원하는 단부의 증가에 의해 측정되는 바와 같이 용해성 올리고당류로의 가수분해를 예시한다. 1% (중량/중량) 건조 고형분 (DS) 밀가루와의 슬러리를 50 mM Na-아세테이트 pH 5.0, 20% NaCl에서 제조하였다. 1 mL의 밀가루 슬러리를 시험관에 분배하였다. 시험관들을 25℃에서 열믹서에서 인큐베이션시켰다. 0분에서, 효소를 시험관에 용량투여하였다(160 마이크로그램/그램 건조 고형분). 샘플을 36, 64, 및 90 분 후에 회수하였다.

올리고당류의 방출을 DNS-시약법을 사용하여 환원하는 단부의 증가를 측정함으로써 구하였다:

DNS-시약: 1 g 3,5-디니트로살리실산을 20 ml 2 N NaOH 및 50 ml 물에 용해시키고 이어서 30 g Rochelle 염 (타르타르산 나트륨 칼륨 삼수화물)을 첨가하고 용액을 대략 70℃로 가열하고 이어서 물로 100 ml로 조절한다.

100℃에서 10분간 50 마이크로리터 DNS-시약과 50 마이크로리터 반응 혼합물 을 인큐베이션함으로써 방출된 환원당을 구하였다. 비등 후에, 250 마이크로리터 물을 첨가하고 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 방출된 환원당의 양을 D-글루코스 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

시간 (분)	각 효소로 방출된 mM 글루코스
시간 (분)	AX379+CBM	AX379	AMY1048	AMY1048, CBM없음
0	0	0	0	0
36	4.5	2.9	2.1	1.6
64	5.5	3.7	2.9	1.8
90	6.0	4.5	3.7	2.0

Claims

i) 식물성 재료를 전분분해 효소로 처리하는 단계와;

ii) 처리된 식물성 재료로부터 간장을 제조하는 단계를 포함하며;

여기서 전분분해 효소는 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 전분분해 효소를 모로미 발효 공정의 전에 또는 그동안에 첨가하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전분분해 효소를 코지 발효 공정의 전에 또는 그동안에 첨가하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 전분분해 효소는 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 알파-아밀라제인 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 전분분해 효소는 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 세균성 알파-아밀라제인 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물성 재료는 대두 및/또는 대두 유도 된 재료를 포함하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물성 재료는 대두 및/또는 대두 유도된 재료를 단계 i) 후에 처리된 식물성 재료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물성 재료는 소맥, 소맥 유도된 재료, 쌀 및/또는 쌀 유도된 재료를 포함하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단계 ii)에서 코지 배양물과의 발효를 포함하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단계 ii) 에서 모로미 배양물과의 발효를 포함하는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)은 단계 ii)의 동안에 수행되는 것을 특징으로 하는 간장의 제조방법.
간장의 제조를 위한 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 전분분해 효소의 사용.
전술한 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 간장.