ES2605235T3 - Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID n.º: 2; (b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con el dominio catalítico mostrado como los aminoácidos 18 a 472 de SEC ID n.º: 2; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

[0043] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia de muy baja a altísima son definidas como prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y bien 25% de formamida para astringencias muy bajas y bajas, 35% de formamida para astringencias medias y medio altas, o 50% de formamida para astringencias altas y muy altas, después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.

[0044] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2% de SDS preferiblemente a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente a 55°C (astringencia media), más preferiblemente a 60°C (astringencia medio alta), aún más preferiblemente a 65°C (astringencia alta), y de la forma más preferible a 70°C (astringencia muy alta).

[0045] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación y post-hibridación de lavado en aproximadamente 5°C a aproximadamente 10°C por debajo de la Tm calculada utilizando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1X solución de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sodio, 1 mM fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.

[0046] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0,1 % SDS durante 15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos utilizando 6X SSC a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada.

[0047] En un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de glucoamilasa codificada por polinucleótidos que comprenden o consisten en secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1 de al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, aún más preferiblemente al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, que codifica un polipéptido activo. Véase la sección polinucleótidos del documento.

[0048] La presente divulgación también se refiere a variantes artificiales que comprenden una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o más (o varios) aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 2. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, esto es sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que significativamente no afectan al plegado y/o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeña extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0049] Ejemplos de sustituciones conservadoras están en el grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que se producen más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

[0050] Además de los 20 aminoácidos estándar, aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, lisina de 6-Nmetil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina) se pueden sustituir por residuos de aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no se codifican por el código genético, y aminoácidos no naturales se pueden sustituir por residuos de aminoácidos. "Aminoácidos no naturales" han sido modificados después de síntesis de proteína, y/o tienen una estructura química en su(s) cadena(s) lateral(es) diferentes de los aminoácidos de estándar. Los aminoácidos no naturales pueden ser químicamente sintetizados, y preferiblemente, están disponibles comercialmente, e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3-y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.

[0051] Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico químicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

[0052] Aminoácidos esenciales en el polipéptido original pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham and

imagen6

5

15

25

35

45

55

65

Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligamiento de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que éstas estén en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor(es) y terminador.

[0062] Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión. En la secreción de la proteína de fusión, el sitio es dividido liberando el polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa a partir de la proteína de fusión. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, un sitio Kex2 que codifica el dipéptido Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-76; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381), un sitio Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg, que es dividido por una proteasa de Factor Xa después del residuo de arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512); un sitio Asp-AspAsp-Asp-Ly, que es dividido por una enteroquinasa después de la lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology

13: 982-987); un sitio His-Tyr-Glu o sitio His-Tyr-Asp, que es dividido por Genenasa I (Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248); un sitio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que es dividido por trombina después de Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48); un sitio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que es dividido por proteasa TEV después de Gin (Stevens, 2003, supra); y un sitio Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que es dividido por una forma genéticamente modificada de proteasa de rinovirus de humano 3C después del Gin (Stevens, 2003, supra).

Polinucleótidos

[0063] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten ten en secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de la presente invención.

[0064] Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en SEC ID n.º: 1. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2 o el polipéptido maduro de la misma, que difiere de SEC ID n.º: 1 o la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la misma en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de SEC ID n.º: 1 que codifican fragmentos de SEC ID n.º: 2 que tienen actividad de glucoamilasa.

[0065] La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprenden o consisten en al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica el polipéptido maduro de SEC ID n.º: 2.

[0066] Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de las mismas. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención a partir de tal ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en secuencias de nucleótidos (NASBA) pueden ser utilizados. Los polinucleótidos se pueden clonar a partir de una cepa de Penicillium, u otro u organismo relacionado y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especies de la región codificante del polipéptido de la secuencia de nucleótidos.

[0067] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten en secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1 de preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, aún más preferiblemente al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad, que codifica un polipéptido activo.

[0068] La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similar al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas que no se produzcan de forma natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna manera diseñada del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes artificiales que difieren en la actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similar. La secuencia variante se puede construir basándose en la secuencia de nucleótidos presentada como la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponde al uso de codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima,

o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente.

imagen7

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

[0087] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al 3' término de la secuencia de nucleótidos y, cuando transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina para ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

[0088] Secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

[0089] Secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura son descritas por Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

[0090] La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al amino terminal de un polipéptido y que dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede intrínsecamente contener una secuencia codificante del péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido segregado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es foráneo de la secuencia codificante. La secuencia codificante del péptido señal foráneo se puede requerir cuando la secuencia codificante no contiene de forma natural una secuencia codificante del péptido señal. Alternativamente, la secuencia codificante del péptido señal foráneo puede sencillamente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección, es decir, segregado en un medio de cultivo, se puede utilizar en la presente invención.

[0091] Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens y lipasa Humicola lanuginosa.

[0092] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que favorecen la expresión del gen que se va a activar o desactivar en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac, xyl y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 pueden ser utilizados. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido estaría operativamente enlazada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

[0093] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Los diferentes ácidos nucleicos y secuencias de control descritos aquí se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención se puede expresar por la inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0094] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueden provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. Los vectores puede ser plásmidos lineales o cerrados circulares.

[0095] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el cromosoma(s) en el que ha sido integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que va a ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón, puede ser utilizado.

imagen9

5

15

25

35

45

55

65

[0106] La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o bacteria gram-negativa. Bacterias gram-positivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus y Oceanobacillus. Bacterias gram negativas incluyen, pero no se limitan a, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria y Ureaplasma.

[0107] La célula huésped también puede ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica.

[0108] Preferiblemente, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos", como se utilizan en este caso, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como definidos por Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) al igual que los Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).

[0109] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura", como se utiliza en este caso, incluye levadura ascoesporogénea (Endomycetales), levadura basidioesporogénea y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0110] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

[0111] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

[0112] En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es aeróbico estrictamente. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0113] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

[0114] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0115] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de manera conocida de por sí. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y de Trichoderma son descritas en la EP 0238023 y en Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y la WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker and Guarente,

imagen10

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

[0134] Actualmente, la transferencia de gen mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y también pueden usarse para la transformación de monocotiledóneas, aunque otros métodos de transformación son frecuentemente usados para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno recubiertas con ADN de transformación) de callos embriogénicos o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology

10: 667-674). Un método alternativo para transformar monocotiledóneas se basa en transformación de protoplasto como se describe en Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

[0135] Tras la transformación, los transformantes que tienen incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente, el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de T-ADN separados o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

[0136] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención que comprenden: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Composiciones

[0137] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad de glucoamilasa de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1,1.

[0138] La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxiribonucleasa, esterasa, alfagalactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser producida(s), por ejemplo, por un microorganismo del género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, preferiblemente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, preferiblemente Humicola insolens o Humicola lanuginosa; o Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0139] Las composiciones de polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede ser en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0140] Más adelante se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las que la composición se usa se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.

Combinación de glucoamilasa y alfa-amilasa ácida

[0141] Según este aspecto de la invención una glucoamilasa de la invención se puede combinar con una alfaamilasa, preferiblemente alfa-amilasa ácida en una proporción de entre 0,3 y 5,0 AFAU/AGU. Más preferiblemente la proporción entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa es al menos 0,35, al menos 0,40, al menos 0,50, al menos 0,60, al menos 0,7, al menos 0,8, al menos 0,9, al menos 1,0, al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,85, o incluso al menos 1,9 AFAU/AGU. Sin embargo, la proporción entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa debería preferiblemente ser menos de 4,5, menos de 4,0, menos de 3,5, menos de 3,0, menos de 2,5, o incluso menos de 2,25 AFAU/AGU. En AUU/AGI las actividades de alfa-amilasa ácida y glucoamilasa están preferiblemente presentes en una proporción de entre 0,4 y 6,5 AUU/AGI. Más preferiblemente la proporción entre actividad de alfaamilasa ácida y actividad de glucoamilasa es al menos 0,45, al menos 0,50, al menos 0,60, al menos 0,7, al menos

imagen12

5

15

25

35

45

55

65

[0152] La sacarificación en la etapa (b) se puede realizar utilizando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completa puede durar hasta aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es común solo hacer una pre-sacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C, típicamente aproximadamente 60°C, seguida de sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultánea (proceso SSF). La sacarificación se realiza típicamente a temperaturas de 30-65°C, típicamente alrededor de 60°C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente alrededor de pH 4,5.

[0153] El proceso más ampliamente usado en la producción del producto de fermentación, especialmente etanol, es el proceso de sacarificación y fermentación simultánea (SSF), donde no hay fase de retención para la sacarificación, los que significa que el organismo fermentador, tal como levadura, y la(s) enzima(s) se puede adicionar juntas. La SSF puede típicamente efectuarse a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 29°C y 35°C, tal como entre 30°C y 34°C, tal como alrededor de 32°C. Según la invención la temperatura se puede subir o bajar durante la fermentación.

[0154] Conforme a la presente invención la etapa de fermentación (c) incluye, sin limitación, el procesos de fermentación usado para producir alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. Procesos de fermentación preferidos incluyen procesos de fermentación de alcohol, bien conocidos en la técnica. Los procesos de fermentación preferidos son los procesos de fermentación anaeróbica, como se conocen bien en la técnica.

Procesos para producir productos de fermentación a partir de materiales que contienen almidón no gelatinizado

[0155] En este aspecto, la invención se refiere a procesos para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón sin gelatinización del material que contiene almidón (es decir, material que contiene almidón crudo). En una forma de realización, solo una glucoamilasa de la invención se usa durante la sacarificación y la fermentación. Según la invención, el producto de fermentación deseado, tal como etanol, se puede producir sin licuefacción del lodo acuoso que contiene el material que contiene almidón. En una forma de realización, un proceso de la invención incluye sacarificación de material que contiene almidón (molido), por ejemplo, almidón granulado, por debajo de la temperatura de gelatinización en presencia de una glucoamilasa de la invención para producir azúcares que se pueden fermentar en el producto de fermentación deseado por un organismo fermentador adecuado.

[0156] Por consiguiente, en este aspecto la invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón que comprende:

(a)

sacarificación del material que contiene almidón con una glucoamilasa madura según la invención, preferiblemente que tiene la secuencia mostrada como los aminoácidos 19 a 575 en SEC ID n.º: 2, a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón,

(b)

fermentación utilizando un organismo fermentador.

[0157] Las etapas (a) y (b) del proceso de la invención se pueden realizar consecutivamente o simultáneamente. En una forma de realización, un lodo que comprende agua y material que contiene almidón, se prepara antes de la etapa (a).

[0158] El proceso de fermentación se puede llevar a cabo durante un periodo de 1 a 250 horas, es preferiblemente de 25 a 190 horas, más preferiblemente de 30 a 180 horas, más preferiblemente de 40 a 170 horas, aún más preferiblemente de 50 a 160 horas, aún más preferiblemente de 60 a 150 horas, incluso aún más preferiblemente de 70 a 140 horas, y de la forma más preferible de 80 a 130 horas.

[0159] El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura mínima a la que la gelatinización del almidón comienza. Almidón calentado en agua empieza a gelatinizar entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico, y puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie de planta, la variedad particular de las especies de planta al igual que con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material que contiene almidón dado es la temperatura en la que la birrefringencia se pierde en 5% de los gránulos de almidón utilizando el método descrito por Gorinstein and Lii, 1992, Starch/Stärke 44(12): 461-466.

[0160] Antes de la etapa (a) un lodo de material que contiene almidón, tal como almidón granulado, que tiene 10-55 % en peso de sólidos secos, preferiblemente 25-40 % en peso de sólidos secos, más preferiblemente 30-35 % en peso de sólidos secos de material que contiene almidón se puede preparar. El lodo puede incluir agua y/o aguas de proceso, tales como vinaza (backset), agua de lavado, condensado o destilado de evaporador, agua de separación lateral de destilación, u otra agua de proceso de planta de producto de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se realiza por debajo de la temperatura de gelatinización y así ningún aumento de la viscosidad

imagen13

imagen14

5

15

25

35

45

55

65

[0177] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o híbrido, especialmente uno descrito en cualquiera de las WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355 (todos los documentos incorporados por la presente por referencia). Variantes de alfa-amilasa contempladas específicamente se describe en la patente de EE.UU. n.:. 6.093.562, 6.187.576 y 6.297.038 (por la presente incorporada por referencia) e incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa BSG) que tienen una eliminación de un o dos aminoácidos en la posición 179 a 182, preferiblemente una eliminación doble descrita en la WO 96/23873 -véase, por ejemplo, página 20, líneas 1-10 (por la presente incorporada por referencia), preferiblemente correspondiente a delta(181-182) en comparación con la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa de tipo salvaje BSG expuesta en SEC ID n.º: 3 descrita en la WO 99/19467 o eliminación de aminoácidos 179 y 180 utilizando SEC ID n.º: 3 en la WO 99/19467 para numeración (cuya referencia es incorporada por la presente por referencia). Aún más preferidas son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, que tienen una eliminación doble correspondiente a delta(181-182) y además comprenden una sustitución N193F (también denominada I181* + G182* + N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa de tipo salvaje BSG expuesta en SEC ID n.º: 3 descrita en la WO 99/19467.

[0178] La alfa-amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, EC 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina en maltosa en la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica de la cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S, Dinamarca. La alfa-amilasa maltogénica es descrita en las patentes de EE.UU. n.º: 4.598.048, 4.604.355 y 6.162.628, que son incorporadas por la presente como referencia.

Alfa-amilasas híbridas bacterianas

[0179] Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminal de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada como SEC ID n.º: 3 en la WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminal de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada como SEC ID n.º: 5 en la WO 99/19467), con una o más, especialmente todas, de las siguientes sustituciones:

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+1201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis). También se prefieren las variantes que tienen una o más de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras estructuras de alfa-amilasa de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o eliminación de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente eliminación de E178 y G179 (utilizando la numeración de la SEC ID n.º: 5 de la WO 99/19467).

[0180] La alfa-amilasa bacteriana se puede añadir en cantidades que son bien conocidas en la técnica. Cuando se miden en unidades KNU (descritas abajo en la sección "Materiales y métodos") la actividad de la alfa-amilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 0,5-5.000 NU/g de sustancia seca, en una cantidad de 1-500 NU/g de sustancia seca, o más preferiblemente en una cantidad de 5-1,000 NU/g de sustancia seca, tal como 10-100 NU/g sustancia seca.

Alfa-amilasas fúngicas

[0181] Alfa-amilasas ácidas fúngicas incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas de una cepa del género Aspergillus, tales como alfa-amilasas de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o Aspergillus kawachii.

[0182] Una alfa-amilasa ácida fúngica preferida es una alfa-amilasa de tipo Fungamyl que se deriva preferiblemente de una cepa de Aspergillus oryzae. En la presente divulgación, el término "alfa-amilasa de tipo Fungamyl" indica una alfa-amilasa que muestra una identidad alta, es decir, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85% más del 90%, más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98%, más del 99% o incluso el 100% de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 10 en la WO 96/23874.

[0183] Otra alfa-amilasa ácida preferida es la derivada de una cepa de Aspergillus niger. En una forma de realización preferida la alfa-amilasa fúngica ácida es la de A. niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el número de acceso primario: P56271 y descrita con más detalle en la WO 89/01969 (ejemplo 3). La alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger ácido se muestra también como SEC ID n.º: 1 en la WO 2004/080923 (Novozymes) que es incorporada por la presente como referencia. También variantes de dicha amilasa fúngica ácida que tienen al menos 70% de identidad, tal como al menos 80% o incluso al menos 90% de identidad, tal como al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con SEC ID n.º: 1 en la WO 2004/080923 son contempladas. Una alfa-amilasa ácida fúngica disponible comercialmente adecuada derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

[0184] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa es derivada de Aspergillus kawachii y descrita por Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81:292-298, "Molecular-cloning and determination of the nucleotide

imagen15

[0197] Una glucoamilasa de la invención también puede usarse en un proceso de elaboración de cerveza. La glucoamilasa de la invención se añade en cantidades eficaces que pueden ser fácilmente determinadas por la persona experta en la técnica.

5 [0198] La presente invención se describe más mediante los ejemplos siguientes.

Materiales y métodos

[0199] Levadura: RED STAR™ disponible de Red Star/Lesaffre, USA

10 Medios y reactivos:

[0200] Productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos calidad reactiva.

15 [0201] PDA: 39 g/L agar de dextrosa de patata, 20 g/L agar, 50 ml/L glicerol

Métodos

20 [0202] A menos que se especifique de otro modo, las manipulaciones y las transformaciones de ADN se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al., 1989,, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990.

25 Actividad de glucoamilasa

[0203] La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades AGI o en unidades de glucoamilasa (AGU).

30 Actividad de glucoamilasa (AGI)

[0204] La glucoamilasa (equivalente a amiloglucosidasa) convierte el almidón en glucosa. La cantidad de glucosa es determinada aquí por el método de glucosa-oxidasa para la determinación de la actividad. El método descrito en la sección 76-11 de Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucose with Glucose Oxidase en

35 "Approved methods of the American Association of Cereal Chemists". Vol.1-2 AACC, de la American Association of Cereal Chemists, (2000); ISBN: 1-891127-12-8.

[0205] Una unidad de glucoamilasa (AGI) es la cantidad de enzima que formará 1 micro mol de glucosa por minuto bajo las condiciones estándar del método. 40 Condiciones estándar/condiciones de reacción:

Sustrato: Almidón soluble, concentración aprox. 16 g materia seca/L.

Tampón: Acetato, aprox. 0,04 M, pH=4,3

PH: 4,3

Temperatura de incubación: 60°C

Tiempo de reacción: 15 minutos

Terminación de la reacción: NaOH a una concentración de aproximadamente 0,2 g/L (pH~9)

Concentración enzimática: 0,15-0,55 AAU/mL.

[0206] El almidón debe ser almidón Lintner, que es un almidón de ebullición fina usado en el laboratorio como indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por tratamiento de ácido clorhídrico diluido de almidón natural de modo que éste retenga la capacidad de dar color azul con yodo.

45 Actividad de glucoamilasa (AGU)

[0207] La unidad Novo de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M,

50 tiempo de reacción 5 minutos.

[0208] Un sistema autoanalizador puede ser utilizado. Mutarotasa se añade al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa

imagen16

imagen17

Fermentación

[0217] Al sustrato para SSF, 1.000 ppm de urea como fuente de nitrógeno y 3 ppm de penicilina para control

5 bacteriano fueron añadidos; el pH fue ajustados a 5,0 con H2SO4. Partes alícuotas de 5 g de triturado fueron transferidas a 15 ml de tubos centrífugos con un agujero taladrado en la parte superior para liberación de CO2. Enzimas y levadura fueron adicionadas y los tubos fueron colocados al baño maría sin agitación a 32°C durante 54 horas. Se analizaron muestras en HPLC para determinar el etanol producido durante la fermentación. Los resultados se muestran en las tablas por debajo.

10

Tabla 1. Rendimiento de etanol producido durante SSF con Nigrofomes sp. AMG a 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína enzimática/g sustancia seca en comparación con Talaromyces emersonii AMG y Trametes cingulata AMG. Control resultó en 100% rendimiento.

Dosis enzimática (microgramos proteína enzimática/g sustancia seca)

30

40 55 70

Nigrofomes sp., SEC ID n.º: 2

85% 93% 98% 98%

Trametes cingulata AMG G1, SEC ID n.º: 4

87% 90% 97% 98%

Talaromyces emersonii, T-AMG, SEC ID n.º: 6

83% 90% 94% 95%

Ejemplo 2:

15 [0218] Actividad específica de Nigrofomes AMGs en comparación con Trametes cingulata AMG. La actividad específica fue calculada por la división de la actividad AGU de glucoamilasa (según el procedimiento de arriba) y proteína enzimática de cada preparación (análisis de AA). La tabla inferior a muestra resultados para Nigrofomes sp. AMGs en comparación con AMG mejor del estado de la técnica, Trametes cingulata AMG.

20

Tabla 2. Actividad específica

[AGU/mg]

Trametes cingulata AMG G1, SEC ID n.º: 4

5,6

Nigrofomes sp., SEC ID n.º: 2

7,4

Temperatura: 32°C pH inicial: 5,0

25 Dosis enzimática: Nigrofomes sp. AMG producido en Aspergillus niger a 30, 40, 55 y 70 microgramos proteína enzimática/g sustancia seca. Las enzimas fueron comparadas con unas muestras purificadas de Talaromyces emersonii AMG y Trametes cingulata AMG dosificado a las mismas dosificaciones. La dosis máxima de Talaromyces emersonii AMG es equivalente a una cantidad pertinente en la industria de 0,56 AGU/g sustancia seca. Un control para sacarificación máxima obtenible se preparó utilizando cantidades en exceso de AMG comercial y alfa-amilasa.

30 Fermentación

[0219] Al sustrato para SSF, 1.000 ppm de urea como fuente de nitrógeno y 3 ppm de penicilina se añadieron para control bacteriano; el pH fue ajustado a 5,0 con H2SO4. Partes alícuotas de 5 g de trituración fueron transferidas a

35 tubos centrifugadores de 15 ml con un agujero taladrado en la parte superior para liberación de CO2. Enzimas y levadura fueron adicionadas y los tubos fueron colocados al baño maría sin agitación a 32°C durante 54 horas. Las muestras fueron analizadas en HPLC para la determinación del etanol producido durante la fermentación. Los resultados se muestran en las tablas por debajo.

Tabla 1. Rendimiento de etanol producido durante SSF con Nigrofomes sp. AMG a 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína enzimática/g sustancia seca en comparación con Talaromyces emersonii AMG y Trametes cingulata AMG. Control resultó en 100% rendimiento.

Dosis enzimática (microgramos proteína enzimática/g sustancia seca)

30

40 55 70

Claims (1)

1. imagen1